CN105779460A - 分离的编码acd突变体的核酸及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了ACD基因突变体及其应用，具体涉及分离的编码ACD突变体的核酸，分离的多肽，筛选易患遗传性骨髓衰竭症的生物样品的系统，用于筛选易患神遗传性骨髓衰竭症的生物样品的试剂盒，以及构建药物筛选模型的方法。其中，该分离的编码ACD突变体的核酸，与SEQ ID NO：1相比，具有c.499_501del突变。通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患遗传性骨髓衰竭症。

Description

分离的编码ACD突变体的核酸及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及分离的编码ACD突变体的核酸及其应用，更具体地，涉及分离的编码ACD突变体的核酸、分离的多肽、筛选易患遗传性骨髓衰竭症的生物样品的系统、用于筛选易患遗传性骨髓衰竭症的生物样品的试剂盒、构建体、重组细胞以及构建药物筛选模型的方法。

背景技术

端粒是在线性染色体末端的重复DNA蛋白复合物，并随着体细胞分裂数的增加而缩短。端粒缩短到一定的程度会激活DNA损伤反应，进而引起细胞衰老和凋亡。生殖细胞，干细胞及胚胎发育中的细胞主要通过核糖核蛋白端粒酶的表达来克服端粒的缩短。端粒酶通过RNA(也称hTR)逆转录将端粒DNA重复序列加到染色体末端。人类端粒酶复合物的核心主要由hTR，逆转录酶蛋白(hTERT)和RNA结合蛋白角化不良蛋白(dyskerin)。端粒酶在其生成和运输到端粒的过程中需要和许多蛋白相互作用，如蛋白TCAB1(也称作WDR79和WRAP53)，主要负责将端粒酶运输到核卡哈尔小体，再从那运输到端粒。

端粒及其相关结合蛋白异常容易引起人的多种疾病。例如，继承短端粒的人容易患“短端粒综合征”，最先发现的这类疾病是先天性角化不良，表现为粘膜与皮肤交界处不正常的色素沉积，口腔白斑，指甲营养不良，并患有由造血祖细胞和干细胞功能缺失导致的渐进性骨髓衰竭。

由此，有待于对端粒及其相关蛋白基因突变引起的疾病进行进一步研究。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种有效筛选遗传性骨髓衰竭症的生物样品的方法。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：

端粒结合蛋白TPP1(由ACD基因转录翻译而来，也被称为PTOP，PIP1，TINT2)对端粒的稳定性及长度调节特别重要。TPPA通过与TIN2的相互作用结合到端粒上，并导致单链DNA结合蛋白Pot1结合到端粒上。Pot1需要TPP1保护端粒不被错认为DNA有害物质，Pot1/TPP1异质二聚体同时也促进着端粒酶的不断合成。也就是它具有合成大片段的端粒DNA的能力。TPP1表面上的TELpatch介导它与端粒酶的相互作用，在促使端粒酶结合到端粒上发挥着重要的作用。

发明人利用特制的DNA序列探针将全基因组中的外显子区域捕获下来，然后针对每个外显子进行深度测序。并在目标区域测序找到了ACD基因的第16号染色体3个碱基CTT的缺失，该缺失导致TPP1的TELpatch上一个氨基酸的丢失进而导致了该病。相比于传统的连锁分析、候选基因关联分析技术，本发明采用的外显子组测序技术针对基因组内编码蛋白质的外显子区域，目标集中，测序深度和精度更高。

因而，根据本发明的第一方面，本发明提供了一种分离的编码ACD突变体的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸与SEQIDNO：1相比，具有c.499_501del突变。发明人惊奇的发现，该突变体与遗传性骨髓衰竭症的发病密切相关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患遗传性骨髓衰竭症，根据本发明的实施例，该突变体的核酸进一步丰富了ACD基因的致病突变图谱，更深入阐明了遗传性骨髓衰竭症的分子发病机制，为遗传性骨髓衰竭症的早期致病基因筛查和干预治疗提供科学依据。

