CN111624335A - 一种诺如病毒gi/gii抗原联合定量检测试剂盒及制备方法 - Google Patents
一种诺如病毒gi/gii抗原联合定量检测试剂盒及制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111624335A CN111624335A CN202010522132.6A CN202010522132A CN111624335A CN 111624335 A CN111624335 A CN 111624335A CN 202010522132 A CN202010522132 A CN 202010522132A CN 111624335 A CN111624335 A CN 111624335A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- norovirus
- gii
- pad
- antibody
- membrane
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 97
- 241000532184 Norovirus GII Species 0.000 title claims abstract description 42
- 241000532183 Norovirus GI Species 0.000 title claims abstract description 40
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 28
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 28
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 28
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 48
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 27
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 25
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims description 19
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 13
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 13
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 13
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 9
- 238000005507 spraying Methods 0.000 claims description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims description 5
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 claims description 5
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 claims description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 5
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims description 5
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 4
- 239000004745 nonwoven fabric Substances 0.000 claims description 4
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 claims description 4
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 claims description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 claims description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 39
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 20
- 241001263478 Norovirus Species 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 7
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 241000714209 Norwalk virus Species 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 3
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 3
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 2
- 208000006339 Caliciviridae Infections Diseases 0.000 description 2
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- 206010012742 Diarrhoea infectious Diseases 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 208000001848 dysentery Diseases 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- HNGDOSBFYRVIEY-UHFFFAOYSA-N ethanesulfonic acid;hydrate Chemical compound O.CCS(O)(=O)=O HNGDOSBFYRVIEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 2
- 101150042997 21 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010004016 Bacterial diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101100282617 Bovine herpesvirus 1.1 (strain Cooper) gC gene Proteins 0.000 description 1
- 241000714198 Caliciviridae Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 241000551546 Minerva Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 208000012873 acute gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000000741 diarrhetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000011841 epidemiological investigation Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000004916 vomit Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种诺如病毒GI/GII抗原联合定量检测试剂盒及制备方法，试剂盒包括试剂条和定标卡；试剂条包括样品垫、结合垫、分析膜以及吸收垫；所述的分析膜上设置有第一检测线和第二检测线，其中，所述的第一检测线上包被有抗诺如病毒GI抗体，所述的第二检测线上包被有抗诺如病毒GII抗体；定标卡用于给免疫荧光分析仪进行定标，实现定量检测。本发明采用联合定量检测，可以实现对诺如病毒GI/GII抗原的简单、快速、准确定量检测分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种诺如病毒GI/GII抗原联合定量检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
免疫层析技术(ImmunochromatographicAssay，ICA)是20世纪末发展起来的结合免疫技术和色谱层析技术的一种分析方法，该方法具有准确、操作简单、快速、价格便宜、稳定性好等特点，广泛应用于临床诊断、环境监测、食品安全等重要领域。
荧光免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术。该技术以固定有检测线(包被抗体或包被抗原)和质控线(抗抗体)的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，荧光标记抗体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。诺如病毒，又称诺瓦克病毒(Norwalk Viruses，NV)是人类杯状病毒科(HumanCalicivirus，HuCV)中诺如病毒(Norovirus,NV)属的一种病毒。是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。
诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。美国每年在所有的非细菌性腹泻暴发中，60-90％是由诺如病毒引起。荷兰、英国、日本、澳大利亚等发达国家也都有类似结果。在中国5岁以下腹泻儿童中，诺如病毒检出率为15％左右，血清抗体水平调查表明中国人群中诺如病毒的感染亦十分普遍。
