WO2017142219A1 - Tmem57 또는 nudc 유전자를 이용한 백혈병 진단용 조성물 - Google Patents

Tmem57 또는 nudc 유전자를 이용한 백혈병 진단용 조성물 Download PDF

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WO2017142219A1
WO2017142219A1 PCT/KR2017/000659 KR2017000659W WO2017142219A1 WO 2017142219 A1 WO2017142219 A1 WO 2017142219A1 KR 2017000659 W KR2017000659 W KR 2017000659W WO 2017142219 A1 WO2017142219 A1 WO 2017142219A1
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leukemia
level
gene
tmem57
diagnosing
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PCT/KR2017/000659
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Inventor
김민정
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숙명여자대학교산학협력단
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the present invention relates to a composition for diagnosing leukemia using a gene encoding TMEM57 or NudC.
  • Leukemia refers to a term that refers to a disease or condition in which leukocytes proliferate oncologically.
  • Types of leukemia can be divided into myeloid leukemia and lymphocytic leukemia according to the leukocyte origin of leukemia, and is divided into acute leukemia and chronic leukemia according to the progress rate.
  • leukemia results from disorders of myeloid blasts that begin to differentiate in the relatively early stages of hematopoiesis.
  • Genes used as target genes for diagnosing such genetic variations are known as CYP, GST, NAT, MTHFR, NQO1, XRCC1, MDR1, cyclin D1, Trk A and CCND1 (see Patent Document 1). Since only a few patients can reliably detect the development of leukemia by using the gene as a marker, there is an urgent need for more diverse leukemia diagnostic gene markers.
  • Patent Document 1 Republic of Korea Patent Publication No. 10-2015-0018276
  • the present inventors have attempted to develop a novel leukemia diagnostic genetic marker to solve the above-mentioned problems of the prior art, and as a result of this research effort, leukemia cell lines, in particular, patients with Acute lymphoblastic leukemia (ALL), acute myeloid
  • ALL Acute lymphoblastic leukemia
  • the gene was identified as a gene marker for diagnosing leukemia by confirming a decrease in the expression level of NudC in the cell line of AML patients and a decrease in the expression of TMEM57 in patients with AML myeloid leukemia (AML). It was confirmed that it can be used to complete the present invention.
  • the present invention provides a composition for diagnosing leukemia comprising an agent for measuring the mRNA level of a gene encoding TMEM57 or NudC or the level of a protein expressed therefrom.
  • the present invention also provides a kit for diagnosing leukemia comprising a composition for diagnosing leukemia comprising an agent for measuring the mRNA level of the gene encoding TMEM57 or NudC or the protein expressed therefrom.
  • the present invention comprises the steps of (a) measuring the mRNA level of the gene encoding TMEM57 or NudC or the protein expressed therefrom from a biological sample of a patient suspected of developing leukemia; And (b) comparing the measured mRNA level or the level of the protein expressed therefrom with the level measured from a sample of a normal control group, and determining that the leukemia has occurred if there is a significant difference. It provides a method of providing information for.
  • the present invention comprises the steps of: (a) measuring the expression level of the gene encoding TMEM57 or NudC or the level of the protein encoded from a sample of a control animal leukemia disease; (b) administering to the experimental animal a candidate substance expected to be able to treat leukemia; (c) measuring the expression level of a gene encoding TMEM57 or NudC or the level of the protein encoded by a sample of a test animal administered with the candidate substance; And (d) comparing the expression level of the gene measured in the control group or the level of the protein encoded by the gene with the level measured in the experimental group compared to the level measured in the control group, compared to that measured in the experimental group. It provides a method for screening a leukemia prevention or treatment agent comprising the step of determining that the substance can be used as a prophylactic agent for preventing the development of leukemia or as a therapeutic agent for treating leukemia.
  • the present invention provides a composition for diagnosing leukemia comprising an agent for measuring the mRNA level of the gene encoding TMEM57 or NudC or the level of protein expressed therefrom.
  • the present inventors conducted various studies to develop new leukemia diagnostic gene markers, and found that TMEM57 is related to immune cells and notch signaling pathway, and that the expression of TMEM57 or NudC gene in leukemia patients is different from normal people. By confirming, the gene was noticed. The purpose of this study was to determine whether the gene encoding TMEM57 or NudC can be used for the diagnosis of leukemia.
  • genes encoding TMEM57 were expressed lower than normal subjects, especially in ALL patients.
  • TMEM57 refers to Transmembrane protein 57, wherein the specific sequence and protein information of the TMEM57 is known from NCBI (GenBank number AAH32427.1).
  • NudC refers to a nuclear transfer protein (Nuclear distribution protein), the specific sequence and protein information of the NudC is known from the NCBI (GenBank number NM_006600.3).
  • the leukemia stage referred to herein is the same as meaning according to the French-American-British (FAB) classification.
  • MO stage of leukemia cells in AML patients refers to the stage in which myeloid cells show no signs of differentiation, accounting for about 5% of adult AML patients and with a significant prognosis It is known as bad leukemia.
  • M1 stage of leukemia cells of AML patients refers to the stage in which myeloid cells show signs of differentiation into granulocytes, which is known to account for about 15% of adult AML patients. .
