CN110982900B - 一种基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器、miRNA检测试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器,包括荧光标记的单链核酸探针及铋烯纳米片,所述单链核酸探针与特定miRNA互补,所述单链核酸探针吸附于铋烯纳米片表面;所述单链核酸探针吸附于铋烯纳米片表面时,荧光淬灭;所述特定miRNA竞争结合单链核酸探针时,荧光恢复。本发明基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器用于检测特定miRNA具有检出限极高、极高的检测特异性、操作简单、检测速度快、样本需求量少等优势。本发明还提供了一种miRNA检测试剂盒及其应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学和分析化学技术领域,具体涉及一种用于临床诊断的试剂,更具体涉及一种基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器,以及包括该基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器的miRNA检测试剂盒,本发明还涉及该基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器在检测miRNA上的应用。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是一种机体内源性表达的单链小分子RNA,位于基因组非编码区,本身不具有开放阅读框(open reading frame,ORF),具有高度保守性,时序性和组织特异性。miRNA广泛存在于各种真核细胞中,不编码任何蛋白质,长度仅为20~24nt。成熟的miRNA 5’端有一个磷酸基团,3’端为羟基,由具有发夹状结构的约70~90nt的单链RNA前体经过Dicer酶加工后形成。成熟的miRNA形成RNA诱导的基因沉默复合体(RNA-inducedsilencing complex,RISC)作用于靶点mRNA,通过对mRNA剪切或抑制其翻译过程而调控基因的表达。目前人们还不明确miRNA及其靶mRNA之间的作用机制。
最近有研究指出,miRNA在细胞生长、发育、分化、死亡等生物过程中起着重要的作用,同时,miRNA参与了血细胞生成、胰岛素分泌、神经系统构成和人类癌细胞生长等不同的过程,因此,非常有必要开发出有效的检测工具来测定miRNA。目前检测miRNA的方法主要有Northern印迹分析,微点阵(microarray)分析和实时定量PCR(quantitative Real-TimePCR)。Northern印迹分析的不足之处在于:Northern分析的过程涉及大量人工操作,对检验人员的技术要求较高,并且每次仅有一条miRNA探针与一个RNA印迹杂交,因此,它不适用于大规模的临床筛选检测。微点阵分析的不足之处在于:需要足够的RNA样本,无法区分差异很小的miRNA,检测分辨率低,难以达到临床检测要求。实时定量PCR需要进行RNA反转录及后续扩增,往往只能进行相对定量或者定性分析,难以达到临床绝对定量检测要求。
基于现有的miRNA检测的局限性,开发出一种新型的miRNA检测方法、检测试剂以及配套的检测设备,成为当下临床miRNA检测研究的一大热点。荧光光谱法是一种快速、实时的样品方法,其具有其它方法无法比拟的精准定量优势。不幸的是,众所周知,找到理想的荧光淬灭剂非常困难,而且需要进一步通过超快光学和分子电子学研究确定荧光淬灭剂的淬灭机理,研究工作的难度不言而喻。
目前,二维材料(2D Nanosheet)已在生物医学、电子、环境和能源应用中引起了广泛关注。近年来,对生物传感器应用的2D材料的研究最多的是石墨烯、黑磷(BP)、二维过度金属硫化物(TMDs)、三族硫族化物等。VA族元素被称为“光子原”,为单元素烯应用打开了一个新的未开发区域。尽管VA族中的几种2D材料(例如BP,砷和锑)已应用于生物医学和分析化学领域,但应用于生物传感领域仍是挑战。作为具有强自旋轨道耦合的VA族中最重的原子量,铋具有出色的金属和拓扑性质,例如快速的载流子迁移,出色的生物相容性,强的光-材料相互作用,化学和热稳定性能,这在生物传感器中表现出巨大的应用前景。用荧光探针检测miRNA的关键在于荧光淬灭机制,包括共振能量转移(FRET)和电荷转移(CT)。