根据本发明的第二方面，本发明还提供了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与SEQIDNO：3相比，所述分离的多肽具有p.Lys167del突变。具体地，致病基因ACD/TPP1上三碱基缺失chr16:67,693,688CCTT>C；c.499_501del，导致p.Lys167del突变，且患者的该致病基因为杂合体。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易患遗传性骨髓衰竭症。

根据本发明的第三方面，本发明还提供了一种筛选易患遗传性骨髓衰竭症的生物样品的系统。该系统包括：核酸提取装置，所述核酸提取装置用于提取所述生物样品中的核酸样本；核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；以及判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于将所述核酸的序列与SEQIDNO：1相比，是否具有c.499_501del突变，判断所述生物样品是否易患遗传性骨髓衰竭症。发明人惊奇地发现，利用该系统可以对遗传性骨髓衰竭症进行基因层面的检测，有助于更准确的筛选易患遗传性骨髓衰竭症的生物样品。

根据本发明的第四方面，本发明还提供了一种用于筛选易患遗传性骨髓衰竭症的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有：适于检测ACD基因突变体的试剂，其中与SEQIDNO：1相比，所述ACD基因突变体具有c.499_501del突变。由此，利用该试剂盒，可以对ACD基因突变体进行高精度的检测，从而对遗传性骨髓衰竭症进行基因层面的检测，有助于更准确的筛选易患遗传性骨髓衰竭症的生物样品。

根据本发明的第五方面，本发明还提供了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前述的分离的编码ACD突变体的核酸。由此，利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用于筛选治疗遗传性骨髓衰竭症的药物。

根据本发明的第六方面，本发明还提供了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞是通过表达前述的构建体转化受体细胞而获得的。根据本发明的一些实施例，利用本发明的重组细胞，能够有效地筛选治疗遗传性骨髓衰竭症的药物。

根据本发明的第七方面，本发明还提供了一种构建药物筛选模型的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：使动物的至少一部分细胞表达前述的多肽。根据本发明的一些实施例，利用本发明的动物模型，能够有效地筛选治疗遗传性骨髓衰竭症的药物。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明实施例的筛选易患遗传性骨髓衰竭症的生物样品的系统及其组成部分的示意图，其中，

图1A为根据本发明实施例的筛选易患遗传性骨髓衰竭症的生物样品的系统的示意图，

图1B为根据本发明实施例的核酸提取装置的示意图，

图1C为根据本发明实施例的核酸序列确定装置的示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例的遗传性骨髓衰竭症患者家系的家系图；

图3显示了根据本发明的一个实施例的ACD基因c.499_501del突变位点的代表性Sanger测序验证峰图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

ACD突变体

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种分离的编码ACD突变体的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸与SEQIDNO：1相比，具有c.499_501del突变。

在本文中所使用的表达方式“编码ACD突变体的核酸”，是指与编码ACD突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与ACD突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据本发明的一些具体示例，所述核酸为DNA。

对于本发明说明书和权利要求书中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及SEQIDNO：1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。

该编码ACD突变体的核酸，是本申请的发明人通过目标区域捕获测序联合候选基因突变验证的方法确定的遗传性骨髓衰竭症的致病基因ACD的新的致病突变。该致病突变位点在现有技术中并未被提到。需要说明的是，在本文中所使用的表达方式“目标区域捕获测序”是指利用特制的探针对客户感兴趣的某段特定序列进行捕获富集后，再利用第二代测序技术进行高通量测序及基因组分析的方法。利用该方法能够获得指定目标区域的遗传信息，极大的提高了基因组中目标区域的研究效率，显著降低了研究成本。在本发明中，将该方法用于识别和研究与疾病相关的编码区域内的结构变异，进而，结合大量的公共数据库提供的数据，有利于更好地解释所得变异结构之间的关联和致病机理。

