KR20130024539A - 비만억제의 기능을 가지는 갈조류 감태의 ｎ-부탄올 추출물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비만 억제용 으로 사용하기 위한 갈조류 감태(Ecklonia cava)를 건조, 파쇄하여 분말로 제작 후, 메탄올(methanol(MeOH)) 용매를 끓는점 까지 가열하여 추출하고, 얻어진 추출액을 다시 상온 상태의 메탄올(MeOH)에 녹인 후 농축하여 디솔팅(desalting)된 조추출물을 용매 극성에 따라 순차적으로 분획하여, n-헥산(n-hexane), 85%수용액메탄올(85% aq. MeOH), n-부탄올(n-BuOH), 수(H₂O) 분획물중 얻어진 n-부탄올 추출물을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은, 갈조류 감태의 n-부탄올 추출물을 실리카 컬럼크로마트그래피(silica column chromatography)를 통해 세부적인 분획물로 나누고, 각 분획물을 적정 농도의 MeOH in CHCl₃ 에 녹인후 sephadex LH20 column chromatography를 통하여 트리플로레솔-A(Triphlorethol-A),엑콜(Eckol), 엑스토로놀(Eckstolonol), 플로로푸코로엑콜(Phlorofuroeckol) 또는 디엑콜(Dieckol)중 어느 하나의 활성화합물을 분리해 내는 비만 억제의 기능을 가지는 갈조류 감태의 n-부탄올 추출물을 제공하는 것이다. 본 발명은 갈조류 감태의 천연 유래 폴리페놀을 함유한 추출물을 이용함으로써 부작용이 없는 새로운 신규 물질을 손 쉽게 획득하고, 이에 따른 생산원가의 절감하고, 천연물 유래 비만 치료에 새로운 길을 제시하는 효과도 있다.

Description

비만억제의 기능을 가지는 갈조류 감태의 ｎ-부탄올 추출물{n-Butanol substracts of Ecklonia cava for preventing obesity}

본 발명은 갈조류 감태의 추출물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 폴리페놀을 함유하고 있는 갈조류 감태를 신규한 추출방법을 통하여 약리작용이 우수한 물질들을 포집하여 비만 억제용으로 사용하기 위한 갈조류 감태의 n-부탄올 추출물에 관한 것이다.

인간의 노력으로 현대 식량수급 문제, 의약품 개발에 따른 질병 문제는 일정 수준 극복하였으나 경제발전에 따른 생활여건 향상으로 현대인들의 정신적 긴장감, 스트레스의 증가, 그리고 신체활동의 부족과 함께 서구화된 식습관으로 인해 비만의 발병률이 지속적으로 증가하였다. 세계보건기구에서는 1996년에 비만을 질병이라 규명하였으며, 2003년부터 우리나라에서도 비만을 만병의 근원이 되는 질병이라 규명함으로써 비만이 큰 사회문제로 떠오르고 있다.

비만은 에너지 저장과 지방축적을 위한 조절과정에서 주로 발생하며 지방세포내의 과도한 지방의 축적은 관절염, 신장병, 심장질환, 소화기 질환, 고혈압, 당뇨병 등의 위험 뿐만 아니라 심리적 부담 등의 위험이 있다고 보고되었다(McArdle et al ., 1996). 지방세포내의 지방구는 지질의 대사와 조절에 중요한 역할을 하며 지방의 축적과 호르몬, 유전자 발현 등을 통해 지방전구세포에서 지방 세포로의 분화가 일어나게 된다고 알려져 있다(이해용 et al., 2009). 분화과정은 비만 전구세포에서 핵심 조절자로 불리는 전사 인자들(PPARγ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma), SREBP1c(Sterol regulatory element binding protein-1), C/EBPα(The CCAAT/enhancer-binding protein α)의 복잡한 유전자발현 조절과정을 통해 성숙한 비만세포로 분화되면서 그 결과로 표적 유전자들(FABP4, LPL, leptin, TNF α, FATP1, FAS, LPL, ACS1)과 세포내 TG축적에 관여하는 다양한 지방세포 효소 활성이 증가된다고 알려져 있다.

현대인들이 비만치료를 위해 사용하는 방법으로는 의약품의 복용으로 체내 지방 대사를 조절하거나 식이요법, 운동, 외과적 수술 등이 있다. 하지만 의약품의 복용은 지방대사의 정확한 조절 기능 보다는 호르몬의 조정을 통한 식욕 억제, 지방 흡수 방해 등의 대사 억제를 통해서 약물 부작용을 나타내고, 외과적 수술역시 통증이나 그 후의 미용적인 부작용 문제 등이 나타난다. 이렇듯 체지방을 감소시키기 위한 기존의 방식들은 일상적인 생활방식을 억제하고 생리적인 욕구에 대한 방해를 전제로 하기 때문에 지속적이고 안전한 효과를 기대하기 어려운 실정이다. 이런 이유로 최근 체중과 체지방을 적절하게 감소시키더라도 인체에 부작용이 없는 비만문제 해결에 관한 연구가 활발하게 이루어지고 있으며 사용상 또는 생리적 억제가 필요 없는 안전한 기능성 제품의 개발이 시급한 실정이다.

최근 국외에서는 부작용 없이 체지방을 감소시키는 연구가 일본과 프랑스를 중심으로 해조류 추출물을 이용하여 이루어져 왔으며(서태수 et al ., 2003), 국내에서도 오래 전부터 미역내의 다당류가 혈중 콜레스테롤 및 중성지방의 함량을 감소시키는 효과(강정호, 성낙응, 1968)나 해조류(미역, 김)의 식이 섭취가 흰쥐에서 혈당이나 혈장 중성지방을 줄이는 효과(경선이, 1983)등 해조류를 통한 여러 가지 연구가 보고되어져 왔다. 하지만 이는 김이나 미역 같은 몇몇 품종에 한정되어 있는 실정이다.

이러한 배경 하에서 우리는 해조류, 특히 갈조류에 풍부하게 포함되어 있는 다당류의 성분 즉, fucoidan, phycocolloids및 phlorotannins 등과 같은 폴리페놀 화합물에 관심을 가지게 되었다. 이중에서 phlorotannin은 많은 연구자들에 의해 뛰어난 항산화, 항균, 항고 혈압 그리고 항암 활성을 가진다는 사실이 보고되어 있으나 비만과 관련된 연구는 거의 보고되지 않았다(YANG et al ., 2010; Heo et al., 2008; Nagayama et al ., 2002; Athukorala et al., 2005).

