CN112881681A - 一种SARS-CoV-2N蛋白IgA的间接ELISA检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种SARS‑CoV‑2 N蛋白IgA的间接ELISA检测方法，包括（1）包板、（2）封闭、（3）一抗孵育、（4）二抗孵育、（5）弃去酶标二抗，TMB单组分显色液100μl/孔，37℃避光显色5 min，每孔加入ELISA终止液50μl，震荡混匀，采用终点法，检测波长450nm，参比波长630nm，酶标仪检测450nm吸光度值。本发明使用NP‑IgA ELISA检测sIgA，可以尽快辅助诊断，这对于有效干预和隔离患者，防止感染进一步扩散具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，涉及一种SARS-CoV-2N蛋白IgA的间接ELISA检测方 法。
背景技术
新冠状病毒(2019-nCoV)被称为严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)， 引起冠状病毒疾病2019(COVID-19)。SARS-CoV-2通过飞沫传播，也可能通过粪口途径传 播。COVID-19病例发病症状为干咳、发热、浑身酸痛无力、腹泻，病情严重的病例的临床表现为高热、呼吸困难、血氧水平低，死亡病例多数死于呼吸衰竭以及细胞因子风暴导致的多器官衰竭。
虽然国内疫情已经得到良好有效的控制，但仍旧有很多问题需要深入的研究。目前，几 种基于聚合酶链反应(PCR)的技术检测病毒RNA是确定新冠病毒感染诊断的主要方法，但 是基于呼吸道标本的核酸检测阳性率低，单一的核酸检测结果可能会造成新冠病人漏诊，需 要开发其他方法对核酸检测进行补充，同时，实时荧光定量PCR(quantitativereal-time PCR RT-qPCR)只能检测标本中是否存在病毒，但并不能反映病例的体液免疫应答情况。
高免疫原性的N蛋白是病毒血清学诊断的重要抗原。它参与RNA包装和病毒颗粒释放， 并干扰宿主细胞的细胞周期过程。SARS-CoV-2的N蛋白的N端结构与其他冠状病毒的N蛋 白相似，但它们之间的表面静电电位特性不同。通过对N蛋白生化性质的表征分析，发现N 蛋白在溶液中主要是一种二聚体，55℃时结构最好，具有非特异性核酸结合能力。COVID-19 感染患者血清中存在抗N抗原的IgA、IgM和IgG抗体。这些引起了人们对其作为诊断标记物的注意。
SARS-CoV-2的特异性抗体，如IgG、IgM等，在免疫分析中的应用远高于IgA。然而，分泌型IgA抗体在预防呼吸道感染方面非常有效。先前对SARS-CoV的研究显示IgA、IgM 和IgG的动力学相似。因此，IgA检测作为一种特殊的诊断标志物是一种很有吸引力的选择。血清学诊断检测IgA已有报道，但COVID-19患者的痰液或咽拭子中分泌型IgA的实时变化尚未知。
发明内容
本发明的目的在于提供一种SARS-CoV-2N蛋白IgA的间接ELISA检测方法。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种SARS-CoV-2N蛋白 IgA的间接ELISA检测方法，包括下列步骤：
步骤1：将采用pH值为9.6的碳酸盐缓冲液稀释的新冠病毒核衣壳蛋白(NP)加入酶标 板，每个反应孔100μL，4℃过夜，次日用PBST缓冲液清洗酶标板反应孔3-5次，每次4-6分钟；
步骤2：向酶标板的反应孔加300μL的质量分数为5％的脱脂奶粉溶液作为封闭液进行封 闭，4℃孵育18小时；
步骤3：弃去酶标板的反应孔中液体，用PBST缓冲液清洗酶标板反应孔3-5次，每次4-6分钟；然后向反应孔分别加待检测样品100μl，同时设立空白，阳性和阴性对照，37℃湿盒孵育1.5h；所述待检测样品为待检测的不同稀释度的血清、痰液或咽拭子；
步骤4：弃去酶标板的反应孔中液体，用PBST缓冲液清洗酶标板反应孔3-5次，每次4-6分钟；每个反应孔添加PBST稀释的HRP-山羊抗人IgA 100μl，37℃温育1h；
