CN102725420A - 用于染色体重排相关肿瘤的诊断、预后和治疗的基于微小rna的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本文提供了染色体重排相关肿瘤，尤其是甲状腺的肿瘤或瘤样病变的诊断、预后和治疗的新方法和组合物。此外，还描述了鉴定抗肿瘤剂的方法。

Description

用于染色体重排相关肿瘤的诊断、预后和治疗的基于微小RNA的方法和组合物

技术领域

本发明一般涉及分子生物学领域。更具体说，涉及关于微小RNA(miRNA或miR)分子的方法和组合物。描述了用于分离、标记和制备用于分析或作为分析工具的miRNA的方法和组合物，如miRNA阵列。此外，还有miRNA在诊断、治疗和预后中的应用。更具体说，本发明涉及miR，尤其是属于位于染色体断裂点区(breakpoint region)附近miR群的那些miR，作为染色体重排相关肿瘤治疗的诊断和治疗靶点的用途。

发明背景

肿瘤的发生常常涉及染色体重排，如易位，引起基因调节和表达的改变。例如，甲状腺腺瘤是一种表现具有7三体性和染色体重排的克隆性染色体异常的肿瘤。甲状腺腺瘤是常见人类肿瘤，与其恶性对应物即滤管癌的区别分别在于包膜性生长以及无侵袭性。即便在碘充分地区，甲状腺腺瘤的成人发病率在4-7％，在碘缺乏地区数字则升至约50％。对这些频发性良性肿瘤的病因学理解尚少，但在约40％的节结中观察到克隆性染色体异常，可能定位于与疾病发生相关的基因组区域和基因(DeLellis，内分泌器官的病理和遗传性肿瘤，编辑和共识会议，法国里昂(Pathology and geneticsof tumours of endocrine organs，editorial和consensus conference in Lyon，France)，2003年4月23-26，320S.IARC出版社，里昂，2004)。约20％的肿瘤显示7三体性的克隆性染色体异常(Bartnitzke等，Cancer Genet.Cytogenet.39(1989)，65-68)，并且约20％具有克隆性细胞遗传学异常的肿瘤显示染色体带19q13相关异常(Belge等，Cancer Genet.Cytogenet.101(1998)，42-48)。考虑到在欧洲和美国甲状腺腺瘤的高发性，可估计有400万-500万人的甲状腺受到这种基因组改变的影响。定位克隆表明19q13断裂点为150kb片段，并对该簇区域的可能靶基因进行了一些详细研究(Belge等，Cytogenet.Cell Genet.93，(2001)，48-51；Rippe等，Genes ChromosomesCancer 26(1999)，229-236)。然而，19号染色体长臂与人基因组的其它区域相比显示出极高的基因密度，并且迄今为止认为只有蛋白质编码基因是这些高频结构染色体异常的靶标。

尽管对于染色体异常相关肿瘤的治疗投入了很多研究，但是这种类型的肿瘤尤其是甲状腺腺瘤仍然难以诊断并有效治疗，表明对于该疾病的诊断、治疗和预防仍需提高。

发明内容

本发明部分基于甲状腺腺瘤特异性指纹两个微小RNA(miRNA)基因群，即C19MC和miR-371-3的鉴定，这两个miRNA染色体重排断裂点区域附近，并相对于正常对照细胞一致性激活。

因此，本发明包括诊断对象是否患有肿瘤或具有发生肿瘤风险的方法，所述肿瘤优选涉及染色体重排，所述方法包括测定来自对象的受试样品中的至少一种微小RNA(miR)的水平。受试样品中miR水平相对于对照样品中对应miR水平的改变，表明对象患有所述肿瘤或有发生所述肿瘤的风险。

在特定方面，本文提供了诊断对象是否患有甲状腺的肿瘤或瘤样病变或者具有发生甲状腺的肿瘤或瘤样病变风险的方法，所述方法包含测定来自对象的受试样品中至少一种RNA(miR)水平。受试样品中miR水平相对于对照样品中对应miR水平的改变尤其是增加表明对象患有甲状腺的肿瘤或瘤样病变或者有发生甲状腺的肿瘤或瘤样病变的风险。

在另一特定方面，本文提供一种方法，其包括鉴定miR表达和肿瘤或发生所述肿瘤倾向的相关性的方法，所述肿瘤优选与染色体重排尤其是染色体易位相关，包括：(a)对分离自具有或怀疑具有疾病或病症的对象样品的miR进行标记；(b)将miR与miR阵列杂交；(c)测定与阵列杂交的miR；和(d)鉴定疾病或病症代表性样品中miR相对参照物的差异表达。

在一个特定方面，本文提供了包括鉴定miR表达和肿瘤相关性的方法，所述肿瘤优选关于19号染色体尤其是染色体带19q13重排，包括测定来自对象受试样品中至少一种微小RNA(miR)的水平。受试样品中miR水平相对于对照样品中对应miR水平的改变，尤其是增加，表明对象患有所述肿瘤或有发生所述肿瘤的风险。

通常，本发明的方法包含检测受试样品中至少一种miR水平，其中所述miR是或属于位于染色体重排尤其是染色体易位相关断裂点区域附近的miR群。

在一个特定方面，本文提供了鉴定miR差异表达的方法，包括产生样品中miR概况，并评价miR概况以确定样品中miR相对于对照样品中是否差异表达。在某些实施方式中，所述miR概况选自C19MC群和/或miR-371-3群中的一个或多个miR，如表3所示。miR概况优选自miR-371-3群中的一个或多个miR。

在一个特定方面，所述染色体重排相关肿瘤是一种或多种甲状腺的肿瘤或瘤样病变，尤其是甲状腺腺瘤。在一个特定方面，所述miR概况选自表3中所示的一种或多种miR，据此将甲状腺腺瘤细胞与正常细胞区分。

在具体实施方式中，所述miR概况包含选自miR-512-5p、miR-517a、miR-519a、miR-520c、miR-371-3p、miR-372和miR-373的至少一种miR，其中一种或多种miRNA相对于正常样品的表达差异则表明甲状腺腺瘤。

在一个特定方面，本文提供了方法，其中hsa-mir-371、hsa-miR-371-3p、hsa-miR-371-5p、hsa-miR-372、hsa-miR-373、hsa-miR-373^*、hsa-mir-512-1、hsa-miR-512-5p、hsa-miR-512-3p、hsa-mir-512-2、hsa-miR-512-5p、hsa-miR-512-3p、hsa-mir-515-1、hsa-miR-515-5p、hsa-miR-515-3p、hsa-mir-515-2、hsa-miR-515-5p、hsa-miR-515-3p、hsa-mir-516a-1、hsa-miR-516a-5p、hsa-miR-516a-3p、hsa-mir-516a-2、hsa-miR-516a-5p、hsa-miR-516a-3p、hsa-mir-516b-1、hsa-miR-516b、hsa-miR-516b^*、hsa-mir-518b、hsa-miR-517a、hsa-miR-517^*、hsa-miR-517b、hsa-miR-517^*、hsa-mir-517c、hsa-miR-517^*、hsa-mir-518a-1、hsa-miR-518a-5p、hsa-miR-518a-3p、hsa-mir-518a-2、hsa-miR-518a-5p、hsa-miR-518a-3p、hsa-miR-518b、hsa-miR-518c、hsa-miR-518c^*、hsa-mir-518d、hsa-miR-518d-5p、hsa-miR-518d-3p、hsa-miR-518e、hsa-miR-518e^*、hsa-mir-518f、hsa-miR-518f^*、hsa-mir-519a-1、hsa-miR-519a、hsa-miR-519a^*、hsa-mir-519a-2、hsa-mir-519b、hsa-miR-519b-5p、hsa-miR-519b-3p、hsa-mir-519c、hsa-miR-519c-5p、hsa-miR-519c-3p、hsa-miR-519d、hsa-mir-519e、hsa-miR-519e、hsa-miR-519e^*、hsa-mir-520a、hsa-miR-520a-5p、hsa-miR-520a-3p、hsa-miR-520b、hsa-mir-520c、hsa-miR-520c-5p、hsa-miR-520c-3p、hsa-mir-520d、hsa-miR-520d-5p、hsa-miR-520d-3p、hsa-mir-520e、hsa-miR-520f、hsa-miR-520g、hsa-miR-520h、hsa-mir-521-1、hsa-mir-521-2、hsa-miR-521、hsa-mir-522、hsa-miR-522^*、hsa-mir-523、hsa-miR-523^*、hsa-mir-524、hsa-miR-524-5p、hsa-miR-524-3p、hsa-mir-525、hsa-miR-525-5p、hsa-miR-525-3p、hsa-mir-526a-1、hsa-miR-526a、hsa-mir-526a-2、hsa-mir-526b、hsa-miR-526b^*、和/或hsa-miR-527；(参见表1)相对于正常样品的表达升高表明甲状腺腺瘤。

在本发明方法的一些实施方式中，优选具有染色体重排的肿瘤与对象中一种或多种预后标记物相关。例如，甲状腺腺瘤的预后标记物7三体性。此外，国际申请WO2003/093310，WO2002/083727和WO2001/027265中描述了甲状腺肿瘤和瘤样病变的分子诊断标记物，即核酸序列和蛋白质，将其公开内容纳入本文参考文献。

在一个特定方面，本文提供了抑制优选与染色体重排相关肿瘤细胞增殖的方法，包括：

(i)在细胞中引入一种或多种试剂，所述试剂抑制与对照细胞相比在具有染色体重排的肿瘤细胞中诱导或升高的一种或多种miR的表达或活性；并且

(ii)将所述细胞维持于某条件之下，所述条件下一种或多种试剂抑制miR的表达或活性，从而抑制肿瘤细胞的增殖。

在具体实施方式中，所述细胞是人细胞.

在一个特定方面，本文提供一种方法，其中miR-371-3p、miR-372和miR-373表达上调，并且具有作为共同推定靶标的肿瘤抑制基因LATS2或其它参与控制细胞增殖的基因，其在优选与染色体重排相关的肿瘤如甲状腺肿瘤，即甲状腺腺瘤中下调。

在一个特定方面，本文提供了调节肿瘤细胞中C19MC群中一种或多种miR和/或miR-371-3群中至少一种miR的方法，所述肿瘤细胞优选是相对正常组织涉及染色体重排的肿瘤，所述方法包括给予有效量的试剂以减少或抑制山松(pumilio)同源物1(PUM1)基因的表达，该基因在某些例子中与其过表达相关；参加实施例4。

本领域技术人员熟知多种用于测定至少一种miR水平的技术。在一个实施方式中，使用Northern印记分析测定至少一种miR的水平。在另一实施方式中，受试样品中的至少一种miR水平高于对照样品中对应的miR。

本发明还提供了在对象中诊断与一种或多种预后标记物有关的肿瘤的方法，包括测定来自对象肿瘤样品中的至少一种miR的水平，其中相对对照样品中对应miR的改变尤其是增加，表明对象患有一种或多种预后标记物相关的肿瘤。在一个实施方式中，通过对来自对象的受试样品的RNA进行反转录以提供靶寡脱氧核苷酸集合；将靶寡脱氧核苷酸与包含miR-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交提供受试样品的杂交概况；并且将受试样品的杂交概况与对照样品产生的杂交概况比较，从而测定至少一种miR的水平。至少一种miR的信号改变表明对象具有此类肿瘤或有发生此类肿瘤的风险。在一个实施方式中，所述预后标记物包含反向预后标记物，如克隆性细胞遗传学异常，例如具有7三体性和结构改变尤其是关于染色体带19q13的克隆性染色体异常。

本发明还包含治疗对象中肿瘤的方法，其中至少一种miR的信号相对于产生于对照样品的信号被解除调控(如上调)。

本发明还包括通过对来自对象的受试样品的RNA进行反转录以提供靶寡脱氧核苷酸集合；将靶寡脱氧核苷酸与包含miR-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交提供受试样品的杂交概况；并且将受试样品的杂交概况与对照样品产生的杂交概况比较，从而诊断对象是否患有一种或多种反向预后标记物相关肿瘤或是否有发生该肿瘤的风险的方法。信号的改变尤其是增加表明对象患有肿瘤或有发生肿瘤的风险。

本发明还包括对患有肿瘤对象进行治疗的方法，所述对象肿瘤的肿瘤细胞中至少一种miR相对对照细胞上调。当肿瘤细胞中至少一种miR上调时，所述方法包括给予对象至少一种有效量的化合物以抑制至少一种miR的表达，从而抑制对象中肿瘤细胞的增殖。

