CN102321177B - 一种抗三聚氰胺单链抗体及其应用体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一条兔源抗三聚氰胺的单链抗体序列，其轻链可变区的氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。该抗体是利用噬菌体表面展示技术筛选获得。本发明的单链抗体特异性识别三聚氰胺，与含三聚氰胺的奶制品有明显的酶联免疫反应。可将本发明用于食品和饲料中三聚氰胺含量的检测。

Description

一种抗三聚氰胺单链抗体及其应用体

技术领域

本发明涉及噬菌体展示技术和基因工程抗体技术，特别是涉及一种抗三聚氰胺单链抗体；本发明还涉及该抗体在检测三聚氰胺样品中的应用。 

背景技术

三聚氰胺（melamine）简称三胺，由德国化学家Justusvon Liebig于1834年首次合成，学名三氨三嗪。三聚氰胺是一种重要的氮杂环有机化工原料，它主要用于生产三聚氰胺—甲醛树脂，同时广泛用于木材、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药等行业。比如，现代工艺多采用尿素合成的三聚氰胺树脂常常被用于生产制作食品包装或餐具，因此通过用三聚氰胺树脂为原材料的食品包装或餐具会将三聚氰胺迁移至食品中。杀虫剂灭蝇胺的代谢产物三聚氰胺沿食物链富集进入植物或动物源食物也会导致食品中污染三聚氰胺。慢性高剂量摄入三聚氰胺会诱发肾脏病理学，引起动物肾脏功能衰竭甚至导致死亡。由于三聚氰胺与蛋白质相比含有更多的氮原子，所以添加在食品中的三聚氰胺可以造成食品蛋白质含量较高的假象，因而常被不法商贩所利用。三聚氰胺被投机者用作食品添加剂，给人类生活带来了很大的安全隐患，因此迫切需要快速、准确、有效的检测方法来监测食物中的三聚氰胺残留。

免疫学检测方法具有操作简便、快速、检测成本低、通量高、对技术人员的要求低的优点，适合于三聚氰胺的现场检测。采用ELISA方法检测三聚氰胺，需要抗三聚氰胺的抗体。以抗原免疫动物获得多抗血清是制备抗体的经典方法，但制备周期长，得到的抗体量有限。B淋巴细胞杂交瘤技术获得单克隆抗体，其特异性强，性质均一，但不易于大批量发酵生产。通过抗体分子基因水平的重组可获得多种多样的特异性抗体，使单克隆抗体的研制有了重要进展。已有研究报道，重组单链抗体（scFv）能够保留与亲本单克隆抗体（mcAb）结构相一致的抗原识别位点。噬菌体抗体库技术的产生为筛选获得高灵敏性重组抗体提供了简便而高效的操作系统。将筛选得到的重组抗体基因导入表达宿主中，能实现特异性抗体的大量生产。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种重组单链抗体序列，该抗体能特异性结合三聚氰胺，可被用于检测食品、水产品、饲料等样品中三聚氰胺的含量。

本发明的第二个目的在于提供编码上述单链抗体的基因。

本发明的第三个目的在于提供上述抗体在制备三聚氰胺检测试剂中的应用。

本发明提供的一种抗三聚氰胺单链抗体，其轻链可变区的氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.1 和SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了编码上述抗体的基因。编码轻链可变区的核苷酸序列和编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

本发明还提供了一种将上述的抗体经过改造得到的衍生抗体，所述改造包括氨基酸的缺失、替换或插入，并且不改变抗体的活性。

    含有本发明所述基因的表达载体及表达载体的宿主均属于本发明的保护范围。

一种与SEQ ID No.1 具有至少90% 同源性且编码相同功能蛋白质的序列，以及一种与SEQ ID No.2 具有至少90% 同源性且编码相同功能蛋白质的序列，也在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了上述抗体在检测三聚氰胺中的应用。

本发明应用噬菌体表面展示技术，通过抗体基因工程技术构建了兔源抗三聚氰胺抗体文库，并筛选获得特异抗三聚氰胺抗体scFv片段，获得的scFv片段命名为B4-scFv。