迫切需要找到一种能够淬灭染料分子的荧光以检测miRNA,并最终实现miRNA定性和定量检测的2D纳米材料。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了一种基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器,本发明还提供了一种包括上述基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器的miRNA检测试剂盒,本发明还提供了上述基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器在miRNA检测方面的应用。本发明基于铋烯纳米片的荧光淬灭效果,实现对特定miRNA的高分辨率检测,包括定性检测及定量检测,应用于体外临床诊断上,例如阿兹海默症(AD)的临床诊断、肿瘤的临床诊断等,具有巨大的应用前景及市场价值。
第一方面,本发明提供了一种基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器,以解决现有的miRNA检测方法存在的操作繁琐、RNA样本需求量大、无法区分差异很小的miRNA、检测分辨率低等问题。
一种基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器,包括荧光标记的单链核酸探针及铋烯纳米片,所述单链核酸探针与特定miRNA互补,所述单链核酸探针吸附于铋烯纳米片表面;
所述单链核酸探针吸附于铋烯纳米片表面时,荧光淬灭;
所述特定miRNA竞争结合单链核酸探针时,荧光恢复。
本发明一具体实施方式中,所述铋烯纳米片的横向尺寸大于30nm,厚度为0.4~20nm。
优选地,所述铋烯纳米片的XRD衍射峰位于22.4°,27.1°,37.9°,39.6°,45.6°,48.7°,56°和59.3°,分别对应铋纳米晶的(003),(012),(104),(110),(006),(202),(024),(107)晶面(JCPDS No.44-1246)。
优选地,所述铋烯纳米片的Raman光谱在65.6cm-1和91cm-1处分别表现出振动峰。
优选地,所述荧光标记的单链核酸探针为荧光素亚酰胺(FAM)标记的单链核酸探针。
本发明另一具体实施方式中,所述荧光标记的单链核酸探针还可以为异硫氰酸荧光素(FITC)、四氯荧光素(TET)、六氯荧光素(HEX)、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)等常见用于标记核苷酸探针的荧光素分子标记的单链核酸探针。
优选地,所述单链核酸探针为单链DNA探针。
在其他可选的实施方式中,所述单链核酸探针还可以为单链RNA探针。
优选地,所述单链DNA探针的序列为5’-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’,该单链DNA探针与miRNA-21互补。
在其他可选的实施方式中,所述单链DNA探针的序列还可以与其它miRNA标志物互补,例如文献已经报道的阿兹海默症(AD)标志物miRNA、肿瘤标志物miRNA、椎间盘退变(IDD)标志物miRNA;还可以是植物miRNA,例如可以是水稻miRNA528。
在其他可选的实施方式中,所述单链DNA探针的长度为15~36nt;更优选地,所述单链DNA探针的长度为19~23nt。
本发明第一方面所述的一种基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器,该基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器为一种特殊的复合物结构:荧光素-单链核酸探针-铋烯纳米片,即荧光标记的单链核酸探针通过分子间作用力(范德华力)吸附于铋烯纳米片表面,由此结合成该特殊的复合物结构。检测原理为:借助于铋烯纳米片独特的荧光淬灭效果,使得该荧光素-单链核酸探针-铋烯纳米片复合物荧光淬灭,当向该复合物结构体系中添加与单链核酸探针互补的特定miRNA或者血清(或者是其它包含miRNA样本液)时,miRNA与铋烯纳米片竞争结合单链核酸探针,且miRNA与单链核酸探针的亲和力更大。铋的显著淬灭作用将铋与染料分子之间的基态弱荧光电荷转移归因于铋,利用该机制,铋纳米材料被用于显示荧光淬灭剂。