在相关的实施方式中，本发明提供了治疗对象中肿瘤的方法，包括：相对于对照细胞测定肿瘤细胞中至少一种miR的量；并且通过给予对象有效量的至少一种分离的miR以改变肿瘤细胞中miR的表达量，如果肿瘤细胞中miR表达量高于对照细胞中的miR表达量，从而抑制了对象中肿瘤细胞的增殖。

本发明还提供了治疗肿瘤的药物组合物，包括至少一种miR表达抑制剂化合物和药学上可接受的运载体。更具体的说，本发明涉及一种治疗罹患优选与染色体重排相关肿瘤的对象的药物组合物，所述组合物包含能够抑制属于位于染色体重排断裂点区附近miR群的至少一种miR的表达，或者降低miR的量或活性水平的化合物；以及任选的药学上可接受的运载体。通常，该待治疗对象已根据本发明的方法诊断患有肿瘤。

在其它实施方式中，本发明提供了发现肿瘤的抗肿瘤剂的方法，所述方法包括向细胞提供测试试剂，并检测在具有染色体重排的肿瘤细胞中表达水平升高相关的至少一种miR的水平，其中细胞中miR水平相对于合适对照细胞的下降表明所述测试试剂是抗肿瘤剂。

在另一实施方式中，本发明涉及用于诊断对象是否患有肿瘤或有发生肿瘤风险的本发明方法所用试剂盒；用于本发明的方法包括鉴定miR表达和优选与染色体重排相关肿瘤的相关性；或用于本发明方法鉴定本文所述抗肿瘤剂，所述试剂盒包含用于检测一种或多种miR的一种或多种试剂。

在一个具体方面，如本文所公开的，至少一种miR选自C19MC群和/或miR-371-3群。在一个特定实施方式中，所述miR选自miR-512-5p、miR-517a、miR-519a、miR-520c、miR-371-3p、miR-372和miR-373。

在一个具体方面，优选与染色体重排，即染色体易位，具体说是关于19q13.4的平衡易位有关的肿瘤是人瘤样病变，更具体说是人上皮肿瘤，如甲状腺腺瘤、间充质肿瘤或淋巴瘤。

在一个具体方面，本文还提供了对于miRNA的鉴定，所述miRNA的表达与特定甲状腺肿瘤即甲状腺腺瘤的生物病理学特征相关，如组织类型，包囊性生长以及无侵袭性，以及在碘充足区高发。

在优选实施方式中，本发明的方法包含同时分别分析和靶向miR群，尤其是C19MC群和/或miR-371-3群，更优选由所述C19MC和miR-371-3群任一或两者编码的一种或多种微小RNA。

在另一特定方面，本文还公开了通过控制miR激活和过表达的机制来改变miR表达的方法，例如通过下调PUM1启动子或其它干扰融合转录物的表达、稳定性、降解等，所述融合转录物位于PUM1外显子/内含子序列和来自19号染色体的序列，具体是C19MC群和/或miR-371-3群的接近部分之间。本领域技术人员了解调节PUM1表达的组合物和方法，尤其是与编码PUM1的核酸分子杂交的寡核苷酸化合物，如美国专利申请号2005/0261217A1所述，将其整体纳入本文参考文献。

通过下文对于优选实施方式和实施例的详细描述，配合附图，本领域技术人员将了解本发明的各种目的和优势。

附图简要说明

本发明和申请文献包含一张或多张彩图和/或一张或多张照片。可向欧洲专利局和美国专利商标局申请并付费获得本专利或专利申请公开文本的彩图和/或照片拷贝。

图1：含两个miRNA群C19MC和miR-371-3的染色体区19q13.4的图示。垂直箭头表示良性甲状腺肿瘤中常见的约150kb的断裂点群(BPC)。miR-512-1(前-miR)编码成熟-miR-512-5p，miR-371(前-miR)编码成熟-miR371-3p。基因符号指下列蛋白质编码基因：ZNF331＝锌指蛋白331，DPRX＝分歧成对相关同源框(divergent-paired related homeobox)，NLRP12＝NLR家族，含热蛋白结构域的蛋白12(pyrin domain containing 12)。

图2：细胞系和原发性肿瘤中miR-520c、miR-371-3p、miR-372和miR-373的表达。实时PCR测定miRNA的相对表达(三次独立实验的平均值±s.d.)。相对RNU6B(RNA，U6小核2)对miRNA的值进行归一化(A)甲状腺细胞系中miR-520c的表达，来自于腺瘤的五种细胞系具有9q13.4重排(S141.2，S290.1，S121，S211，S40.2)(黑色柱)和三株甲状腺腺瘤细胞系具有其它结构重排(S533，S325，S270.2)(白色柱)。(B)三个非瘤样病变甲状腺组织样品(Th1，Th2，Th3)(白色柱)，19q13.4重排的五个腺瘤(S801，S849，S842，S846，S814)(黑色柱)和没有细胞遗传学可检测异常的五个腺瘤(S805，S806，S889，S920，S925)(白色柱)中miR-520c表达。(C)三个非瘤样病变的甲状腺组织样品(黑点柱(miR-371-3p)，斜条纹柱(miR-372)和横条纹柱(miR-373))，19q13.4重排的五个腺瘤(黑色柱(miR-371-3p)，大方块柱(miR-372)和小方块柱(miR-373))和没有细胞遗传学可检测异常的五个腺瘤(黑点柱，斜条纹柱和横条纹柱)中miR-371-3的表达(参见表2中的病例数字)。(D)甲状腺细胞系中miR-371-3的表达，五株细胞系来自于19q13.4重排的腺瘤(黑色柱(miR-371-3p)，大方块柱(miR-372)和小方块柱(miR-373))，三株细胞系来自具有其它结构重排的甲状腺腺瘤(黑色点柱(miR-371-3p)，斜条纹柱(miR-372)和横条纹柱(miR-373))(参见表2中的病例数字)。高变异s.d.由极高的Ct值引起。

图3：细胞系S40.2中t(1；19)(p35.2；13.4)易位所得衍生1号染色体上的融合基因的基因组组成。详细图示说明了细胞系S40.2中发现的融合转录物PUM1-FUS-19q-I(Genbank登录号GQ334687)和PUM1-FUS-19q-II(Genbank登录号GQ334688)的来源。1p35.2中的PUM1基因组区域在10号外显子后与19q 13.4中的C19MC的基因组区域融合。两根垂直柱分别表示选择性剪切来源的PUM1-FUS-19q-I和PUM1-FUS-19q-II中PUM1的1-10号外显子后的3′-序列。3′-RACE-PCR(PUM1-FUS-19q-I)或RT-PCR(PUM1-FUS-19q-II)实验可检测融合转录物。定量的miRNA的名字突出表示。

图4：用RT-PCR进行miR-517a表达分析。进行PCR，然后用4％小DNA琼脂糖进行分析。预计的DNA片段大小为62bp，使用超低范围梯(Ultra lowrange Ladder)(富酶泰斯(Fermentas))作为标准品(M)。泳道1：S40.2，2：S40.2无逆转录酶(-RT)，3：S121，4：S121-RT，5：甲状腺(正常)，6：甲状腺-RT，7：胎盘，8：胎盘-RT，9：S270.2，10：S270.2-RT，11：S290.1，12：S290.1-RT，13：S141.2，14：S325，15：S211，16：S211-RT，17：胎儿RNA，18：成人睾丸，19：胎儿RNA-RT，20：S141.2-RT，21：成人睾丸-RT，22：S325-RT(参见表1中关于细胞系和肿瘤的详情)。

图5：细胞系S40.2中t(1；19)(p35.2；13.4)易位所得衍生1号染色体上的融合基因的基因组组成。详细图示说明了细胞系S40.2中发现的融合转录物PUM1-FUS-19q-I(Genbank登录号GQ334687)和PUM1-FUS-19q-II(Genbank登录号GQ334688)的来源。1p35.2中的PUM1基因组区域在10号外显子后与19q13.4中的C19MC的基因组区域融合。两根垂直柱分别表示选择性剪切来源的PUM1-FUS-19q-I和PUM1-FUS-19q-II中PUM1的1-10号外显子后的3′-序列。3′-RACE-PCR(PUM1-FUS-19q-I)或RT-PCR(PUM1-FUS-19q-II)实验可检测融合转录物。定量的miRNA的名字突出表示。

图6：细胞系S40.2的部分核型。部分G-带核型显示染色体1和19及其t(1；19)(p35.2；q13.4)衍生物。

图7：中期FISH描绘PUM1断裂点。使用覆盖1p35.2中PUM1全基因组序列的两个交叠BAC克隆RP11-201O14和RP11-1136E4进行FISH后细胞系S40.2中期的部分。RP11-201O14和RP11-1136E4分离表明1p35.2断裂点位于PUM1内部。由于der(1)上RP11-1136E4的剩余信号弱，所以断裂点位于RP11-201O14远端的RP11-1136E4内。

图8：miR-371-3p相对表达。实时PCR测定miR-371-3p的相对表达(三次独立实验的平均值±s.d.)。Ct值相对miR-103归一化。

图9：miR-372相对表达。实时PCR测定miR-372的相对表达(三次独立实验的平均值±s.d.)。Ct值相对miR-103归一化。

图10：miR-373相对表达。实时PCR测定miR-373的相对表达(三次独立实验的平均值±s.d.)。Ct值相对miR-103归一化。

图11：miR-520c.3p相对表达。实时PCR测定miR-520c-3p的相对表达(三次独立实验的平均值±s.d.)。Ct值相对miR-103归一化。

图12：miR-371-3p相对表达。实时PCR测定miR-371-3p的相对表达(三次独立实验的平均值±s.d.)。Ct值相对miR-103归一化。显示在括号中的是绒毛染色体核型。

图13：miR-372相对表达。实时PCR测定miR-372的相对表达(三次独立实验的平均值±s.d.)。Ct值相对miR-103归一化。

图14：miR-373相对表达。实时PCR测定miR-373的相对表达(三次独立实验的平均值±s.d.)。Ct值相对miR-103归一化。

图15：miR-520c-3p相对表达。用实时PCR检测两个甲状腺腺瘤组织(一个没有19q13.4重排(S925)和一个含有19q13.4重排(S958))、一株来自19q 13.4重排甲状腺腺瘤的细胞系(S40.2)，以及8个不同培养的绒膜绒毛(第一和/或第二代)(三次独立实验的平均值±s.d.)。Ct值相对miR-103归一化。

发明详述

本发明关于miRNA制备和表征的组合物和方法，以及miRNA在肿瘤治疗、预后和诊断应用中的用途，所述肿瘤由于染色体重排尤其是染色体易位引起。

本发明基于并通过甲状腺腺瘤进行说明，该肿瘤在碘缺乏地区是常见高发性肿瘤。在甲状腺腺瘤中常见19q13.4染色体带重排，使其成为人上皮肿瘤中最常见的特异性染色体易位(Belge等，Cancer Genet.Cytogenet.101(1998)，42-48)。两个微小RNA(miRNA)基因群即C19MC和miR-371-3位于这些染色体重排断裂点区域附近。干细胞相关的微小RNA miR-520c和miR-373是这些群中的成员，并参与体内外上皮细胞的侵袭性生长(Huang等，Nat.Cell Biol.10(2008)，202-210)。

Calin等2002评论了关于微小RNA在肿瘤发生中作用的观点，并在2004发现了染色体重排中的断裂点与微小RNA编码基因任务之间的关系(Calin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(2002)，15524-15529；Calin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)，2999-3004)。此外，还描述了细胞原癌基因即c-myc由于其接近miRNA座位而被激活(Calin等(2004)，如前述；Gauwerky等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)，8867-8871)。然而，尽管已经发现染色体重排中断裂点和miRNA基因位置之间的吻合，但是迄今没有发现或猜想易位引起致癌微小RNA活化的易位的例子；参见例如，Calin和Croce，J.Clin.Invest.117(2007)，2059-2066。

本发明范围内进行的实验惊人的揭示了，通过染色体带19q13.4重排，C19MC和miR-371-3群都一致性活化，从而划定了甲状腺腺瘤的一类独特的分子亚型。鉴于人瘤样病变中重排的频发，本发明人的观点是两个群的激活是人瘤样病变的更常见表型，并且miR表达的改变同样在其它染色体重排相关肿瘤中显著。

因此本发明关于一种诊断对象是否患有优选与染色体重排相关的肿瘤或是否有发生该肿瘤风险的方法，所述方法包括测定来自该对象的受试样品中至少一种微小RNA(miRNA)的水平，其中相对对照样品中的对应miR水平，该受试样品中miR水平的存在或升高表明该对象患有所述肿瘤或有发生所述肿瘤的风险。

