CN106591431B - 一种甲状腺癌致病相关的基因融合变异检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

一种甲状腺癌致病基因融合基因变异检测试剂盒，其特征在于，包括以下部分：RNA探针组，引物，封闭缓冲液，RNA酶封闭液，杂交缓冲液，结合缓冲液，1倍浓度的SSC的漂洗液，0.1倍浓度的SSC的漂洗液，PCR反应液和TE缓冲液；所述的RNA探针组包括161条RNA探针，所述的RNA探针序列如Seq ID No 1～Seq ID No 161。本发明提供的一种甲状腺癌致病基因融合检测试剂盒，可同时检测5个疾病相关的致病基因，可以为甲状腺癌患病个体精准诊断和治疗创造了条件，并可为甲状腺结节患者进行癌症风险评估。

Description

一种甲状腺癌致病相关的基因融合变异检测试剂盒
技术领域
本发明涉及基因变异检测领域，尤其涉及一种甲状腺癌致病相关基因融合变异检测试剂盒。
背景技术
甲状腺癌是内分泌系统中发病率最高的恶性疾病，其发病率在近三十年内上升了三倍。根据2012年中国国家癌症中心登记处统计，我国甲状腺癌的发病率约为十万分之8.76，每年大约有11.8万人被检测出甲状腺癌。从细胞起源和临床病理上甲状腺癌可分为以下几种亚型：起源于甲状腺滤泡上皮细胞的高分化的乳头状癌和滤泡状癌，低分化癌，未分化癌；以及起源于甲状腺滤泡旁细胞的甲状腺髓样癌。其中乳头状癌占了所有甲状腺癌85％的病例。目前的研究表明基因融合是甲状腺癌发病的决定性因素之一，癌症基因组计划(The Cancer GenomeAtlas)绘制的甲状腺癌的遗传图谱提示，基因融合占据了甲状腺癌驱动突变的20％左右。因此鉴定出甲状腺癌组织中的基因融合对于甲状腺癌的精准诊断和治疗是必要的。
目前基因融合的检测，主要依赖于实时荧光定量PCR(RealTime PCR,RT-PCR)、荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)和免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)等。FISH和IHC均采用探针杂交原理对已知的基因融合进行检测，一般一次仅检测一种类型的基因融合；RT-PCR具有相对较高的检测通量，例如针对白血病常见30个已知基因融合，可在8个PCR反应管中实现同时检测。但以上方法无一例外只能对已知的基因融合检测，并且受限于检测通量的限制，无法对致癌的所有基因融合实现一次性的全检测。而据众多研究报道，甲状腺癌的致病性基因融合已经超过40种，并且有大量的新的基因融合被陆续报道。因此，开发一种检测多基因的、已知及未知基因融合的方法，对于癌症的临床研究和诊断具有重要的意义。随着高通量测序技术的成熟，利用对癌组织的全转录组进行测序，可以实现对多基因的、已知及未知基因融合进行有效检测。但是在人类的全转录组中，存在2万多个基因，为测得所有的潜在的基因融合，需要至少得到8Gb的转录组测序数据；假如基因融合在全转录组中的表达丰度较低，甚至需要更多的转录组测序数据。因此，在实际临床诊断中，面临着全转录组测序成本高昂的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种甲状腺癌致病相关的基因融合变异检测试剂盒，可同时检测与甲状腺癌致病相关的基因，可以为甲状腺癌患病个体进行分子遗传学诊断。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种甲状腺癌致病相关的基因融合变异检测试剂盒，包括以下部分：RNA探针组，封闭缓冲液，RNA酶封闭液，杂交缓冲液，结合缓冲液，1倍浓度的SSC漂洗液，0.1倍浓度的SSC漂洗液，PCR反应液和TE缓冲液；
所述的RNA探针组包括161条RNA探针，所述的RNA探针序列如Seq ID No.1～SeqID No.161。
优选的，所述的RNA探针组能特异性捕获甲状腺癌致病相关的基因；
所述的甲状腺癌致病相关的基因包括：RET，NTRK1，NTRK3，PPARγ和RAF1。
优选的，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物序列为Seq IDNo.162，所述反向引物序列为Seq ID No.163。
优选的，所述的RNA探针为生物素标记的RNA探针。
优选的，所述的封闭缓冲液的成分包括人cot-1 DNA、鲑鱼精DNA和特异性封闭引物。
优选的，所述特异性封闭引物的序列为Seq ID No.164～Seq ID No.169。
优选的，所述的杂交缓冲液的成分包括SSPE溶液、Denhardt溶液、EDTA和SDS。
优选的，所述的结合缓冲液的成分包括NaCl，Tris-HCl和EDTA。
优选的，所述RNA酶封闭液为RNA酶抑制剂。
优选的，所述的1倍浓度的SSC漂洗液包括1倍浓度的SSC溶液和0.1％SDS；
优选的，所述的0.1倍浓度的SSC漂洗液包括0.1倍浓度的SSC溶液和0.1％SDS。
本发明的有益效果：本发明提供的一种甲状腺癌致病相关基因融合检测试剂盒，可同时检测5个疾病相关的致病基因，可以为甲状腺癌患病个体精准诊断和治疗创造了条件，并可为甲状腺结节患者进行癌症风险评估。
同时，本发明提供的甲状腺癌致病相关基因融合检测试剂盒，原料广泛易得，解决了检测成分本高昂的问题。
具体实施方式
