KR101398074B1

KR101398074B1 - 재발성 다형교아종 진단용 조성물 및 진단 방법

Info

Publication number: KR101398074B1
Application number: KR1020120079314A
Authority: KR
Inventors: 김건화; 김지원; 김수현; 김승일; 박창균
Original assignee: 한국기초과학지원연구원
Priority date: 2012-07-20
Filing date: 2012-07-20
Publication date: 2014-05-27
Also published as: US20150232946A1; KR20140012426A; US10266898B2; WO2014014322A1

Abstract

본 발명은 재발성 다형교아종 진단용 조성물 및 진단 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 재발성 다형교아종에 특이적인 miRNA 마커를 선별하고 또한 상기 마커의 존재를 측정하는 제제를 포함하는 조성물, 미트 및 이를 사용하여 재발성 다형교아종을 진단하는 방법에 관한 것이다. 이러한 본 발명의 재발성 다형교아종 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단 방법은 재발성 다형교아종의 발병을 진단할 수 있는 진단 마커들을 제공함으로써, 재발성 다형교아종의 치료 및 예후관리에 유용한 자료를 제공한다. 또한, 상기 재발성 다형교아종 진단 마커들은 재발성 다형교아종 특이적 항암제 개발연구에 이용될 수 있다.

Description

재발성 다형교아종 진단용 조성물 및 진단 방법{Composition for detecting recurrent glioblastoma multiform and use thereof}

본 발명은 재발성 다형교아종 진단용 조성물 및 진단 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 재발성 다형교아종에 특이적인 miRNA 마커를 선별하고 또한 상기 마커의 존재를 측정하는 제제를 포함하는 조성물, 미트 및 이를 사용하여 재발성 다형교아종을 진단하는 방법에 관한 것이다.

miRNA는 18-25개의 핵산으로 이루어진 단일염기가닥의 비암호화 small RNA로 유전자 발현을 제어한다. 하나의 miRNA는 직접적으로 여러 개의 타겟 유전자를 제어할 수 있으며 이에 따라 다양한 신호경로의 여러 단백질 발현을 조절할 수 있다(Bartel DP. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell 2009;136:215-233.). miRNA의 발현은 기관의 발달과 조직의 차이에 따라 다르다(Rosenfeld N, Aharonov R, Meiri E, et al. MicroRNAs accurately identify cancer tissue origin. Nat Biotechnol 2008;26:462-469.). miRNA는 다양한 생물학적 과정을 제어하는 것으로 잘 알려져 있으며(Rosenfeld N, Aharonov R, Meiri E, et al. MicroRNAs accurately identify cancer tissue origin. Nat Biotechnol 2008;26:462-469.), 종양 억제 유전자와 종양 유전자 번역 제어에 의해 암과 세포소멸에 연관된다.(Lee YS Dutta A. MicroRNAs in cancer. Annu Rev Pathol 2009;4:199-227.). 최근의 연구에서는 다양한 암들의 시작과 진행에서의 miRNA 조절장애를 보여주고 있다(Lovat F, Valeri N Croce CM. MicroRNAs in the pathogenesis of cancer. Seminars in oncology 2011;38:724-733.).

다형교아종(GBM)은 가장 흔하고 공격적인 타입의 주요한 성인 뇌 암이다. 최초 진단된(newly diagnosed) 다형교아종의 치료법은 화학적방사선치료와 방사선치료 조합을 통한 외과적 절제이다(Stupp R, Mason WP, van den Bent MJ, et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med 2005;352:987-996.). 치료법의 발전과 GBM의 유전학과 분자 대사 이해의 발전에도 불구하고(Bai RY, Staedtke V Riggins GJ. Molecular targeting of glioblastoma: Drug discovery and therapies. Trends in molecular medicine 2011;17:301-312.,Kesari S. Understanding glioblastoma tumor biology: the potential to improve current diagnosis and treatments. Seminars in oncology 2011;38 Suppl 4:S2-10.), 전반적인 생존율은 매우 낮으며 GBM 환자의 평균수명은 10-15개월로 제한되어있다. 이 수명은 치료를 함에도 불구하고 십년 동안 겨우 최소한으로 개선되었다. 가장 주된 문제는 대부분의 GBM(약 90%의 경우)의 재발이 원래 종양부위 내에 있거나 인접한다는 점이다(Joki T, Carroll RS, Dunn IF, Zhang J, Abe T Black PM. Assessment of alterations in gene expression in recurrent malignant glioma after radiotherapy using complementary deoxyribonucleic acid microarrays. Neurosurgery 2001;48:195-201; discussion 201-192.). 현재까지는 재수술, 화학적방사선치료, 방사선치료를 쓰는 것 외에는 재발한 GBM을 치료하는 일반적인 방법이 없다. 따라서 GBM에 대한 새로운 분자적 타겟, 개념과 접근법이 시급하게 필요하다.

