CN112462059A - 一种SARS-CoV-2S蛋白IgG的间接ELISA检测方法 - Google Patents

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Abstract

一种SARS‑CoV‑2S蛋白IgG的间接ELISA检测方法，包括下列步骤：将采用ELISA包被液稀释的新冠病毒刺突蛋白加入酶标板，每孔100μL，4℃过夜，PBST缓冲液清洗；加250μL 5%的脱脂奶粉溶液进行封闭，ELISA抗体稀释液稀释待检测血清作为一抗，每孔加100μL一抗，37℃孵育1h；ELISA抗体稀释液稀释的辣根过氧化物标记抗人IgG作为二抗，每孔加100μL二抗，37℃孵育45min，每孔避光加入100μL单组分TMB显色液，37℃孵育5min，每孔加入50μL终止液，检测波长450nm，参比波长630nm，酶标仪检测450nm吸光度值OD450nm值。

Description

一种SARS-CoV-2S蛋白IgG的间接ELISA检测方法
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，涉及一种SARS-CoV-2S蛋白IgG的间接ELISA检测方法。
背景技术
在2019年12月发现的与严重肺炎相关的冠状病毒科新成员最初被称为2019新冠状病毒(2019-nCoV)，目前被称为严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)，引起冠状病毒疾病2019(COVID-19)。SARS-CoV-2与另一种人类冠状病毒(severe acuterespiratory syndrome coronavirus(SARS-CoV))有着高度同源性。SARS-CoV-2通过飞沫传播，也可能通过粪口途径传播。COVID-19病例发病症状为干咳、发热、浑身酸痛无力、腹泻，病情严重的病例的临床表现为高热、呼吸困难、血氧水平低，死亡病例多数死于呼吸衰竭以及细胞因子风暴导致的多器官衰竭。冠状病毒表面的同源三聚体介导病毒进入宿主，这是一种跨膜刺突糖蛋白，是抗体产生的主要靶点，SARS-CoV与SARS-CoV-2Spike蛋白(Sprotein)通过与血管紧张素酶2(ACE2)相互作用进入靶细胞，以SARS-CoV-2S蛋白为抗原制备的多克隆抗体可以有效地抑制SARS-CoV-2假病毒进入靶细胞，但机体产生抗体的变化规律目前还有待于人们进一步认识。
虽然疫情已经得到良好有效的控制，但仍旧有很多问题需要深入的研究。目前，几种基于聚合酶链反应(PCR)的技术检测病毒RNA是确定新冠病毒感染诊断的主要方法，但是基于呼吸道标本的核酸检测阳性率低，单一的核酸检测结果可能会造成新冠病人漏诊，需要开发其他方法对核酸检测进行补充，同时，实时荧光定量PCR(quantitative real-timePCR RT-qPCR)只能检测标本中是否存在病毒，但并不能反映病例的体液免疫应答情况。
发明内容
本发明的目的在于提供一种SARS-CoV-2S蛋白IgG的间接ELISA检测方法。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种SARS-CoV-2S蛋白IgG的间接ELISA检测方法，其特征在于：包括下列步骤：
步骤1：将采用ELISA包被液稀释的新冠病毒刺突蛋白加入酶标板，每孔100μL，4℃过夜，然后用PBST缓冲液清洗酶标板三次，每次静置1分钟；
步骤2：向酶标板的每孔加250μL的质量分数为5％的脱脂奶粉溶液进行封闭，4℃过夜，然后用PBST缓冲液清洗酶标板三次，每次静置1分钟；
步骤3：将ELISA抗体稀释液稀释待检测血清作为一抗，向步骤2得到的酶标板的每孔加100μL一抗，37℃孵育1h，然后用PBST缓冲液清洗酶标板三次，每次静置1分钟；
步骤4：将ELISA抗体稀释液稀释的辣根过氧化物标记抗人IgG作为二抗，向步骤3得到的酶标板的每孔加100μL二抗，37℃孵育45min，然后用PBST缓冲液清洗酶标板三次，每次静置1分钟；
步骤5：步骤4得到的酶标板的每孔避光加入100μL单组分TMB显色液，37℃孵育5min，每孔加入50μL终止液，震荡混匀，采用终点法，检测波长450nm，参比波长630nm，酶标仪检测450nm吸光度值OD450nm值；