其中，野生型的ACD的cDNA的序列如下所示：

ATGCCTGGCCGCTGTCAGAGTGACGCCGCGATGAGAGTAAACGGGCCAGCATCCCGTGCACCAGCGGGGTGGACCAGCGGGAGTCTGCACACAGGCCCCCGAGCAGGACGCCCTCGTGCGCAGGCGCGGGGTGTACGTGGGCGGGGCCTCCTCCTCCGGCCCCGCCCAGCGAAGGAGCTTCCTCTTCCGAGGAAAGGCGGGGCCTGGGCGCCCGCGGGAAACCCGGGCCCGTTGCATCCGCTGGGTGTAGCCGTGGGGATGGCAGGTTCGGGGAGGCTGGTCCTACGGCCCTGGATTCGGGAGCTGATTCTGGGGTCAGAGACACCCTCCAGTCCACGAGCCGGGCAGCTGCTTGAGGACGCCGAGGCCGCGGTCGCGGGCCCATCCCACGCCCCTGATACGTCCGACGTCGGGGCCACGCTGCTTGTGTCTGACGGGACCCACAGTGTCCGATGCCTGGTGACGCGGGAGGCCCTGGACACCTCGGACTGGGAGGAGAAGGAGTTCGGCTTCCGCGGGACAGAGGGCCGGCTGCTGCTGCTGCAGGACTGCGGGGTTCATGTCCAGGTCGCTGAGGGCGGCGCGCCCGCAGAGTTCTATCTCCAGGTGGACCGCTTCAGCCTGCTGCCCACGGAGCAGCCCCGGCTACGGGTGCCTGGTTGCAACCAAGACTTAGATGTTCAGAAAAAGCTCTATGACTGCCTTGAGGAGCACCTTTCAGAGTCCACCTCGTCCAATGCAGGCCTATCACTGTCCCAGCTTCTGGATGAAATGCGGGAGGACCAGGAGCATCAGGGGGCACTCGTGTGCCTGGCTGAAAGCTGCCTGACACTGGAGGGCCCTTGCACAGCACCCCCTGTCACCCACTGGGCTGCCTCACGATGCAAGGCCACGGGAGAAGCTGTGTACACTGTCCCCAGCTCAATGCTGTGCATCTCTGAGAATGACCAGCTAATTCTGAGCTCTCTAGGCCCCTGTCAGAGGACACAGGGCCCTGAGCTGCCCCCACCAGACCCGGCTCTGCAGGACCTATCTCTGACCCTCATAGCCTCTCCTCCTTCCTCACCCAGTTCCTCAGGAACCCCGGCCTTACCCGGCCACATGTCATCCGAGGAAAGTGGTACCAGCATCAGCCTTCTGCCTGCCCTGTCCTTGGCTGCTCCAGACCCAGGGCAGAGAAGCAGCTCCCAGCCCTCACCAGCCATCTGCTCAGCCCCTGCCACCCTGACCCCCAGGTCCCCACACGCCAGCCGTACCCCCAGCTCCCCACTCCAGAGCTGCACTCCCAGTCTCTCACCCCGTAGCCATGTCCCCAGTCCACACCAGGCTCTTGTGACCAGGCCCCAGAAACCTAGCCTGGAGTTCAAGGAGTTTGTAGGGTTGCCCTGCAAGAATCGGCCGCCTTTTCCCAGGACCGGAGCTACCAGGGGAGCCCAGGAGCCCTGCTCTGTCTGGGAACCCCCAAAGAGGCATCGTGATGGTTCTGCCTTCCAGTATGAGTATGAGCCACCCTGCACGTCCCTCTGTGCTCGGGTCCAAGCTGTCAGGCTTCCTCCCCAGCTCATGGCCTGGGCCTTGCACTTTCTGATGGATGCACAGCCAGGGTCTGAGCCAACTCCGATGTGA(SEQIDNO：1)