miRNA与单链核酸探针结合形成双链DNA(dsDNA)结构,dsDNA的形成削弱了铋烯纳米片与单链核酸探针的吸附力,单链核酸探针(此时miRNA与单链核酸探针结合形成dsDNA)摆脱铋烯纳米片的束缚。脱离铋烯纳米片后,铋烯纳米片的荧光淬灭效应难以继续发挥作用,该复合物结构体系出现一定程度的荧光恢复。通过检测荧光恢复程度,检测特定miRNA或者血清中特定miRNA的浓度,实现临床诊断的功能。本发明基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器用于检测特定miRNA具有检出限极高,能够检出浓度低至60pM的miRNA;还具有极高的检测特异性,能够区分单碱基错配的情况;同时该基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器还具有操作简单、检测速度快、样本需求量少等优势。
第二方面,本发明还提供了一种miRNA检测试剂盒,以解决现有miRNA检测试剂盒存在的检测操作繁琐、RNA样本需求量大、检出限低、无法区分差异很小的miRNA、检测分辨率低等问题。
一种miRNA检测试剂盒,包括荧光标记的单链核酸探针及荧光淬灭剂,所述单链核酸探针与特定miRNA互补,所述荧光淬灭剂包含铋烯纳米片;
所述荧光淬灭剂结合单链核酸探针时,荧光淬灭;
所述特定miRNA竞争结合单链核酸探针时,荧光恢复。
优选地,还包括标准浓度的特定miRNA;
所述标准浓度的特定miRNA通过竞争结合单链核酸探针,用于测定荧光恢复强度及制作标准线。
优选地,所述标准浓度的特定miRNA包括以下浓度的特定miRNA:0nM、0.5nM、1nM、2nM、4nM、6nM、8nM和10nM。
优选地,所述荧光淬灭剂包含1~500μg/ml铋烯纳米片。更优选地,所述荧光淬灭剂包含20~80μg/ml铋烯纳米片。更优选地,所述荧光淬灭剂包含50μg/ml铋烯纳米片。
本发明第二方面所述的一种miRNA检测试剂盒,其包括荧光标记的单链核酸探针及荧光淬灭剂。荧光标记的单链核酸探针具有荧光效应,即接受一定激发光照射时,发出相对应的荧光。当将荧光标记的单链核酸探针与荧光淬灭剂一起孵育时候,荧光标记的单链核酸探针借助于范德华力吸附于铋烯纳米片表面,形成荧光素-单链核酸探针-铋烯纳米片复合物。借助于铋烯纳米片的淬灭效应,荧光标记的单链核酸探针产生荧光淬灭。当向该复合物结构体系中添加与单链核酸探针互补的miRNA或者血清(或者是其它包含miRNA样本液)时,miRNA与铋烯纳米片竞争结合单链核酸探针,miRNA与单链核酸探针结合形成dsDNA结构,dsDNA的形成削弱了铋烯纳米片与单链核酸探针的吸附力,单链核酸探针(此时miRNA与单链核酸探针结合形成dsDNA)摆脱铋烯纳米片的束缚,出现一定程度的荧光恢复。通过检测荧光恢复程度,经检测特定miRNA或者血清中特定miRNA的浓度,实现临床诊断的功能。本发明miRNA检测试剂盒具有检出限极高,能够检出60pM的miRNA;还具有极高的检测特异性,能够区分单碱基错配的情况;同时该miRNA检测试剂盒还具有操作简单、检测速度快、样本需求量少等优势。
第三方面,本发明还提供了一种基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器在检测miRNA上的应用,以解决现有miRNA检测技术存在的检测操作繁琐、RNA样本需求量大、检出限低、无法区分差异很小的miRNA、检测分辨率低等问题。
一种基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器在检测miRNA上的应用。
本发明基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器在检测miRNA上的应用,通过该基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器制备出荧光淬灭型miRNA检测试剂盒,并最终应用于miRNA的定性或者定量检测上,具有检出限极高,能够检出60pM的miRNA;还具有极高的检测特异性,能够区分单碱基错配的情况。同时,应用基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器检测miRNA还具有操作简单,对操作人员的技术要求不高,检测速度快,添加检测样本后即可进行荧光恢复测量并通过计算机自动计算、输出miRNA水平。另外,该基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器检测miRNA时样本需求量少,无需扩增即可通过核酸分子间形成双链结构实现绝对定量。