诺如病毒感染性腹泻属于自限性疾病，没有疫苗和特效药物，公众搞好个人卫生、食品卫生和饮水卫生是预防本病的关键，要养成勤洗手、不喝生水、生熟食物分开、避免交叉污染等健康生活习惯。
诺如病毒分5个基因组(GⅠ～GⅤ)，其中只有GⅠ、GⅡ和GⅣ可以感染人，而GⅢ、GⅤ分别感染牛和鼠。我国目前最常见的诺如病毒为GⅡ、GⅠ型。GⅡ型含有至少21个基因亚型，毒株变异较快，其中GⅡ.4基因亚型近10年已引起3次全球性流行，分别由2006年GⅡ.4-06Minerva变异株、2009年GⅡ.4-2009New Orleans变异株和GⅡ.4-2012Sydney变异株所致，成为全球重要的公共卫生问题之一。
诺如病毒变异快、环境抵抗力强、感染剂量低，感染后潜伏期短、排毒时间长、免疫保护时间短，且传播途径多样、全人群普遍易感，因此，诺如病毒具有高度传染性和快速传播能力。诺如病毒感染发病的主要表现为腹泻和/或呕吐，国际上通常称之为急性胃肠炎。
目前诺如病毒的主要检测技术有三类：电镜法、核酸检测(PCR)和抗原检测三类方法。其中电镜法的优点是快速简便直接，但其缺点是诺如病毒缺乏典型杯状病毒特征，不易观察，且需要病毒浓度达到一定程度才能观察到，并且电镜价格昂贵，技术要求高，不适合大规模流行病学调查；核酸检测具有高灵敏度和高特异性，常作为诺如病毒检测的标准参考，但是其程序繁琐，标本预处理工序多，受引物设计，核酸纯化，反应条件等限制，仅限于实验室操作，易受到实验室污染而出现假阳，必须在独立的空间进行样品处理和检验；抗原检测(免疫法)和基于侧向免疫层析技术的试纸技术，可直接检测标本中的抗原或抗体，无需专业的检测仪器和场地，已广泛应用于临床检测中，如CN 110456041 A公开了以胶体金作为示踪标记物应用于抗原抗体反应的检测技术，但胶体金技术敏感性较低，检测结果不稳定，临床检测的漏检风险较高；再如，CN 110954695 A公开了以量子点作为标记物联检诺如病毒的技术，但是量子点和某些蛋白质结合后可能导致量子点的荧光减弱或淬灭，并且均只作为定性检测。
发明内容
本发明目的是提供一种可以同时定量检测诺如病毒GI/GII抗原的试剂盒及制备方法，该试剂盒可以简单、快速、准确地检测区分诺如病毒GI/GII抗原，还可实现定量检测。
为了达到上述目的，本发明采用如下方案：
本发明一方面提供一种诺如病毒GI/GII抗原联合定量检测试剂盒，包括试剂条与定标卡；所述的试剂条包括样品垫、结合垫、分析膜以及吸收垫；其中，所述的结合垫包被有标记有标记物的抗诺如病毒GI抗体和标记有标记物的抗诺如病毒GII抗体；所述的分析膜上设置有第一检测线和第二检测线，其中，所述的第一检测线上包被有抗诺如病毒GI抗体，所述的第二检测线包被有抗诺如病毒GII抗体。
优选地，所述的样品垫、所述的结合垫、所述的分析膜以及所述的吸收垫组装在底板上制得所述的试剂条。
优选地，所述的试剂条的长度为5～10cm，宽度为2～8mm。
优选地，所述的样品垫部分搭接在结合垫的一侧，所述的结合垫的另一侧部分搭接在分析膜的一侧；所述的吸收垫部分搭接在分析膜的另一侧。
优选地，所述的标记物为荧光微球。
优选地，所述的样品垫采用玻璃纤维素膜、聚酯纤维素膜、纤维素滤纸、无纺布中的一种制成。
优选地，所述的结合垫采用玻璃纤维素膜、聚酯纤维素膜、纤维素滤纸、无纺布中的一种制成。
优选地，所述的分析膜材采用硝酸纤维素膜或者尼龙膜制成。
优选地，所述的分析膜上还设置有质控线。
优选地，所述的定标卡储存有两条检测标准曲线，所述的两条检测标准曲线分别为诺如病毒GI检测标准曲线和诺如病毒GII检测标准曲线。所述的定标卡用于免疫荧光分析仪的定标，实现试剂盒的定量检测。
本发明的另一个方面是提供一种所述的诺如病毒GI/GII抗原联合定量检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备标记有标记物的抗诺如病毒GI抗体和标记有标记物的抗诺如病毒GII抗体的混合物，其中，所述的标记有标记物的抗诺如病毒GI抗体和所述的标记有标记物的抗诺如病毒GII抗体的浓度独立地为0.05mg/mL～5mg/mL；
(2)将步骤(1)中得到的混合物按照0.25～15μL/cm喷涂在所述的结合垫上，干燥备用；
(3)制备浓度独立地为0.1～5mg/mL的抗诺如病毒GI抗体液体和抗诺如病毒GII抗体液体，在点膜仪上以0.25～4.0μL/cm的喷量喷涂在分析膜材上，分别形成所述的第一检测线和所述的第二检测线；
(4)将所述的样品垫、所述的结合垫、所述的分析膜以及所述的吸收垫组装在底板上制得所述的试剂条。
优选地，所述的混合物可以是溶液，也可是混悬液。
优选地，所述的标记物采用抗体标记荧光微球。