本发明的ACD突变体的cDNA序列如下所示：

ATGCCTGGCCGCTGTCAGAGTGACGCCGCGATGAGAGTAAACGGGCCAGCATCCCGTGCACCAGCGGGGTGGACCAGCGGGAGTCTGCACACAGGCCCCCGAGCAGGACGCCCTCGTGCGCAGGCGCGGGGTGTACGTGGGCGGGGCCTCCTCCTCCGGCCCCGCCCAGCGAAGGAGCTTCCTCTTCCGAGGAAAGGCGGGGCCTGGGCGCCCGCGGGAAACCCGGGCCCGTTGCATCCGCTGGGTGTAGCCGTGGGGATGGCAGGTTCGGGGAGGCTGGTCCTACGGCCCTGGATTCGGGAGCTGATTCTGGGGTCAGAGACACCCTCCAGTCCACGAGCCGGGCAGCTGCTTGAGGACGCCGAGGCCGCGGTCGCGGGCCCATCCCACGCCCCTGATACGTCCGACGTCGGGGCCACGCTGCTTGTGTCTGACGGGACCCACAGTGTCCGATGCCTGGTGACGCGGGAGGCCCTGGACACCTCGGACTGGGAGGAGGAGTTCGGCTTCCGCGGGACAGAGGGCCGGCTGCTGCTGCTGCAGGACTGCGGGGTTCATGTCCAGGTCGCTGAGGGCGGCGCGCCCGCAGAGTTCTATCTCCAGGTGGACCGCTTCAGCCTGCTGCCCACGGAGCAGCCCCGGCTACGGGTGCCTGGTTGCAACCAAGACTTAGATGTTCAGAAAAAGCTCTATGACTGCCTTGAGGAGCACCTTTCAGAGTCCACCTCGTCCAATGCAGGCCTATCACTGTCCCAGCTTCTGGATGAAATGCGGGAGGACCAGGAGCATCAGGGGGCACTCGTGTGCCTGGCTGAAAGCTGCCTGACACTGGAGGGCCCTTGCACAGCACCCCCTGTCACCCACTGGGCTGCCTCACGATGCAAGGCCACGGGAGAAGCTGTGTACACTGTCCCCAGCTCAATGCTGTGCATCTCTGAGAATGACCAGCTAATTCTGAGCTCTCTAGGCCCCTGTCAGAGGACACAGGGCCCTGAGCTGCCCCCACCAGACCCGGCTCTGCAGGACCTATCTCTGACCCTCATAGCCTCTCCTCCTTCCTCACCCAGTTCCTCAGGAACCCCGGCCTTACCCGGCCACATGTCATCCGAGGAAAGTGGTACCAGCATCAGCCTTCTGCCTGCCCTGTCCTTGGCTGCTCCAGACCCAGGGCAGAGAAGCAGCTCCCAGCCCTCACCAGCCATCTGCTCAGCCCCTGCCACCCTGACCCCCAGGTCCCCACACGCCAGCCGTACCCCCAGCTCCCCACTCCAGAGCTGCACTCCCAGTCTCTCACCCCGTAGCCATGTCCCCAGTCCACACCAGGCTCTTGTGACCAGGCCCCAGAAACCTAGCCTGGAGTTCAAGGAGTTTGTAGGGTTGCCCTGCAAGAATCGGCCGCCTTTTCCCAGGACCGGAGCTACCAGGGGAGCCCAGGAGCCCTGCTCTGTCTGGGAACCCCCAAAGAGGCATCGTGATGGTTCTGCCTTCCAGTATGAGTATGAGCCACCCTGCACGTCCCTCTGTGCTCGGGTCCAAGCTGTCAGGCTTCCTCCCCAGCTCATGGCCTGGGCCTTGCACTTTCTGATGGATGCACAGCCAGGGTCTGAGCCAACTCCGATGTGA(SEQIDNO：2)

