CN102939389A - 基于体细胞获得性重排的诊断方法 - Google Patents
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Abstract
描述了一种监测方法,其包括通过对患者的核酸的全基因组分析鉴定与该患者中的疾病状态相关的体细胞获得性基因组重排,和监测含有所述基因组重排的核酸的水平变化,和/或定量含有所述基因组重排的核酸的水平作为该患者的疾病进展或严重性的标志物。还描述了本发明的监测方法在评估疗法效力中的用途和患者特异性基因组重排作为该患者疾病进展的生物标志物的用途。
Description
背景技术
个体化医疗保健是在未来5-10年中医学的主要目标。为了达到这个目标需要许多进展,包括开发用于测量疾病负荷的灵敏的和特异的生物标志物。
例如,个性化癌症医学取决于个性化诊断的实施。由于癌症其核心是由体细胞突变所驱动的,详细的基因组筛查可能在推进个人的治疗选择中发挥核心作用。随着用于癌症的药物和其他疗法的范围持续增长,存在对疾病负荷的灵敏的和特异的测量手段的不断增长的迫切需要以指导治疗方案。
在血液学恶性肿瘤中,存在通过针对频发基因组重排的测定来常规定量残留疾病水平。白血病与不要求全基因组筛查或开发患者特异性测定的特征性基因组重排相关的发现已使这成为可能。然而在实体瘤中,用于定量疾病负荷的方法较不灵敏和较不特异。常规地使用放射成像对患者分期,但只能检测大于1厘米大小的显而易见的病变,其已代表数百万的癌细胞。血清标志物可以是有帮助的,例如针对前列腺癌的PSA,但对许多肿瘤类型是不可获得的而且经常存在非特异性的问题。循环肿瘤细胞的免疫检测是灵敏的,可在成千的正常细胞中检测到低至一个肿瘤细胞,但其仅检测血液中的细胞而且会导致对表达感兴趣标志物的非恶性细胞的假阳性判断。
肿瘤细胞在坏死或凋亡时释放裸DNA进入血浆,而循环的游离DNA的水平与疾病负荷相关。这可以用于以一些预后值来监测癌基因中的肿瘤特异性点突变或表观遗传变化的水平。然而,在许多情况下源于肿瘤细胞的循环裸DNA的比例是0.01%或更低,而目前的在这一深度辨别单个突变碱基的方法是不能胜任的。因此,基于血浆DNA中点突变或表观遗传变化的现有的策略灵敏性差并缺乏特异性。
本发明解决疾病的检测和监测的问题以支持个人化医疗方法。
发明概述
本发明涉及适合于监测疾病的方法,该方法包括:
a)鉴定与患者中的疾病状态相关的体细胞获得性基因组重排,其中通过对该患者的核酸的全基因组分析进行所述鉴定,和
b)监测含有所述基因组重排的核酸的水平变化,和/或定量含有所述基因组重排的核酸的水平,作为该患者中的疾病进展或严重性的标志物。
本发明还涉及适合于监测疾病的方法,该方法包含监测含有基因组重排的核酸的水平变化,和/或定量含有基因组重排的核酸的水平,其中该基因组重排是与患者中的疾病进展或严重性相关的体细胞获得性突变,而其中已通过对该患者的核酸的全基因组分析进行该重排的鉴定。
本发明另一方面涉及医学治疗的方法,其包括根据本发明监测患者以及然后在必要的情况下额外地用适合的疗法治疗患者或改变治疗或停止治疗的步骤,其取决于由包含基因组重排的核酸的存在或水平所指示的疾病的严重性或进展。
本发明另一方面涉及患者特异性基因组重排作为该患者的疾病进展的生物标志物的用途,其中所述基因组重排是体细胞获得性突变。
本发明另一方面涉及评估治疗的效力的方法,该方法包含:
i)鉴定与患者中的疾病状态相关的体细胞获得性基因组重排,其中通过对该患者的核酸的全基因组分析进行所述鉴定,和
ii)监测含有所述基因组重排的核酸的水平变化,作为该患者中的疾病进展或严重性对治疗的反应的标志物,从而评估所述治疗的效力。
附图简述
图1显示在血浆DNA中基因组重排的定量检测
图2显示系列样品的分析
发明详述
本发明大体上涉及通过对患者的核酸的全基因组分析检测该患者的核酸中与疾病状态相关的重排。现在可获得的技术使得可以跨越基因组对组织样品中的核酸断裂点定位。一旦已鉴定到对患者适合的核酸重排生物标志物,可以通过监测患者体内的含有所述断裂点的核酸的水平随时间的增加或降低来追踪疾病进展。如果所述含有重排的核酸能够在血液或血浆中被检测出,那么可以对血液或血浆取样以方便地监测疾病进展。一旦通过重排生物标志物水平评估的疾病进展已经恶化或逆转或未能检测到,可以停止对患者疾病的治疗。如果通过重排生物标志物的水平评估的疾病负荷没有减少,可以修改或终止治疗方案。也可以评估不同治疗的效果和由此而来的适合性。
本发明的方法也可以用于确定是否发生复发,从而如果必要的话重新开始治疗。