  • M2 stage of leukemia cells in AML patients myelogenous leukemia state
  • myeloid cells are out of granular leukocyte state and account for about 25% of adult AML patients.
  • the maturation of granulocytes can be observed in the M2 step, and the prognosis is good among AML types.
  • M3 stage of leukemia cells of the AML patient promyelocytic leukemia
  • most abnormal cells become granular leukocytes between myeloblasts and myelocytes, and most cells have small particles and nuclei of various sizes and shapes. It means to have.
  • the M4 stage of leukemia cells in AML patients is an acute myeloid mononuclear leukemia state that at least about 30% of the cells with nuclei are composed of myeloid and monocytes.
  • the M5 stage of leukemia cells in AML patients is mononuclear leukemia, meaning that at least about 80% of the nucleated cells are composed of monocytes.
  • the M6 stage of leukemia cells in AML patients means that at least 50% of the cells with nuclei are red leukemias that are composed of abnormal red hair cells.
  • Stage M7 of leukemia cells in AML patients means megakaryocyte leukemia.
  • the term “diagnostic” means confirming the presence or characteristic of a pathological state.
  • the “diagnosis” may be interpreted as observing and confirming the development of leukemia.
  • the term "agent for measuring mRNA level of a gene” refers to an agent used in a method for measuring the level of mRNA transcribed from the target gene in order to confirm whether a target gene included in a sample is expressed.
  • RT-PCR Competitive RT-PCR
  • Real-time RT-PCR RNase protection assay (RPA)
  • Northern blotting It may mean a probe or a primer that can specifically bind to a target gene used in a method such as DNA chip analysis, but is not particularly limited thereto.
  • primer refers to a nucleic acid sequence having a short free 3 'hydroxyl group, for example, having the same meaning as a primer in a conventional sense, and having a complementary template and base pair.
  • the term refers to a short nucleic acid sequence that can form a base pair and that serves as a starting point for template strand copying.
  • Such primers can initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) at appropriate buffers and temperatures.
  • the primer may be a primer that can be used for amplification of a gene encoding TMEM57 or NudC, and as long as it can bind to the gene and amplify the gene, the nucleotide sequence of the primer is Although not limited, preferably when amplifying a gene encoding NudC, the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1 and 2 attached to the sequence listing, SEQ ID NO: 3 and Nucleotide sequence of 4.
  • probe may mean the same meaning as a probe in a conventional sense, and may correspond to, for example, RNA or DNA corresponding to a short number of bases to hundreds of bases capable of specific binding with a gene or mRNA.
  • Nucleic acid fragments, and the like and may be prepared in the form of oligonucleotide probes, single stranded DNA probes, double stranded DNA probes, RNA probes, and the like. It can be labeled for detection.
  • the probe may be a probe capable of complementarily binding to a gene encoding TMEM57 or NudC, and the nucleotide sequence of the probe may be complementary to the TMEM57 or NudC gene. It is not limited.
  • the term "agent to measure the level of protein” refers to an agent used in a method for measuring the level of a target protein included in a sample, preferably Western blotting, ELISA (enzyme linked immunosorbent). assay, Radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement It may be an antibody used in methods such as the Complement Fixation Assay, FACS, and Protein Chip Assay.
  • the term "antibody” refers to a proteinaceous molecule capable of specifically binding to the antigenic site of a protein or peptide molecule, which antibody can be cloned into an expression vector according to a conventional method.
  • the protein encoded by the marker gene can be obtained and prepared by conventional methods from the obtained protein.
  • the form of the antibody is not particularly limited and, if it is a polyclonal antibody, a monoclonal antibody or antigen-binding, a part thereof may be included in the antibody of the present invention and may include all immunoglobulin antibodies, as well as humanized antibodies. It may also contain a special antibody of.
  • the antibodies include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains.
  • the term "functional fragment of an antibody molecule” refers to a fragment having at least antigen binding function, and may be, for example, Fab, F (ab '), F (ab') 2 and Fv.
  • the antibody may be an antibody capable of specifically binding to a TMEM57 or NudC protein, and preferably a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or a polyclonal antibody capable of specifically binding to the protein. It can be part of it.
  • the level of expression of NudC in patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL) and patients with acute myeloid leukemia (AML) is higher than that of normal bone marrow cells. This decrease was confirmed (see FIG. 1). In addition, it was confirmed that the expression level of TMEM57 in patients with acute myeloid leukemia (AML) decreased compared to normal samples.
  • ALL acute lymphoblastic leukemia
  • AML acute myeloid leukemia
  • the TMEM57 or NudC can be used as a marker for diagnosing leukemia, and it is possible to effectively diagnose leukemia by using an agent that measures the mRNA level of the gene encoding TMEM57 or NudC or the protein expressed therefrom. I could see the point.
  • the present invention also provides a kit for diagnosing leukemia comprising the composition for diagnosing leukemia.
  • the kit of the present invention can be used to diagnose leukemia by measuring the mRNA level of a gene encoding TMEM57 or NudC or a protein expressed therefrom from a sample of a patient suspected of developing leukemia.
  • a gene encoding TMEM57 or NudC or a protein expressed therefrom from a sample of a patient suspected of developing leukemia.
  • primers, probes or antibodies for measuring the mRNA level of the gene or the protein expressed therefrom as well as one or more other component compositions, solutions or devices suitable for analytical methods. It may be.
