LU503352B1 - Ein Verfahren zur Identifizierung von antigenen Epitopen des óC-Proteins des neuartigen Wasservogel-Reovirus - Google Patents

Ein Verfahren zur Identifizierung von antigenen Epitopen des óC-Proteins des neuartigen Wasservogel-Reovirus Download PDF

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Jionggang Hua
Liu Chen
Tao Yun
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Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das technische Gebiet der Identifizierung von Antigenexpressionen bei Wasservögeln, insbesondere auf ein Verfahren zur Identifizierung von antigenen Epitopen des σC-Proteins des neuartigen Wasservogel-Reovirus, mit dem vorteilhaften Effekt, dass unter Verwendung indirekter Immunfluoreszenzergebnisse alle vier Stämme von MAbs positiv für das neuartige Enten-Reovirus (NDRV) und negativ für das klassische Enten-Reovirus (CDRV) und das aviäre Enten-Reovirus (ARV) waren, die antigenen Epitope, die von den vier Stämmen von MAbs erkannt wurden, wurden mit Hilfe von synthetischen überlappenden Peptidbibliotheken und einer Reihe von abgeschnittenen Peptiden identifiziert, und die Ergebnisse zeigten, dass das zentrale antigene Epitop, das von den drei monoklonalen Antikörpern A5-A1, A5-B6 und B9-6 erkannt wurde, 177PILSGPADA185 war, und das antigene Epitop, das von dem monoklonalen Antikörper A9-D4 erkannt wurde, befand sich wahrscheinlich in einer räumlichen Konformation, und die Konservativitätsanalyse des antigenen Epitops zeigte, dass die antigenen Epitope in NDRV-Isolaten aus verschiedenen geografischen Regionen und unterschiedlichen Wirtsquellen in hohem Maße konserviert waren, was grundlegende Informationen für weitere Studien zur Struktur des SigC-Proteins und die Entwicklung klinischer Tests für NDRV liefert.

Description

Ein Verfahren zur Identifizierung von antigenen Epitopen des cC-Proteins des neuartigehr/>03352
Wasservogel-Reovirus
Technischer Bereich
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das technische Gebiet der Identifizierung der
Antigenexpression bei Wasservögeln, insbesondere auf ein Verfahren zur Identifizierung von antigenen Epitopen des 6C-Proteins des neuartigen Wasservogel-Reovirus.
Technologie im Hintergrund
Das Enten-Reovirus (Duck reovirus, DRV) wird in zwei Genotypen unterteilt, Typ l und Typ
II. Beim Genotyp I handelt es sich um das klassische Enten-Reovirus (Classical DRV, CDRV), das vor allem Enten, Halbenten und Gänse infiziert und eine nekrotisierende Hepatitis (allgemein bekannt als , WeiBfleckenkrankheit“ oder ,,Blumenleberkrankheit“ bei Enten) verursacht, die
Krankheit wurde in den 1990er Jahren nach China eingeschleppt und breitete sich anschlieBend epidemisch aus; beim Genotyp II handelt es sich um ein neuartiges Enten-Reovirus (Novel DRV,
NDRYV), das bei einer Vielzahl von Wasservôgeln Krankheiten verursacht, die durch schwere
Nekrosen und Blutungen in Leber und Milz gekennzeichnet sind (allgemein als ,hämorrhagische nekrotisierende Hepatitis“ bekannt), die Krankheit wurde erstmals zu Beginn des 21. Jahrhunderts in China festgestellt, und der Erreger wurde isoliert und identifiziert. Derzeit ist der Genotyp II (NDRV) der vorherrschende Genotyp in China.
Das NDRV-Genom besteht aus 10 Segmenten doppelstrangiger RNA, und das Viruspartikel besteht aus einer ikosaedrisch symmetrischen Doppelhülle mit einem Durchmesser von 70 nm ohne Kapsid. Das Genom kann in drei große Fragmente (L 1-3), drei mittlere Fragmente (M1-3) und vier kleine Fragmente (S1-4) unterteilt werden, die fir mindestens 10 strukturelle und vier nicht-strukturelle Proteine kodieren können, wie die Ergebnisse der SDS-PAGE-Elektrophorese zeigen. Das SigC-Protein wird vom 3. ORF des S1-Segments kodiert und ist ein kleiner Bestandteil der äußeren Hülle des Virus. Es hat sich gezeigt, dass das SigC-Protein mit Oberflächenantigenen für virustypspezifische Neutralisierungsreaktionen assoziiert ist, wodurch der Körper zur Bildung schiitzender neutralisierender Antikörper angeregt wird; außerdem befindet sich das Protein auf der Oberfläche der AuBenhülle und kann Zielzellen durch rezeptorvermittelte Erkennung erkennen und sich an sie anlagern und somit als Rezeptor fungieren. Darüber hinaus können SigC-Proteine in Wirtszellen über einen von p53 abhängigen Weg Apoptose auslösen.
SigC ist das variabelste der von aviärem Enten-Reovirus kodierten Proteine, NDRV, CDRV und ARV gehören alle zur Population des aviären orthorektalen Enten-Reovirus, aber das NDRV-
SigC-Protein weist eine geringe Aminosäurehomologie mit den SigC-Proteinen von CDRV und
ARV auf, etwa 40% bzw. 30%. NDRYV ist derzeit der vorherrschende Genotyp, und es gibt bisher keine antigenen B-Zell-Epitope für NDRV. Darüber hinaus sind die Epitop-Antigenität des NDRV-
SigC-Proteins und die Existenz typspezifischer antigener Epitope unbekannt.
Inhalt der Erfindung
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Identifizierung von antigenen
Epitopen des cC-Proteins des neuartigen Wasservogel-Reovirus bereitzustellen, um die im obigen
Stand der Technik angesprochenen Probleme zu lösen.