在癌症的实例中,重排的筛查潜在地适用于其中可以获取诊断样品用于基因组筛查的所有肿瘤类型。大多数实体瘤的患者在其治疗过程中经历活检或完全手术切除其癌症,意味着对肿瘤DNA的获取通常是可以实现的。以我们目前的经验,超过99%的所分析的样品(覆盖众多肿瘤类型)具有至少一种可鉴定的肿瘤特异性的基因组重排。
因此,在第一方面本发明涉及确定疾病的进展的方法,该方法包含
a)鉴定与患者中的疾病状态相关的体细胞获得性基因组重排,其中通过对该患者的核酸的全基因组分析进行所述鉴定,和
b)监测含有所述基因组重排的核酸的水平变化,作为该患者中的疾病进展的标志物。
疾病,如本文所公开的,可以是与体细胞重排相关的任何疾病。疾病可以包括,例如,癌症如实体瘤、阵发性睡眠性血红蛋白尿、1型和2型神经纤维瘤、McCune-Albright综合征、色素失调症和Proteus综合征。
在本发明的一方面,所述疾病是癌症,例如实体瘤如乳腺癌、非小细胞肺癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌和骨癌。
一方面,所述疾病特征在于包含所述重排的核酸可在来自于体液(如血液、血清、血浆、淋巴、痰、尿、粪便或唾液)的样品中检测出。
本文中,与疾病状态如癌症相关的重排不一定是该疾病的病因,不过它们可能引起或参与所述疾病的表型。然而,重排与疾病相关而使得检测所述重排能够追踪疾病的进展或严重性才是必要的。一方面,本发明涉及使用不是病因或不是唯一病因的重排进行监测。
用于鉴定重排的对患者核酸的分析适合地在来自于体内(例如肿瘤如实体瘤中)的患病细胞的核酸上进行。一方面,全基因组核酸分析在活检或手术切除的肿瘤组织上进行。重排筛查适合地在源于细胞群的肿瘤核酸上进行。因此在一方面,用于全基因组分析的核酸来源是已知的患病细胞或组织,从而使得可以鉴定与该疾病相关的突变。
本发明另一方面,核酸可以直接取自组织或液体,例如血液或血浆或血清,其本身是否患病未知,但是来自已知患有疾病的患者。在作出突变与疾病状态相关的假设的情况下,体细胞获得性基因组重排也可用作该疾病的标志物。
核酸可以从培养的细胞,以及直接从身体组织或体液中获得。
所述核酸可以是DNA或RNA。
本文所公开的全基因组分析一方面是对个体的基因组的全部或显著部分的分析,以鉴定在该个体患病组织(如肿瘤)中所找到的重排形式的突变。全基因组分析一方面是通过分析来自个体的随机核酸片段或区域而鉴定来自该个体的与疾病相关的重排突变,适当地不使用已知对来自该个体的核酸特异的探针或引物。因此,没有必要完全覆盖基因组,虽然一方面优选可以分析整个基因组(至少基于对覆盖度的统计学分析)的技术。
体细胞获得性基因组重排可能包括缺失、倒位、易位和扩增。一方面,重排可通过突变所在的限制性片段的长度与患者正常(非突变)的基因组比较的变化来检测。
一方面,所述分析通过DNA测序进行,例如对个体的DNA的随机生成片段的测序。一方面,所述测序是对一定大小的DNA片段(如400-500bp)的文库测序。一方面,所使用的技术是大规模平行测序,如本文所描述,以及在Campbell等人Nature Genetics,Vol 40,number 6,June 2008,page 722-729中也有所描述。
适合的大规模平行测序平台也包括SOLiD平台(Applied Biosystems公司)和454测序仪(Roche)的使用。
一方面,所述测序使用配对末端测序进行。从六千万个片段的量级中生成适合地配对的读段(read),其通常足以鉴定>50%的存在于样品中的体细胞基因组重排。
配对末端测序方法公开于,例如Genome Res.2009.19:521-532。
一方面,区分所述基因组重排的优先次序。优先次序的区分可以通过,例如,包括一或多个以下步骤:
·≥2个读段跨越相同重排;
·对两端高置信度的定位(mapping);
·定位在相同染色体上小于100kb的间隔的读段;
·两端定位到分割算法所确定的拷贝数的变化点的100kb的范围内。
一方面,监测含有所述基因组重排的核酸的水平变化的步骤是DNA扩增测定,例如PCR测定,如巢式PCR方法。本文所指的PCR一般是指DNA扩增技术,特别包括聚合酶链式反应。适合地,在扩增方法中使用设计用于特异性地鉴定所述核酸重排的引物。
一方面,在从血液或血清中获得的核酸样品上进行该PCR方法。
一方面,初始PCR产物的大小小于<200bp,优选小于190bp、180bp、170bp、160bp、150bp。
适合地,监视特定重排的水平的测定优选地是基本上定量的。