인간의 종양 세포가 발견된 후로, GBM 저항 연구에 화학적방사선치료가 사용되어 왔다. 그 저항은 DNA 복구 능숙도(proficiency)와 비조절성(dysregulated) 성장 인자 신호 경로와 암줄기세포(cancer stem-like cell)의 특별한 생물학적 습관 덕분이라고 할 수 있다(Haar CP, Hebbar P, Wallace GCt, et al. Drug Resistance in Glioblastoma: A Mini Review. Neurochemical research 2012.). GBM 재발의 분자적, 유전자적 변화가 연구되어 왔음에도 불구하고 GBM 재발의 이유와 저항적 발병은 명확하게 확인되지 않았다.

수술 후의 방사선 치료가 GBM환자에게 별다른 효과를 내지 못하므로 GBM 재발을 막기 위한 효과적이고 적합한 화학적방사선치료를 찾기 위한 여러 시도들이 있었다. 종양의 분자 특성을 정의하기 위한 새로운 접근법은 miRNA들의 발현 조사에 바탕을 두고 있다. 지난 몇 년간, GBM의 발병과 관련된 여러 miRNA들이 알려졌다(Novakova J, Slaby O, Vyzula R Michalek J. MicroRNA involvement in glioblastoma pathogenesis. Biochem Biophys Res Commun 2009;386:1-5.,Srinivasan S, Patric IR Somasundaram K. A ten-microRNA expression signature predicts survival in glioblastoma. PLoS One 2011;6:e17438.). 그러나 알려진 miRNA의 겨우 작은 부분의 생리학적 역할을 파악하였다. 게다가 GBM 재발의 저항에 관여하는 전체적인 miRNA 특징은 여태까지 조사된 적이 없다.

이에 본 발명자들은 재발성 다형교아종을 치료하고 예방하기 위한 효과적인 방법에 관하여 연구하던 중, 재발성 다형교아종 세포에서 발현되는 miRNA를 통해 재발성 다형교아종을 진단하는 재발성 다형교아종에 특이적인 마커들을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 miRNA를 포함하는 재발성 다형교아종 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 재발성 다형교아종 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 miRNA의 발현 수준을 대조구 시료의 해당 miRNA의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 재발성 다형교아종 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 서열번호 1로 표시되는 miRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 재발성 다형교아종 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 miRNA를 포함하는 재발성 다형교아종 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 재발성 다형교아종 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 miRNA의 발현 수준을 대조구 시료의 해당 miRNA의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 재발성 다형교아종 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적은 서열번호 1로 표시되는 miRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 재발성 다형교아종 진단용 키트를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1 내지 29로 이루어진 군에서 선택된 하나이상의 miRNA를 포함하는 재발성 다형교아종 진단용 조성물을 제공한다.

바람직하게는 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 miRNA를 포함하는 재발성 다형교아종 진단용 조성물을 제공한다.

상기의 재발성 다형교아종(recurrent glioblastoma multiform)은 뇌 신경세포에 발생하는 종양인 다형교아종의 재발로 초기 발병 시 다형교아종이 생긴 부분에 다시 재발하거나 그 주변에 재발한 다형교아종을 의미한다.

상기 서열번호 1(hsa-miR-365, taatgcccctaaaaatccttat)은 실시예에서 확인된 재발성 GBM에서 다르게 발현되는 miRNA들 중 하나이며, 상기 서열번호 1의 miRNA는 재발성 GBM의 miRNA의 변화를 정상 및 초발성 GBM과 비교했을 때 가장 많이 나타난 것으로 확인되었다.