步骤5：弃去酶标板的反应孔中液体，用PBST缓冲液清洗酶标板反应孔3-5次，每次4-6分钟；酶标板的反应孔每孔添加TMB单组分显色液100μl，37℃避光显色5min，酶标板 反应孔每孔加入ELISA终止液50μl，震荡混匀；
步骤6：采用终点法，检测波长450nm，参比波长630nm，酶标仪检测450nm吸光度值；当OD450nm值大于或等于0.235，判定为为阳性，OD450nm值小于0.235则判定为阴性。
优选的技术方案为：步骤1中，采用pH值为9.6的碳酸盐缓冲液将新冠病毒核衣壳蛋白 稀释至浓度为5μg/ml，然后加入酶标板的反应孔中。
优选的技术方案为：步骤3中，如果待检测样品为血清，则待检测血清与ELISA抗体稀 释液的体积比为1：200；如果待检测样品为咽拭子或痰液，则均为原液。
优选的技术方案为：步骤4中，HRP-山羊抗人IgA与ELISA抗体稀释液的体积比为1：100000。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
本发明使用NP-IgA ELISA检测sIgA，可以尽快辅助诊断，这对于有效干预和隔离患 者，防止感染进一步扩散具有重要意义。
附图说明
图1为COVID-19NP-IgA ELISA检测非新冠病人和新冠病人结果。
图2为NP-IgA ELISA检测新冠病人不同时间点不同标本的阳性率。
图3为NP-IgA ELISA检测新冠病人不同时间点不同样本的阳性率比较。
图4为NP-IgA ELISA检测28个新冠病人不同样本IgA抗体阳性出现时间和抗体转阴时 间分布图。
图5为NP-IgA ELISA检测新冠病人不同时间点不同样本的的OD450nm均值比较。
图6为NP-IgA ELISA检测新冠病人不同时间点不同样本的的OD450nm值。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭 露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
请参阅图1-6。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合 说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限 定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不 影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能 涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间” 及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关 系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
实施例：一种SARS-CoV-2N蛋白IgA的间接ELISA检测方法
本实施例建立了核衣壳蛋白IgA间接ELISA法(NP-IgA-ELISA)。28例COVID-19患者在不同时间点连续采样。用NP-IgA-ELISA法检测血清中N蛋白非分泌性IgA、痰液和咽 拭子中N蛋白分泌性IgA。对患者各标本中IgA的变化进行统计学分析。
2.1.1临床标本
在2020年2月8日至2020年8月25日期间，28例COVID-19患者的连续标本包括疾病各阶段的血清、痰液和咽拭子由安徽省疾病预防控制中心、阜阳市疾控中心、阜阳市第二人民医院共同提供。早期的痰液和咽拭子标本经RT-PCR诊断为COVID-19。痰标本和咽拭子标本收集后分别放置在3mL的病毒转运介质中。
30份艾滋病患者(HIV)血清，30例乙型肝炎患者(HBV)血清和30例丙型肝炎患者(HCV) 血清由马鞍山市疾控中心提供。他们还收集了30例不明原因发热患者(UF)和30例H1型 流感患者(H1)的咽拭子标本。30例健康人血清标本、30例健康人咽拭子和30例健康人痰液标本由安徽省阜阳市第二人民医院提供。痰标本和咽拭子标本收集后分别放置在3 mL的病 毒转运介质中。
本研究经过伦理委员会审查批准，批准号为2020H015。