所述核酸的水平的变化可以通过绝对或相对测量得出。例如,可以使用“正常的”基因组DNA与突变的基因组DNA的水平的比率。或者,突变的DNA的绝对量可以例如每毫升血浆的DNA来测量。可以通过比率或绝对浓度测量来进行核酸水平的变化测量或核酸水平的定量。
一方面,用于同步监测患者核酸水平的变化的本发明的测定可线性地定量低至每测定25pg DNA的水平。
一方面,所检测的具有所述重排的DNA绝对量的一个对数(log)的增加被认为是疾病负荷的显著增加,可能需要治疗。
在本发明的一方面,监测多种基因组重排以提供个体的遗传指纹。
另一方面,本发明涉及包含本发明的监测的医学治疗方法,此外在必要的情况下还包含治疗所述患者,或如果治疗正在进行时改变治疗或停止治疗的步骤,其取决于由包含信息性重排的核酸的水平所表示的疾病严重性或进展。
本发明另一方面涉及患者特异性的基因组重排作为该患者的疾病进展的生物标志物的用途。
将会意识到可以通过监测所鉴定的标志物随时间的变化来追踪疾病的进展。可以通过在单个时间点上测量其存在或浓度代表疾病严重性的生物标志物来评估疾病的严重性。例如,血液中存在最初在实体瘤中所鉴定的体细胞DNA重排可能表示癌症的进展超过某种疾病状态。
因此,本发明涉及用于确定疾病状态的方法,该方法包含鉴定与患者中的疾病状态相关的体细胞获得性基因组重排,其中该鉴定通过对该患者核酸的全基因组分析进行。适合地,在患者的组织或液体(例如血液或血浆或血清)中鉴定所述基因组重排。优选地,在除进行了全基因组分析的原发患病组织以外的位点或器官组织或液体中鉴定基因组重排。
例如,实体瘤可以代表原发疾病组织,而在血液或其他体液中存在体细胞获得性基因组重排可能表示癌症的某种疾病进展,并使得可以确定治疗性疗法。
一方面,本发明还涉及确定疾病治疗方案的方法,该方法包含定量组织或液体(优选除主要患病组织之外)中的与患者疾病状态相关的体细胞获得性基因组重排的水平,其中通过对该患者核酸的全基因组分析进行所述鉴定,并根据所述基因组重排的水平选择治疗方案。
本发明另一方面涉及评估治疗的效力的方法,该方法包括:
i)鉴定与患者中的疾病状态相关的体细胞获得性基因组重排,其中通过对该患者的核酸的全基因组分析进行该鉴定,和
ii)监测含有该基因组重排的核酸的水平变化,作为该患者的疾病进展对治疗反应的标志物,从而评估该治疗的效力。
所述治疗可能是新的治疗,在这种情况下本发明的方法可能不仅用于监测对患者的最佳治疗,也可以用于一般性地确定新治疗方案和新的药物或其他治疗性疗法的效力。
此应用不限于人,也可以应用到动物。本发明因此也延伸至评估药物或治疗方案的效力的方法,该方法包含用药物或治疗方案治疗有需要的个体,然后在治疗后通过测量作为疾病生物标志物的含有体细胞重排的核酸的水平以监测疾病的进展或严重性。
一方面,本发明还涉及用于监测细胞杀灭的方法,其中通过包含体细胞重排的核酸的释放监测使用药物或治疗方案的细胞杀灭。
Cancer Res 2007;67:(19).October 1,2007 p9364-9370公开在动物模型中监测细胞杀灭。
如果患者正在用药物或其他疗法(例如手术或放身疗法或化学疗法)治疗,那么该疗法的效果可以通过寻找患者中具有所述重排的核酸的水平来监测。
适合的治疗包括手术、化疗、放射疗法、单克隆抗体、激素疗法和分子靶向疗法或者它们的组合。
此外,如果患者已针对疾病进行治疗并处于缓解中,那么可以监测该患者的后续的缓解状态。如果患者脱离缓解(复发),则可以重新开始治疗。因此,如本文所涉及的监测疾病的进展也包括监测缓解后疾病的重现,以及任选地在复发后治疗疾病。本发明可用于监测缓解或最后一轮治疗一段时期如数小时、数天、数周或数月后的复发。
在本发明的优选方面,提供了用于确定癌症的进展的方法,该方法包括:
a)由通过配对末端测序的全基因组分析鉴定来自患者肿瘤样品的核酸中的体细胞获得性基因组重排;
b)设计用于鉴定和测量所述体细胞获得性基因组重排的定量测定;
c)在治疗的未来阶段期间获得来自所述患者的一或多个另外的样品;
d)使用所述测定测量在步骤(a)和步骤(c)中获得的样品中的具有体细胞重排的核酸的水平;和任选地
e)通过比较步骤(d)中所测量的具有体细胞重排的核酸的水平确定所述患者的疾病进展和/或严重性。
在本发明的另一方面,可以筛查孕妇以确定遗传疾病是否已传递至其子女。如果父亲已知具有与体细胞获得性基因组重排相关的疾病,可以评估所述重排在母亲的例如血液或血清中的存在。因此,本发明一方面涉及适合于监测疾病的方法,该方法包含:
a)鉴定与患者中的疾病状态相关的体细胞获得性基因组重排,其中通过对该患者核酸的全基因组分析进行该鉴定,和