특히 영양세포가 1년 이상 생육하는 다년생 갈조류인 감태는 지금까지 주로 식용으로 쓰였으나 감태가 가지고 있는 phlorotannins 같은 polyphenol계의 화합물의 다양한 생리활성이 알려짐에 따라 관심이 점점 증가되고 있는 상황이다(Funahashi et al ., 2001). Phlorotannins 화합물들은 지금까지 항산화활성에 대해서는 선행 연구가 많이 이루어져 있으나(Kim, Lee, 2004; Yoo et al ., 2004; Park et al., 2005) 항비만에 대해서는 거의 연구가 이루어지지 않았다.

본 발명에 사용된 해조류인 감태(Ecklonia cava)는 갈조식물문(Phaeophyta) 갈조식물강(Phaeophyceae) 다시마목(Laminariales) 미역과(Alariaceae)에 속하는 다년생 갈조류로서 점심대(漸深帶)의 깊은 곳에서 해중림(海中林)을 형성하여 서식한다. 우리나라에서는 남해안이나 제주도에 많이 분포하며 줄기는 원기둥 모양이고 길이 1~2 m, 줄기 길이 5~10 cm,지름 3~5 mm, 가운뎃잎은 길이 20~30 cm, 너비 4 cm정도 이다. 이러한 배경 하에 본 연구는 부산 기장에서 감태를 직접 구입하여 감태가 함유하고 있는 polyphenol의 량을 측정해 보고 항산화, NO 생성억제, 항비만 등의 기초 생리활성을 검색 하였으며, NMR 분광분석과 생리활성검색 결과를 토대로 polyphenol 함유 용매 분획층으로부터 6개의 phlorotannins들을 분리하였다. Phlorotannins을 처리한 3T3-L1 지방 전구세포의 분화과정에서 glycerol과 leptin, triglyceride함량을 측정하여 염증과 지방의 축적 및 분해에 미치는 영향을 연구하였다. 또한 지방분해와 지방구 생성억제에 관한 효소의 발현과 메커니즘을 확인하기 위해 비만 연구에 많이 쓰이는 3T3-L1 세포를 이용한 분화 과정을 분자수준에서 검토하였다.

감태의 함유물질이 가지는 비만억제 활성에 대한 연구는 오랜기간 단순하게 식용으로만 인식되어 왔던 해조류를 고부가가치 기능성 물질의 유용자원으로서의 중요성을 부각시킬 뿐만 아니라 해조소비 증대에도 크게 기여하여 최근 침체일로에 있는 해조 양식산업에도 크게 기여할 수 있을 것이라고 예상된다.

따라서, 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명은 본 발명에서는 감태 자체보다는 이를 보다 순수하게 정제함으로써 감태가 함유하는 이차대사산물인 폴리페놀(polyphenol) 화합물을 함유하는 유효성분을 고순도로 분리하여 비만 억제용으로 사용하기 위한 폴리페놀을 함유한 갈조류 감태의 n-부탄올 추출물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 갈조류 감태의 n-부탄올 추출물을 더욱 분리 정제하여 얻어진 활성화합물들이 비만 억제용으로 사용가능한 갈조류 감태에서 유래한 비만 억제용 추출물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 비만 억제용으로 사용하기 위한 갈조류 감태(Ecklonia cava)를 건조, 파쇄하여 분말로 제작 후, 메탄올에서 조추출된 조추출물을 다시 이차적으로 n-부탄올에서 재차 추출된 비만억제의 기능을 가지는 갈조류 감태의 n-부탄올 추출물을 특징으로 한다.

그리고 바람직하기로는 상기 n-부탄올 추출물은, 감태 분말을 메탄올(methanol(MeOH)) 용매를 끓는점 까지 가열하여 추출하고, 얻어진 추출액을 다시 상온 상태의 메탄올(MeOH)에 녹인 후 농축하여 디솔팅(desalting)된 조추출물을 용매 극성에 따라 순차적으로 분획하여, n-헥산(n-hexane), 85%수용액메탄올(85% aq. MeOH), n-부탄올(n-BuOH), 수(H₂O) 분획물중 얻어진 n-부탄올 추출물이도록 한다.

또한 본 발명은, 갈조류 감태의 n-부탄올 추출물을 실리카 컬럼크로마트그래피(silica column chromatography)를 통해 세부적인 분획물로 나누고, 각 분획물을 적정 농도의 MeOH in CHCl₃ 에 녹인후 sephadex LH20 column chromatography를 통하여 활성화합물을 분리해 내는 것을 특징으로 하는 비만 억제의 기능을 가지는 갈조류 감태의 n-부탄올 추출물을 제공하는 것이다.

상기 분리된 활성추출물은 트리플로레솔-A(Triphlorethol-A),엑콜(Eckol), 엑스토로놀(Eckstolonol), 플로로푸코로엑콜(Phlorofuroeckol) 또는 디엑콜(Dieckol)중 어느 하나이고, 상기 각 활성화합물은, 감태의 n-BuOH 분획에 대해 MeOH과 CHCl₃의 혼합용매를 사용하여 silica gel flash column chromatography를 실시하였으며 100% CHCl₃(nfc 1), 5% (nfc 2), 10% (nfc 3), 20% (nfc 4), 30% (nfc 5), 40% (nfc 6), 50% (nfc 7), 70% (nfc 8) MeOH in CHCl₃과 100% MeOH (nfc 9) 그리고 90% MeOH in H₂O (nfc 10) 용매 분획 을 얻고, nfc 4번을 40% MeOH in CHCl₃로 LH20 실행 하여 엑콜(Eckol) 플로로푸코로엑콜(Phlorofuroeckol)을 얻고, 그 중 subfraction 4와 subfraction 8을 30% MeOH in CHCl₃로 sepadex LH20하여 엑스토로놀(Eckstolonol)과 트리플로레솔-A(Triphlorethol-A)을 언으며, nfc 5번 2.6 g을 100% MeOH 용매로 LH20를 수행하였으며, 얻어진 subfraction 5를 reLH20 (30% MeOH in CHCl₃)를 실행하여 디엑콜(Dieckol)을 분리하여 얻도록 한다.

본 발명은 갈조류 감태의 천연 유래 폴리페놀을 함유한 추출물을 이용함으로써 부작용이 없는 새로운 신규 물질을 손 쉽게 획득하고, 이에 따른 생산원가의 절감하는 효과를 얻을 수 있다.