发明人惊奇的发现，该突变体与遗传性骨髓衰竭症的发病密切相关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患遗传性骨髓衰竭症，根据本发明的实施例，该突变体的核酸进一步丰富了ACD基因的致病突变图谱，更深入阐明了遗传性骨髓衰竭症的分子发病机制，为神遗传性骨髓衰竭症的早期致病基因筛查和干预治疗提供科学依据。

根据本发明的第二方面，本发明还提供了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与SEQIDNO：3相比，所述分离的多肽具有p.Lys167del突变。具体地，致病基因ACD/TPP1上三碱基缺失chr16:67,693,688CCTT>C；c.499_501del，导致p.Lys167del突变，且该突变在患者中是杂合的。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易患遗传性骨髓衰竭症。

根据本发明的一些具体示例，所述多肽由前述的核酸编码。其中，野生型的ACD的cDNA编码的多肽的氨基酸序列如下：

本发明ACD突变体cDNA编码的多肽的氨基酸序列如下：

通过比对发现，与SEQIDNO：1相比，ACD突变体的cDNA具有c.499_501del突变，进而，其编码产物与野生型的ACD多肽的氨基酸序列相比，具有p.Lys167del突变，即由缺失的AAG碱基编码的Lys缺失，从而引起遗传性骨髓衰竭症。

筛选易患遗传性骨髓衰竭症的生物样品的系统和试剂盒

根据本发明的第三方面，本发明提供了一种筛选易患遗传性骨髓衰竭症的生物样品的系统。参照图1A，该系统包括：

核酸提取装置100，所述核酸提取装置100用于提取所述生物样品中的核酸样本。根据本发明的一些具体示例，所述核酸提取装置100进一步包括：RNA提取单元101，所述RNA提取单元101用于从生物样品中提取RNA样本；以及逆转录单元102，所述逆转录单元102与所述RNA提取单元101相连，用于对所述RNA样本进行逆转录反应，以便获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。

核酸序列确定装置200，所述核酸序列确定装置200与所述核酸提取装置100相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列。根据发明的具体示例，所述核酸序列确定装置进一步包括：文库构建单元201，所述文库构建单元201用于针对所述核酸样本，构建所述核酸的文库；以及测序单元202，所述测序单元202与所述文库构建单元201相连，通过对所述文库进行测序，以便确定所述核酸的序列。其中，所述文库构建单元201进一步包括：PCR扩增模块，所述PCR扩增模块中设置有ACD基因外显子特异性引物，以便利用所述特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增。根据本发明的实施例，所述特异性引物具有如SEQIDNO：5和6所示的核苷酸序列。根据本发明的一些具体示例，所述测序单元包括选自HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种。

判断装置300，所述判断装置300与所述核酸序列确定装置200相连，以便基于将所述核酸的序列与SEQIDNO：1相比，是否具有c.499_501del突变，判断所述生物样品是否易患遗传性骨髓衰竭症。

发明人惊奇地发现，利用该系统可以对遗传性骨髓衰竭症进行基因层面的检测，有助于更准确的筛选易患遗传性骨髓衰竭症的生物样品。

根据本发明的第四方面，本发明提供了一种用于筛选易患遗传性骨髓衰竭症的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有：适于检测ACD基因突变体的试剂，其中与SEQIDNO：1相比，所述ACD基因突变体具有c.499_501del突变。

在发明中，所使用的术语“适于检测ACD基因突变体的试剂”应做广义理解，即可以是检测ACD编码基因的试剂，也可以是检测ACD突变体多肽的试剂，例如可以采用识别特异性位点的抗体。根据本发明的一些具体示例，所述试剂为核酸探针或引物。由此，能够特异性的检测ACD基因。优选地，所述核酸探针或引物具有如SEQIDNO：5和6所示的核苷酸序列。由此，对ACD基因检测的特异性好，准确性高。