b)监测孕妇中包含所述基因组重排的核酸的水平变化,和/或定量包含所述基因组重排的核酸的水平,作为胎儿中疾病的进展和严重性的标志物。
在本申请中全部参考文献的教导通过引用整体并入本文,包括专利申请和授权专利。本申请要求优先权的任何专利申请以本文所描述的方法通过引用以其整体并入本文,用于公开和应用。
为避免不确定,发明人对于本文中术语“包含(comprising)”、“包含(comprise)”和“包括(comprises)”旨在任选地在每一实例中可分别替换为术语“由……组成(consisting of)”、“由……组成(consist of)”和“由……组成(consists of)”。所有数字值中的术语“大约”(或“左右”)允许5%的差异,即大约1.25%的值将意为1.19%-1.31%。
将理解本文所述的具体实施方案是以说明的方式而不是作为本发明的限制显示。本发明的主要特征可以多种实施方案采用而不偏离本发明的领域。本领域技术人员会承认或者能够确定大量的本文所述的具体方法的等同物,只需要常规的研究。这些等同物被认为是在本发明的范围内并由所述权利要求涵盖。在说明书中所提到的所有出版物和专利申请代表着本发明相关的本领域技术人员技术水平。所有的出版物和专利申请是以相同程度通过引用并入本文的,正如同每个单独的出版物或专利申请都具体地和单独地被指明通过引用并入本文。
在权利要求和/或说明书中用术语“包含”结合所使用的单词“一(a)”或“一(an)”的使用可能是指“一”,但也与“一或多”、“至少一”和“一或大于一”的意思一致。在权利要求中使用术语“或”是用来指“和/或”,除非明确地表示其只指代替代物或替代物是互斥的,不过本公开支持意为只有替代物和“和/或”的定义。本申请全文中,术语“大约”是用来表示数值包括测量的固有误差、所应用的确定该值的方法的固有误差,或者存在于研究对象中间的差异。如本说明书和权利要求中所用的,术语“包含(comprising)”(和任何形式的包含,如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(和任何形式的具有,如“有(have)”和“有(has)”)、“包括(including)”(和任何形式的包括,如“包括(include)”和“包括(includes)”)、或“含有(containing)”(和任何形式的含有,如“含有(contain)”和“含有(contains)”)是包容性或开放式的,并不排除额外的未引用的元素或方法步骤。
本文所用的术语“或其组合”是指此项之前的所列出的项的所有变换和组合。例如,“A、B、C或其组合”旨在包括A、B、C、AB、、AC、BC或ABC中的至少一种,并且如果在某一具体上下文中顺序是重要的,也包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续此例,明确地包括包含一或多个项或术语的重复的组合,例如BB、AAA、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。技术人员会理解在任何组合中一般在项和术语的数目上没有限制,除非上下文中明显另有别义。
本文所公开和要求的所有组合物和/或方法可以根据本公开制作和执行,无需过度的实验。本发明的组合物和方法已在优选实施方案方面有所描述,因此可以对组合物和/或方法和在所述步骤或步骤的顺序中应用变化而不背离本发明的概念、精神和范围,这对本领域技术人员而言是明显的。所有这些对本领域技术人员而言类似的替代和修改视作在所附权利要求中限定的本发明的精神、范围和概念范围内。
现在参考如下实施例举例说明本发明,这些实施例不限制本发明。方法
以下步骤在本发明的这一实例中采用
1.通过大规模平行测序鉴定肿瘤特异性基因组重排。
2.将重排定位至碱基对分辨率。
3.设计基于PCR的测定,其用于灵敏地和特异性地定量肿瘤负荷。
4.从血清提取游离DNA并用适当的对照定量肿瘤负荷。
通过大规模平行测序鉴定肿瘤特异性重排
使用酚-氯仿提取或其他标准方案从肿瘤样品提取基因组DNA。根据由要使用的大规模平行测序平台的制造商所建议的方案从肿瘤DNA制备文库。对于Solexa测序平台(Genome Analyzer,lllumina,San Diego CA),根据制造商的说明使用随同Genome Analyzer仪器提供的喷雾器随机剪切基因组DNA(5ug)。使用T4 DNA聚合酶和Klenow聚合酶末端修复所述片段化的DNA,用T4多核苷酸激酶使其5'末端磷酸化。使用缺乏3'-5'外切酶的Klenow片段生成3'A突出,并将lllumina的配对末端接头寡核苷酸连接至由此生成的粘性末端。所述连接混合物在琼脂糖凝胶上电泳,并通过切割长度在400-500碱基对的DNA片段进行大小选择。按照制造商的说明从凝胶中提取DNA并通过有限循环PCR反应用任一末端上的Solexa引物富集片段。