B4-scFv特异性的轻链和重链可变区基因来源于对兔源抗三聚氰胺单链抗体文库的特异性富集筛选，该抗体库的建立来源于日本大耳兔的脾脏细胞基因。抗体蛋白功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的抗原决定簇互补区域CDRs中特异性核苷酸序列决定，6个相应的CDRs区氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域，决定发明中抗体的抗原结合特征（表1）。

表1 B4-scFv抗体的轻链和重链高可变区序列

B4-scFv轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。编码B4-scFv轻链可变区的基因序列如SEQ ID No.3所示，重链可变区的基因序列如SEQ ID No.4所示。

将上述编码scFv基因克隆到表达载体中，进而转化宿主Rosseta中，通过诱导表达获得scFv抗体。利用SDS-PAGE和ELISA对获得的B4-scFv抗体进行功能鉴定，结果表明B4-scFv对三聚氰胺有特异性结合，并且能灵敏的检测出牛奶样品中三聚氰胺。

本发明的B4-scFv蛋白可制备三聚氰胺检测试剂，用于检测食品、水产品、饲料等样品中的三聚氰胺残留量。

附图说明

图1为抗三聚氰胺单链抗体B4-scFv蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中（M）蛋白marker；（1）非诱导的Rosseta菌的周质蛋白提取液；（2）B4菌的周质蛋白提取液；（3）纯化的B4-scFv。

图2 为B4-scFv的三聚氰胺标准抑制曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式做进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围。

材料与方法

1.载体、菌株：噬菌体VCSM13，噬菌质粒pComb3，菌株XL1-Blue均为美国Scripps研究所提供。

 2.主要试剂

明胶、牛血清白蛋白（BSA）购自上海生工生物工程有限公司；TRIZOLreagent试剂为Invitrogen公司产品；cDNA合成试剂盒和sfiI限制性内切酶为Fermentas公司产品；T4DNA连接酶、胶回收试剂盒、核酸marker和蛋白质marker均购自TaKaRa公司；2×Taq PCR MasterMix购自天根生化科技有限公司；Goat HRP/anti-HA conjugate抗体为南京金斯瑞公司产品；PCR引物均为Invitrogen公司合成。

 3.抗原制备

采用戊二醛做交联剂(Avrameas，1969)，使牛血清白蛋白（BSA）载体和三聚氰胺的氨基以共价键连接合成免疫全抗原。具体制备如下：将630mg三聚氰胺溶于50mL 的甘油中备用；另外取200mg BSA 溶于25mL 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）制成BSA溶液；将三聚氰胺溶液在搅拌下缓慢加入BSA溶液中；搅拌均匀后，再缓慢滴入0.4mL25%戊二醛溶液，搅拌反应4h后，在4℃下将合成产物用PBS（pH7.2）透析3d，并用超滤离心管浓缩产物，4℃冰箱保存。

 4.动物免疫

准备4只健康的雄性日本大白兔（购自福建医科大学动物实验中心），分两组，2只加步骤3制备的完全抗原，另2只为对照组，免疫前各分别采取血样，测血清效价。免疫抗原剂量为0.5mL/只，实验组加制备的完全抗原，对照组加生理盐水，采用皮下多点注射。14d后进行第2次免疫，免疫的剂量为第一次的1/4；8d后，从耳缘静脉取1mL血，制备血清，检测抗体效价。此后每隔14d加强免疫1次，8d后测效价。两个月后，当效价不再上升时，采用心脏采血并获得兔子脾脏。

 5.引物设计

如表2所示，针对κ型轻链可变区共设计了3条上游引物和3条下游引物，可组合成9对引物；λ型轻链可变区仅设计了1对引物。这10对引物的上游引物5’端含有内切酶SfiI酶切位点，下游引物5’端含有连接片段（linker）序列。针对重链可变区共设计了4条上游引物和1条下游引物，可组合成4对引物。这4对引物的上游引物5’端含有连接片段（linker）序列，下游引物5’端含有SfiI酶切位点。Linker序列编码七个氨基酸（GGSSRSS）。另外，设计1对引物用于扩增scFv。