步骤6：当OD450nm值大于或等于0.3，判定为为阳性，OD450nm值小于0.3则判定为阴性。
优选的技术方案为：步骤1中，采用ELISA包被液稀释新冠病毒刺突蛋白，得到浓度至浓度为2μg/mL，然后加入酶标板的孔中。
优选的技术方案为：步骤3中，待检测血清与ELISA抗体稀释液的体积比为1：100。
优选的技术方案为：步骤4中，辣根过氧化物标记抗人IgG与ELISA抗体稀释液的体积比为1：50000。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
本发明使用SARS-CoV-2的Spike蛋白(S蛋白)作为检测抗原，通过方法的特异性、敏感性和可重复性评价，建立了一套针对SARS-CoV-2S蛋白IgG(SP-IgG)的间接ELISA检测方法，同时对165名SARS-CoV-2确诊病例的连续样本进行检测，并对50名病例进行长时间的追踪检测，以求了解IgG抗体的在疾病进程中的变化规律，为临床诊断方法完善和疫苗研发提供科学数据。
附图说明
图1为间接酶联免疫吸附法检测IgG的特异性和敏感性。乙型肝炎，丙型肝炎，肺结核和呼吸道疾病阳性血清与SARS-CoV-2S抗原无交叉反应。
图2为发病不同时间段的RNA RT-qPCR方法与S蛋白IgG的间接ELISA检测方法的检测阳性率比较。
图3为IgG水平在发病第一天至第四个月的的变化趋势。
图4为9名具有连续样本的患者他们的IgG水平变化趋势。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
请参阅图1-4。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
本申请使用的材料与试剂包括：新冠病毒刺突蛋白(S蛋白)购自上海近岸科技有限公司。辣根过氧化物标记抗人IgG购自美国Abcam，酶标板购自美国康宁公司，ELISA抗体稀释液购自上海碧云天，Twen-20、ELISA包被液、单组分TMB显色液、ELISA终止液购自Solarbio，病毒核酸提取试剂盒购自江苏生物工程技术有限公司，SARS-COV-2核酸检测试剂盒购自上海伯杰医疗科技有限公司。165例新冠肺炎病例共388份阳性血清，HBV、HCV、类风湿、肺结核和呼吸道其他相关疾病病例血清样本各30份，2018年以前收集的40份健康人血清，都有申请人收集得到，本研究经过伦理委员会审查批准。将30份新冠病人混合血清(阳性血清)及30份正常人混合血清(阴性血清)进行预实验。随机选择40份新冠病例的阳性血清，每份取出等体积血清均匀混合作为混合阳性血清，同样抽取40份2018年收集的健康人血清等体积均匀混合作为混合阴性血清，用于本研究的阳性与阴性对照。
本申请使用的实验仪器包括：酶标仪、洗板机产于美国BioTek公司。
实施例：一种SARS-CoV-2S蛋白IgG的间接ELISA检测方法
1.2.1间接ELISA法检测方法
1.2实验方法
1.2.1间接ELISA法检测方法
使用ELISA包被液稀释的S蛋白，每孔100μL，4℃过夜，PBST缓冲液洗板三次，每次静置1分钟；每孔加250μL5％脱脂奶粉进行封闭，4℃过夜，洗板同上。使用ELISA抗体稀释液稀释混合阳性血清与混合阴性血清作为一抗，每孔加100μL一抗，37℃孵育1h，洗板三次。ELISA抗体稀释液稀释辣根过氧化物标记抗人IgG作为二抗，每孔加100μL二抗，37℃孵育45min，洗板三次；每孔避光加入100μL单组分TMB显色液，37℃孵育5min，每孔加入50μL终止液，震荡混匀，采用终点法，检测波长450nm，参比波长630nm，酶标仪检测450nm吸光度值。
1.2.2间接ELISA法最佳反应条件的优化
使用棋盘法对间接ELISA法各检测条件进行优化。S蛋白稀释为0.1μg/ml、1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml包被酶标板；血清稀释度1：10、1：50、1：100、1：200；二抗稀释度1：10000、1：50000、1：100000。采用阳性值接近1，阴性值接近0.1，且阳性混合血清OD值/阴性混合血清OD值(P/N值)最大时，确定适合的蛋白包被浓度、一抗稀释倍数、二抗稀释倍数。