根据制造商的方案在所提供的簇生成仪(cluster station)上制备GenomeAnalyzer的配对末端流动槽(flow-cell)。然后使用制造商所推荐的方案在Genome Analyzer平台上对PCR集落簇进行测序。从任一末端的至少35bp的配对末端测序给出用于鉴定重排的最佳的覆盖度,不过重排可以用具有更长读段长度的、单末端的读段找到。使用制造商的软件处理来自仪器的图像以生成FASTQ序列文件。
大多数当前一代的大规模平行测序平台可以用于鉴定基因组重排,包括SOLiD平台(Applied Biosystems)和454测序仪(Roche)。更长的插入大小增加覆盖度,并允许在识别成簇的重排中更大的置信度。如果可获得来自同一患者的组成型(种系)DNA的测序数据,其可以用于辅助区分种系和体细胞重排。
使用若干免费可获得的软件包中任何一个将序列数据比对到参考人类基因组上。我们使用MAQ算法vO.4.3(可从http://maq.sourceforge.netMAQ-man.shtml获得)。用SSAHA算法进一步筛选两末端未能以正确的朝向和分开的距离比对到基因组的读段。
去除假象(artefact)
从分析中排除两末端定位到彼此500bp的范围内但两末端之一的方向不正确的读段,因为它们很可能是由于在PCR集落内的错误引发(mis-priming)或由于在扩增文库过程中生成的分子内重排导致的假象。通过其序列的两个末端定位至相同的基因组位置来鉴定彼此是正确重复的读段(在PCR富集步骤中产生):只保留具有更高定位质量的片段。从拷贝数和重排分析中去除着丝粒或端粒序列缺口的1Mb范围的区域以减少来自参考基因组的序列缺口的假DNA定位(见目前序列缺口的列表,例如在http://genome.ucsc.edu/CGI-BIN/hgTables)。
拷贝数算法
为了校正跨越基因组变化的唯一性(uniqueness)水平,通过产生每个末端35个碱基、间距500bp的配对序列(或等同物,如果使用了不同的文库)进行配对末端短读段的电脑模拟,模拟的配对位于沿基因组的每35bp。使用MAQ算法将这些模拟读段定位至基因组。在此基础上,将基因组分为非重叠的不等宽度的窗口,其包含固定数目的以高唯一性定位的电脑读段。利用所述窗口边界组,计数唯一地定位至每个窗口中的配对末端读段的数目。这形成二元循环分割算法的原始输入,该算法最初是为基因组杂交微阵列数据开发的。在R中作为Bioconductor项目(见http://www.bioconductor.org/)的DNAcopy库执行的该算法通过迭代二元分割鉴定拷贝数的变化点。我们使用α=0.01以及平滑参数2和2个标准偏差用于剪除分割后的可能的假阳性,不过该模型化通常对不同的参数选择给出类似的结果。
将重排定位至碱基对的分辨率
以下标准用于区分不正确定位的读段的优先次序以进行确认性筛查:
1.≥2个读段跨越相同重排;
2.对两末端的高置信度的定位;
3.读段定位在相同染色体上<100kb的间隔;
4.两末端定位至由分割算法鉴定的拷贝数变化点的100kb内。
设计引物跨越可能的断裂点,使其位于配对末端读段以外的1kb内,最大产物大小为1kb。每套引物在肿瘤和正常的基因组DNA上进行PCR反应。给出条带的产物通过传统的Sanger毛细管方法测序并与参考序列比较以鉴定断裂点。体细胞获得性肿瘤特异性重排定义为至少在两个独立的反应中所看到的在肿瘤DNA中给出令人信服的条带而在正常DNA中没有匹配条带的PCR反应,并具有提示为重排的明确地定位的序列数据。
或者,可以通过横跨断裂点的从头组装对重排定位。通过提取一端定位至所述断裂点的位置的配对末端读段实现。这些读段可以组装成更长的重叠群,其可以比对至参考基因组以确定所述断裂点的确切位置。
设计用于定量肿瘤特异性重排的基于PCR的测定
我们已发现巢式PCR是用于扩增肿瘤特异性基因组重排的灵敏的和特异的方法。
评估每一确认的体细胞结构重排作为DNA标志物的适合性:
拷贝数变化
选择在大多数的肿瘤细胞中存在的DNA标志物是重要的。在来自细胞群的肿瘤DNA上进行重排的筛查,因此所述测序实验的输出是肿瘤细胞群平均的重排。我们寻求使用这样的重排,其i)在测序数据中是普遍的,并且ii)有明确的拷贝数的变化,因为这些重排会存在于大多数(或全部)肿瘤细胞中。
周围的DNA的唯一性