进一步优选地，所述的诺如病毒GI/GII抗原联合定量检测试剂盒的制备方法，在步骤(1)中，微球活化：向0.1～10mg/ml荧光微球中加入用10～100mM，pH 5.0～9.0MES(2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物)溶解的0.1～10mg EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)和0.1～10mg NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，活化10～600min，7000～15000rpm离心5～30min，弃上清，沉淀用pH 5.0～9.0的10～100mM PBS(磷酸盐缓冲液)重悬，得到0.1～10mg/ml活化的荧光微球溶液；抗体偶联：将0.1～10.0mg抗诺如病毒GI/GII抗体分别加入0.1～10mg/ml活化的荧光微球溶液中，室温混匀0.5～24h，7000～15000rpm离心5～30min，弃上清，沉淀用含0.5～50mg BSA(牛血清白蛋白)的10～100mM PBS溶液封闭0.5～24h，搅拌混匀，7000～15000rpm离心5～30min，收集的沉淀保存于pH 6.0～8.0、0～100mM Tris缓冲液中，得到抗诺如病毒GI/GII抗体标记荧光微球悬液。
本案的试剂盒可用于多种类型样本中诺如病毒GI和诺如病毒GII定量检测，例如，呕吐物样本、食品样本、粪便样本。将样本与样本检测液混合后制成混合液，取一定体积0～200μL混合液加入试剂条加样口，3-30min后通过配套仪器进行检测并自动计算，即判断样本中诺如病毒GI和诺如病毒GII的量。
优选的，所述底板为PVC底板。
本发明中的试剂条可装入卡壳，也可不装卡壳直接使用。
本发明的检测原理为：
将样本加入试剂卡中，样本中诺如病毒GI/GII分别与标记物垫上抗诺如病毒GI/GII抗体标记荧光微球结合形成复合物，并通过层析作用至硝酸纤维膜上含有另一个抗诺如病毒GI/GII特异性抗体的检测带，并被捕获，形成双抗体夹心复合物。因此样本中的抗诺如病毒GI/GII越多，检测带上的复合物积聚的越多。剩余荧光探针则继续层析至质控线并被捕获。检测线上荧光强度反应了样本中被捕获抗诺如病毒GI/GII的含量。经过免疫分析仪的检测计算，定量反应出样本中抗诺如病毒GI/GII的浓度。
由于采用上述技术方案，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明采用免疫层析技术，可以实现对诺如病毒GI/GII的联合定量检测。可检各种样本，且无需对样本进行前处理，操作便，方便快捷；只需一份样本，一次加样，就能对诺如病毒GI、诺如病毒GII抗原同时快速免疫定量分析。本发明操作简单、减少样本用量、节约时间、节省成本、准确有效。
附图说明
图1为具体实施方式的检测试剂条的结构示意图；
其中：1、样品垫；2、结合垫；3、分析膜；4、吸收垫；5、底板；31、检测线；32、质控线。
具体实施方式
下面结合具体的实施案例对本发明的技术方案进一步描述，但本发明不只限于下面的实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。本实施例中采用的试剂或原料均可市购获得，或者按照本领域常规方法制备得到。
实施例1：
一种诺如病毒GI/GII抗原联合定量检测试剂盒。如附图1所示，检测试剂条，包括样品垫1、结合垫2、分析膜3、吸收垫4和底板5；所述底板5上依次设置有样品垫1、结合垫2、分析膜3和吸收垫4；所述样品垫1部分搭接在结合垫2的一侧；所述结合垫3另一侧部分搭接在分析膜3的一侧；所述吸收垫4部分搭接在分析膜3的另一侧；所述分析膜上设置有两条检测线31和一条质控线32；两条检测线分别是诺如病毒GI检测线、诺如病毒GII检测线；结合垫包被有抗诺如病毒GI抗体标记物和抗诺如病毒GII抗体标记物。
所述诺如病毒GI检测线包被有抗诺如病毒GI抗体、所述诺如病毒GII检测线包被有抗诺如病毒GII抗体；所述标记物为荧光微球；结合垫包被抗诺如病毒GI抗体标记物和抗诺如病毒GII抗体标记物。
所述样品垫和结合垫采用玻璃纤维素膜；所述分析膜材采用硝酸纤维素膜。
一种诺如病毒GI/GII抗原联合定量检测试剂盒的制备方法，具体制备步骤包括：
1)抗体标记荧光微球：
1.1微球活化：向1mg/ml荧光微球中加入用50mM，pH 7.0MES(2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物)溶解的5mg EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)和5mg NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，活化60min，15000rpm离心30min，弃上清，沉淀用pH 7.0的50mM PBS(磷酸盐缓冲液)重悬，得到1mg/ml活化的荧光微球溶液；
1.2抗体偶联：将1.0mg抗诺如病毒GI、抗诺如病毒GII抗体分别加入1mg/ml活化的荧光微球溶液2ml中，室温混匀1h，15000rpm离心30min，弃上清，沉淀用含5mg BSA(乙酰胺)的50mM PBS(磷酸盐缓冲液)溶液封闭1h，搅拌混匀，15000rpm离心30min，收集的沉淀保存于pH7.0含0.5％BSA(牛血清白蛋白)的20mM Tris缓冲液中，得到浓度为0.1mg/ml抗诺如病毒GI/GII抗体标记荧光微球悬液；
2)结合垫制作：将步骤1)中得到的抗诺如病毒GI抗体标记荧光微球悬液、抗诺如病毒GII抗体标记荧光微球悬液按照体积比1:1混合，按照10μL/cm喷涂在结合膜材上，即为结合垫干燥备用；
