CN112442537B - 一种长链非编码rna rp11-469h8.6及其应用 - Google Patents

一种长链非编码rna rp11-469h8.6及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种长链非编码RNA RP11‑469H8.6及其应用，属于肿瘤检测和分子靶向治疗领域。本发明通过实验证明长链非编码RNA RP11‑469H8.6在头颈癌、甲状腺癌、肺癌、食管鳞癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、皮肤癌等多种实体瘤中显著低表达，并通过实验证明过表达lnc RP11‑469H8.6后能显著抑制人头颈癌、甲状腺癌、肺癌、食管鳞癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、皮肤癌等多种实体瘤的增殖、迁移侵袭，具有重要的肿瘤检测和治疗价值。

Description

一种长链非编码RNA RP11-469H8.6及其应用
技术领域
本发明属于肿瘤检测和分子靶向治疗领域，更具体地说，涉及一种长链非编码RNARP11-469H8.6及其应用。
背景技术
肿瘤是目前危害人类健康最严重的一类疾病。研究发现肿瘤的产生是一个由基因突变逐渐积累的复杂过程，现代医学技术和分子生物学的发展，使得肿瘤治疗进入个体化时代，大大增加肿瘤治疗的缓解率。因此找到特异性的靶点对于肿瘤早期检测、治疗及预后是目前制约肿瘤临床疗效的关键瓶颈。
长链非编码RNA(long non coding RNA，lncRNAs)是一类转录本长度超过200nt的RNA 分子，缺少特异完整的开放阅读框，无蛋白质编码功能的RNA，在总非编码RNA(ncRNA)中占有相当大的比例。起初lncRNA被认为是基因组转录的“噪音”，不具有生物学功能。然而，近年来的研究表明，lncRNA以RNA的形式在多种层面上(表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等)调控了基因的表达水平。lncRNA具有较高的组织与细胞特异性，大量的lncRNA被报道在肿瘤疾病中具有差异表达谱，被认为是潜在的原癌基因及抑癌基因，并有望作为临床检测分期及治疗的理想靶标。
本发明通过生物信息学分析首次发现lncRNA RP11-469H8.6在包括头颈癌、甲状腺癌、肺癌、食管鳞癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、皮肤癌在内的多种实体瘤中显著低表达，经数据库和文献检索(Pubmed，Ensembl，Google)发现RP11-469H8.6的功能未有任何文献报道。
发明内容
1.发明目的
本发明的目的之一，是提供一种长链非编码RNA RP11-469H8.6，能应用在制备肿瘤检测试剂和肿瘤治疗药物；
本发明的目的之二，是提供一种含有针对RP11-469H8.6的核苷酸序列设计的特异性引物的检测试剂盒；
本发明的目的之三，是提供一种特异性结合RP11-469H8.6的寡核苷酸探针用于肿瘤的检测；
更具体地，lnc RP11-469H8.6在头颈癌、甲状腺癌、肺癌、食管鳞癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、皮肤癌等多种实体瘤中显著低表达，过表达lnc RP11-469H8.6后能显著抑制人头颈癌、甲状腺癌、肺癌、食管鳞癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、皮肤癌等多种实体瘤的增殖和迁移，可作为上述几种肿瘤潜在的生物标志物。探究其作为靶点用于人头颈癌、甲状腺癌、肺癌、食管鳞癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、皮肤癌等恶性肿瘤的治疗和检测。
2.技术方案
本发明提供的技术方案如下：
本发明提供了一种长链非编码RNA在制备肿瘤检测试剂和肿瘤治疗药物中的应用，所述的长链非编码RNA为RP11-469H8.6，是位于人类染色体Chromosome 12： 49，951，968-49，962，922的反义链，所述长链非编码RNA序列为SEQ ID NO.1所示。
优选地，(a)所述的肿瘤检测试剂用于检测SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(b)所述的肿瘤治疗药物用于实现在肿瘤组织或细胞中过表达SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
一种肿瘤检测试剂盒，含有针对所述的核苷酸的序列设计的特异性引物对。