1.2.3间接ELISA法判定临界值的确定
采用实验室保存的新冠爆发前正常人血清40份做间接ELISA法检测，在1.2.2最优条件下，测得40份样本OD450nm值。计算40分样本平均值
Figure BDA0002801321580000041
及标准差(SD)，则判定临界值则为
Figure BDA0002801321580000042
当待测
Figure BDA0002801321580000043
时则判定为阳性，若
Figure BDA0002801321580000044
Figure BDA0002801321580000045
时则判定为阴性。
1.2.4间接ELISA法的特异性
使用建立的间接ELISA法分别检测HBV、HCV、类风湿、肺结核和呼吸道其他相关疾病患者血清中SARS-CoV-2特异性IgG抗体水平，评价方法的特异性。
1.2.5灵敏性
使用建立的间接ELISA法确诊的165名COVID-19患者恢复期血清进行SP-IgG抗体检测，分别计算阳性例数所占患者总数百分比，评价方法的灵敏性。
1.2.6重复性试验
选择3份强阳性清、3份弱阳性血清与1份阳性混合血清使用建立的间接ELISA法进行检测，每份样本重复3次进行组内稳定性检测；在抗原包被后1天、1个月、5个月后分别对对以上样本进行重复性检测，检测组间稳定性。计算组内、组间平均值、标准差与变异系数，评价本方法的稳定性。
1.2.7患者咽拭子的核酸检测
对165名患者不同发病时间采集的咽拭子病毒核酸提取试剂盒提取RNA进行RT-qPCR检测，扩增检测SARS-Cov-2开放阅读框架1ab(ORF1ab)和核衣壳蛋白(N)的基因，扩增曲线呈s形、Ct值≤37判定为阳性，Ct值＞37或检测不到时判定为阴性。
1.2.8新冠病人血清IgG抗体变化规律
对收集的165名SARS-CoV-2患者共388份不同时期血清进行间接ELISA法检测、并分析他们的SP-IgG抗体随病程发展的变化情况。
1.2.9数据分析
所有数据均使用Graphpad软件进行绘制分析。连续变量数据表示为平均值±标准差。分类变量表示为平均值±标准差和百分比。
2结果
2.1间接ELISA法最佳反应条件
通过棋盘法对包被蛋白浓度、血清稀释倍数、二抗稀释倍数的调整，确定出检测血清IgG抗体最佳反应条件为：S蛋白浓度2μg/mL，血清1：100倍稀释，HRP标记抗人IgG 1：50000倍稀释.
2.2 IgG检测临界值
对40份阴性血清的检测结果进行统计学分析：
IgG:平均值
Figure BDA0002801321580000046
标准差SD＝0.06，临界值
Figure BDA0002801321580000047
所以检测样本的IgG时OD450nm值≥0.3判定为为阳性，OD450nm值＜0.3则判定为阴性。
2.3特异性
使用建立的间接ELISA法对30份HBV、30份HCV、30份类风湿、30份肺结核与30份呼吸道其他相关疾病的患者血清进行特异性的IgG的检测，检测结果显示这些患者血清的SP-IgG OD450nm值均为阴性，S蛋白在检测SP-IgG时特异性为100％(150/150)。结果如图1。
2.4灵敏性
SP-IgG灵敏性为99.4％(164/165)。
2.5重复性
通过间接ELISA法对3份强阳性清(OD450nm值高于阳性平均值，IgG：0.711)、3份弱阳性血清(OD450nm值低于阳性平均值)与1份阳性混合血清进行组内与组间的重复性检测，如表所示，检测血清SP-IgG：强阳性血清组内值0.944±0.039、0.927±0.035、1.017±0.012，组内变异系数4.189％、3.802％、1.17％，组间值0.912±0.091、0.927±0.135、1.05±0.141组间变异系数10.002％、14.568％、13.441％；弱阳性血清组内值0.652±0.045、0.549±0.056、0.524±0.042，组内变异系数9.322％、5.457％、8.376％，组间值0.627±0.067、0.581±0.029、0.46±0.037，组间变异系数6.883％、10.192％、7.918％；阳性混合血清组内值0.953±0.067，组内变异系数6.888％，组间值0.921±0.062，组间变异系数6.75％。