3)分析膜制作：分别将抗诺如病毒GI抗体、抗诺如病毒GII抗体和羊抗鼠IgG释至1mg/ml，在点膜仪上以1μL/cm的喷量喷涂在硝酸纤维素膜上，形成诺如病毒GI检测线、诺如病毒GII检测线和质控线，即为分析膜，干燥备用；
4)试剂盒的组装：将样品垫1、结合垫2、分析膜3和吸收垫4依次搭接地粘贴在PVC底板5上且结合垫2部分搭接在分析膜3的一侧，吸收垫4部分搭接在分析膜3的另一侧，样品垫1部分搭接在结合垫2上制成试纸条(如图1所示)；然后将试纸条裁切成长度为7.5cm，宽度为4mm的纸条，并装入卡壳以及包装中，即得诺如病毒GI、GII抗原联合检测试剂条。
定标卡的制备方法，具体制备步骤包括：
1、诺如病毒GI标准曲线的建立
在样本检测液(主要成分为10mM PBS)中分别添加诺如病毒GI至终浓度为20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL，取实施例1制得的试纸条进行检测，每个样品重复测定三次。将测定的三次重复结果取平均值后，在荧光免疫分析仪上进行标定。
2、诺如病毒GII检测标准曲线的建立
在样本检测液(主要成分为10mM PBS)中分别添加诺如病毒GII至终浓度为20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL，取实施例1制得的试纸条进行检测，每个样品重复测定三次。将测定的三次重复结果取平均值后，在荧光免疫分析仪上进行标定。
3、标准曲线导入定标卡
使用定标卡烧写工具与软件，将标准曲线导入定标卡。
实施例2：
1.粪便样品中诺如病毒GI和诺如病毒GII含量的检测
(1)取样
①检测前将样本恢复至室温20-25℃；
②移取1g粪便样本；
③加入1mL样品检测液混合均匀；
(2)用实施例1制得的试纸条进行检测
①开启免疫分析仪，插入对应定标卡，读取标准曲线；
②正面朝上平放检测卡，向试纸条的样品孔中加入待测样本100μL，室温反应
15min后，将检测卡放入时间分辨荧光免疫分析仪中进行检测；
③截留在检测线和质控线的荧光微球在最佳激发光下，发出强烈的荧光条带；
④采用免疫分析仪读取检测线和质控线的荧光强度，并给出T1/C、T2/C值，分析仪可通过内置的标准曲线可以同时计算出样品中诺如病毒GI和诺如病毒GII的浓度以及两者的比值，并判断阴阳性。
(3)性能评估
①检出限：用诺如病毒GI和诺如病毒GII浓度分别为10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL的样本进行测试，浓度为20ng/mL、50ng/mL的样本应均为阳性，浓度为10ng/mL的样本应均为阴性，实验结果如表1。
表1检测试剂卡的最低检测限结果
②阴性符合率：分别检测5份诺如病毒GI和5份诺如病毒GII的阴性参考品(N1-N5)，结果应均为阴性，实验结果如表2。
表2检测试剂卡的阴性符合率结果
从表中可见，检测试剂卡的阴性符合率为100％。
③阳性符合率：分别检测5份诺如病毒GI和5份诺如病毒GII的阳性参考品(P11-P15、P21-P25，浓度分别为20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL)，结果应均为阳性，实验结果如表3。
表3检测试剂卡的阳性符合率结果
从表中可见，检测试剂卡的阳性符合率为100％。
④重复性：取同一批号的检测试剂条10人份，检测重复性参考品(诺如病毒GI/GII浓度为100ng/mL)，检测结果一致，检测结果应均为阳性，实验结果如表4。
表4检测试剂卡的重复性结果
2.临床样本测试
取33份腹泻病人粪便标本进行测试，其中18份非诺如病毒感染，15份诺如病毒感染。
结果如表5：
表5临床样本测试结果表
从测试结果可以看出，采用本申请所述的试剂盒对临床样本进行检测的结果与临床结果诊断一致，准确率为100％，具有准确的检出阴、阳效果；此外，本申请的试剂盒能进一步区分所感染的诺如病毒类型(GⅠ/GⅡ)，比临床诊断结果更具有区分性。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明的。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明的所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种诺如病毒GI/GII抗原联合定量检测试剂盒，其特征在于：包括试剂条与定标卡；所述的试剂条包括样品垫、结合垫、分析膜以及吸收垫；其中，所述的结合垫包被有标记有标记物的抗诺如病毒GI抗体和标记有标记物的抗诺如病毒GII抗体；所述的分析膜上设置有第一检测线和第二检测线，其中，所述的第一检测线上包被有抗诺如病毒GI抗体，所述的第二检测线包被有抗诺如病毒GII抗体。
2.根据权利要求1所述的诺如病毒GI/GII抗原联合定量检测试剂盒，其特征在于：所述的样品垫、所述的结合垫、所述的分析膜以及所述的吸收垫组装在底板上制得所述的试剂条。
3.根据权利要求1所述的诺如病毒GI/GII抗原联合定量检测试剂盒，其特征在于：所述的样品垫部分搭接在结合垫的一侧，所述的结合垫的另一侧部分搭接在分析膜的一侧；所述吸收垫部分搭接在分析膜的另一侧。
4.根据权利要求1所述的诺如病毒GI/GII抗原联合定量检测试剂盒，其特征在于：所述标记物为荧光微球。