또한, 본 발명은 비만 억제용으로 사용 가능한 물질들을 수득함으로써 천연물 유래비만 치료에 새로운 길을 제시하는 다른 효과도 있다.

도 1은 갈조류 감태로부터 각 용매에 의한 추출과정 및 추출물의 양을 나타낸 도.
도 2는 n-부탄올 추출물을 이용하여 활성화합물(compound) 1 내지 7의 추출과정을 나타낸 도.
도 3은 각 분리된 활성화합물의 ¹H NMR, ¹³C NMRS의 스펙트럼을 데이터를 나타낸 도.
도 4a 내지 도4e는 각 분리된 활성화합물의 ¹H NMR, ¹³C NMR, gDQCOSY 및 TOCYS의 스펙트럼을 나타낸 그래프를 나타낸 도.
도 5는 각 분리된 활성화합물1 내지 6의 구조를 나타낸 도.
도 6은 감태 용매 추출물의 3T3-L1전구 지방세포에서의 세포 분화능 측정 결과를 나타낸 도.
도 7은 감태 용매 추출물의 3T3-L1전구 지방세포에서의 세포 분화능의 모습을 촬영한 사진.
도 8은 감태 용매추출물의 Glycerol 분비 측정의 결과를 나타낸 도.
도 9는 감태 용매 추출물의 비만관련 유전자 PPARγ, SREBP1c, C/EBPα의 분화된 3T3-L1 지방세포로부터 이들의 mRNA의 발현을 나타낸 도.
도 10은 감태 용매 추출물의 표적 유전자가 되는 대표적인 5가지 유전자(FATP1, FAS, FABP4, LPL, ACS1)에 대한 발현을 나타낸 도.
도 11은 감태 용매 추출물의 지방분해 유전자와 관련된 HSL, TNF α, perilipin의 mRNA발현 양상을 살펴 본 도.
도 12는 n-부탄올 추출물을 재차추출한 활성화합물(compound 1-6)의 3T3-L1전구 지방세포에서의 세포 분화능 측정을 나타낸 도.
도 13은 n-부탄올 추출물을 재차추출한 활성화합물(compound 1-6)의 TG 축적의 함량을 흡광도로 나타낸 도.
도 14는 n-부탄올 추출물을 재차추출한 활성화합물(compound 1-6)의 Glycerol 분비 측정을 나타낸 도.
도 15는 n-부탄올 추출물을 재차추출한 활성화합물(compound 1-6)의 Glucose의 소비 측정을 나타낸 도.
도 16은 n-부탄올 추출물을 재차추출한 활성화합물(compound 1-6)의 Leptin 측정을 나타낸 도.
도 17은 n-부탄올 추출물을 재차추출한 활성화합물(compound 1-6)의 비만 관련 핵심 조절인자 유전자 PPARγ, SREBP1c, C/EBPα의 mRNA의 발현을 보인 도.
도 18은 n-부탄올 추출물을 재차추출한 활성화합물(compound 1-6)의 6가지 유전자(FATP1, FAS, FABP4, LPL, ACS1, leptin)에 대한 발현을 나타낸 도.
도 19는 n-부탄올 추출물을 재차추출한 활성화합물(compound 1-6)의 대표적인 지방분해 유전자인 HSL, TNFα, Perilipin의 유전자 발현 수준을 측정한 도.

이하, 본 발명에 의한 비만 억제용으로 사용하기 위한 폴리페놀을 함유한 갈조류 감태의 n-부탄올 추출물을 구체적으로 설명하기로 한다.

실험준비

재료의 선택

실험에 사용한 건조 감태(E. cava)는 2009년 부산 기장에서 직접 구입하였으며 추출하기 전까지 실온에서 보관하였다가 추출하였다.

시약, 추출, 분획 및 분리

Column packing material은 RP 18(YMC-GEL ODS-A, 12 nm, S-75 μm)을 사용하였다. 추출 및 분획, column chromatography에 사용한 모든 용매는 1급 시약을 구입하여 사용하였다. Varian RI detector와 high performed liquid chromatography(HPLC, Dionex P580)를 사용하여 정제·분리하였다. 사용한 HPLC column은 YMC pack ODS-A (250×10 mm, S 5 μm, 12 mm)을 사용하였고, guard column(7.5×4.6 mm, Alltech)을 사용하였다. NMR 측정 시 사용한 용매는 CD₃OD(Merck. deuterium degree 99.95%)를 사용하였다.

활성

항산화 활성 실험에 사용된 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical (DPPH), 3-morpholinsydnonimine(SIN-1)과 dihydrorhodamine 123(DHR 123), penicillamine(DL-2-amino-3-mercapto-3-methyl-butanoic acid)은 Sigma사(ST Louis, MO, USA)에서 구입하였고 peroxynitrite(ONOO^-)는 Cayman(Ann Arbor, MI, USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포배양에 필요한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)은 Sigma(ST Louis, MO, USA)에서 구입하였고 , FBS(Fedal Bovine Serum)는 hyclone(Logan, Utah, USA), 0.05% Trypsin-0.02% EDTA와 100 units/mL penicillin-streptomycin은 GIBCO사(USA)에서 구입하였다. ROS측정에 사용된 DCFH-DA는 Molecular Probes inc.(Eugene, OR, USA)로부터 구입하였다. NO에 사용된 MEM(Modified Eagle Medium) sigma에서 구입하였다. mRNA 발현에 사용된 iNOS(inducible nitric oxide synthase), COX-2(cyclooxygenase-2), GAPDH(Glyceraldehydre 3-phosphate dehydrogenase), PPARγ, SREBP1c, C/EBPα, FABP4, FATP1, FAS, LPL, ACS1, Leptin, Perilipin, HSL, TNFα 유전자 및 primer는 BIONEER사에서 구입 하였고 전기영동에 사용된 powder형태의 agar는 JUSEI Chemical, EtBr(ethidium bromide)는 BIONEER사에서 구입하여 사용하였다.

사용 기기

¹H-NMR과 ¹³C-NMR, two-dimensional NMR 실험은 모두 Varian NMR 300 spectrometer를 사용하였다. UV-Vis spectrophotometer(Thermo Spectronic, England), Multi-detection microplate fluorescence spectrophotometer Synergy HT(bio-TEC instruments, USA)가 항산화 활성 측정에 사용되었으며 그 외에 rotary Evaporator(EYELA, JAPAN), vacuum pump, pH meter, water bath, pipet(JBM-pipet), 여과기 등을 사용하였다. 세포배양은 5% CO₂ incubator(Forma Scientific, Japan)를 사용하였고 유전자는 PCR(BIORAD, USA)을 사용하여 유전자 증폭하였다.

추출, 분획 및 분리

추출 및 분획

구입한 기장산 감태(E. cava)를 사용하기 전에 실온에 보관하였다가 분쇄기를 이용하여 powder형태로 만든 후, 환류장치를 사용하여 methanol로 3시간 동안 가열 시켜 여과하였다. 이 과정을 3번 반복하였고, 얻어진 추출액은 40℃ 수욕 상에서 rotary vacuum evaporator(EYELA JAPAN, N-N series)로 농축과정을 통해 조추출물을 얻었다. 도1에 도시된 바와 같이, 조추출물 177.43 g을 용매 극성에 따라 순차적으로 분획하여, n-hexane, 85% aq. MeOH, n-BuOH, H₂O 분획물을 각각 12.9 g, 5.7 g, 60.32 g, 98.5 g 얻었다.

실시예1 감태의 n- 부탄올 추출물의 재추출을 통한 활성 성분 분리

감태의 n-BuOH 분획에 대해 MeOH과 CHCl₃의 혼합용매를 사용하여 silica gel flash column chromatography를 실시하였으며 100% CHCl₃(nfc 1), 5% (nfc 2), 10% (nfc 3), 20% (nfc 4), 30% (nfc 5), 40% (nfc 6), 50% (nfc 7), 70% (nfc 8) MeOH in CHCl₃과 100% MeOH (nfc 9) 그리고 90% MeOH in H₂O (nfc 10) 용매 분획 을 얻었다.

얻어진 각각의 분획을 ¹H NMR 분광분석 자료와 시료의 양을 고려하여 nfc 5 fraction과 6 fraction에 대해 다시 한번 silica gel flash column chromatography를 실시였다. Chromatography를 통하여 100% CHCl₃ (nfc 1), 10% (nfc 2), 15% (nfc 3), 20% (nfc 4), 25% (nfc 5), 30% (nfc 6), 35% (nfc 7) MeOH in CHCl₃과 100% MeOH (nfc 8) fraction을 얻었다.

이 8가지 fraction 중 nfc 4번(1 g)을 40% MeOH in CHCl₃로 LH20 실행 하여 compound 1 (subfraction 2)과 compound 3 (subfraction 6), compound 5 (subfraction 12)가 분리 되었으며 이를 포함해 총 13개의 subfractions을 얻었다. 그 중 subfraction 4와 subfraction 8을 30% MeOH in CHCl₃로 sepadex LH20하여 compound 4와 compound 2을 각각 분리 하였다.

nfc 5번 2.6 g을 100% MeOH 용매로 LH20를 수행하였으며, 얻어진 subfraction 5를 reLH20 (30% MeOH in CHCl₃)를 실행하여 compound 6을 분리하였다.

실시예2 . 활성성분들 화합물들의 구조결정

도3과 도4는 활성성분들의 구조결정을 위한 자료들이다. 먼저 도4a에 도시된 바와 같이, Compound 2는 황백색의 powder 형태로 분리되었으며, 분자량은 LREIMS m/z 426 [M]⁺와 ¹³C NMR 자료에 의해서 C₁₈H₁₄O₉으로 결정되었다. ¹H NMR 스펙트럼의 δ 5.7 - 6.0 ppm에서 방향족 화합물에서 기인한 신호를 참고하고, ¹³C NMR에서 14개의 피크가 관찰되는 것을 통해, 세 개의 벤젠 고리 중 두 개가 대칭으로 존재하고 있음을 알 수 있었고 이는 불포화도 값(U=12)과 정확히 일치하였으며, 이들 벤젠고리는 compound 1 단량체들의 결합으로 예상할 수 있었다. ¹H NMR 스펙트럼에서 AB₂ system signal [δ 6.00(1H, d, 2.2), δ 5.92(1H, t, 2.2)]과 AB system signal [δ 6.04(1H, d, 2.8), δ 5.75(1H, d, 2.8)] 그리고 A₂ system [δ 5.89(1H, s)]이 확인되었다. 또한 ¹³C NMR 스펙트럼을 통해 각각의 벤젠고리는 ether 결합으로 연결되어 있음을 확인할 수 있었다. 추가적인 구조는 ¹H COSY, TOCSY, gHMQC, gHMBC와 같은 2D NMR 실험을 이용하여 결정하였다. 이는 이미 알려진 화합물인 Triphlorethol-A로서 문헌치의 NMR data와 비교 분석한 결과 잘 일치하였다(Yoshiyasu et al., 1985).

도4b에 도시된 바와 같이, Compound 3은 밝은 갈색의 powder 형태로 분리되었으며, 분자량은 FAB-MS(m/z 372 [M]⁺)와 ¹³C NMR 자료 분석을 통해 분자식 C₁₈H₁₂O₉로 결정되었고, 불포화도는 13을 나타내었다. ¹³C NMR 스펙트럼 분석결과, 산소가 치환된 방향족 탄소로 예상되는 δ 160 ― 100 부근에서 12개의 신호가 관찰되었으며, δ 100 ― 90 부근에 6개의 치환되지 않은 방향족 탄소가 확인되었다. 그리고 ¹H NMR 스펙트럼 분석 결과, 방향족 수소에 기인한 3개의 5.92(3H, s), 5.93(2H, s), δ 6.12(1H, s)의 수소 신호가 관찰되었다. 이는 compound 3이 3개의 phloroglucinol 단위를 가지는 화합물임을 예측할 수 있었다. Compound 3은 NMR 스펙트럼 분석 결과, compound 2와 매우 유사한 화합물임을 알수 있었으며, 두 화합물의 NMR 스펙트럼 비교 분석 결과, compound 2의 ¹H NMR에서 나타난 한 개의 방향족 수소(H-5, δ 6.04)와 ¹³C NMR에서 나타난 치환되지 않은 방향족 탄소(C-5, δ 94.8)가 사라지고, 산소가 치환된 새로운 방향족 탄소신호(C-5a, δ 147.05)가 나타남으로써, aryl-ether 결합으로 연결된 전형적인 dibenzo-p-dioxin 골격을 가지고 있는 화합물임을 알 수 있었다. Compound 3의 구조 결정은 ¹H COSY, TOCSY, gHMQC, gHMBC 등의 2D NMR 실험과 문헌조사를 통해 감태에서 분리된 바 있는 eckol임을 확인하였다.

도4c에 도시된 바와 같이, Compound 4는 황백색의 powder 형태로 분리되었으며, 분자량은 LRFABMS m/z 431 [M + Na]⁺와 ¹³C NMR 자료에 의해서 C₁₈H₁₀O₉로 결정되었고 불포화도는 14로 나타났다. ¹³C NMR 스펙트럼의 δ 155 - 124 ppm 부근에서 13개의 산소가 결합된 방향족 탄소가 나타났으며, δ 100 - 95 ppm 부근에서 5개의 치환되지 않은 탄소 신호가 나타났다. ¹H NMR 스펙트럼의 δ 6.2 - 5.9 ppm 부근에서 방향족 수소에 기인한 5개의 피크가 나타났다. 이는 compound 3과 유사한 양상의 NMR 스펙트럼을 보였으며, compound 4가 dibenzo-p-dioxin의 기본골격을 이루고 있음을 나타냈다. 두 화합물의 스펙트럼 비교 결과, 차이는 compound 3에서 보여주었던 하나의 방향족 수소 신호(H-2', δ 5.92)와 한 개의 치환되지 않은 방향족 탄소 신호(C-2', δ 95.18)가 사라졌으며, 산소가 치환된 새로운 방향족 탄소신호(C-8a, δ 124.73)가 나타남으로써, compound 4가 C-2'와 C-2사이에 aryl-ether 결합이 추가된 구조임을 확인하였다. 이는 이미 알려진 화합물인 eckstolonol로서 문헌치의 NMR data와 비교 분석한 결과 잘 일치하였다(Kang et al ., 2003).

도4d에 도시된 바와 같이, Compound 5는 밝은 갈색의 powder형태로 분리되었으며, FAB-MS(m/z 603 [M]⁺)과 ¹³C NMR 자료에 의해서 분자식 C₃₀H₁₈O₁₄로 결정되었고, 불포화도 20을 나타내었다. ¹³C NMR spectrum에 의해 30개의 방향족 탄소 중 9개의 methine탄소, 산소에서 기인된 19개의 탄소와 2개의 quaternary 탄소신호를 관찰 할 수 있었다. ¹H NMR spectrum에서는 2개의 AB₂ system signal [δ 5.96(2H, d, 2), δ 5.91(1H, t, 2)]과 [δ 5.93(1H, t, 2.2), δ 5.87(2H, d, 2.2)]이 존재하며, 3개의 singlet(δ 6.62, δ 6.39, δ6.25)이 확인 되었다. 분자량과 NMR 스펙트럼 분석을 통해 5개의 phloroglucinol 단위로 이루어진 화합물임을 예측할 수 있었으며, dibenzo-p-dioxin 골격을 가지는 compound 3과 매우 유사한 화합물임을 확인하였다. ¹³C NMR에서 dibenzo-p-dioxin 골격에서 나타나는 aryl ether 결합에 의한 탄소신호 이외의 aryl ether 결합에 의한 탄소신호 C-12a(δ 152.97)와 C-11a(δ 150.96)가 추가적으로 나타났으며, 그리고 quaternary 탄소인 C-6(δ 105.17)과 C-7(δ 105.22)의 chemical shift 값을 통해 C-6과 C-7이 aryl-aryl 결합을 통해서 연결됨을 추정할 수 있었다. Compoun 5의 구조 결정은 추가적인 2D NMR 실험과 문헌 조사를 통해서 Ecklonia Kurome에서 분리되어진 phlorofucofuroeckol A임을 확인하였으며, 분광학적 데이터와 정확히 일치하였다(Yoshimasa et al., 2006; Yoshiyasu et al., 1990).

도4e에 도시된 바와같이, Compound 6 역시 밝은 갈색의 powder형태로 분리되었으며, FAB-MS (m/z 743 [M]⁺)과 ¹³C NMR 자료에 의해서 분자식 C₃₆H₂₂O₁₈ 결정되었고, 불포화도 26으로 나타났다. Compound 6의 ¹³C NMR spectrum의 양상이 Compound 3와 매우 유사한 형태로써 스펙트럼 상에서 각각의 신호들이 쌍을 이루어 나타나는 것을 확인하였으며, 이는 두 개의 eckol 단위로 결합되어 있음을 추측하였다. ¹H NMR에서 eckol의 H-4'(δ 5.92) 신호와 쌍을 이루는 H-4'''의 수소신호가 사라졌으며, ¹³C NMR 스펙트럼에서 C-4'(δ 97.53)와 쌍을 이루는 C-4'''(δ 126.26)는 전형적인 산소 치환된 방향족 탄소신호로 나타났다. 뿐만 아니라, C-7(δ 155.76, -OH)은 C-7''(δ 154.28, -O-R)과 chemical shift 값의 차이가 뚜렷하게 나타나므로써, 두 eckol group 간의 결합이 C-7과 C-4'''사이에 aryl ether 결합으로 연결되어 있음을 확인할 수 있었다. 또한 C-1'''(δ 157.57)와 C-3'''(δ 152.16)의 각각의 chemical shift값도 C-1'(δ 161.57)과 C-3'(δ 159.81)보다 고자장으로 이동됐다. 이러한 점들로 미루어 보았을 때 compound 6은 Compound 3의 dimer라고 추측 할 수 있으며, ¹H NMR spectrum에서 강한 singlet 신호인 H-2',6'(δ 5.92)와 서로 쌍을 이루어 나타나는 신호인 H-2''', 6'''(δ 6.08)의 저자장으로의 화학적 이동은 eckol의 dimer형태를 더욱 지지해 주었다. 전체적인 구조는 2D실험을 통해 규명되었으며 문헌조사를 통해 compound 6은 감태에서 분리된 화합물인 dieckol이라는 사실을 확인 할 수 있었고 보고된 분광 데이터와 정확히 일치하였다(Lee et al.. 2009).

이상에서와 같이 n-부탄올 추출물을 더욱 더 세분하여 추출함으로써 각각 다른 색깔을 뛴 여석가지의 활성추출물을 분리해 낼 수 있었으며, 각 분리한 활성추출물들의 분석자료를 토대로 하여 도 5에 나타난 바와 같은 물질들임을 알 수 있었다.