2.6不同时间核酸阳性率与抗体阳性率的比较
对165份患者的咽拭子RT-qPCR检测结果进行汇总，统计不同发病时间RT-qPCR、间接ELISA检测SP-IgG阳性率。发病1～3天RT-qPCR检测阳性率(60％)高于间接ELISA法SP-IgG(43％)检测阳性率；在发病的第4-6天，SP-IgG阳性率(70％)超过RT-qPCR(47％)。SP-IgG阳性率由发病第1天的43％在发病的16～18天增长到100％。结果如图2、表2。
2.7COVID-19患者IgG抗体OD450nm值变化趋势
在收集到的388份血清中，分别为165名COVID-19患者发病1天至发病6个月的血清，对间接ELISA法检测SP-IgG结果进行统计，以发病天数时间线为横坐标，以COVID-19血清中SP-IgG OD450nm值为纵坐标，来绘制抗体变化的折线图。折线图绘制了抗体的均值与标准差。图3一定程度上反映了患者自发病以来不同天数内SP-IgG抗体OD值水平的变化情况。
SP-IgG在1～28天呈现一个升高趋势，OD值：1～7天0.3660±0.1724、8～14天0.5693±0.2380、15～21天0.8±0.2763、22～28天0.8957±0.1992，在28天至所观察的4个月内维持高水平抗体平台期状态，6个月左右抗体水平下降明显，6个月与4个月的抗体水平差异有统计学意义(P＝0.0013,P＜0.01)，OD值：29～35天0.8489±0.2232、36～49天0.7627±0.1883、50～63天0.7661±0.2646、3个月0.7904±0.1592、4个月0.7296±1380、6个月0.5486±0.2096。结果如图2、3。
2.8新冠患者连续血清样本抗体变化规律研究
图2和图3是由不同病人不同天数的数据进行绘制，有些患者仅有发病后某一次或某两次样本，对抗体变化的整体趋势有一定的干扰，我们挑选出从发病早期直至发病4个月有连续血清样本9位患者绘制了他们得SP-IgG变化折线，可以观察到他们的SP-IgG变化与图3的变化趋势基本保持一致，我们还观察到一位患者的SP-IgG一直为阴性而SP-IgM可以被检测到。其中患者1、2、4、5、7、9在发病较早的时间段时，他们的SP-IgM OD450nm值均高于SP-IgG，说明SP-IgM在早期诊断中具有一定价值。
3讨论
到目前为止，新冠病毒感染的确诊主要使用病毒核酸检测方法。尽管RT-qPCR检测具有较高的灵敏度，但核酸检测需要的咽拭子样本采集，由于采集手法的差异，样本在质量上难以控制，易造成采样不当而引起的阴性结果，且许多疑似病人在确诊前需要在一段时间内采集多分样本，造成患者不能获得及时治疗的机会；同时采集咽拭子或痰液会增加样本采集人员感染的风险。
而ELISA方法操作简单、节省时间、成本较低且具有良好的特异性和敏感性，适用于大规模样本检测，是一种广泛用于临床诊断的方法。我们的研究表明，在发病的第一天患者血清IgG抗体检出率分别是46％和43％，与核酸检测的60％的阳性率是一个较好的补充，尤其是核酸检测阴性的患者，可以增加IgG抗体检测。
以新冠病毒S蛋白作为包被抗原，优化了工作条件建立了新冠病毒抗体间接ELISA检测方法。具有良好的特异性、敏感性与重复性。SP-IgG与本研究涉及到的五种疾病血清无交叉反应，方法特异性为100％。
我们的结果显示，在患者发病1～3天，RT-qPCR检测阳性率(60％)高于SP-IgM检测阳性率，约在发病的第5天核酸检测和IgM抗体检测阳性率折线图相交，检出率低于50％，随后IgM抗体阳性率逐渐升高，并于发病22天达到100％检出率，IgG抗体总体来说自发病1-3天开始就一直持续升高，并于16天达100％，而核酸随发病时间延长，检出率在发病1-3天最高，为60％，随后核酸阳性率一直呈降低趋势至消失。因此本方法可作为该病毒核酸检之外的一种检测辅助手段，血清IgG抗体检测与核酸检测相结合，有利于对SARS-CoV-2感染患者的早发现、早治疗和早隔离，有利于疾病的防控。
研究结果显示，SP-IgG在患者发病的第一个月内都是不断升高的，这与其他已经报道的数据相一致，但是目前还没有研究报道IgM、IgG在COVID-19患者体内持续的时间。