由此，利用该试剂盒，可以对ACD基因突变体进行高精度的检测，从而对遗传性骨髓衰竭症进行基因层面的检测，有助于更准确的筛选易患遗传性骨髓衰竭症的生物样品。

构建体和重组细胞

根据本发明的第五方面，本发明提供了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前述的分离的编码ACD突变体的核酸。由此，利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用于筛选治疗遗传性骨髓衰竭症的药物。

在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一种，优选质粒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。

根据本发明的第六方面，本发明还提供了一种重组细胞，根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过表达前述的构建体转化受体细胞而获得的。根据本发明的一些实施例，利用本发明的重组细胞，能够有效地筛选治疗遗传性骨髓衰竭症的药物。

构建药物筛选模型的方法

根据本发明的第七方面，本发明还提供了一种构建药物筛选模型的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：使动物的至少一部分细胞表达前述的多肽。根据本发明的实施例，所述动物为小鼠、猪、狗、灵长类动物。根据本发明的一些实施例，利用本发明的动物模型，能够有效地筛选治疗遗传性骨髓衰竭症的药物。

其中，需要说明的是，本发明构建药物筛选模型的方法不受特别的限制，只要使动物的至少一部分细胞表达前述的多肽即可。例如，采用分子生物学技术，对受体细胞产生精确的目标基因定点突变，获得患有遗传性骨髓衰竭症的动物，该动物可以作为模型用于筛选治疗该疾病的药物。例如，可以通过无标记转基因技术，定点整合技术，基因组编辑技术等方法实现目标基因的定点突变，获得本发明的编码ACD突变体的基因，进而构建ACD突变体基因的重组载体，将该重组载体通过一定的方式(常用电穿孔法)导入同源的胚胎干细胞中，使突变的外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而ACD突变体基因在细胞中得以表达。再将重组细胞植入假孕母体，使其发育成嵌合体动物。利用嵌合体之间的交配，产生纯合体动物，嵌合体动物和纯化体动物均可用于药物筛选模型，从而有效地筛选治疗遗传性骨髓衰竭症的药物。

本发明至少具有以下有益效果：

本发明发现遗传性骨髓衰竭症致病基因的一个新错义突变。以此为基础，可用于早期筛查遗传性骨髓衰竭症致病突变携带者，进而在携带者发病之前进行早期干预治疗；也可用于遗传性骨髓衰竭症患者的分子诊断及与相关疾病的的鉴别诊断。该技术具有快速、准确、高效、简便、早期诊断率高等优点，检测结果可以为遗传性骨髓衰竭症的早期诊断、鉴别诊断及开发遗传性骨髓衰竭症治疗药物提供科学依据。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。

实施例1

确定遗传性骨髓衰竭症突变基因的方法，具体如下：

1、样本采集

本实施例收集了澳大利亚韦斯特米德儿童医院一个三代家系的样本，其家系图如图2所示，正方形代表男性，圆形代表女性，“/”代表已死亡，菱形代表性别不详，“+/+”代表正常人在相应位点为纯合体，+/ΔK170代表患者在该位点为杂合缺失，家谱中包括外祖父母和父母和一个女儿(外祖母(图2,III:6)，母亲(图2,IV:2)和女儿(图2,V:1)均患病)，先证者患有严重的血小板减少症和大红细胞症，并被诊断为再生障碍性贫血。并有骨髓衰竭，口腔肿瘤和白血病的家族史。采集了该家系5个成员，其中，3个患者，即外祖母(图2,III:6)，母亲(图2,IV:2)和女儿(图2,V:1)，2个正常的人外祖父(图2,III:5)、父亲(图2,IV:3)的外周血，并提取DNA，所有血样均签属知情同意书，并获得伦理委员会批准。

2、芯片设计、文库构建和高通量测序

用AglientSureSelectHumanAllExonkit(AgilentTechnologies,SantaClara,CA,USA)结合IlluminaHiSeq2000高通量测序技术对该家系中五个成员的外显子组序列进行了测序，具体如下：