此外，本发明还关于一种治疗罹患优选与染色体重排相关肿瘤的对象的药物组合物，所述组合物包含能够抑制前述权利要求任一中所定义或本文定义，更具体是表1所述的至少一种miR的表达，或者降低miR的量或活性水平的化合物；以及任选的药学上可接受的运载体。

此外，本发明涉及抑制优选与染色体重排相关肿瘤细胞增殖的方法，包括：

(i)在细胞中引入一种或多种试剂，所述试剂抑制与对照细胞相比优选在具有染色体重排的肿瘤细胞中诱导或升高的一种或多种miR的表达或活性；并且

(ii)将细胞维持于某条件之下，所述条件下一种或多种试剂抑制miR的表达或活性，从而抑制肿瘤细胞的增殖。

本发明公开的每一并且任何方法、工艺和/或用途的肿瘤对象是良性或恶性肿瘤，也在本发明范围内。在一个实施方式中，所述肿瘤是甲状腺肿瘤或甲状腺增生，乳腺恶性肿瘤，种系良性或恶性肿瘤，或卵巢癌。

而且，本发明涉及诊断或确定胎盘病症和/或怀孕失调的方法，其中所述方法包括测量来自对象的受试样品中至少一种微小RNA(miR)的水平，其中受试样品中的miR水平相对对照样品中对应miR水平的出现或升高，表明对象患有或具有发生所述胎盘病症和/或怀孕失调相关病症的风险。在本发明一个实施方式中的miR本发明公开的miR，优选属于miR群的miR，据此优选miR群选自C19MC群和miR-371-3群，更优选表1中的miR。在一个实施方式中，胎盘病症和/或怀孕失调选自先兆子痫，胎儿宫内发育迟缓，胎盘痣及其它。在另一实施方式中，所述方法用于诊断胎儿染色体异常的诊断。在一个更优选的实施方式中，所述染色体异常是X-染色体丢失或21三体性。

本发明还涉及一种发现肿瘤的抗肿瘤剂的方法，所述方法包括向细胞提供测试试剂，并检测优选具有染色体重排的肿瘤细胞中表达水平升高相关的至少一种miR的水平，其中细胞中miR水平相对于合适对照细胞的下降表明所述测试试剂是抗肿瘤剂。

此外，本发明涉及用于本发明方法的试剂盒，所述方法关于优选具有染色体重排的肿瘤的诊断以及抗肿瘤剂的鉴定，因此包含一种或多种用于检测本文所述一种或多种miR的试剂。

本领域技术人员了解检测miR存在的方法，并且如Cissell KA，Deo SK(2009)微小RNA检测趋势(Trends in microRNA detection)Anal BioanalChem 394：1109-1116所述，或者通过miRNA-FISH的方法，例如使用锁定核酸(LNA)探针，参见Nuovo GJ，Elton TS，Nana-Sinkam P，Volinia S，CroceCM，Schmittgen TD.微小RNA前体和成熟形式的组合原位分析与推测靶点相关性的方法(A methodology for the combined in situ analyses of theprecursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putativetargets).Nat Protoc.2009；4(1)：107-15，或者Song R，Ro S，Michaels JD，ParkC，McCarrey JR，Yan W.许多X连锁微小RNA逃离减数分裂性染色体失活(Many X-linked microRNAs escape meiotic sex chromosome inactivation).NatGenet.2009年4月；41(4)：488-93.2009年3月22日电子公开；或通过Northern印记的方法，参见Valoczi A，Hornyik C，Varga N，Burgyan J，Kauppinen S等(2004)使用LNA修饰寡核苷酸探针通过northern印记分析对微小RNA进行敏感并特异性的检测(Sensitive and specific detection ofmicroRNAs by northern blot analysis using LNA-modified oligonucleotideprobes).Nucleic Acids Res 32：e175。

至于C19M群，应当了解的是首次描述是Bentwich I，Avniel A，Karov Y，Aharonov R，Gilad S，等(2005)数百种保守和非保守微小RNA的鉴定(Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs).Nat Genet 37：766-770，首次称作C19MC是Lehnert S，Van Loo P，Thilakarathne PJ，Marynen P，Verbeke G等(2009)人微小RNA和Alu-重复之间共进化的证据(Evidence for co-evolution between human microRNAs andAlu-repeats).PLoS ONE 4：e4456。

除非另有说明，本文术语“癌症”和“肿瘤”互换使用。

本文互换使用的术语“miR”、“微小RNA”、“miR”或“miRNA”指来自miR基因的未加工的或加工的RNA转录物。因为miR不翻译成蛋白质，因此“miR”不包括蛋白质。未加工的miR基因转录物也称作“miR前体”并且通常包括长度约70-100个核苷酸的RNA转录物。通过RNA酶消化将miR前体加工成(例如，切酶，Argonaut，或RNA酶111，如大肠杆菌RNA酶111)19-25个核苷酸的活性RNA分子。该19-25个核苷酸的活性RNA分子也称作“加工的”miR基因转录物或“成熟”miRNA。应当理解的是本文所用术语“miR”包括一种或多种miR-寡核苷酸，包括成熟miR，前-miR，原-miR(pri-miR)或miR种子序列。在某些实施方式中，还可使用各种miR核酸的混合物。在某些实施方式中，还可对miR修饰增强递送。

miRNA(miR)信息可获自桑格研究所(Sanger Institute)，该研究所维护miRNA注册信息http:/microrna.sanger.ac.uk/sequences/.(参见Griffiths-JonesS等，“miRBase：微小RNA基因组工具”(miRBase：tools for microRNAgenomics.NAR 2008 36(数据库卷)：D154-D158；Griffiths-Jones S等，“miRBase：微小RNA序列，靶点和基因命名法”(miRBase：microRNAsequences，targets and gene nomenclature.)NAR 2006 34(数据库卷)：D140-D144，或者Griffiths-Jones S.，“微小RNA注册”(The microRNARegistry)，NAR 2004 32(数据库卷)：D109-D111.)。miRBase序列数据库包括多种来源的公开miRNA的核苷酸序列和注释。miRBase注册信息提供了新miRNA基因的特有名称，合乎新miRNA公开前的常规命名法。同样miRBase靶点是动物中的预测miRNA靶点的资源。

19-25个核苷酸的活性RNA分子可通过天然加工途径(如使用完整细胞或细胞裂解物)或通过合成加工途径(如使用分离的加工酶，如分离的切酶、Argonaut、或RNA酶111)获自miR前体。应当理解的是19-25个核苷酸的活性RNA分子也可通过生物或化学合成直接产生，而无需从miR前体加工而来。

本发明包括诊断对象患有或有发生肿瘤风险的方法，包括检测来自对象的受试样品中至少一种miR的水平，并将受试样品miR水平与对照样品中对应miR水平进行比较。如本文所用“对象”可以是任何患有或怀疑患有染色体重排相关肿瘤的哺乳动物，尤其在19号染色体的翻译中；参见其它实施例。在具体实施方式中，所述对象是患有或怀疑患有肿瘤的人。表1中列举了本发明方法和试剂盒中优选的miR：

表1：C19MC和miR371-3群的微小RNA

术语mirBase acc#代表所示序列在miRBase数据库中的登录号。miRBase数据库是包含公开的miRNA序列和注释的搜索型数据库。网址是http://www.mirbase.org/.(参见Griffiths-Jones S等，“miRBase：微小RNA基因组工具”(miRBase：tools for microRNA genomics.NAR 2008 36(数据库卷)：D154-D158；Griffiths-Jones S等，“miRBase：微小RNA序列，靶点和基因命名法”(miRBase：microRNA sequences，targets and gene nomenclature.)NAR 2006 34(数据库卷)：D140-D144，或者Griffiths-Jones S.，“微小RNA注册”(The microRNA Registry)，NAR 2004 32(数据库卷)：D109-D111.)。

上述所示序列也包含于附件序列表中的SEQ ID NO：1-121中，SEQ IDNO：1是hsa-mir-371，SEQ ID NO：2是hsa-miR-371-3p等。

可从获自对象的生物样品的细胞中测量至少一种miR的水平。例如，通过常规活检技术从染色体重排相关肿瘤的疑似对象中获取组织样品。此类组织样品形成一个或所述受试样品。在另一实施例中，从对象中获得血液样品，通过标准技术从白细胞中分离DNA，优选形成一个或所述受试样品。优选在放疗、化疗或其它治疗开始之前从对象中获得血液或组织样品。称作一个或所述正常样品的对照样品，如对应对照组织或血液样品可获自对象的未受影响的组织，获自正常人个体或正常人群，或来自对象样品中大多数细胞所对应的培养细胞。然后将对照样品，如一个或所述对应的组织或血液样品与来自对象的样品一起处理，以便比较从对象样品细胞中给定miR基因产生的miR水平与对照样品细胞中对应的miR水平。本步骤适用于本文公开的使用受试样品、正常样品或对照样品的每一和任何方法、工艺或用途。

获自对象样品中miR水平相对于对照样品中对应miR水平的改变，即增加表明对象存在肿瘤。根据本发明，受试样品中至少一种miR的水平高于对照样品中对应的miR水平(即miR的表达“上调”)。当来自对象的细胞或组织样品中miR的量高于对照细胞或对照组织样品中相同miR的量，则如本文所用，miR表达“上调”。可用关于一种或多种RNA表达标准品来测定对照或正常样品中miR的相对基因表达。标准品可包括，例如，零miR基因表达水平，标准细胞系中的miR基因表达水平，或之前获自正常人对照群体的miR基因表达平均水平。适用于本文所述的每一和任何方法、工艺或用途。

可使用适用于检测生物样品中RNA表达水平的任何技术测定样品中miR的水平。本领域技术人员熟知生物样品的细胞中RNA表达水平的测定合适技术(如Northern印记分析，RT-PCR，原位杂交)；参见实施例。在具体实施方式中，使用Northern印记分析检测至少一种miR的水平。例如，在核酸抽提缓冲液存在下匀浆细胞得到总细胞RNA，然后离心。沉淀核酸，用DNA酶和沉淀去除DNA。根据标准技术在琼脂糖凝胶上分离RNA分子并转移到硝基纤维素滤纸上。通过加热将RNA固定在滤纸上。使用与所研究RNA互补的合适标记的DNA或RNA探针完成特定RNA的检测与定量；参见例如，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratorv Manual)，J.Sambrook等编，第二版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)，1989，第7章，将其整体纳入本文参考文献。这适用于本文所述的每一和任何方法、工艺或用途。

可从给定miR的核酸序列中产生适用于给定miR进行northern印记杂交的探针。制备标记的DNA和RNA探针的方法，及其与靶核酸序列杂交条件参见《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratorv Manual)，J.Sambrook等编，第二版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)，1989，第7、11章，将其整体纳入本文参考文献。

例如，核酸可通过如放射性核素标记，如³H、³²P、³³P、¹⁴C或³⁵S；通过重金属标记，或能够用作标记配体特异性结合对的配体(如生物素、亲和素或抗体)、荧光分子、化学发光分子、酶等进行标记。

通过缺口平移法(Rigby等，J.Mol.Biol.113(1977)，237-251)或随机引物法(Feinberg等，Anal.Biochem.132(1983)，6-13)，对探针进行高特异性标记，将其整体纳入本文参考文献。后者是从单链DNA或RNA模板中合成高特异性³²P-标记探针的选用方法。例如，根据缺口平移法用高放射性核苷酸取代已经存在的核苷酸，可能制备活性超过10⁸cpm/mg的特异性³²P-标记的核酸探针。

然后将杂交滤纸暴露于成像胶片可以进行放射自显影检测。将暴露于杂交滤纸的成像胶片进行灰度扫描提供了测定miR基因转录物水平的准确方法。通过另一方案，使用计算机成像系统对miR基因转录物水平进行定量，如安玛西亚生物科学公司的分子动态400-B 2D磷成像仪(MolecularDynamics 400-B 2D Phosphorimager available from Amersham Biosciences)，新泽西州皮斯卡塔韦。

当放射性核素标记DNA或RNA探针无法实施时，可使用随机引物法将同系物产物探针分子，如dTTP同系物5-(N-(N-生物素基-ε-氨基己酰基)-3-氨基烯丙基)脱氧尿苷三磷酸掺入探针分子。生物素标记的探针寡核苷酸可通过与生物素结合蛋白质，如与荧光染料或产生颜色反应的酶偶联的亲和素，链酶亲和素和抗体(如抗-生物素抗体)发生反应进行检测。