本发明的优点将会在下面的说明书中部分阐明,一部分根据说明书是显而易见的,或者可以通过本发明实施例的实施而获知。
附图说明
为更清楚地阐述本发明的内容,下面结合附图与具体实施例来对其进行详细说明。
图1为本发明铋烯纳米片的制备和表征图。a)铋纳米片的制备过程示意图;I,通过探头超声处理铋溶液;II,将溶液离心,并收集含有铋的上清液。b)AFM形貌显示云母上有少层铋烯纳米片。c)少层铋烯纳米片的FFT屏蔽HRTEM图像的傅里叶转换(FFT)图。d)铋烯纳米片的XRD谱(上方线条为铋烯纳米片)。e)少层铋烯纳米片的拉曼光谱,Eg(双重简并的面内振动模式)和A1g(双重简并的面外振动模式)这两个峰代表两种不同的振动模式。
图2为本发明铋烯纳米片的光谱测试图。a)铋浓度为0μg/ml(最右侧),50μg/ml(中间)和100μg/ml(最左侧)的FAM-ssDNA溶液的线性归一化吸收光谱。b)FAM-ssDNA的典型归一化荧光光谱,其中铋浓度为0μg/ml(最右侧),50μg/ml(中间)和100μg/ml(最左侧)。c)在泵浦探测发射波长为2.29eV的条件下,FAM-ssDNS和铋烯/FAM-ssDNA的光激发载流子动力学曲线。两条衰减曲线均具有双指数衰减函数规律(下方为0μg/ml,上方为100μg/ml)。d)FAM–ssDNA和铋烯/FAM–ssDNA在各种探针上的瞬态吸收光谱(上部图片的最右侧,从上往下分别对应线条:-0.24ps、500ps、100ps、20ps、0.8ps;下部图片的最右侧,从上往下分别对应线条:-0.7ps、0.8ps、20ps、100ps、500ps)。e)FAM-ssDNA和铋烯/FAM-ssDNA的瞬态吸收光谱的二维(mapping)图。f)铋烯/FAM-ssDNA复合物的示意图。
图3为本发明基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器的荧光淬灭试验效果图。a)基于铋烯纳米片的miRNA检测的示意图。b)在混合铋烯纳米片之前,FAM-ssDNA探针溶液(10-6M)的荧光图像。c)FAM-ssDNA探针溶液与铋烯纳米片混合的荧光图像。d)FAM-ssDNA与铋烯纳米片溶液与miRNA-21一起孵育的荧光图像。e)FAM-ssDNA探针(最上方),FAM-ssDNA/miRNA-21(由上往下第二条线),FAM-ssDNA/miRNA-21@铋烯纳米片(由上往下第三条线),FAM-ssDNA@铋烯(由上往下第四条线)的荧光光谱。f)在铋烯纳米片溶液中存在不同浓度的miRNA-21时,FAM-ssDNA探针溶液的荧光光谱(由上往下十三条线对应的miRNA-21浓度递减)。g)荧光强度与miRNA-21/miRNA浓度不匹配之间的关系。每个点对应于具有指示的miRNA浓度的荧光强度。所有误差条是来自五个数据点的荧光强度的标准误差。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
在本专利中,我们使用铋烯纳米片解决了这一问题,并使用光致发光和光学泵浦探测光谱学阐明了淬灭机理。铋烯纳米片的显著淬灭作用归因于铋烯纳米片与染料分子之间的基态弱荧光电荷转移。利用该机制,铋烯纳米片被用于荧光淬灭剂,以检测肺癌相关的miRNA-21生物标记物,从而为miRNA传感提供快速灵敏且选择性的检测平台。
实施例1:基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器
一种基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器,包括荧光标记的单链核酸探针及铋烯纳米片,单链核酸探针借助于范德华力吸附于铋烯纳米片表面,形成独特的荧光素-单链核酸探针-铋烯纳米片复合物结构,其中,单链核酸探针与特定miRNA互补,用于与特定miRNA结合形成双链结构。