表2 兔源scFv文库构建引物

6.兔抗体全套VH和VL基因的扩增与scFv片段的拼接

按照invitrogen公司的TRIZOLreagent试剂盒提取脾脏中的总RNA，并使用Fermentas公司的cDNA合成试剂盒合成cDNA。然后以cDNA为模板，分别克隆出兔抗体全套VH和VL基因。PCR反应体系：上游引物2μL，下游引物2μL，cDNA 5μL，2×Taq PCR MasterMix 25μL，超纯水16μL。克隆反应条件为：94℃预变性5 min；94℃30 s， 56℃30 s，72℃ 1 min，共30 个循环；72℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并回收VH和VL目的片段。将所有回收的VH基因片段混合即得到VH基因库，同样将回收的Vκ和Vλ基因片段混合后即得到VL基因库。这两个基因库取等摩尔量为模板，在PCR系统中进行重叠延伸，即得到完整的scFv基因片段。PCR反应体系：上游引物2μL，下游引物2μL，VH基因库 3μL，VL基因库 2μL，2×Taq PCR MasterMix 25μL，超纯水16μL。克隆反应条件为：94℃预变性5 min；94℃30 s， 58℃30 s，72℃ 1 min，共25 个循环；72℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，并用胶回收试剂盒回收scFv 片段。

 7.单链抗体库的构建

将回收纯化的scFv基因产物经sfiI单酶切后克隆进入噬菌粒载体pcomb 3，连接产物电转化至大肠杆菌XL1-Blue。取2μL纯化的连接产物加入到50 μL电转化感受态中，混匀后转入冰浴的电转化杯中，在冰上放置1 min，后进行电转化。电转化条件：电容25 μF，电阻200W，电压2.5 kV，Expect t约为4.0 msec，0.2 cm电转化杯。电击后的细胞立即倒入1 mL的SOC培养基中，再用2 mL的SOC洗涤，最终加入至5 mL的SOC培养基到空试管中，37℃ 150 r/min培养1 h。转移至新试管中，并加入10 mL预热（37℃）的LB培养基中，并加入10 μL的100 mg/mL的氨苄青霉素和3 μL的50 mg/mL的四环素混匀。15mL的菌液在37℃ 250 r/min，摇2 h。用LB培养基将培养液稀释10倍和100倍，取100 μL菌液稀释液涂布在LB平板上，根据长出的菌落计算库容。从抗体库平板上随机挑取20个菌落，分别加入5 mL的LB培养基中，37℃250 r/min培养过夜，碱裂解法提取质粒，进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测scFv基因的重组率，根据重组率的结果判断抗体基因是否正确连到载体上，反应所建抗体库的质量。

 8.噬菌体单链抗体库的富集筛选

将转化后的菌液加入到100mL LB中，并加入2 mL的VCSM13噬菌体，在37℃ 300 rpm 摇2 h，后加入卡那霉素，37℃ 300 rpm 摇过夜；次日离心，上清液转移到50mL的离心管中，加入4% PEG-8000，和3%氯化钠，沉淀上清中的重组噬菌体，用含1% BSA的TBS缓冲液重悬噬菌体，即为重组噬菌体表面展示抗体库。并用0.2 μm的滤膜过滤到2 mL的离心管中，加入0.02%（w/v）的叠氮化钠，保存在4℃冰箱。

    以20 μg/mL浓度的明胶-三聚氰胺偶联物包被酶标板，100 μL/孔，4℃过夜；次日，洗涤液洗涤2 次，用0.1%的明胶封闭1 h，倒掉封闭液，加入刚刚制备的噬菌体库稀释液50μL/孔。加盖37℃恒温箱温育2 h，倒掉噬菌液。每孔加入150 μL的含0.5%tween20的TBS，用枪吹洗5下，放置5 min倒掉洗涤液，重新洗一次（第一轮吹5下，第二轮10下，第三轮15下）。倒掉洗涤液，每孔加入50 μL新配置的10 mg/mL胰蛋白酶。37℃培养30 min，将洗脱液移到2 mL的XL1-Blue培养液中。室温培养15 min后，取2μL的液体加入到200μL的LB培养基上，分别取10μL和100 μL涂布在含有Amp的平板上。其余菌液加入6 mL的LB培养基，37℃ 250 rpm，摇2 h。加入1mL的VCSM13辅助噬菌体到8mL的培养液中，并转移至100mL的LB培养基中，300 rpm，摇1.5-2 h，37℃。再加入100μL的50 mg/mL卡那霉素，300 rpm，37℃，过夜。进行第二轮筛选，如此“吸附-洗脱-扩增”的过程重复4轮。