한편, 본 발명의 조성물은 서열번호 1의 miRNA에 추가적으로 서열번호 2 내지 29로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 miRNA를 포함할 수 있다. 각각의 서열의 통상적인 명칭은 다음과 같다: 서열번호 2(hsa-miR-29b, tagcaccatttgaaatcagtgtt), 서열번호 3(hsa-miR-34c-5p, aggcagtgtagttagctgattgc), 서열번호 4(hsa-miR-129-3p, aagcccttaccccaaaaagcat), 서열번호 5(hsa-miR-218, ttgtgcttgatctaaccatgt), 서열번호 6(hsa-miR-124, taaggcacgcggtgaatgcc), 서열번호 7(hsa-miR-486-5p, tcctgtactgagctgccccgag), 서열번호 8(hsa-miR-10b, taccctgtagaaccgaatttgtg), 서열번호 9(hsa-miR-95, ttcaacgggtatttattgagca), 서열번호 10(hsa-miR-154, taggttatccgtgttgccttcg), 서열번호 11(hsa-miR-224, caagtcactagtggttccgtt), 서열번호 12(hsa-miR-299-3p, tatgtgggatggtaaaccgctt), 서열번호 13(hsa-miR-299-5p, tggtttaccgtcccacatacat), 서열번호 14(hsa-miR-376a, atcatagaggaaaatccacgt), 서열번호 15(hsa-miR-376c, aacatagaggaaattccacgt), 서열번호 16(hsa-miR-379, tggtagactatggaacgtagg), 서열번호 17(hsa-miR-571, tgagttggccatctgagtgag), 서열번호 18(hsa-miR-592, ttgtgtcaatatgcgatgatgt), 서열번호 19(hsa-miR-629, tgggtttacgttgggagaact), 서열번호 20(hsa-miR-654-3p, tatgtctgctgaccatcacctt), 서열번호 21(hsa-miR-1271, cttggcacctagcaagcactca), 서열번호 22(hsa-miR-20a, taaagttgcttatagtgcaggtag), 서열번호 23(hsa-miR-142-3p, tgtagtgtttcctactttatgga), 서열번호 24(hsa-miR-196, taggtagtttcatgttgttggg), 서열번호 25(hsa-miR-223, tgtcagtttgtcaaatacccca), 서열번호 26(hsa-miR-450a, ttttgcgatgtgttcctaatat), 서열번호 27(hsa-miR-451, aaaccgttaccattactgagtt), 서열번호 28(hsa-miR-542-3p, tgtgacagattgataactgaaa), 서열번호 29(hsa-miR-582-5p, ttacagttgttcaaccagttact)이다.

이러한 본 발명의 서열번호 1 내지 29에 속하는 miRNA는 재발성 다형교아종을 진단하기 위한 마커가 될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 재발성 다형교아종 진단 키트, 즉 서열번호 1로 표시되는 miRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 재발성 다형교아종 진단용 키트를 제공한다. 아울러, 본 발명의 진단 키트는 서열번호 2 내지 29로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA의 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.

바람직하게는 또한 상기 제제를 통해 생물학적 시료에서 재발성 다형교아종 진단 마커인 miRNA들의 발현 정도를 확인할 수 있으며, miRNA의 양을 측정할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는 상기 제제는 해당 miRNA를 증폭하는 PCR 프라이머일 수 있다. 마커는 바람직하게는 서열번호 30(hsa-miR-20a에 대한 프라이머;ACTGCATTATGAGCACTTAAAG), 서열번호 31(hsa-miR-142-3p에 대한 프라이머;TGTAGTGTTTCCTACTTTATGGA), 서열번호 32(hsa-miR-196에 대한 프라이머;TAGGTAGTTTCATGTTGTTGG), 서열번호 33(hsa-miR-223에 대한 프라이머;TGTCAGTTTGTCAAATACCCCA), 서열번호 34(hsa-miR-450a에 대한 프라이머;TTTTGCGATGTGTTCCTAATAT), 서열번호 35(hsa-miR-451에 대한 프라이머;AAACCGTTACCATTACTGAGTT), 서열번호 36(hsa-miR-542-3p에 대한 프라이머;TGTGACAGATTGATAACTGAAA), 서열번호 37(hsa-miR-582-5p에 대한 프라이머;TTACAGTTGTTCAACCAGTTACT)의 프라이머일 수 있다 (miRNA에 대한 PCR 프라이머는 miRNA 자체가 프라이머 역할을 할 수 있으므로 한 쪽만으로 PCR이 가능). 프라이머는 각 miRNA에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 16 bp 내지 30 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 21 bp 내지 23 bp 의 길이이다.