Um dies zu erreichen, bietet die Erfindung die folgenden technischen Lösungen:
Ein Verfahren zur Identifizierung von antigenen Epitopen des cC-Proteins des neuartigen
Wasservogel-Reovirus, wobei das Identifizierungsverfahren die folgenden Schritte umfasst:
S1: Vorbereitung des Rohstoffs
Rohstoffen: Zellen, Virusstimme und Versuchstiere, Virusstimme einschließlich NDRV
ZJOOM und CDRV ZJ2000M, Zellen einschließlich Hühnerembryo-Filbroblast DF-1; LU503352
S2: Vorbereitung der Reagenzien
Reagenzien: pET-28a-his-Vektor, Test-Kit, HRP-markiertes Schafs-Anti-Maus-IgG (HRP-
IgG), Forsters vollständiges Adjuvans, Forsters unvollstindiges Adjuvans, PEG4000,
Hypoxanthin-Thymin-Nukleosid, Hypoxanthin-Methotrexat-Thymin-Nukleosid,
S3: Konstruktion, Proteinexpression und Reinigung des rekombinanten Plasmids pET-28a-
SigC
Entsprechend der S1-Gensequenz des NDRV ZJOOM-Stammes wurde mit Hilfe der Oligo6.0-
Software ein Primerpaar entworfen, das den SigC ORF des S1-Gens als Zielregion verwendet, und
NDRYV ZJOOM wurde genommen, um DF-1-Zellen zu beimpfen, 200 ul Zelllysat wurden nach 72
Stunden entnommen, die RNA-Extraktion wurde durchgeführt, und das Zielfragment SigC wurde amplifiziert, und das Zielfragment SigC wurde durch Amplifikation und pET-28a-His-Vektor, um das rekombinante Plasmid pET-28a-SigC zu erhalten;
Die SigC des rekombinanten Plasmids pET-28a-SigC und des Vektors pET-28a-His wurden einem Ncol/Xhol-Doppelverdau unterzogen, die verdauten Produkte wurden ligiert und transformiert, und das erhaltene rekombinante Plasmid pET-28a-SigC wurde durch Doppel- verdauung und Sequenzierung verifiziert, das validierte rekombinante Plasmid pET-28a-SigC wurde in Rezeptorzellen transformiert, und die Expression wurde durch Isopropyl-p-D- thiogalactopyranosid (1.0 mol/L) für 5 h induziert, und Zentrifuge, um die Bakterien zu sammeln und Ultraschallstôrungen durchzuführen, und Überstände und Prizipitate wurden getrennt;
Analyse der rekombinanten Proteinexpression und Reinigung rekombinanter Proteine, was zur Bestimmung der Proteinkonzentration und zur Analyse ihrer Reinheit durch das Analysegerät führt;
S4: Immunisierung von Tieren
Immunisierung von gereinigtem rekombinantem SigC-Protein in Kultur;
SS: Zellfusion und Herstellung von MAbs
Milzzellen von Mäusen wurden mit konventionellen Methoden mit Myelomzellen von
Mäusen fusioniert, und positive Hybridomzellen, die in der Lage waren, Anti-SigC-Protein- spezifische MAbss stabil abzusondern, wurden durch ELISA untersucht, und für die untersuchten positiven Hybridomzellen, die stabil Antikörper absondern, wurde Aszites durch konventionelle
Methoden hergestellt, und die Wirksamkeit des Aszites-Antikörpers wurde durch indirekten
ELISA nachgewiesen;
S6: Identifizierung der biologischen Merkmale von MAbs (1) Identifizierung von MAbs-Subtypen
Identifizierung der vorbereiteten Aszites-Antikörper mit dem MAbs-Subtyp-
Identifizierungskit; (2) Western-Blot-Analyse von MAbs
Entnahme von DF-1-Zellen, die mit NDRV infiziert sind, Visualisierung und Analyse der
Western-Blot-Banden durch Kontrollversuche mit einem Kit; (3) Indirekter Immunfluoreszenz-Identifizierung
Durchführung von Kontrollexperimenten zur Bestimmung der Bindungsaktivität von MAbs an NDRV und zur Bewertung, ob MAbs eine Bindungsaktivität an CDRV und ARV haben;
S7: Identifizierung und Lokalisierung antigener Epitope durch Peptid-Scanning
Eine Bibliothek von 32 SigC-1-32-Peptiden mit einer verkürzten Länge von 15 Aminosäuren und einer Überlappung von 5 Aminosäuren des SigC-Proteins wurde künstlich synthetisiert, und jedes Peptid wurde mit DMSO gelöst und mit 1 ug/Well beschichtet, und das ELISA-Screenirg/ 503352 wurde mit den vorbereiteten MAbs als primärem Antikörper und HRP-markiertem Schaf-Anti-
Maus-IgG als sekundärem Antikörper durchgeführt, und das vorbereitete Anti-SigC-Protein-
Mausserum mit hoher Immunität wurde als Positivkontrolle und das Mausserum ohne Immunität als Negativkontrolle für die vorläufige Identifizierung der antigenen Epitope mittels indirektem
ELISA verwendet;
Die 32 SigC-Proteinpeptide (SigC-1-32) wurden mit den Peptiden verkürzt, die im MAbs-
ELISA stark positiv waren, und die Synthese von 8 SigC-18-1-8-Peptiden wurde durch schrittweise Verkürzung vom N- bzw. C-terminalen Ende mit einer Cis-Verschiebung von jeweils 2 Aminogruppen fortgesetzt, und die 8 verkürzten Peptide wurden mit ELISA-Platten beschichtet, und die antigene Epitopsequenz wurde anhand des OD4s0-Werts mit der gleichen ELISA-Methode wie oben ermittelt;
S8: Analyse der Konservativität
Es wurden aviäres Reovirus wie NDRV und CDRV verschiedener Generationen und geografischer Standorte ausgewählt und ihre jeweiligen SigC-Protein-Aminosäuresequenzen analysiert und verglichen, um die Konservativität der antigenen Epitope zu untersuchen.
Vorzugsweise umfassen die Kits in Schritt 2: DL15000 DNA Marker, MiniBEST Viral
RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0, PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit, Agarose Gel Recovery
Kit, Ncol und Xhol Restriktionsendonukleasen und Plasmidextraktionskit, MAb Isoform
Detection Kit, ECL Chemilumineszenz Detektionskit, Ni-NTA Kit.