 9.ELISA法筛选阳性克隆

从第4轮筛选的结果中，挑取5单菌落并经VCSM13辅助噬菌体拯救获得单个重组噬菌体。在酶标板上加抗原50μL/孔，4℃过夜；次日用封闭液封闭1h，倒掉封闭液，加入噬菌体稀释液50μL/孔，37℃温浴2 h，每个样品平行做两份，PBS 作为空白对照。倒去液体，用洗涤液洗涤10次，用封闭液稀释二抗HRP-anti-HA（1：1000），每孔50μL，37℃温浴1 h；每孔加50μL底物TMB反应，室温温育15min显色。每孔加入50μL终止液终止反应，酶标仪测定OD₄₅₀吸光值。筛选出OD₄₅₀值最高的克隆子B4，送英韦创津公司测序。

 10.单链抗体的可溶性表达及鉴定

提取阳性克隆子B4质粒，通过热击法将质粒转入到Rosseta菌株中，挑取单菌落，接种到5mL含氨苄青霉素的LB培养基中，250rpm，37℃，培养过夜；取5mL培养液到100 mL的LB培养基中，250 rpm，37℃，摇5-8 h，加入IPTG诱导，37℃，摇过夜。将培养的菌液4000 r/min 离心30 min，去除上清液；用含1 mmol/ L EDTA 的20% 蔗糖溶液充分悬浮沉淀，冰上静置10 min后，9000 r/min，离心10min，收集沉淀；加入5mL含5 mmol/ L MgSO4的反渗透水中，冰上静置15 min；9000 r/min，离心10min，收集上清液，即为周质蛋白提取液；用Ni-NTA亲和层析柱分离纯化scFv蛋白。SDS-PAGE分析可溶性抗体蛋白的表达情况。

 11.可溶性B4-scFv抗体的亲和力与交叉反应率分析

通过间接竞争ELISA法分析B4-scFv抗体的亲和力。根据各浓度标准品溶液所得OD₄₅₀的梯度变化，以抑制率(B/B0)×100% 为纵坐标(其中B 为加入不同浓度的三聚氰胺标准溶液所测OD值， B0为未加游离三聚氰胺所测OD值)， 三聚氰胺各标准溶液浓度为横坐标， 绘制出三聚氰胺单抗的抑制曲线。以抑制率值接近50% 所对应的三聚氰胺的浓度为IC₅₀，用IC₅₀表示单链抗体的亲和力。

通过间接竞争ELISA法分析B4-scFv抗体的特异性。以三聚氰酸和氯霉素作为竞争物用于单抗的交叉反应性研究。以单链抗体对三聚氰胺的半数抑制浓度( IC₅₀ )与单链抗体对竞争物的IC₅₀之比的百分数为其交叉反应率(CR% = IC₅₀三聚氰胺/IC₅₀三聚氰胺类似物×l00% )。

 12.B4-scFv检测牛奶中三聚氰胺含量

用纯化的B4-scFv蛋白检测纯牛奶和奶粉中三聚氰胺的含量。首先，100μL的纯牛奶加入900μL的磷酸盐缓冲液，往稀释后的溶液中加入三聚氰胺，分别配制三聚氰胺浓度为2.0, 4.0, 和8.0 mg/L的纯牛奶样品。接着，称1g的奶粉溶于5mL的0.02M醋酸盐缓冲液中，3000rpm离心5min，取100μL的上清液加入到900μL的磷酸盐缓冲液中，分别配制三聚氰胺浓度为2.5, 5.0, 和10.0 mg/L的奶粉样品。采用间接竞争ELISA法，通过回收率计算，分析B4-scFv的灵敏性。检测率（%）=（检测的量/预测的量）×100.