1)利用捕获芯片(AglientSureSelectHumanAllExonkit(AgilentTechnologies,SantaClara,CA,USA))对基因组的外显子、剪接位点和邻近的内含子序列进行捕获。

2)将基因组DNA随机打断成200-300bp左右的片段，随后在片段两端分别连接上接头，制备测序文库(参见http://www.illumina.com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明书)。

3)文库经纯化后经过ligation-mediatedPCR(LM-PCR)的线性扩增与customcapturearray进行杂交富集，再经过LM-PCR的线性扩增后进行上机测序。测序平台为IlluminaHiseq2000，读取长度为100bp。

3、变异检测、注释及与数据库比较

1)测序后获得的原始数据由IlluminabasecallingSoftware1.7进行处理。然后过滤低质量读段和包含接头污染读段。使用Burrows–WheelerAligner(BWA)和ShortOligonucleotideAnalysisPackage(SOAPaligner2.21)将高质量读段比对到参考基因组(hg19)，获得比对到基因组上的唯一比对读段。然后对SOAP比对的结果用SOAPsnp1.05进行SNP的检测，对BWA比对的结果用GenomeAnalysisToolKit(GATK1.4)进行indel的检测。

2)对于检出的SNP和indel变异进行注释，即确定变异所处基因组环境，以及变异的类型。我们关注非同义突变，剪接受体/供体位点突变和编码区插入和缺失突变这三类最有可能与疾病相关的突变。我们将检出的变异和dbSNP135数据库、千人基因组数据库和HapMap数据库，ESP数据库(http://evs.gs.washington.edu/EVS/)一系列公共数据库进行了比较，保留了低频的变异(MAF≤0.005)。接着用PhyloP进行保守性预测，去掉值小于0.95的不保守区域，再用PolyPhenandSIFT保留危害性较高的位点，最后根据遗传模式(常染色体显性遗传)，选取了患者中为杂合而对照为纯合的位点进行优先考虑。

3)通过以上分析，我们在患者的基因上发现了ACD/TPP1chr16:67,693,688，c.499_501del；p.Lys167del(RefSeq:NM_001082486.1)三个碱基的缺失，该突变在三个患者中是在杂合，在对照中是纯合。

综上所述，发明人认为，ACD基因的c.499_501del突变极有可能是遗传性骨髓衰竭症的致病突变。

实施例2

利用实施例1中家系内3个患者样本和2个正常样本(患者：III:6，IV:2，V:1，正常人：III:5，IV:3)，采用Sanger法对遗传性骨髓衰竭症致病突变位点进行验证，包括引物设计，PCR扩增，产物纯化，测序得到序列，根据序列测定结果属于突变型还是野生型，验证突变与遗传性骨髓衰竭之间相关性。具体步骤如下：

1、DNA提取

采集的上述5个样本(3个患者样本和2个正常样本)的外周血，利用常规酚-氯仿法抽提外周血白细胞中的基因组DNA，利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得的每个样本基因组DNA的OD260/OD280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于200ng/μl，总量不少于30μg。

2、引物设计及PCR反应

引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3，具体见下。

a)引物序列：

正向引物：5'-CCGCCGTCAGGTACTACAG-3'(SEQIDNO：5)

反向引物：5'-CGGTCCACCTGGAGATAGAA-3'(SEQIDNO：6)

b)反应体系：25μL

c)反应条件：

3)将步骤2中获得PCR扩增产物纯化后用ABI的3730进行DNA测序。

在该家系中，患者均为致病突变的杂合体，对照为纯合体。图3显示了上述遗传性骨髓衰竭症患者家系中，未发病男性(为纯合体)、女性患者(具杂合突变)的ACD基因c.499_501del突变位点的代表性Sanger测序验证峰图，其中，方框内为缺失的碱基位点的各样本的峰图，前三个患者在相应的三位点检测到的为AAG以及其后三位GAG的复合峰，后两位正常患者检测到的为AAG的纯合峰，说明前三位患者AAG三碱基的缺失，且为杂合体，从而，进一步证明了ACD/TPP1chr16:67,693,688CCTT>C，即c.499_501del；p.Lys167del(RefSeq:NM_001082486.1)基因上的三碱基缺失为遗传性骨髓衰竭的一个致病突变。