Vorzugsweise umfassen die Ausgangsmaterialien in Schritt 1 insbesondere Maus-
Myelomzellen SP2/0, den ARV S1133-Stamm, E. coli DH5a und BL21-Rezeptorzellen sowie 6-8
Wochen alte BALB/c-Mäuse.
Vorzugsweise wird in Schritt 3 das Zielfragment SigC unter Verwendung der extrahierten
RNA als Matrize mit dem PrimeScriptTM One Step RT-PCR-Kit amplifiziert, PCR-
Reaktionssystem: PrimeScript One Step Enzyme Mix 1 pL, 2xOne Step Buffer 12.5 uL, 20 pmol/L
Upstream- und Downstream-Primer je 10 pmol, RNA-Template 1.5 pL, ergänzt mit RNase Free dH20 25.0 uL, wobei One-Step-RT-PCR-Reaktionsbedingungen: reverse Transkription bei 50°C fiir 30 min; Vordenaturierung bei 94°C fiir 2 min; Denaturierung bei 94°C für 30 s, Annealing bei 56°C für 30 s und Extension bei 72°C für 60 s, insgesamt wurden 30 Zyklen durchgeführt.
Vorzugsweise wird in Schritt 3 die Expression des rekombinanten Proteins durch SDS-PAGE analysiert, das rekombinante Protein SUMO-SigC wird unter Verwendung eines Ni-NTA-Kits gereinigt, dann die Proteinkonzentration wird unter Verwendung eines Quawell Q3000 Nucleic
Acid Protein Analyzer bestimmt und seine Reinheit wurde mittels SDS-PAGE analysiert.
Vorzugsweise umfasst das Verarbeitungsverfahren für das Screening durch das ELISA-
Verfahren in Schritt 5 Folgendes: Es wurde eine indirekte ELISA-Methode etabliert, bei der gereinigtes rekombinantes SigC-Protein als eingekapseltes Antigen verwendet wurde, der
Kulturüberstand der fusionierten Hybridomazellen wurde mit der etablierten ELISA-Methode getestet, wobei positive Seren von Mäusen mit Anti-NDRV-SigC-Protein als Positivkontrolle und
Seren von nicht immunisierten Mäusen als Negativkontrolle verwendet wurden, Hybridomazellen, die dem im ELISA positiv getesteten Uberstand entsprachen, wurden entnommen und mit der konventionellen Methode der begrenzten Verdünnung untersucht, und es wurden insgesamt drei
Runden der Subklonierung durchgeführt.
Vorzugsweise abläuft der Kontrollexperiment in Schritt 6 wie folgt: nach der Lyse, dem
Abkochen und der Zentrifugation wird der Uberstand für die SDS-PAGE-Elektrophorese unterzogen, dann wird das PAGE-Gel auf eine Nitrozellulosemembran übertragen, die N&V508852
Membran wird mit 5% Magermilch verschlossen, und die hergestellten MAbs als Primärantikörper und Ziegen-Anti-Maus-IgG-HRP als Sekundärantikörper, während DF-1-Zellen, die nicht mit
NDRV infiziert waren, als Negativkontrolle verwendet wurden.
Vorzugsweise umfasst das Immunisierungskulturverfahren in Schritt 4 Folgendes:
Immunisierung von 6-8 Wochen alten BALB/c-Mäusen (100 ug/Stück) mit gereinigtem rekombinantem SigC-Protein durch subkutane Mehrpunktinjektion in den Nacken und
Auffrischungsimpfung einmal in einem Abstand von 2 Wochen, insgesamt dreimal, 7 Tage nach der dritten Immunisierung Mäuse mit der höchsten Serum-Antikôrper-Potenz (100 ug/Stück) wurden erneut mit SigC-Protein (ohne Adjuvans) immunisiert, und Milzzellen wurden am dritten
Tag mit SP2/0-Zellen fusioniert.
Vorzugsweise umfasst das Verfahren der indirekten Fluoreszenz-Identifizierung in Schritt 6:
NDRV ZJOOM wurde mit DF-1-Zellen in einer infektiôsen Dosis von 0.01 MOI geimpft, und
Zellen, die nicht mit dem Virus geimpft wurden, wurden als Negativkontrolle verwendet und 48
Stunden lang bei 37°C und 5% CO2 bebrütet; das Medium wurde verworfen und die Zellen wurden mit 4% Paraformaldehyd fixiert und durch indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung der vorbereiteten MAbs als primärem Antikörper und Ziegen-Anti-Maus-IgG-FITC als sekundärem Antikörper identifiziert, um die Bindungsaktivität der MAbs an NDRV zu bestimmen.
Vorzugsweise wurden in Schritt 6 DF-1-Zellen mit CDRV ZJ2000M bzw. ARV S1133 bei 0.01 MOI infiziert und Zellen, die nicht mit dem Virus inokuliert wurden, als Negativkontrolle verwendet, 48 Stunden lang inkubiert und dann durch IFA identifiziert wurden, um festzustellen, ob die MAbs eine Bindungsaktivität für CDRV und ARV aufweisen, und die Western-Blot-Banden wurden mit dem ECL-Chemilumineszenz-Kit visualisiert und analysiert.
Verglichen mit dem Stand der Technik hat die vorliegende Erfindung folgende vorteilhafte
Auswirkungen:
Die vier MAbs-Stämme erkannten das natürliche SigC-Protein von NDRV spezifisch, indem sie die Peptid-Scan-Methode zur Identifizierung und Lokalisierung antigener Epitope anwandten, die Ergebnisse der indirekten Immunfluoreszenz zeigten, dass alle vier MAbs positiv für NDRV und negativ für das klassische Enten-Reovirus und das aviäre Enten-Reovirus waren, die antigenen
Epitope, die von den vier Stämmen von MAbs erkannt wurden, wurden mit Hilfe von synthetischen überlappenden Peptidbibliotheken und einer Reihe von abgeschnittenen Peptiden identifiziert, und die Ergebnisse zeigten, dass das zentrale antigene Epitop, das von den drei monoklonalen Antikörpern AS-A1, A5-B6 und B9-6 erkannt wurde, 177PILSGPADA 185 war, und das antigene Epitop, das von dem monoklonalen Antikörper A9-D4 erkannt wurde, befand sich wahrscheinlich in einer räumlichen Konformation, und die Konservativitätsanalyse des antigenen
Epitops zeigte, dass die antigenen Epitope in NDRV-Isolaten aus verschiedenen geografischen
Regionen und unterschiedlichen Wirtsquellen in hohem Maße konserviert waren, was grundlegende Informationen fir weitere Studien zur Struktur des SigC-Proteins und die
Entwicklung klinischer Tests fiir NDRV liefert.
