CN105779462B - 分离的编码kcnj6突变体的核酸及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了KCNJ6基因突变体及其应用，具体涉及分离的编码KCNJ6突变体的核酸、分离的多肽、筛选易患Keppen‑Lubinsky综合症的生物样品的系统、用于筛选易患神Keppen‑Lubinsky综合症的生物样品的试剂盒，以及构建药物筛选模型的方法，其中，该分离的编码KCNJ6突变体的核酸，与SEQ ID NO：1相比，具有c.455_457del突变和c.460G>A突变的至少之一。通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患Keppen‑Lubinsky综合症。

Description

分离的编码KCNJ6突变体的核酸及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及分离的编码KCNJ6突变体的核酸及其应用，更具体地，涉及分离的编码KCNJ6突变体的核酸、分离的多肽、筛选易患Keppen-Lubinsky综合症的生物样品的系统、用于筛选易患Keppen-Lubinsky综合症的生物样品的试剂盒、构建体、重组细胞以及构建药物筛选模型的方法。

背景技术

Keppen-Lubinsky综合症是一种罕见的先天异常，由Keppen和Lubinskyz在2000年首先提出此病。该综合症的临床表现是患者出生时各项生长指标正常，但6～9个月后出现严重的生长发育迟缓和智力发育迟缓，肌张力亢进，反射亢进，同时伴有癫痫发作。患者面部畸形，头小眼大，鼻子紧缩且小，鼻冀发育不全，上嘴唇撑起，高腭穹，张口，皮肤紧贴，人中短，样貌老年化，全身或脸部出现严重的脂肪代谢障碍。KPLBS(Keppen-Lubinsky综合症)现行诊断标准是出生时各项生长指标正常，但后天发育不良，脸部皮肤紧贴骨头，全身性脂肪代谢障碍，发育迟缓，无法在疾病的早期准确的对疾病进行诊断。

由此，Keppen-Lubinsky综合症的早期诊断有待于进一步研究。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种有效筛选Keppen-Lubinsky综合症的生物样品的方法。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：

KCNJ6(GIRK2)基因位于21号染色体，是唐氏综合症关键区。KCNJ6(GIRK2)蛋白是受G蛋白控制，并对ATP敏感的内向整流性钾离子通道。当细胞内ATP浓度升高时，该通道会关闭。它将细胞代谢和细胞膜的电兴奋联系起来。一般而言，内向整流性通道只容许离子流进细胞，不容许离子流出细胞。钾离子通道上有一个高度保守的基序。这个基序由8个氨基酸(TXXTXGYG)构成，会对流经该通道的钾离子进行选择。电生理学在非洲爪蟾卵母细胞中发现该基序的1，5，6，8位点发生突变会显著影响通道对钾离子的选择性。其中一个突变是G6S。这个突变和第三个患者在该基因发生的突变一样。因此，该基序所在的序列区域对通道的功能至关重要。GIRK2基因在绝大多数哺乳类动物的组织中都大量表达。它和其他通道蛋白结合形成同源或异源的多亚基复合物，共同参与众多生理过程。绝大数神经元会表达GIRK1，GIRK2和GIRK3，而在中枢神经系统，GIRK2会形成同源四聚体，或与GIRK1以及GIRK3形成异源四聚体。在小鼠模型中，KCNJ6(GIRK2)基因的纯合突变会导致小鼠体型变小，步态不稳，肌肉张力低，小脑体积非常小而简单，几乎没有小神经胶质细胞；该基因杂合突变的小鼠行为正常，但是神经系统异常。最近研究表明钾离子通道蛋白是诸如脂肪形成、人体间质干细胞成骨分化和未成熟神经祖细胞增殖等细胞过程的重要调控蛋白。特别的是，钾离子通道的封锁可以减少人体间质干细胞的成脂诱导分化程度以及前体脂肪细胞的分化程度。此外，膜外钾离子的高浓度会抑制成骨分化时的脂肪形成标志物PPARG、LPL和IBSP，而且这种抑制主要发生在胚胎发育时期。因此，发明人认为在胚胎发育早期的膜电位破坏以及脂肪细胞分化程度减弱可能是导致Keppen-Lubinsky综合症患者皮下脂肪缺失的原因。

发明人利用特制的DNA序列探针将全基因组中的外显子区域捕获下来，然后针对每个外显子进行深度测序。并在目标区域测序找到了KCNJ6(GIRK2)基因c.455_457del突变和c.460G>A突变，这两个突变位点分别引起相应多肽的p.T152_I153delinsI突变和p.G154S突变，上述突变均与Keppen-Lubinsky综合症有关。

因而，根据本发明的第一方面，本发明提供了一种分离的编码KCNJ6突变体的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸与SEQ ID NO：1相比，具有c.455_457del突变和c.460G>A突变的至少之一。在本发明中，采用本领域通用表示法表示突变。c.455_457del表示cDNA第455～457位核苷酸发生缺失；c.460G>A表示cDNA第460位核苷酸由G变成A。发明人惊奇的发现，该突变体与Keppen-Lubinsky综合症的发病密切相关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患Keppen-Lubinsky综合症，根据本发明的实施例，该突变体的核酸进一步丰富了KCNJ6基因的致病突变图谱，更深入阐明了Keppen-Lubinsky综合症的分子发病机制，为Keppen-Lubinsky综合症的早期致病基因筛查和干预治疗提供科学依据。