在本研究中，我们挑选9名有较多次数连续血样的COVID-19患者的抗体检测结果单独绘制出抗体随时间变化趋势曲线，除了患者9的SP-IgG一直为阴性，未见阳转外，其余8名患者的IgM和IgG抗体在发病早期均出现阳性，其中6名患者的SP-IgM水平升高早于SP-IgG(图4)。报道中也有部分患者的IgM血清转换早于IgG，因此SP-IgM在COVID-19的早期诊断价值仍不可忽略。
在我们的结果中，RT-qPCR检测阳性率从发病1-3天的60％，随着发病时间延长而降低，在发病2个月后降为6.4％，在发病3个月后降为0％。SP-IgG则可以在患者体内维持更长时间高水平，在本研究最长6个月的时间点仍保持阳性；RT-qPCR检测阳性率的下降伴随SP-IgG水平的增长，表明SP-IgG可能在清除体内病毒中起作用，SP-IgG可能保护患者再次感染SARS-CoV-2。患者在康复期有着较高滴度的抗体有相关报道，血清IgG抗体的抗病毒活性还需要进一步用中和实验来验证。
SARA-CoV-2是人类新发传染病，传染性高，病死率高，严重危害人类健康，对全世界人民的正常生活秩序，人们对其引起的疾病规律尚处于认识过程中，所以新冠患者的临床实验研究数据不仅对疾病的诊断方法确立有重要的科学价值，同时也指导临床医生对疾病的救治采取相应方法，更重要的是我们通过对患者抗体水平追踪调查研究结果，能更好的指导和评价疫苗研究和开发。我们建立的新冠患者IgG抗体间接免疫荧光法具有可靠的特异性、灵敏性和重复性；SP-IgG水平与患者COVID-19的严重程度无关，从抗体水平不能判断患者病情的严重程度。而患者是否有高血压、糖尿病这类基础疾病也不影响抗体水平的变化。
表1.IgG的重复性实验。
Figure BDA0002801321580000071
强阳性病例：病例74、病例113和病例73；weak positive sample：弱阳性病例：病例116、病例75和病例128。
表2.IgG的特异性与敏感性实验。
新冠肺炎 其他疾病
阳性 149 0
阴性 0 150
使用此方法检测新冠IgG的特异性为100％，敏感性为99.3％。
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。

Claims (4)

1.一种SARS-CoV-2S蛋白IgG的间接ELISA检测方法，其特征在于：包括下列步骤：
步骤1：将采用ELISA包被液稀释的新冠病毒刺突蛋白加入酶标板，每孔100μL，4℃过夜，然后用PBST缓冲液清洗酶标板三次，每次静置1分钟；
步骤2：向酶标板的每孔加250μL的质量分数为5%的脱脂奶粉溶液进行封闭，4℃过夜，然后用PBST缓冲液清洗酶标板三次，每次静置1分钟；
步骤3：将ELISA抗体稀释液稀释待检测血清作为一抗，向步骤2得到的酶标板的每孔加100μL一抗，37℃孵育1h，然后用PBST缓冲液清洗酶标板三次，每次静置1分钟；
步骤4：将ELISA抗体稀释液稀释的辣根过氧化物标记抗人IgG作为二抗，向步骤3得到的酶标板的每孔加100μL二抗，37℃孵育45min，然后用PBST缓冲液清洗酶标板三次，每次静置1分钟；
步骤5：步骤4得到的酶标板的每孔避光加入100μL单组分TMB显色液，37℃孵育5min，每孔加入50μL终止液，震荡混匀，采用终点法，检测波长450nm，参比波长630nm，酶标仪检测450nm吸光度值OD450nm值；
步骤6：当OD450nm值大于或等于0.3，判定为为阳性，OD450nm值小于0.3则判定为阴性。
2.根据权利要求1所述的SARS-CoV-2S蛋白IgG的间接ELISA检测方法，其特征在于：步骤1中，采用ELISA包被液稀释新冠病毒刺突蛋白，得到浓度至浓度为2μg/mL，然后加入酶标板的孔中。
3.根据权利要求1所述的SARS-CoV-2S蛋白IgG的间接ELISA检测方法，其特征在于：步骤3中，待检测血清与ELISA抗体稀释液的体积比为1：100。
4.根据权利要求1所述的SARS-CoV-2S蛋白IgG的间接ELISA检测方法，其特征在于：步骤4中，辣根过氧化物标记抗人IgG与ELISA抗体稀释液的体积比为1：50000。
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