Beschreibung der beigefügten Zeichnungen
Bild 1 zeigt eine Tabelle zur Identifizierung von Antikörper-Isoformen, die von der
Hybridom-Zelllinie der vorliegenden Erfindung sezerniert werden;
Bild 2 zeigt ein Western-Blot-Identifikationsreaktionsdiagramm für die MAbs der vorliegenden Erfindung;
Bild 3 zeigt ein Identifikationsreaktionsdiagramm A für die antigenen Epitope der vorliegenden Erfindung; LU503352
Bild 4 zeigt ein Identifizierungsreaktionsdiagramm B fiir die antigenen Epitope der vorliegenden Erfindung.
Detaillierte Beschreibung 5 Die technischen Lösungen in den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden im
Folgenden in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen in den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung klar und vollständig beschrieben, und es ist klar, dass die beschriebenen
Ausführungsformen nur ein Teil der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind, und nicht alle von ihnen. Ausgehend von den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung fallen alle anderen Ausführungsformen, die von einem Fachmann ohne schöpferische Arbeit erzielt werden, in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung.
Unter Bezugnahme auf die Bilder 1 bis 4 zeigt die vorliegende Erfindung eine technische
Lösung:
Ein Verfahren zur Identifizierung von antigenen Epitopen des cC-Proteins des neuartigen
Wasservogel-Reovirus, wobei das Identifizierungsverfahren die folgenden Schritte umfasst:
S1: Vorbereitung des Rohstoffs
Rohstoffen: Zellen, Virusstimme und Versuchstiere, Virusstämme einschließlich NDRV
ZJ00M und CDRV ZJ2000M, Zellen einschließlich Hühnerembryo-Filbroblast DF-1, die
Ausgangsmaterialien umfassen insbesondere Maus-Myelomzellen SP2/0, den ARV S1133-Stamm,
E. coli DH5a und BL21-Rezeptorzellen sowie 6-8 Wochen alte BALB/c-Mäuse;
S2: Vorbereitung der Reagenzien
Reagenzien: pET-28a-his-Vektor, Test-Kit, HRP-markiertes Schafs-Anti-Maus-IgG (HRP-
IgG), Försters vollständiges Adjuvans, Försters unvollständiges Adjuvans, PEG4000,
Hypoxanthin-Thymin-Nukleosid, Hypoxanthin-Methotrexat-Thymin-Nukleosid, Kits: DL15000
DNA Marker, MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0, PrimeScriptTM One Step RT-
PCR Kit, Agarose Gel Recovery Kit, Ncol und Xhol Restriktionsendonukleasen und
Plasmidextraktionskit, MAb Isoform Detection Kit, ECL Chemilumineszenz Detektionskit, Ni-
NTA Kit;
S3: Konstruktion, Proteinexpression und Reinigung des rekombinanten Plasmids pET-28a-
SigC
Entsprechend der S1-Gensequenz des NDRV ZJOOM-Stammes wurde mit Hilfe der Oligo6.0-
Software ein Primerpaar entworfen, das den SigC ORF des S1-Gens als Zielregion verwendet, das
Zielfragment SigC unter Verwendung der extrahierten RNA als Matrize mit dem PrimeScriptTM
One Step RT-PCR-Kit amplifiziert wird, PCR-Reaktionssystem: PrimeScript One Step Enzyme
Mix 1 pL, 2xOne Step Buffer 12.5 pL, 20 pmol/L Upstream- und Downstream-Primer je 10 pmol,
RNA-Template 1.5 ul, ergänzt mit RNase Free dH20 25.0 pL, wobei One-Step-RT-PCR-
Reaktionsbedingungen: reverse Transkription bei 50°C für 30 min; Vordenaturierung bei 94°C für 2 min; Denaturierung bei 94°C fiir 30 s, Annealing bei 56°C fiir 30 s und Extension bei 72°C fur 60 s, insgesamt wurden 30 Zyklen durchgeführt, und NDRV ZJOOM wurde genommen, um DF-1-
Zellen zu beimpfen, 200 ul Zelllysat wurden nach 72 Stunden entnommen, die RNA-Extraktion wurde durchgeführt, und das Zielfragment SigC wurde amplifiziert, und das Zielfragment SigC wurde durch Amplifikation und pET-28a-His-Vektor, um das rekombinante Plasmid pET-28a-
SigC zu erhalten;
Die SigC des rekombinanten Plasmids pET-28a-SigC und des Vektors pET-28a-His wurden einem Ncol/Xhol-Doppelverdau unterzogen, die verdauten Produkte wurden ligiert und transformiert, und das erhaltene rekombinante Plasmid pET-28a-SigC wurde durd503352
Doppelverdauung und Sequenzierung verifiziert, das validierte rekombinante Plasmid pET-28a-
SigC wurde in Rezeptorzellen transformiert, und die Expression wurde durch Isopropyl-B-D- thiogalactopyranosid (1.0 mol/L) für 5 h induziert, und Zentrifuge, um die Bakterien zu sammeln und Ultraschallstôrungen durchzuführen, und Überstände und Präzipitate wurden getrennt;
Die Expression des rekombinanten Proteins wird durch SDS-PAGE analysiert, das rekombinante Protein SUMO-SigC wird unter Verwendung eines Ni-NTA-Kits gereinigt, dann die
Proteinkonzentration wird unter Verwendung eines Quawell Q3000 Nucleic Acid Protein Analyzer bestimmt und seine Reinheit wurde mittels SDS-PAGE analysiert.