除了Northern和其它RNA杂交技术，还可用原位杂交技术完成RNA转录物水平的检测。该技术相比Northern印记所需细胞更少，包括将全细胞置于显微镜盖片上，用包含放射性或其它标记的核酸(如cDNA或RNA)探针的溶液探测细胞中的核酸含量。该技术尤其适合分析来自对象的组织活检样品。原位杂交的操作详述参见美国专利号5,427,916，将其整体纳入本文的参考文献。可从核酸序列中产生给定miR的原位杂交的合适探针。该原位杂交适用于本文所述的每一和任何方法、工艺或用途。

与本文公开的每一和任何方法、工艺或用途相关，可通过将miR基因转录物反转录，然后使用聚合酶链反应(RT-PCR)扩增反转录的转录物从而进行细胞中miR基因转录物相对数量的检测。miR基因转录物水平可通过与内标作比较进行定量，内标例如同一样品中“管家”基因的mRNA水平。合适用作内标的“管家”基因包括如5S rRNA、U6snRNA或tRNA。本领域技术人员了解定量RT-PCR及其各种变形的方法。

在本文公开的方法、工艺或用途的一些例子中，可能需要同时检测样品中多种不同miR的表达水平。在本发明公开的方法、工艺或用途的其它一些例子中，可能需要检测所有已知肿瘤相关mi R基因转录物的表达水平。对数百种miR基因的肿瘤特异性表达水平进行评价耗费时间并且需要大量的总RNA(每次Northern印记需要至少20pg)以及需要放射性同位素的放射性显影技术。

为了克服这些限制，可以微芯片的形式(即微阵列)构建包含对miR基因集合特异性的探针寡脱氧核苷酸集合的寡核苷酸文库。使用该微阵列，可通过将RNA反转录产生靶寡脱氧核苷酸集合，然后将其与微阵列上的探针寡脱氧核苷酸杂交产生杂交或表达概况，从而检测生物制品中多个微小RNA的表达水平。然后将受试样品中的杂交概况与对照样品中的进行比较，从而确定哪种微小RNA在肿瘤中的表达水平发生改变。适用于本文所述的每一和任何方法、工艺或用途。

如本文所用“探针寡核苷酸”或“探针寡脱氧核苷酸”指能够与靶寡核苷酸杂交的寡核苷酸。

“靶寡核苷酸”或“靶寡脱氧核苷酸”指需要(如通过杂交)检测的分子。

通过“miR-特异性探针寡核苷酸”或“对miR具有特异性的探针寡核苷酸”指具有与特定miR杂交或与特定miR的反转录物杂交的所选序列的探针寡核苷酸。

特定样品的“表达概况”或“杂交概况”实际上是样品状态的指纹；当两种状态可能具有任何表达相似的特定基因时，同时对多种基因进行评价从而产生细胞状态独特的基因表达概况。也就是说，正常细胞区分于肿瘤细胞，并且在肿瘤细胞中，可确定不同的预后状态(例如长期生存方面好或坏)。通过对不同状态肿瘤细胞表达概况的比较，获得有关这些状态中哪一基因重要(包括上调和下调的基因)的信息。

在一个实施方式中，如本文优选使用的术语“染色体重排”指一条或多条染色体的非同源重排，例如受到染色体易位、倒位或中间缺失的影响。

优选通过经典细胞遗传学方法或分子细胞遗传学方法检测染色体重排，包括但不限于：原位杂交。

如本文优选使用的术语染色体重排相关肿瘤在一个实施方式中指，至少一些肿瘤细胞表现或显示此类染色体重排。

在本文优选使用的术语，结果“表明”对象，如患有肿瘤指该结果提供了对象患有肿瘤的证据。

鉴定在肿瘤细胞或正常细胞中差异表达的序列，以及造成不同预后结果的差异表达，该信息具有多种用途。例如，可评价特定的治疗方案(如以确定化疗药物作用是否改善特定病人的长期预后)。

同样，通过将病人样品与已知表达概况进行比较，进行诊断或确认。而且，这些基因表达概况(或单独基因)可进行候选药物的筛选，所述药物候选物抑制所述肿瘤表达概况，或者将差预后概况转化为好预后概况。

因此，本发明提供了诊断对象是否患有本文所定义的肿瘤或具有发生肿瘤风险的方法，包括将来自对象受试样品的RNA进行反转录以提供靶寡脱氧核苷酸集合，将寡脱氧核苷酸与含有miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供受试样品的杂交概况，并将受试样品的杂交概况与来自对照样品的杂交概况进行比较，其中至少一种miRNA的信号发生改变尤其是升高时，则表明对象患有肿瘤或有发生肿瘤的风险。

在一个实施方式中，所述微阵列包含C19MC和miR-371-3群中大部分的miRNA-特异性探针寡核苷酸。

可从已知miRNA序列中产生的基因特异性寡核苷酸探针中制备微阵列。对于每一miRNA所述阵列可包含两种不同的寡核苷酸探针，一种包含活性成熟的序列，另一种对于miRNA前体具有特异性。所述阵列也可包含对照，如与人同源序列有数个碱基差异的一种或多种小鼠序列，可作为杂交严谨性条件的对照。也可将来自于两个物种的tRNA印于微阵列上，提供内部相对稳定的进行特异性杂交的阳性对照。微阵列上还可包含一种或多种合适的非特异性杂交的对照。出于该目的，根据不出现与任何已知miRNA的同源性进行序列选择。

使用本领域已知技术制造微阵列。例如，合适长度，如40个核苷酸的探针寡核苷酸在C6位置进行5′-胺修饰，并用市售微阵列系统，如基因机器(GeneMachine)OmiGrid^TM 100微阵列器和安玛西亚(Amersham)CodeLink^TM活化载片进行印刷。使用标记的引物通过将靶RNA反转录制备与靶RNA对应的标记的cDNA。在第一链合成后，将RNA/DNA嵌合物变性以降解RNA模板。由此制备的标记的靶cDNA在杂交条件下与微阵列芯片杂交，如6X SSPE/30％甲酰胺25℃18小时，然后在0.75X TNT 37℃洗涤40分钟。在阵列上固定探针DNA识别样品中的互补靶cDNA的位置发生杂交。标记的靶cDNA标记阵列上结合发生的准确位置，从而进行自动检测和定量。输出信息由一系列的杂交事件组成，表明特定cDNA序列的相对丰度，因此表明病人样品中对应互补miR的相对丰度。根据一个实施方式，标记的cDNA寡聚物是生物素标记的从生物素引物制备的cDNA。然后使用如链酶亲和素-Alexa647耦合物直接检测含生物素的转录物对微阵列进行处理，并使用常规方法进行扫描。阵列上每一点的图像强度与病人样品中对应的miR丰富成比例。

阵列的使用对于miRNA表达检测具有多个优势。首先，可在一个时间点鉴定数百个基因的全局表达。第二，通过仔细设计寡核苷酸探针，成熟和前体分子均可进行鉴定。第三，与Northern印记分析相比，芯片需要小量的RNA，并可使用2.5pg的总RNA得到可重复的结果。由于miRNA数目相对有限(每个物种几百个)，可使用针对每一物种的独特寡核苷酸探针制作针对多个物种的通用微阵列。该工具可在不同条件下对每一已知miR的跨物种表达进行分析。

除了用于特定miR的定量表达水平实验，包含对应C19MC和miR-371-3群中大部分成员，优选其整个miR组的miRNA-特异性探针寡核苷酸的微芯片可用于进行miR基因表达概况研究，用于分析miR表达的模式。独特的miR指纹与确定的疾病标记物相关，或直接与疾病状态相关。

根据本文所述表达概况分析方法，来自肿瘤疑似对象样品的总RNA进行定量反转录以获得与样品中RNA互补的标记的靶寡脱氧核苷酸集合。然后将靶寡脱氧核苷酸与含有miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交获得样品的杂交概况。结果是样品的杂交概况，其代表样品中miRNA的表达模式。杂交概况包含样品中靶寡脱氧核苷酸与微阵列上miRNA-特异性探针寡核苷酸结合的信号。可将概况记录为出现或没有结合(信号与零信号)。更优选的是，所记录的概况包括每一杂交的信号强度。将概况与正常即非肿瘤性的对照样品的杂交概况进行比较。信号的改变表示对象中存在肿瘤。

上文中有关使用能够抑制本文公开并分别定义的至少一种miR的表达的化合物治疗肿瘤患病对象的内容同样适用于治疗患有或有发生本文所述的胎盘和/或怀孕失调风险的对象。其适用于各药物组合物。

本领域技术人员还了解其它用于测定miR基因表达的技术，并且包括测定RNA转录和降解速率的各种技术。

本文所用术语“治疗”指改善疾病或病症相关的症状，例如肿瘤，包括防止或延迟疾病症状的发作，和/或减轻疾病或病症症状的严重性或发生频率。本文定义的术语“对象”和“个体”包括动物，如哺乳动物，包括但不限于：灵长类、奶牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、豚鼠、大鼠、小鼠或其它牛、羊、马、犬、猫、啮齿类或鼠类物种。在优选实施方式中，所述动物是人。

在本发明治疗方法的一个实施方式中，将有效量的至少一种抑制miR表达的化合物给予对象。如本文所用“抑制miR表达”指治疗后miR的活性成熟形式的产量比治疗前的产量要少。使用例如上文所述诊断方法中用于确定miR转录物水平的技术，本领域技术人员易于测定肿瘤细胞中miR的表达是否受到抑制。抑制可发生于基因表达水平(即通过抑制miR编码基因的转录)或加工水平(如通过抑制miR前体加工为成熟活性的miR)。

如本文所用抑制miR表达的化合物的“有效量”指足以在罹患肿瘤相关染色体特征相关性肿瘤的对象中抑制肿瘤细胞增殖的量。本领域技术人员易于通过考虑以下因素确定给予给定对象的miR表达抑制化合物的有效量，这些因素是，如对象的大小和体重、疾病侵入程度、年龄、健康状况以及性别；给药途径，以及给药是局部还是全身性的。

例如，表达抑制化合物的有效量可基于治疗对象大约或估计的体重。如本文所述，该有效量可经肠道外或经肠道等途径给予。例如，给予对象的表达抑制化合物的有效量范围从约5-3000微克/千克体重，约700-1000微克/千克体重，或高于1000微克/千克体重。

本领域技术人员易于确定给予给定对象的抑制miR表达化合物的合适给药方案。例如可一次性给予对象表达抑制化合物(如单次注射或沉积)。或者，可在一定时期内每天一次或两次向对象给予表达抑制化合物，所述一定时期约3-28天，更优选约7-10天。在一个特定的给药方案中，每天一次给予表达抑制化合物共给七天。当给药方案包含多次给药时，应理解的是给予对象的表达抑制化合物的有效量可包含在整个给药方案中给予化合物的总量。

抑制miR基因表达的合适化合物包括双链RNA(如短或小干扰RNA或siRNAn)、反义核酸和酶RNA分子，如核酶。这些化合物的每种可靶向给定的miR，并破坏或诱导靶miR的破坏。

例如，利用分离的双链RNA(“dsRNA”)分子诱导miR基因的RNA干扰，可抑制给定miR基因的表达，所述双链RNA与miR至少一部分具有至少90％，如至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同源性。在具体实施方式中，所述dsRNA分子是“短或小干扰RNA”或“s iRNA”。

本方法所用的siRNA包括长约17-29个核苷酸，优选长约19-25个核苷酸的短双链RNA。siRNA包含通过标准沃森-克里克碱基对相互作用退火在一起的正义RNA链和互补反义RNA链(下文中称为“碱基配对”)。正义链包含与靶miR所含核酸序列基本相同的核酸序列。

如本文所用，siRNA包含的与靶mRNA所含的靶序列“基本相同的”核酸序列是指与靶序列相同的核酸序列，或者与靶序列有一个、两个或更多核苷酸不同，只要该s iRNA分子仍能介导RNA干扰。siRNA的正义和反义链包含两条互补的单链RNA分子，或者包含单个分子，其中两个互补部分是碱基配对的，并且由单链“发夹”区域共价连接。

通过加入、删除、取代和/或改变一个或多个核苷酸，还可将siRNA改变为不同于天然产生的RNA。此类改变可包括加入非核苷酸材料至siRNA末端或至siRNA的一个或多个内部核苷酸，或者修饰使siRNA具有核酸酶消化抗性，或者用脱氧核糖核酸取代siRNA中的一个或多个核苷酸。

siRNA的一条或两条链还可包括3′突出端。如本文所用“3′突出端”指RNA双链体结构的3′端延伸出至少一个未配对的核苷酸。因此，在某些实施方式中，所述siRNA包含长约1-6个核苷酸、长约1-5个核苷酸、长约1-4个核苷酸、长约2-4个核苷酸的3′突出端(包含核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)。在具体实施方式中，所述3′突出端出现于siRNA的两条链，长为2个核苷酸。例如，siRNA的每条链包含双胸腺嘧啶核苷酸(“TT”)或双尿嘧啶核苷酸(“UU”)3′突出端。