优选地，所述的特异性引物对序列为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
一种用于肿瘤检测的芯片，所述的芯片含有固相载体以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针能特异性地结合于所述的核苷酸序列。
优选地，所述的探针序列为SEQ ID NO.4所示。
进一步地，所述的肿瘤包括人的头颈癌、甲状腺癌、肺癌、食管鳞癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、皮肤癌。
3.有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的长链非编码RNA RP11-469H8.6(ENSG00000257588，又称AC025154.2)，在包括人的头颈癌、甲状腺癌、肺癌、食管鳞癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、皮肤癌等恶性肿瘤临床组织中的表达水平显著低于对应的癌旁组织；
经数据库和文献资料(Pubmed，Ensembl，Google)检索，目前未发现与lnc RP11-469H8.6 具有同源性序列的lncRNA，且其生物学功能未有任何文献报道，表明RP11-469H8.6可以作为一种新的肿瘤标志物，用于早期肿瘤的辅助诊断和预后效果的判定。
(2)本发明提供的lnc RP11-469H8.6过表达，能显著抑制人头颈癌SCC4细胞、甲状腺癌 SW579细胞、肺癌A549细胞、食管鳞癌TE13细胞、胃癌MGC803细胞、乳腺癌MDA-MB-231细胞、肾癌UOK262细胞、皮肤癌A431细胞的增殖、迁移侵袭；因此，lnc RP11-469H8.6 可以作为肿瘤治疗药物的开发。
附图说明
附图1为RP11-469H8.6在不同肿瘤组织中的表达水平；
附图2为RP11-469H8.6在头颈癌组织和癌旁组织的表达水平；
附图3为利用原位杂交检测PP11-469H8.6在头颈癌组织和癌旁组织的表达情况；
附图4为RP11-469H8.6的慢病毒过表达载体图谱；
附图5为RP11-469H8.6过表达慢病毒载体转染肿瘤细胞的效率检测；
附图6为过表达RP11-469H8.6对人头颈癌SCC4细胞的增殖抑制作用；
附图7为过表达RP11-469H8.6对人甲状腺癌SW579细胞的增殖抑制作用；
附图8为过表达RP11-469H8.6对人肺癌A549细胞的增殖抑制作用；
附图9为过表达RP11-469H8.6对人食管鳞癌TE13细胞的增殖抑制作用；
附图10为过表达RP11-469H8.6对人胃癌MGC803细胞的增殖抑制作用；
附图11为过表达RP11-469H8.6对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用；
附图12为过表达RP11-469H8.6对人肾癌UOK262细胞的增殖抑制作用；
附图13为过表达RP11-469H8.6对人皮肤癌A431细胞的增殖抑制作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1
RP11-469H8.6在人多种肿瘤组织和癌旁组织中的表达量分析。
TCGA标准方法下载包括头颈癌、脑胶质瘤、甲状腺癌、食管鳞癌、肺癌、肝癌、胃癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、结直肠癌、胰腺癌、骨肉瘤、皮肤癌在内的16种肿瘤的癌组织和正常组织的RNA-seq测序文件及临床信息，发现了表1中RP11-469H8.6的差异表达(判断标准：(1)|癌/癌旁的表达量|＞2，(2)P＜0.05)。
表1 RP11-469H8.6在人肿瘤组织和正常组织中的表达量分析(癌/癌旁)
Figure BSA0000189922340000031
Figure BSA0000189922340000041
由表1和图1所示，与正常组织比较，RP11-469H8.6在人头颈癌、脑胶质瘤、食管鳞癌、肺癌、肾癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌8种肿瘤组织中的表达水平显著降低。推定RP11-469H8.6 的表达与多种肿瘤的发展呈显著负相关。
实施例2
利用荧光定量PCR检测RP11-469H8.6在头颈癌临床病人及癌旁组织中的表达情况。
(1)标本的采集
在患者知情同意的情况下，于术中采集头颈癌及癌旁组织标本，生理盐水清洗后，保存于液氮或-80℃冰箱中备用。
(2)引物设计