S4: Immunisierung von Tieren
Immunisierung von gereinigtem rekombinantem SigC-Protein in Kultur, das
Immunisierungskulturverfahren umfasst Folgendes: Immunisierung von 6-8 Wochen alten
BALB/c-Mäusen (100 ug/Stück) mit gereinigtem rekombinantem SigC-Protein durch subkutane
Mehrpunktinjektion in den Nacken und Auffrischungsimpfung einmal in einem Abstand von 2
Wochen, insgesamt dreimal, 7 Tage nach der dritten Immunisierung Mäuse mit der höchsten
Serum-Antikôrper-Potenz (100 ug/Stück) wurden erneut mit SigC-Protein (ohne Adjuvans) immunisiert, und Milzzellen wurden am dritten Tag mit SP2/0-Zellen fusioniert;
SS: Zellfusion und Herstellung von MAbs
Milzzellen von Mäusen wurden mit konventionellen Methoden mit Myelomzellen von
Mäusen fusioniert, das Verarbeitungsverfahren umfasst für das Screening durch das ELISA-
Verfahren Folgendes: Es wurde eine indirekte ELISA-Methode etabliert, bei der gereinigtes rekombinantes SigC-Protein als eingekapseltes Antigen verwendet wurde, der Kulturüberstand der fusionierten Hybridomazellen wurde mit der etablierten ELISA-Methode getestet, wobei positive
Seren von Mäusen mit Anti-NDRV-SigC-Protein als Positivkontrolle und Seren von nicht 1mmunisierten Mäusen als Negativkontrolle verwendet wurden, Hybridomazellen, die dem im
ELISA positiv getesteten Uberstand entsprachen, wurden entnommen und mit der konventionellen
Methode der begrenzten Verdünnung untersucht, und es wurden insgesamt drei Runden der
Subklonierung durchgeführt, und positive Hybridomzellen, die in der Lage waren, Anti-SigC-
Protein-spezifische MAbss stabil abzusondern, wurden untersucht, und fiir die untersuchten positiven Hybridomzellen, die stabil Antikörper absondern, wurde Aszites durch konventionelle
Methoden hergestellt, und die Wirksamkeit des Aszites-Antikôrpers wurde durch indirekten
ELISA nachgewiesen;
S6: Identifizierung der biologischen Merkmale von MAbs (1) Identifizierung von MAbs-Subtypen
Identifizierung der vorbereiteten Aszites-Antikorper mit dem MAbs-Subtyp-
Identifizierungskit; (2) Western-Blot-Analyse von MAbs
NDRV-infizierte DF-1-Zellen wurden gesammelt, und die spezifische Methode des
Kontrollexperiments war wie folgt: nach der Lyse, dem Abkochen und der Zentrifugation wird der
Uberstand für die SDS-PAGE-Elektrophorese unterzogen, dann wird das PAGE-Gel auf eine
Nitrozellulosemembran übertragen, die NC-Membran wird mit 5% Magermilch verschlossen, und die hergestellten MAbs als Primärantikörper und Ziegen-Anti-Maus-IgG-HRP als Sekundär- antikörper, während DF-1-Zellen, die nicht mit NDRV infiziert waren, als Negativkontrolle verwendet wurden, und die Western-Blot-Banden wurden mit dem Kit visualisiert und analysiert. (3) Indirekter Immunfluoreszenz-Identifizierung
NDRV ZJOOM wurde mit DF-1-Zellen in einer infektiösen Dosis von 0.01 MOI geimpft, und 503352
Zellen, die nicht mit dem Virus geimpft wurden, wurden als Negativkontrolle verwendet und 48
Stunden lang bei 37°C und 5% CO2 bebrütet; das Medium wurde verworfen und die Zellen wurden mit 4% Paraformaldehyd fixiert und durch indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung der vorbereiteten MAbs als primärem Antikörper und Ziegen-Anti-Maus-IgG-FITC als sekundärem Antikörper identifiziert, um die Bindungsaktivität der MAbs an NDRV zu bestimmen,
DF-1-Zellen wurden mit CDRV ZJ2000M bzw. ARV S1133 bei 0.01 MOI infiziert und Zellen, die nicht mit dem Virus inokuliert wurden, als Negativkontrolle verwendet, 48 Stunden lang inkubiert und dann durch IFA identifiziert wurden, um festzustellen, ob die MAbs eine Bindungsaktivität für CDRV und ARV aufweisen, und die Western-Blot-Banden wurden mit dem ECL-
Chemilumineszenz-Kit visualisiert und analysiert, Visualisierung und Analyse zur Bestimmung der Bindungsaktivität von MAbs an NDRV und zur Bewertung, ob MAbs eine Bindungsaktivität an CDRV und ARV haben;
S7: Identifizierung und Lokalisierung antigener Epitope durch Peptid-Scanning
Eine Bibliothek von 32 SigC-1-32-Peptiden mit einer verkürzten Länge von 15 Aminosäuren und einer Überlappung von 5 Aminosäuren des SigC-Proteins wurde künstlich synthetisiert, und jedes Peptid wurde mit DMSO gelöst und mit 1 ug/Well beschichtet, und das ELISA-Screening wurde mit den vorbereiteten MAbs als primärem Antikörper und HRP-markiertem Schaf-Anti-
Maus-IgG als sekundärem Antikörper durchgeführt, und das vorbereitete Anti-SigC-Protein-
Mausserum mit hoher Immunität wurde als Positivkontrolle und das Mausserum ohne Immunität als Negativkontrolle für die vorläufige Identifizierung der antigenen Epitope mittels indirektem
ELISA verwendet;
Die 32 SigC-Proteinpeptide (SigC-1-32) wurden mit den Peptiden verkürzt, die im MAbs-
ELISA stark positiv waren, und die Synthese von 8 SigC-18-1-8-Peptiden wurde durch schrittweise Verkürzung vom N- bzw. C-terminalen Ende mit einer Cis-Verschiebung von jeweils 2 Aminogruppen fortgesetzt, und die 8 verkürzten Peptide wurden mit ELISA-Platten beschichtet, und die antigene Epitopsequenz wurde anhand des OD4s0-Werts mit der gleichen ELISA-Methode wie oben ermittelt;
S8: Analyse der Konservativität
Es wurden aviäres Reovirus wie NDRV und CDRV verschiedener Generationen und geografischer Standorte ausgewählt und ihre jeweiligen SigC-Protein-Aminosäuresequenzen analysiert und verglichen, um die Konservativität der antigenen Epitope zu untersuchen.