根据本发明的第二方面，本发明还提供了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与SEQ ID NO：4相比，所述分离的多肽具有p.T152_I153delinsI突变和p.G154S突变的至少之一。在本发明中，采用本领域通用表示法表示突变。p.T152_I153delinsI或p.Thr152del均表示蛋白质水平第152位密码子发生缺失；p.G154S表示蛋白质水平第154位密码子由Gly变成Ser。具体地，致病基因KCNJ6上c.455_457del三碱基缺失，引起多肽p.T152_I153delinsI突变，而c.460G>A突变，导致p.G154S突变。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易患Keppen-Lubinsky综合症。

根据本发明的第三方面，本发明还提供了一种筛选易患Keppen-Lubinsky综合症的生物样品的系统。该系统包括：核酸提取装置，所述核酸提取装置用于提取所述生物样品中的核酸样本；核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；以及判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于将所述核酸的序列与SEQ ID NO：1相比，是否具有c.455_457del突变和c.460G>A突变至少之一，判断所述生物样品是否易患Keppen-Lubinsky综合症。发明人惊奇地发现，利用该系统可以对Keppen-Lubinsky综合症进行基因层面的检测，有助于更准确的筛选易患Keppen-Lubinsky综合症的生物样品。

根据本发明的第四方面，本发明还提供了一种用于筛选易患Keppen-Lubinsky综合症的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有：适于检测KCNJ6基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO：1相比，所述KCNJ6基因突变体具有c.455_457del突变和c.460G>A突变至少之一。由此，利用该试剂盒，可以对KCNJ6基因突变体进行高精度的检测，从而对Keppen-Lubinsky综合症进行基因层面的检测，有助于更准确的筛选易患Keppen-Lubinsky综合症的生物样品。

根据本发明的第五方面，本发明还提供了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前述的分离的编码KCNJ6突变体的核酸。由此，利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用于筛选治疗Keppen-Lubinsky综合症的药物。

根据本发明的第六方面，本发明还提供了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞是通过表达前述的构建体转化受体细胞而获得的。根据本发明的一些实施例，利用本发明的重组细胞，能够有效地筛选治疗Keppen-Lubinsky综合症的药物。

根据本发明的第七方面，本发明还提供了一种构建药物筛选模型的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：使动物的至少一部分细胞表达前述的多肽。根据本发明的一些实施例，利用本发明的动物模型，能够有效地筛选治疗Keppen-Lubinsky综合症的药物。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明实施例的筛选易患Keppen-Lubinsky综合症的生物样品的系统及其组成部分的示意图，其中，

图1A为根据本发明实施例的筛选易患Keppen-Lubinsky综合症的生物样品的系统的示意图，

图1B为根据本发明实施例的核酸提取装置的示意图，

图1C为根据本发明实施例的核酸序列确定装置的示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例的含有Keppen-Lubinsky综合症患者的3个家系的家系图；

图3显示了根据本发明的一个实施例的KCNJ6基因突变体的结构以及突变区域和位点的示意图；

图4显示了根据本发明的一个实施例的3个患者Sanger测序结果的示意图；

图5显示了根据本发明的一个实施例的野生型及变异后KCNJ6(GIRK2)蛋白的3D结构示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

KCNJ6突变体

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种分离的编码KCNJ6突变体的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸与SEQ ID NO：1相比，具有c.455_457del突变和c.460G>A突变的至少之一。KCNJ6(GIRK2)基因发生缺失以及突变的区域以及位点如图3所示。

在本文中所使用的表达方式“编码KCNJ6突变体的核酸”，是指与编码KCNJ6突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与KCNJ6突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据本发明的一些具体示例，所述核酸为DNA。

对于本发明说明书和权利要求书中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及SEQ ID NO：1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。

本申请中的基因序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。例如提及KCNJ6(GIRK2)基因的cDNA序列，实际也包括相应的RNA序列。

该编码KCNJ6突变体的核酸，是本申请的发明人通过目标区域捕获测序联合候选基因突变验证的方法确定的Keppen-Lubinsky综合症的致病基因KCNJ6的新的致病突变。该致病突变位点在现有技术中并未被提到。需要说明的是，在本文中所使用的表达方式“目标区域捕获测序”是指利用特制的探针对客户感兴趣的某段特定序列进行捕获富集后，再利用第二代测序技术进行高通量测序及基因组分析的方法。利用该方法能够获得指定目标区域的遗传信息，极大的提高了基因组中目标区域的研究效率，显著降低了研究成本。在本发明中，将该方法用于识别和研究与疾病相关的编码区域内的结构变异，进而，结合大量的公共数据库提供的数据，有利于更好地解释所得变异结构之间的关联和致病机理。

其中，野生型的KCNJ6的cDNA的序列如下所示：

ATGGCCAAGCTGACAGAATCCATGACTAACGTCCTGGAGGGCGACTCCATGGATCAGGACGTCGAAAGCCCAGTGGCCATTCACCAGCCAAAGTTGCCTAAGCAGGCCAGGGATGACCTGCCAAGACACATCAGCCGAGATCGGACCAAAAGGAAAATCCAGAGGTACGTGAGGAAAGACGGAAAGTGCAATGTTCATCACGGCAACGTGAGGGAGACCTATCGCTACCTGACCGATATCTTCACCACATTAGTGGACCTGAAGTGGAGATTCAACCTATTGATTTTTGTCATGGTTTACACAGTGACCTGGCTCTTTTTTGGAATGATCTGGTGGTTGATCGCATACATACGGGGAGACATGGACCACATAGAGGACCCCTCCTGGACTCCTTGTGTTACCAACCTCAACGGGTTCGTCTCTGCTTTTTTATTCTCAATAGAGACAGAAACCACCATTGGTTATGGCTACCGGGTCATCACAGATAAATGCCCAGAGGGAATTATTCTTCTCTTAATCCAATCTGTGTTGGGGTCCATTGTCAATGCATTCATGGTGGGATGCATGTTTGTAAAAATCTCTCAACCCAAGAAGAGGGCAGAGACCCTGGTCTTTTCCACCCATGCAGTGATCTCCATGCGGGATGGGAAACTGTGCCTGATGTTCCGGGTAGGGGACCTTAGGAATTCCCACATTGTGGAGGCTTCCATCAGAGCCAAGTTGATCAAATCCAAACAGACCTCGGAGGGGGAGTTCATCCCGTTGAACCAGACGGATATCAACGTAGGGTATTACACGGGGGATGACCGTCTGTTTCTGGTGTCACCGCTGATCATTAGCCATGAAATTAACCAACAGAGTCCTTTCTGGGAGATCTCCAAAGCCCAGCTGCCCAAAGAGGAACTGGAAATTGTGGTCATCCTAGAAGGAATGGTGGAAGCCACAGGGATGACATGCCAAGCTCGAAGCTCCTACATCACCAGTGAGATCCTGTGGGGTTACCGGTTCACACCTGTCCTGACCCTGGAGGACGGGTTCTACGAAGTTGACTACAACAGCTTCCATGAGACCTATGAGACCAGCACCCCATCCCTTAGTGCCAAAGAGCTGGCCGAGTTAGCCAGCAGGGCAGAGCTGCCCCTGAGTTGGTCTGTATCCAGCAAACTCAACCAACATGCAGAACTGGAGACTGAAGAGGAAGAAAAGAACCTCGAAGAGCAAACAGAAAGAAATGGTGATGTGGCAAACCTGGAGAATGAATCCAAAGTTTAG(SEQ ID NO：1，1272nt)

本发明的发生c.455_457del突变的KCNJ6突变体的cDNA序列如下所示：

ATGGCCAAGCTGACAGAATCCATGACTAACGTCCTGGAGGGCGACTCCATGGATCAGGACGTCGAAAGCCCAGTGGCCATTCACCAGCCAAAGTTGCCTAAGCAGGCCAGGGATGACCTGCCAAGACACATCAGCCGAGATCGGACCAAAAGGAAAATCCAGAGGTACGTGAGGAAAGACGGAAAGTGCAATGTTCATCACGGCAACGTGAGGGAGACCTATCGCTACCTGACCGATATCTTCACCACATTAGTGGACCTGAAGTGGAGATTCAACCTATTGATTTTTGTCATGGTTTACACAGTGACCTGGCTCTTTTTTGGAATGATCTGGTGGTTGATCGCATACATACGGGGAGACATGGACCACATAGAGGACCCCTCCTGGACTCCTTGTGTTACCAACCTCAACGGGTTCGTCTCTGCTTTTTTATTCTCAATAGAGACAGAAACCATTGGTTATGGCTACCGGGTCATCACAGATAAATGCCCAGAGGGAATTATTCTTCTCTTAATCCAATCTGTGTTGGGGTCCATTGTCAATGCATTCATGGTGGGATGCATGTTTGTAAAAATCTCTCAACCCAAGAAGAGGGCAGAGACCCTGGTCTTTTCCACCCATGCAGTGATCTCCATGCGGGATGGGAAACTGTGCCTGATGTTCCGGGTAGGGGACCTTAGGAATTCCCACATTGTGGAGGCTTCCATCAGAGCCAAGTTGATCAAATCCAAACAGACCTCGGAGGGGGAGTTCATCCCGTTGAACCAGACGGATATCAACGTAGGGTATTACACGGGGGATGACCGTCTGTTTCTGGTGTCACCGCTGATCATTAGCCATGAAATTAACCAACAGAGTCCTTTCTGGGAGATCTCCAAAGCCCAGCTGCCCAAAGAGGAACTGGAAATTGTGGTCATCCTAGAAGGAATGGTGGAAGCCACAGGGATGACATGCCAAGCTCGAAGCTCCTACATCACCAGTGAGATCCTGTGGGGTTACCGGTTCACACCTGTCCTGACCCTGGAGGACGGGTTCTACGAAGTTGACTACAACAGCTTCCATGAGACCTATGAGACCAGCACCCCATCCCTTAGTGCCAAAGAGCTGGCCGAGTTAGCCAGCAGGGCAGAGCTGCCCCTGAGTTGGTCTGTATCCAGCAAACTCAACCAACATGCAGAACTGGAGACTGAAGAGGAAGAAAAGAACCTCGAAGAGCAAACAGAAAGAAATGGTGATGTGGCAAACCTGGAGAATGAATCCAAAGTTTAG(SEQ ID NO：2，1269nt)

