CN114457192B

CN114457192B - 对唾液中EB病毒CpG位点进行甲基化分型的试剂在制备鼻咽癌诊断试剂盒中的应用

Info

Publication number: CN114457192B
Application number: CN202110769625.4A
Authority: CN
Inventors: 贾卫华; 郑小辉; 邓常密
Original assignee: Sun Yat Sen University; Sun Yat Sen University Cancer Center
Current assignee: Sun Yat Sen University; Sun Yat Sen University Cancer Center
Priority date: 2021-07-07
Filing date: 2021-07-07
Publication date: 2023-02-07
Anticipated expiration: 2041-07-07
Also published as: WO2023280050A1; CN114457192A

Abstract

本发明公开了检测唾液中EB病毒甲基化情况的试剂在制备鼻咽癌诊断试剂盒中的应用。本发明建立了一种鼻咽癌的检测方法，利用唾液进行鼻咽癌的检测。其针对鼻咽癌的诊断灵敏度高，特异性好，可有效辅助鼻咽癌的诊断。由于唾液取材具有无创无损，无需依赖医护人员和医疗器械，简单易操作的优势，使得在鼻咽癌高发地区现场开展广泛筛查成为可能，以对鼻咽癌进行早诊早治，进而提高患者生存率、改善预后。

Description

对唾液中EB病毒CpG位点进行甲基化分型的试剂在制备鼻咽癌诊断试剂盒中的应用

技术领域

本发明涉及鼻咽癌技术领域，具体地，涉及对唾液中EB病毒CpG位点进行甲基化分型的试剂在制备鼻咽癌诊断试剂盒中的应用。

背景技术

鼻咽癌是一种高侵袭性、高转移性的恶性肿瘤，在中国南方和东南亚地区广泛流行。尽管鼻咽癌早期临床阶段的病人总生存率达到了约90％，由于早期疾病基本没有任何症状，70％以上的鼻咽癌病人在首次就诊时疾病已经进展到中晚期，其生存率低于50％，因此推动鼻咽癌的早诊早治是提高鼻咽癌预后的关键。因此，临床上鼻咽癌的早诊早治是提高患者生存率、改善预后的关键突破口。如何寻找和建立简单可靠的生物学标志物用于高发区鼻咽癌的早期诊断和筛查是亟待解决的问题。

鼻咽癌临床诊断的金标准是鼻咽镜下进行组织活检取材，之后由病理医生进行病理诊断。由于取材创伤性较大、取材组织小、且依赖镜下肉眼观察，因此约有10％的患者在首次取材时诊断失败，医生和患者需面临再次或多次取材、或随访观察的抉择，易延误病情。此外，鼻咽活检严格依赖临床医生的临床经验，以及鼻咽电子镜等医疗器械，难以在高发现场开展鼻咽癌广泛筛查。无创或微创的取样技术，结合肿瘤标志物检测的研究应用对于实现鼻咽癌的筛查和早诊意义重大。

目前研究已经证实，鼻咽癌的发生与EB病毒的感染有一定的关系已有充分的研究表明，EB病毒感染在鼻咽癌的发病中扮演着重要的角色。EB病毒在全世界范围内感染90％以上的人群，已往研究表明EB病毒主要通过唾液在人群中传播，即病毒穿过口咽黏膜上皮细胞进入B淋巴细胞，通过感染转化B淋巴细胞建立长期全身性的潜伏感染。这种感染EBV的B淋巴细胞更容易聚集在口咽部淋巴组织中。在一定条件下，潜伏在B淋巴细胞中的EBV会发生激活，裂解释放EBV，进入口咽部细胞，经过进一步的裂解复制释放病毒进入唾液，感染新的宿主。

在鼻咽癌流行地区，几乎100％的未分化型鼻咽癌(WHO III型)的病变部位都可以检测到EBV基因组的存在；此外，鼻咽鳞状细胞癌(WHO I型)和非角化型鼻咽癌(WHO II型)的发生也与EBV感染密切相关，可以说鼻咽上皮细胞的EBV感染是鼻咽癌的一个重要特征。目前临床上广泛应用于鼻咽癌辅助诊断的标志物主要包括如下两个方面：

(1)EBV相关的血清学标志物(包括VCA-IgA、EA-IgA抗体检测等)已纳入临床检测，但这些血清学抗体指标最大的缺点是不能实时反映鼻咽癌鼻咽部发病和进展状况，且存在特异性以及灵敏度不足的问题，在临床上仅能提供有限参考。同时在现场筛查应用中，阳性预测值过低，约为5％，即大量阳性人群并没有鼻咽癌的发病。

(2)血浆游离EBV拷贝数的检测是目前另一种临床上应用于鼻咽癌诊断的分子标志物，但其对鼻咽癌的早期诊断和早期复发尚缺乏足够的灵敏度，在中国广东广西高发区并没有广泛开展，中国香港地区的筛查研究显示阳性预测值约为11％。

总体而言，除了阳性预测值有待进一步提高外，基于血液样本的EBV标志物的检测还依赖临床护士进行采血取样，限制了其在鼻咽癌高发现场进行全人群的推广检测，所以开发易于在高发现场推广应用的取样技术以及高效的诊断分子标志物仍然意义重大。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供对唾液中EB病毒CpG位点进行甲基化分型的试剂在制备鼻咽癌诊断试剂盒中的应用。

本发明的第一个目的是提供对唾液中EB病毒CpG位点进行甲基化分型的试剂在制备鼻咽癌诊断试剂盒中的应用。

本发明的第二个目的是提供一组用于检测鼻咽癌的引物组。

本发明的第三个目的是提供一种检测鼻咽癌的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

发明人研究发现，虽然EB病毒感染者都会释放EB病毒到唾液中，但是鼻咽癌患者唾液中的EBV-DNA会发生显著的甲基化变化，即在正常人的唾液中，EB病毒DNA上大多数CpG位点甲基化的密度是小于50％的，而在鼻咽癌患者的唾液中，EB病毒DNA上大多数CpG位点甲基化的密度是大于50％的，这一变化规律以往并没有被留意到，属于首次发现。我们推测病人口咽部EB病毒发生了由裂解感染到潜伏感染的切换，虽然这一变化规律背后的分子机制及与鼻咽癌发生的关系还不是非常明确，但是根据这一新发现的规律，通过开展唾液的液体活检，即对EB病毒特定CpG位点进行甲基化分型的检测，从而能够实现对鼻咽癌的无创诊断。

因此本发明要求保护对唾液中EB病毒CpG位点进行甲基化分型的试剂在制备鼻咽癌诊断试剂盒中的应用。

优选地，所述试剂对EB病毒基因组中以下CpG位点中的一个或几个进行甲基化分型：

所述CpG位点位于在EB病毒基因组的11029bp、11044bp、11209bp、11220bp、45849bp、55696bp、55714bp、57945bp、70375bp、108542bp、111401bp、128102bp、137676bp、137698bp和158044bp处，所述EB病毒基因组为GenBank中的LOCUS为NC_007605。

更优选地，所述试剂对EB病毒基因组中位于11029bp、11044bp、11209bp和11220bp的CpG位点进行甲基化分型。

进一步优选地，所述试剂为核苷酸序列如SEQ ID NO：1～4所示引物。

针对发生甲基化模板DNA的引物：正向引物为5’-TGTTGGCGGGAGAAGGAATAAC-3’(SEQ ID NO:1)，反向引物5’-CTAAACTTACGTAAACAAAACGT-3’(SEQ ID NO:2)；针对未发生甲基化模板DNA的引物：正向引物为5’-TTTGTTGGTGGGAGAAGGAATAAT-3’(SEQ ID NO:3)，反向引物为5’-AACTAAACTTACATAAACAAAACAT-3’(SEQ ID NO:4)。

本发明还要求保护一组用于检测鼻咽癌的引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～4所示引物。

以及一种检测鼻咽癌的试剂盒，含有对唾液中EB病毒CpG位点进行甲基化分型的试剂。

优选地，所述试剂检测对EB病毒基因组中以下CpG位点中的一个或几个进行甲基化分型：

所述CpG位点位于在EB病毒基因组的11029bp、11044bp、11209bp、11220bp、45849bp、55696bp、55714bp、57945bp、70375bp、108542bp、111401bp、128102bp、137676bp、137698bp和158044bp处，所述EB病毒基因组GenBank中的LOCUS为NC_007605。

优选地，还含有染料法的q-PCR试剂。

更优选地，所述q-PCR试剂为q-PCR反应mix和无酶水。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明建立了一种鼻咽癌的检测方法，利用唾液进行鼻咽癌的检测。其针对鼻咽癌的诊断灵敏度高，特异性好，可有效辅助鼻咽癌的诊断。由于唾液取材具有无创无损，无需依赖医护人员和医疗器械，简单易操作的优势，使得在鼻咽癌高发地区现场开展广泛筛查成为可能，以对鼻咽癌进行早诊早治，进而提高患者生存率、改善预后。

附图说明

图1为捕获测序对36例唾液样本(包括20例鼻咽癌患者和16例健康对照)中EB病毒DNA上CpG位点的甲基化密度进行计算。

图2为针对位于11029bp,11044bp,11209bp和11220bp四个CpG位点引物的位置示意图。

图3为q-PCR技术对36例唾液样本EB病毒DNA位于11029bp,11044bp,11209bp和11220bp四个CpG位点进行甲基化分型。

图4为q-PCR技术对验证组1唾液样本中EB病毒DNA位于11029bp,11044bp,11209bp和11220bp四个CpG位点进行甲基化分型。

图5为q-PCR技术对验证组2唾液样本中EB病毒DNA位于11029bp,11044bp,11209bp和11220bp四个CpG位点进行甲基化分型。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1 EB病毒全基因组甲基化捕获测序

一、实验方法

1、样本来源

36例，其中20例来自鼻咽癌患者&16例来自健康对照人员。

2、唾液样本的采集

唾液样本采集前30分钟，受试者禁止实物或喝水。唾液采集前，受试者首先用生理盐水漱口，随后取样本采集杯抵住下颚，待唾液自动流出约2～5mL后，倒入事先已经加好2.5mL裂解保存液的10mL离心管，密封保存。样本DNA抽提前，可放入-80度超低温冰箱保存。

3、唾液总DNA的提取

唾液样本DNA的提取使用自动化的核酸提取工作站(设备型号为hamiltonchemagen-star)提取，每批次最大可提取96例样本。DNA的提取原理采用的是磁珠法，样本裂解后，DNA吸附到磁珠上，后经过几步清洗后洗脱，获得纯的DNA溶液，洗脱体积为150μl。

4、EB病毒DNA的捕获

由于唾液样本提取的DNA中来自宿主细胞的DNA占比较多，因此需要从总DNA中分离EB病毒的DNA进行后续实验，设计定制了覆盖EB病毒全基因组的捕获探针，从3μg唾液样本提取的总DNA中捕获EB病毒的DNA分子。

5、建库测序

捕获的EB病毒DNA分子经过重亚硫酸处理转化后，再进行扩增建立文库和二代测序。

6、对测序结果进行分析

根据测序结果，计算每个CpG位点的甲基化密度(methylation density)，即对EB病毒基因组上某一个位置的CpG位点，根据测序结果中发生甲基化的C以及未发生甲基化的T的数量，根据公式C/(C+T)计算出该位点的甲基化密度。

对EB病毒基因组上所有CpG位点的甲基化情况进行比对和分析，找出在鼻咽癌组和对照组来源的唾液EB病毒DNA中有显著差异的甲基化位点。

以上分析，使用EB病毒基因组为GenBank中的LOCUS为NC_007605。

二、实验结果

测序结果中去除EB病毒基因组上的W-region重复片段，其余区域总共7531个CpG位点，在开展的36例(20例来自鼻咽癌患者vs 16例来自健康对照人员)唾液EB病毒DNA捕获测序的实验中，检测CpG位点数量少于5％的样本有4例，进行质控后予以排除，剩余32例唾液样本包含18例鼻咽癌患者和14例健康对照。

对剩余的32例样本进行Wilcox检验，其中甲基化密度经过统计之后有显著差异的位点有5234个(P<0.05)。图1中圆形表示的是在鼻咽癌患者的唾液样本中EB病毒DNA上各CpG位点的甲基化密度(methylation density)，三角形表示的是在健康对照人员唾液样本中EB病毒DNA上各CpG位点的甲基化密度(methylation density)。

结果发现，鼻咽癌中大多数CpG位点的甲基化密度基本上都在50％以上，表明样本中发生甲基化的EBV DNA分子在总EBV DNA分子中占多数(即>50％)；对照组中大多数CpG位点的甲基化密度基本上都在50％以下，提示对照样本中发生甲基化的EBV DNA分子在总EBVDNA分子中占少数(即<50％)。

本发明首先发现鼻咽癌患者和健康对照唾液中的EB病毒甲基化情况存在本质上的差别，过往研究中并没有注意到这一规律性的变化，这为通过对唾液EB病毒的特定CpG位点的甲基化分型应用于鼻咽癌诊断提供了明确的分子基础。

实施例2筛选特定CpG位点构建应用于鼻咽癌诊断的风险预测模型

一、实验方法

1、筛选显著差异的位点进入风险预测模型：

(1)纳入条件：

在鼻咽癌患者和健康对照中甲基化密度有显著差异的CpG位点；

优先选取在特殊的病例(即整体低甲基化的病例)中高甲基化的位点；

(2)排除条件：

在特殊的对照(即整体低甲基化的对照)中高甲基化的位点。

根据纳入条件和排除条件挑选出15个位点(表1)根据以下公式构建鼻咽癌风险模型，计算区分病例对照的甲基化分型评分(methylation typing score,MTS)：

其中，β₁指在低甲基化病例中筛选的高甲基化的位点的风险预测系数，根据测试数据集中低甲基化病例与高甲基化病例的比率确定为10，c1为该位点的甲基化C计数，t1为该位点的t计数(即未甲基化的C，在重亚硫酸盐的处理下转变为T)；β₂为普遍高甲基化病例中高甲基化位点的风险预测系数，确定为1，ci是每个选入位点的甲基化C计数，ti为该位点的t计数，k为模型中纳入普遍高甲基化病例中高甲基化位点数量。

根据该风险预测模型，把15个位点的情况代入后，计算出每例样本的甲基化分型得分(methylation typing score,MTS)(表2)，病例组中甲基化分型得分值为10.42-87.95，对照组中甲基化分型得分值为0-9.72，所以设定MTS截断值＝10，根据MTS实现对18例鼻咽癌患者和14例健康对照的有效区分，即敏感度和特异度都为100％。

表1 EB病毒基因组上15个CpG位点的位置及其所在的基因

表2 EB病毒15个CpG位点代入风险预测模型计算每例样本的甲基化分型得分

实施例3鼻咽癌患者与健康人的甲基化程度

一、实验方法

为了进一步降低对EB病毒CpG位点甲基化分型检测的成本，使技术方案便于现场广泛推广，在捕获测序结果的基础上，利用q-PCR的技术手段，对EB病毒特定位点的甲基化进行甲基化程度定量计算(methylation degree)。

根据筛选出的15个位点的分布情况，留意到EBV基因组上11029bp，11044bp，11209bp和11220bp四个连续的CpG位点相距较近，便于设计引物进行PCR扩增，因此选择覆盖这四个位点的区域(即EB病毒DNA C启动子区11021～11232bp区域)作为q-PCR检测的模板。设计两对引物，其中一对引物是针对发生甲基化的模板EBV DNA进行扩增，另一对引物是针对未发生甲基化的模板EBV DNA进行扩增。

如图2所示，图中红色表示引物所在位置的序列，针对发生甲基化模板DNA的引物：正向引物为5’-TGTTGGCGGGAGAAGGAATAAC-3’(SEQ ID NO:1)，反向引物5’-CTAAACTTACGTAAACAAAACGT-3’(SEQ ID NO:2)；针对未发生甲基化模板DNA的引物：正向引物为5’-TTTGTTGGTGGGAGAAGGAATAAT-3’(SEQ ID NO:3)，反向引物为5’-AACTAAACTTACATAAACAAAACAT-3’(SEQ ID NO:4)。两对引物中的正向引物利用11029和11044bp的两个CpG位点(图中阴影表示)，反向引物利用11209和11220bp的两个CpG位点(图中阴影表示)。

在同样的反应体系下，进行染料法的q-PCR。q-PCR反应体系为15μL，包括7.5μL的q-PCR反应mix，1μL的引物，5.5μL的无酶水，以及1μL重亚硫酸盐处理后的DNA模板。

q-PCR反应条件为:95℃10min，40个扩增循环(95℃30s,60℃35s和72℃30s)，72℃7min。

当样本中发生甲基化的EBV DNA数量较多(即大于总EBV DNA模板数量的50％)，则q-PCR反应中针对发生甲基化模板DNA扩增的Ct(m)值会小于针对未发生甲基化的模板扩增的Ct(u)值，如果样本中发生甲基化的模板DNA数量较少(即小于总EBV DNA模板数量的50％)，则结果相反。最后通过相对表达量的计算，即采用2^{-[Ct(m)-Ct(u)]}的计算法则得出每一例样本对11029bp,11044bp,11209bp和11220bp四个甲基化位点进行分型的甲基化程度值。

根据EB病毒全基因组甲基化测序的结果，来自鼻咽癌患者的唾液中EBV DNA多数是发生甲基化的，经过2^{-[Ct(m)-Ct(u)]}计算后甲基化程度应该>1，而来自对照组人员的唾液中EBV DNA多数是未发生甲基化的，经过该公式计算后甲基化程度应该<1。

利用这一方法检测实施例1进行捕获测序的36例样本，20例来自鼻咽癌患者，16例来自健康对照(探索组)。

二、实验结果

结果如下表1和图3所示，结果显示，鼻咽癌患者的唾液中EB病毒DNA的甲基化程度平均值为7.72，甲基化程度的范围为0.02～53.4，健康对照人员唾液EB病毒DNA的甲基化程度平均值只有0.11，甲基化程度的范围为0.16×10^-3～0.53。

把甲基化程度＝1设为截断值(Cut off value)，该技术体系对甲基化分型后，诊断鼻咽癌的敏感度为90％，特异度为100％。

表1通过q-PCR技术体系对EB病毒甲基化进行分型，应用于鼻咽癌诊断的敏感度和特异度计算统计如下(选取的cut off value＝1)

实施例4一种鼻咽癌的检测试剂盒

一、组成

核苷酸序列如SEQ ID NO:1～4所示的引物，染料法的q-PCR试剂。

其中，SEQ ID NO:1～2所示引物为针对发生甲基化模板DNA的引物，SEQ ID NO:3～4所示引物为针对未发生甲基化模板DNA的引物。

二、使用方法

在同样的反应体系下，分别使用SEQ ID NO:1～2所示引物和SEQ ID NO:3～4所示引物对待测唾液样本DNA进行染料法的q-PCR。

q-PCR反应体系为15μL，包括7.5μL的q-PCR反应mix，1μL的引物，5.5μL的无酶水，以及1μL DNA模板。

三、结果判读

针对发生甲基化模板DNA的引物扩增的Ct值小于针对甲基化模板DNA的引物扩增的Ct值，说明发生甲基化的EBV DNA数量较多(即大于总EBV DNA模板数量的50％)，则样本来源患者大概率为鼻咽癌阳性；针对发生甲基化模板DNA的引物扩增的Ct值大于针对甲基化模板DNA的引物扩增的Ct值，说明发生甲基化的EBV DNA数量较少(即小于总EBV DNA模板数量的50％)，则样本来源患者大概率为鼻咽癌阴性。

实施例5广东四会居民样本的检测

一、实验方法

在确定实施例3的q-PCR的技术体系可以对EB病毒甲基化情况进行分型，并指示是否患鼻咽癌与否后，使用实施例4的试剂盒进一步在49例鼻咽癌患者的唾液样本DNA，65例健康对照人员的唾液样本DNA中进行检测验证，这组样本定义为验证组1。该样本集是一个基于高发现场的病例对照研究，即病例来源于在广东四会居民体检时，通过鼻内镜检查发现的鼻咽癌患者，健康对照为经过鼻内镜检查排除鼻咽癌的体检人员

二、实验结果

结果如下表2和图4所示，实验结果显示，在49例鼻咽癌患者唾液中，EB病毒DNA的甲基化程度平均值为68.81，表达范围为1.0×10^-5～754.8，而在65例健康对照人员的唾液样本DNA中，EB病毒DNA的甲基化程度值平均为3.985，表达范围为2.1×10^-5～195.4。同样以甲基化程度＝1为截断值，对鼻咽癌诊断的敏感度为83.67％(8/49)，特异度为89.23％(7/65)。

表2：

实施例6中山大学肿瘤防治中心样本的检测

一、实验方法

在上述研究的基础上，使用实施4的试剂盒进一步在另一个样本集进行验证，该样本集定义为验证组2，收集的唾液样本来自60例的鼻咽癌患者和123例的对照。该样本集是一个基于医院的病例对照研究，即病例样本来自中山大学肿瘤防治中心就诊的鼻咽癌患者。

二、实验结果

结果如下表3和如图5所示，60例鼻咽癌患者唾液中，EB病毒DNA的甲基化程度平均值为42.72，表达范围为0.014～474.4，而在123例健康对照人员的唾液样本DNA中，EB病毒DNA的甲基化程度值平均为8.48，表达范围为1.71×10^-8～337.8).同样以甲基化程度＝1为截断值，对鼻咽癌诊断的敏感度为86.67％(8/60)，特异度为89.23％(14/123)。

表3

实施例7各组数据汇总统计

一、实验方法

对以上探索组、验证组1和验证组2的数据进行汇总统计。

二、实验结果

结果如下表4所示，结果说明通过对唾液EB病毒DNA特定的CpG位点进行甲基化分型检测，可以实现对鼻咽癌的有效诊断，诊断的敏感度达到86.05％，特异度达到89.71％。

表4：

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 中山大学

中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所）

<120> 对唾液中EB病毒CpG位点进行甲基化分型的试剂在制备鼻咽癌诊断试剂盒中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgttggcggg agaaggaata ac 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctaaacttac gtaaacaaaa cgt 23

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttgttggtg ggagaaggaa taat 24

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aactaaactt acataaacaa aacat 25

Claims

1.对唾液中EB病毒CpG位点进行甲基化分型的试剂在制备鼻咽癌诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂对EB病毒基因组中位于11029bp、11044bp、11209bp和11220bp的CpG位点进行甲基化分型，所述EB病毒基因组为GenBank中的LOCUS为NC_007605。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂为核苷酸序列如SEQ ID NO ：1～4所示引物。