结果

1．scFv抗体库的富集和筛选

富集与筛选是根据ELISA原理，将抗原包被在酶标板上，通过吸附-洗脱-扩增的过程，循化反复4轮，洗涤除去非特异性和亲和力低的噬菌体，洗脱下结合的噬菌体。每一轮筛选的结果如表3，结果显示抗体库最初的库容量为1.6×10⁸，经过第一、二轮筛选后数目明显减少，第三、四轮数目逐渐上升，表明特异性单链抗体得到了富集。从第4轮筛选的结果中随机挑取15个单菌落培养，并经VCSM13辅助噬菌体拯救获得单个重组噬菌体。用ELISA法鉴定获得抗MEL的特异性单链抗体B4-scFv。经BLAST搜索比对，B4-scFv序列是日本大耳兔的抗体可变区基因序列。表4列出了B4-scFv的CDR和FR区。 

表3 抗体库的富集筛选

                     表4 B4-scFv的氨基酸序列

2.B4-scFv的可溶性表达

选用Rosseta菌表达B4-scFv，经IPTG诱导表达。采用渗透休克法提取周质蛋白并用Ni-NTA亲和层析柱分离纯化scFv蛋白，SDS-PAGE鉴定结果如图1所示，结果显示scFv的分子量约24KD。

 3.scFv抗体的亲和力和交叉反应性分析

纯化的scFv抗体采用间接竞争ELISA法（CI-ELISAs）测定其亲和力。B4-scFv的标准抑制曲线如图2，B4-scFv的IC₅₀为9.6μM。同样也采用CI-ELISA 法测定B4-scFv的交叉反应性。选取三聚氰酸和氯霉素作为竞争物，其结果如表5。B4-scFv对这两种三聚氰胺结构类似物的交叉反应性均小于1%，说明B4-scFv有较好的特异性。

表5  B4-scFv抗体的交叉反应率

4.牛奶样品中三聚氰胺的回收率

配制含不同浓度三聚氰胺的纯牛奶和奶粉，采用间接竞争ELISA法分析B4-scFv的检测灵敏度。如表6所示，B4-scFv的检测率范围在90-108%，说明B4-scFv灵敏度较高，可用于检测食品、饲料中三聚氰胺的残留。

表6 B4-scFv检测牛奶样品中的三聚氰胺

<110> 福州大学

<120> 一种抗三聚氰胺单链抗体及其应用

<160> 4

<210> 1

<211> 110

<212> PRT

<213> 日本大耳兔（Oryctolagus cuniculus）

<400> 1

Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Ala

20 25 30 

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45 

Tyr Ala Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Cys

65 70 75 80

Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Tyr Gly Gly Tyr Ser Ser Ser

85 90 95

Asn Gly Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys

100 105 110

 

<210> 2

<211> 110

<212> PRT

<213> 日本大耳兔（Oryctolagus cuniculus）

<400> 2

Gln Ser Val Glu Glu Ser Arg Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Asn Ala

20 25 30 

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45 

Ile Ile Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr

65 70 75 80

Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Gly Arg

85 90 95

Phe Ser Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

 

<210> 3

<211> 330

<212> DNA

<213> 日本大耳兔（Oryctolagus cuniculus）

<400> 3

gagctcgtga tgacccagac tccagcctct gtggaggtag ctgtgggagg cacagtcacc      60

atcagttgcc aggccagtca gagcattagc actgcattag cctggtatca gcagaaacca     120

gggcagcctc ccaagctcct gatctatgct gcatccaaac tggcatctgg ggtcccatcg     180

cggttcaaag gcagtggatc tgggacagag tacactctca ccatcagcgg cgtggagtgt     240

gccgatgctg ccacttacta ctgtctatac ggtggttata gtagtagtaa tggtggggct     300

ttcggcggag gcaccaatgt ggaaatcaaa                                      330

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<212> DNA

<213> 日本大耳兔（Oryctolagus cuniculus）

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cagtcggtgg aggagtccag gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc      60

tgcacagtct ctggaatcga cctcagtagc aatgcaatga gctgggtccg ccaggctcca     120

gggaaggggc tggaatggat cggaatcatt ggtagtagtg gtagtacata ctacgcgagc     180

tgggcgaaag gccgattcac catctccaaa acctcgacca cggtggatct gaaaatcacc     240

agtccgacaa ccgaggacac ggccacctat ttctgtgtca gggggaggtt tagcctctgg     300

ggcccaggca ccctggtcac cgtctcctca                                      330

Claims (3)

1.一种抗三聚氰胺单链抗体，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.如权利要求1所述的抗三聚氰胺单链抗体，其特征在于，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.3，编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

3.权利要求1-2任一项所述的抗三聚氰胺单链抗体在检测三聚氰胺中的应用。

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