  • sample refers to a direct subject which is isolated from a leukemia patient and measures the expression level of TMEM57 or NudC, and may be, for example, blood, bone marrow, or tissue sample of a leukemia patient, but is not limited thereto. .
  • the kit for measuring the mRNA expression level of the TMEM57 or NudC gene of the present invention may be a kit containing the necessary elements necessary to perform RT-PCR.
  • the RT-PCR kit includes a test tube or other suitable container, reaction buffers (pH and magnesium concentrations vary), deoxynucleotides (dNTPs), Taq-polymerases and reverse transcriptases, in addition to each primer pair specific for the gene.
  • reaction buffers pH and magnesium concentrations vary
  • deoxynucleotides dNTPs
  • Taq-polymerases dNTPs
  • reverse transcriptases in addition to each primer pair specific for the gene.
  • enzymes DNase, RNAse inhibitors, DEPC-water (DEPC-water)
  • DEPC-water DEPC-water
  • It may also comprise primer pairs specific for the genes used as quantitative controls.
  • kits of the present invention may include the necessary elements necessary to perform DNA chip assays.
  • the DNA chip analysis kit may include a substrate on which a cDNA corresponding to a gene or a fragment thereof is attached with a probe, and a reagent, a preparation, an enzyme, or the like for preparing a fluorescence-labeled probe.
  • the substrate may comprise cDNA corresponding to the quantitative control gene or fragment thereof.
  • the kit of the present invention may be a protein chip analysis kit for measuring the level of the protein expressed from the TMEM57 or NudC gene, the kit is not particularly limited, but for immunological detection of the antibody Substrates, suitable buffers, secondary antibodies labeled with a chromophore or fluorophore, chromogenic substrate, and the like.
  • the substrate is not particularly limited thereto, but a nitrocellulose membrane, a 96 well plate synthesized with a polyvinyl resin, a 96 well plate synthesized with a polystyrene resin, a slide glass made of glass, and the like may be used.
  • peroxidase, alkaline phosphatase may be used, and the fluorescent material is not particularly limited, but may be FITC, RITC, and the like, and the colorant substrate solution is not particularly limited thereto. 2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) or OPD (o-phenylenediamine), TMB (tetramethyl benzidine).
  • the present invention also provides a method for providing information for diagnosing leukemia using the diagnostic composition or kit.
  • the method for providing information for diagnosing leukemia may include: (a) measuring the mRNA level of a gene encoding TMEM57 or NudC or the protein expressed therefrom from a biological sample of a patient suspected of developing leukemia; And (b) comparing the measured mRNA level or the level of protein expressed therefrom with a level measured from a sample of a normal control group to determine that leukemia is developed if there is a significant difference.
  • the leukemia is not particularly limited, but may be, for example, acute lymphocytic leukemia (ALL) or acute myeloid leukemia (AML).
  • ALL acute lymphocytic leukemia
  • AML acute myeloid leukemia
  • the mRNA level of the gene encoding TMEM57 or the level of the protein expressed therefrom is significantly reduced, it is determined to be AML.
  • a significant reduction in the mRNA level or the level of protein expressed therefrom may be determined to be AML or ALL.
  • the ALL may determine that one of B-cell ALL and Pro-B ALL is developed.
  • the present invention also provides a method for screening an agent for preventing or treating leukemia.
  • the method for screening a prophylactic or therapeutic agent for the treatment of leukemia a candidate substance that is expected to be able to prevent or treat the development of leukemia is administered to the experimental animal, encoding TMEM57 or NudC from the administered experimental animal
  • the present invention relates to a method for screening an agent for preventing or treating leukemia, including measuring the mRNA level of a gene or a protein expressed therefrom.
  • Measuring the expression level of the gene of the present invention or the level of the protein encoded by the gene in a cell in the absence of a candidate agent capable of preventing or treating leukemia, and also in the presence of the candidate agent After comparing the two by measuring the expression level or the level of the protein encoded by the gene, a substance that changes the expression level of the gene of the present invention or the level of the protein encoded by the leukemia when the candidate substance is present It can be expected as a prophylactic or therapeutic agent for.
  • the method for screening an agent for preventing or treating leukemia of the present invention (a) the expression level of the gene encoding TMEM57 or NudC or the protein encoding the gene from the sample of the leukemia in the control animal Measuring the level; (b) administering to the experimental animal a candidate substance expected to be able to treat leukemia; (c) measuring the expression level of a gene encoding TMEM57 or NudC or the level of the protein encoded by a sample of a test animal administered with the candidate substance; And (d) comparing the expression level of the gene measured in the control group or the level of the protein encoded by the gene with the level measured in the experimental group compared to the level measured in the control group, compared to that measured in the experimental group. Determining that the substance can be used as a prophylactic agent for preventing the development of leukemia or as a therapeutic agent for treating leukemia.
  • the leukemia is ALL or AML
  • the level measured in the experimental group is higher than the level measured in the control group, it can be determined that it can be used as a therapeutic agent.
  • the expression of the gene encoding TMEM57 or NudC is acute lymphocytic leukemia or acute myeloid leukemia patients
  • FIG. 1 is a diagram showing the decrease in the expression of NudC in leukemia cells of patients with Acute lymphoblastic leukemia (ALL) and patients with Acute myeloid leukemia (AML).