每个测定必须是对某一具体的重排特异的。基因组的重复特性意味着非唯一的、重复的序列位于跨越基因组的多个位置。为了获得高特异性的测定,使用重复屏蔽软件(www.repeatmasker.org)屏蔽每个断裂点周围的重复序列。这将使一部分体细胞获得性断裂点由于紧接的周围重复而被排除在进一步分析之外。对于一些断裂点连接处,没有或只有很短的核苷酸段(stretch)被屏蔽掉。如果避免了重复序列,可以为这些重排设计特异的测定。
测定的数量
我们打算对每名患者设计3-4种肿瘤特异性重排的探针。对每个患者进行多个测定增加最终结果的可信度,尽管对每个患者并不总是能够鉴定这一数目的适合的重排。肿瘤特异性测定与用于识别基因组的野生型区域所设计的4个对照并排运行。
测定/寡核苷酸设计
我们采取巢式PCR方法从源于正常细胞的循环DNA的高背景中鉴定癌症特异性的重排。使用primer 3(http://frodo.wi.mit.edu/)设计引物以避免重复序列并跨越重排断裂点。最初的PCR产物的大小应保持到最小(<200bp),因为循环肿瘤DNA倾向于在这个大小范围内最为丰富。在第一轮PCR中所扩增的序列用作模板以使用Beacon Designer软件(Premier BiosoftInternational)设计双标记DNA探针(“TaqMan”)形式的定量PCR测定。该程序选择引物和双标记[5'FAM,3'BHQ1]DNA探针。由于严格的大小限制,有时需要在实时引物和第一轮引物之间的重叠。
从血浆/血清中提取DNA并定量肿瘤负荷
DNA的提取
通过在16000g离心10分钟从患者的血浆或血清去除碎片。使用QIAamp MinElute Virus Vacuum Kit(Qiagen)从2-20mL的所得上清中提取DNA。洗脱的DNA稀释于20μl所提供的洗脱缓冲液中并且使用全部体积作为以下PCR的模板。
多重PCR
从2-20mL患者血浆中提取的全部量的DNA(或源于此的10倍系列稀释物)与所有的患者特异性第一轮PCR引物以及第一轮对照区引物组合并在多重PCR中进行20个循环。组合所有引物确保对每套引物可获得最高的可能的DNA量。
实时PCR
将巢式PCR产物制成十倍稀释物并使用5μl作为使用重排特异性引物和探针的单个实时PCR反应的模板。
定量
使用患者的肿瘤DNA在正常DNA(或水)中的系列稀释物使得可以生成标准曲线,因为每个反应的肿瘤DNA(以pg)的量已知。然后使用所述应用标准物的最佳拟合曲线使得可以内插获得在已知体积的血浆/血清中存在的肿瘤DNA的量。根据我们的经验,嵌套、实时PCR能够检测存在于所分析的整个血浆体积中的低至1个拷贝的靶重排。
结果
我们调查了两位转移性乳腺癌的患者。使用大规模平行配对末端测序从两个原发癌症的基因组中鉴定体细胞获得性基因组重排并且设计PCR测定以从每个基因组中扩增多种重排(见下面的图1)。对所述PCR产物测序以将断裂点鉴定至碱基对的分辨率。我们接着设计嵌套实时PCR测定以扩增和定量肿瘤DNA的量。确认在来自癌症的DNA上的PCR设计成功后,我们接着检查两个病例中最初出现疾病时所取的血浆样品。从2mL血浆中提取DNA并通过我们所设计的患者特异性实时测定进行分析。图1显示实时PCR反应的结果。该曲线在y轴上显示由实时探针(TaqMan)所产生的荧光的量,在x轴上显示PCR的循环数。在图1中每幅图片大约中部的黑色水平线标出反应被视为达到阳性的荧光水平,所以曲线越早(越向左)与阈值相交,反应中靶DNA的量越多。在图1中用分开的箭头指示源于正常个体(所述反应的阴性对照)的血浆DNA的曲线和患者血浆在水中的10倍系列稀释物的曲线。对每个患者的左边的图显示肿瘤特异性重排的结果。明显地,患者的血浆样品是阳性的,而阴性对照的血浆(来自正常个体)始终是阴性的。对每个患者的右边的图显示基因组正常区域的结果(阳性对照),如所预期的其在在患者和正常对照中是阳性的。
图1:乳腺癌患者的血浆DNA中基因组重排的定量检测:通过大规模平行测序在患有转移性疾病的两位患者的原发性乳腺癌中鉴定体细胞获得性基因组重排。从诊断中获取的2mL血浆中提取DNA并通过巢式PCR和最终轮的实时PCR筛选10倍系列稀释物。在两位患者中对重排的强检测(对每个患者显示一种重排,没有显示另两种)均是可能的。在稀释物系列中的肿瘤特异性反应和对照反应的比较提示每个患者血浆中的肿瘤特异性DNA与总DNA的比值为1:10,患者PD3722a的所提取的血浆DNA的总量是PD3770a的~100倍。
该结果显示可以在血浆DNA中定量地检测这些体细胞重排。具体来说,从所述分析中可以说明该测定的以下主要特征:
·该检测是高度灵敏的,因为甚至使用血浆的稀释物所述分析也是阳性(对第一个患者1:10稀释以及对第二个患者1:1000稀释,相当于从仅2μL血浆的DNA中检测信号,因为2mL是起始体积)。
·该检测是高度特异的,因为即使使用巢式PCR,正常血浆DNA也没有出现信号。
·该检测是定量的,因为血浆稀释物显示Ct线性增加并且曲线之间明显分离。
我们随后分析了来自经历化疗的第三位癌症患者的系列样品(下面的图2)。如我们对前两位患者所做的,使用大规模平行测序进行全基因组重排的筛查以鉴定体细胞获得性重排。选择其中两种重排用于测定设计。在正常的DNA中制备肿瘤DNA的系列稀释物。
图2A显示跨越在正常的DNA中的肿瘤DNA系列稀释物的重复反应中对重排1和2的分析。在Ct≤27,可以从最佳拟合线估算肿瘤DNA的绝对量。对Ct>27,只能将疾病分类为可检测或不可检测。然而,该测定似乎能够检测存在于反应中的单个拷贝的重排。图2B显示来自在患者临床过程中的里程碑式时间点收集的6个样品的血清每毫升中肿瘤DNA的估算的量。
图2的A幅显示以系列稀释物的重复实验测试所述测定。结果表明该测定是强大的、可重复的并且可线性定量低至每反应大约25pg DNA。鉴于二倍体人类体细胞含有~6.75pg DNA,这等价于每个反应~4个基因组。在反应中使用更低的肿瘤DNA的量(每个反应5pg和10pg),我们发现反应是阳性或是阴性的(如图最右边的点所示)。这意味在阴性的反应中不存在所述重排的拷贝,而在阳性的反应中存在1或2个拷贝。因此,一个主要发现是巢式实时PCR检测将能够检测在许多毫升血液中存在的单个拷贝的重排。
我们接着筛选在患者化疗期间的时间点(图2B和2C)收集的来自所述患者的系列血清样品。不幸的是,没有获得开始治疗前的样品。然而,从她的第一线化疗的中点到第二线化疗的结束,残留疾病在该测定的检测限上在血清中可检测。不幸地,她在完成化疗的一个月或两个月内经受了临床性进展,而这与她血清中可检测的疾病水平的增加相关。在安排挽救性化疗的时期内,疾病的水平进一步增加。
这些系列分析表明该测定能够检测即使在临床上少量存在的疾病,并且疾病负荷的定量与疾病进展相关。
未来的研究
目的:
我们打算针对以下患者测量在血浆DNA中定量的肿瘤特异性重排的预后意义:
1.100位以辅助疗法设置治疗的患有非转移性乳腺癌的患者;
2.100位患有三期或二期晚期结肠癌的患者。
非转移性乳腺癌
乳腺癌导致英国妇女的癌症死亡的16%。对于在诊断时没有已知的远程转移的患者,所给予的治疗一般有治愈的意图,但在5年内复发率在20-40%之间,其取决于局部淋巴结转移、原发肿瘤的大小和雌激素受体的状态。许多关于在这一临床设置中最佳辅助疗法使用的问题没有答案,而准确定量疾病负荷的方法对建立个性化治疗方案和优化治疗强度和持续时间将是非常重要的。
三期和高危的二期结肠癌
结肠癌导致英国所有癌症死亡人数的10%。所有患者的近一半表现为高危的二期或三期疾病,而这一组有33%-75%的总体5年生存率,其取决于局部肠和淋巴结转移的程度。出于这一原因,依据手术后持续性疾病将患者准确划分为危险种类的方法将对临床管理特别有用。
研究计划
患者招募和样品收集
将招收将通过手术和辅助疗法治疗的患有早期乳腺癌的患者进入试验。在手术前肿瘤门诊中审核所有这些妇女,并且正是在这里向她们告知该研究,使她们同意该研究,并招收她们进入研究。手术时,乳腺癌样品将由研究护士取至病理实验室,其中无需用于诊断目的的一部分肿瘤会被新鲜冷冻用于随后的DNA提取。对患者的癌症护理路径过程中重要的里程碑的20mL血浆的系列样品进行提取和冷冻,所述里程碑为:手术前、手术后(辅助疗法规划门诊)、化疗结束(对ER阴性的患者)或激素治疗期间(ER阳性)、随访期间的每6个月、临床复发时。将在手术后和在化疗结束收集样品用于通过免疫学方法评估循环肿瘤细胞。将从全血白细胞提取正常DNA。
将招收正在接受有治愈意图的原发肿瘤切除的患有三期和高危的二期结肠癌的患者进入试验。所有这些患者的分期/诊断阶段、手术、辅助疗法和治疗后的随访全部由特定的多学科团队管理,其中包括外科医生、内科肿瘤学家和专科护士。会在手术前的审查中使患者知情同意并将其招收进入研究。手术时,结肠癌样品将由研究护士取至病理实验室,其中无需用于诊断目的的一部分肿瘤会被新鲜冷冻用于随后的DNA提取。对患者的癌症护理路径过程中重要的里程碑的20mL血浆的系列样品进行提取和冷冻,所述里程碑为:手术前、手术后(辅助疗法规划门诊)、随访期间的每6个月、临床复发时。将从全血白细胞提取正常DNA。
配对末端测序