실시예3 . 항비만 실험

세포배양

Raw264.7(mouse macrophase cell)은 10% Fetal Bovine Serum(FBS), 100 units/㎖ penicillin-streptomycin이 포함된 DMEM 배양액으로 75 T-flask를 사용하여 humid, 37℃의 5% CO₂ incubatior에서 배양하였다. 3-4일 후 세포가 confluent하게 되면 scraper를 사용하여 계대 배양하여 실험에 사용하였다.

Cell viability 의 측정

MTT assay를 이용하여 감태가 세포 생존율에 미치는 영향을 확인하였다. MTT assay는 세포의 증식과 세포의 살아있는 정도를 간접적으로 측정하는 것으로써 세포 감수성에 대한 1차 선별검사의 목적으로 많이 사용된다. 대사과정이 온전한 암세포의 경우 미토콘드리아의 탈수소 효소 작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT tetrazolium을 청자색인 비수용성의 MTT formazan〔3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl

-tetrazolium bromide〕 crystal로 환원시킨다. 생성된 MTT formazan의 흡광도는 살아 있고 대사가 왕성한 세포의 농도를 반영한다. 구체적인 실험 방법은 다음과 같다. 배양된 Raw264.7 세포를 96 well micro-plate에 well당 2 × 10⁵ cell/mL로 100 μL씩 분주하여 37℃의 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양한 후 배지를 제거하고 배지 90 μL와 일정농도의 시료 10 μL를 첨가하여 CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 대조군에는 시료 대신 PBS 10 μL를 첨가하였다. 배지를 제거 한 후 MTT 시약 0.5 mg을 1 mL PBS로 녹인 후, 10% FBS가 함유된 DMEM배지 9 mL와 희석하여 각 well에 100 μL씩 처리한다. 동일한 배양 조건에서 3~4시간 동안 incubation하여 formazan형성을 관찰한다. Formazan이 형성되면 MTT 시약처리 배지를 제거하고 DMSO 100 μL를 넣어서 10분간 반응시켜 540 nm에서 흡광도를 측정한 후 아래의 식을 이용하여 생존률(%)을 구하였다.

3 T3 - L1 세포의 배양 및 지방세포로의 분화 유도

3T3-L1 preadipocytes(ATCC)는 10% FBS, 100 units/mL penicillin-streptomycin이 포함된 DMEM 배양액으로 75 T-flask를 사용하여 humid, 37℃의 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. 3-4일 후 세포가 confluent하게 되면 0.05% Trysin/EDTA를 처리하여 세포를 분리한 후 원심분리(1000 rpm, 3분)하여 세포를 모았다. 그 후 세포의 밀도가 3.3 × 10³ cell/cm² 인 suspension 용액을 만들어 6 well plate에 1 mL씩 plating하여 배양하였다. 2~3일에 한번씩 10% FBS가 포함된 새로운 DMEM 배양액으로 바꿔주었다. 3~4일 후 세포가 confluent되면 이틀 만에 분화배지(DMEM 배양액에 5 μg/mL의 insulin, 0.25 μM Dexamethazone, 0.5 mM IBMX가 첨가된 배지)를 처리하여 분화가 시작되게 하였다. 이틀 후 feeding medium(DMEM 배양액에 5 μg/mL의 insulin만 포함된 배지)으로 배지를 갈아 준 후 2일에 한번 씩 계속 feeding medium로 갈아주며 세포를 분화시켰다. 분화배지 처리 후 7일이 되면 90%이상이 지방세포로 분화하게 되면, sample을 처리하여 24시간동안 incubation 시켰다. 그 후 pellet과 배양액을 각각 모아 실험에 사용하였다.

3 T3 - L1 전구 지방세포에서의 세포 분화능 측정

3T3-L1의 분화능은 Oil Red O로 염색하여 측정하였다. 8일간 배양한 후 배양액을 제거하고 PBS로 세척, 10% formalin으로 10분간 고정시킨 후 Oil Red O를 처리하여 30분간 염색하였다. 염색 후에 증류수로 세척하고 세포내 지방 축적 정도를 관찰하였다. 관찰 후, 증류수를 제거하고 isopropyl alcohol로 용해하여 500 nm에서 흡광도를 측정하였다.

TG 함량의 측정

TG 측정은 Green and Kehinde(Green et al ., 1974)의 방법을 이용하였다. Trypsin-EDTA 처리로 세포를 수축시킨 다음 원심분리(12,000 rpm, 3 min, 4℃)하여 상층액을 제거하였다. Pellet에 homogenizing buffer(KCl 154 mM, Tris 50 mM, EDTA 1 mM)의 비율로 만들어진 triglyceride extraction solution으로 세포 내 triglyceride를 추출하였다. triglyceride의 농도는 TRIGLYZYME-V "EiKen" kit(신양화학, Korea)를 사용하여 spectrophotomerter를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

Glycerol 분비 측정

분화된 지방세포에 sample을 feeding medium에 녹여서 0.2 μm의 filter로 여과한 후 완전히 분화된 지방세포에 처리하였다. 시료처리 후 24시간이 지나면 배지를 모아 glycerol분비량을 측정하였다.

Glycerol 정량은 효소 반응법을 이용하여 free glycerol reagent(Sigma, USA)를 반응시켜 측정하였다. 37℃로 pre-warmed된 free glycerol reagent 1 mL에 collect한 배지 10 μL를 넣어 37℃에서 15분간 incubation 시킨후, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Glucose 소비 측정

배지의 포도당의 농도는 oxidase법을 이용한 glucose kit(GLzyme사)를 이용하여 분석하였다(최미자, 김선화, 2010).

Leptin 측정

지방세포에서 분비하는 호르몬인 Leptin의 양은 배지를 가지고 ELISA (enzyme Linked Immunosolvent Assay, R&D systems) 방법을 이용하여 측정하였다. Leptin 항체가 coating된 96 well plate에 시료 100 μL을 넣어 1시간 동안 배양하였다. PBS-T로 3차례 세척한 후 biotinylated goat anti-mouse leptin IgG 200 μg/mL을 넣고 1시간 동안 상온에서 incubation한 후 다시 PBS-T로 3번 세척한다. Avidine-HRP(horse-radish peroxidase)를 첨가하여 상온에서 1시간 30분 동안 배양한 후 3번 세척한다. 각 well에 100 μL의 TMB(tetramethylbenzidine dihydrochloride substrate)를 넣고 30분 동안 반응시켜 발색시킨 후, 50 μL의 2 M H₂SO₄ 를 첨가하여 반응을 종결한다. 반응 종료 후 흡광도는 450 nm에서 측정한다.