  • ALL Acute lymphoblastic leukemia
  • AML Acute myeloid leukemia
  • TMEM57 is reduced in leukemia cells of patients with acute myeloid leukemia (AML).
  • Figure 3 is a diagram confirming the expression level of TMEM57, NOTCH and HES1 for each stage of differentiation of leukemia cells of patients with acute myeloid leukemia (AML).
  • RNA from monocytes was extracted using AccuPrepGenomic DNA extraction kit and ExiPrep cell total RNA kit (Bioneer, Daejeon, Korea), and cDNA was generated using Superscript III Reverse Transcriptase (Applied Biosystems).
  • mRNA sets expressed using the primer sets of SEQ ID NOs: 1 and 2 and SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa) were quantitatively analyzed, and ⁇ -actin mRNA was used as a control for standardization.
  • Real-time quantitative PCR was performed using Rotor-Gene Q (QIAGEN), and changes in gene expression were calculated using the Com Ct method. The results of confirming the degree of NudC expression of monocytes of the AML or ALL patients are shown in FIG. 1.
  • the NudC can be used as a marker for diagnosing AML or ALL.
  • TMEM57 specifically in monocytes of AML patients is significantly reduced compared to the expression in the bone marrow.
  • TMEM57 confirmed that the expression of AML patients from stage M0 to M2 is reduced.
  • TMEM57 can be used as a marker for diagnosing AML patients.

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Abstract

본 발명은 백혈병 진단용 조성물, 키트, 진단을 위한 정보를 제공하는 방법 및 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 백혈병 진단용 조성물, 키트, 진단을 위한 정보를 제공하는 방법 및 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법을 사용할 경우, TMEM57 또는 NudC를 코딩하는 유전자의 발현이 급성 림프구성 백혈병 또는 급성 골수성 백혈병 환자의 세포에서 정상세포보다 현저히 감소하는 점을 확인함으로써, 정상세포와의 비교에 의한 백혈병의 초기 단계에서의 진단이 가능하고, 급성 림프구성 백혈병 또는 급성 골수성 백혈병 진단에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

TMEM57 또는 NUDC 유전자를 이용한 백혈병 진단용 조성물
본 발명은 TMEM57 또는 NudC를 코딩하는 유전자를 이용한 백혈병 진단용 조성물에 관한 것이다.
백혈병(leukemia)은 백혈구가 종양성으로 증식하는 질환 또는 질병을 총칭하는 용어를 의미한다.
백혈병의 종류는 백혈병이 기원하는 백혈구에 따라 골수성 백혈병과 림프성 백혈병으로 나눌 수 있고, 진행 속도에 따라 급성 백혈병과 만성 백혈병으로 나뉜다.
한편, 백혈병의 임상 양상은 질환의 유형과 침범된 세포의 성질에 따라 다양하다. 림프성 백혈병은 림프계 혈액 세포가, 골수성 백혈병은 골수계 혈액세포가, 그리고 만성 골수성 백혈병은 성숙기에 있는 세포가 변이, 즉 혈구 모세포(pluripotent hematopoietic stem cell)의 악성 클론들에 의해서 발생하며, 급성 골수성 백혈병은 비교적 초기단계의 조혈과정에서 분화를 시작하는 골수계 모세포의 장애로 초래된다.
이러한 백혈병을 진단하기 위해 종래에는 환자의 말초 혈중의 백혈구 수를 측정하여, 계측치가 정상치를 웃도는 경우에 백혈병의 발생을 의심하는 방법을 사용하여 왔으나, 감기 등의 백혈병 이외의 질환에 있어서도, 체내의 면역 반응의 항진에 의해 백혈구 수는 증대하므로, 백혈구 수의 측정만으로는, 양성 오류의 가능성이 있다는 문제점이 있었다.
이에 보다 신뢰성이 있는 백혈병이라는 특정 질환만을 진단할 수 있는 백혈병 진단 방법을 개발하려는 연구가 계속되었다.
최근 분자유전학이 발달되고, 악성 혈액질환의 80-90% 이상에서 백혈병 관련 특이 염색체 및 유전자의 이상이 어느 정도 규명되면서, 염색체 이상에 의한 분자생물학적 진단 방법인 고 분염법, 형광 in situ hybridization, 중합효소 연쇄반응법 등이 제안되었으며, 이러한 진단 방법을 사용할 경우, 백혈병 진단 성공율을 향상시키고 있다. 특히, 급성 림프구성 백혈병의 경우에는 종양 억제 유전자(tumor suppressor gene), 암유전자(oncogene) 및 몇몇 염색체에 영향을 미치는 유전적 돌연변이가 주된 발병원인으로 알려져 있기 때문에, 유전적 변이를 검출하여 백혈병의 발병 여부를 판단하는 방법이 사용되고 있다.