实施例3

制备一检测试剂盒，其包含能够检测ACD基因的c.499_501del突变的引物，用于筛选遗传性骨髓衰竭症的生物样品，其中这些引物为ACD基因外显子特异性引物，其序列如实施例2中所述SEQIDNO：5-6所示。

利用上述试剂盒筛选遗传性骨髓衰竭症的生物样品的具体步骤为：按照实施例2的步骤1所述的方法提取待测者DNA，以所提取的DNA为模板与上述ACD基因的外显子特异性引物进行PCR反应，反应体系和反应条件如实施例2所示，并按照本领域常规方法对PCR产物纯化，将纯化的产物进行测序，然后通过观察测序所得到的序列是否具有c.499_501del突变，能够有效地检测本发明的ACD基因突变体在待测者DNA中是否存在，从而能够有效地检测待测者是否易患遗传性骨髓衰竭症，进一步，能够从待测者中筛选出遗传性骨髓衰竭症的生物样品。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种分离的编码ACD突变体的核酸，其特征在于，所述核酸与SEQIDNO：1相比，具有c.499_501del突变，

任选地，所述核酸为DNA。

2.一种分离的多肽，其特征在于，与SEQIDNO：3相比，所述分离的多肽具有p.Lys167del突变，

任选地，所述多肽由权利要求1所述的核酸编码。

3.一种筛选易患遗传性骨髓衰竭症的生物样品的系统，其特征在于，包括：

核酸提取装置，所述核酸提取装置用于提取所述生物样品中的核酸样本；

核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；以及

判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于将所述核酸的序列与SEQIDNO：1相比，是否具有c.499_501del突变，判断所述生物样品是否易患遗传性骨髓衰竭症。

4.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，所述核酸提取装置进一步包括：

RNA提取单元，所述RNA提取单元用于从生物样品中提取RNA样本；以及

逆转录单元，所述逆转录单元与所述RNA提取单元相连，用于对所述RNA样本进行逆转录反应，以便获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。

5.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，所述核酸序列确定装置进一步包括：

文库构建单元，所述文库构建单元用于针对所述核酸样本，构建所述核酸的文库；以及

测序单元，所述测序单元与所述文库构建单元相连，通过对所述文库进行测序，以便确定所述核酸的序列。

6.根据权利要求5所述的系统，其特征在于，所述文库构建单元进一步包括：

PCR扩增模块，所述PCR扩增模块中设置有ACD基因外显子特异性引物，以便利用所述特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增，

任选地，所述特异性引物具有如SEQIDNO：5和6所示的核苷酸序列，

任选地，所述测序单元包括选自HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种。

7.一种用于筛选易患遗传性骨髓衰竭症的生物样品的试剂盒，其特征在于，含有：

适于检测ACD基因突变体的试剂，其中与SEQIDNO：1相比，所述ACD基因突变体具有c.499_501del突变，

任选地，所述试剂为核酸探针或者引物，

任选地，所述核酸探针或者引物具有SEQIDNO：5和6所示的核苷酸序列。

8.一种构建体，其特征在于，包含权利要求1所述的分离的编码ACD突变体的核酸。

9.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是通过表达权利要求8所述的构建体转化受体细胞而获得的。

10.一种构建药物筛选模型的方法，其特征在于，包括：

使动物的至少一部分细胞表达权利要求1所述的核酸，

任选地，所述动物为小鼠、猪、狗、灵长类动物。