CN109371119A - 用于检测人类线粒体dna删除突变及耗竭的引物对、试剂盒及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及线粒体DNA分子检测领域，特别涉及用于检测人类线粒体DNA删除突变及耗竭的引物对、试剂盒及其方法。用于检测人类线粒体DNA删除突变及耗竭的引物对，引物对的正向引物位于线粒体重链复制原点的正负300bp范围内，反向引物位于线粒体重链复制原点区段内。本发明巧妙地将长程PCR的两条引物均设计在人类线粒体DNA的重链复制原点邻近区域，避免了因为引物落入删除区域而导致漏检的问题；本发明的扩增区域长达16397bp，几乎扩增整个环形线粒体DNA，可覆盖环形线粒体DNA上几乎所有可能的删除类型，形成了一种检测范围广、灵敏度高、操作快速简单、成本低廉的人类线粒体DNA删除突变及耗竭的检测方法。

Description

用于检测人类线粒体DNA删除突变及耗竭的引物对、试剂盒及 其方法

技术领域

本发明涉及线粒体DNA分子检测领域，具体而言，涉及用于检测人类线粒体DNA删除突变及耗竭的引物对、试剂盒及其方法。

背景技术

线粒体是细胞内一种提供能量的细胞器，在人体除了成熟的红细胞以外，其他所有的细胞都含有数量不等的线粒体。线粒体是双膜结构，有独立的可以半自主复制的遗传物质即线粒体DNA。在线粒体内可完成多种生物化学反应，主要是氧化磷酸化过程。氧化磷酸化是将丙酮酸和脂肪酸等底物氧化成水和二氧化碳的过程，在此过程中产生的三磷酸腺苷(ATP)为细胞活动提供能量。

线粒体功能受损，可导致氧化磷酸化过程中ATP产生缺陷，从而引起细胞代谢紊乱并出现一系列的临床症状。骨骼肌和神经系统中由于存在大量线粒体，耐缺氧能力较差，因此对ATP供应不足最敏感，成为发病率最高的器官。临床上表现为LHON综合征(Leber遗传性视神经病)；MERRF 综合征(肌阵挛性癫痫发作、小脑共济失调、乳酸血症和碎红肌纤维)；MELAS综合症(线粒体肌病、脑病、乳酸中毒、卒中样发作)；Leigh病(亚急性坏死性脑脊髓病)；KSS综合征(视网膜色素变性、心脏传导阻滞和眼外肌麻痹)；Pearson综合征(骨髓-胰腺综合征)；CPEO综合症(慢性进展性眼外肌麻痹)；Alpers病(家族性原发性进行性灰质萎缩症)；MNGIE综合征 (线粒体周围神经病并胃肠型脑病)；NARP综合征(视网膜色素变性共济失调性周围神经病)；Menke病(卷毛型灰质营养不良)；wolfram综合征(视神经萎缩、耳聋、糖尿病)；线粒体心肌病等。另外，线粒体功能受损还与其他一些疾病如帕金森病、肿瘤、冠心病等相关。

虽然人类线粒体自身基因组只编码13种蛋白质，约相当于线粒体生命活动总蛋白质的1％不到，但目前已知的线粒体疾病绝大多数来源于线粒体基因编码蛋白质的缺失或缺陷。线粒体DNA(线粒体DNA)是独立于细胞核染色体外的又一基因组，虽然它仅由16569个碱基组成，但其表达对于维持细胞的生理功能至关重要。与核DNA相比，线粒体DNA更易于发生突变。核DNA具有完善的突变纠正机制，但线粒体只有有限的DNA修复机制(如线粒体DNA聚合酶无校对功能,不能像核基因那样去除变异的碱基)；机体95％以上的氧自由基来自于线粒体，线粒体呼吸链产生的氧自由基积累会导致线粒体DNA的损伤和突变；线粒体DNA缺乏组蛋白保护；线粒体DNA没有内含子，突变易损害重要的功能区。这些因素使得线粒体DNA的突变率非常高，从而导致线粒体病。至今已发现几百种线粒体DNA 异常，这些发现很大程度上丰富了我们对线粒体病的认识。

线粒体基因的检测在线粒体病的确诊过程中具有举足轻重的意义。线粒体DNA的异质性(heteroplasmy)是影响线粒体DNA检测准确性的一个重要因素。与核基因组不同，线粒体DNA以多拷贝形式存在于线粒体中，而同一个细胞又拥有数百至上千个线粒体。线粒体DNA的突变可发生在大量不同的线粒体DNA分子上，突变的线粒体DNA(突变型)可以和正常的线粒体DNA(野生型)共存，突变体含量可在0％～100％之间，突变型与野生型的比率是线粒体疾病发病机制中的重要决定因素。受精卵经过卵裂和胚胎发育，最终仅有几个拷贝的线粒体DNA分子进入新生儿的组织细胞中。体细胞每经历一次有丝分裂，线粒体DNA又会随着线粒体一起被随机分配到子代细胞中。因此，同一母系家族成员间、同一患者各个组织间的突变型与野生型的比例常常会大不相同。这导致目前发现的很多线粒体病先证者都是散发的，先证者中检测到的突变很少能在其母亲体内检测到。患者各个组织中突变载荷(突变型线粒体DNA占总的线粒体DNA的比例) 的差别，也对检测样本来源提出了要求，一般推荐使用不分裂组织来源的细胞，如肌肉、脑组织等。而血液样本检测效果较差，容易造成假阴性，但是肌肉样本或脑组织样本取样困难，不易获得受检者的配合。

线粒体DNA的缺陷，主要包括点突变、大片段删除、线粒体DNA总量减少等三种类型。其中线粒体DNA的点突变及小的插入缺失(indels)，以及线粒体相关核基因的点突变及indels，现在都可以使用成熟的二代测序技术(next generation sequencing；NGS)进行检测，二代测序技术还可以根据突变位点的reads数和该位点的总reads数，计算出突变位点的突变载荷。相对而言，线粒体DNA的大片段删除及线粒体DNA的数量减少一直缺乏快速、准确且灵敏的检测方法。目前常用的检测技术有4种，阐述如下：

1、southern-blot杂交技术。southern-blot杂交技术的原理是使用限制性内切酶将环形的线粒体DNA酶切成线性，线性线粒体DNA经凝胶电泳后，正常大小的野生型线粒体DNA(16569bp)与发生删除的突变型线粒体DNA 会相互分离开来，然后使用线粒体DNA的D-Loop区或整个线粒体DNA 作为标记探针，对分离的线性线粒体DNA进行杂交显色，从而判断是否存在异常大小的线性线粒体DNA条带。southern-blot杂交技术优势是几乎不会出现假阳性，但是技术流程长、操作费时费力，从实际应用看，难以对待检样本随到随检，需要积累一定数量样本成批检测以降低成本，最关键的是检测灵敏度低，鉴于这些缺点，目前已不推荐使用southern-blot杂交技术检测线粒体DNA的大片段删除。

2、Gap-PCR技术。环形线粒体DNA发生大片段删除后，当一对引物正好位于线粒体DNA断裂位点两侧的适当位置时，野生型线粒体DNA模板扩增出的DNA片段大小，会与删除型线粒体DNA模板扩增出的DNA 片段大小不一致(删除型线粒体DNA模板扩增出的DNA片段较小)，对较小片段进行一代测序，可以准确分析出线粒体DNA的断裂位点。Gap-PCR 技术操作简单快速，可以准确显示出线粒体DNA断裂位点。但是，由于每个受检者线粒体DNA断裂位点未知，需要同时设计多对引物进行 Gap-PCR，直到有一对引物正好位于断裂位点两侧的适当位置，才能达到检测目的，也就是说检测过程其实就是一个断裂位点的摸索查找过程，这造成了实验和分析的麻烦，每个受检者的线粒体DNA断裂位点不同，从而使得方法的通用性难以满足要求，且耗时费力。

3、MLPA技术。MLPA技术自2011年起开始应用于线粒体DNA的删除及重复检测，是一种新型的半定量线粒体DNA删除重复检测技术，由荷兰MRC公司开发应用。该技术设计了位于线粒体DNA不同部位的37对探针，与野生型线粒体DNA模板杂交后，探针对中的两条探针首尾相邻，在连接酶的作用下，可以连接成一条完整的DNA单链模板。37对探针连接后，使用通用引物进行PCR扩增，每个探针对连接产物扩增产生的PCR片段大小各不相同(每对探针中的两条探针5’端或3’端带有通用引物序列。使用填充序列使得PCR产物大小不一，产物大小为预先设定)，然后使用毛细管电泳进行片段筛选区分各个大小不同的PCR产物，根据PCR产物的长度(bp数)，判断探针对在线粒体DNA上的位置，根据PCR产物的丰度(峰高)，判断线粒体DNA上该探针对所处位置是否发生删除或重复，如果探针对所处的线粒体DNA部位发生删除，PCR产物丰度降低，如果探针对所处的线粒体DNA部位发生重复，PCR产物丰度升高。MLPA技术操作简单方便，已成功地应用于核基因的删除重复突变检测，但是线粒体DNA的异质性特点，使得线粒体DNA的MLPA检测与核基因的MLPA检测大不相同：野生型核基因一般为2个拷贝，删除型突变一般由2拷贝变成1拷贝或0拷贝，重复型突变一般由2拷贝变成3拷贝或4拷贝。删除或重复突变的载荷数值要么为50％，要么为100％。而线粒体DNA突变由于具有异质性，删除或重复突变的载荷可为从0％到100％区间中的任何值。MLPA 做出删除或重复突变判断的突变载荷至少得是50％，从文献报道来看，使用MLPA技术进行线粒体DNA删除重复突变的检测，受检者样本中线粒体 DNA删除重复突变的载荷至少得达到40％以上，才能做出阳性判断。这无疑大幅度降低了检测的灵敏度，特别是对于临床上常见的血液样本来说，很难检测出阳性结果。

4、长程PCR技术。长程PCR技术使用一对引物一次性扩增线粒体DNA 的大部分区域，一般是扩增大弧区域(线粒体重链复制原点OH和轻链复制原点OL之间的大弧，含有大部分线粒体DNA编码基因)，由于PCR技术的限制，长度一般不超过11Kb。如果线粒体DNA删除发生在两条引物所处位置的中间，那么，PCR扩增除了得到野生型线粒体DNA扩增片段外，还会得到较小的突变型线粒体DNA扩增片段。长程PCR技术操作简单快速，检测灵敏度很高，线粒体DNA删除载荷大于10％即可检出。但是，使用的两条引物必须位于删除区域的两端，如果有一条引物位于删除区域内部，则会漏检。已报道的文献中使用的引物对有：8286F/13705R； 8286F/15591R；10360F/151R(数值为引物5’端在线粒体DNA上的位置，线粒体DNA总长16569bp，参考序列Genebank号：NC_012920，F指正向引物，R指反向引物)。从文献报道的结果看，由于扩增长度不超过11Kb，确实有发生漏检的报道。从Mitomap数据库搜集的已知的线粒体DNA删除突变案例来看，也确实存在漏检的可能性。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

鉴于长程PCR技术的优势，如果能对现有的技术加以改进，进一步延长扩增长度，减少漏检的可能性，有可能形成一种更为可靠、简便、快速、高灵敏、低成本的线粒体DNA删除检测方法。从文献报道及Mitomap数据库记录结果看，我们发现线粒体DNA的重链复制原点(O_H)附近从未发现过删除，而轻链复制原点(O_L)附近则有删除突变的案例报道。我们推测可能是因为重链复制原点附近区域为线粒体DNA复制所必须，如果该区域发生删除，那么，删除突变后的线粒体DNA分子无法复制，从而也无法达到致病性的突变载荷。如果将长程PCR引物设计在重链复制原点附近，那么可以使得我们的引物位于绝大部分删除区域的两侧，从而避免漏检的可能性，至少大幅度降低漏检的可能性。这样的引物位置设计，需要扩增几乎整个线粒体DNA的16Kb区域，在减少漏检可能性的同时，对长程PCR 技术提出了更高的要求与挑战，但这样的设计与操作执行，优势显而易见。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

用于检测人类线粒体DNA删除突变及耗竭的引物对，所述引物对的正向引物位于线粒体重链复制原点的正负300bp范围内，反向引物位于线粒体重链复制原点区段内。

目前的文献报道及Mitomap数据库均记录了发生线粒体DNA删除突变的大量案例，但是，从未检测到重链复制原点(O_H)附近发生的删除突变。推测人类线粒体DNA的重链复制原点(O_H)是人类线粒体DNA复制所必须。本发明巧妙地将长程PCR的两条引物均设计在人类线粒体DNA的重链复制原点(O_H)邻近区域，其中，正向引物位于线粒体重链复制原点的正负300bp范围内，反向引物位于线粒体重链复制原点区段内，避免了因为引物落入删除区域而导致漏检的问题。

人类线粒体DNA总长度为16569bp，所处的位置坐标的参考序列为 NC_012920，具体见SEQ ID NO.3所示，其中，1-576bp和16024-16569bp 为D-loop区，线粒体重链复制原点O_H位于111-191bp。正向引物位于线粒体重链复制原点的正负300bp范围内，也就是以111bp向前数300bp， 191bp向后数300bp，得到本发明正向引物的设置区段，即16380-491bp。

进一步地，所述引物对的核酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2 所示。

具体地，正向引物MTDF1位于环形线粒体DNA序列323-345bp处，反向引物MTDR1位于环形线粒体DNA序列128-150bp处。线粒体重链复制原点O_H位于111-191bp处，正向引物MTDF1位于O_H附近，反向引物 MTDR1位于O_H内部。PCR扩增产物长度为16397bp(人类线粒体DNA总长度为16569bp)，所处的位置坐标的参考序列为NC_012920。

另外，本发明的扩增区域长达16397bp，几乎扩增整个环形线粒体 DNA。可覆盖环形线粒体DNA上几乎所有可能的删除类型。与现有的长程PCR技术相比，本发明提升了检测的范围，大幅度降低了漏检的可能性。与现有的MLPA技术和southern-blot检测方法相比，具有灵敏度高、操作快速简单、成本低廉的优势。从而形成了一种检测范围广、灵敏度高、操作快速简单、成本低廉的人类线粒体DNA删除突变及耗竭的检测方法。

本发明还提供了用于检测人类线粒体DNA删除突变及耗竭的试剂盒，含有上述的引物对。

进一步地，所述试剂盒还包括dNTPs、用于大片段扩增的DNA聚合酶、缓冲液、双蒸水中的任一种或几种。

进一步地，所述用于大片段扩增的DNA聚合酶为PrimeSTAR GXL聚合酶或PrimeSTAR Max DNA聚合酶。

本发明还提供了人类线粒体DNA删除突变及耗竭的检测方法，待检测线粒体基因组作为模板，以上述的引物对进行PCR扩增，得到的产物进行电泳检测，判断所述待检测线粒体基因组的类型。

进一步地，所述待检测线粒体基因组来自待检测物的组织或细胞。

进一步地，所述待检测线粒体基因组在PCR扩增体系中的浓度不低于 0.5ng/μl。如在不同的实施例中，待检测线粒体基因组在PCR扩增体系中的浓度可以为0.5ng/μl、1ng/μl、2ng/μl、5ng/μl、10ng/μl、50ng/μl等等。

进一步地，PCR扩增体系为20-75μl。如在不同的实施例中，扩增体系的体积可以为20μl、25μl、50μl、75μl等等。

进一步地，PCR扩增的程序为：95-98℃，10-15s；60℃，15s；68℃， 5-6min；上述程序共25-35个循环。

如在不同的实施例中，循环数可以为25、28、30、35等等。

进一步地，检测时的样本还包括正常线粒体基因组，通过待检测线粒体基因组与正常线粒体基因组的扩增结果比对，判断所述待检测线粒体基因组的类型。

进一步地，所述电泳检测为：采用琼脂糖凝胶电泳，电泳完成后，抓取条带信息。

进一步地，所述抓取条带信息采用凝胶成像仪和Gel-Pro Analyzer软件完成。

本发明中，可按照以下扩增体系进行扩增以及检测：

PCR反应体系体积为50μl，其中，人类线粒体基因组的浓度为1ng/μl， 5×PrimeSTAR GXL buffer 10μl，dNTP Mixture(每种2.5mM)1μl，上下引物浓度均为10mM各1μl，PrimeSTAR GXL polymerase(1.25U/μL)2μl，余量为双蒸水。

PCR反应程序如下

将PCR产物取5μl上样，同时使用DL15000DNA分子量Marker 5μl 上样。在0.8％的琼脂糖凝胶、1×TAE溶液中、100V进行电泳，并使用凝胶成像仪和Gel-Pro Analyzer软件进行成像。若受检样本线粒体有大片段删除，在胶图中除了可以看到16397bp的主带外，应该还可以看到分子量较小的条带。若受检样本线粒体DNA有耗竭(线粒体DNA总量减少)，在胶图中可以看到受检样本的16397bp主带，与正常对照样本的16397bp主带相比，亮度会明显减弱，且在整个泳道上，有DNA弥散分布。可以用Gel-Pro Analyzer软件对受检样本和正常对照样本的16397bp主带进行定量，操作如下：1)点击“工具”，选择“区域密度”；2)弹出界面后，点击“定义范围”； 3)使用鼠标单击需要标注的条带，然后右击确认；4)选定完成后，点击“end”即可弹出结果。当受检样本平均密度值低于对照样本平均密度值的1/3时，判定受检样本线粒体DNA存在耗竭情况。

另外，本发明中的PCR扩增体系以及体系中的组分根据情况可进行相应的变化。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明巧妙地将长程PCR的两条引物均设计在人类线粒体DNA 的重链复制原点(O_H)邻近区域，避免了因为引物落入删除区域而导致漏检的问题。

(2)本发明的扩增区域长达16397bp，几乎扩增整个环形线粒体DNA，可覆盖环形线粒体DNA上几乎所有可能的删除类型。

(3)与现有的长程PCR技术相比，本发明提升了检测的范围，大幅度降低了漏检的可能性。

(4)与现有的MLPA技术和southern-blot检测方法相比，具有灵敏度高、操作快速简单、成本低廉的优势。

(5)本发明形成了一种检测范围广、灵敏度高、操作快速简单、成本低廉的人类线粒体DNA删除突变及耗竭的检测方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例1中pearson综合症患者样本线粒体DNA删除型突变长程PCR产物电泳检测图；

图2为本发明实施例1中pearson综合症患者样本线粒体DNA删除型突变断裂位点一代测序图；

图3为本发明实施例2中MNGIE型线粒体DNA耗竭症患者样本线粒体DNA耗竭长程PCR产物电泳检测图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明可用于检测人类线粒体DNA的删除突变及耗竭，下面分别以 pearson综合症患者样本和MNGIE型线粒体DNA耗竭症患者样本的检测为例，阐述本发明的技术方案。

Qiagen QIAamp DNA Mini Kit购自QIAGEN公司；Qubit定量试剂盒购自ABI公司；PrimeSTAR GXL polymerase、PrimeSTAR GXL buffer、dNTP 购自Takara公司；琼脂糖凝胶购自Amoresco公司；DNA纯化回收试剂盒购自天根公司。

实施例1

Pearson综合症患者样本中线粒体DNA删除突变的检测

1、Pearson综合症患者样本线粒体DNA的提取

从400μl血液样本出发，使用Qiagen QIAamp DNA Mini Kit试剂盒提取人基因组DNA及线粒体DNA混合物。使用qubit对提取的总DNA进行定量，浓度为98.3ng/μl，体积为45μl，共计获得DNA4.40μg，用TE 溶液将DNA稀释到50ng/μl。

2、PCR反应体系的组装

将提取的线粒体DNA、5X PrimeSTAR GXL缓冲液、PrimeSTAR GXL polymerase、dNTP(4种dNTP，每种浓度为2.5mM)、正向引物MTDF1 和反向引物MTDR1等试剂及材料置于冰上融化，震荡混匀后瞬时离心放冰上备用。按照下表1组装PCR反应体系。

表1 PCR反应体系组份

组份	体积(μl)
		5×PrimeSTAR GXL buffer	10
dNTP Mixture(每种2.5mM)	1
		引物MTDF1(10mM)	1
引物MTDR1(10mM)	1
		基因组DNA(50ng/μl)	1
超纯水	34
		PrimeSTAR GXL polymerase(1.25U/μL)	2
TOTAL	50

3、运行PCR反应

将组装好的体系震荡混匀，瞬时离心后，放PCR仪内，运行如下表2 程序。

表2 PCR反应程序

4、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳

将PCR产物取5μl上样，同时使用DL15000DNA分子量Marker 5μl 上样。在0.8％的琼脂糖凝胶、1XTAE溶液中、100V进行电泳，并使用凝胶成像仪和Gel-Pro Analyzer软件进行成像。结果见图1。图1中，左侧两个条带为正常对照样本扩增的条带，另一条为待检测样本扩增的条带。与正常对照样本相比，该例pearson综合症患者样本除了16397bp的野生型条带外，还存在约11Kb的删除型条带。

5、对删除型条带的一代测序验证

使用DNA纯化回收试剂盒纯化回收约11Kb的删除型条带，使用多对引物对回收条带进行Gap-PCR，并回收PCR产物直接进行一代测序，结果证实该pearson综合症患者样本的确发生了线粒体DNA的删除突变，且确认删除发生在线粒体DNA的8469-13447bp之间，删除区域总长度为 4978bp。结果见图2，其中蓝色方框和红色方框之间为断裂位点。

实施例2

MNGIE型线粒体DNA耗竭症患者中线粒体DNA耗竭的检测

1、MNGIE型线粒体DNA耗竭症患者线粒体DNA的提取

从400μl血液样本出发，使用Qiagen QIAamp DNA Mini Kit试剂盒提取人基因组DNA及线粒体DNA。使用qubit对提取的DNA进行定量，浓度为76.8ng/μl，体积为45μl，共计获得DNA 3.46μg，用TE溶液将DNA 稀释到50ng/μl。

2、PCR反应体系的组装

将提取的线粒体DNA、5X PrimeSTAR GXL缓冲液、PrimeSTAR GXL polymerase、dNTP(4种dNTP，每种浓度为2.5mM)、正向引物MTDF1 和反向引物MTDR1等试剂及材料置于冰上融化，震荡混匀后瞬时离心放冰上备用。PCR反应体系同实施例1表1。

3、运行PCR反应

将组装好的体系震荡混匀，瞬时离心后，放PCR仪内，运行程序同实施例1表2。

4、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳

将PCR产物取5μl上样，同时使用DL15000DNA分子量Marker 5μl 上样。在0.8％的琼脂糖凝胶、1XTAE溶液中、100V进行电泳，并使用凝胶成像仪和Gel-Pro Analyzer软件进行成像。结果见图3。图3中，左侧两个条带为正常对照样本扩增的条带，另一条为待检测样本扩增的条带。

与正常对照样本相比，该例MNGIE型线粒体DNA耗竭症患者样本中 16397bp的野生型条带显著减弱，且可见泳道上弥散型的DNA分布。

使用Gel-Pro Analyzer软件对受检样本和正常对照样本的16397bp主带进行定量，两个正常对照样本16397bp的野生型条带的平均密度分别为 145.599和146.517，平均值为146.058。MNGIE型线粒体DNA耗竭症患者样本中16397bp的野生型条带的平均密度为36.391，低于正常对照样本平均值的1/3，结果判定为线粒体耗竭。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京纳诺基生物医药科技有限公司

<120> 用于检测人类线粒体DNA删除突变及耗竭的引物对、试剂盒及其方法

<130> 2018

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gccacagcac ttaaacacat ctc 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gatgaggcag gaatcaaaga cag 23

<210> 3

<211> 16569

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (3107)..(3107)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 3

gatcacaggt ctatcaccct attaaccact cacgggagct ctccatgcat ttggtatttt 60

cgtctggggg gtatgcacgc gatagcattg cgagacgctg gagccggagc accctatgtc 120

gcagtatctg tctttgattc ctgcctcatc ctattattta tcgcacctac gttcaatatt 180

acaggcgaac atacttacta aagtgtgtta attaattaat gcttgtagga cataataata 240

acaattgaat gtctgcacag ccactttcca cacagacatc ataacaaaaa atttccacca 300

aaccccccct cccccgcttc tggccacagc acttaaacac atctctgcca aaccccaaaa 360

acaaagaacc ctaacaccag cctaaccaga tttcaaattt tatcttttgg cggtatgcac 420

ttttaacagt caccccccaa ctaacacatt attttcccct cccactccca tactactaat 480

ctcatcaata caacccccgc ccatcctacc cagcacacac acaccgctgc taaccccata 540

ccccgaacca accaaacccc aaagacaccc cccacagttt atgtagctta cctcctcaaa 600

gcaatacact gaaaatgttt agacgggctc acatcacccc ataaacaaat aggtttggtc 660

ctagcctttc tattagctct tagtaagatt acacatgcaa gcatccccgt tccagtgagt 720

tcaccctcta aatcaccacg atcaaaagga acaagcatca agcacgcagc aatgcagctc 780

aaaacgctta gcctagccac acccccacgg gaaacagcag tgattaacct ttagcaataa 840

acgaaagttt aactaagcta tactaacccc agggttggtc aatttcgtgc cagccaccgc 900

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aagcacccaa cttacactta ggagatttca acttaacttg accgctctga gctaaaccta 1680

gccccaaacc cactccacct tactaccaga caaccttagc caaaccattt acccaaataa 1740

agtataggcg atagaaattg aaacctggcg caatagatat agtaccgcaa gggaaagatg 1800

aaaaattata accaagcata atatagcaag gactaacccc tataccttct gcataatgaa 1860

ttaactagaa ataactttgc aaggagagcc aaagctaaga cccccgaaac cagacgagct 1920

acctaagaac agctaaaaga gcacacccgt ctatgtagca aaatagtggg aagatttata 1980

ggtagaggcg acaaacctac cgagcctggt gatagctggt tgtccaagat agaatcttag 2040

ttcaacttta aatttgccca cagaaccctc taaatcccct tgtaaattta actgttagtc 2100

caaagaggaa cagctctttg gacactagga aaaaaccttg tagagagagt aaaaaattta 2160

acacccatag taggcctaaa agcagccacc aattaagaaa gcgttcaagc tcaacaccca 2220

ctacctaaaa aatcccaaac atataactga actcctcaca cccaattgga ccaatctatc 2280

accctataga agaactaatg ttagtataag taacatgaaa acattctcct ccgcataagc 2340

ctgcgtcaga ttaaaacact gaactgacaa ttaacagccc aatatctaca atcaaccaac 2400

aagtcattat taccctcact gtcaacccaa cacaggcatg ctcataagga aaggttaaaa 2460

aaagtaaaag gaactcggca aatcttaccc cgcctgttta ccaaaaacat cacctctagc 2520

atcaccagta ttagaggcac cgcctgccca gtgacacatg tttaacggcc gcggtaccct 2580

aaccgtgcaa aggtagcata atcacttgtt ccttaaatag ggacctgtat gaatggctcc 2640

acgagggttc agctgtctct tacttttaac cagtgaaatt gacctgcccg tgaagaggcg 2700

ggcataacac agcaagacga gaagacccta tggagcttta atttattaat gcaaacagta 2760

cctaacaaac ccacaggtcc taaactacca aacctgcatt aaaaatttcg gttggggcga 2820

cctcggagca gaacccaacc tccgagcagt acatgctaag acttcaccag tcaaagcgaa 2880

ctactatact caattgatcc aataacttga ccaacggaac aagttaccct agggataaca 2940

gcgcaatcct attctagagt ccatatcaac aatagggttt acgacctcga tgttggatca 3000

ggacatcccg atggtgcagc cgctattaaa ggttcgtttg ttcaacgatt aaagtcctac 3060

gtgatctgag ttcagaccgg agtaatccag gtcggtttct atctacnttc aaattcctcc 3120

ctgtacgaaa ggacaagaga aataaggcct acttcacaaa gcgccttccc ccgtaaatga 3180

tatcatctca acttagtatt atacccacac ccacccaaga acagggtttg ttaagatggc 3240

agagcccggt aatcgcataa aacttaaaac tttacagtca gaggttcaat tcctcttctt 3300

aacaacatac ccatggccaa cctcctactc ctcattgtac ccattctaat cgcaatggca 3360

ttcctaatgc ttaccgaacg aaaaattcta ggctatatac aactacgcaa aggccccaac 3420

gttgtaggcc cctacgggct actacaaccc ttcgctgacg ccataaaact cttcaccaaa 3480

gagcccctaa aacccgccac atctaccatc accctctaca tcaccgcccc gaccttagct 3540

ctcaccatcg ctcttctact atgaaccccc ctccccatac ccaaccccct ggtcaacctc 3600

aacctaggcc tcctatttat tctagccacc tctagcctag ccgtttactc aatcctctga 3660

tcagggtgag catcaaactc aaactacgcc ctgatcggcg cactgcgagc agtagcccaa 3720

acaatctcat atgaagtcac cctagccatc attctactat caacattact aataagtggc 3780

tcctttaacc tctccaccct tatcacaaca caagaacacc tctgattact cctgccatca 3840

tgacccttgg ccataatatg atttatctcc acactagcag agaccaaccg aacccccttc 3900

gaccttgccg aaggggagtc cgaactagtc tcaggcttca acatcgaata cgccgcaggc 3960

cccttcgccc tattcttcat agccgaatac acaaacatta ttataataaa caccctcacc 4020

actacaatct tcctaggaac aacatatgac gcactctccc ctgaactcta cacaacatat 4080

tttgtcacca agaccctact tctaacctcc ctgttcttat gaattcgaac agcatacccc 4140

cgattccgct acgaccaact catacacctc ctatgaaaaa acttcctacc actcacccta 4200

gcattactta tatgatatgt ctccataccc attacaatct ccagcattcc ccctcaaacc 4260

taagaaatat gtctgataaa agagttactt tgatagagta aataatagga gcttaaaccc 4320

ccttatttct aggactatga gaatcgaacc catccctgag aatccaaaat tctccgtgcc 4380

acctatcaca ccccatccta aagtaaggtc agctaaataa gctatcgggc ccataccccg 4440

aaaatgttgg ttataccctt cccgtactaa ttaatcccct ggcccaaccc gtcatctact 4500

ctaccatctt tgcaggcaca ctcatcacag cgctaagctc gcactgattt tttacctgag 4560

taggcctaga aataaacatg ctagctttta ttccagttct aaccaaaaaa ataaaccctc 4620

gttccacaga agctgccatc aagtatttcc tcacgcaagc aaccgcatcc ataatccttc 4680

taatagctat cctcttcaac aatatactct ccggacaatg aaccataacc aatactacca 4740

atcaatactc atcattaata atcataatag ctatagcaat aaaactagga atagccccct 4800

ttcacttctg agtcccagag gttacccaag gcacccctct gacatccggc ctgcttcttc 4860

tcacatgaca aaaactagcc cccatctcaa tcatatacca aatctctccc tcactaaacg 4920

taagccttct cctcactctc tcaatcttat ccatcatagc aggcagttga ggtggattaa 4980

accaaaccca gctacgcaaa atcttagcat actcctcaat tacccacata ggatgaataa 5040

tagcagttct accgtacaac cctaacataa ccattcttaa tttaactatt tatattatcc 5100

taactactac cgcattccta ctactcaact taaactccag caccacgacc ctactactat 5160

ctcgcacctg aaacaagcta acatgactaa cacccttaat tccatccacc ctcctctccc 5220

taggaggcct gcccccgcta accggctttt tgcccaaatg ggccattatc gaagaattca 5280

caaaaaacaa tagcctcatc atccccacca tcatagccac catcaccctc cttaacctct 5340

acttctacct acgcctaatc tactccacct caatcacact actccccata tctaacaacg 5400

taaaaataaa atgacagttt gaacatacaa aacccacccc attcctcccc acactcatcg 5460

cccttaccac gctactccta cctatctccc cttttatact aataatctta tagaaattta 5520

ggttaaatac agaccaagag ccttcaaagc cctcagtaag ttgcaatact taatttctgt 5580

aacagctaag gactgcaaaa ccccactctg catcaactga acgcaaatca gccactttaa 5640

ttaagctaag cccttactag accaatggga cttaaaccca caaacactta gttaacagct 5700

aagcacccta atcaactggc ttcaatctac ttctcccgcc gccgggaaaa aaggcgggag 5760

aagccccggc aggtttgaag ctgcttcttc gaatttgcaa ttcaatatga aaatcacctc 5820

ggagctggta aaaagaggcc taacccctgt ctttagattt acagtccaat gcttcactca 5880

gccattttac ctcaccccca ctgatgttcg ccgaccgttg actattctct acaaaccaca 5940

aagacattgg aacactatac ctattattcg gcgcatgagc tggagtccta ggcacagctc 6000

taagcctcct tattcgagcc gagctgggcc agccaggcaa ccttctaggt aacgaccaca 6060

tctacaacgt tatcgtcaca gcccatgcat ttgtaataat cttcttcata gtaataccca 6120

tcataatcgg aggctttggc aactgactag ttcccctaat aatcggtgcc cccgatatgg 6180

cgtttccccg cataaacaac ataagcttct gactcttacc tccctctctc ctactcctgc 6240

tcgcatctgc tatagtggag gccggagcag gaacaggttg aacagtctac cctcccttag 6300

cagggaacta ctcccaccct ggagcctccg tagacctaac catcttctcc ttacacctag 6360

caggtgtctc ctctatctta ggggccatca atttcatcac aacaattatc aatataaaac 6420

cccctgccat aacccaatac caaacgcccc tcttcgtctg atccgtccta atcacagcag 6480

tcctacttct cctatctctc ccagtcctag ctgctggcat cactatacta ctaacagacc 6540

gcaacctcaa caccaccttc ttcgaccccg ccggaggagg agaccccatt ctataccaac 6600

acctattctg atttttcggt caccctgaag tttatattct tatcctacca ggcttcggaa 6660

taatctccca tattgtaact tactactccg gaaaaaaaga accatttgga tacataggta 6720

tggtctgagc tatgatatca attggcttcc tagggtttat cgtgtgagca caccatatat 6780

ttacagtagg aatagacgta gacacacgag catatttcac ctccgctacc ataatcatcg 6840

ctatccccac cggcgtcaaa gtatttagct gactcgccac actccacgga agcaatatga 6900

aatgatctgc tgcagtgctc tgagccctag gattcatctt tcttttcacc gtaggtggcc 6960

tgactggcat tgtattagca aactcatcac tagacatcgt actacacgac acgtactacg 7020

ttgtagccca cttccactat gtcctatcaa taggagctgt atttgccatc ataggaggct 7080

tcattcactg atttccccta ttctcaggct acaccctaga ccaaacctac gccaaaatcc 7140

atttcactat catattcatc ggcgtaaatc taactttctt cccacaacac tttctcggcc 7200

tatccggaat gccccgacgt tactcggact accccgatgc atacaccaca tgaaacatcc 7260

tatcatctgt aggctcattc atttctctaa cagcagtaat attaataatt ttcatgattt 7320

gagaagcctt cgcttcgaag cgaaaagtcc taatagtaga agaaccctcc ataaacctgg 7380

agtgactata tggatgcccc ccaccctacc acacattcga agaacccgta tacataaaat 7440

ctagacaaaa aaggaaggaa tcgaaccccc caaagctggt ttcaagccaa ccccatggcc 7500

tccatgactt tttcaaaaag gtattagaaa aaccatttca taactttgtc aaagttaaat 7560

tataggctaa atcctatata tcttaatggc acatgcagcg caagtaggtc tacaagacgc 7620

tacttcccct atcatagaag agcttatcac ctttcatgat cacgccctca taatcatttt 7680

ccttatctgc ttcctagtcc tgtatgccct tttcctaaca ctcacaacaa aactaactaa 7740

tactaacatc tcagacgctc aggaaataga aaccgtctga actatcctgc ccgccatcat 7800

cctagtcctc atcgccctcc catccctacg catcctttac ataacagacg aggtcaacga 7860

tccctccctt accatcaaat caattggcca ccaatggtac tgaacctacg agtacaccga 7920

ctacggcgga ctaatcttca actcctacat acttccccca ttattcctag aaccaggcga 7980

cctgcgactc cttgacgttg acaatcgagt agtactcccg attgaagccc ccattcgtat 8040

aataattaca tcacaagacg tcttgcactc atgagctgtc cccacattag gcttaaaaac 8100

agatgcaatt cccggacgtc taaaccaaac cactttcacc gctacacgac cgggggtata 8160

ctacggtcaa tgctctgaaa tctgtggagc aaaccacagt ttcatgccca tcgtcctaga 8220

attaattccc ctaaaaatct ttgaaatagg gcccgtattt accctatagc accccctcta 8280

ccccctctag agcccactgt aaagctaact tagcattaac cttttaagtt aaagattaag 8340

agaaccaaca cctctttaca gtgaaatgcc ccaactaaat actaccgtat ggcccaccat 8400

aattaccccc atactcctta cactattcct catcacccaa ctaaaaatat taaacacaaa 8460

ctaccaccta cctccctcac caaagcccat aaaaataaaa aattataaca aaccctgaga 8520

accaaaatga acgaaaatct gttcgcttca ttcattgccc ccacaatcct aggcctaccc 8580

gccgcagtac tgatcattct atttccccct ctattgatcc ccacctccaa atatctcatc 8640

aacaaccgac taatcaccac ccaacaatga ctaatcaaac taacctcaaa acaaatgata 8700

accatacaca acactaaagg acgaacctga tctcttatac tagtatcctt aatcattttt 8760

attgccacaa ctaacctcct cggactcctg cctcactcat ttacaccaac cacccaacta 8820

tctataaacc tagccatggc catcccctta tgagcgggca cagtgattat aggctttcgc 8880

tctaagatta aaaatgccct agcccacttc ttaccacaag gcacacctac accccttatc 8940

cccatactag ttattatcga aaccatcagc ctactcattc aaccaatagc cctggccgta 9000

cgcctaaccg ctaacattac tgcaggccac ctactcatgc acctaattgg aagcgccacc 9060

ctagcaatat caaccattaa ccttccctct acacttatca tcttcacaat tctaattcta 9120

ctgactatcc tagaaatcgc tgtcgcctta atccaagcct acgttttcac acttctagta 9180

agcctctacc tgcacgacaa cacataatga cccaccaatc acatgcctat catatagtaa 9240

aacccagccc atgaccccta acaggggccc tctcagccct cctaatgacc tccggcctag 9300

ccatgtgatt tcacttccac tccataacgc tcctcatact aggcctacta accaacacac 9360

taaccatata ccaatgatgg cgcgatgtaa cacgagaaag cacataccaa ggccaccaca 9420

caccacctgt ccaaaaaggc cttcgatacg ggataatcct atttattacc tcagaagttt 9480

ttttcttcgc aggatttttc tgagcctttt accactccag cctagcccct accccccaat 9540

taggagggca ctggccccca acaggcatca ccccgctaaa tcccctagaa gtcccactcc 9600

taaacacatc cgtattactc gcatcaggag tatcaatcac ctgagctcac catagtctaa 9660

tagaaaacaa ccgaaaccaa ataattcaag cactgcttat tacaatttta ctgggtctct 9720

attttaccct cctacaagcc tcagagtact tcgagtctcc cttcaccatt tccgacggca 9780

tctacggctc aacatttttt gtagccacag gcttccacgg acttcacgtc attattggct 9840

caactttcct cactatctgc ttcatccgcc aactaatatt tcactttaca tccaaacatc 9900

actttggctt cgaagccgcc gcctgatact ggcattttgt agatgtggtt tgactatttc 9960

tgtatgtctc catctattga tgagggtctt actcttttag tataaatagt accgttaact 10020

tccaattaac tagttttgac aacattcaaa aaagagtaat aaacttcgcc ttaattttaa 10080

taatcaacac cctcctagcc ttactactaa taattattac attttgacta ccacaactca 10140

acggctacat agaaaaatcc accccttacg agtgcggctt cgaccctata tcccccgccc 10200

gcgtcccttt ctccataaaa ttcttcttag tagctattac cttcttatta tttgatctag 10260

aaattgccct ccttttaccc ctaccatgag ccctacaaac aactaacctg ccactaatag 10320

ttatgtcatc cctcttatta atcatcatcc tagccctaag tctggcctat gagtgactac 10380

aaaaaggatt agactgaacc gaattggtat atagtttaaa caaaacgaat gatttcgact 10440

cattaaatta tgataatcat atttaccaaa tgcccctcat ttacataaat attatactag 10500

catttaccat ctcacttcta ggaatactag tatatcgctc acacctcata tcctccctac 10560

tatgcctaga aggaataata ctatcgctgt tcattatagc tactctcata accctcaaca 10620

cccactccct cttagccaat attgtgccta ttgccatact agtctttgcc gcctgcgaag 10680

cagcggtggg cctagcccta ctagtctcaa tctccaacac atatggccta gactacgtac 10740

ataacctaaa cctactccaa tgctaaaact aatcgtccca acaattatat tactaccact 10800

gacatgactt tccaaaaaac acataatttg aatcaacaca accacccaca gcctaattat 10860

tagcatcatc cctctactat tttttaacca aatcaacaac aacctattta gctgttcccc 10920

aaccttttcc tccgaccccc taacaacccc cctcctaata ctaactacct gactcctacc 10980

cctcacaatc atggcaagcc aacgccactt atccagtgaa ccactatcac gaaaaaaact 11040

ctacctctct atactaatct ccctacaaat ctccttaatt ataacattca cagccacaga 11100

actaatcata ttttatatct tcttcgaaac cacacttatc cccaccttgg ctatcatcac 11160

ccgatgaggc aaccagccag aacgcctgaa cgcaggcaca tacttcctat tctacaccct 11220

agtaggctcc cttcccctac tcatcgcact aatttacact cacaacaccc taggctcact 11280

aaacattcta ctactcactc tcactgccca agaactatca aactcctgag ccaacaactt 11340

aatatgacta gcttacacaa tagcttttat agtaaagata cctctttacg gactccactt 11400

atgactccct aaagcccatg tcgaagcccc catcgctggg tcaatagtac ttgccgcagt 11460

actcttaaaa ctaggcggct atggtataat acgcctcaca ctcattctca accccctgac 11520

aaaacacata gcctacccct tccttgtact atccctatga ggcataatta taacaagctc 11580

catctgccta cgacaaacag acctaaaatc gctcattgca tactcttcaa tcagccacat 11640

agccctcgta gtaacagcca ttctcatcca aaccccctga agcttcaccg gcgcagtcat 11700

tctcataatc gcccacgggc ttacatcctc attactattc tgcctagcaa actcaaacta 11760

cgaacgcact cacagtcgca tcataatcct ctctcaagga cttcaaactc tactcccact 11820

aatagctttt tgatgacttc tagcaagcct cgctaacctc gccttacccc ccactattaa 11880

cctactggga gaactctctg tgctagtaac cacgttctcc tgatcaaata tcactctcct 11940

acttacagga ctcaacatac tagtcacagc cctatactcc ctctacatat ttaccacaac 12000

acaatggggc tcactcaccc accacattaa caacataaaa ccctcattca cacgagaaaa 12060

caccctcatg ttcatacacc tatcccccat tctcctccta tccctcaacc ccgacatcat 12120

taccgggttt tcctcttgta aatatagttt aaccaaaaca tcagattgtg aatctgacaa 12180

cagaggctta cgacccctta tttaccgaga aagctcacaa gaactgctaa ctcatgcccc 12240

catgtctaac aacatggctt tctcaacttt taaaggataa cagctatcca ttggtcttag 12300

gccccaaaaa ttttggtgca actccaaata aaagtaataa ccatgcacac tactataacc 12360

accctaaccc tgacttccct aattcccccc atccttacca ccctcgttaa ccctaacaaa 12420

aaaaactcat acccccatta tgtaaaatcc attgtcgcat ccacctttat tatcagtctc 12480

ttccccacaa caatattcat gtgcctagac caagaagtta ttatctcgaa ctgacactga 12540

gccacaaccc aaacaaccca gctctcccta agcttcaaac tagactactt ctccataata 12600

ttcatccctg tagcattgtt cgttacatgg tccatcatag aattctcact gtgatatata 12660

aactcagacc caaacattaa tcagttcttc aaatatctac tcatcttcct aattaccata 12720

ctaatcttag ttaccgctaa caacctattc caactgttca tcggctgaga gggcgtagga 12780

attatatcct tcttgctcat cagttgatga tacgcccgag cagatgccaa cacagcagcc 12840

attcaagcaa tcctatacaa ccgtatcggc gatatcggtt tcatcctcgc cttagcatga 12900

tttatcctac actccaactc atgagaccca caacaaatag cccttctaaa cgctaatcca 12960

agcctcaccc cactactagg cctcctccta gcagcagcag gcaaatcagc ccaattaggt 13020

ctccacccct gactcccctc agccatagaa ggccccaccc cagtctcagc cctactccac 13080

tcaagcacta tagttgtagc aggaatcttc ttactcatcc gcttccaccc cctagcagaa 13140

aatagcccac taatccaaac tctaacacta tgcttaggcg ctatcaccac tctgttcgca 13200

gcagtctgcg cccttacaca aaatgacatc aaaaaaatcg tagccttctc cacttcaagt 13260

caactaggac tcataatagt tacaatcggc atcaaccaac cacacctagc attcctgcac 13320

atctgtaccc acgccttctt caaagccata ctatttatgt gctccgggtc catcatccac 13380

aaccttaaca atgaacaaga tattcgaaaa ataggaggac tactcaaaac catacctctc 13440

acttcaacct ccctcaccat tggcagccta gcattagcag gaataccttt cctcacaggt 13500

ttctactcca aagaccacat catcgaaacc gcaaacatat catacacaaa cgcctgagcc 13560

ctatctatta ctctcatcgc tacctccctg acaagcgcct atagcactcg aataattctt 13620

ctcaccctaa caggtcaacc tcgcttcccc acccttacta acattaacga aaataacccc 13680

accctactaa accccattaa acgcctggca gccggaagcc tattcgcagg atttctcatt 13740

actaacaaca tttcccccgc atcccccttc caaacaacaa tccccctcta cctaaaactc 13800

acagccctcg ctgtcacttt cctaggactt ctaacagccc tagacctcaa ctacctaacc 13860

aacaaactta aaataaaatc cccactatgc acattttatt tctccaacat actcggattc 13920

taccctagca tcacacaccg cacaatcccc tatctaggcc ttcttacgag ccaaaacctg 13980

cccctactcc tcctagacct aacctgacta gaaaagctat tacctaaaac aatttcacag 14040

caccaaatct ccacctccat catcacctca acccaaaaag gcataattaa actttacttc 14100

ctctctttct tcttcccact catcctaacc ctactcctaa tcacataacc tattcccccg 14160

agcaatctca attacaatat atacaccaac aaacaatgtt caaccagtaa ctactactaa 14220

tcaacgccca taatcataca aagcccccgc accaatagga tcctcccgaa tcaaccctga 14280

cccctctcct tcataaatta ttcagcttcc tacactatta aagtttacca caaccaccac 14340

cccatcatac tctttcaccc acagcaccaa tcctacctcc atcgctaacc ccactaaaac 14400

actcaccaag acctcaaccc ctgaccccca tgcctcagga tactcctcaa tagccatcgc 14460

tgtagtatat ccaaagacaa ccatcattcc ccctaaataa attaaaaaaa ctattaaacc 14520

catataacct cccccaaaat tcagaataat aacacacccg accacaccgc taacaatcaa 14580

tactaaaccc ccataaatag gagaaggctt agaagaaaac cccacaaacc ccattactaa 14640

acccacactc aacagaaaca aagcatacat cattattctc gcacggacta caaccacgac 14700

caatgatatg aaaaaccatc gttgtatttc aactacaaga acaccaatga ccccaatacg 14760

caaaactaac cccctaataa aattaattaa ccactcattc atcgacctcc ccaccccatc 14820

caacatctcc gcatgatgaa acttcggctc actccttggc gcctgcctga tcctccaaat 14880

caccacagga ctattcctag ccatgcacta ctcaccagac gcctcaaccg ccttttcatc 14940

aatcgcccac atcactcgag acgtaaatta tggctgaatc atccgctacc ttcacgccaa 15000

tggcgcctca atattcttta tctgcctctt cctacacatc gggcgaggcc tatattacgg 15060

atcatttctc tactcagaaa cctgaaacat cggcattatc ctcctgcttg caactatagc 15120

aacagccttc ataggctatg tcctcccgtg aggccaaata tcattctgag gggccacagt 15180

aattacaaac ttactatccg ccatcccata cattgggaca gacctagttc aatgaatctg 15240

aggaggctac tcagtagaca gtcccaccct cacacgattc tttacctttc acttcatctt 15300

gcccttcatt attgcagccc tagcaacact ccacctccta ttcttgcacg aaacgggatc 15360

aaacaacccc ctaggaatca cctcccattc cgataaaatc accttccacc cttactacac 15420

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ctcaccagac ctcctaggcg acccagacaa ttatacccta gccaacccct taaacacccc 15540

tccccacatc aagcccgaat gatatttcct attcgcctac acaattctcc gatccgtccc 15600

taacaaacta ggaggcgtcc ttgccctatt actatccatc ctcatcctag caataatccc 15660

catcctccat atatccaaac aacaaagcat aatatttcgc ccactaagcc aatcacttta 15720

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aataccaact atctccctaa ttgaaaacaa aatactcaaa tgggcctgtc cttgtagtat 15900

aaactaatac accagtcttg taaaccggag atgaaaacct ttttccaagg acaaatcaga 15960

gaaaaagtct ttaactccac cattagcacc caaagctaag attctaattt aaactattct 16020

ctgttctttc atggggaagc agatttgggt accacccaag tattgactca cccatcaaca 16080

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acttgaccac ctgtagtaca taaaaaccca atccacatca aaaccccctc cccatgctta 16200

caagcaagta cagcaatcaa ccctcaacta tcacacatca actgcaactc caaagccacc 16260

cctcacccac taggatacca acaaacctac ccacccttaa cagtacatag tacataaagc 16320

catttaccgt acatagcaca ttacagtcaa atcccttctc gtccccatgg atgacccccc 16380

tcagataggg gtcccttgac caccatcctc cgtgaaatca atatcccgca caagagtgct 16440

actctcctcg ctccgggccc ataacacttg ggggtagcta aagtgaactg tatccgacat 16500

ctggttccta cttcagggtc ataaagccta aatagcccac acgttcccct taaataagac 16560

atcacgatg 16569

Claims (10)

1.用于检测人类线粒体DNA删除突变及耗竭的引物对，其特征在于，所述引物对的正向引物位于线粒体重链复制原点的正负300bp范围内，反向引物位于线粒体重链复制原点区段内；

进一步地，所述引物对的核酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

2.用于检测人类线粒体DNA删除突变及耗竭的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物对。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、用于大片段扩增的DNA聚合酶、缓冲液、双蒸水中的任一种或几种。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述用于大片段扩增的DNA聚合酶为PrimeSTAR GXL聚合酶或PrimeSTAR Max DNA聚合酶。

5.人类线粒体DNA删除突变及耗竭的检测方法，其特征在于，待检测线粒体基因组作为模板，以权利要求1所述的引物对进行PCR扩增，得到的产物进行电泳检测，判断所述待检测线粒体基因组的类型。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述待检测线粒体基因组来自待检测物的组织或细胞。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述待检测线粒体基因组在PCR扩增体系中的浓度不低于0.5ng/μl。

8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，PCR扩增体系为20-75μl。

9.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，PCR扩增的程序为：95-98℃，10-15s；60℃，15s；68℃，5-6min；上述程序共25-35个循环。

10.根据权利要求5-9任一项所述的检测方法，其特征在于，检测时的样本还包括正常线粒体基因组，通过待检测线粒体基因组与正常线粒体基因组的扩增结果比对，判断所述待检测线粒体基因组的类型；

进一步地，所述电泳检测为：采用琼脂糖凝胶电泳，电泳完成后，抓取条带信息；

进一步地，所述抓取条带信息采用凝胶成像仪和Gel-Pro Analyzer软件完成。