이와 같은 유전적 변이를 진단할 수 있는 대상 유전자로 사용되는 유전자로는 CYP, GST, NAT, MTHFR, NQO1, XRCC1, MDR1, cyclin D1, Trk A 및 CCND1 등이 알려져 있으나(특허 문헌 1 참조), 상기 유전자를 마커로 사용하여 백혈병의 발병여부를 신뢰성있게 검출할 수 있는 환자는 아직까지도 일부에 불과하므로, 보다 다양한 백혈병 진단용 유전자 마커에 대한 필요성이 절실한 실정이다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
특허문헌 1 : 대한민국 공개특허 제10-2015-0018276호
본 발명자들은 상기 언급한 종래 기술의 문제점 해결을 위해 새로운 백혈병 진단용 유전자 마커를 개발하고자 하였으며, 이러한 연구 노력의 결과로서, 백혈병 세포주, 특히, 급성 림프구성 백혈병(Acute lymphoblastic leukemia, ALL) 환자, 급성 골수성 백혈병(Acute myeloid leukemia, AML) 환자의 세포주에서 NudC의 발현양이 감소하였고, 급성 골수성 백혈병(Acute myeloid leukemia, AML) 환자에게서 TMEM57의 발현이 감소함을 확인함으로써, 상기 유전자를 백혈병 진단용 유전자 마커로서 사용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 TMEM57 또는 NudC를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 백혈병 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 TMEM57 또는 NudC를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 백혈병 진단용 조성물을 포함하는 백혈병 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 백혈병의 발병이 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 TMEM57 또는 NudC를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 정상 대조군의 시료로부터 측정된 수준과 비교하여, 유의한 차이를 나타내는 경우 백혈병이 발병된 것으로 판정하는 단계를 포함하는 백혈병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 대조군인 백혈병이 발병된 실험동물의 시료로부터 TMEM57 또는 NudC를 코딩하는 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; (b) 백혈병을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질을 상기 실험동물에 투여하는 단계; (c) 실험군인 상기 후보물질이 투여된 실험동물의 시료로부터 TMEM57 또는 NudC를 코딩하는 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (d) 대조군에서 측정된 유전자의 발현수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 실험군에서 측정된 것과 비교하여, 대조군에서 측정된 수준에 비하여 실험군에서 측정된 수준이 차이를 나타내는 경우, 상기 후보물질을 백혈병의 발병을 방지하는 예방용 제제 또는 백혈병을 치료하는 치료용 제제로서 사용할 수 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는 백혈병 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 실시양태로서, 본 발명은 TMEM57 또는 NudC를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 백혈병 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 새로운 백혈병 진단용 유전자 마커를 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, TMEM57과 면역세포와 관련성 및 노치 신호경로와 관련성이 있음을 알아내고, 백혈병 환자의 TMEM57 또는 NudC 유전자의 발현이 정상인과 다름을 확인함으로써, 상기 유전자를 주목하게 되었다. 상기 TMEM57 또는 NudC을 코딩하는 유전자가 백혈병의 진단에도 사용될 수 있는지의 여부를 확인하고자 하였다.
NudC를 코딩하는 유전자의 경우, 백혈병의 종류 중 급성 림프구성 백혈병(Acute lymphoblastic leukemia, ALL) 환자 및 급성 골수성 백혈병(Acute myeloid leukemia, AML) 환자에서 정상인보다 유전자 발현양이 감소하였다.
또한, TMEM57를 코딩하는 유전자의 경우, 특히 ALL 환자에서 정상인보다 낮게 발현되었다.
본 명세서상의 용어 "TMEM57"이란, Transmembrane protein 57을 나타내는 용어로서, 상기 TMEM57의 상기 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank number AAH32427.1).
또한, 본 명세서상의 용어 "NudC" 란, 핵이동 단백질(Nuclear distribution protein)로써, 상기 NudC의 상기 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank number NM_006600.3).
또한, 본 명세서상에서 언급되는 백혈병 단계는 French-American-British (FAB) classification을 따른 의미와 동일하다.
보다 구체적으로, "AML 환자의 백혈병 세포의 MO 단계(분화되지 않은 급성골수성 백혈병 상태)"란 골수세포가 분화의 징후가 나타나지 않은 단계를 의미하며, 성인 AML 환자의 약 5%를 차지하고 예후가 상당히 나쁜 백혈병으로 알려져 있다. 또한, "AML 환자의 백혈병 세포의 M1 단계(골수아구성의 백혈병 상태)"란 골수세포가 과립성 백혈구로 분화의 징후가 나타나는 단계를 의미하고 이는 성인 AML 환자의 약 15%를 차지하는 것으로 알려져 있다. "AML 환자의 백혈병 세포의 M2 단계(골수아구성의 백혈병 상태)"란 골수세포가 과립성 백혈구 상태를 벗어난 상태를 의미하고 성인 AML 환자의 약 25%를 차지하는 것으로 알려져 있다. 특히, 상기 M2 단계에서는 과립성 백혈구의 성숙이 관찰될 수 있으며, AML 종류 중 예후가 좋은 편이다. 또한, AML 환자의 백혈병 세포의 M3단계(전골수세포성 백혈병 상태)에서는 대부분의 이상 세포는 myeloblasts와 myelocytes 사이의 과립성 백혈구가 되며, 대부분의 세포는 작은 입자와 다양한 크기와 형태를 갖는 핵을 갖는 것을 의미한다. 특히, 다른 아형에 비해 ATRA (All Trans-Retinoic Acid)를 사용하여 치료할 수 있는 특이성이 있으며, AML 중 예후가 가장 좋은 단계로 알려져 있다. 또한, AML 환자의 백혈병 세포의 M4 단계는, 급성 골수구단핵구성 백혈병 상태로서 핵을 가지고 있는 세포의 약 30% 이상이 골수모구와 단핵모구로 구성되어 있음을 의미한다. AML 환자의 백혈병 세포의 M5 단계는, 단핵구성 백혈병으로 유핵세포의 약 80% 이상이 단핵구계로 구성되어 있음을 의미한다. AML 환자의 백혈병 세포의 M6 단계는 적백혈병으로 핵을 가지고 있는 세포의 약 50% 이상이 비정상형의 적모구로 이루어져 있음을 의미한다. AML 환자의 백혈병 세포의 M7 단계는 거핵모구성 백혈병을 의미한다.