5.根据权利要求1所述的诺如病毒GI/GII抗原联合定量检测试剂盒，其特征在于：所述样品垫采用玻璃纤维素膜、聚酯纤维素膜、纤维素滤纸、无纺布中的一种制成。
6.根据权利要求1所述的诺如病毒GI/GII抗原联合定量检测试剂盒，其特征在于：所述的结合垫采用玻璃纤维素膜、聚酯纤维素膜、纤维素滤纸、无纺布中的一种制成。
7.根据权利要求1所述的诺如病毒GI/GII抗原联合定量检测试剂盒，其特征在于：所述的分析膜材采用硝酸纤维素膜或者尼龙膜制成。
8.根据权利要求1所述的诺如病毒GI/GII抗原联合定量检测试剂盒，其特征在于：所述的分析膜上还设置有质控线。
9.根据权利要求1所述的诺如病毒GI/GII抗原联合定量检测试剂盒，其特征在于：所述的定标卡储存有两条检测标准曲线，所述的两条检测标准曲线分别为诺如病毒GI检测标准曲线和诺如病毒GII检测标准曲线。
10.一种如权利要求1至9中任一项所述的诺如病毒GI/GII抗原联合定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)制备标记有标记物的抗诺如病毒GI抗体和标记有标记物的抗诺如病毒GII抗体的混合物，其中，所述的标记有标记物的抗诺如病毒GI抗体和所述的标记有标记物的抗诺如病毒GII抗体的浓度独立地为0.05mg/mL～5mg/mL；
(2)将步骤(1)中得到的混合物按照0.25～15μL/cm的量喷涂在所述的结合垫上，干燥备用；
(3)制备浓度独立地为0.1～5mg/mL的抗诺如病毒GI抗体液体和抗诺如病毒GII抗体液体，在点膜仪上以0.25～4.0μL/cm的喷量喷涂在分析膜材上，分别形成所述的第一检测线和所述的第二检测线；
(4)将所述的样品垫、所述的结合垫、所述的分析膜以及所述的吸收垫组装在底板上制得所述的试剂条。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010522132.6A CN111624335A (zh) | 2020-06-10 | 2020-06-10 | 一种诺如病毒gi/gii抗原联合定量检测试剂盒及制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010522132.6A CN111624335A (zh) | 2020-06-10 | 2020-06-10 | 一种诺如病毒gi/gii抗原联合定量检测试剂盒及制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111624335A true CN111624335A (zh) | 2020-09-04 |
Family
ID=72272268
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010522132.6A Pending CN111624335A (zh) | 2020-06-10 | 2020-06-10 | 一种诺如病毒gi/gii抗原联合定量检测试剂盒及制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111624335A (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107991487A (zh) * | 2017-11-29 | 2018-05-04 | 洛阳现代生物技术研究院有限公司 | 一种检测喹诺酮类抗生素的荧光微球免疫试纸卡、制备及检测方法 |
| WO2019148754A1 (zh) * | 2018-01-30 | 2019-08-08 | 深圳市伯劳特生物制品有限公司 | 一种pla2r抗体的检测试纸条及检测方法 |
| CN110133281A (zh) * | 2019-05-06 | 2019-08-16 | 中生北控生物科技股份有限公司 | Crp和saa联合检测试剂盒及其制备方法 |
| CN110133283A (zh) * | 2019-05-06 | 2019-08-16 | 中生北控生物科技股份有限公司 | Pct和il-6联合检测试剂盒及其制备方法 |
| CN110456041A (zh) * | 2019-08-06 | 2019-11-15 | 珠海市医友生物科技有限公司 | 一种诺如病毒gi型gii型联合检测试剂及其制备方法 |
| CN110954695A (zh) * | 2019-11-18 | 2020-04-03 | 广东医科大学附属医院 | 诺如病毒gi和gii型量子点联检试纸条及其制备方法和应用 |
-
2020
- 2020-06-10 CN CN202010522132.6A patent/CN111624335A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107991487A (zh) * | 2017-11-29 | 2018-05-04 | 洛阳现代生物技术研究院有限公司 | 一种检测喹诺酮类抗生素的荧光微球免疫试纸卡、制备及检测方法 |
| WO2019148754A1 (zh) * | 2018-01-30 | 2019-08-08 | 深圳市伯劳特生物制品有限公司 | 一种pla2r抗体的检测试纸条及检测方法 |