Analyse der Ergebnisse:
Analyse 1: Prokaryotische Expression, Identifizierung und Reinigung des SigC-Proteins
Das rekombinante Plasmid pET-28a-SigC wurde durch doppelten Verdau mit Ncol und Xhol identifiziert, um zwei Fragmente zu erhalten, die mit der erwarteten Größe von 5236 und 966 bp übereinstimmten, und die Sequenzierungsergebnisse zeigten, dass die Sequenzen korrekt waren.
E. coli BL21-Zellen wurden mit pET-28a-SigC transformiert und durch IPTG bei 37°C für 5 h induziert, der Uberstand und das Präzipitat wurden durch Ultraschall-Lyse der Bakterien gesammelt und dann einer SDS-PAGE unterzogen. Die Ergebnisse zeigten, dass das exprimierte rekombinante Protein wie erwartet hauptsächlich in Form von Einschlusskôrpern im Zellpräzipitat mit einem Molekulargewicht von etwa 35 kD vorlag. Western-Blot-Assay des gereinigten rekombinanten SigC-Proteins zeigten eine spezifische Reaktionsbande bei 35 kD, was auf eine gute Reaktivität des Expressionsprodukts mit dem Anti-Allovirus-Serum hinweist;
Analyse 2: Identifizierung von MAbs-Subtypen und Bestimmung der Aszites-Wirkung
Nach der Zellfusion wurden die erhaltenen Hybridomazellen mit der indirekten ELISAY503352
Methode untersucht, und die positiv getesteten Hybridomazellen wurden mit der Methode der dreifachen begrenzten Verdünnung subklonal gereinigt, um vier positive Hybridomazelllinien zu erhalten, die stabil Anti-NDRV-SigC-Protein-MAbs sezernierten und die Namen A5-A1, A5-B6,
A9-D4 bzw. B9-6 tragen. Die Ergebnisse des Isotyp-Tests für monoklonale Antikörper zeigten, dass alle vier Hybridom-Zelllinien IgG1-Antikörper sezernierten und die leichten Ketten der sezernierten Antikörper alle x waren (wie in Bild 1 dargestellt). 4 Hybridomazell-Uberstinde, A5-
Al, A5-B6, A9-D4 und B9-6, mit einer Antikörper-Potenz von 1:1 200 im ELISA; jeder der hergestellten monoklonalen Antikörper-Aszite hatte nach der Reinigung eine Potenz von 1:240 000;
Analyse 3: Western-Blot-Identifizierung von MAbs
DF-1-Zellen wurden mit NDRV ZJOOM infiziert, die Zellen wurden lysiert und der Überstand für den Western-Blot-Nachweis mit dem NDRV-Vollvirus als Antigen gesammelt. Die Ergebnisse zeigten, dass die vier erhaltenen MAbs, A5-A1, A5-B6, A9-D4 und B9-6, alle mit dem NDRV-
Vollvirus reagierten, mit spezifischen Banden bei etwa 35 kD; sie reagierten negativ mit DF-1-
Zellen, die nicht mit NDRV infiziert waren (wie in Bild 2 dargestellt). Die obigen Ergebnisse zeigen, dass alle vier MAbs-Stämme das natürliche SigC-Protein von NDRV spezifisch erkennen;
Analyse 4: Identifizierung von antigenen Epitopen
Die synthetischen 32 Peptide (SigC-1-32) wurden mit ELISA-Platten beschichtet und jeder der 4 MAbs-Stämme wurde als primärer Antikörper für den ELISA-Nachweis verwendet. Die
Ergebnisse zeigten, dass alle drei monoklonalen Antikörper, A5-A1, A5-B6 und B9-6, stark positive Reaktion mit dem SigC-18-Peptid, schwach positive Reaktion mit dem SigC-19-Peptid und nicht mit den anderen Peptiden reagierten (wie in Bild 3 dargestellt), und die ursprünglichen antigenen Epitope für diese drei monoklonalen Antikörper sollten 171SFCSLSPILSGPADA185 sein. Der monoklonale Antikörper A9-D4 reagierte mit keinem der 36 kurzen Polypeptide, vermutlich handelt es sich bei dem vom monoklonalen Antikörper A9-D4 erkannten antigenen
Epitop um ein räumliches Konformationsepitop. Acht kurze Polypeptide (SigC-18-1-8), die durch schrittweise Verkürzung von zwei Aminosäuren am N- bzw. C-Terminus synthetisiert wurden, wurden auf ELISA-Platten aufgetragen, und drei MAbs, A5-A1, A5-B6 und B9-6, wurden als primäre Antikörper für den ELISA-Nachweis verwendet, die Ergebnisse zeigten, dass das SigC- 18-Peptid nach Abschneiden von sechs Aminogruppen am N-terminalen Ende (entsprechend
SigC-18-5, SigC-18-6 bzw. SigC-18-7) immer noch starke positive Reaktionen mit den drei monoklonalen Antikörpern A5-A1, A5-B6 und B9-6 zeigte (wie in Bild 4 dargestellt). Daher sollte das Kernantigenepitop, das den drei monoklonalen Antikörpern A5-Al, A5-B6 und B9-6 entspricht, 177PILSGPADA185 sein und aus 9 Aminosäuren bestehen.
Obwohl Ausführungsformen der Erfindung gezeigt und beschrieben wurden, versteht der
Fachmann, dass eine Vielzahl von Variationen, Modifikationen, Ersetzungen und Varianten dieser
Ausführungsformen möglich sind, ohne von den Prinzipien und dem Geist der Erfindung abzuweichen, deren Umfang durch die beigefügten Ansprüche und deren Äquivalente begrenzt ist.