2.1.2试剂和仪器
新冠病毒核衣壳蛋白(N蛋白，NP)购自北京泰和健生物医药研发有限公司；辣根过氧 化物酶(HRP)标记的山羊抗人IgA购自美国Abcam公司；酶标板购自美国coring公司；PBS粉剂购自北京中衫金桥生物技术公司；Tween-20购自生工生物工程(上海)股份有限公司；脱脂奶粉购自伊利公司；一抗稀释液购自碧云天公司；ELISA包被液、TMB单组分显色液和ELISA终止液购自北京索莱宝科技有限公司。酶标仪、洗板机购自美国BioTek公司。
2.2方法
2.2.1COVID-19NP-IgA ELISA实验步骤
1)包板：pH 9.6碳酸盐缓冲液稀释NP抗原，100μl/孔，4℃湿盒过夜；
2)封闭:次日弃去包被液，PBST洗涤酶标反应孔4次，每次5min，甩干，5％脱脂奶粉300μl/孔封闭，4℃湿盒孵育18h；
3)一抗孵育：：弃去封闭液，同上洗涤，血清样品、痰液或咽拭子100μl/孔，同时设立 空白，阳性和阴性对照，37℃湿盒孵育1.5h；
4)二抗孵育：弃去样品，同上洗涤，PBS稀释的HRP-羊抗人IgA 100μl/孔，37℃温育1h；
5)弃去酶标二抗，同上洗涤，TMB单组分显色液100μl/孔，37℃避光显色5min，每孔加入ELISA终止液50μl，震荡混匀，采用终点法，检测波长450nm，参比波长630nm，酶 标仪检测450nm吸光度值。
2.2.2COVID-19NP-IgA ELISA最佳反应条件的优化
利用棋盘滴定法进行预实验。将30份新冠病毒感染者混合血清(阳性混合血清)及30份 正常人混合血清(阴性混合血清)进行预实验，在血清稀释度确定的情况下，以阳性血清与阴 性血清OD450nm值差值最大时的抗原浓度为最佳抗原包被浓度；在确定最佳抗原包被浓度 的情况下，以阳性血清与正常人混合血清OD450nm值比值(P/N)最大时的血清稀释度为最佳 血清稀释度；在确定最佳抗原包被浓度和血清稀释度的情况下，OD450nm值阳性值在1.0左 右、阴性值在0.2左右时的HRP-羊抗人IgG稀释度为其工作浓度。
2.2.3阳性阈值(cut off value)的确定
计算30份健康人血清标本
及标准差(SD)，判定临界值则为
为0.235，当待测样 本OD450nm值大于或等于0.235，判定为为阳性，OD450nm值小于0.235则判定为阴性。
2.2.4COVID-19NP-IgA ELISA的敏感性
使用COVID-19NP-IgA ELISA法分别检测30例COVID-19患者感染后15-21天痰液、咽拭子和血清标本中SARS-CoV-2特异性NP-IgA抗体水平，评价该实验方法的敏感性。
2.2.5COVID-19NP-IgA ELISA的特异性
使用COVID-19NP-IgA ELISA法分别检测30例健康人血清、30例健康人咽拭子和30例健康人痰液标本中SARS-CoV-2特异性NP-IgA抗体水平，评价该实验方法的特异性。
2.2.6COVID-19NP-IgA ELISA的交叉反应性
使用COVID-19NP-IgA ELISA法分别检测30例HIV、30例HBV和30例HCV患者血 清，30例UF和30例H1患者咽拭子中SARS-CoV-2特异性IgA抗体水平，评价该法的交叉 反应性。
2.2.7COVID-19NP-IgA ELISA的稳定性
选择3份强阳性新冠患者血清、3份弱阳性新冠患者血清与1份新冠患者阳性混合血清使 用建立的间接ELISA法进行检测，每份样本重复3次进行组内稳定性检测；在抗原包被后1 天、1个月、6个月后分别对以上样本进行重复性检测，检测组间稳定性。计算组内、组间平 均值、标准差与变异系数，评价本方法的稳定性。
2.2.8NP-IgA ELISA检测临床样本
在确定NP蛋白最适包被浓度、样本稀释度以及酶标IgA二抗的最佳工作浓度的基础上， 用NP-IgA ELISA法分别检测28位COVID-19患者的连续标本包括疾病各阶段的血清、痰液 和咽拭子样本(感染后1-7天、8-14天、15-21天、30天、60天、90天、120天、180天)。 每个样品复孔检测，同时设立阴性对照、阳性对照和空白对照。全自动酶标仪测定OD450nm值，与cut off值比较，高于此值的为阳性。