본 명세서상의 용어 "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서는, 상기 "진단"은 백혈병의 발병 여부를 관찰 및 확인하는 것으로 해석될 수 있다.
본 명세서상의 용어 "유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제"란, 시료에 포함된 표적 유전자의 발현 여부를 확인하기 위하여, 상기 표적 유전자로부터 전사된 mRNA의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는데, 바람직하게는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA;RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), DNA 칩 분석법 등의 방법에 사용되는 표적 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브 또는 프라이머를 의미할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 명세서상의 용어 "프라이머"란, 통상적인 의미의 프라이머와 동일한 의미로서, 예를 들어 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열을 의미하고, 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 일컫는 용어이다. 이러한 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 TMEM57 또는 NudC를 코딩하는 유전자의 증폭에 사용될 수 있는 프라이머가 될 수 있고, 상기 유전자와 상보적으로 결합하여 상기 유전자를 증폭시킬 수 있는 한, 상기 프라이머의 뉴클레오티드 서열은 제한되지 않으나, 바람직하게는 NudC를 코딩하는 유전자를 증폭하는 경우, 서열 목록으로 첨부된 서열번호 1 및 2의 뉴클레오티드 서열, TMEM57를 코딩하는 유전자를 증폭하는 경우, 서열 목록으로 첨부된 서열번호 3 및 4의 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
본 명세서상의 용어 "프로브"란, 통상적인 의미의 프로브와 동일한 의미일 수 있고, 예를 들어 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미할 수 있고, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프로브는 TMEM57 또는 NudC를 코딩하는 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브가 될 수 있고, 상기 TMEM57 또는 NudC 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 한, 상기 프로브의 뉴클레오티드 서열은 제한되지 않는다.
본 명세서상의 용어 "단백질의 수준을 측정하는 제제"란, 시료에 포함된 표적 단백질의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는데, 바람직하게는 웨스턴 블럿(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩 분석법(protein chip assay) 등의 방법에 사용되는 항체가 될 수 있다.
본 명세서상의 용어 "항체"란, 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현 벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다.
상기 "항체 분자의 기능적인 단편"이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, 예를 들어 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 TMEM57 또는 NudC 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 될 수 있고, 바람직하게는 상기 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 그의 일부가 될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 급성 림프구성 백혈병(Acute lymphoblastic leukemia, ALL) 환자, 급성 골수성 백혈병(Acute myeloid leukemia, AML) 환자를 대상으로 NudC 발현 수준을 비교한 결과, 정상 골수세포보다 발현 수준이 감소함을 확인하였다(도 1 참조). 또한, 급성 골수성 백혈병(Acute myeloid leukemia, AML) 환자에서 TMEM57 발현 수준이 정상인 시료와 비교하여 감소함을 확인하였다.
따라서, 상기 TMEM57 또는 NudC는 백혈병 진단을 위한 마커로서 사용될 수 있다는 점 및 TMEM57 또는 NudC를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 이용하면 백혈병을 효과적으로 진단할 수 있다는 점을 알 수 있었다.
본 발명은 또한 상기 백혈병 진단용 조성물을 포함하는 백혈병 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 백혈병의 발병이 의심되는 환자의 시료로부터 TMEM57 또는 NudC를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하여 백혈병의 발병여부를 확인함으로써 백혈병을 진단하는데 사용될 수 있는데, 특별히 제한되지는 않으나, 상기 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 항체 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수도 있다.
본 명세서상의 용어 "시료"란, 백혈병 환자로부터 분리되어 TMEM57 또는 NudC의 발현 수준을 측정하는 직접적인 대상을 의미하고, 예를 들어 백혈병 환자의 혈액, 골수, 조직 시료 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적인 일례로서, 본 발명의 TMEM57 또는 NudC 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다.
RT-PCR 키트는, 상기 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
다른 일례로서, 본 발명의 키트는 DNA 칩 분석법을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 분석용 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
또 다른 일례로서, 본 발명의 키트는 TMEM57 또는 NudC 유전자로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하기 위한 단백질 칩 분석용 키트가 될 수 있는데, 상기 키트는 특별히 이에 제한되지 않으나, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다.
상기 기재는 특별히 이에 제한되지 않으나 니트로셀룰로오스막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 특별히 이에 제한되지 않으나 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있으며, 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나 FITC, RITC 등이 될 수 있고, 발색 기질액은 특별히 이에 제한되지 않으나 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 진단용 조성물 또는 키트를 이용하여 백혈병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 백혈병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은, (a) 백혈병의 발병이 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 TMEM57 또는 NudC를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 정상 대조군의 시료로부터 측정된 수준과 비교하여, 유의한 차이를 나타내는 경우 백혈병이 발병된 것으로 판정하는 단계를 포함한다.