发生c.460G>A变异的KCNJ6(GIRK2)cDNA序列如下，其中突变碱基加框示出：

ATGGCCAAGCTGACAGAATCCATGACTAACGTCCTGGAGGGCGACTCCATGGATCAGGACGTCGAAAGCCCAGTGGCCATTCACCAGCCAAAGTTGCCTAAGCAGGCCAGGGATGACCTGCCAAGACACATCAGCCGAGATCGGACCAAAAGGAAAATCCAGAGGTACGTGAGGAAAGACGGAAAGTGCAATGTTCATCACGGCAACGTGAGGGAGACCTATCGCTACCTGACCGATATCTTCACCACATTAGTGGACCTGAAGTGGAGATTCAACCTATTGATTTTTGTCATGGTTTACACAGTGACCTGGCTCTTTTTTGGAATGATCTGGTGGTTGATCGCATACATACGGGGAGACATGGACCACATAGAGGACCCCTCCTGGACTCCTTGTGTTACCAACCTCAACGGGTTCGTCTCTGCTTTTTTATTCTCAATAGAGACAGAAACCACCATTGTTATGGCTACCGGGTCATCACAGATAAATGCCCAGAGGGAATTATTCTTCTCTTAATCCAATCTGTGTTGGGGTCCATTGTCAATGCATTCATGGTGGGATGCATGTTTGTAAAAATCTCTCAACCCAAGAAGAGGGCAGAGACCCTGGTCTTTTCCACCCATGCAGTGATCTCCATGCGGGATGGGAAACTGTGCCTGATGTTCCGGGTAGGGGACCTTAGGAATTCCCACATTGTGGAGGCTTCCATCAGAGCCAAGTTGATCAAATCCAAACAGACCTCGGAGGGGGAGTTCATCCCGTTGAACCAGACGGATATCAACGTAGGGTATTACACGGGGGATGACCGTCTGTTTCTGGTGTCACCGCTGATCATTAGCCATGAAATTAACCAACAGAGTCCTTTCTGGGAGATCTCCAAAGCCCAGCTGCCCAAAGAGGAACTGGAAATTGTGGTCATCCTAGAAGGAATGGTGGAAGCCACAGGGATGACATGCCAAGCTCGAAGCTCCTACATCACCAGTGAGATCCTGTGGGGTTACCGGTTCACACCTGTCCTGACCCTGGAGGACGGGTTCTACGAAGTTGACTACAACAGCTTCCATGAGACCTATGAGACCAGCACCCCATCCCTTAGTGCCAAAGAGCTGGCCGAGTTAGCCAGCAGGGCAGAGCTGCCCCTGAGTTGGTCTGTATCCAGCAAACTCAACCAACATGCAGAACTGGAGACTGAAGAGGAAGAAAAGAACCTCGAAGAGCAAACAGAAAGAAATGGTGATGTGGCAAACCTGGAGAATGAATCCAAAGTTTAG(SEQ ID NO:3，1272nt)

发明人惊奇的发现，该突变体与Keppen-Lubinsky综合症的发病密切相关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患Keppen-Lubinsky综合症，根据本发明的实施例，该突变体的核酸进一步丰富了KCNJ6基因的致病突变图谱，并且更深入地阐明了Keppen-Lubinsky综合症的分子发病机制，为Keppen-Lubinsky综合症的早期致病基因筛查和干预治疗提供科学依据。

根据本发明的第二方面，本发明还提供了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与SEQ ID NO：4相比，所述分离的多肽具有p.T152_I153delinsI突变和p.G154S突变的至少之一。具体地，致病基因KCNJ6上c.455_457del三碱基缺失，引起多肽p.T152_I153delinsI突变，而c.460G>A突变，导致p.G154S突变。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易患Keppen-Lubinsky综合症。

根据本发明的一些具体示例，所述多肽由权利要求1所述的核酸编码。其中，野生型的KCNJ6的cDNA编码的多肽的氨基酸序列如下：

MAKLTESMTNVLEGDSMDQDVESPVAIHQPKLPKQARDDLPRHISRDRTKRKIQRYVRKDGKCNVHHGNVRETYRYLTDIFTTLVDLKWRFNLLIFVMVYTVTWLFFGMIWWLIAYIRGDMDHIEDPSWTPCVTNLNGFVSAFLFSIETETTIGYGYRVITDKCPEGIILLLIQSVLGSIVNAFMVGCMFVKISQPKKRAETLVFSTHAVISMRDGKLCLMFRVGDLRNSHIVEASIRAKLIKSKQTSEGEFIPLNQTDINVGYYTGDDRLFLVSPLIISHEINQQSPFWEISKAQLPKEELEIVVILEGMVEATGMTCQARSSYITSEILWGYRFTPVLTLEDGFYEVDYNSFHETYETSTPSLSAKELAELASRAELPLSWSVSSKLNQHAELETEEEEKNLEEQTERNGDVANLENESKV(SEQ ID NO：4，423个氨基酸)

发生c.455_457del突变的KCNJ6突变体的氨基酸序列如下：

MAKLTESMTNVLEGDSMDQDVESPVAIHQPKLPKQARDDLPRHISRDRTKRKIQRYVRKDGKCNVHHGNVRETYRYLTDIFTTLVDLKWRFNLLIFVMVYTVTWLFFGMIWWLIAYIRGDMDHIEDPSWTPCVTNLNGFVSAFLFSIETETIGYGYRVITDKCPEGIILLLIQSVLGSIVNAFMVGCMFVKISQPKKRAETLVFSTHAVISMRDGKLCLMFRVGDLRNSHIVEASIRAKLIKSKQTSEGEFIPLNQTDINVGYYTGDDRLFLVSPLIISHEINQQSPFWEISKAQLPKEELEIVVILEGMVEATGMTCQARSSYITSEILWGYRFTPVLTLEDGFYEVDYNSFHETYETSTPSLSAKELAELASRAELPLSWSVSSKLNQHAELETEEEEKNLEEQTERNGDVANLENESKV(SEQ ID NO:5，422个氨基酸)

发生c.460G>A突变的KCNJ6突变体的氨基酸序列如下，其中突变氨基酸加框示出：

MAKLTESMTNVLEGDSMDQDVESPVAIHQPKLPKQARDDLPRHISRDRTKRKIQRYVRKDGKCNVHHGNVRETYRYLTDIFTTLVDLKWRFNLLIFVMVYTVTWLFFGMIWWLIAYIRGDMDHIEDPSWTPCVTNLNGFVSAFLFSIETETTISYGYRVITDKCPEGIILLLIQSVLGSIVNAFMVGCMFVKISQPKKRAETLVFSTHAVISMRDGKLCLMFRVGDLRNSHIVEASIRAKLIKSKQTSEGEFIPLNQTDINVGYYTGDDRLFLVSPLIISHEINQQSPFWEISKAQLPKEELEIVVILEGMVEATGMTCQARSSYITSEILWGYRFTPVLTLEDGFYEVDYNSFHETYETSTPSLSAKELAELASRAELPLSWSVSSKLNQHAELETEEEEKNLEEQTERNGDVANLENESKV(SEQ ID NO:6，423个氨基酸)

通过比对发现，与SEQ ID NO：1相比，发生c.455_457del突变的KCNJ6突变体的cDNA具有c.455_457del突变，进而，其编码产物与野生型的KCNJ6多肽的氨基酸序列相比，具有p.T152_I153delinsI突变，即由缺失的ACC碱基编码的Ile缺失；与SEQ ID NO：1相比，发生c.460G>A突变的KCNJ6突变体的cDNA具有c.460G>A突变，进而，其编码产物与野生型的KCNJ6多肽的氨基酸序列相比，具有p.G154S突变，即Gly突变为Ser。综上，上述两种突变均可引起Keppen-Lubinsky综合症。

筛选易患Keppen-Lubinsky综合症的生物样品的系统和试剂盒

根据本发明的第三方面，本发明提供了一种筛选易患Keppen-Lubinsky综合症的生物样品的系统。参照图1A，该系统包括：

核酸提取装置100，所述核酸提取装置100用于提取所述生物样品中的核酸样本。根据本发明的一些具体示例，所述核酸提取装置100进一步包括：RNA提取单元101，所述RNA提取单元101用于从生物样品中提取RNA样本；以及逆转录单元102，所述逆转录单元102与所述RNA提取单元101相连，用于对所述RNA样本进行逆转录反应，以便获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。

核酸序列确定装置200，所述核酸序列确定装置200与所述核酸提取装置100相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列。根据发明的具体示例，所述核酸序列确定装置进一步包括：文库构建单元201，所述文库构建单元201用于针对所述核酸样本，构建所述核酸的文库；以及测序单元202，所述测序单元202与所述文库构建单元201相连，通过对所述文库进行测序，以便确定所述核酸的序列。其中，所述文库构建单元201进一步包括：PCR扩增模块，所述PCR扩增模块中设置有KCNJ6基因外显子特异性引物，以便利用所述特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增。根据本发明的实施例，所述特异性引物具有如SEQ ID NO：7和8所示的核苷酸序列。根据本发明的一些具体示例，所述测序单元包括选自HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种。

判断装置300，所述判断装置300与所述核酸序列确定装置200相连，以便基于将所述核酸的序列与SEQ ID NO：1相比，是否具有c.455_457del突变和c.460G>A突变至少之一，判断所述生物样品是否易患Keppen-Lubinsky综合症。

发明人惊奇地发现，利用该系统可以对Keppen-Lubinsky综合症进行基因层面的检测，有助于更准确的筛选易患Keppen-Lubinsky综合症的生物样品。

根据本发明的第四方面，本发明提供了一种用于筛选易患Keppen-Lubinsky综合症的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有：适于检测KCNJ6基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO：1相比，所述KCNJ6基因突变体具有具有c.455_457del突变和c.460G>A突变至少之一。

在发明中，所使用的术语“适于检测KCNJ6基因突变体的试剂”应做广义理解，即可以是检测KCNJ6编码基因的试剂，也可以是检测KCNJ6突变体多肽的试剂，例如可以采用识别特异性位点的抗体。根据本发明的一些具体示例，所述试剂为核酸探针或引物。由此，能够特异性的检测KCNJ6基因。优选地，所述核酸探针或引物具有如SEQ ID NO：7和8所示的核苷酸序列。由此，对KCNJ6基因检测的特异性好，准确性高。

由此，利用该试剂盒，可以对KCNJ6基因突变体进行高精度的检测，从而对Keppen-Lubinsky综合症进行基因层面的检测，有助于更准确的筛选易患Keppen-Lubinsky综合症的生物样品。

构建体和重组细胞

根据本发明的第五方面，本发明提供了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前述的分离的编码KCNJ6突变体的核酸。由此，利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用于筛选治疗Keppen-Lubinsky综合症的药物。

在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一种，优选质粒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。

根据本发明的第六方面，本发明还提供了一种重组细胞，根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过表达前述的构建体转化受体细胞而获得的。根据本发明的一些实施例，利用本发明的重组细胞，能够有效地筛选治疗Keppen-Lubinsky综合症的药物。

构建药物筛选模型的方法

根据本发明的第七方面，本发明还提供了一种构建药物筛选模型的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：使动物的至少一部分细胞表达前述的多肽。根据本发明的实施例，所述动物为小鼠、猪、狗、灵长类动物。根据本发明的一些实施例，利用本发明的动物模型，能够有效地筛选治疗Keppen-Lubinsky综合症的药物。

其中，需要说明的是，本发明构建药物筛选模型的方法不受特别的限制，只要使动物的至少一部分细胞表达前述的多肽即可。例如，采用分子生物学技术，对受体细胞产生精确的目标基因定点突变，获得患有Keppen-Lubinsky综合症的动物，该动物可以作为模型用于筛选治疗该疾病的药物。例如，可以通过无标记转基因技术，定点整合技术，基因组编辑技术等方法实现目标基因的定点突变，获得本发明的编码KCNJ6突变体的基因，进而构建KCNJ6突变体基因的重组载体，将该重组载体通过一定的方式(常用电穿孔法)导入同源的胚胎干细胞中，使突变的外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而KCNJ6突变体基因在细胞中得以表达。再将重组细胞植入假孕母体，使其发育成嵌合体动物。利用嵌合体之间的交配，产生纯合体动物，嵌合体动物和纯化体动物均可用于药物筛选模型，从而有效地筛选治疗Keppen-Lubinsky综合症的药物。

本发明至少具有以下有益效果：

(1)本发明发现了Keppen-Lubinsky综合症相关基因的2个新的突变位点，对该基因位点的检测可以用于KPLBS患者的辅助诊断，并且可进一步应用于Keppen-Lubinsky综合症患者的分子诊断。因此，本发明的检测突变KCNJ6(GIRK2)基因或蛋白的方法可以可用于早期筛查Keppen-Lubinsky综合症致病突变携带者，进而在携带者发病之前进行早期干预治疗。该技术具有快速、准确、高效、简便、早期诊断率高等优点。

(2)本发明可以对Keppen-Lubinsky综合症的发病机理提供重要线索，对KPLBS的诊断治疗具有十分重要的意义。

(3)本发明发现的KCNJ6(GIRK2)基因也可作为脂肪代谢障碍的候选基因。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。

实施例1

确定Keppen-Lubinsky综合症突变基因的方法，具体如下：

1、样本采集

本实施例收集了不同地区的3个家系的样本，每个家系中均有一个Keppen-Lubinsky综合症患者，其家系图如图2所示，其中，罗马数字及阿拉伯数字表示该家系成员编号。圆表示女性，方框表示男性。实心圆或方框表示患者，三角形表示流产，箭头所指为先证者，即本实施例中的3个患者。其中，在三个家系中的患者信息如下：

第一个患者(来自家系#1的II1)，男，20岁，美国和西班牙混血，其妊娠史正常，出生体重为3.9kg。该患者脸部由于缺少皮下组织而皮肤紧贴，额头和下巴布满皱纹，眼睛由于眼眶浅而显得突出，鼻子小，齿龈突出，腭较窄并高耸，小颌畸形。患者有严重的复发性肺炎以及呼吸衰竭，4岁接受气管切开术，7岁植入人工气管，2岁时曾接受胃造瘘术。患者神经紧张亢进，屈曲挛缩，严重的脊柱侧凸，不能完全合上双眼，婴儿期即出现癫痫。患者父母不是近亲结婚。该家系其他成员均表型正常。

第二个患者(来自家系#2的II3)，男，20岁，意大利人，其妊娠后期出现羊水过多，剖腹产，出生体重为3.4kg，体长为50cm，头部周长为34cm，阿普伽新生儿标准1得分为6，标准5得分为7。该患者全身脂肪代谢障碍，四肢轻瘫，张口，大眼，鼻孔和鼻翼均发育不全，龈肥大，脊柱侧凸。患者父母为高加索人，不是近亲结婚。该家系其他成员均表型正常。

第三个患者(来自家系#3的II1)，男，14岁，也门人，其妊娠史正常，出生体重为3.3kg。该患者出生时即面部畸形，2周时出现角弓反张，并由于鼻孔过窄而呼吸困难，1岁出现发育迟缓，1.5岁时接受鼻软骨重建。患者随即出现自残行为，咀嚼自己的舌头以及嘴唇，并在2到4岁期间曾多次癫痫发作。由于脸部皮下脂肪的大幅减少，患者皮肤紧贴，眼睛突出，眼眶周围皮肤松弛，鼻子缩紧且鼻冀发育不全，人中短，上嘴唇撑起，张口，腭高耸，下巴突出。患者有严重的发育迟缓，常表现出紧张不安。患者父母为犹太人，不是近亲结婚。该家系其他成员均表型正常。

三个患者均具有KPLBS特征。由于目前KPLBS的发病机理和遗传方式尚不清楚，发明人同时考虑显性(新发突变)、隐形(纯合突变)和复合杂合遗传模式，并对三个患者及其父母进行全外显子组测序。

2、样品制备

采集的上述3个患者和其父母的样本(3个患者样本和6个正常样本)的外周血，根据世界医学会《赫尔辛基宣言》的要求，患者父母与BGI合作机构意大利分子神经遗传学研究所伦理委员会签署了知情同意书。利用常规酚-氯仿法抽提外周血白细胞中的基因组DNA，利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得的每个样本基因组DNA的OD260/OD280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于200ng/μl，总量不少于30μg。所有血样均签属知情同意书，并获得伦理委员会批准。

3、芯片设计、文库构建和高通量测序

用Aglient Sure Select Human All Exon kit(Agilent Technologies,SantaClara,CA,USA)结合Illumina HiSeq 2000高通量测序技术对上述3个患者的外显子组序列进行了测序，具体如下：

1)利用捕获芯片(Aglient Sure Select Human All Exon kit(AgilentTechnologies,Santa Clara,CA,USA))对基因组的外显子、剪接位点和邻近的内含子序列进行捕获。

2)将基因组DNA随机打断成100-200bp左右的片段，随后在片段两端分别连接上接头，制备测序文库(参见http://www.illumina.com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明书)。

3)文库经纯化后经过ligation-mediated PCR(LM-PCR)的线性扩增与customcapture array进行杂交富集，再经过LM-PCR的线性扩增后进行上机测序。测序平台为Illumina Hiseq2000，读取长度为90bp，双端测序。三个患者全外显子组序列的平均测序深度分别为50.08×，78.2×和46.11×。

3、变异检测、注释及与数据库比较

1)测序后获得的原始数据由Illumina base calling Software 1.7进行处理。在第一个患者中发现有87245个单核苷酸多态性(SNP)和8420处的插入/缺失，在第二个患者中发现有103638个单核苷酸多态性(SNP)和7268处的插入/缺失，在第三个患者中发现有90641个单核苷酸多态性(SNP)和8778处的插入/缺失。然后过滤低质量reads和接头片段，使用SOAPaligner/SOAP2(可参见：Li R,Li Y,Kristiansen K,et al,SOAP:shortoligonucleotide alignment program.Bioinformatics 2008,24(5):713-714；Li R,YuC,Li Y,et al.,SOAP2:an improved ultrafast tool for short readalignment.Bioinformatics 2009,25(15):1966-1967.，通过参照将其全文并入本文)比对到参考基因组Hg19(snp132)，以便获得比对到基因组上的唯一比对序列。然后利用SOAPsnp(可参见：Li R,Li Y,Fang X,Yang H,et al,SNP detection for massively parallelwhole-genome resequencing.Genome Res 2009,19(6):1124-1132.，通过参照将其全文并入本文)确定靶区域的基因型。

2)对于检出的SNP和indel变异，本实施例中采用BWA(0.7.5版)(可参见Li H,Durbin R.Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheelertransform.Bioinformatics 2010；26(5):589-595)和GATK(2.8-1版)(可参见DePristoMA,Banks E,Poplin R,et al.A framework for variation discovery and genotypingusing next-generation DNA sequencing data.Nat Genet 2011；43:491-8.，通过参照将其全文并入本文)确定indel(缺失)的类型。

同时，关注非同义突变，剪接受体/供体位点突变和编码区插入和缺失突变这三类最有可能与疾病相关的突变。将检出的变异和dbSNP135数据库、千人基因组数据库和HapMap数据库，ESP数据库(http://evs.gs.washington.edu/EVS/)等公共数据库和CAG数据库进行了比较，保留了低频的变异(MAF≤0.005)。接着用PhyloP进行保守性预测，去掉值小于0.95的不保守区域，再用PolyPhen and SIFT保留危害性较高的位点

3)通过比较三个患者及其父母的变异，重点关注de novo突变，发现这三个家系的患者在共有同一个基因上均有de novo突变，即为KCNJ6(GIRK2)基因第3号外显子的变异。具体而言为家系一和家系二的患者均发生了三个碱基的缺失c.455_457del，导致Thr152del氨基酸的缺失；家系三的患者发生了由G到A的错义突变c.460G>A，导致Gly154Ser的氨基酸改变。其父母亲均不含以上突变，证明以上2个突变任意其一均可导致患者发病。

如前所述，发明人认为在胚胎发育早期的膜电位破坏以及脂肪细胞分化程度减弱可能是导致Keppen-Lubinsky综合症患者皮下脂肪缺失的原因。从而，KCNJ6(GIRK2)基因可能是KPLBS的致病基因，发明人利用网页版SWISS-MODEL对野生型及变异后的KCNJ6(GIRK2)蛋白3D结构进行预测，蛋白的结构示意图详见图5，KCNJ6(GIRK2)蛋白的四个亚基分别用A链、B链、C链和D链表示，其中，A图为野生型KCNJ6(GIRK2)蛋白的3D结构；B图为钾离子选择区3D结构图；C图为KCNJ6(GIRK2)蛋白Gly154Ser突变后钾离子选择区3D结构图；D图为KCNJ6(GIRK2)蛋白Thr152del变异后钾离子选择区3D结构图。发明人发现本实施例发现的2个变异均位于GIRK2蛋白的选择区域，其中G154S变异正好位于该选择区的中间。与甘氨酸相比，丝氨酸的亲水性更强，位于通道内的钾离子可能会被-OH基团阻挡，导致通道关闭。另外，Thr152del显著地影响通道蛋白的结构。GIRK2蛋白152位苏氨酸的缺失导致位于151位的苏氨酸发生构象变化，两者共同作用使得通道高度减小，选择区的内部空间变宽，进而影响通道内钾离子的稳定性，并最终影响通道的功能。

因此，综上所述，发明人认为本发明找到的KCNJ6(GIRK2)基因的两个突变位点，即c.455_457del和c.460G>A位点，极可能是KPLBS(Keppen-Lubinsky综合症)的致病变异位点。

实施例2

由于外显子组测序存在一定程度的假阳性，本实施例利用Sanger测序方法，对KCNJ6(GIRK2)基因的突变位点进行了验证。

利用实施例1中3个家系，采用Sanger法对Keppen-Lubinsky综合症致病突变位点进行验证，包括引物设计，PCR扩增，产物纯化，测序得到序列，根据序列测定结果属于突变型还是野生型，验证突变与Keppen-Lubinsky综合症之间相关性。具体步骤如下：

1、DNA提取

采集的上述3个家系每个成员的外周血，根据世界医学会《赫尔辛基宣言》的要求，患者父母与BGI合作机构意大利分子神经遗传学研究所伦理委员会签署了知情同意书。利用常规酚-氯仿法抽提外周血白细胞中的基因组DNA，利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得的每个样本基因组DNA的OD260/OD280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于200ng/μl，总量不少于30μg。利用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA降解情况，以查检是否符合测序条件要求。

2、引物设计及PCR反应

引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3，具体见下。

a)引物序列：

b)反应体系：25μL

c)反应条件：

由此，获得患者和家系内正常人的PCR扩增产物。

3)将步骤2中获得PCR扩增产物纯化后用ABI的3730进行DNA测序。

Sanger测序结果见图4，其中家系一和家系二的患者sanger测序结果均证明发生了3个碱基的缺失导致了Thr152del氨基酸的缺失，家系三的患者的sanger测序结果显示其发生了G到A的错义突变c.460G>A，导致Gly154Ser的氨基酸改变。

因此，进一步证明了KCNJ6(GIRK2)基因的两个突变位点，即c.455_457del和c.460G>A位点突变，是KPLBS(Keppen-Lubinsky综合症)的致病变异位点。

实施例3

制备一检测试剂盒，其包含能够检测KCNJ6基因的c.455_457del和c.460G>A突变的引物，用于筛选Keppen-Lubinsky综合症的生物样品，其中这些引物为KCNJ6基因外显子特异性引物，其序列如实施例2中所述SEQ ID NO：7和8所示。

利用上述试剂盒筛选Keppen-Lubinsky综合症的生物样品的具体步骤为：按照实施例2的步骤1所述的方法提取待测者DNA，以所提取的DNA为模板与上述KCNJ6基因的外显子特异性引物进行PCR反应，反应体系和反应条件如实施例2所示，并按照本领域常规方法对PCR产物纯化，将纯化的产物进行测序，然后基于测序序列是否具有c.455_457del和c.460G>A突变至少之一，有效地检测本发明的KCNJ6基因突变体在待测者DNA中是否存在，从而能够有效地检测待测者是否易患Keppen-Lubinsky综合症，进一步，能够从待测者中筛选出Keppen-Lubinsky综合症的生物样品。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种分离的编码KCNJ6突变体的核酸，其特征在于，所述核酸与SEQ ID NO：1相比，具有c.455_457del突变和c.460G>A突变的至少之一。

2.根据权利要求1所述的核酸，其特征在于，所述核酸为DNA。

3.一种分离的多肽，其特征在于，与SEQ ID NO：4相比，所述分离的多肽具有p.T152_I153delinsI突变和p.G154S突变的至少之一。

4.根据权利要求3所述的多肽，其特征在于，所述多肽由权利要求1～2任一项所述的核酸编码。

5.一种用于筛选易患Keppen-Lubinsky综合症的生物样品的试剂盒，其特征在于，含有：

适于检测KCNJ6基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO：1相比，所述KCNJ6基因突变体具有c.455_457del突变和c.460G>A突变的至少之一。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述试剂为引物。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：7和8所示。

8.一种构建体，其特征在于，包含权利要求1～2任一项所述的分离的编码KCNJ6突变体的核酸。

9.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是通过将表达权利要求8所述的构建体转化受体细胞而获得的。