Claims (10)

Ansprüche LU503352
1. Ein Verfahren zur Identifizierung von antigenen Epitopen des cC-Proteins des neuartigen Wasservogel-Reovirus, dadurch gekennzeichnet, dass das Identifizierungsverfahren die folgenden Schritte umfasst: S1: Vorbereitung des Rohstoffs Rohstoffen: Zellen, Virusstimme und Versuchstiere, Virusstämme einschließlich NDRV ZJOOM und CDRV ZJ2000M, Zellen einschließlich Hühnerembryo-Filbroblast DF-1; S2: Vorbereitung der Reagenzien Reagenzien: pET-28a-his-Vektor, Test-Kit, HRP-markiertes Schafs-Anti-Maus-IgG (HRP- IgG), Försters vollständiges Adjuvans, Försters unvollständiges Adjuvans, PEG4000, Hypoxanthin-Thymin-Nukleosid, Hypoxanthin-Methotrexat-Thymin-Nukleosid; S3: Konstruktion, Proteinexpression und Reinigung des rekombinanten Plasmids pET-28a- SigC Entsprechend der S1-Gensequenz des NDRV ZJ00M-Stammes wurde mit Hilfe der Oligo6.0- Software ein Primerpaar entworfen, das den SigC ORF des S1-Gens als Zielregion verwendet, und NDRV ZJOOM wurde genommen, um DF-1-Zellen zu beimpfen, 200 ul Zelllysat wurden nach 72 Stunden entnommen, die RNA-Extraktion wurde durchgeführt, und das Zielfragment SigC wurde amplifiziert, und das Zielfragment SigC wurde durch Amplifikation und pET-28a-His-Vektor, um das rekombinante Plasmid pET-28a-SigC zu erhalten; Die SigC des rekombinanten Plasmids pET-28a-SigC und des Vektors pET-28a-His wurden einem Ncol/Xhol-Doppelverdau unterzogen, die verdauten Produkte wurden ligiert und transformiert, und das erhaltene rekombinante Plasmid pET-28a-SigC wurde durch Doppel- verdauung und Sequenzierung verifiziert, das validierte rekombinante Plasmid pET-28a-SigC wurde in Rezeptorzellen transformiert, und die Expression wurde durch Isopropyl-ß-D- thiogalactopyranosid (1.0 mol/L) für 5 h induziert, und Zentrifuge, um die Bakterien zu sammeln und Ultraschallstörungen durchzuführen, und Überstände und Präzipitate wurden getrennt; Analyse der rekombinanten Proteinexpression und Reinigung rekombinanter Proteine, was zur Bestimmung der Proteinkonzentration und zur Analyse ihrer Reinheit durch das Analysegerät führt; S4: Immunisierung von Tieren Immunisierung von gereinigtem rekombinantem SigC-Protein in Kultur; SS: Zellfusion und Herstellung von MAbs Milzzellen von Mäusen wurden mit konventionellen Methoden mit Myelomzellen von Mäusen fusioniert, und positive Hybridomzellen, die in der Lage waren, Anti-SigC-Protein- spezifische MAbss stabil abzusondern, wurden durch ELISA untersucht, und für die untersuchten positiven Hybridomzellen, die stabil Antikörper absondern, wurde Aszites durch konventionelle Methoden hergestellt, und die Wirksamkeit des Aszites-Antikörpers wurde durch indirekten ELISA nachgewiesen; S6: Identifizierung der biologischen Merkmale von MAbs (1) Identifizierung von MAbs-Subtypen Identifizierung der vorbereiteten Aszites-Antikörper mit dem MAbs-Subtyp- Identifizierungskit; (2) Western-Blot-Analyse von MAbs Entnahme von DF-1-Zellen, die mit NDRV infiziert sind, Visualisierung und Analyse der
Western-Blot-Banden durch Kontrollversuche mit einem Kit; LUS03352 (3) Indirekter Immunfluoreszenz-Identifizierung Durchführung von Kontrollexperimenten zur Bestimmung der Bindungsaktivität von MAbs an NDRV und zur Bewertung, ob MAbs eine Bindungsaktivität an CDRV und ARV haben; S7: Identifizierung und Lokalisierung antigener Epitope durch Peptid-Scanning Eine Bibliothek von 32 SigC-1-32-Peptiden mit einer verkürzten Länge von 15 Aminosäuren und einer Überlappung von 5 Aminosäuren des SigC-Proteins wurde künstlich synthetisiert, und jedes Peptid wurde mit DMSO gelöst und mit 1 ug/Well beschichtet, und das ELISA-Screening wurde mit den vorbereiteten MAbs als primärem Antikörper und HRP-markiertem Schaf-Anti- Maus-IgG als sekundärem Antikörper durchgeführt, und das vorbereitete Anti-SigC-Protein- Mausserum mit hoher Immunität wurde als Positivkontrolle und das Mausserum ohne Immunität als Negativkontrolle für die vorläufige Identifizierung der antigenen Epitope mittels indirektem ELISA verwendet; Die 32 SigC-Proteinpeptide (SigC-1-32) wurden mit den Peptiden verkürzt, die im MAbs- ELISA stark positiv waren, und die Synthese von 8 SigC-18-1-8-Peptiden wurde durch schrittweise Verkürzung vom N- bzw. C-terminalen Ende mit einer Cis-Verschiebung von jeweils 2 Aminogruppen fortgesetzt, und die 8 verkürzten Peptide wurden mit ELISA-Platten beschichtet, und die antigene Epitopsequenz wurde anhand des OD4s0-Werts mit der gleichen ELISA-Methode wie oben ermittelt; S8: Analyse der Konservativität Es wurden aviäres Reovirus wie NDRV und CDRV verschiedener Generationen und geografischer Standorte ausgewählt und ihre jeweiligen SigC-Protein-Aminosäuresequenzen analysiert und verglichen, um die Konservativität der antigenen Epitope zu untersuchen.
2. Ein Verfahren zur Identifizierung von antigenen Epitopen des cC-Proteins des neuartigen Wasservogel-Reovirus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kits in Schritt 2 umfassen: DL15000 DNA Marker, MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0, PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit, Agarose Gel Recovery Kit, Ncol und Xhol Restriktionsendonukleasen und Plasmidextraktionskit, MAb Isoform Detection Kit, ECL Chemilumineszenz Detektionskit, Ni-NTA Kit.