简单地,会遵照以上所述的标准方案以生成400-500bp片段的文库用于使用37bp配对末端读段的鸟枪法测序。这些会用于大规模平行测序以从六千万的片段中生成配对读段,以我们的经验其足以鉴定样品中存在的>50%的体细胞基因组重排。使用已建立的算法,我们将针对确认性PCR和断裂点的毛细管测序区分重排的优先次序——这一步骤包括跨越患者的正常DNA样品的PCR以证明所述重排是体细胞获得性的。
定量血浆DNA的肿瘤特异性重排
首先,每肿瘤的四种细胞获得性重排会用于测定设计。选择将根据:
·在大多数肿瘤细胞的存在—最好通过将重排划定为拷贝数的整体变化(允许正常细胞的污染)估计。
·存在于所述断裂点的唯一的DNA-PCR扩增子中不存在重复会提高该测定的特异性。
·如果可能,癌症基因的参与—例如,CDKN2A的缺失或在ERBB2扩增中的第一重排更可能在所有细胞存在,包括那些最终复发的细胞。
测定将最初基于使用设计为扩增不超过200bp(由于循环肿瘤DNA片段的尺寸小)的产物的引物的第一轮20个循环的PCR,随后使用TaqMan探针进行第二轮巢式实时PCR。肿瘤DNA和对照扩增子的稀释系列会用来估计源于肿瘤细胞的血浆DNA的相对比例以及总量(见针对实施例的图)。我们发现这种方法给出准确的、可重复的、线性的定量。
将使用既定的方案从冷冻的血浆样品中分批提取DNA并用上述定量的标准分批分析。从基因组的正常对照区域的扩增会用于估计血浆中存在的裸DNA的总量。很可能我们会将肿瘤DNA的定量表述为总裸血浆DNA的分数,尽管可能将循环肿瘤DNA定量为绝对浓度。
临床结果的相关性和能力(power)的计算
统计分析将集中于三个问题:在里程碑时间点(呈现、手术后、在治疗完成时)的个体测量的预后意义;通过评估肿瘤特异性血浆DNA瞬时增加和随后下降来定量药物诱导的细胞杀灭的能力;和在临床并发症发展之前通过鉴定上升的水平预测即将发生的复发的可行性。能力的计算显示,对根据ctDNA估计划分的两组25个患者的比较,80%的能力可以检测2.2的危险比(基于在较差的预后组的中位无病生存为30个月的60个月的研究)。用该数据集将可能进行额外的预后分析,例如总体基因组不稳定性标志物与结果的相关性以及基因组重排的特定模式与存活的关联。
Claims (18)
1.适合于监测疾病的方法,所述方法包括:
a)鉴定与患者中的疾病状态相关的体细胞获得性基因组重排,其中通过对该患者的核酸的全基因组分析进行所述鉴定,和
b)监测含有所述基因组重排的核酸的水平变化,和/或定量含有所述基因组重排的核酸的水平,作为该患者中疾病进展或严重性的标志物。
2.权利要求1的方法,其中所述疾病是癌症。
3.权利要求2的方法,其中所述疾病是实体瘤。
4.前述权利要求中任一项的方法,其中在活检或手术切除的肿瘤组织上进行步骤(a)中的核酸分析。
5.前述权利要求中任一项的方法,其中通过DNA测序进行所述全基因组分析。
6.前述权利要求中任一项的方法,其中所述全基因组分析是大规模平行测序方法。
7.权利要求5或6的方法,其中使用配对末端测序进行所述测序。
8.前述权利要求中任一项的方法,其中步骤(b)中的监测步骤是PCR测定。
9.前述权利要求中任一项的方法,其中在来自体液的核酸上进行步骤(b)中的监测步骤。
10.权利要求1的方法,还包括,根据含有所述基因组重排的核酸的水平或水平的变化的指示,在必要情况下治疗所述患者,或在必要情况下停止治疗所述患者的步骤。
11.权利要求1的方法,还包括基于含有所述基因组重排的核酸的水平或水平的变化来确定用于治疗患者的治疗方案的步骤。
12.患者特异性基因组重排作为该患者中的疾病进展的生物标志物的用途。
13.权利要求1的监测方法在评估药物或其他治疗性疗法的效力中的用途。
14.权利要求13的监测方法在评估癌症组织的手术切除的效力中的用途。
15.监测疾病的方法,所述方法包括监测含有基因组重排的核酸的水平变化,和/或定量含有基因组重排的核酸的水平,其中所述基因组重排是与患者中的疾病进展或严重性相关的体细胞获得性突变,并且其中已经通过对该患者的核酸的全基因组分析进行所述重排的鉴定。
16.权利要求1或15的方法,其中在来自处于缓解中的患者的样品上监测含有所述基因组重排的核酸的水平的变化,和/或定量含有所述基因组重排的核酸的水平。
17.前述权利要求中任一项的方法或用途,其中监测多种体细胞获得性基因组重排。
18.医学治疗方法,所述方法包括用适合的疗法治疗患者,或改变对患者的治疗,或停止对患者的治疗,其中所述患者中的含有根据权利要求1或15鉴定的基因组重排的核酸的水平变化已经被鉴定。
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