根据lnc RP11-469H8.6的核苷酸序列采用Primer Premier5.0设计引物，序列如下：
上游引物(SEQ ID NO.2)
下游引物(SEQ ID NO.3)
(3)实时定量PCR检测RP11-469H8.6在头颈癌病人及正常癌旁组织中的表达。
按life公司的Trizol说明书提取收集样本的总RNA，再用NanoDrop ND-1000核酸定量仪定量所提取的RNA的纯度和浓度，琼脂糖质检确保提取RNA的完整性。采用TaKaRa试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)对提取的总RNA反转录合成cDNA。采用TaKaRa试剂盒
Figure BSA0000189922340000042
Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)进行qPCR 反应。反应体系如下表：
表2 PCR反应体系
Figure BSA0000189922340000043
Figure BSA0000189922340000051
将上述组份混合均匀后按以下程序：95℃30s预变性，40个循环；95℃5s，60℃30s。
根据熔解曲线判断反应的特异性，由公式2-ΔΔCt计算RP11-469H8.6的相对表达量。利用P值表示统计学意义，P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为极显著性差异。
结果见图2，在85％左右的头颈癌样本中RP11-469H8.6的表达水平显著低于正常癌旁组织，提示RP11-469H8.6可以作为头颈癌检测的潜在指标。
实施例3
利用原位杂交检测RP11-469H8.6在头颈癌临床病人及癌旁组织中的表达情况。
(1)收集组织样本和处理
在患者知情同意的情况下，于术中收集头颈癌及癌旁组织标本，生理盐水清洗后，置于福尔马林固定液中固定至少4h。进行石蜡包埋和切片，常规脱蜡至水。
(2)体外合成地高辛标记的探针
根据RP11-469H8.6的核苷酸序列设计特异性探针，具体序列如SEQ ID NO.4所示，并在探针的两端通过共价结合标记数个DIG-11-dUTP分子。
(3)杂交和免疫检测
每张玻片上加50-100ul的杂交液，玻片上盖上22X22盖玻片，用胶水封片(防止干片)，在杂交温度50℃下孵育1h，用镊子小心的把封片胶撕掉，避免玻片刮花组织样本，把玻片放入室温5XSSC中。将玻片甩干，室温放入封闭液，封闭15min；用纸吸干封闭液后，放在湿盒与1∶800的anti-DIG-AP Fab fragments二抗共孵育，4度过夜。室温，PBST 3次，每次5min；加200ul核固红染液，1分钟；把片子在自来水中冲洗10分钟，酒精脱水；用甘油或Entellan缓冲液封片；结果观察，紫蓝色为阳性信号。
结果见图3所示，RP11-469H8.6在头颈癌组织中阳性表达率明显低于癌旁组织，与qPCR 检测结果一致。
实施例4
RP11-469H8.6过表达质粒病毒的制备和转染效率检测
如图4所示，合成针对lnc RP11-469H8.6的全长cDNA(具体序列如SEQ ID NO.1所示)，然后将其导入过表达慢病毒质粒，同包装质粒DR8.9和包膜质粒VSVG.2共转入293T细胞中以产生病毒，转染48h后，收集细胞的病毒上清，分别感染SCC4细胞、甲状腺癌SW579、肺癌A549细胞、食管鳞癌TE13细胞、胃癌MGC803、乳腺癌MDA-MB-231细胞、肾癌UOK262 细胞和皮肤癌A431细胞。感染24h后，加入嘌呤霉素筛选分别获得相应的稳定过表达lnc RP11-469H8.6的细胞株。提取稳转细胞的总RNA，通过qPCR方法检测lnc RP11-469H8.6表达变化。
按life公司的Trizol说明书分别提取SCC4细胞、甲状腺癌SW579、肺癌A549细胞、食管鳞癌TE13细胞、胃癌MGC803、乳腺癌MDA-MB-231细胞、肾癌UOK262细胞和皮肤癌A431细胞的总RNA，再用NanoDrop ND-1000核酸定量仪定量所提取的RNA的纯度和浓度，琼脂糖质检确保提取RNA的完整性。采用TaKaRa试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNAEraser(Perfect Real Time)对提取的总RNA反转录合成cDNA。采用TaKaRa试剂盒
Figure BSA0000189922340000061
Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)进行qPCR反应。其中lnc RP11-469H8.6的上游引物和下游引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。反应体系如下表：