3. Ein Verfahren zur Identifizierung von antigenen Epitopen des 6C-Proteins des neuartigen Wasservogel-Reovirus nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausgangsmaterialien in Schritt 1 insbesondere Maus-Myelomzellen SP2/0, den ARV S1133-Stamm, E. coli DH5a und BL21-Rezeptorzellen sowie 6-8 Wochen alte BALB/c-Mäuse umfassen.
4. Ein Verfahren zur Identifizierung von antigenen Epitopen des cC-Proteins des neuartigen Wasservogel-Reovirus nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Zielfragment SigC in Schritt 3 unter Verwendung der extrahierten RNA als Matrize mit dem PrimeScriptTM One Step RT-PCR-Kit amplifiziert wird, PCR-Reaktionssystem: PrimeScript One Step Enzyme Mix 1 pL, 2xOne Step Buffer 12.5 pL, 20 umol/L Upstream- und Downstream-Primer je 10 pmol, RNA- Template 1.5 pL, ergänzt mit RNase Free dH20 25.0 uL, wobei One-Step-RT-PCR- Reaktionsbedingungen: reverse Transkription bei 50°C für 30 min; Vordenaturierung bei 94°C für 2 min; Denaturierung bei 94°C fiir 30 s, Annealing bei 56°C fiir 30 s und Extension bei 72°C fur 60 s, insgesamt wurden 30 Zyklen durchgeführt.
5. Ein Verfahren zur Identifizierung von antigenen Epitopen des 6C-Proteins des neuartigen Wasservogel-Reovirus nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt 3 die Expression des rekombinanten Proteins durch SDS-PAGE analysiert wird, das rekombinante Protein SUMO-
SigC unter Verwendung eines Ni-NTA-Kits gereinigt wird, dann die Proteinkonzentration untk}/>03352 Verwendung eines Quawell Q3000 Nucleic Acid Protein Analyzer bestimmt wird und seine Reinheit mittels SDS-PAGE analysiert wurde.
6. Ein Verfahren zur Identifizierung von antigenen Epitopen des 6C-Proteins des neuartigen Wasservogel-Reovirus nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Verarbeitungs- verfahren fiir das Screening durch das ELISA-Verfahren in Schritt 5 Folgendes umfasst: Es wurde eine indirekte ELISA-Methode etabliert, bei der gereinigtes rekombinantes SigC-Protein als eingekapseltes Antigen verwendet wurde, der Kulturüberstand der fusionierten Hybridomazellen wurde mit der etablierten ELISA-Methode getestet, wobei positive Seren von Mäusen mit Anti- NDRV-SigC-Protein als Positivkontrolle und Seren von nicht immunisierten Mäusen als Negativkontrolle verwendet wurden, Hybridomazellen, die dem im ELISA positiv getesteten Uberstand entsprachen, wurden entnommen und mit der konventionellen Methode der begrenzten Verdünnung untersucht, und es wurden insgesamt drei Runden der Subklonierung durchgeführt.
7. Ein Verfahren zur Identifizierung von antigenen Epitopen des 6C-Proteins des neuartigen Wasservogel-Reovirus nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Kontrollexperiment in Schritt 6 wie folgt abläuft: Nach der Lyse, dem Abkochen und der Zentrifugation wird der Uberstand fiir die SDS-PAGE-Elektrophorese unterzogen, dann wird das PAGE-Gel auf eine Nitrozellulosemembran übertragen, die NC-Membran wird mit 5% Magermilch verschlossen, und die hergestellten MAbs als Primärantikôrper und Ziegen-Anti-Maus-IgG-HRP als Sekundär- antikôrper, während DF-1-Zellen, die nicht mit NDRV infiziert waren, als Negativkontrolle verwendet wurden.
8. Ein Verfahren zur Identifizierung von antigenen Epitopen des 6C-Proteins des neuartigen Wasservogel-Reovirus nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Immunisierungs- kulturverfahren in Schritt 4 Folgendes umfasst: Immunisierung von 6-8 Wochen alten BALB/c- Mäusen (100 ug/Stück) mit gereinigtem rekombinantem SigC-Protein durch subkutane Mehrpunktinjektion in den Nacken und Auffrischungsimpfung einmal in einem Abstand von 2 Wochen, insgesamt dreimal, 7 Tage nach der dritten Immunisierung Mäuse mit der höchsten Serum-Antikôrper-Potenz (100 ug/Stück) wurden erneut mit SigC-Protein (ohne Adjuvans) immunisiert, und Milzzellen wurden am dritten Tag mit SP2/0-Zellen fusioniert.
9. Ein Verfahren zur Identifizierung von antigenen Epitopen des 6C-Proteins des neuartigen Wasservogel-Reovirus nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren der indirekten Fluoreszenz-Identifizierung in Schritt 6 umfasst: NDRV ZJOOM wurde mit DF-1-Zellen in einer infektiôsen Dosis von 0.01 MOI geimpft, und Zellen, die nicht mit dem Virus geimpft wurden, wurden als Negativkontrolle verwendet und 48 Stunden lang bei 37°C und 5% CO2 bebrütet; das Medium wurde verworfen und die Zellen wurden mit 4% Paraformaldehyd fixiert und durch indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung der vorbereiteten MAbs als primärem Antikörper und Ziegen-Anti-Maus-IgG-FITC als sekundärem Antikörper identifiziert, um die Bindungsaktivität der MAbs an NDRV zu bestimmen.
10. Fin Verfahren zur Identifizierung von antigenen Epitopen des cC-Proteins des neuartigen Wasservogel-Reovirus nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt 6 DF-1-Zellen mit CDRV ZJ2000M bzw. ARV S1133 bei 0.01 MOI infiziert wurden und Zellen, die nicht mit dem Virus inokuliert wurden, als Negativkontrolle verwendet, 48 Stunden lang inkubiert und dann durch IFA identifiziert wurden, um festzustellen, ob die MAbs eine Bindungsaktivität für CDRV und ARV aufweisen, und die Western-Blot-Banden wurden mit dem ECL-Chemilumineszenz-Kit visualisiert und analysiert.
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