通过化学或生物学方法产生siRNA，或从重组质粒或病毒载体中表达产生，如国际申请WO 2009/033140中关于分离的miR的描述，将其公开内容整体纳入本文参考文献。产生并测试dsRNA或siRNA分子的示例性方法参见美国公开专利申请号2002/0173478A1，以及美国公开专利申请号2004/0018176A1，将其公开内容整体纳入本文参考文献。

反义核酸也可抑制给定miR基因的表达。如本文所用“反义核酸”指与靶RNA结合的核酸分子，所述结合通过RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-肽核酸相互作用的方式实现，其改变靶RNA的活性。适用于本方法的反义核酸是通常包含与miR中毗连核酸序列互补的核酸序列的单链核酸(如RNA、DNA、RNA-DNA嵌合体、PNA)。反义核酸可包含与miR中毗连核酸序列50-100％互补，75-100％互补，或95-100％互补的核酸序列。本文提供了miR的核酸序列。不受制于任何理论，认为反义核酸激活消化miR/反义核酸双链体的RNA酶H或其他细胞核酸酶，

反义核酸还可包含对于核酸主链或糖和碱基部分(或其等价物)的修饰，以增强靶点特异性、核酸酶抗性、递送或其他分子效能相关属性。此类修饰包括胆固醇部分，双链体嵌入剂如吖啶，或一种或多种核酸酶抗性基团。

可通过化学或生物学方法产生反义核酸，或从重组质粒或病毒载体中表达，如关于分离的miR所述。本领域技术人员了解生产和测试的示例性方法；参见如Stein和Cheng，Science 261(1993)，1004，以及美国专利号5,849,902，将其整体纳入本文做参考。

最近化学修饰的反义寡核苷酸(ASO)作为工具用于使微小RNA(miRNA)功能化，常报道ASO抑制后miRNA水平降低以显示效能。例如，Berger等在In Vitro.Biol.Anim.41(2005)，12-18中描述了在果蝇S2细胞中用2′-o-甲基寡核苷酸抑制miRNA的表达。此外，Davies等在NucleicAcids Res.37(2009)，70-77中描述了体内不降解的基于ASO的强效微小RNA抑制剂，将两个文献公开的内容纳入本文参考文献。根据本发明使用相似的方法分别抑制染色体重排相关miRNA，如miR-371-3和C19MC群的那些miRNA的表达和活性。

酶核酸也可抑制给定miR基因的表达。如本文所用“酶核酸”指含有底物结合区的能够特异性切割miR的核酸，该底物结合区与miR毗连核酸序列互补。酶核酸底物结合区域与miR中的毗邻核酸序列例如50-100％互补，75-100％互补或95-100％互补。酶核酸还可包含碱基、糖和/或磷酸基团上的修饰。本方法所用示例性酶核酸是核酶。

可通过化学或生物学方法产生酶核酸，或从重组质粒或病毒载体中表达，如关于分离的miR所述。产生并测试酶核酸即核酶的示例性方法参见Werner和Uhlenbeck，Nucl.Acids Res.23(1995)，2092-2096；Hammann等，Antisense und Nucleic Acid Drug Dev.9(1999)，25-31；Steinecke等，EMBO J.11(1992)，1525-1530；Steinecke等，Gene 149(1994)，47-54，以及美国专利号4,987,071，将其公开内容整体纳入本文参考文献。

抑制miR基因表达的另一组化合物称作抗miR(antagomiR)，参见例如，Krützfeldt J等(Krützfeldt J等，(2005)使用“抗miR”体内沉默微小RNA(Silencing of microRNAs in vivo with′antagomirs′).Nature 438(7068)：685-689)。

给予至少一种抑制miR表达的化合物，抑制罹患肿瘤相关染色体特征相关性肿瘤的患者中肿瘤细胞的增殖。如本文所用，“抑制肿瘤细胞的增殖”指杀死细胞，或永久或暂时阻滞或减缓细胞的生长。当给予miR基因表达抑制化合物后对象体内此类细胞数保持恒定或减少，则推断肿瘤细胞增殖受到抑制。如果此类细胞绝对数目增加，但是肿瘤生长速度降低，则也推断肿瘤细胞增殖受到抑制。

可直接测量对象体内的肿瘤细胞数目，或者从原发或转移肿瘤块的大小进行估测。例如，通过免疫组织学方法、流式细胞术或其它检测肿瘤细胞表面标记物的方法测量对象中肿瘤细胞的数目。

使用任何适于将化合物递送至对象肿瘤细胞的途径向对象给予miR基因表达抑制化合物。例如，通过适合将这些化合物或包含这些化合物编码序列的核酸转染对象细胞的方法给予miR表达抑制化合物。在一个实施方式中，用包含编码至少一种miR基因表达抑制化合物的序列的质粒或病毒载体转染细胞。

本领域熟知真核细胞的转染方法，如直接将核酸注射进入细胞的核或者原核，电穿孔，脂质体转移或亲脂性材料介导的转移，受体介导的核酸递送，生物射弹或颗粒加速，磷酸钙沉淀或病毒载体介导的转染。

例如，使用脂质体转移化合物转染细胞，如DOTAP(N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲铵硫酸二甲酯，罗氏诊断公司罗氏应用科学部，诺瓦德2，德国彭茨贝格82372(Roche Diagnostics GmbH，Roche AppliedScience，Nonnenwald 2，82372 Penzberg，Germany))或等价物，如LIPOFECTIN。核酸的用量对于本发明的实践不重要，使用0.1-100微克核酸/10⁵个细胞可得到可接受的结果。例如，10⁵细胞可使用含0.5微克质粒载体的3微克DOTAP。

可通过合适的经肠道或胃肠道外给药途径给予对象miR基因表达抑制化合物。本方法合适的经肠道给药途径包括如，口服、直肠或鼻内递送。合适的肠外给药途径包括，例如，血管内注射(例如，静脉注射，静脉滴注，动脉推注，动脉输注和导管灌注到血管)，组织周围和组织内注射(例如，瘤周及瘤内注射，视网膜内注射，或视网膜下注射)；皮下注射或放置，包括皮下输液(如通过渗透泵)，直接应用到感兴趣的组织，例如，通过导管或其它安置设备(例如，视网膜颗粒或栓剂或植入具有多孔，无孔或胶状物质)；以及吸入。尤其合适的给药途径是注射、输注和静脉内给予病人。

在本发明中，可将miR表达抑制化合物以裸露RNA的形式、与递送试剂组合形式，或以包含表达miR表达抑制化合物序列的核酸(如重组质粒或病毒载体)形式给予对象。合适的递送试剂包括如，Mirus Transit TKO亲脂性试剂；脂质转染试剂、脂质转染胺试剂(lipofectamine)；细胞转染试剂(cellfectin)；聚阳离子(如聚赖氨酸)和脂质体。

本文讨论了包含表达miR基因表达抑制化合物的序列的重组质粒和病毒载体，以及用于将此类质粒和载体递送到肿瘤细胞的技术。

在具体实施方式中，用脂质体将miR基因表达抑制化合物(或包含它们的编码序列的核酸)递送至对象。脂质体也可以延长核酸的血液半衰期。标准囊泡形成脂类可形成适用于本发明的脂质体，所述脂类通常包括中性或带负电的磷脂和甾醇，如胆固醇。选择脂类需要考虑的因素如所需的脂质体大小以及在血流中脂质体的半衰期。多种脂质体制备方法为人所知，例如Szoka等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9(1980)，467；美国专利号4,235,871，4,501,728，4,837,028和5,019,369，将其整体纳入本文作为参考文献。

用于本方法的脂质体包括将脂质体靶向肿瘤细胞的配体分子。优选肿瘤细胞中常见受体的结合配体，如与肿瘤细胞抗原结合的单克隆抗体。

可将本方法使用的脂质体修饰以避免被单核巨噬细胞系统(“MMS”)和网状内皮系统(“RES”)清除。此类修饰的脂质体在脂质体结构的表面具有或在脂质体结构内部掺有调理抑制部分。在尤其优选的实施方式中，本发明的脂质体包含调理抑制部分和配体。

用于制备本发明脂质体的调理抑制部分通常是与脂质体膜结合的大的亲水性聚合物。如本文所用，调理抑制部分与脂质体膜“结合”指调理部分通过脂溶性锚插入膜本身，或通过与膜脂活性基团的直接结合，以化学或者物理方式附着于膜。这些抑制调理的亲水聚合物形成保护性的表层，显著性降低了MMS和RES对于脂质体的摄取，例如美国专利号4,920,016所述，将其整体纳入本文作为参考文献。

适用于修饰脂质体的调理抑制部分优选数均分子量约500-40,000道尔顿，更优选约2,000-20,000道尔顿的水溶性聚合物。这种聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)的衍生物，例如，甲氧基聚乙二醇或PPG，PEG或PPG硬脂酸酯；合成聚合物，如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；线性、分支或树枝状聚酰胺-胺；聚丙烯酸；多元醇，例如化学连接有羧基或氨基的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神经节苷脂，如神经节苷脂GM1等。适用的还有PEG、甲氧基PEG、甲氧基PPG，或其衍生物的共聚物。此外，所述调理抑制聚合物可以是PEG和聚氨基酸、多糖、聚酰胺-胺、聚乙烯胺或聚核苷的嵌段共聚物。调理抑制聚合物也可以是含有氨基酸或羧酸，例如半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、褐藻酸、卡拉胶的天然多糖；胺基多糖或寡糖(线性或分支)或羧基化的多糖或寡糖，例如，与碳酸衍生物反应产生羧基连接的多糖或寡糖。优选调理抑制部分是PEG、PPG或其衍生物。PEG或PEG衍生物修饰的脂质体有时称作“PEG化脂质体”。

通过数种已知技术中任一种，可将调理抑制部分与脂质体膜结合。例如，PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯可结合于磷脂酰-乙醇胺脂可溶性锚，然后与膜结合。同样，在60℃用Na(CN)BH₃和溶剂混合物，如以30∶12比例混合的四氢呋喃和水，通过还原胺化，使用硬脂胺脂溶性锚对葡聚糖聚合物进行衍生化。

调理抑制部分修饰的脂质体在循环中停留的时间长于未修饰的脂质体。出于此因，此类脂质体有时称作“隐形”脂质体。已知隐形脂质体蓄积在由多孔或“渗漏”的微血管喂养的组织中。因此，以此类微血管缺陷为特征的组织，例如实体瘤，将有效蓄积这些脂质体；参见Gabizon等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，18(1988)，6949-6953。此外，RES摄取减少通过显著阻滞脂质体在肝脏和脾脏的蓄积从而降低了隐形脂质体的毒性。因此，用调理抑制部分修饰的脂质体尤其适于将miR基因表达抑制化合物(或包含其编码序列的核酸)递送至肿瘤细胞。

在给予对象之前，根据本领域已知技术可将miR基因表达抑制化合物配制成药物组合物，有时称为“药物”。因此，本发明涵盖治疗肿瘤的药物组合物。在一个实施方式中，所述药物组合物包含至少一种分离的miR表达抑制化合物。在具体实施方式中，所述至少一种miR基因表达抑制化合物对于在肿瘤细胞中的表达高于对照细胞的miR基因具有特异性。

本发明的药物组合物的特征在于至少是无菌无热源的。如本文所用“药物制剂”包括人用和兽用的制剂。本领域技术人员了解制备本发明药物组合物的方法，例如《雷明顿药物科学》，第十七版，马克出版公司，宾夕法尼亚州伊斯顿(1985)(Remington′s Pharmaceutical Science，17th ed.，MackPublishing Company，Easton，Pa.(1985))以及《雷明顿：药学科学及实践》更新版(2000)，宾夕法尼亚科学大学(update version Remington：The Scienceand Practice of Pharmacy(2000)by the University of Sciences in Philadelphia)，ISBN 0-683-306472所述，将其整体纳入本文参考文献。

本药物制剂包括至少一种miR基因表达抑制化合物(或至少一种包含其编码序列的核酸)(如0.1-90％重量)，或其生理可接受的盐，并与药学可接受运载体混合。本发明的药物制剂还可包含至少一种miR基因表达抑制化合物(或至少一种包含其编码序列的核酸)，所述化合物被脂质体和药学可接受运载体所包裹。