2.3统计学分析
IgA-ELISA法检测的痰液、咽拭子和血清在不同时间点的OD450值比较用重复测量方差 分析或多独立样本非参数检验。用卡方检验或Fisher精确检验比较血清、咽拭子和痰液中 IgA-ELISA阳性率。p<0.05被认为具有统计学意义。
3.结果
3.1成功建立COVID-19NP-IgA ELISA
根据棋盘滴定实验，成功建立COVID-19NP-IgA ELISA。其中NP蛋白包被浓度为5μg/ml， 血清稀释度为1:200，咽拭子和痰液均为原液。HRP-山羊抗人IgA稀释度为1:100,000。 COVID-19NP-IgA ELISA的cut off值为0.235。
3.2COVID-19NP-IgA ELISA的敏感性
NP-IgA-ELISA检测COVID-19患者恢复期痰液、咽拭子和血清中的敏感性均为100％ (30/30，如图1所示)。
3.3COVID-19NP-IgA ELISA的特异性
健康志愿者，包括30份血清样本、30份痰样本和30份喉部拭子样本，使用NP-IgA-ELISA 法均未检测出IgA阳性。该方法特异性为100％(如图1所示)。
3.4COVID-19NP-IgA ELISA的交叉反应性
NP-IgA-ELISA检测H1流感患者及不明原因发热(UF)咽拭子标本均未检测出IgA阳性 反应。此外，乙型肝炎(HB)、丙型肝炎(HC)或艾滋病(HIV)患者的血清中亦未发现交 叉反应。该方法的交叉反应性为100％(如图1所示)。
3.4COVID-19NP-IgA ELISA的稳定性
强阳性血清组内值1.767±0.036、1.656±0.035、1.749±0.093，组内变异系数2.037％、 2.113％、5.317％，组间值1.694±0.089、1.631±0.104、1.754±0.191组间变异系数5.253％、6.376％、10.889％；
弱阳性血清组内值0.763±0.031、0.689±0.046、0.624±0.062，组内变异系数4.062％、 6.676％、9.935％，组间值0.727±0.065、0.651±0.023、0.672±0.083，组间变异系数8.941％、 3.533％、12.351％；
阳性混合血清组内值1.763±0.061，组内变异系数3.460％，组间值1.721±0.124，组间 变异系数7.205％。
该结果表明NP-IgA ELISA法检测新冠病人的标本时稳定性较好。
3.5COVID-19NP-IgA ELISA检测新冠病人临床样本
所有的早期新冠病人(发病一周内)痰液标本都是阳性，而且在发病第1天时就能检测到 (如图2-4)。新冠病人的早期咽拭子标本阳性率为85.71％(24/28)，在病人发病第1天时能检 测到(如图2-4)。遗憾的是，同一批病人的血清抗体阳性率为42.86％(12/28),在病人发病第 3天时能检测到(如图2-4)。统计学分析结果显示，在新冠病人发病早期，NP-IgA ELISA检 测痰液的阳性率显著高于检测血清的阳性率，早期检测阳性率高达100％。同时NP-IgA ELISA 检测咽拭子的阳性率也显著高于检测血清的阳性率，早期检测阳性率为85.71％。而NP-IgA ELISA检测痰液的阳性率和检测咽拭子的阳性率无显著性差异。而且IgA ELISA检测痰液的 OD450值比血清和咽拭子的OD450值明显偏高，差异具有显著性(调整后p<0.001，见图4-5). 这些结果说明痰液和咽拭子中的NP-IgA具有较好的早期诊断价值。
在发病中期(8-14天)和治疗期(15-21天)，我们同样检测了病人痰液、咽拭子和血清 中的IgA。三种标本中IgA阳性率均为100％(如图2-4)。
在恢复期，发病后1个月时，病人血清中IgA的阳性率为100％，痰液中IgA的阳性率为 60.71％(17/28),咽拭子中IgA的阳性率为57.14％(16/28)。此时，病人痰液及咽拭子中的IgA 已有部分阴转(见表1，图2-3)。经统计学分析发现，NP-IgA ELISA检测痰液与检测咽拭子 的阴转率相比，无显著性差异；痰液中NP-IgA与血清中NP-IgA的抗体阴转率相比，有显著 性差异；咽拭子中NP-IgA的抗体阴转率也明显高于血清中NP-IgA的抗体阴转率(P<0.01)。