또한, 본 발명의 재발성 다형교아종 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.

상기 진단 키트는 실시간 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 실시간 RT-PCR 키트는 마커 miRNA에 대한 특이적인 프라이머들을 포함한다. 본 발명에서는 바람직하게 서열번호 30 내지 37의 프라이머를 하나 이상 포함하는 키트일 수 있다. 또한 그 외 실시간 RT-PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재발성 다형교아종 진단용 조성물 또는 상기 재발성 다형교아종 진단 키트를 이용한 재발성 다형교아종 진단 방법을 제공한다.

즉, 본 발명은 서열번호 1 및 2 내지 29 중에서 선택되는 1개 이상의 miRNA에 특이적인 프라이머를 사용하여 재발성 다형교아종 의심 환자의 생물학적 시료로부터 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 miRNA의 발현 수준을 대조구 시료의 miRNA의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 재발성 다형교아종 진단 방법을 제공한다.

생물학적 시료에서 miRNA를 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며 miRNA 수준은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.

상기의 생물학적 시료는 재발성 다형교아종 발병에 의해 재발성 다형교아종 마커의 miRNA 발현 수준이 차이나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

miRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 miRNA 발현량과 재발성 다형교아종 의심환자에서의 miRNA 발현량을 비교할 수 있고, 재발성 다형교아종 마커의 miRNA의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여 재발성 다형교아종 의심 환자의 실제 재발성 다형교아종 발병 여부를 진단할 수 있다.

miRNA 발현수준 측정은 바람직하게는, 재발성 다형교아종 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 실시간 RT-PCR법 또는 DNA 칩을 이용하는 것이다.

상기의 실시간 RT-PCR은 반응 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 재발성 다형교아종 진단 마커로 사용되는 miRNA의 발현 여부와 정도를 확인 가능하고 이를 대조군과 비교함으로써, 재발성 다형교아종 발병 여부를 간편하게 진단할 수 있다.

본 발명의 도면은 하기 기재를 참조 할 수 있다.

도 1은 재발성 GBM에서 다르게 발현되는 miRNA들의 Heat map분석이다. 각 열은 miRNA의 발현 수준을 나타내고 각 행들은 시료들의 발현 수준 정도를 나타낸다. 빨간색은 과발현 정도를 나타내고 초록색은 저발현 정도를 나타낸다. R1: 재발성 GBM 환자 1, R2:재발성 GBM 환자 2, P1: 초발성 GBM 환자 1, P2: 초발성 GBM 환자2.

도 2는 마이크로어레이 분석에서 3개의 상승 조절되는 miRNA들(A)과 5개의 하락 조절된 miRNA들(B)을 실시간 RT-PCR을 통해 확인한 것이다. miRNA의 발현 수준은 초발성 GBM과 재발성 GBM을 비교하였다. RNU6-1 RNA는 miRNA 발현의 내부 통제(internal control) 역할을 하였다.

도 3은 초발성 GBM과 재발성 GBM에 연관된 RNU6-1 RNA의 발현 수준을 실시간 RT-PCR을 통해 확인한 것이다. P: 초발성 GBM 환자, R1: 재발성 GBM 환자 1, R2:재발성 GBM 환자 2 이다.

도 4는 IPA(Ingenuity Pathway Analysis)를 통한 재발성 GBM에서 다르게 발현되는 43개 miRNA들의 관련 정도를 나타낸 것이다.

도 5는 재발성 GBM에서 다른게 발현되는 43개 miRNA들을 Global IPA miRNA-단백질 네트워크 분석을 한 것이다.