本发明提供了一种甲状腺癌致病基因融合基因变异检测试剂盒，包括以下部分：RNA探针组，引物，封闭缓冲液，RNA酶封闭液，杂交缓冲液，结合缓冲液，1倍浓度的SSC漂洗液，0.1倍浓度的SSC漂洗液，PCR反应液和TE缓冲液；
所述的RNA探针组包括161条RNA探针，所述的RNA探针序列如Seq ID No.1～SeqID No.161。
本发明提供的试剂盒，可同时检测5个与甲状腺癌致病相关的基因，可以为甲状腺癌患病个体进行分子遗传学诊断，为精准诊断和治疗创造了条件，并可为甲状腺结节患者进行癌症风险评估。
本发明提供的试剂盒包括RNA探针组。所述RNA探针组的浓度优选为100ng/μl。所述RNA探针组的体积优选为200μl。
本发明中，所述甲状腺癌致病相关基因的获取方法优选通过调研医学文献检索服务系统PUBMED上截止目前所有有关甲状腺癌的遗传学研究的论文，确定了甲状腺癌致病相关的5个。
本发明中，所述的甲状腺癌致病相关基因优选包括RET，NTRK1，NTRK3，PPARγ，RAF1。本发明中，所述RET，NTRK1，NTRK3，PPARγ，RAF1基因与探针组对应关系如表1所示。
表1甲状腺癌的致病相关基因与RNA探针组的对应关系
本发明还提供了所述RNA探针组中探针的设计标准，优选包括以下内容：探针序列长度为55bp～120bp，且与目标区域序列一致；探针序列和目标区域序列的Tm值与探针序列和非目标区域序列Tm值的差值大于等于5℃，更优选与目标区域序列Tm与非目标区域序列Tm≥10℃；优选Tm的值基于SantaLucia2007热力学参数表的最邻近法计算；所述的探针自身形成发卡结构的Tm值≤45℃，更优选为Tm值≤37℃，优选Tm的值基于SantaLucia 2007热力学参数表的最邻近法计算；所述各个探针的拷贝数根据目标区域的GC含量调整，目标区域序列的GC含量为10～30％或70～90％的探针拷贝数是目标区域序列为40％～60％探针拷贝数的3～4倍，目标区域序列的GC含量为10～30％或70～90％的探针拷贝数是目标区域序列为40％～60％探针拷贝数的2.2～2.8倍。
本发明还提供了所述RNA探针组中探针的制备方法，优选包括以下步骤：
1)针对基因的编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，从第一个碱基开始设计长度为110～130bp的探针序列，并且每两个相邻的探针序列之间存在50～70bp的重叠；
2)在每个探针序列的5’端和3’端，分别添加序列为Seq ID No.170的引物和序列为Seq ID No.171的引物，形成两端带有同样序列的探针组序列列表；
3)采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸的大规模合成上述探针组序列列表中的序列；
4)将芯片上的寡核苷酸洗脱下来，形成寡核苷酸混合物；
5)以寡核苷酸混合物为模板，以序列为Seq ID No.170的引物和与序列为Seq IDNo.172的反向互补的序列为引物，利用Taq聚合酶进行聚合酶链式(PCR)反应扩增，获得大量的双链DNA池；
6)使用PCR纯化试剂盒，根据其操作说明书进行PCR产物纯化，获得纯化后的双链DNA池；
7)以1μl纯化后的双链DNA池为模板，使用序列为Seq ID No.173和Seq ID No.170为引物，利用Taq聚合酶进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，形成带T7序列的双链DNA池；
8)采用凝胶电泳对上一步PCR反应产物进行分离，去除非特异条带，回收170-180bp区域片段，采用胶回收试剂盒进行纯化；
9)采用T7大量RNA转录试剂盒，利用在dNTP中掺杂Biotin-UTP为底物，对上一步胶回收纯化产物进行体外转录，制备成含生物素标记的核糖核酸探针组：
37℃孵育8～12小时，得到最高产量含生物素标记的核糖核酸探针组，纯化后稀释至500ng/μl，置于-80℃冰箱保存。
本发明中，所述步骤5)优选采用PCR的反应体系：5uL10×PCR缓冲液，1μl dNTP(10mmol/L每种)，1μl的10μmol/L序列为SEQ ID No..170引物，1μl的10μmol/L序列为SEQID No..172的引物，1μl JumpStart Taq DNA聚合酶，1μl寡核苷酸混合物，40μl ddH2O。所述步骤7)所述PCR方法反应条件：94℃，1min；94℃，30s；68℃，30s；72℃，1min 15循环数；72℃，1min。
本发明中，所述步骤5)中Taq聚合酶的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的Taq聚合酶即可。本发明实施例中所述Taq聚合酶的来源为JumpStart TaqDNAPolymerase采购至Sigma，Catalog No.D6558。
本发明中，所述步骤6)PCR纯化试剂盒的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的PCR纯化试剂盒即可。本发明实施例中所述PCR纯化试剂盒的来源为QIAGEN公司，型号为CatNo./ID 28104。
本发明中，所述步骤7)所述PCR的反应体系：5uL10×PCR缓冲液，1μl dNTP(10mmol/L每种)，1μl的10μmol/L序列为SEQ ID No..173引物，1μl的10μmol/L序列为SEQID No..172的引物，1μl JumpStart Taq DNA聚合酶，1μl双链DNA池，40μl ddH2O。所述步骤7)所述PCR方法反应条件：94℃，1min；94℃，30s；68℃，30s；72℃，1min 15循环数；72℃，1min。
本发明中，所述步骤8)胶回收试剂盒来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的胶回收试剂盒即可。本发明实施例中所述胶回收试剂盒的来源为QIAGEN公司，型号为CatNo./ID 28704。
本发明中，所述T7大量RNA转录试剂盒来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的胶回收试剂盒即可。本发明实施例中所述T7大量RNA转录试剂盒购自Vazyme,型号为TR101-01/02。
本发明中，所述的RNA探针优选为生物素标记的RNA探针。本发明所述的生物素标记方法没有特殊限制采用本领域技术人员所熟知的生物素标记RNA探针的方法即可。
本发明提供的试剂盒包括引物。所述的引物包括1对DNA引物，所述的DNA引物正向序列为Seq ID No.162，所述的DNA引物反向序列为Seq ID No.163。所述引物正向序列和反向序列的来源委托生物工程公司合成。所述的引物的浓度优选为10μmol/L。所述的引物的体积优选为10μmol/L。
本发明提供的试剂盒包括封闭缓冲液。所述封闭缓冲液的体积优选为1.1mL。所述的封闭缓冲液包括人cot-1 DNA、鲑鱼精DNA和特异性封闭引物。
所述封闭缓冲液每11μl包括2.5μl的1mg/mL的人cot-1 DNA，2.5μl的1mg/mL鲑鱼精DNA和6种特异性封闭引物。所述的6种特异性封闭引物的浓度均为1mmol/L，各1μl，共6μl。
本发明中，所述特异性封闭引物的序列为Seq ID No.164～Seq ID No.169。本发明所述特异性封闭引物的序列的来源由发明人自己设计制备得到。本发明对引物合成的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的引物合成的方法即可。
本发明中，所述人cot-1 DNA的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的人cot-1 DNA即可。本发明实施例中所述人cot-1 DNA购自Invitrogen公司。
本发明中，所述鲑鱼精DNA的浓来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的鲑鱼精DNA即可。本发明实施例中所述鲑鱼精DNA购自Invitrogen公司。
本发明提供的试剂盒包括杂交缓冲液。所述的杂交缓冲液包括浓度为5倍浓度的SSPE溶液、5倍浓度的Denhardt溶液(邓哈特溶液)、5mmol/L的EDTA和质量浓度为0.1％的SDS。所属的杂交缓冲液的pH值优选为7.8。所述的杂交缓冲液的体积优选为2mL。所述SSPE溶液购买时为20倍浓度的SSPE缓冲液，购自Invitrogen公司。所述Denhardt溶液购买时为50倍浓度的Denhardt溶液，购自Invitrogen公司。所述EDTA溶液购买时的浓度为0.5mol/L，pH为8.0，购自Invitrogen公司。所述SSC溶液购自Invitrogen公司。
本发明提供的试剂盒包括结合缓冲液。所述的结合缓冲液包括浓度为的1mol/LNaCl，浓度为10mmol/L的Tris-HCl和浓度为1mmol/L的EDTA。所述的结合缓冲液的体积优选为100mL。
本发明提供的试剂盒包括RNA酶封闭液。所述RNA酶封闭液的体积优选为500μL。所述RNA酶封闭液优选为RNA酶抑制剂。所述RNA酶抑制剂的浓度优选为2U/μl。本发明中，所述RNA酶抑制剂的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的RNA酶抑制剂的来源即可。本发明实施例中，所述RNA酶抑制剂购自Invitrogen公司。
本发明提供的试剂盒包括1倍浓度的SSC漂洗液。所述的1倍浓度的SSC漂洗液包括1倍浓度的SSC溶液和质量浓度为0.1％SDS；所述0.1倍浓度的漂洗液的体积30mL。
本发明提供的试剂盒包括0.1倍浓度的SSC漂洗液。所述的0.1倍浓度的SSC漂洗液包括0.1倍浓度的SSC溶液和0.1％SDS。所述0.1倍浓度的漂洗液的体积100mL。
本发明提供的试剂盒包括PCR反应液。所述的PCR反应液包括0.1μmol/L dNTPs，0.1U/μL高保真Hotstart DNA聚合酶和2倍浓度PCR反应缓冲液。所述的PCR反应液的体积为2.2ml。
本发明提供的试剂盒包括TE缓冲液。所述TE缓冲液优选包括10mmol/L的Tris-HCl，1mmol/L的EDTA，调pH至8.0，水定容至500ml。每个试剂盒中TE缓冲液的体积优选5mL。
在本发明中，使用所述试剂盒进行检测的方法优选包括以下步骤：
A、肿瘤组织中提取RNA，并对提取的RNA进行质量检测；
B、取质检合格的RNA进行逆转录合成单链cDNA，并进行第二条链合成，得到双链cDNA；
C、将所述双链cDNA超声波破碎成小片段cDNA；
D、将所述步骤C得到的小片段cDNA制备成小片段文库；
E、将所述步骤D得到的小片段文库与封闭缓冲液混合；
F、将所述步骤E得到混合液进行高温变性；
G、将探针组与RNA酶封闭缓冲液混合，放置于冰上；
H、待所述步骤F文库和封闭液变性后降到恒温时将所述步骤G得到的探针与RNA酶封闭液的混合液和杂交缓冲液置于恒温中；
I、将所述步骤H得到的杂交缓冲液、所述步骤G得到的探针与RNA酶封闭液的混合液和变性反应后得到的小片段文库与封闭缓冲液混合进行混合，孵育过夜，得到杂交产物；
J、将磁珠重悬置于磁力架上1～2min，加入结合缓冲液，混合，如此重复3～4次，得到处理好的磁珠；
K、将所述步骤I中得到杂交产物与所述步骤H中得到磁珠进行混合；
L、向所述步骤K中得到的混合液中加入预热的1倍浓度的SSC漂洗液进行漂洗，放置于磁力架上吸附2-3min，分离除去上清液，得到磁珠杂交产物；
M、向所述步骤L中得到的磁珠杂交产物中加入预热的0.1倍浓度的SSC漂洗液进行漂洗，放置于磁力架上吸附2-3min，分离除去上清液，得到磁珠杂交产物；
N、将所述步骤M得到的磁珠杂交产物用水重悬，得到重悬的磁珠杂交产物；
O、将所述步骤N得到的磁珠杂交产物进行富集；
P、将所述步骤O得到的富集的磁珠杂交产物进行纯化；
Q、将所述步骤P得到的纯化的文库进行测序；
R、将测序得到的数据进行生物信息学分析流程和结果输出；
所述步骤C～E没有时间上的限制。
本发明从肿瘤组织中提取RNA，并对提取的RNA进行质量检测。所述质量检测优选用超微量分光光度计Nanodrop定量，琼脂糖凝胶电泳检测样本质量，完整的RNA电泳条带应该是清晰28S、18S和5S条带。
得到质检合格的RNA后，本发明将质检合格的RNA进行逆转录合成单链cDNA，将单链cDNA进行第二条链合成产生双链cDNA。本发明中，所述双链cDNA合成的方法优选用NEBNext mRNA Second Strand Synthesis Module进行双链cDNA合成，并且用DNA Clean&ConcentratorKit对双链cDNA进行纯化。本发明中，所述NEBNext mRNA Second StrandSynthesis Module购自NEB公司；所述DNA Clean&Concentrator Kit购自Zymo公司。
得到cDNA后，本发明将cDNA超声波破碎成小片段cDNA。所述超声波破碎优选使用Bioruptor。所述超声波破碎的时间为20～30s；所述超声波破碎的间隔时间为30s。所述超声破碎循环数优选为20个循环。所述小片段DNA的长度优选为150-250bp小片段。
得到小片段cDNA后，本发明将所述小片段cDNA进行捕获制备小片段文库。本发明中，所述制备文库的方法优选采用Illumina TruSeq DNA library preparation试剂盒。所述试剂盒的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的所述试剂盒即可。
得到小片段文库后，本发明将所述小片段文库与封闭缓冲液混合。所述小片段文库与封闭缓冲液的质量体积比为750～800：11～15(ng：μl)。本领域技术人员在所述混合后优选还包括浓缩。所述浓缩的方法优选采用真空浓缩离心机进行。所述浓缩后体积优选为9μL。
得到小片段文库与封闭缓冲液混合液后，本发明将所述混合液进行DNA变性反应。所述DNA变性反应程序优选为95℃，5min；65℃，保温。所述DNA变性反应优选在热盖开启状态下进行。
本发明将探针组与RNA酶封闭缓冲液混合，放置于冰上。本发明中，所述的探针组与RNA酶封闭缓冲液混合时的体积比优选为(1～3)：(4～6)，更优选为2：5。
待所述PCR反应至恒温后，本发明将所述步骤E得到的探针与RNA酶封闭液的混合液和杂交缓冲液置于恒温中。在本发明中，所述恒温的温度优选为60～70℃，更优选为65℃。所述探针与RNA酶封闭液的混合液和杂交缓冲液置于恒温中的时间优选2～7min，更优选为杂交缓冲液置于恒温中的时间优选为6～7min，所述探针与RNA酶封闭液的混合液置于恒温中的时间优选为2～3min。
杂交缓冲液达到恒温后，本发明将所述杂交缓冲液、所述步骤F得到的探针与RNA酶封闭液的混合液和PCR反应后得到的小片段文库与封闭缓冲液混合进行混合，孵育过夜，得到杂交产物。所述孵育的温度优选为60～70℃，更优选为65℃。所述孵育的时间优选为8～16h，更优选为12h。
本发明将磁珠重悬置于磁力架上1～2min，加入结合缓冲液，混合，得到处理好的磁珠。所述磁珠优选为Dynabeads MyOne Streptavidin T1 magnetic beads(链霉亲和素磁珠)，购于Invitrogen。所述磁珠与结合缓冲液的体积比优选为(50～60)：(200～300)。所述磁珠优选重复3～4次。
得到处理好的磁珠后，本发明将所述杂交产物与所述磁珠进行混合，得到杂交液孵育后的磁珠。所述杂交产物与所述磁珠的比例优选为(25～34)：(45～60)，更优选为29：50。
杂交液孵育后的磁珠后，本发明向所述杂交液孵育后的磁珠中加入预热的1倍浓度的SSC漂洗液后放置于磁力架上吸附2～3min，分离除去上清液，得到第一次洗涤后的磁珠杂交产物。所述1倍浓度的SSC漂洗液的添加量优选为150～300μL，更优选为200μL。所述1倍浓度的SSC漂洗液的预热的温度优选为60～70℃，更优选为65℃。本发明中，所述分离前优选还包括涡旋混匀和置于旋转混匀仪上混匀。所述涡旋的时间优选为5s～8s，更优选为7s；所述涡旋的速度优选为120～150rpm，更优选为140rpm。所述旋转混匀速度优选为30～50rpm，更优选为40rpm。所述旋转混匀时间优选为室温15～25mins，更优选为20min。
得到第一次洗涤后的磁珠杂交产物后，本发明向所述磁珠杂交产物中加入预热的0.1倍浓度的SSC漂洗液，放置于磁力架上吸附2-3min，分离除去上清液，得到第二次漂洗后的磁珠杂交产物。所述0.1倍浓度的SSC漂洗液的添加量优选为150～300μL，更优选为200μL。所述0.1倍浓度的SSC漂洗液的预热的温度优选为60～70℃，更优选为65℃。所述0.1倍浓度的SSC漂洗液的添加量优选为150～300μL，更优选为200μL。本发明在分离之前优选进行涡旋混匀和孵育。所述涡旋的时间优选为5s～8s，所述涡旋的速度优选为120～150rpm。所述孵育优选在金属浴上孵育。所述孵育的时间优选为10mins～15min，更优选为12min。所述分离的方法优选为磁力架吸附，吸附时间优选为2-3min。分离前优选进行离心，所述离心的转速优选700rpm～1000rpm，更优选为800rpm，离心时间优选为10s。
得到第二次漂洗后磁珠杂交产物沉淀后，本发明将所述磁珠杂交产物沉淀用水重悬。所述水的加入量为30μL～50μL，更优选为40μL。
重悬后，本发明将所述重悬后的磁珠杂交产物进行富集。所述的富集优选采用PCR的方法进行。所述PCR的反应体系优选如下：21μl 2×KAPA HiFi HotStart Ready Mix，20μl Captured on-bead DNA，1μl各10μmol/mol/L的正反向引物。所述PCR反应条件优选为：98℃，5min；98℃，30s；65℃，30s；72℃，30s，16个循环；72℃，5min。
得到富集的杂交产物后，本发明将所述富集的磁珠杂交产物进行纯化。所述纯化优选采用磁珠纯化文库试剂盒。本发明对所述磁珠纯化文库试剂盒没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的磁珠纯化文库试剂盒即可。本发明中，所述磁珠纯化文库试剂盒为Beckman Agencourt AMPure XP磁珠纯化文库试剂盒。
得到纯化后的文库后，本发明将所述纯化的文库进行测序。所述测序优选采用Illumina Hiseq 4000进行测序。
得到测序结果后，本发明将所述测序数据进行生物信息学分析流程和结果输出。所述生物信息学分析流程包括SNP分析流程、InDel分析流程和基因融合分析流程。
本发明中，所述的SNP分析流程包括以下步骤：
①获取原始短序列；
②去除测序数据中的接头、引物和低质量数据等；
③把短序列用SOAPaligner软件定位到人MHC3.6M基因组数据相应的位置上，所用到参数：soap2.20-a-b-t-v 3-l 42-s 63-m100-x 400，其中序列错配数为3，具体参数含义参考：http://soap.genomics.org.cn/soapaligner.html；
④统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等；
⑤SOAPsnp用于在目标区域找出位点的基因型，所用到参数：soapsnp-i-d-o-r0.00005-e 0.0001-M-t-u-L-s-2–T，具体参数含义参考http://soap.genomics.org.cn/soapsnp.html；
⑥过滤掉低质量值(质量值≥20)和低覆盖度(深度≥10)的SNP；
⑦利用CCDS、人基因组数据库(NCBI 37.2)、dbSNP(v138)信息对SNP进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、SNP功能(错义突变/无义突变/可变剪切位点)、SIFT预测SNP影响蛋白功能预测等；
⑧根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的SNP作为候选的SNPs，在候选的SNPs中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人MHC3.6M基因组、其他外显子测序项目中出现的SNP。同时，过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的SNPs作为最后疾病相关的候选SNPs；
本发明中，所述的InDel分析流程包括以下步骤：
①把去除接头序列和低质量的测序数据用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)比对到人MHC3.6M基因组上，所用到参数：bwa aln-L-l 31-i10-k2-t 7-e 40，具体参数含义参考：http://bio-bwa.sourceforge.net/bwa.shtml；
②用GATK软件找出序列中所含有的插入/缺失(InDel)的信息；
③利用CCDS、人基因组数据库(NCBI 37.2)、dbSNP(v138)信息对InDel进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能(氨基酸插入/氨基酸缺失/移码突变)。
(3)基因融合分析流程
①去除接头和低质量数据等；
②用DeFuse软件找出目标基因上基因融合的信息；
③对基因融合进行注释，确定融合位点的位置信息，是否移码等信息来判断是否发生遗传变异。
下面结合实施例对本发明提供的一种甲状腺癌致病相关基因融合变异检测试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
甲状腺癌致病相关基因的筛选
通过调研医学文献检索服务系统PUBMED上截止目前所有有关甲状腺癌的遗传学研究的论文，确定了甲状腺癌相关的5个致病基因，具体为RET，NTRK1，NTRK3，PPARγ，RAF1。
探针组的设计和制备
根据上述5个基因序列(HG19版本)，本领域技术人员可以通过公知、通用的方法设计并合成探针序列，本实施例中对合成的探针序列进行扩增，体外转录和生物素标记。具体步骤如下：
1、针对基因的编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，从第一个碱基开始设计长度为110-130bp的探针序列，并且每两个相邻的探针序列之间存在50-70bp的重叠；
2、在每个探针序列的5’端和3’端，分别添加TAGGTGTGTAGGCGC(SEQ ID No..123)和GTCAGCTAGTACGCA(SEQ ID No..124)序列，形成两端带有同样序列的探针组序列列表；
3、采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸的大规模合成上述探针组序列列表中的序列；
4、将芯片上的寡核苷酸洗脱下来，形成寡核苷酸混合物；
5、以寡核苷酸混合物为模板，以SEQ ID No..123和与序列为SEQ ID No..125的反向互补的序列为引物，利用Taq聚合酶(JumpStart Taq DNA Polymerase采购至Sigma，Catalog No.D6558)进行聚合酶链式反应扩增，获得大量的双链DNA池，具体操作步骤如下：
反应体系：5uL 10×PCR缓冲液，1μl dNTP(10mmol/L每种)，1μl的10μmol/L序列为SEQ ID No..170引物，1μl的10μmol/L序列为SEQ ID No..172的引物，1μl JumpStart TaqDNA聚合酶，1μl寡核苷酸混合物，40μl ddH2O。所述步骤7)所述PCR方法反应条件：94℃，1min；94℃，30s；68℃，30s；72℃，1min 15循环数；72℃，1min；
6、使用QIAGEN PCR纯化试剂盒，根据其操作说明书进行PCR产物纯化，获得纯化后的双链DNA池；
7、以1μl纯化后的双链DNA池为模板，使用序列为SEQ ID No..126和SEQ IDNo..125为引物，利用Taq聚合酶进行聚合酶链式反应扩增，形成带T7序列的双链DNA池。操作如下：
反应体系：5uL 10×PCR缓冲液，1μl dNTP(10mmol/L每种)，1μl的10μmol/L序列为SEQ ID No..173引物，1μl的10μmol/L序列为SEQ ID No..172的引物，1μl JumpStart TaqDNA聚合酶，1μl双链DNA池，40μl ddH2O。所述步骤7)所述PCR方法反应条件：94℃，1min；94℃，30s；68℃，30s；72℃，1min 15循环数；72℃，1min；
8、采用凝胶电泳对上一步PCR反应产物进行分离，去除非特异条带，回收170-180bp区域片段，采用Qiagen胶回收试剂盒进行纯化；
9、采用T7高通量RNA转录试剂盒，利用在dNTP中掺杂Biotin-UTP为底物，对上一步胶回收纯化产物进行体外转录，制备成含生物素标记的核糖核酸探针组：
37℃孵育8-12小时，得到最高产量含生物素标记的核糖核酸探针组，纯化后稀释至500ng/μl，置于-80℃冰箱保存。
实施例2
使用Trizol或类似产品提取肿瘤组织中的RNA。用超微量分光光度计Nanodrop定量，琼脂糖凝胶电泳检测样本质量，完整的基因组DNA电泳条带通常应不小于20kb，完整的RNA电泳条带应该是清晰28S、18S和5S条带。
取2ug质检合格的RNA用NEB Protoscript II Reverse Transcriptase(购自NEB公司)进行逆转录合成单链cDNA。用NEBNext mRNA Second Strand Synthesis Module(购自NEB公司)进行双链cDNA合成。用DNA Clean&Concentrator Kit(购自Zymo公司)对双链cDNA进行纯化。将双链cDNA使用超声波破碎仪Bioruptor pico进行随机打断至150-250bp小片段；
使用Illumina TruSeq DNA文库准备试剂盒进行捕获前小片段文库制备。
取750ng步骤2中构建好的小片段文库，与11μl封闭缓冲液混合，在真空浓缩离心机中浓缩至9μl。
将杂交缓冲液在室温下融化，混匀后置于65℃水浴锅中预热，预热期间拿出混匀一次。分装到PCR管中，20μl每管。
取2μl探针加入5μl RNA酶封闭缓冲液，混匀后短暂离心，置于冰上。
设置PCR仪参数，95℃，5min；65℃，hold(热盖开启)；
将步骤3中准备的样品置于PCR仪上，运行以上程序；
PCR仪温度降至65℃时，将步骤4中准备的杂交缓冲液置于PCR仪上；
杂交缓冲液65℃保温5min后，将步骤5中准备的探针和RNA酶封闭缓冲液置于PCR上2min；
吸取13μl杂交缓冲液移至探针中，吸取全部文库和封闭缓冲液移至探针中,轻轻吸打10次，充分混匀，盖上管盖，盖好PCR仪热盖,65℃孵育过夜(8-16h)；
将磁珠Dynabeads MyOne Streptavidin T1 magnetic beads(购于Invitrogen)从4℃取出，涡旋震荡重悬；取50μl磁珠置于1.5mL EP管内，置于磁力架上1min，移除上清，从磁力架上取下EP管，加入200μL结合缓冲液，移液器吹打混匀；
置于磁力架上1min，吸弃上清。该步骤重复2次，共用结合缓冲液洗磁珠3次。加入200μL结合缓冲液，重悬磁珠；
将漂洗液2于水浴锅中65℃提前预热；
将杂交产物加入到200μl结合缓冲液重悬的磁珠中，用移液器吸打混匀，置于旋转混匀仪上室温结合30min；
加入200μL的漂洗液1，轻轻吸打6次混匀，置于旋转混匀仪上室温15mins，然后短暂离心，将PCR管放于磁力架上吸附2min，移除上清；
加入65℃预热的漂洗液2，涡旋混匀5s，65℃震荡金属浴上孵育10mins,转速800转每分钟，然后短暂离心，将PCR管放于磁力架上吸附2min，移除上清；
重复上述步骤两次；
向PCR管加入42μL不含DNA酶的水轻轻吸打6次，重悬磁珠。
对捕获的目标区域进行富集，PCR反应体系如下：21μl 2×KAPA HiFi HotStartReadyMix，20μl Captured on-bead DNA，1μL Nextflex引物。PCR反应条件为：98℃，5min；16cycles[98℃，30s；65℃，30s；72℃，30s]；72℃，5min。
文库纯化：用Beckman Agencourt AMPure XP磁珠纯化文库，用20μl Nuclease-free water溶解文库。
将步骤20得到的文库进行Illumina Hiseq 4000测序。
生物信息学分析流程和结果输出
(1)SNP分析流程
①获取原始短序列；
②去除测序数据中的接头、引物和低质量数据等；
③把短序列用SOAPaligner软件定位到人MHC3.6M基因组数据相应的位置上，所用到参数：soap2.20-a-b-t-v 3-l 42-s 63-m100-x 400，其中序列错配数为3，具体参数含义参考：http://soap.genomics.org.cn/soapaligner.html；
④统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等；
⑤SOAPsnp用于在目标区域找出位点的基因型，所用到参数：soapsnp-i-d-o-r0.00005-e 0.0001-M-t-u-L-s-2–T，具体参数含义参考http://soap.genomics.org.cn/soapsnp.html；
⑥过滤掉低质量值(质量值>＝20)和低覆盖度(深度>＝10)的SNP；
⑦利用CCDS、人基因组数据库(NCBI 37.2)、dbSNP(v138)信息对SNP进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、SNP功能(错义突变/无义突变/可变剪切位点)、SIFT预测SNP影响蛋白功能预测等；
⑧根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的SNP作为候选的SNPs，在候选的SNPs中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人MHC3.6M基因组、其他外显子测序项目中出现的SNP。同时，过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的SNPs作为最后疾病相关的候选SNPs；
(2)InDel分析流程
①把去除接头序列和低质量的测序数据用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)比对
到人MHC3.6M基因组上，所用到参数：bwa aln-L-l 31-i 10-k2-t 7-e 40，具体参数含义参考：http://bio-bwa.sourceforge.net/bwa.shtml；
②用GATK软件找出序列中所含有的插入/缺失(InDel)的信息；
③利用CCDS、人基因组数据库(NCBI 37.2)、dbSNP(v138)信息对InDel进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能(氨基酸插入/氨基酸缺失/移码突变)。
(3)基因融合分析流程
①去除接头和低质量数据等；
②用DeFuse软件找出目标基因上基因融合的信息；
③对基因融合进行注释，确定融合位点的位置信息，是否移码等信息来判断是否发生遗传变异。
实施例4
对89例患者进行了RNA目标区域捕获测序，目的致病/易感基因RNA目标区域捕获测序数据质量如表2所示，95.3％以上的原始短序列都能被比对回参考序列，目的致病/易感基因的富集显著，目标区域的平均有效测序数据量达到412Mb，这能够有效监测出甲状腺癌组织中的基因融合事件。
表2目的致病/易感基因RNA目标区域捕获测序数据质量
实施例5
LTY，女，38岁，患者颈部不适4个月，无疼痛。发病以来患者无发热，手震，无声嘶、呛咳，无心悸，无气促、吞咽不适。精神体力好，食欲可，睡眠差，二便正常，体重无明显改变。否认肝炎、结核等其他传染病史，否认高血压、冠心病等其他心血管病史，否认糖尿病史，否认其他内分泌病史，否认肿瘤病史，否认手术、外伤史。无输血史，喹诺酮过敏，表现为耳鸣。无食物过敏史。超声检查显示右侧甲状腺实性占位，穿刺考虑为乳头状癌。手术中可见甲状腺右叶灰红色甲状腺组织，大小5X3X1.5cm，表面附包膜，尚光滑，切开可见灰白结节一枚，大小1.5X1.5X1cm，结节切面灰白实性质中。未见脉管癌栓。利用本发明所述试剂盒检测手术切除的癌组织，检测到了CCDC6-RET基因融合事件。检测癌旁样本后确定基因融合为体细胞变异。CCDC6-RET基因融合是被广泛报道的甲状腺癌致病遗传变异。