비만 관련 유전자 발현 측정

활성성분에 의한 비만관련 유전자(PPARγ, SREBP1c, C/EBPα 등)의 mRNA 발현 변화는 RT-PCR을 이용하여 확인 하였다. 이 때 Housekeeping 유전자인 GAPDH 유전자를 internal control로 사용하였다. RNA는 시료 처리된 3T3-L1 세포로부터 Trizol reagent(sigma)을 사용하여 total RNA을 추출, 정량하였다. 분리된 RNA내에서 유전자 발현을 분석하기 위해 표준화방법에 따라 역전사 반응을 실시하여 cDNA를 합성하였다. 각 유전자는 94℃에서 5분간 denaturation 반응을 시킨 후, 94℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 1분 동안 35 cycles을 반응시켰다. 다시 72℃에서 5분 동안 유지시킨 후에 4℃에서 종결하였다. PCR 산물은 1% agarose 겔에서 전기영동을 실행 하여 밴드를 확인하였으며, 아래표와 같이 나타났다.

실시예2 . 감태의 조추출물과 n- 부탄올 추출물을 포함함 용매분획물의 활성

3 T3 - L1 전구 지방세포에서의 세포 분화능 측정

분화된 3T3-L1 지방세포에서 감태의 조추출물인 CE과 4개의 용매fractions이 생성된 지방구에 미치는 영향을 확인하기 위하여 Oil Red O 시약을 사용해서 염색하였다. Sample의 농도는 0.5 mg/mL씩 각각 처리하였으며 smaple을 처리하지 않은 control을 기준으로 지방의 축적율을 나타내었다. 도6에 나타난 바와 같이, 그 결과 control에 비해 CE는 22%의 약한 지방 축적 억제율을 보였다. 4개의 fractions중 n-BuOH fraction이 56.4%의 강한 억제율을 나타냈으며 85% aq. MeOH (37.6%), n-hexane (36.0%), H₂O (33.8%) fractions의 순서로 억제 효과가 나타났다. 도7에 나타난 사진에서 보여지는 바와 같이, 이러한 세포 내 지방축적의 억제는 Oil Red O 염색에 대한 현미경적 관찰에서도 동일하게 나타났다.

본 연구는 조추출물과 4개의 fractions들이 지방구 감소효과를 검증하기 위하여 형성된 지방구를 분해 또는 감소시킬 수 있을지 여부를 측정한 것으로 0.5 mg/mL의 농도에서 효과적으로 지방 축적을 억제하는 것을 보여주었으며, 특히 n-부탄올 추출물이 가장 효과적임을 알 수 있다.

Glycerol 분비 측정

지방세포 내 지방구에 축적된 triglyceride는 분해되면 glycerol과 지방산으로 나누어지며 이는 세포외 혈액으로 유리되어 간으로 이송된다. 마찬가지로 3T3-L1 지방세포에서 유리된 glycerol의 함량은 지방구 내 triglyceride의 분해정도를 간접적으로 나타내는 척도가 된다. 본 실험은 감태의 조추출물과 그의 용매분획층이 지방세포에서의 TG의 분해율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 배지를 모아 측정하였으며 sample 1과 0.5 mg/mL의 농도에서 실험하였다.

도 8에 나타난 바와 같이, 조추출물인 CE과 용매분획층은 모든 농도에서 control과 비교시 glycerol 함량이 증가되지 않았지만, n-BuOH fraction은 1과 0.5 mg/mL의 농도에서 glycerol 수치가 증가되는 것으로 나타났다. Glycerol 수치의 증가는 지방세포내 축적되어 있던 중성지방이 glycerol과 지방산으로 분해되어 나타나는 결과로서, n-BuOH fraction이 세포내 축적된 중성지방을 효과적을 분해하는 것으로 사료된다.

비만 유전자 발현 측정

지질의 축적은 지방의 생성과 분해에 밀접한 연관이 있다. 본 연구는 지방구의 생성과 분해에 관련된 각각의 유전자 발현을 통해 물질들의 지방세포분화 억제 메커니즘을 확인하였다.

핵심 조절인자 발현

유전자 PPARγ, SREBP1c, C/EBPα는 비만 관련 핵심 조절인자로 불리우는 유전자로써 지방조직에서 주로 발현되어 지방세포의 분화와 세포내 지방구의 형성에 중요한 영향을 끼친다. 특히 PPARγ, C/EBPα는 지방-특이적 표지 유전자의 활성을 증가 시켜 3T3-L1전구 지방세포를 성숙한 지방세포로 분화 시키며(Corey et al., 2010), SREBP1c은 PPARγ의 발현을 증가 시킴으로 지방생성을 촉진 시킨다(De Vos et al ., 1996).

감태의 조추출물과 분획물들이 세포 내 지방 축적과 분해에 미치는 영향을 알아보기 위해 분화된 3T3-L1 지방세포로부터 이들의 mRNA의 발현을 보았다.

sample의 농도는 0.5 μg/mL씩 각각 처리하였으며 sample을 처리하지 않은 control을 기준으로 mRNA발현양을 비교하였다.

도 9에 나타난 바와 같이, 감태 조추출물인 CE은 PPARγ, C/EBPα의 발현에는 아무 영향을 미치지 못하였으나 SREBP1c의 발현양은 control과 비교해 보았을 때 발현이 감소되는 것을 확인하였다. 4가지 fractions중 특히, n-BuOH fraction은 두 유전자인 PPARγ와 SREBP1c의 발현을 유의적으로 억제하였다. 하지만 C/EBPα의 발현에는 영향을 끼치지 않는 것으로 사료된다. 그 밖에도 85% aq. MeOH fraction이 C/EBPα와 SREBP1c의 발현이 다소 감소됨을 확인하였다.

위의 연구 결과들은 n-BuOH fraction이 지방세포에서 지방세포분화 및 지방축적을 효과적으로 억제함을 증명해주며 n-BuOH fraction을 더욱 정제 분리하여 지방조직에 효과가 좋은 화합물을 분리할 수 있을 것이라고 예상된다.

표적 유전자 발현

감태가 지방 전구세포의 분화에 미치는 추가적인 연구를 위해 세 가지 주요 전사인자들의 표적 유전자가 되는 대표적인 5가지 유전자(FATP1, FAS, FABP4, LPL, ACS1)에 대한 발현을 조사해 보았다.