| CN110133281A (zh) * | 2019-05-06 | 2019-08-16 | 中生北控生物科技股份有限公司 | Crp和saa联合检测试剂盒及其制备方法 |
| CN110133283A (zh) * | 2019-05-06 | 2019-08-16 | 中生北控生物科技股份有限公司 | Pct和il-6联合检测试剂盒及其制备方法 |
| CN110456041A (zh) * | 2019-08-06 | 2019-11-15 | 珠海市医友生物科技有限公司 | 一种诺如病毒gi型gii型联合检测试剂及其制备方法 |
| CN110954695A (zh) * | 2019-11-18 | 2020-04-03 | 广东医科大学附属医院 | 诺如病毒gi和gii型量子点联检试纸条及其制备方法和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111233985A (zh) | 一种新型冠状病毒IgA抗体快速检测试纸条的制备方法 | |
| AU748387B2 (en) | Neutralization of polycations in a chromatographic device for whole blood use | |
| KR102489679B1 (ko) | 바이러스 및 박테리아 감염의 복합 검출을 위한 방법 및 장치 | |
| US7344893B2 (en) | Immuno-gold lateral flow assay | |
| US20190219569A1 (en) | Fluorescence immunochromatographic detection card and a preparation method therefor and use thereof | |
| EP1327885B1 (en) | A kit for the simultaneous diagnosis of a plurality of infectious diseases and a method for preparation of it | |
| CN111999507B (zh) | 一种检测新型冠状病毒抗体的荧光免疫层析试纸 | |
| JP7451431B2 (ja) | 側方流動アッセイのシグナルを増幅させるシステム、装置および方法 | |
| KR101942098B1 (ko) | 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 특이항체 진단용 래피드 키트 | |
| US20030049658A1 (en) | Assay | |
| GB2181840A (en) | Method for the immunoassay of a macromolecular analyte | |
| TW494238B (en) | Chromatographic test pieces and chromatographic assay | |
| CN101738476B (zh) | 乙肝病毒前s1抗原快速诊断试剂盒及其制备方法 | |
| JP4503334B2 (ja) | 免疫測定に供する検体浮遊液調製用媒体組成物及びそれを用いる免疫測定方法 | |
| Chen et al. | Development of a Luminex assay for the detection of swine antibodies to non-structural proteins of foot-and-mouth disease virus | |
| CN110954695A (zh) | 诺如病毒gi和gii型量子点联检试纸条及其制备方法和应用 | |
| CN111624335A (zh) | 一种诺如病毒gi/gii抗原联合定量检测试剂盒及制备方法 | |
| CN111208292B (zh) | 肺炎支原体抗体IgM的免疫检测试剂盒、其制备方法及使用方法 | |
| CN111239411B (zh) | 肺炎支原体抗体IgG的免疫检测试剂盒、其制备方法及使用方法 | |
| CN114689869A (zh) | 试纸条、制备方法及pla2r、thsd7a、nell-1自身抗体联合定量检测方法 | |
| KR102268785B1 (ko) | 표면에서 노로바이러스를 검출하기 위한 장치 및 방법 | |
| CN111521787A (zh) | 新布尼亚病毒IgG、IgM联合检测试剂卡及其制备方法 | |
| KR20210067690A (ko) | 오리 간염 바이러스 및 오리 장염 바이러스의 고감도 시분할형광을 이용한 동시 검사방법 | |
| JP2022023357A (ja) | シグナルの低下を改善した検査試薬 | |
| AU2021100489A4 (en) | Ultra-High Sensitive Assay Kit for Brucellosis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200904 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |