CN116083578A - 预测宫颈癌新辅助化疗效果或复发高危分类的系统及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种预测宫颈癌新辅助化疗效果或复发高危分类的系统及其方法，所述系统包括血浆cfDNA的浓度、纯度检测模块、测序模块、过滤模块、分析模块和分类模块；本发明采用血浆cfDNA特征作为预测宫颈癌新辅助化疗效果、进行复发高危分类的指标，具体包括motif CCCA频率值，总结得出一种化疗敏感性预测系统，方便临床评价待检宫颈癌患者对铂类新辅助化疗是否敏感的同时进行复发高危分类，对于指导临床个体化用药，改善患者预后具有重要意义。

Description

预测宫颈癌新辅助化疗效果或复发高危分类的系统及其方法
技术领域
本发明涉及医药技术和生物检测领域，具体涉及一种预测宫颈癌新辅助化疗效果或复发高危分类的系统及其方法。
背景技术
宫颈癌是女性生殖系统中常见的恶性肿瘤，目前最佳的防控策略是早期筛查和疫苗接种。尽管如此，由于地区发展、医疗资源匹配的不平衡，目前宫颈癌在发展中国家的发病率仍然较高，落后地区的妇女就诊时已处于晚期。宫颈癌的治疗以手术和同步放化疗为主，由于放疗会损伤盆腔器官造成远期并发症，诸如损伤卵巢功能导致出现更年期症状影响患者生活质量等，因此近年来关于宫颈癌治疗的研究热点多集中在新辅助化疗、术后化疗等方面。新辅助化疗又称术前化疗，其优势一方面在于可以使局部肿瘤缩小或达到降低肿瘤分期的目的，以利于手术的进行，另一方面可以消除难以检测的微小转移灶，降低术后复发风险。
大量临床数据表明无论是新辅助化疗，还是术后化疗，仅部分患者对化疗药物有反应，然而目前仍然缺乏有效预测宫颈癌化疗效果的生物标志物，现有的影像学及肿瘤标志物作为化疗效果的评估方法也存在一些不可忽视的缺点，如影像学的延迟效应、肿瘤标志物的特异性低、部分患者无明显变化等。研究表明紫杉醇周疗相较于传统的三周疗法能够缩短肿瘤再生长的时间间隔，改善患者的预后，但由于患者间化疗效果的异质性，使得这一结果仍然存在争议性。因此急需开发新的标志物用于预测或者早期评估患者化疗敏感性，进而推动治疗方案的改进，这对患者实施个体化的治疗，改善患者的预后、同时节省医疗资源具有重要意义。
液体活检领域的发展为持续监测肿瘤的特征性改变带来了希望，血浆游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)是血浆中的游离在细胞外的DNA，在健康状态下，血浆cfDNA主要来源于造血系统正常细胞的凋亡。在特定的病理或疾病发展过程中，cfDNA的组织来源构成会发生改变，引起体液中cfDNA片段分布、表观遗传、基因组覆盖等特征发生变化，肿瘤患者的血浆cfDNA包括携带来自肿瘤内部的变化信息，从而能一定程度上反应机体疾病发生发展过程，评估体内肿瘤负荷变化。由于cfDNA在体内的代谢周期很短的特性，其携带的信息能够及时的反映出患者的整体疾病状态。
ctDNA是由肿瘤细胞凋亡坏死或正常分泌到血液中的DNA片段，其携带了肿瘤相关的基因变异信息，目前ctDNA检测主要应用于靶向药物基因检测以及耐药监测中，但近些年的研究结果提示以ctDNA为研究核心的液体活检高通量测序技术，很难突破复杂的背景噪音以及ctDNA来源问题的困境，在实际应用中需要更有效的技术方法，在现有的临床检验技术平台存在短板的情况下，挖掘更有效的指导肿瘤筛查、疗效评估及预后监测的标志物体现出了重要意义。而在上述研究中存在的不可避免的来源问题外，在临床实际应用中也面临着含量稀少、NGS灵敏度不够、成本价格昂贵、临床指导意义不强、时间延迟效应等问题。
发明内容
本发明的目的是针对现有的宫颈癌新辅助化疗效果预测标志物的缺乏及现有技术中的不足，提供了一种预测宫颈癌新辅助化疗效果或复发高危分类的系统及其方法。
为实现上述目的，本发明所设计以下技术方案：
本发明提供了一种预测宫颈癌新辅助化疗效果或复发高危分类的系统，所述系统包括血浆cfDNA的浓度、纯度检测模块、测序模块、过滤模块、分析模块和分类模块；其中，
(1)血浆cfDNA的浓度、纯度检测模块：用于分析血浆的cfDNA浓度及纯度，提取血浆的cfDNA后获得cfDNA浓度数据，通过Fragment Analyzer检测血浆中cfDNA的纯度；
(2)测序模块：用于检查者外周血血浆游离DNA进行高通量测序，获得各检查者外显子组区域的位置信息；
(3)过滤模块：用于过滤cfDNA，保留双端测序数据中两端皆比对上参考基因组且位于相同染色体上的序列；保留比对质量值大于等于30；保留双端测序数据中测序一端比对上正链且另一端比对上负链的配对序列；去除PCR重复或光学重复；去除次要比对；去除超过600bp的cfDNA片段；去除与参考基因组差异超过5个碱基的cfDNA；去除包含插入和缺失的cfDNA；
(4)分析模块：用于获取cfDNA特征结果，利用人基因组参考序列GRCh38.p14进行序列比对(mapping)，获取所有cfDNA的5’末端4个碱基序列(即为血浆中cfDNA的基序(motif))，统计cfDNA的5’末端“CCCA”基序(motif CCCA)频率值(ATCG几个碱基进行排列组合能够得到256种cfDNA的5’末端基序(motif)，任意一种cfDNA的5’末端基序(motif)的频率值为motifX(任意一种motif)/sum(所有motif频率)；
(5)分类模块：用于预测患者新辅助化疗效果或者复发高危分类，分析基线motifCCCA频率值，预测患者新辅助化疗效果；或者，分析基线motif CCCA频率值，进行复发高危分类。
进一步地，所述血浆cfDNA的浓度、纯度检测模块中，血浆中cfDNA质量标准为：
血浆中cfDNA在166bp处呈现明显起峰，显示无明显核基因组污染。
再进一步地，所述分析模块中，cfDNA的5’末端“CCCA”基序(motif CCCA)频率值＝cfDNA的5’末端“CCCA”基序的频率/所有cfDNA的5’末端基序的频率。
再进一步地，所述分类模块中，
a.基于基线motif CCCA频率值预测患者新辅助化疗效果：
若基线motif CCCA频率值范围大于0.030时，则认为患者化疗效果差，反之，则认为患者化疗效果好。
d.基于基线motif CCCA频率值进行复发高危分类：
若基线motif CCCA频率值小于0.028时，则认为患者属于复发高危人群，反之，则认为患者不属于复发高危人群。
作为优选方案，所述分类模块中，
a.基于基线motif CCCA频率值预测患者新辅助化疗效果：
若基线motif CCCA频率值范围处于median在0.02769-0.02933范围内时，则认为患者化疗效果好，
或者，若基线motif CCCA频率值范围处于median在0.03016-0.03155范围内时，则认为患者化疗效果差；
d.基于基线motif CCCA频率值进行复发高危分类：
若基线motif CCCA频率值median在0.02769-0.02782范围内时，则认为患者属于复发高危人群，
或者，若基线motif CCCA频率值median在0.02933-0.03155范围内时，反之则不属于。
本发明还提供了一种利用上述的预测宫颈癌新辅助化疗效果或复发高危分类的系统进行分析检测的方法，包括以下步骤：
1)样本收集和储备：收集待检测者化疗前后的全血样本，进行血浆分离，然后提取血浆游离DNA(即为血浆cfDNA)(血浆游离DNA提取试剂盒The QIAamp ccfDNA/RNAKit，货号55184)；
2)样品质检与建库测序：
(1)样本质检：通过Fragment Analyzer检测血浆cfDNA的纯度和质量，(2)建库：采用标准的Illumina建库流程进行文库构建(利用Nanodrop/凝胶电泳技术进行样本检测，当样本合格后，采用标准的Illumina建库流程进行文库构建。构建好的文库采用ABI Q3 qPCR仪进行文库的质检，当文库检测为单峰，且浓度高于3nM，体积大于15ul则判定为合格)
(3)测序：使用Agilent-V6液相芯片捕获系统对血浆游离DNA外显子区域进行富集，利用Illumina NovaSeq6000测序平台进行血浆游离DNA全外显子组测序；
3)血浆游离DNA生物学特性分析：
(1)利用人基因组参考序列GRCh38.p14，利用BWA软件对测序数据进行序列mapping；采用samtools对血浆游离DNA全外显子组测序分析；
(2)cfDNA特征值计算：获取所有血浆cfDNA的5’末端4个碱基序列(即为血浆游离DNA的基序(motif))，统计cfDNA的5’末端“CCCA”基序(motif CCCA)频率值；
4)新辅助化疗效果预测或复发高危分类中的应用分析：
a.基于基线motif CCCA频率值预测患者新辅助化疗效果：
若基线motif CCCA频率值范围大于0.030时，则认为患者化疗效果差，反之，则认为患者化疗效果好。
d.基于基线motif CCCA频率值进行复发高危分类：
若基线motif CCCA频率值小于0.028时，则认为患者属于复发高危人群，反之，则认为患者不属于复发高危人群。
作为优选方案，所述分类模块中，
a.基于基线motif CCCA频率值预测患者新辅助化疗效果：
若基线motif CCCA频率值范围处于median在0.02769-0.02933范围内时，则认为患者化疗效果好，
或者，若基线motif CCCA频率值范围处于median在0.03016-0.03155范围内时，则认为患者化疗效果差；
d.基于基线motif CCCA频率值进行复发高危分类：
若基线motif CCCA频率值median在0.02769-0.02782范围内时，则认为患者属于复发高危人群，
或者，若基线motif CCCA频率值median在0.02933-0.03155范围内时，反之则不属于。
进一步地，所述步骤1)中，血浆分离步骤如下：4℃低温离心机内2000g离心10分钟，分离血浆和血细胞，然后将上层血浆进行二次离心处理，4℃低温离心机内3000g离心15分钟。
再进一步地，所述步骤2)的第(2)小步中，Fragment Analyzer检测血浆cfDNA在166bp呈现明显起峰，无明显核基因组污染认为样品质量符合要求；血浆cfDNA浓度≥1ng/ul，总量≥20ng满足全外显子组建库要求。
再进一步地，所述步骤2)的第(2)小步中，构建好的文库采用ABI Q3 qPCR仪进行文库的质检，当文库检测为单峰，且浓度高于3nM，体积大于15ul则判定为合格。
再进一步地，所述步骤2)的第(3)小步中，测序模式为：150PE，每个样品产生200Mreads数据，在总数据量足够的情况下，每个样本数据量不低于目标数据量的90％，平均Q30≥85％。
本发明还提供了一种上述的系统或上述的方法在预测宫颈癌新辅助化疗效果或复发高危分类的应用。
本发明的生物信息分析方法和系统可对多个样本进行批量分析。
本发明的原理：
血浆cfDNA片段组学作为新型的肿瘤标志物，在肿瘤标志物领域展现出了良好的应用前景。前期研究已发现，肿瘤患者cfDNA的motif CCCA频率明显低于健康对照，这与体内特异性的核酸酶的表达具有相关性，而DNASE1L3核酸酶与体内细胞凋亡反应密切相关，参与肿瘤发生发展机制的调控，因此，血浆cfDNA片段特征在评估患者体内肿瘤负荷，评价患者化疗药物反应性及预后方面具有潜在的应用价值。
本发明的有益效果：
1.本发明首次发现宫颈癌患者基线血浆cfDNA的motif特征与化疗敏感性密切相关。因此，本发明采用血浆cfDNA特征作为预测宫颈癌化疗敏感性的指标，总结得出一种化疗敏感性预测系统，方便临床评价待检宫颈癌患者对铂类新辅助化疗是否敏感的同时进行复发高危分类，对于指导临床个体化用药，评价患者预后具有重要意义。
2.本发明采用无创手段实现宫颈癌新辅助化疗反应预测及复发高危分类。
附图说明
图1为宫颈癌患者基线血浆cfDNA的motif CCCA频率在新辅助化疗不同效果人群中的差异分布图。
图2为宫颈癌患者基线血浆cfDNA的motif CCCA频率在复发高危及非复发高危人群中的差异分布图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
实施例1
一种预测宫颈癌新辅助化疗效果或复发高危分类的系统，它包括血浆cfDNA的浓度、纯度检测模块、测序模块、过滤模块、分析模块和分类模块；其中，
(1)血浆cfDNA的浓度、纯度检测模块：用于分析血浆的cfDNA浓度及纯度，提取血浆的cfDNA后获得cfDNA浓度数据，通过Fragment Analyzer检测血浆中cfDNA的纯度；
(2)测序模块：用于检查者外周血血浆游离DNA进行高通量测序，获得各检查者外显子组区域的位置信息；
(3)过滤模块：用于过滤cfDNA，保留双端测序数据中两端皆比对上参考基因组且位于相同染色体上的序列；保留比对质量值大于等于30；保留双端测序数据中测序一端比对上正链且另一端比对上负链的配对序列；去除PCR重复或光学重复；去除次要比对；去除超过600bp的cfDNA 片段；去除与参考基因组差异超过5个碱基的cfDNA；去除包含插入和缺失的cfDNA；
(4)分析模块：用于获取cfDNA特征结果，利用人基因组参考序列GRCh38.p14进行序列比对(mapping)，获取所有cfDNA的5’末端4个碱基序列(即为血浆中cfDNA的基序(motif))，统计cfDNA的5’末端“CCCA”基序(motif CCCA)频率值(ATCG几个碱基进行排列组合能够得到256种cfDNA的5’末端基序(motif)，任意一种cfDNA的5’末端基序(motif)的频率值为motifX(任意一种motif)/sum(所有motif频率)；
(5)分类模块：用于预测患者新辅助化疗效果或者复发高危分类，分析基线motifCCCA频率值，预测患者新辅助化疗效果；或者，分析基线motif CCCA频率值，进行复发高危分类。
利用上述的预测宫颈癌化疗效果或复发高危分类检测系统进行分析检测的方法，具体包括以下步骤：
1)样本收集和储备：收集待检测者化疗前后的全血样本，进行血浆分离，然后提取血浆游离DNA(即为血浆cfDNA)(血浆游离DNA提取试剂盒The QIAamp ccfDNA/RNAKit，货号55184)；
2)样品质检与建库测序：
(1)样本质检：通过Fragment Analyzer检测血浆cfDNA的纯度，FragmentAnalyzer检测血浆cfDNA在166bp呈现明显起峰，无明显核基因组污染认为样品质量符合要求；血浆cfDNA浓度≥1ng/ul，总量≥20ng满足全外显子组建库要求；
(2)建库：采用标准的Illumina建库流程进行文库构建(利用Nanodrop/凝胶电泳技术进行样本检测，当样本合格后，采用标准的Illumina建库流程进行文库构建。构建好的文库采用ABI Q3qPCR仪进行文库的质检，当文库检测为单峰，且浓度高于3nM，体积大于15ul则判定为合格)
(3)测序：使用Agilent-V6液相芯片捕获系统对血浆游离DNA外显子区域进行富集，利用Illumina NovaSeq6000测序平台进行血浆游离DNA全外显子组测序；
3)血浆游离DNA生物学特性分析：
(1)利用人基因组参考序列GRCh38.p14，利用BWA软件对测序数据进行序列mapping；采用samtools对血浆游离DNA全外显子组测序分析；
(2)cfDNA特征值计算：获取所有血浆cfDNA的5’末端4个碱基序列(即为血浆游离DNA的基序(motif))，统计cfDNA的5’末端“CCCA”基序(motif CCCA)频率值；
4)新辅助化疗效果预测或复发高危分类中的应用分析：
a.基于基线motif CCCA频率值预测患者新辅助化疗效果：
若基线motif CCCA频率值范围大于0.030时，则认为患者化疗效果差，反之，则认为患者化疗效果好。
d基于基线motif CCCA频率值进行复发高危分类：
若基线motif CCCA频率值小于0.028时，则认为患者属于复发高危人群，反之，则认为患者不属于复发高危人群。
实施例2：基于高通量测序探究宫颈癌患者外周血血浆游离DNA片段特征与化疗效果的相关性分析
基于9例进行新辅助化疗的宫颈癌患者治疗前后的外周血血浆，采用本发明的系统和方法进行患者血浆游离DNA样品全外显子组测序和生物信息学分析，统计cfDNA特征值。分析基线cfDNA片段特征值治疗反应之间的关系，具体包括motif CCCA频率。发现了宫颈癌新辅助化疗不同效果的人群基线motif CCCA频率上存在显著差异(P＝0.0159)，且基线motif CCCA频率值在复发及无复发人群中呈现差异(P＝0.0238)，提示该系统和方法可以用于评估患者化疗效果。具体步骤如下：
步骤1：样本收集和储备。使用EDTA的抗凝管采集宫颈癌患者化疗前后的全血样本，进行血浆分离和游离DNA提取(血浆分离：4℃低温离心机内2000g离心10分钟，分离血浆和血细胞，然后将上层血浆进行二次离心处理，4℃低温离心机内3000g离心15分钟；血浆游离DNA提取：血浆游离核酸提取试剂盒The QIAamp ccfDNA/RNA Kit，货号55184)。
步骤2：样品质检。通过Fragment Analyzer检测血浆cfDNA的纯度，FragmentAnalyzer检测cfDNA样品在166bp呈现明显起峰，无明显核基因组污染认为样品质量符合要求；血浆cfDNA样品浓度≥1ng/ul，总量≥20ng满足全外显子组建库要求。
步骤3：建库。利用Nanodrop/凝胶电泳技术进行样本检测，当样本合格后，采用标准的Illumina建库流程进行文库构建。构建好的文库采用ABI Q3 qPCR仪进行文库的质检，当文库检测为单峰，且浓度高于3nM，体积大于15ul则判定为合格；
步骤4：测序。使用Agilent-V6液相芯片捕获系统对DNA外显子区域进行富集，利用Illumina NovaSeq6000测序平台进行血浆游离DNA样品全外显子组测序，测序模式为：150PE，每个样品产生200M reads数据，在总数据量足够的情况下，每个样本数据量不低于目标数据量的90％，平均Q30≥85％。
步骤5：二代测序数据的生物信息学分析和特征筛选。
(1)过滤cfDNA。保留双端测序数据中两端皆比对上参考基因组且位于相同染色体上的序列；保留比对质量值大于等于30；保留双端测序数据中测序一端比对上正链且另一端比对上负链的配对序列；去除PCR重复或光学重复；去除次要比对；去除超过600bp的cfDNA片段；去除与参考基因组差异超过5个碱基的cfDNA；去除包含插入和缺失的cfDNA；
(2)cfDNA基序特征值分析：用于获取cfDNA基序特征结果，利用人基因组参考序列GRCh38.p14进行序列比对(mapping)，利用BWA软件对测序数据进行序列mapping，采用samtools对测序数据进行分析。获取所有cfDNA的5’末端4个碱基序列(即为血浆中cfDNA的基序(motif))，统计cfDNA的5’末端“CCCA”基序(motif CCCA)频率值(ATCG几个碱基进行排列组合能够得到256种cfDNA的5’末端基序(motif)，任意一种cfDNA的5’末端基序(motif)的频率值为motifX(任意一种motif)/sum(所有motif频率)；
步骤6：cfDNA特征在预测宫颈癌化疗效果或复发高危分类中的应用分析。
(1)根据宫颈癌新辅助化疗效果评估标准，将化疗后肿瘤消失或最大直径缩小超过1/2，视为化疗效果好(包括完全反应CR和部分反应PR)，肿瘤最大直径缩小少于1/2，视为化疗效果差(包括疾病稳定SD和疾病进展PD)。不同化疗效果患者在基线cfDNA特征上存在差异(P＝0.0159)，化疗效果好的患者motif CCCA频率median＝0.02780，range：0.02769-0.02933(mean，0.02816；95％ CI，0.02691-0.02940)，化疗效果差的患者motif CCCA频率median＝0.03094，range：0.03016-0.03155(mean，0.03098；95％ CI，0.03027-0.03169)。
如图1所示：宫颈癌基线血浆cfDNA的motif CCCA频率分布在新辅助化疗效果好的患者显著低于新辅助化疗效果差。其中5例新化疗后肿瘤最大直径缩小不超过1/2的宫颈癌患者基线motif CCCA频率值分别为0.030160962、0.030757559、0.031488675、0.031547075、0.030936812。均大于0.03；剩余新辅助化疗后肿瘤最大直径缩小超过1/2的被认定为化疗效果好的宫颈癌患者中，基线motif CCCA频率值分别为0.027694668、0.027790326、0.027818421、0.029328784，均不处于大于0.03范围内，基线motif CCCA频率值可以用于区分患者新辅助化疗敏感性；
(2)随访患者的临床结局和病理特点识别复发高危患者，随访时间为3年，将研究队列中出现复发、转移、以及病理为小细胞癌的判定为复发高危患者，与尚未出现不良结局的非复发高危进行比较，分析复发高危患者与非复发高危患者在基线motif CCCA频率值分布上的差异，发现3例复发高危患者与其余的非复发高危患者在基线motif CCCA频率值分布上存在显著差异(P＝0.0238)，复发患者基线motif CCCA频率值分布median＝0.02779，range：0.02769-0.02782(mean，0.02777；95％ CI，0.02761-0.02793)，无复发患者基线motif CCCA频率值分布median＝0.03085，range：0.02933-0.03155(mean，0.03070；95％CI，0.02982-0.03159)。
如图2所示：宫颈癌复发高危患者基线血浆cfDNA的motif CCCA频率显著低于非复发高危患者。其中3例复发高危患者基线motif CCCA频率为0.027694668、0.027790326、0.027818421，均小于0.028，6例非复发高危患者0.029328784、0.030160962、0.030757559、0.030936812、0.031488675、0.031547075，均不处于小于0.028范围内，基线motif CCCA频率可以对宫颈癌患者进行复发高危分类。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种预测宫颈癌新辅助化疗效果或复发高危分类的系统，其特征在于：所述系统包括血浆cfDNA的浓度、纯度检测模块、测序模块、过滤模块、分析模块和分类模块；其中，
(1)血浆cfDNA的浓度、纯度检测模块：用于分析血浆的cfDNA浓度及纯度，提取血浆的cfDNA后获得cfDNA浓度数据，通过Fragment Analyzer检测血浆中cfDNA的纯度；
(2)测序模块：用于检查者外周血血浆游离DNA进行高通量测序，获得各检查者外显子组区域的位置信息；
(3)过滤模块：用于过滤cfDNA，保留双端测序数据中两端皆比对上参考基因组且位于相同染色体上的序列；保留比对质量值大于等于30；保留双端测序数据中测序一端比对上正链且另一端比对上负链的配对序列；去除PCR重复或光学重复；去除次要比对；去除超过600bp的cfDNA片段；去除与参考基因组差异超过5个碱基的cfDNA；去除包含插入和缺失的cfDNA；
(4)分析模块：用于获取cfDNA特征结果，利用人基因组参考序列GRCh38.p14进行序列比对，获取所有cfDNA的5’末端4个碱基序列，统计cfDNA的5’末端“CCCA”基序频率值，即为motif CCCA频率值；
(5)分类模块：用于预测患者新辅助化疗效果或者复发高危分类，分析基线motif CCCA频率值，预测患者新辅助化疗效果；或者，分析基线motif CCCA频率值，进行复发高危分类。
2.根据权利要求1所述预测宫颈癌新辅助化疗效果或复发高危分类的系统，其特征在于：所述血浆cfDNA的浓度、纯度检测模块中，血浆中cfDNA质量标准为：
血浆中cfDNA在166bp处呈现明显起峰，显示无明显核基因组污染。
3.根据权利要求1所述预测宫颈癌新辅助化疗效果或复发高危分类的系统，其特征在于：所述分析模块中，cfDNA的5’末端“CCCA”基序＝cfDNA的5’末端“CCCA”基序的频率/所有cfDNA的5’末端基序的频率。
4.根据权利要求1所述预测宫颈癌新辅助化疗效果或复发高危分类的系统，其特征在于：所述分类模块中，
a.基于基线motif CCCA频率值预测患者新辅助化疗效果：
若基线motif CCCA频率值范围大于0.030时，则认为患者化疗效果差，反之，则认为患者化疗效果好；
d.基于基线motif CCCA频率值进行复发高危分类：
若基线motif CCCA频率值小于0.028时，则认为患者属于复发高危人群，反之，则认为患者不属于复发高危人群。
5.利用权利要求1所述的预测宫颈癌新辅助化疗效果或复发高危分类的系统进行分析检测的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)样本收集和储备：收集待检测者化疗前后的全血样本，进行血浆分离，然后提取血浆游离DNA，即为血浆cfDNA；
2)样品质检与建库测序：
(1)样本质检：通过Fragment Analyzer检测血浆cfDNA的纯度和质量；
(2)建库：采用标准的Illumina建库流程进行文库构建；
(3)测序：使用Agilent-V6液相芯片捕获系统对血浆游离DNA外显子区域进行富集，利用Illumina NovaSeq6000测序平台进行血浆游离DNA全外显子组测序；
3)血浆游离DNA生物学特性分析：
(1)利用人基因组参考序列GRCh38.p14，利用BWA软件对测序数据进行序列mapping；采用samtools对血浆游离DNA全外显子组测序分析；
(2)cfDNA特征值计算：获取所有血浆cfDNA的5’末端4个碱基序列，统计cfDNA的5’末端“CCCA”基序频率值，即为motif CCCA频率值；
4)新辅助化疗效果预测或复发高危分类中的应用分析：
a.基于基线motif CCCA频率值预测患者新辅助化疗效果：
若基线motif CCCA频率值范围大于0.030时，则认为患者化疗效果差，反之，则认为患者化疗效果好；
b.基于基线motif CCCA频率值进行复发高危分类：
若基线motif CCCA频率值小于0.028时，则认为患者属于复发高危人群，反之，则认为患者不属于复发高危人群。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，血浆分离步骤如下：4℃低温离心机内2000g离心10分钟，分离血浆和血细胞，然后将上层血浆进行二次离心处理，4℃低温离心机内3000g离心15分钟。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤2)的第(1)小步中，FragmentAnalyzer检测血浆cfDNA在166bp呈现明显起峰，无明显核基因组污染认为样品质量符合要求；血浆cfDNA浓度≥1ng/ul，总量≥20ng满足全外显子组建库要求。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤2)的第(2)小步中，构建好的文库采用ABI Q3 qPCR仪进行文库的质检，当文库检测为单峰，且浓度高于3nM，体积大于15ul则判定为合格。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤2)的第(3)小步中，测序模式为：150PE，每个样品产生200M reads数据，在总数据量足够的情况下，每个样本数据量不低于目标数据量的90％，平均Q30≥85％。
10.一种权利要求1所述的系统或权利要求5所述的方法在预测宫颈癌新辅助化疗效果或复发高危分类的应用。
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