表3.qPCR反应体系
Figure BSA0000189922340000062
将上述组份混合均匀后按以下程序：95℃30s预变性，40个循环；95℃5s，60℃30s。
根据熔解曲线判断反应的特异性，由公式2-ΔΔCt计算lnc RP11-469H8.6的相对表达量。利用P值表示统计学意义，P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为极显著性差异。
结果见图5，在不同肿瘤细胞中，较对照组CTL相比，lnc RP11-469H8.6在过表达组的表达量显著上调(P＜0.01)。
实施例5
过表达RP11-469H8.6对人肿瘤细胞增殖能力的影响
将人头颈癌SCC4细胞、甲状腺癌SW579细胞、肺癌A549细胞、食管鳞癌TE13细胞、胃癌MGC803细胞、乳腺癌MDA-MB-231细胞、肾癌UOK262细胞、皮肤癌A431细胞的 RP11-469H8.6过表达组和对照组在37℃、5％CO2的培养箱中培养至密度90％时用胰蛋白酶消化收集，用培养液重悬细胞并在显微镜下计数，将细胞浓度调整为3.0×104个/mL，将细胞悬液接种到96孔板中，每孔100μL，并于37℃，5％CO2培养箱中培养。分别在培养0h、 24h、48h和72h后向96孔板中每孔加入20μL 5mg/mL的MTT，继续培养4h。吸去培养基，每孔加入100μLDMSO溶解。用酶标仪在检测波长为570nm，参比波长为630nm处测定吸光值，并计算生长抑制率(proliferation inhibition，PI)公式为：
PI(％)＝1-给药组/阴性组
试验独立重复3次，试验得到的结果以mean±SD表示，并进行统计t检验，两组以上数据比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，利用P值表示统计学意义，其中P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为极显著性差异。
结果见图6-13，与对照组(CTL)相比，lnc RP11-469H8.6过表达量的细胞 (lenti-RP11-469H8.6)的增殖速度明显减弱。表明lnc RP11-469H8.6过表达能显著抑制人头颈癌SCC4细胞(图6)、甲状腺癌SW579细胞(图7)、肺癌A549细胞(图8)、食管鳞癌TE13 细胞(图9)、胃癌MGC803细胞(图10)、乳腺癌MDA-MB-231细胞(图11)、肾癌UOK262 细胞(图12)、皮肤癌A431细胞(图13)的增殖，表明lnc RP11-469H8.6具有体外抑制不同肿瘤细胞增殖的能力。
实施例6
过表达RP11-469H8.6对人肿瘤细胞迁移能力的影响。
将人头颈癌SCC4细胞、甲状腺癌SW579细胞、肺癌A549细胞、食管鳞癌TE13细胞、胃癌MGC803细胞、乳腺癌MDA-MB-231细胞、肾癌UOK262细胞、皮肤癌A431细胞过表达组和空白对照组接种到transwell小室中，每孔100μL，在transwell下室加入0.6mL含 10％FBS的完全培养基刺激细胞迁移，于5％CO2，37℃培养24h。弃去孔中培液，用90％酒精常温固定30min，0.1％结晶紫常温染色10min，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，显微镜下观察并选择四个视野拍照计数。按照公式计算迁移抑制率(migration inhibition rate，MIR)：
Figure BSA0000189922340000071
其中Ntest为测试组(表格中以lenti-RP11-469H8.6表示)的细胞迁移数，Ncontrol为空白对照组(表格中以CTL表示)的细胞迁移数。试验独立重复3次，试验得到的结果计算mean± SD，并进行统计t检验，两组以上数据比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，利用P 值表示统计学意义，P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为极显著性差异。
表4.过表达lnc RP11-469H8.6对人肿瘤细胞迁移能力的抑制作用
Figure BSA0000189922340000072
Figure BSA0000189922340000081
表中：*表示P值＜0.05，**表示P值＜0.01。