尤其适合的药学可接受的运载体是水、缓冲水、生理盐水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。

在具体实施方式中，本发明的药物组合物包含至少一种miR基因表达抑制化合物(或至少一种包含其编码序列的核酸)，所述化合物对于核酸酶降解耐受。本领域技术人员易于合成对于核酸酶耐受的核酸，例如通过将一个或多个2′位修饰的核糖核苷酸掺入miR。合适的2′-修饰核糖核苷酸包括用氟、氨基、烷基、烷氧基和0-烯丙基在2′位修饰的那些。

本发明的药物组合物还可包含常规的药物赋形剂和/或添加剂。合适的药物赋形剂包括稳定剂、抗氧化剂、渗透压调节剂、缓冲剂和pH调节剂。合适的添加剂包括，例如，生理生物相容性缓冲剂(例如，盐酸氨丁三醇)、螯合添加剂(例如DTPA或DTPA双酰胺)或钙螯合络合物(例如钙DTPA、CaNaDTPA-双酰胺)，或者任选的钙或钠盐添加剂(例如，氯化钙、抗坏血酸钙、葡萄糖酸钙或乳酸钙)。本发明的药物组合物可包装为液体形式使用，或被冻干。

对于本发明的固体药物组合物，可使用传统的无毒固体药学上可接受的运载体，例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。

例如，口服给药的固体药物组合物可包含任何上述运载体和赋形剂和10-95％，优选25％-75％的至少一种miR基因表达抑制化合物(或至少一种包含其编码序列的核酸)。气溶胶(吸入)给药的药物组合物可包含0.01-20％重量，优选1％-10％重量的至少一种miR基因表达抑制化合物(或至少一种包含其编码序列的核酸)和推进剂，所述化合物包装于上述脂质体中。还可根据需要包括运载体，如用于鼻内递送的卵磷脂。

本发明还包括鉴定抗肿瘤剂的方法，包括将受试试剂给予细胞，并测量细胞中至少一种miR的水平。在一个实施方式中，所述方法包括将受试试剂给予细胞，并测定在肿瘤细胞中表达水平升高的至少一种miR的水平。相对合适的对照细胞，细胞中miR水平降低，表明受试试剂是抗肿瘤剂。

合适的试剂包括但不限于药物(如小分子、肽)和生物大分子(如蛋白质、核酸)。可通过重组、合成或从天然资源中分离(即纯化)等方式产生所述试剂。本领域熟知将此类试剂给予细胞的多种方法(如转染)，上文中也描述了多种此类方法。本领域还熟知检测至少一种miR表达的方法(如Northem印记、原位杂交、RT-PCR，表达概况分析)。

本发明的说明书和实施例中公开并涵盖了这些和其它实施方式。其它关于本发明所用的任一材料、方法、用途和化合物的文献可使用(例如)电子设备从公共图书馆和数据库中获取。例如可使用公共数据库“Medline”，该数据库由国立卫生院的国家生物技术信息中心和/或国家药物图书馆主办。本领域技术人员了解其它数据库和网址，也可使用互联网搜索引擎获得，如欧洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute)(EBI)的数据库和网址，该研究所是欧洲分子生物学实验室(European Molecular Biology Laboratory)(EMBL)的一部分。Berks，TIBTECH 12(1994)，352-364中给出了生物技术专利信息的概览，以及用于追溯检索和目前认知的相关专利信息来源的调查。

以上内容在总体上描述了本发明。除非另有说明，本文明所用术语的定义参见1997年牛津大学出版社出版，2000年修订，2003年重印的《牛津生化和分子生物学辞典》(Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology)，ISBN 0 19 850673 2。本说明书文本中通篇引用了多个文档。在此将所有引用文献的内容(包括本申请通篇引用的参考文献，已授权专利，公开的专利申请，以及厂商的说明书，指南等)明确纳入本文作参考；然而，不承认引用的任何文件确实是本发明的现有技术。

参照以下具体实施例可获得更全面的理解，所述实施例仅用于说明的目的，不意在对本发明的范围构成限制。

实施例

下列实施例进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明的范围。在引用的文献中可找到常规方法的详述，如本文使用的那些，也可参见默克诊疗手册(The Merck Manual of Diagnosis and Therapy)第七版，Beers和Berkow，默克公司(Merck and Co.，Inc.)。除非另有说明，本发明的实施将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，它们均在本领域技术范围内。

分子遗传学和遗传工程方法通常参见最新版本的《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，(Sambrook等(1989)《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港实验室出版社Cold Spring Harbor Laboratory Press)；《DNA克隆》(DNA Cloning)，第1、2卷(Glover等，1985)；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis)(Gait等，1984)；《核酸杂交》(Nucleic Acid Hybridization)(Hames和Higgins编，1984)；《转录和翻译》(Transcription And Translation)(Hames和Higgins编，1984)；《动物细胞培养》(Culture Of Animal Cells)(Freshney和Alan，Liss公司，1987)；《哺乳动物细胞中的基因转移载体》(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)(Miller和Calos编)；《分子生物学最新实验方法以及分子生物学简便方法》(Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in MolecularBiology)，第三版，(Ausubel等编)；以及《重组DNA方法学》(Wu编，科学出版社)。《哺乳动物细胞基因转移载体》(Gene Transfer Vectors For MammalianCells)(Miller和Calos编，1987，冷泉港实验室)；《酶学方法》，第154、155卷(Wu等编)；《固化细胞和酶》(Immobilized Cells And Enzymes)(IRL出版社，1986)；Perbal，《分子克隆实践指南》(A Practical Guide To Molecular Cloning)(1984)；论文，《酶学方法》(the treatise，Methods In Enzymology)(科学出版社，纽约)；《细胞和分子生物学的免疫组织学方法》(Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology)(Mayer和Walker编，科学出版社，伦敦，1987)；《实验免疫学手册》，I-IV卷(Handbook Of Experimental Immunology，VolumesI-IV)(Weir和Blackwell编，1986)。本公开文本中提及的用于遗传操作的试剂、克隆载体和试剂盒可购自商品供应商，如伯乐公司(BioRad)，斯查塔基公司(Stratagene)，英骏公司(Invitrogen)和克隆泰克公司(Clontech)。细胞培养和培养基收集的通用技术参见：“大规模哺乳动物细胞培养”(Large ScaleMammalian Cell Culture)(Hu等，Curr.Opin.Biotechnol.8(1997)，148)；“无血清培养基”(Kitano，Biotechnology 17(1991)，73)；“大规模哺乳动物细胞培养”(Large Scale Mammalian Cell Culture)(Curr.Opin.Biotechnol.2(1991)，375)；以及“哺乳动物细胞悬浮培养”(Suspension Culture of Mammalian Cells)(Birch等，Bioprocess Technol.19(1990)，251)；“从cDNA阵列中提取信息”(Extractinginformation from cDNA arrays)，Herzel等，CHAOS 11(2001)，98-107。

补充材料和方法

在引用文献中可见常规方法的详述，如本文所用的那些。

组织和细胞系

所有样品获自不来梅圣约瑟夫斯蒂夫特普通内脏外科部(Departmentof General and Visceral Surgery of the St.Joseph Stift，Bremen)(德国)的进行甲状腺切除的病人。项目的批文获自当地伦理委员会，并遵守赫尔辛基宣言(第25段)中关于人对象的医学研究的守则。每个肿瘤的一块存储于汉克斯(Hank′s)溶液用于细胞培养，第二块存储于液氮中用于基因表达分析。来源于甲状腺腺瘤细胞的细胞系如前所述(Belge等，J.Cell Biol.Int.Rep.16，(1992)339-347)。来自胎儿、胎盘和睾丸组织的存储RNA作为对照。

细胞培养和细胞遗传学分析

根据如前所述进行组织消化、原代细胞系培养和细胞遗传学分析(Belge等，Cancer Genet.Cytogenet.101(1998)，42-48；Roque等，Cancer Genet.Cytogenet.67(1993)，1-6)。消化前，将每个样品依附于载片上得到用于FISH筛查的样品。

RNA分离，反转录和实时PCR(qRT-PCR)定量

根据厂商指南，用Trizol(英骏公司，德国卡尔斯鲁厄)或mirVana(安苄公司，美国伍德沃德)(Ambion，Woodward，USA)miRNA抽提试剂盒抽提组织和永生化细胞系的总RNA。根据厂商指南，用TaqMan微小RNA RT试剂盒和Taqman微小RNA实验中的基因特异性RT引物(应用生物系统公司，美国加州福斯特城)(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)从10ng的总RNA中产生miRNA(miR-371-3p、miR-372、miR-373和miR-520c)和RNU6B(RNA，U6小核2；相对定量的内部对照)-特异性cDNA。在热循环仪上孵育该反应，16℃30分钟，42℃30分钟，85℃5分钟，然后存储于4℃。所有的反转录包括无模板对照和负RT对照(-RT)。使用miRNA和RNU6B-特异性探针和TaqMan通用PCR预混试剂((应用生物系统公司，美国加州福斯特城))在应用生物系统7300快速实时PCR系统上进行实时PCR。将96孔板中的反应孵育，95℃10分钟、然后95℃15秒和60℃1分钟进行40个循环。所有反应一式三份进行。使用应用生物系统SDS软件基于RQ＝2^-ΔΔCt方法(Livak等，Methods 25(2001)，402-408)进行相对定量。将Ct数据相对内部对照RNU6B进行归一化(Yu等，Cancer cell 13(2008)，48-57)。

通过3，RACE-PCR检测融合转录物

在细胞系S40.2上进行3’RACE-PCR。使用RNeasy小抽试剂盒(凯捷公司，德国希尔登)抽提总RNA。使用聚(dT)作为锚定引物对M-MLV逆转录酶稍作修改进行cDNA合成(英骏公司，德国卡尔斯鲁厄)。如Gene Racer试剂盒(英骏公司，德国卡尔斯鲁厄)(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)所述，调整条件适用于GoTaq Flexi DNA聚合酶(普洛麦格公司，德国曼海姆)(Promega，Mannheim，Germany)，进行3’RACE-PCR和巢式3’RACE-PCR。用地高辛-11-dUTP标记的PUM1特异性探针(罗氏诊断，德国彭茨贝格)(Roche Diagnostics，Penzberg，Germany)如Fehr等(Fehr et al.，J.Cancer Genet.Cytogenet.180(2008)，135-139)所述进行Southern印记。切下感兴趣的片段，用QIAquick凝胶抽提试剂盒(凯捷公司，德国希尔登)(Qiagen，Hilden，Germany)抽提，然后克隆入pGEM-T Easy载体(普洛麦格公司，德国曼海姆)(Promega，Mannheim，Germany)。通过QIAprep Spin小抽试剂盒(凯捷公司，德国希尔登)(Qiagen，Hilden，Germany)分离感兴趣克隆的质粒DNA，由德国埃伯斯贝格的欧陆MWG公司进行测序。

用于通过3′RACE-PCR检测融合转录物的引物：

pum1-特异性引物(引物(外显子)序列(5’-3’))：

Ex1_Up(外显子2)CCCTCAAGAACCAGCTAATCCCAACA

Ex3_Up(外显子4)TTCCTGGGTGATCAATGGCGAGA

Ex4_Up(外显子5)TCCCCGGGCGATTCCTGTCT

Ex5_Lo(外显子6)TCCATCACATCACCCTCCTCCTTCAA

Ex7_Up(外显子8)ACCTAATGCGCTTGCTGTCCA

Ex8_Up(外显子9)GCTCCCGCTGCGTTTGTCC

Ex9_Up(外显子10)CAACAGACCACCCCACAGGCTCAG

cDNA合成所用引物(引物序列(5’-3’))：

AP2 AAGGATCCGTCGACATC(T)17

寡聚dT

GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)24

3’RACE-PCR所用引物(引物序列(5’-3’))：

UAP2 CTACTACTACTAAAGGATCCGTCGACATC

基因Racer 3’GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG

基因Racer 3’巢式CGCTACGTAACGGCATGACAGTG

PCR产生的Southern印记PUM1-特异性探针：

1.引物Ex4_Up和Ex5_Lo间的序列

2.引物Ex3_Up和Ex5_Lo之间的序列

引物

Ex3_Up(外显子4)＝TTCCTGGGTGATCAATGGCGAGA

Ex4_Up(外显子5)＝TCCCCGGGCGATTCCTGTCT

Ex5_Lo(外显子6)＝TCCATCACATCACCCTCCTCCTTCAA

通过RT-PCR检测融合转录物

使用polyadq程序(Tabaska等，Gene 231(1999)，77-86)，检测C19MC群的可能性聚A位点。设计附近的引物随后与PUM1-特异性引物配合使用。如前所述用TRIzol试剂(英骏公司，德国卡尔斯鲁厄)(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)抽提S40.2的总RNA用于cDNA合成。使用GoTaq Flexi DNA聚合酶(普洛麦格公司，德国曼海姆)(Promega，Mannheim，Germany)进行PCR，然后进行半巢式PCR。如前所述切下感兴趣的片段并抽提，由德国埃伯斯贝格的欧陆MWG公司进行测序。