在恢复期，发病后2个月时，病人血清中IgA的阳性率为100％，且OD450值没有下降的趋势。而痰液和咽拭子中IgA的的阳性率为46.43％(13/28)，已有一半以上的病人阴转，且其OD450值明显降低(见表1，图2-5)。统计学分析发现，痰液及咽拭子中NP-IgA的抗 体阴转率明显高于血清中NP-IgA的抗体阴转率(P<0.01)。而且IgA ELISA检测血清的OD450 值比咽拭子和痰液的OD450值明显偏高，差异具有显著性(p<0.001，见图5-6)。
在恢复期，发病后3个月时，COVID-19病人血清中IgA的阳性率为100％，OD450值也没有下降的趋势。而痰液和咽拭子中IgA的阳性率为35.71％(10/28，见图2-4)。统计学分析结果显示，分泌型IgA的阴转率显著高于非分泌型IgA的阴转率。且IgA ELISA检测分泌型IgA的OD450值也显著偏低(见图5-6)。
在恢复期，发病后4个月时，病人血清中IgA的阳性率仍为100％，OD450值没有下降的 趋势。而痰液和咽拭子中IgA的阳性率均为10.71％(3/28)，大部分病人IgA已经转阴，且其OD450值明显降低(见图2，图3-6)。通过统计学分析，分泌型IgA的阴转率同样显著高 于非分泌型IgA的阴转率。且IgA ELISA检测分泌型IgA的OD450值也显著偏低。大部分 OD450值基本已接近于正常值。检测结果显示分泌型IgA的阳性率及OD450值与正常组相 比，无统计学意义。
在发病6个月后，所有病人的痰液及咽拭子中均检测不到NP-IgA antibody(0％,0/28)， 一半以上的病人血清中也已检测不到该抗体(46.43％,13/28，见图2-6)。统计学分析结果显 示，sIgA阴转率显著高于血清中IgA，而该时间点病人血清中IgA阴转率显著高于4个月时。 同时该时间点的病人血清中IgA的OD450值明显低于4个月时(见图5-6)。
4.讨论
SARS-CoV-2作为一种黏膜靶向病毒，能刺激宿主产生分泌型IgA(sIgA)，并诱导机体 产生较强的黏膜免疫24-26。与粘膜sIgA相比，血清中非分泌型IgA不具有这些功能。最近的 一篇报导指出，具备交叉活性的人IgA单抗能高效地阻断SARS-CoV与SARS-CoV-2刺蛋白与转基因293T细胞上ACE2的结合，而IgG则没有该功能，提示sIgA在SARS-CoV-2感染 中起重要作用27。因此检测IgA不仅可以作为COVID-2019的诊断方案之一，其表达随时间 的变化也可以做为个体化病情发展程度和临床风险的参考指标，特别是在后续评估康复者的获得性免疫记忆效能上具有巨大的提示作用。为此我们首次通过NP-IgA ELISA检测痰液和咽拭子确定分泌型IgA表达，通过检测血清确定非分泌型IgA表达。
令人振奋的是,我们的结果显示部分新冠病人痰液和咽拭子中iga是在发病后第一天就检 测出阳性反应，痰液、咽拭子的IgA转为阳性的中位时间分别为发病后第3和4天。而且， 病人痰液中Iga发病后在一周内全部能够检测到。血清中的IgA转为阳性的中位时间为发病 后第10天，与其他实验室报道的基本接近。然而，其他研究表明，IgM和IgG的第一个血清 转化日是发病后5天。IgM和IgG的中位转化时间分别为14天和14天。病毒特异性IgG阳性患者比例在症状出现后17-19天达到100％，而病毒特异性IgM阳性患者比例在症状出现后 20-22天达到94.1％的峰值。该研究证明在时间窗口上分泌型IgA要在IgG和IgM之前更早 出现，窗口期期提前约10天。因此检测分泌型IgA能尽快地辅助诊断，对于有效干预和隔离 病人，防止传染进一步扩大具有重要意义。
最令人惊讶的是，根据我们的结果，与非分泌性IgA相比，分泌性IgA在恢复期会迅速 转为阴性。病人的痰液和咽拭子中的sIgA在发病一个月后已部分转为阴性。超过半数的COVID-19患者在发病后两个月时sIgA为阴性，有趣的是，新冠患者在6个月时IgA已全部 转为阴性。这些结果表明，分泌型IgA在肺上皮的早期免疫保护作用是有时间限制的。这种 在香港第二次感染的病例也表明，即使在痊愈后，COVID-19患者也可能不是“终生免疫”。 这些现象表明分泌型IgA在获得性免疫中起重要作用。此外，分泌型IgA的持续时间也可作 为疫苗接种间隔的参考。
另外，从检测的便捷性和安全性角度考虑，分泌型IgA相较于非分泌型IgA还具有额外 的好处：痰液与咽拭子采样均为非侵入性采样。特别是痰液采样，比咽拭子采样更快速、方 便，受检者没有任何痛苦。痰中分泌型IgA检测已成功用于肺炎支原体和铜绿假单胞菌的辅 助诊断。我们的结果也证实了痰液IgA检测与咽拭子IgA检测一样，都可以满足针对SARS-CoV-2的诊断需求。
同时NP-IgA ELISA在检测非新冠病人的标本中显示出良好的特异性。在检测正常人的血 清、痰液及咽拭子时均未出现假阳性。用来检测其他非SARS-CoV-2感染者，如HB、HC、 AIDS、UF或H1流感时，也没有交叉反应。该检测方法的总体特异性为100％。
综上研究结果表明，COVID-19NP-IgA ELISA具有优良的特异性和敏感性。使用NP-IgA ELISA检测sIgA的窗口期比血清中IgA早10天左右。因此，使用NP-IgA ELISA检测sIgA可以尽快辅助诊断，这对于有效干预和隔离患者，防止感染进一步扩散具有重要意义。同时， NP-IgA ELISA检测结果显示sIgA在恢复期迅速转为阴性。剖析SARS-CoV-2感染期间sIgA 的反应，将有助于提高对病毒与宿主相互作用和疾病免疫病理机制的认识。此外，sIgA的持 续时间也可作为疫苗接种间隔的参考。
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之 限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本 发明意图保护之范畴。
Claims (4)
1.一种SARS-CoV-2N蛋白IgA的间接ELISA检测方法，其特征在于：包括下列步骤：
步骤1：将采用pH值为9.6的碳酸盐缓冲液稀释的新冠病毒核衣壳蛋白加入酶标板，每个反应孔100μL，4℃过夜，次日用PBST缓冲液清洗酶标板反应孔3-5次，每次4-6分钟；
步骤2：向酶标板的反应孔加300μL的质量分数为5%的脱脂奶粉溶液作为封闭液进行封闭，4℃孵育18小时；
步骤3：弃去酶标板的反应孔中液体，用PBST缓冲液清洗酶标板反应孔3-5次，每次4-6分钟；然后向反应孔分别加待检测样品100 μl，同时设立空白，阳性和阴性对照，37℃湿盒孵育1.5h；所述待检测样品为待检测的不同稀释度的血清、痰液或咽拭子；
步骤4：弃去酶标板的反应孔中液体，用PBST缓冲液清洗酶标板反应孔3-5次，每次4-6分钟；每个反应孔添加PBST稀释的HRP-山羊抗人IgA 100 μl，37 ℃温育1h；
步骤5：弃去酶标板的反应孔中液体，用PBST缓冲液清洗酶标板反应孔3-5次，每次4-6分钟；酶标板的反应孔每孔添加TMB单组分显色液100 μl，37℃避光显色5 min，酶标板反应孔每孔加入ELISA终止液50 μl，震荡混匀；
步骤6：采用终点法，检测波长450nm，参比波长630nm，酶标仪检测450nm吸光度值；当OD450nm值大于或等于0.235，判定为为阳性，OD450nm值小于0.235则判定为阴性。
2.根据权利要求1所述的SARS-CoV-2N蛋白IgA的间接ELISA检测方法，其特征在于：步骤1中，采用pH值为9.6的碳酸盐缓冲液将新冠病毒核衣壳蛋白稀释至浓度为5μg/ml，然后加入酶标板的反应孔中。
3.根据权利要求1所述的SARS-CoV-2N蛋白IgA的间接ELISA检测方法，其特征在于：步骤3中，如果待检测样品为血清，则待检测血清与ELISA抗体稀释液的体积比为1：200；如果待检测样品为咽拭子或痰液，则均为原液。
4.根据权利要求1所述的SARS-CoV-2N蛋白IgA的间接ELISA检测方法，其特征在于：步骤4中，HRP-山羊抗人IgA与ELISA抗体稀释液的体积比为1：100000。
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