따라서 본 발명은 재발성 다형교아종 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단 방법을 제공한다. 이러한 본 발명의 재발성 다형교아종 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단 방법은 재발성 다형교아종의 발병을 진단할 수 있는 진단 마커들을 제공함으로써, 재발성 다형교아종의 치료 및 예후관리에 유용한 자료를 제공한다. 또한, 상기 재발성 다형교아종 진단 마커들은 재발성 다형교아종 특이적 항암제 개발연구에 이용될 수 있다.

도 1은 재발성 GBM에서 다르게 발현되는 miRNA들의 Heat map 분석이다.
도 2는 마이크로어레이 분석에서 3개의 상승 조절된 miRNA들(A)과 5개의 하락 조절된 miRNA들을 실시간 RT-PCR을 통해 확인한 것이다.
도 3은 초발성 GBM과 재발성 GBM에 연관된 RNU6-1 RNA의 발현 수준을 실시간 RT-PCR을 통해 확인한 것이다.
도 4는 IPA(Ingenuity Pathway Analysis)를 통한 재발성 GBM에서 다르게 발현되는 43개 miRNA들의 관련 정도를 나타낸 것이다.
도 5는 재발성 GBM에서 다른게 발현되는 43개 miRNA들을 Global IPA miRNA-단백질 네트워크 분석을 한 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험 방법>

1. 환자 시료

본 연구는 가톨릭대학교 심의회의 승인(KC10SISI042)을 얻은 것이다. 인간 GBM 시료는 2명의 GBM 첫 발병 환자들로부터 수술(definitive surgery) 중 얻고, 2명의 GBM 재발 환자의 구제 수술(salvage surgery) 중 얻었다. GBM 재발 시료는 테모졸로마이드(temozolomide) 기반 화학적방사선치료 후 종양제거 치료를 받은 환자들에게서 얻었다. 방사선 치료는 등각 기술(conformal technique)에 의해 수술용 침대에서 전체 59.5Gy 범위로 주었다. 환자들의 특성은 표 1과 같다.

2. RNA 분리

전체 RNA 추출과 miRNA 마이크로어레이 분석은 다음에 기재된 것과 같다. 시료들은 TRI Reagent(Molecular Research Center, Cincinnati, OH)로 균질화하고 상등액은 층분리를 위해 BCP(1-bromo-3-chloropropane, Molecular Research Center)를 넣고 세게 섞었다. 4℃에서 10분 동안 12,000rpm으로 원심분리한 후 액체 층은 페놀-클로로포름 추출에 사용하였다. 전체 RNA는 침전시킨 후, RNase-free water로 용해시켰다. 얻어진 RNA는 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)로 정량화 하였다.

3. MiRNA 마이크로어레이 분석

타겟 miRNA 절편의 합성과 혼성화(hybridization)는 Agilent's miRNA Labeling Reagent and Hybridization kit을 사용하였다. 총 RNA를 각각 100ng씩 calf intestine alkaline phosphatase 15 unit으로 탈인산화 시키고 40% DMSO로 10분간 100℃에서 RNA를 변성(denaturation)시켰다. 탈인산화된 RNA는 pCp-Cy3 mononucleotide와 결합되며, MicroBioSpin 6 columns(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 정제시켰다. 정제한 뒤 시료들은 Gene Express Blocking Reagent와 Hi-RPM Hybridization Buffer로 5분간 100℃에서 끓이고 5분간 얼음에 식혀서 재 침전시켰다. 마지막으로 Agilent Microarray(15K)쪽으로 절편들을 모아주고 파이펫으로 섞고 Agilent Hybridization Oven에서 20시간 동안 55℃에서 20rpm으로 hybridization 시켰다. 세척 한 뒤 Agilent G2404B Scanner로 스캔하였다. 스캔한 이미지는 배경 수정을 위해 기본적으로 세팅된 파라미터를 사용해 Feature Extraction software(Agilent Technologies)로 얻었다.