用于通过RT-PCR检测融合转录物的引物：

pum1-引物：Ex8_Up    GCTCCCGCTGCGTTTGTCC

pum1-引物：Ex9_Up    CAACAGACCACCCCACAGGCTCAG

#19-引物：500-群_聚A_I  CAACCGTTGGGGATTACAAAATAGA

验证融合转录物

使用融合转录物内部不同的引物确认之前的结果。如上述进行PCR。切下期望大小的片段，抽提并测序(如上)。

用于验证融合转录物的引物

#19-引物：19_1 GGCTGCCCAGGGAGTTGCT

#19-引物：19_2 GCAGAAGCTCCCAGCCAGATCTT

#19-引物：19_3 CTAGGGTTCGCTGTCCTCACACTGC

pum1-引物：Ex8_Up GCTCCCGCTGCGTTTGTCC

pum1-引物Ex9_Up CAACAGACCACCCCACAGGCTCAG

RT-PCR

如Chen等所述设计miR-512-5p、miR-517a和miR-519a的miRNA-特异性引物(Chen等，Nucleic Acids Res.33(2005)，e179)。根据Chen等(2005)(前述)，从1μg总RNA中产生cDNA，小的改动是茎环引物的浓度(5nM)，以及PCR反应的退火温度(68℃)和持续时间(10s)。用GoTaq FlexiDNA-聚合酶(普洛麦格公司，德国曼海姆)(Promega，Mannheim，Germany)进行RT-PCR。72℃延伸15秒。

miRNA-特异性引物

miR-371-5p环引物

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACACTC

miR-371-5p环引物

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGTGCC

miR-372环引物

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACGCTC

miR-373环引物

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACACCC

miR-512-5p环引物

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGAAAGT

miR-517a环引物

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACACTC

miR-520c-3p环引物

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCCTC

miR-520c-5p环引物

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGAAA

miR-371-3p正向ACCGCTAAGTGCCGCCATCTTTTG

miR-371-5p正向GCCGCCACTCAAACTGTGGGG

miR-372正向GGTCATAAAGTGCTGCGACATTTG

miR-373正向TTCATGAAGTGCTTCGATTTTGG

miR-512-5p正向AGTCTACACTCAGCCTTGAGGGCA

miR-517a正向CGGCGGATCGTGCATCCCTTTA

miR-519a正向CCGGCTAAAGTGCATCCTTTTAG

miR-520c-3p正向GCCGCCAAAGTGCTTCCTTTTAG

miR-520c-5p正向ACCGCTCTCTAGAGGGAAGCAC

反向引物：GTGCAGGGTCCGAGGT

荧光原位杂交

在甲状腺肿瘤的印片上进行I-FISH分析。为检测19q13.4重排，使用称作tbpc19(甲状腺断裂群19q13)的双色断裂分离重排探针(潘帕斯公司，布德尔，荷兰)(PanPath，Budel，Netherlands)。重排探针是两种探针的混合物，位置分别远离(3’-tbpc19；Alexa Fluor 488标记)和接近(5’-tbpc19；AlexaFluor555接近)良性甲状腺病变中19q13.4的常见断裂群区域。每张片子使用10μl断裂分离探针。在Mastercycler梯度仪上(艾本德公司，德国汉堡)(Eppendorf，Hamburg，Germany)80℃共变性3分钟，然后在37℃湿盒中过夜杂交，后杂交在0.1xSSC中于61℃进行5分钟。用DAPI(0.75μg/ml)反染出间期的核。用Axioskop 2 plus荧光显微镜(卡尔蔡司公司，德国哥廷根)(Carl Zeiss，

Germany)镜检片子。用AxioCam MRm数字相机照相，并用AxioVision进行分析(卡尔蔡司公司，德国哥廷根)(Carl Zeiss，

Germany)。每一例进行200个非交叠核的评分。共定位信号(绿/红)代表非重排断裂点区，而分离的绿色和红色信号则表明19q 13.4染色体区域重排。根据上述I-FISH在印片上进行S842病例的tbpc-19中期FISH。如Kievits等(Kievits等，Cytometry 11(1990)，105-109)所述进行中期处理。在细胞系S40.2中期制备物上进行染色体1 FISH断裂点的确定。使用两个覆盖PUM1整个基因组序列的交叠克隆RP11-1136E4(AQ707626和AQ733864)和RP11-201O14(AL356320.8)(伊美基公司，德国柏林)(imagenes，Berlin，Germany)作为探针。使用凯捷公司质粒中抽试剂盒(凯捷公司，德国海尔登)抽提DNA。使用地高辛-11-dUTP(RP11-201O14)或生物素-16-dUTP(RP11-1136E4)通过缺口反义标记1μg分离的质粒DNA。如前Kievits等(1990)所述进行中期处理和后续FISH实验，除了如上所述进行共变性和后杂交。

染色体19探针：

PAC13173对应BAC-克隆AC011453.4和AC011487.5。

统计学分析

结果表示为平均值±标准误(SE)。使用非成对斯氏t检验进行统计学比较。p-值小于0.05认为显著。

实施例1：计算机分析表明在甲状腺肿瘤中C19MC和miR-371-3与19q13.4断裂群接近。

约20％具有克隆细胞遗传学紊乱的甲状腺肿瘤显示染色体19q13相关异常(Belge，G等，Cancer Genet.Cytogenet.101(1998)42-48)。迄今为止，通过定位克隆和计算机分析，发现断裂点聚集于150kb(千碱基)的片段内(Belge等，Cytogenet.Cell Genet.93，(2001)，48-51)，与编码miRNA群即C19MC和miR-371-3的基因接近(图4)。具有46个串联重复的灵长类特异性miRNA基因的100kb长的C19MC群占据所有已知人miRNA基因的约8％，使其称为迄今为止发现的最大人miRNA基因群(Bortolin-Cavaille等，Nucleic Acids Res.37(2009)，3464-3473)。Ren等(Ren等，J.Transl.Med.7(2009)，20)预测了该群的4,691个靶点。最近证据表明其miRNA由非蛋白编码Pol-II转录物的内含子编码，其主要在胎盘中表达(Bortolin-Cavaille等(2009)，前述)。与大群相比，miR-371-3群较小，覆盖了约1,050bp的区域，其中编码五个miRNA。两群的miRNA术语共有相似种子序列的miRNA家族(Laurent等，Stem Cells 26(2008)，1506-1516)。值得主意的是，多个研究小组将C19MC以及miR-371-3群成员的表达和人胚胎干细胞(hESC)的miRNA签名特征联系在一起(Ren等(2009)，前述；Laurent等(2008)，前述；Li等，J.Cell.Biochem.106(2009)，1020-1030)。miR-373的首个致癌潜能的证据获自人睾丸种系细胞肿瘤，其中它显示在野生型p53存在的条件下使肿瘤生长(Voorhoeve等，Cell 124(2006)，1169-1181)。在前列腺肿瘤中，尽管miR-373和miR-520c均下调，但可在体外刺激迁移和侵袭(Yang等，Int.J.Clin.Exp.Pathol.2(2009)，361-369)。最近，Huang等(Huang等，Nat.Cell Biol.10(2008)，202-210)能够显示miR-373和miR-520c在体内外通过抑制CD44的表达促进肿瘤侵袭和转移。有趣的是，对于CD44表达定性和定量变化与甲状腺肿瘤的生长和进展相关。因为侵袭行为对于甲状腺肿瘤的差异诊断至关重要，进行实验解释在甲状腺腺瘤中两个miRNA群可能上调的问题。

实施例2：具有19q13异常的腺瘤的C19MC群成员表达水平明显高于没有易位的腺瘤

为了评价甲状腺腺瘤中这两群是否作为19q13易位的可能靶点，使用RT-PCR比较C19MC群中三个成员的表达，即miR-512-5p、miR-517a和miR-519a，其中五株细胞系来自19q13重排的甲状腺腺瘤、三株细胞系来自具有其它克隆性异常的腺瘤；参见表2。

表2：所用组织样品和细胞系

使用来自滤泡状甲状腺肿瘤和细胞系的分析样品的细胞遗传学细节，其遗传学亚组通过常规细胞遗传学和/或中期荧光原位杂交(I-FISH)进行测定，I-FISH使用断裂分离双色重排探针(tbpc-19)。当使用细胞系时，仅给出细胞系来源的原始肿瘤中所发现的克隆性异常。

使用SV40来源的亚基因组片段从原发瘤中建立所有的细胞系。五株具有19q13重排的细胞系中四株表达可检测水平的三种miRNA，而剩下的一株细胞系(S121，表2)以及有其它异常的所有细胞系不表达三种miRNA中的任何一种(图4)。使用这些细胞系通过实时PCR(qRT-PCR)对C19MC群的其它成员，即miR-520c表达进行定量。类似于获自该群其他成员的结果，只在表达miR-512-5P、miR-517A和miR-519A的具有19q 13重排的相同4株细胞系中发现高表达(图5a)，而余下细胞系表达显著较低(p值＝0,001659；详见表3)。

表3：qRT-PCR数据的统计分析

将含有19q13重排的组织或细胞系的群C19MC和miR-371-3来源的miRNA表达与正常甲状腺组织和/或没有19q13重排的腺瘤进行比较，进行统计学分析(t检验，双尾)。用统计软件R获取数据(www.r-proiect.org)。(d.f.＝自由度，t＝斯氏t检验值)。

细胞系S121中所有检测的C19MC群成员的格外低的表达很有可能是因为染色体易位引起的断裂点区该部分缺失所致。为了验证在原发肿瘤中可否获得相似的结果，对细胞培养前的细胞学样品进行中期荧光原位杂交，以便对70例甲状腺节结进行表征。常用常规细胞遗传学对这些结果进行补充。节结FISH筛查发现5个肿瘤具有染色体带19q13克隆性重排(图5)。可见所有19q13重排的甲状腺腺瘤的miR-520表达水平显著高于无19q13重排的样品(p值≤0,003133)(腺瘤和周围甲状腺组织；详见表3)(图5b)。

实施例3：具有19q13异常的腺瘤的miR-371-3群成员的表达水平显著高于无易位的样品

为了观察19q13重排是否也激活了miR-371-3群的表达，在之前使用的相同样品中对该群的三个成员进行定量。19q13重排的所有肿瘤表达的miR-371-3p、miR-372和miR-373的水平显著高于三例周围组织学正常的甲状腺组织(p-值≤0,02236)以及五例细胞遗传学正常的腺瘤(p-值≤0,01428)(图5c)。然后在获得相似结果的细胞系中对miR-371-3p、miR-372和miR-373的表达进行定量(图5d)。有趣的是，C19MC群成员缺失或低表达的S121细胞系显示miR-371-3群的高表达，进一步验证了该细胞系中部分C19MC群缺失的观点。

实施例4：山松(pumilio)同源物1(PUM1)基因近端部分易位激活C19MC和miR-371-3群

为了进一步研究miRNA群活化相关机制，对19q13组中的一个细胞系进行详细研究。该细胞系由于明显的平衡易位t(1；19)(1p35.2；q13.4)表现出染色体带19q13.4易位(图6)。通过合适的BAC(细菌人工染色体)探针，染色体1上的断裂点缩小至山松同源物1(PUM1)内的区域(图7在线)。PUM1编码RNA结合蛋白并在成人组织中广泛表达。其具有22个外显子，覆盖染色体带1p35.2上约150kb(Spassov和Jurecic，Gene 299(2002)，195-204；Szabo等，Genome Biol.5(2004)，R59)。通过该易位，PUM1近端部分的易位变得与miRNA群并列(图6)。因此使用3′RACE-PCR检测PUM1近端部分和来自染色体19之间的可能融合转录物。首先，可能检测PUM1的外显子1-10后随染色体19断裂点区异源序列的融合转录物(提交至GenBankGQ334687)。从该转录物的存在可以得到该细胞系中的染色体断裂位于PUM1的外显子10之内。因此，使用如下位于外显子10之内的序列作为正向引物，进行RT-PCR实验(引物：Ex9_Up(PUM1的外显子10)CAACAGACCACCCCACAGGCTCAG；C19MC之后的引物：500-群_聚A_ICAACCGTTGGGGATTACAAAATAGA)，由此可能检测一个边界延伸至C19MC远端的融合转录物的部分(基因银行登录号GQ334688；图6)。从这些结果来看，可以推测在细胞系S40.2中，两群均变成PUM1启动子驱动的大Pol-II转录物的一部分。由异位Pol-II启动子激活一般是易位激活两个miRNA群的机制，而且契合C19MC群的miRNA明显由大Pol-II驱动转录物“天然”产生和最近的研究结果(Bortolin-Cavaille等，J.Nucleic Acids Res.37，(2009)3464-73)。