检测原理为:借助于铋烯纳米片独特的荧光淬灭效果,使得该荧光素-单链核酸探针-铋烯纳米片复合物荧光淬灭。铋的显著淬灭作用将铋与染料分子之间的基态弱荧光电荷转移归因于铋,利用该机制,铋纳米材料被用于显示荧光淬灭剂。当向该复合物结构体系中添加与单链核酸探针互补的特定miRNA或者血清(或者是其它包含miRNA样本液)时,miRNA与铋烯纳米片竞争结合单链核酸探针,且miRNA与单链核酸探针的亲和力更大,单链核酸探针倾向于形成dsDNA结构。miRNA与单链核酸探针结合形成双链DNA(dsDNA)结构,dsDNA的形成削弱了铋烯纳米片与单链核酸探针的吸附力,单链核酸探针(此时miRNA与单链核酸探针结合形成dsDNA)摆脱铋烯纳米片的束缚。脱离铋烯纳米片后,铋烯纳米片的荧光淬灭效应难以继续发挥作用,该复合物结构体系出现一定程度的荧光恢复。通过检测荧光恢复程度,检测特定miRNA或者血清中特定miRNA的浓度,实现临床诊断的功能。本发明基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器用于检测特定miRNA具有检出限极高,能够检出浓度低至60pM的miRNA;还具有极高的检测特异性,能够区分单碱基错配的情况;同时该基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器还具有操作简单、检测速度快、样本需求量少等优势。
在具体的实施方式中,铋烯纳米片的横向尺寸大于30nm,厚度为0.4~20nm。该横向尺寸及厚度的铋烯纳米片能够保证单链核酸探针借助于范德华力吸附于铋烯纳米片表面,不至于因吸附力不够而使得单链核酸探针脱离铋烯纳米片,造成检测结果不准确。
在具体的实施方式中,铋烯纳米片的XRD衍射峰位于22.4°,27.1°,37.9°,39.6°,45.6°,48.7°,56°和59.3°,分别对应铋纳米晶的(003),(012),(104),(110),(006),(202),(024),(107)晶面(JCPDS No.44-1246)。通过XRD表征方法,证实本发明制备出了铋烯纳米片,且后续通过铋烯纳米片起到荧光淬灭剂的作用。
在具体的实施方式中,铋烯纳米片的Raman光谱在65.6cm-1和91cm-1处分别表现出典型的峰,分别对应铋的Eg和Alg振动模式。借助于拉曼光谱表征,本发明制备出了铋烯纳米片,且后续通过铋烯纳米片起到荧光淬灭剂的作用。
在具体的实施方式中,荧光标记的单链核酸探针为荧光素亚酰胺(FAM)标记的单链核酸探针。FAM为常用的核酸探针,广泛应用于荧光标记检测,具有与氨基反应迅速、结合产物稳定且易于控制等优点。
在其他实施方式中,荧光标记的单链核酸探针还可以为异硫氰酸荧光素(FITC)、四氯荧光素(TET)、六氯荧光素(HEX)、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)等常见用于标记核苷酸探针的荧光素分子标记的单链核酸探针,具有相似的荧光标记及荧光检测效果。
在具体的实施方式中,单链核酸探针为单链DNA(ssDNA)探针,ssDNA探针具有分子结构稳定,易于与miRNA结合形成稳定双链结构等优点,方便控制以及进行荧光检测。
在具体的实施方式中,单链DNA探针的序列为5’-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’,该单链DNA探针与miRNA-21互补,其中,miRNA-21的序列为5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’。miRNA-21是一个公认的致癌性miRNA。根据文献报道,多种肿瘤标本以及细胞系都检测出miRNA-21表达水平异常升高,包括乳腺癌、子宫颈癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、大肠癌、胶质癌和胆管癌等。
在其他实施方式中,单链DNA探针的序列还可以与其它miRNA标志物互补,例如文献已经报道的阿兹海默症(AD)标志物miRNA、肿瘤标志物miRNA、椎间盘退变(IDD)标志物miRNA;还可以是植物miRNA,例如可以是水稻miRNA528。借助于相同的检测原理,即miRNA竞争结合基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器(荧光素-单链核酸探针-铋烯纳米片复合物)中的单链DNA探针,荧光恢复,实现miRNA的定性或者定量检测。
在其他实施方式中,单链核酸探针还可以为单链RNA探针。通过优化荧光检测体系,例如通过去除荧光检测体系中的RNA酶或者向荧光检测体系中添加抑制RNA降解的试剂,同样能够保证单链RNA探针与miRNA结合成稳定的双链结构,确保荧光标记的单链核酸探针摆脱铋烯纳米片的束缚,恢复荧光强度。