4. MiRNA 단일 가닥 cDNA 합성과 정량적 실시간 PCR

RNA에서 miRNA first-strand cDNA를 합성하기 위해서 Mir-X^TMmiRNA first-strand synthesis Kit(TAkara Bio, Shiga, Japan)를 사용해 miRNA의 polyadenylation과 역전사를 수행하였다. 타겟 miRNA의 정량화하기 위해서 SmartCyclerSystem(Cepheid)와 SYBRPremix Ex Taq^TMⅡ(Takara Bio)를 이용해 실시간 PCR을 수행하였다. 각 타겟 miRNA의 forward primer들은 서열번호 22 내지 29와 같다.

5. MiRNA 타겟들의 생물정보학적 분석과 관련된 경로

상승 및 하락 조절된 miRNA를 위한 타겟은 miRanda(http://www.microRNA.org/microRNA/home.do)와 miRbase(http://www.mirbase.org/)의 공개된 데이타베이스를 이용해서 찾았다. 경로 분석을 위해서 KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)와 NCI-Nature curated(http://pid.nci.nih.gov/browse_pathways.shtml)에서 주요 경로를 수집하였다. 각 경로 데이타베이스는 하나의 파일에 누적하고, 상승 또는 하락 조절된 miRNA로부터 얻은 타겟 유전자를 이용해 각 경로와 일치하는 유전자의 수를 주어진 경로의 전체 유전자와 함께 계산해서 일치한 유전자를 기준으로 분류한 뒤 상위 10개 경로를 선정하였다.

<실험결과>

1. 재발된 GBM 에서 다르게 발현되는 miRNA 확인

GBM 재발의 저항에 관여하는 miRNA을 알기 위해 수술 후 화학적방사선치료를 받은 GBM재발과 처음 발병된 GBM 간 miRNA 전사 프로파일을 분석 하였다. 인간 뇌 조직은 처음으로 GBM이 발병된 환자 2명과 GBM이 재발한 환자 2명으로부터 얻었다. GBM환자들에게서 총 318개의 miRNA가 발현됐다. 재발 환자 2명 모두 발현 단계에서 miRNA 318개 중 적어도 2-fold의 변화를 나타낸 것은 43개였다. GBM 재발 환자에서 18개의 miRNA가 up regulated되었고 25개는 down regulated 되었다(도 1).

2. 정량화 RT - PCR 을 이용한 miRNA 발현 검증

miRNA 어레이 분석 결과를 확인하기 위해 RT-PCR을 실행하였다. RT-PCR을 하기 전에 앞서, miRNA 전사 발현의 표준화를 위해서 내부 조절 유전자 확인이 필수적이었다. 이를 위해 GBM 처음 발병된 환자와 재발 환자에서 RNU6-1 RNA(miRNA 발현 조절을 함) 유전자를 비교하였다. 재발 환자와 처음 발병한 환자 간의 RNU6-1 RNA 발현은 서로 비슷하였다(도 3). 마이크로어레이에서 발견한 miRNA발현 변화를 검증하기 위해 무작위적으로 선택한 8개의 miRNA를 RT-PCR 하였다(8개 miRNA:has-miR-142-3p, has-miR-233, has-miR-451, has-miR-20a*, has-miR-196, has-miR-450a, has-miR-452-3p, has-miR-582-5p). MiRNA 마이크로어레이결과와 동일한 결과를 나타낸 것으로는 GBM재발 환자에서 has-miR-142-3p, has-miR-233, has-miR-451 가 up regulated 되었고 has-miR-20a*(도 2A), has-miR-196, has-miR-450a, has-miR-452-3p, has-miR-582-5p가 down regulated 되었다(도 2B).

3. 지식기반( knowledge - based ) 생물정보학적 분석

화학적방사선치료 후 GBM 재발에서 다르게 발현되는 miRNA와 관련된 분자적, 세포적 네트워크를 알아보기 위해, 발현 단계에서 2-fold 변화 이상 나타내는 43개의 miRNA를 사용해 지식기반(knowledge-based)의 IPA(Ingenuity Pathway Analysis)를 수행하였다. IPA는 세포사멸을 세포 발달과 성장의 뒤를 잇는 상위 카테고리로써 알아냈고, 특수하게 miRNA와 연관되는 (세포)급증도 알아냈다(도 4). IPA을 이용한 핵심 분석은 12개의 miRNA와 암과 세포 사멸에 연관되는 핵심 단백질을 포함한 네트워크를 만들었다(도 5). 이 네트워크에서 종양 억제 유전자 TP53는 miRNA가 직접적으로 p53발현을 제어하지 않더라도 네트워크의 핵심 지점으로 확인됐다. 게다가 p53신호변화와 p53 effector의 발현은 GBM 재발의 원인으로 추정되었다.