상기 백혈병은 특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 급성 골수성 백혈병(AML)등일 수 있다.
상기 백혈병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 사용할 경우, TMEM57를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준이 유의하게 감소하는 경우에는 AML이 된 것으로 판정하고, NudC를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준이 유의하게 감소하는 경우에는 AML 또는 ALL이 발병된 것으로 판정할 수 있다. 또한, ALL이 발병된 것으로 판정된 경우, 상기 ALL은 B-cell ALL 및 Pro-B ALL 중의 하나가 발병된 것으로 판단할 수 있다.
한편, 상기 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 방법은 전술한 내용과 동일하다.
본 발명은 또한 백혈병의 예방 또는 치료용 제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, 상기 백혈병의 예방 또는 치료용 제제를 스크리닝하는 방법은, 백혈병의 발병을 예방 또는 치료할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질을 실험동물에 투여하고, 상기 투여된 실험동물로부터 TMEM57 또는 NudC를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 백혈병의 예방 또는 치료용 제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
백혈병을 예방 또는 치료할 수 있는 후보 물질의 부재 하에 세포에서의 본 발명의 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하고, 또한, 상기 후보 물질의 존재 하에서 본 발명의 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 상기 후보 물질이 존재할 때의 본 발명의 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 변화시키는 물질을 백혈병의 예방 또는 치료용 제제로 예측할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 백혈병 예방 또는 치료용 제제를 스크리닝하는 방법은, (a) 대조군인 백혈병이 발병된 실험동물의 시료로부터 TMEM57 또는 NudC를 코딩하는 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; (b) 백혈병을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질을 상기 실험동물에 투여하는 단계; (c) 실험군인 상기 후보물질이 투여된 실험동물의 시료로부터 TMEM57 또는 NudC를 코딩하는 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (d) 대조군에서 측정된 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 실험군에서 측정된 것과 비교하여, 대조군에서 측정된 수준에 비하여 실험군에서 측정된 수준이 차이를 나타내는 경우, 상기 후보물질을 백혈병의 발병을 방지하는 예방용 제제 또는 백혈병을 치료하는 치료용 제제로서 사용할 수 있는 것으로 판정하는 단계를 포함한다.
이 경우, 상기 백혈병이 ALL 또는 AML인 경우에 대조군에서 측정된 수준에 비하여 실험군에서 측정된 수준이 높은 수준을 나타낼 때, 치료용 제제로서 사용할 수 있는 것으로 판정할 수 있다.
본 발명에 따른 백혈병 진단용 조성물, 키트, 진단을 위한 정보를 제공하는 방법 및 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법을 사용할 경우, TMEM57 또는 NudC를 코딩하는 유전자의 발현이 급성 림프구성 백혈병 또는 급성 골수성 백혈병 환자의 세포에서 정상세포보다 현저히 감소하는 점을 확인함으로써, 정상세포와의 비교에 의한 백혈병의 초기 단계에서의 진단이 가능하고, 급성 림프구성 백혈병 또는 급성 골수성 백혈병 진단에 유용하게 활용될 수 있다.
첨부된 도면은 해당 기술 분야의 통상의 기술자에게 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 기술적 사상이 이에 한정되는 것은 아니다.
도 1은, 급성 림프구성 백혈병(Acute lymphoblastic leukemia, ALL) 환자 및 급성 골수성 백혈병(Acute myeloid leukemia, AML) 환자의 백혈병 세포에서 NudC의 발현이 감소됨을 확인한 도이다.
도 2는, 급성 골수성 백혈병(Acute myeloid leukemia, AML) 환자의 백혈병 세포에서 TMEM57의 발현이 감소됨을 확인한 도이다.
도 3은, 급성 골수성 백혈병(Acute myeloid leukemia, AML) 환자의 백혈병 세포의 분화 단계마다 TMEM57, NOTCH 및 HES1의 발현 수준을 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] NudC 및 백혈병 상호간의 상관관계 확인
NudC 유전자 및 백혈병 상호간 상관관계를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
우선, 백혈병의 진단은 2008년 World Health Organization의 기준에 따라 수행하였다. ficoll hypaque (Sigma-aldrich, St. Louis, USA)를 이용하여, ALL또는 AML 환자의 골수로부터 단핵구를 농도 구배 원심 분리를 수행하였다. 이 후, 완충액(phosphate-buffered saline)으로 두 번 정도 세척하였다. AccuPrepGenomic DNA extraction kit 및 ExiPrep cell total RNA kit (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 단핵구의 총 RNA를 추출하였고, Superscript III Reverse Transcriptase (Applied Biosystems)를 이용하여 cDNA를 생성하였다. 이때 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트 및 SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa)를 이용하여 발현된 mRNA를 정량 분석하였고, β-actin mRNA를 표준화를 위한 대조군으로 사용하였다. Rotor-Gene Q (QIAGEN)를 이용하여 실시간 정량적 PCR을 수행하였고, 컴 Ct방법으로 유전자 발현의 변화를 계산하였다. 상기, AML 또는 ALL 환자의 단핵구세포의 NudC 발현의 정도를 확인한 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, AML 또는 ALL 환자의 단핵구에서 NudC의 발현이 정상인의 단핵구에서의 발현에 비하여, 현저히 감소함을 확인하였다.
따라서, 상기 NudC는 AML 또는 ALL을 진단하기 위한 마커로 사용할 수 있음을 확인하였다.
[실시예 2] TMEM57 및 백혈병 상호간의 상관관계 확인
TMEM57 유전자 및 백혈병 상호간의 상관관계를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
우선, 백혈병의 진단은 2008년 World Health Organization의 기준에 따라 수행하였다. ficoll hypaque (Sigma-aldrich, St. Louis, USA)를 이용하여, ALL 또는 AML 환자의 골수로부터 얻은 단핵구를 밀도 구배 원심 분리를 수행하였다. 이 후, 완충액(phosphate-buffered saline)으로 두 번 정도 세척하였다. AccuPrep Genomic DNA extraction kit 및 ExiPrep cell total RNA kit (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 단핵구의 총 RNA를 추출하였고, Superscript III Reverse Transcriptase (Applied Biosystems)를 이용하여 cDNA를 생성하였다. 이때 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트 및 SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa)를 이용하여 발현된 mRNA를 정량 분석하였고, β-actin mRNA를 표준화를 위한 대조군으로 사용하였다. Rotor-Gene Q (QIAGEN)를 이용하여 실시간 정량적 PCR을 수행하였고, 컴 Ct방법으로 유전자 발현의 변화를 계산하였다. 또한, 같은 방식으로 NOTCH 및 HES1 유전자의 발현을 확인하였다.
상기 AML 환자의 단핵구세포의 TMEM57 발현의 정도를 확인한 결과를 도 2에 나타내었다. 또한, 세포의 분화 시기에 따라 TMEM57, NOTCH 및 HES1의 발현 양상을 도 3에 나타내었다.
도 2 및 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, AML 환자의 단핵구에서만 특이적으로 TMEM57의 발현이 골수에서의 발현에 비하여, 현저히 감소함을 확인하였다. 또한, TMEM57은 M0기부터 M2기까지 AML 환자의 발현이 감소됨을 확인하였다.
따라서, TMEM57은 AML 환자를 진단하기 위한 마커로 사용할 수 있음을 확인하였다.
- NudC를 코딩하는 유전자 서열목록
서열번호 1 : 5'-cca gat caa gga gct aac tg-3'
서열번호 2 : 5'-ctc atg att ctc tgc atc ct-3'
- TMEM57을 코딩하는 유전자 서열목록
서열번호 3 : 5'-ctt cac ctc gaa gtc ata gc-3'
서열번호 4 : 5'-gct agt gca ttt ctg ctt ct-3'

Claims (16)

  1. TMEM57 또는 NudC를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 백혈병 진단용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 유전자 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 백혈병 진단용 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 백혈병 진단용 조성물.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 3 및 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 백혈병 진단용 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 백혈병 진단용 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 백혈병은 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL) 및 만성 골수성 백혈병(CML)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 질병인 것을 특징으로 하는 백혈병 진단용 조성물.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 백혈병 진단용 키트.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 백혈병 진단용 키트.
  9. (a) 백혈병의 발병이 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 TMEM57 또는 NudC를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 측정된 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 정상 대조군의 시료로부터 측정된 수준과 비교하여, 유의한 차이를 나타내는 경우 백혈병이 발병된 것으로 판정하는 단계를 포함하는 백혈병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 환자는 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL) 및 만성 골수성 백혈병(CML)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 질병이 발병된 환자인 것을 특징으로 하는 백혈병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 유전자의 mRNA 수준은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 분석법(DNA chip technology assay)에 의하여 측정되는 것을 특징으로 하는 백혈병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  12. 제 9 항에 있어서, 상기 단백질의 수준은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 및 단백질 칩 분석법(protein chip technology assay)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 백혈병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  13. 제 9 항에 있어서, TMEM57을 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준이 감소하는 경우에는 급성 골수성 백혈병(AML)이 발병된 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 백혈병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  14. 제 9 항에 있어서, NudC를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준이 감소하는 경우에는 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 급성 골수성 백혈병(AML)이 발병된 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 백혈병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  15. (a) 대조군인 백혈병이 발병된 실험동물의 시료로부터 TMEM57 또는 NudC를 코딩하는 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계;
    (b) 백혈병을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질을 상기 실험동물에 투여하는 단계;
    (c) 실험군인 상기 후보물질이 투여된 실험동물의 시료로부터 TMEM57 또는 NudC를 코딩하는 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
    (d) 대조군에서 측정된 유전자의 발현수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 실험군에서 측정된 것과 비교하여, 대조군에서 측정된 수준에 비하여 실험군에서 측정된 수준이 차이를 나타내는 경우, 상기 후보물질을 백혈병의 발병을 방지하는 예방용 제제 또는 백혈병을 치료하는 치료용 제제로서 사용할 수 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는 백혈병 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 백혈병이 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 급성 골수성 백혈병(AML)인 경우에는 대조군에서 측정된 수준과 비교하여 실험군에서 측정된 수준이 높은 수준을 나타낼 때 상기 후보물질을 치료용 제제로서 사용할 수 있는 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 백혈병 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법.
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