CAX，女，52岁，甲状腺肿物。甲功五项无异常。病理诊断为甲状腺微小乳头状癌，大小0.6X0.6X0.3cm，未见被膜侵犯，淋巴结见癌转移。利用本发明所述试剂盒检测手术切除的癌组织，检测到ETV6-NTRK3基因融合事件。检测癌旁样本后确定基因融合为体细胞变异。ETV6-NTRK3基因融合是被广泛报道的甲状腺癌致病遗传变异。
YLQ，女，43岁，甲状腺乳头状癌滤泡亚型，超声显示肿物长径5.3cm。术中未见被甲状腺外侵犯；未见脉管癌栓。利用本发明所述试剂盒检测手术切除的癌组织，检测到PAX8-PPARγ基因融合事件。检测癌旁样本后确定基因融合为体细胞变异。PAX8-PPARγ是甲状腺滤泡状癌中频率最高的变异，在甲状腺乳头状癌滤泡亚型中也经常被检测到，其致癌特性在小鼠模型中得到了验证。
YHD，男，42岁，甲状腺乳头状癌(1.7cm)，可见淋巴结癌转移。利用本发明所述试剂盒检测手术切除的癌组织，未检测到已经报道的基因融合事件，检测到AFAP1L2-RET基因融合事件。检测癌旁样本后确定基因融合为体细胞变异。RET和其他基因的融合事件在甲状腺癌中被广泛报道是致病事件，AFAP1L2-RET之前未在癌症中报道过，AFAP1L2被鉴定为RET新的融合伙伴基因。
LN，女，29岁，甲状腺乳头状癌(1.0cm)，VI区淋巴结癌转移。纤维脂肪组织内见癌浸润。利用本发明所述试剂盒检测手术切除的癌组织，检测到TPM3-NTRK1基因融合事件。检测癌旁样本后确定基因融合为体细胞变异。TPM3-NTRK1基因融合是被广泛报道的甲状腺癌致病遗传变异。
MCH，女，29岁，左甲状腺乳头状癌，VI区淋巴结癌转移。利用本发明所述试剂盒检测手术切除的癌组织，检测到CCDC6-RET基因融合事件。检测癌旁样本后确定基因融合为体细胞变异。CCDC6-RET基因融合是被广泛报道的甲状腺癌致病遗传变异。
LWL，女，56岁，甲状腺乳头状癌(0.5cm)，未发现淋巴结癌转移。甲状腺组织中局部滤泡上皮增生。利用本发明所述试剂盒检测手术切除的癌组织，检测到PAX8-PPARγ基因融合事件。检测癌旁样本后确定基因融合为体细胞变异。PAX8-PPARγ是甲状腺滤泡状癌中频率最高的变异，在甲状腺乳头状癌滤泡亚型中也经常被检测到，其致癌特性在小鼠模型中得到了验证。
综上所述，以上8例甲状腺癌患者，分别检测到已知的致病基因融合，新的基因融合事件。本发明提供的用于检测甲状腺癌的致病/易感基因变异的探针组及试剂盒具有操作简便、成本低廉、特异性好、灵敏度高等特点，因此本发明的探针组和试剂盒可应用于患病个体的分子遗传学诊断，同时还可用于甲状腺结节患者的癌症风险评估。本发明的使用可以对患病个体的靶向治疗提供依据，为甲状腺结节患者评估癌症风险、及时监测治疗，符合精准医疗的发展趋势。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种甲状腺癌致病基因融合检测试剂盒，其特征在于，包括以下部分：RNA探针组，引物，封闭缓冲液，RNA酶封闭液，杂交缓冲液，结合缓冲液，1倍浓度的SSC的漂洗液，0.1倍浓度的SSC的漂洗液，PCR反应液和TE缓冲液；所述的RNA探针组包括161条RNA探针，所述的RNA探针序列如Seq ID No.1～Seq ID No.161。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的RNA探针组能特异性捕获甲状腺癌的致病相关的基因；
所述的甲状腺癌相关的致病基因包括：RET，NTRK1，NTRK3，PPARγ和RAF1。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物序列为Seq ID No.162，所述反向引物序列为Seq ID No.163。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的RNA探针为生物素标记的RNA探针。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的封闭缓冲液包括人cot-1DNA、鲑鱼精DNA和特异性封闭引物；所述的特异性封闭引物的序列为Seq ID No.164～SeqIDNo.169。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的杂交缓冲液包括SSPE溶液、Denhardt溶液、EDTA和SDS。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的结合缓冲液包括NaCl、Tris-HCl和EDTA。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述RNA酶封闭液为RNA酶抑制剂。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述1倍浓度的SSC漂洗液包括1倍浓度的SSC溶液和0.1％SDS；
所述0.1倍浓度的SSC漂洗液包括0.1倍浓度的SSC溶液和0.1％SDS。
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GR01 Patent grant
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