在具体的实施方式中,单链DNA探针的长度为15~36nt;更优选地,单链DNA探针的长度为19~23nt。单链DNA探针与miRNA结合形成双链结构,随着单链DNA探针的长度增加,DNA-miRNA结合的配对特异性越强,即检测精准度越高;但是,长度过大的单链DNA探针会导致DNA-miRNA结合时间延长,不利于快速检测。鉴于miRNA的长度普遍分布范围为19~23nt,本发明通过大量的探索,发现长度为15~36nt的单链DNA探针既能保证DNA-miRNA快速结合,同时也能保证DNA-miRNA结合的特异性。更优选的,单链DNA探针的长度为19~23nt时,具有更快的检测速率,同时保证DNA-miRNA结合的高特异性,能够很好地满足临床上miRNA的检测要求,并用于临床诊断。
实施例2:miRNA检测试剂盒
一种miRNA检测试剂盒,包括荧光标记的单链核酸探针及荧光淬灭剂两部分,其中,单链核酸探针与特定miRNA互补,荧光淬灭剂包含铋烯纳米片。例如,miRNA检测试剂盒可以包括两部分试剂,第一部分试剂包括一定浓度的荧光标记的单链核酸探针,第二部分试剂包括一定浓度的荧光淬灭剂。
使用该miRNA检测试剂盒时,可以先将荧光标记的单链核酸探针与荧光淬灭剂一起孵育形成荧光素-单链核酸探针-铋烯纳米片复合物,即基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器,此时,借助于铋烯纳米片独特的荧光淬灭效果,使得该荧光素-单链核酸探针-铋烯纳米片复合物荧光淬灭。当向该复合物结构体系中添加与单链核酸探针互补的特定miRNA或者血清(或者是其它包含miRNA样本液)时,miRNA与铋烯纳米片竞争结合单链核酸探针,且miRNA与单链核酸探针的亲和力更大。miRNA与单链核酸探针结合形成双链DNA(dsDNA)结构,dsDNA的形成削弱了铋烯纳米片与单链核酸探针的吸附力,单链核酸探针(此时miRNA与单链核酸探针结合形成dsDNA)摆脱铋烯纳米片的束缚。脱离铋烯纳米片后,铋烯纳米片的荧光淬灭效应难以继续发挥作用,该复合物结构体系出现一定程度的荧光恢复。通过检测荧光恢复程度,检测特定miRNA或者血清中特定miRNA的浓度,实现临床miRNA诊断的功能。
在具体的实施方式中,该miRNA检测试剂盒还包括标准浓度的特定miRNA。标准浓度的特定miRNA通常包括若干浓度梯度的特定miRNA标准溶液,通过miRNA标准溶液竞争结合单链核酸探针,检测miRNA标准溶液竞争结合所产生的荧光淬灭强度,并基于上述关联检测结果制作制作标准线,用于后期计算样本中特定miRNA的浓度。
在具体的实施方式中,标准浓度的特定miRNA包括以下浓度的特定miRNA:0nM、0.5nM、1nM、2nM、4nM、6nM、8nM和10nM。在本发明中,通过大量的标准浓度的特定miRNA检测试验发现:随着标准浓度的特定miRNA浓度增加,荧光恢复强度同样增加,即出现miRNA浓度与荧光恢复强度的正相关趋势,特别是,在0到10nM范围内,标准浓度的特定miRNA浓度增加与荧光恢复强度呈现线性正相关,该浓度范围内的标准曲线可以用来进行样本miRNA的定量检测及计算。
在具体的实施方式中,荧光淬灭剂包含1~500μg/ml铋烯纳米片。更优选地,荧光淬灭剂包含20~80μg/ml铋烯纳米片。更优选地,荧光淬灭剂包含50μg/ml铋烯纳米片。上述浓度下的荧光淬灭剂能够确保荧光标记的单链核酸探针充分淬灭,保证后续dsDNA结构均从铋烯纳米片表面脱离,实现荧光恢复。
在具体的实施方式中,荧光淬灭剂需要确保荧光标记的单链核酸探针充分淬灭,由此荧光淬灭剂的浓度同样决定了单链核酸探针的浓度。为保证待检测样本中miRNA充分竞争结合单链核酸探针,临床上可以基于待检测样本中特定miRNA的大概浓度范围选择不同型号(其对应的铋烯纳米片浓度不同)的miRNA检测试剂盒。
实施例3:铋烯纳米片的制备与表征
本实施例使用超声化学方法处理市售的块体铋,通过自上而下的液相剥离法制备少层铋烯纳米片,并对制备的铋烯纳米片进行了形态和化学成分的表征。
(1)铋烯纳米片的制备:液相超声处理是打破弱范德华力制备多层铋的有效方法。
如图1a所示,使用探针超声液相剥离法成功制备了分散良好且超薄的铋纳米片。具体而言,将30mg铋粉末研磨后加入到溶剂(300ml)中。在冰浴中以420W的功率对铋粉末溶液进行超声处理6h。然后,通过1080W的探头超声对溶液处理24h。随后,将溶液在7000rpm下离心30min。最后,收集铋烯纳米片。得到的铋烯纳米片分散在上述溶剂中,存于4℃冰箱待用。在具体制备过程中,溶剂可以选为N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)溶液、乙醇、异丙醇中的一种或几种、不同比例的组合,本实施例中选用NMP。
(2)铋烯纳米片的表征
将上述制备的铋烯纳米片通过原子力显微镜(AFM)、高分辨率透射电子显微镜(HRTEM)、XRD光谱及拉曼光谱表征。
典型的铋烯纳米片的原子力显微镜(AFM)形貌如图1b所示。铋烯纳米片的整体横向尺寸大于800nm,厚度约为1nm,表明了铋烯纳米片厚度为2层。如图1c所示,通过高分辨率透射电子显微镜(HRTEM)证实了铋烯纳米片的结构。良好分辨的晶格显示出它们的单晶性质,晶格间距为0.328nm可以与铋的(012)晶面相匹配,与XRD光谱一致。为了进一步研究铋烯纳米片的晶体结构,如图1d所示测量了XRD光谱。少层铋烯纳米片的XRD衍射峰位于22.4°,27.1°,37.9°,39.6°,45.6°,48.7°,56°和59.3°,分别对应铋烯纳米片的(003),(012),(104),(110),(006),(202),(024),(107)晶面(JCPDS No.44-1246);图1e中的拉曼光谱表明,铋烯纳米片在65.6cm-1和91cm-1处分别表现出典型的峰,分别对应铋的Eg和Alg振动模式。
(3)荧光素与铋烯纳米片之间的淬灭机制
为了更好地了解染料分子与铋纳米片之间的强相互作用,使用了荧光素亚酰胺(FAM)作为分子信标的流行荧光素标记,以标记探针ssDNA。我们进行了稳态荧光光谱和时间分辨荧光光谱的测量。
图2a显示了添加了不同浓度的铋(0、50μg/ml和100μg/ml)的FAM-ssDNA的归一化吸收光谱。所有光谱都根据铋的背景吸收进行了校正。与FAM-ssDNA相比,在添加铋溶液(50μg/ml)后观察到2.72eV和2.57eV的峰,在2.49eV处出现新的谱带。铋烯纳米片浓度进一步提高到100μg/ml时,蓝色峰的位置从2.49eV变为2.41eV,混合溶液中的两种物质具有相同的吸收率。新吸收带的起源以及等渗点的出现表明由于基态电荷转移复合物,系统中形成了新物种(FAM-ssDNA-铋复合物,即本发明中的基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器)。图2b显示了图2a中用于吸收测量的样品的归一化荧光光谱。样品FAM-ssDNA在2.40eV处显示出发射峰。除了荧光强度的急剧抑制外,在发射光谱中观察到显著的位移(0.09eV),这清楚地表明电荷转移复合物的弱荧光性质。
(4)少层铋烯纳米片的飞秒瞬态吸收光谱
本实施例利用飞秒泵浦探测技术,获取铋烯纳米片的飞秒瞬态吸收光谱,揭示了铋烯纳米片的荧光淬灭机理即基态弱的荧光电荷转移过程。
为了直接揭示FAM-ssDNA和铋烯纳米片的超快速动力学和电子转移,本发明使用泵浦探测光谱法测量了FAM-ssDNA和铋-FAM-ssDNA复合溶液的飞秒瞬态吸收光谱(图2c)。与FAM-ssDNA相比(τ1=3.7ps和τ2=0.86ns),铋-FAM-ssDNA复合物表现出更长的衰减动力学响应(τ1=30ps和τ2=5.20ns)。本发明比较了在不存在和存在铋的情况下,各种探针延迟下FAM-ssDNA的瞬态吸收光谱(图2d)。本发明在FAM-ssDNA-铋复合物的瞬态吸收光谱中没有观察到任何明显的新谱带,表明没有激发态相互作用的证据。图3e展示了在不存在和存在铋纳米片的情况下,FAM–ssDNA的瞬态吸收变化的二维图,该图是波长和长达4ns时间窗口的探针延迟的函数。颜色在垂直方向上的变化和跨度分别表示样品的瞬态吸收信号强度和动态响应。FAM-ssDNA-铋复合物的ΔA值较低可能是由于(i)混合溶液中铋烯纳米片的线性吸收大和(ii)激光脉冲中激发态的淬灭。但是,从图2d和2e中可以清楚地看出,该复合物在所有波长范围内的动态响应都比FAM-ssDNA长得多。铋烯纳米片存在下,FAM-ssDNA的大动态响应是电荷转移复合物的固有特性。因此,甚至在存在铋原子的情况下,使FAM-ssDNA的衰变动力响应变短的能量转移过程也不明显。最后,我们可以推断出,基态弱的荧光电荷转移复合物是对FAM-ssdDNA荧光的强烈抑制(即荧光淬灭)的主要贡献。
效果实施例
基于铋烯纳米片荧光淬灭生物传感器实现对miRNA的超灵敏定量和选择性检测的性能测试
如图3a所示,染料标记的ssDNA探针可以通过核碱基与铋纳米片基面之间的范德华力吸附在铋烯纳米片的表面上。本发明预期由于铋烯纳米片作为高效淬灭剂,可以在铋烯纳米片上进行染料标记的ssDNA的完全荧光淬灭。ssDNA的序列以及目标miRNA(miRNA-21)的的序列如表1所示。鉴于目标miRNA的存在,dsDNA的形成削弱了铋表面上染料标记的DNA探针之间的相互作用,从而导致了荧光的恢复。
表1.实验中的寡核苷酸序列信息
首先,为了验证上述传感策略的可行性,我们使用荧光显微镜在高浓度(10-6M)下进行了直接观察荧光图像。图3b描绘了10-6M FAM-ssDNA探针溶液的荧光显微镜图像。图3c中的图片显示,一旦添加了铋烯纳米片,FAM-ssDNA探针溶液的荧光就会被急剧淬灭,这证明了铋纳米片具有出色的淬灭能力。从图3d中,在添加的目标miRNA-21下发现了荧光恢复,这主要归因于FAM-ssDNA与目标miRNA-21之间的互补结合,然后从铋纳米片解吸。
为了进一步验证观察结果,我们进行了图3e所示的荧光光谱测量。FAM标记的ssDNA(探针)在525nm波长处显示强发射。添加铋纳米片后,探针的荧光淬灭至几乎不明显。由于dsDNA与铋纳米片之间的弱相互作用,荧光强度大大提高到400(红色曲线)。
为了确认该平台的敏感性,将不同浓度的miRNA-21与FAM-ssDNA探针杂交,然后与铋纳米片混合。图3f显示了添加0至500nM不同浓度的miRNA-21后,FAM-ssDNA荧光光谱的变化。随着miRNA-21浓度的增加,荧光强度逐渐增加。
为了研究该平台的选择,图3g显示了碱基匹配和一个碱基不匹配的miRNA-21的荧光恢复响应的比较。随着miRNA-21浓度的增加,它显着增强,而与一碱基错配的miRNA-21的响应没有明显变化。图3g中荧光恢复的放大图显示,随着miRNA-21浓度在0到10nM范围内线性增加(插图,图3g),该浓度范围内的标准曲线可以很好地适用于样本miRNA-21的定量检测。极限检测为60pM(信噪比的3倍)。
上述效果实施例均直接证明了基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器能够很好地应用于样本miRNA的检测,具有检出限极高,能够检出浓度低至60pM的miRNA;还具有极高的检测特异性,能够区分单碱基错配的情况;同时该基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器还具有操作简单、检测速度快、样本需求量少等优势。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (6)
1.一种基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器,其特征在于,包括荧光标记的单链核酸探针及铋烯纳米片,所述单链核酸探针与特定miRNA互补,所述单链核酸探针吸附于铋烯纳米片表面;
所述单链核酸探针吸附于铋烯纳米片表面时,荧光淬灭;
所述特定miRNA竞争结合单链核酸探针时,荧光恢复;
所述铋烯纳米片的横向尺寸大于30nm,厚度为0.4~20nm;
所述铋烯纳米片的XRD衍射峰位于22.4°,27.1°,37.9°,39.6°,45.6°,48.7°,56°和59.3°;
所述铋烯纳米片的Raman光谱在65.6cm-1和91cm-1处分别表现出振动峰;所述荧光标记的单链核酸探针为荧光素亚酰胺标记的单链核酸探针;
所述单链核酸探针为单链DNA探针;
所述单链DNA探针的序列为5’-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’。
2.一种miRNA检测试剂盒,其特征在于,包括荧光标记的单链核酸探针及荧光淬灭剂,所述单链核酸探针与特定miRNA互补,所述荧光淬灭剂包含铋烯纳米片;
所述荧光淬灭剂结合单链核酸探针时,荧光淬灭;
所述特定miRNA竞争结合单链核酸探针时,荧光恢复。
3.如权利要求2所述的荧光淬灭型miRNA检测试剂盒,其特征在于,还包括标准浓度的特定miRNA;
所述标准浓度的特定miRNA通过竞争结合单链核酸探针,用于测定荧光恢复强度及制作标准线。
4.如权利要求3所述的荧光淬灭型miRNA检测试剂盒,其特征在于,所述荧光淬灭剂包含1~500μg/ml铋烯纳米片。
5.如权利要求3所述的荧光淬灭型miRNA检测试剂盒,其特征在于,所述标准浓度的特定miRNA包括以下浓度的特定miRNA:0nM、0.5nM、1nM、2nM、4nM、6nM、8nM和10nM。
6.一种基于铋烯纳米片荧光淬灭的生物传感器在检测miRNA上的应用。
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