结果见表4，与空白对照组相比，过表达lnc RP11-469H8.6能够在不同程度显著抑制人头颈癌SCC4细胞、甲状腺癌SW579细胞、肺癌A549细胞、食管鳞癌TE13细胞、胃癌MGC803细胞、乳腺癌MDA-MB-231细胞、肾癌UOK262细胞、皮肤癌A431细胞的迁移，说明lnc RP11-469H8.6可以抑制恶性肿瘤细胞的迁移能力。
实施例7
过表达RP11-469H8.6对人肿瘤细胞侵袭能力的影响。
将10mg/mL Matrigel用培养基以1∶3稀释，涂布于transwell小室膜上，室温风干。将培养到对数生长期的人头颈癌SCC4细胞、甲状腺癌SW579细胞、肺癌A549细胞、食管鳞癌TE13细胞、胃癌MGC803细胞、乳腺癌MDA-MB-231细胞、肾癌UOK262细胞、皮肤癌 A431细胞过表达组和空白对照组接种到transwell小室中，每孔100μL，在transwell下室加入0.6mL含10％FBS的完全培养基刺激细胞迁移，于5％CO2，37℃培养24h。弃去孔中培液，用90％酒精常温固定30min，0.1％结晶紫常温染色10min，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未发生侵袭的细胞，显微镜下观察并选择四个视野拍照计数。按照公式计算侵袭抑制率 (Invasioninhibition rate，IIR)：
Figure BSA0000189922340000082
其中Ntest为测试组(表格中以lenti-RP11-469H8.6表示)的细胞侵袭数，Ncontrol为空白对照组(表格中以CTL表示)的细胞侵袭数。试验独立重复3次，试验得到的结果计算mean±SD，并进行统计t检验，两组以上数据比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA)，利用P值表示统计学意义，P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为极显著性差异。
表5.过表达lnc RP11-469H8.6对人肿瘤细胞侵袭能力的抑制作用
Figure BSA0000189922340000091
表中：*表示P值＜0.05，**表示P值＜0.01。
结果见表5，与空白对照组相比，过表达lnc RP11-469H8.6能够在不同程度显著抑制人头颈癌SCC4细胞、甲状腺癌SW579细胞、肺癌A549细胞、食管鳞癌TE13细胞、胃癌MGC803细胞、乳腺癌MDA-MB-231细胞、肾癌UOK262细胞、皮肤癌A431细胞的侵袭，说明lnc RP11-469H8.6可以抑制恶性肿瘤细胞的侵袭能力。
Figure ISA0000189922360000011
Figure ISA0000189922360000021

Claims (8)

1.检测长链非编码RNA RP11-469H8.6的引物在制备肿瘤检测试剂中的应用，其特征在于：所述的长链非编码RNA序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的检测长链非编码RNA RP11-469H8.6的引物在制备肿瘤检测试剂中的应用，其特征在于，所述的肿瘤检测为针对SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列设计了特异性引物对。
3.根据权利要求2所述的检测长链非编码RNA RP11-469H8.6的引物在制备肿瘤检测试剂中的应用，所述的引物对序列为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
4.一种长链非编码RNA在制备肿瘤治疗药物中的应用，所述的肿瘤治疗是通过在肿瘤中过表达SEQ ID NO .1所示的核苷酸序列而实现，所述肿瘤为人的头颈癌、甲状腺癌、肺癌、食管鳞癌、胃癌、乳腺癌、肾癌及皮肤癌。
5.一种肿瘤检测试剂盒，其特征在于，含有针对权利要求1所述的SEQ ID NO.1序列设计的特异性引物对，所述肿瘤为人的头颈癌、甲状腺癌、肺癌、食管鳞癌、胃癌、乳腺癌、肾癌及皮肤癌。
6.根据权利要求5所述的肿瘤检测试剂盒，其特征在于，所述的引物对序列为SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示。
7.一种用于肿瘤检测的芯片，其特征在于：所述的芯片含有固相载体以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地结合权利要求1中所述的核苷酸序列，所述肿瘤为人的头颈癌、甲状腺癌、肺癌、食管鳞癌、胃癌、乳腺癌、肾癌及皮肤癌。
8.根据权利要求7所述的芯片，其特征在于，所述的寡核苷酸探针序列为SEQ ID NO.4所示。
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