实施例5：miR群激活相关染色体易位相关性肿瘤

根据本文进行的组织学研究，没有发现对应肿瘤侵袭的证据可通过定义产生对于滤泡癌的诊断。同样，没有发现与无19q重排的腺瘤相比其它的差异。19q 13.4平衡易位的描述也见于肝脏间叶性错构瘤(MHL)中，这是儿童中罕见的良性肿瘤样病变(Speleman等，Cancer Genet.Cytogenet.40(1989)，29-32)，并且，染色体带19q13断裂常见于多种人瘤样病变的报道(如小细胞肺癌或结肠癌)。而且，根据癌症染色体/Mitelman数据库(NCBI)，染色体带19q 13属于基因组中染色体异常最常影响的区域。因此，仍需确定的是这些(异常)是否也靶向本文研究的的miRNA群之一或两群。。然而，充足的证据表明，在甲状腺上皮内部，两个重要的“胚胎性”miRNA群以及数千种潜在的靶点的再表达是一大亚组甲状腺腺瘤发生的原因。这些miRNA中具有单一靶点的个体与人肿瘤相关，但实际上所观察到的效应最可能来自于全局基因表达的改变，而非对应miRNA单一靶点失去调控。

因此，根据本发明进行的实验使C19MC和miR-371-3群的miR成为上皮肿瘤中高发染色体重排的最有可能的靶基因。而且，这是首次将常见染色体重排分别与miRNA基因或miRNA群的激活相关联的证据。因此，应当谨慎将miR，尤其是属于位于断裂点区附近miR群的那些当作染色体重排相关肿瘤治疗中有价值的诊断和治疗工具。

实施例6：两个干细胞微小RNA基因群C19MC和miR-371-3分别在肿瘤和不同肿瘤细胞系中的表达

根据厂商指南使用QIAGEN miRNEasy小抽试剂盒(凯捷公司，德国希尔登)分离细胞系和肿瘤组织的总RNA。

根据厂商说明书，使用TaqMan微小RNA RT试剂盒和TaqMan微小RNA实验中基因特异性RT引物(应用生物系统公司，美国加州福斯特城)从200ng总RNA中产生miRNA(miR-371-3p、miR-372、miR-373、miR-520c和miR-103)特异性cDNA。miR-103作为相对定量的内源性对照。在热循环仪上孵育该反应，16℃30分钟，42℃30分钟，85℃5分钟，然后存储于4℃。所有的反转录包括无模板对照和负RT对照(-RT)。

使用miRNA特异性探针和TaqMan通用PCR预混试剂(应用生物系统公司，美国加州福斯特城)在应用生物系统7300快速实时PCR系统上进行实时PCR。孵育96孔板中的反应，95℃10分钟、然后95℃15秒和60℃1分钟，进行40个循环。所有反应一式三份进行。

使用应用系统SDS软件基于RQ＝2^-ΔΔCt方法(Livak等，Methods 25(2001)，402-408)进行相对定量。Ct值相对内标miR-103归一化。

在两例甲状腺腺瘤组织(一例没有19q13.4重排(S925)，一例有19q13.4重排(S958))，一株来自于19q13.4重排甲状腺腺瘤的细胞系(S40.2)，以及不同肿瘤来源的细胞系(都没有19q13.4重排)中用qPCR检测两群miRNA的相对表达。

结果

结果见图8-11。

具有19q13.4重排的两例样品(甲状腺腺瘤组织S958以及甲状腺腺瘤来源的细胞系S40.2)中，所有测量的两群的miRNA显示高水平表达。这些miRNA的表达水平在宫颈癌细胞系MRIH-215也略微上升。

实施例7：绒膜绒毛取样获得胎盘细胞的细胞培养物中两种干细胞微小RNA基因群C19MC和miR-371-3的表达

根据厂商指南使用QIAGEN miRNEasy小抽试剂盒(凯捷公司，德国希尔登)分离培养的绒膜绒毛细胞的总RNA。

根据厂商说明书，使用TaqMan微小RNA RT试剂盒和TaqMan微小RNA实验中基因特异性RT引物(应用生物系统公司，美国加州福斯特城)从200ng总RNA中产生miRNA(miR-371-3p、miR-372、miR-373、miR-520c和miR-103)特异性cDNA。miR-103作为相对定量的内源性对照。将反应孵育在热循环仪上孵育该反应，16℃30分钟，42℃30分钟，85℃5分钟，然后存储于4℃。所有的反转录包括无模板对照和负RT对照(-RT)。

使用miRNA特异性探针和TaqMan通用PCR预混试剂(应用生物系统公司，美国加州福斯特城)在应用生物系统7300快速实时PCR系统上进行实时PCR。将96孔板中的反应孵育，95℃10分钟、然后95℃15秒和60℃1分钟进行40个循环。所有反应一式三份进行。使用应用生物系统SDS软件基于RQ＝2^-ΔΔCt方法进行相对定量。Ct值相对内标miR-103归一化。

在两例甲状腺腺瘤组织(一例没有19q13.4重排(S925)，一例有19q13.4重排(S958))，一株来自于19q13.4重排甲状腺腺瘤的细胞系(S40.2)，以及八个不同的培养绒膜绒毛样品(第一和/或第二代)中用qRT-PCR检测两群miRNA的相对表达。

结果

结果参见图12-15。

具有19q 13.4重排的两例样品(甲状腺腺瘤组织S958以及甲状腺腺瘤来源的细胞系S40.2)中，所有测量的两群的miRNA显示高水平表达。

除Fi92之外所有的绒膜绒毛样品中也发现了miR-371-3群miRNA的高水平表达。有趣的是，该样品的细胞遗传学分析显示45，X0核型(特纳氏综合征)(Turner syndrome)。

C19MC群中的miR-520c-3p在所有的绒膜绒毛样品中均高表达，除了在Fi 156和Fi 160(第一、二代)中仅表现出表达水平的略微升高。

本说明书、权利要求书、序列表和/或附图中公开的本发明的特征可以单独或和任何组合形式作为以多种形式实现本发明的材料。

Claims (23)

1.一种诊断对象是否患有优选与染色体重排相关的肿瘤或是否有发生该肿瘤风险的方法，所述方法包括测定来自对象的受试样品中至少一种微小RNA(miRNA)的水平，其中相对对照样品中的对应miR水平，该受试样品中该miR水平的存在或升高表明该对象患有所述肿瘤或有发生所述肿瘤的风险。

2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述染色体重排是易位。

3.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述染色体重排位于19号染色体上。

4.如权利要求3所述方法，其特征在于，所述染色体重排包括染色体带19q13。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述miR是或属于位于断裂点区域附近的miR群。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述miR群是C19MC或miR-371-3群。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，测定所述C19MC群中至少一种miR和所述miR-371-3群中至少一种miR的水平。

8.如权利要求6或7所述方法，其特征在于，所述C19MC群中的miR是hsa-mir-371、hsa-miR-371-3p、hsa-miR-371-5p、hsa-miR-372、hsa-miR-373、hsa-miR-373^*、hsa-mir-512-1、hsa-miR-512-5p、hsa-miR-512-3p、hsa-mir-512-2、hsa-miR-512-5p、hsa-miR-512-3p、hsa-mir-515-1、hsa-miR-515-5p、hsa-miR-515-3p、hsa-mir-515-2、hsa-miR-515-5p、hsa-miR-515-3p、hsa-mir-516a-1、hsa-miR-516a-5p、hsa-miR-516a-3p、hsa-mir-516a-2、hsa-miR-516a-5p、hsa-miR-516a-3p、hsa-mir-516b-1、hsa-miR-516b、hsa-miR-516b^*、hsa-mir-518b、hsa-miR-517a、hsa-miR-517^*、hsa-miR-517b、hsa-miR-517^*、hsa-mir-517c、hsa-miR-517^*、hsa-mir-518a-1、hsa-miR-518a-5p、hsa-miR-518a-3p、hsa-mir-518a-2、hsa-miR-518a-5p、hsa-miR-518a-3p、hsa-miR-518b、hsa-miR-518c、hsa-miR-518c^*、hsa-mir-518d、hsa-miR-518d-5p、hsa-miR-518d-3p、hsa-miR-518e、hsa-miR-518e^*、hsa-mir-518f、hsa-miR-518f^*、hsa-mir-519a-1、hsa-miR-519a、hsa-miR-519a^*、hsa-mir-519a-2、hsa-mir-519b、hsa-miR-519b-5p、hsa-miR-519b-3p、hsa-mir-519c、hsa-miR-519c-5p、hsa-miR-519c-3p、hsa-miR-519d、hsa-mir-519e、hsa-miR-519e、hsa-miR-519e^*、hsa-mir-520a、hsa-miR-520a-5p、hsa-miR-520a-3p、hsa-miR-520b、hsa-mir-520c、hsa-miR-520c-5p、hsa-miR-520c-3p、hsa-mir-520d、hsa-miR-520d-5p、hsa-miR-520d-3p、hsa-mir-520e、hsa-miR-520f、hsa-miR-520g、hsa-miR-520h、hsa-mir-521-1、hsa-mir-521-2、hsa-miR-521、hsa-mir-522、hsa-miR-522^*、hsa-mir-523、hsa-miR-523^*、hsa-mir-524、hsa-miR-524-5p、hsa-miR-524-3p、hsa-mir-525、hsa-miR-525-5p、hsa-miR-525-3p、hsa-mir-526a-1、hsa-miR-526a、hsa-mir-526a-2、hsa-mir-526b、hsa-miR-526b^*、orhsa-miR-527；参见表1。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述肿瘤是甲状腺的肿瘤或瘤样病变。

10.如权利要求9所述方法，其特征在于，所述肿瘤是甲状腺腺瘤。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述肿瘤与对象中一种或多种预后标记物相关。

12.如权利要求11所述方法，其特征在于，所述肿瘤是甲状腺腺瘤并且所述预后标记物是7三体性。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述对象是人。

14.一种检测甲状腺肿瘤亚型的方法，所述亚型的特征在于如权利要求8中所定义的miRNA的表达水平升高，所述方法优选包括检测并任选包括定量测定权利要求8中所定义的miRNA。

15.一种治疗罹患优选与染色体重排相关肿瘤的对象的药物组合物，所述组合物包含能够抑制前述任一项权利要求所定义的至少一种miR的表达，或者降低所述miR的量或活性水平的化合物；以及任选的药学上可接受的运载体。

16.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，已根据权利要求1-14中任一项所述方法对所述对象进行过诊断。

17.如权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述miR是miR-373，并且所述肿瘤是甲状腺的肿瘤或瘤样病变。

18.一种抑制染色体重排相关肿瘤的细胞增殖的方法，包括：

(i)在所述细胞中引入一种或多种试剂，所述试剂抑制与对照细胞相比，在优选具有染色体重排的肿瘤细胞中诱导或升高其表达的一种或多种miR的表达或活性；并且

(ii)将所述细胞维持于某条件之下，所述条件下所述一种或多种试剂抑制所述miR的表达或活性，从而抑制该肿瘤细胞的增殖。

19.一种鉴定肿瘤的抗肿瘤剂的方法，所述方法包括向细胞提供测试试剂，并检测具有染色体重排的肿瘤细胞中表达水平升高相关的至少一种miR的水平，其中所述细胞中miR水平相对于合适对照细胞下降表明所述测试试剂是抗肿瘤剂。

20.如权利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述肿瘤是甲状腺的肿瘤或瘤样病变，并且所述细胞是甲状腺腺瘤细胞。

21.一种用于权利要求1-13或18-20中任一项所述方法的药盒，所述药盒包含用于检测前述权利要求中任一项所定义的一种或多种miR的一种或多种试剂。

22.如权利要求21所述的药盒，其特征在于，所述一种或多种试剂选自前述权利要求中任一项定义的一种或多种miR的特异性引物以及前述权利要求中任一项定义的一种或多种miR的特异性探针。

23.如权利要求17-20中任一项所述的方法或如权利要求21-22中任一项所述的药盒，其特征在于，所述至少一种miR包含miR-512-5p、miR-517a、miR-519a、miR-520c、miR-371-3p、miR-372和/或miR-373。

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