4. MiRNA 타겟 유전자와 연관 경로에 대한 생물정보학적 분석

GBM의 재발과정과 화학적방사선치료에 대한 저항에서 앞에서 언급한 결과들이 잠재적 타겟 유전자와 관련되어있는지 알아보기 위해 miRNA의 생물정보학적 분석을 실시하였다. 43개의 다르게 발현되는 miRNA의 잠재적 타겟 유전자는 in silico에서 알아냈고, pathway enrichment 분석은 GBM 재발에 있어서 miRNA의 생물학적 영향 가능성 탐색을 위해 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 데이타베이스를 이용해 실행하였다. 예상대로 암과 관련된 경로에서 miRNA의 타겟 유전자가 다량 있었다(표 2).

이러한 결과는 (세포)급증, 지속적인 혈관형성, 분화(differentiation) 차단, 세포소멸 회피, 조직의 감염과 전이, 유전자 복구 실패, 유전적 손상, 비성장 신호에 대한 둔감을 포함하고 있다. 추가적으로 Wnt과 미토겐 활성 단백질 kinase(MAPK) 신호 경로에 연관된 다수의 유전자들은 miRNA의 타겟이다. Wnt 신호는 줄기세포의 미분화 상태를 유지시키는 작용을 하고 MAPK는 다양한 성장 인자의 신호를 조절한다. 화학적방사선치료 후의 GBM 재발에서 암 조직이 더 공격적으로 되고 급증할 수 있음이 제시됐다(성장인자: epidermal growth factor(EGF), fibroblast growth factor(FGF), platelet-derived growth factor(PDGF)).

좀 더 자세한 miRNA의 신호 경로 조사를 위해, 경로분석을 NCI-Nature curated 데이타베이스로 확장시켜 miRNA 타겟 유전자들이 주요하게 연관된 다양한 성장 인자의 신호 경로들을 찾아냈다(성장 인자 신호 경로: ErbB1,Smad2/3,Wnt,Notch). 또한 miRNA가 p53신호로 제어되는 유전자들의 가장 많은 수를 타겟으로 하고 있는 것도 찾아냈으며 이 결과는 IPA를 이용한 결과와 높게 일치하였다(도 4).

마지막으로 GBM 재발 원인이 있다고 여겨지는 새로운 miRNA를 찾아내기 위해 miRNA 타겟 예측으로부터 추정 유전자들과 경로분석의 유전자 reference 세트를 비교하였다. 그래서 세트와 겹치는 유전자들은 목록으로 만들었다. 72개의 직접적인 p53 effector 유전자들은 재발 환자의 18개의 up regulated miRNA에 의해 확인되었다(표 3).

GBM재발의 25개의 down-regulated miRNA로부터 ErbB1의 downstream 신호과 관련된 72개 유전자, Samd2/3 신호의 54개 유전자, Wnt-mediatedβ-catenin 신호의 48개 유전자, Notch 신호 경로의 44개 유전자를 확인했으며 다음에 기재하였다(표 4).

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 재발성 다형교아종 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단 방법을 제공한다. 이러한 본 발명의 재발성 다형교아종 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단 방법은 재발성 다형교아종의 발병을 진단할 수 있는 진단 마커들을 제공함으로써, 재발성 다형교아종의 치료 및 예후관리에 유용한 자료를 제공한다. 또한, 상기 재발성 다형교아종 진단 마커들은 재발성 다형교아종 특이적 항암제 개발연구에 이용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1로 표시되는 miRNA를 포함하는 재발성 다형교아종 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 2 내지 29로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA를 추가로 포함하는 것인 재발성 다형교아종 진단용 조성물.
재발성 다형교아종 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 서열 번호 1의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
상기 miRNA의 발현 수준을 대조구 시료의 해당 miRNA의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 재발성 다형교아종 진단을 위한 정보의 제공 방법.
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