혈액에 있는 TG는 LPL의 조절하에 지방산과 글리세롤로 분해되고 FATP1등의 단백질에 의해 조직으로 흡수된다. 흡수된 지방산은 FABP4 같은 운반 단백질을 통해 수송되어 ACS1에 의해 지방산 아실-조효소 A복합체를 형성하고 FAS의 작용으로 중성지방으로 저장되거나 에너지 생성을 위해 산화된다.

0.5 μg/mL씩 sample을 세포에 각각 처리하였으며 control은 sample을 처리하지 않았고 이를 기준으로 mRNA발현양을 나타내었다.

도 10에 나타난 바와 같이, FAS, FABP4, LPL, ACS1에서 모든 sample이 유전자의 발현을 유의적인 수준으로 감소시켰으며 특히 n-BuOH fraction에서 크게 감소하는 양상을 보였다. FATP1은 85% aq. MeOH을 제외한 다른 sample에서 유의적인 수준의 억제율을 관찰 할 수 있었으며 이 또한 역시 n-BuOH fraction에서 큰 감소가 나타났다.

지방분해 관련 유전자 발현

지방세포내의 지방구는 지질의 대사와 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 지방구내의 TG의 분해로 인한 glycerol의 유출은 세포 내 지방의 축적을 조절하는 중요한 기전으로 여겨져 왔다. 특히 HSL, TNF α, perilipin 등은 TG의 분해 과정 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Holm C., 2003).

0.5 μg/mL씩 sample을 세포에 각각 처리하였으며 control은 sample을 처리하지 않았고 이를 기준으로 mRNA발현양을 나타내었다.

본 연구는 감태의 항비만 효과와 지방구의 분해와의 상관 관계를 알아보기 위하여 HSL, TNF α, perilipin의 mRNA발현 양상을 살펴 본 결과 도 11에 나타난 바와 같이, 4가지 fractions 모두 perilipin유전자를 유의적인 차이로 억제 시켰고 특히 n-BuOH fraction에서 큰 감소가 관찰되었다. HSL과 TNF α역시 모든 sample이 유의적인 활성을 보였으며 n-BuOH fraction에서 큰 억제 활성이 나타났다.

실시예3 . n- 부탄올 추출물을 재차 분리한 활성화합물( compound 1 -6)의 활성

3 T3 - L1 전구 지방세포에서의 세포 분화능 측정

지방 생성 억제 효과를 직접 확인하기 위해서 세포내 중성지방만을 염색시키는 Oil Red O 염색 방법을 실행하였으며, 중성지방에 염색된 Oil Red O는 isopropyl alcohol로 녹여내어 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. Sample의 농도는 50 μM씩 각각 세포에 처리하였으며 smaple을 처리하지 않은 control을 기준으로 지방의 축적율을 나타내었다.

도 12에 나타난 바와 같이, 모든 sample에서 지방구의 감소가 유의적으로 나타났으며, 그 중 compound 6에서 가장 유의적인 수준의 지방구 감소가 관찰되었다.

TG 축적 측정

지방 생성 억제 효과는 중성지방의 축적 정도와 밀접하게 연관되어 있으며 대부분의 지방구는 TG와 같은 지방으로 구성되어 있기 때문에 지방구의 감소를 보다 정확하게 확인하기 위해 TG의 함량을 흡광도를 통해 확인해 보았다. Sample의 농도는 50, 20 μM로 각각 처리하였으며 smaple을 처리하지 않은 control을 기준으로 지방의 축적율을 나타내었다.

도 13에 나타난 바와 같이, TG생성은 20, 50 μM의 compound 6을 처리하였을 때 6, 33%의 감소를 보였으며 compound 5는 각각 42, 56%, compound 3은 40, 45%의 농도 의존적인 감소를 보였다. 또한 compound 2의 농도가 20, 50 μM일 때 각각 42, 74%로 TG생성이 감소되는 것을 확인 할 수 있었다.

Glycerol 분비 측정

감태유래의 활성화합물들이 TG의 분해에 미치는 영향을 알아보기 위해 free glycerol함량을 측정하였다. sample의 농도는 5 μM로 처리하였으며 smaple을 처리하지 않은 control을 기준으로 glycerol의 양을 나타내었다.

도 14에 나타난 바와 같이, 모든 sample에서 유의적으로 glycerol 분비량이 증가하였다. compound 2, compound 3, compound 5가 각각 90, 94, 89%로 증가시켰으며 특히 compound 6에서 sample처리를 하지 않은 control에 비해 free glycerol함량이 2배 증가하였다. 이번 실험은 감태유래의 화합물들이 5 μM의 적은 농도에서도 지방 분해효과가 나타남을 증명하였다.

Glucose 소비 측정

지방세포에서 glucose의 흡수는 인슐린 신호전달체계에 의해 세포질에서 세포막으로 이동하는 glucose trans - porter 4(Glut-4)에 의해 이루어 지며 Glut-4의 isomer형태인 Glut-1 형태가 있다. 지방세포에서 이 두 형태가 주로 glucose의 흡수에 관여하며 Glut-1은 세포막에 항상 존재하는 반면 Glut-4는 세포질에 존재한다. 인슐린의 존재시 Glut-4는 세포막으로 이동하여 glucose의 흡수를 용이하게 도와준다. 흡수된 glucose는 glycerol로 전환되고 지방산과 합쳐져 TG로 합성되어 지방구를 형성하거나 에너지 합성에 쓰이게 된다. 따라서 지방세포 내로 glucose의 유입은 지방세포의 분화와 세포내 지방구의 형성에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(차승윤 et al., 2010). 본 연구는 감태유래의 화합물들이 지방대사에 미치는 영향을 확인하기 위해 3T3-L1 지방세포에서 glucose의 유입을 확인하기 5, 50 μM의 농도로 sample을 처리하였으며 sample을 처리하지 않은 control을 기준으로 glucose함량을 나타내었다.

도 15에 나타난 바와 같이, 모든 sample이 glucose의 유의적인 감소를 보였으며 compound 2는 5, 50 μM의 농도일 때 각각 41, 49%, compound 5는 47, 48%, compound 6은 61,53%의 감소를 보였다. 또한 compound 3은 60, 63%의 비율로 농도 의존적으로 glucose의 함량이 감소되었음을 알 수 있었다.

Leptin 측정

지방생성 억제 능력을 확인하기 위한 방법으로써 렙틴분비량을 측정하였다. 렙틴은 지방세포에서 주로 분비되는 단백질로써 생체내에서 중추신경계에 작용하여 에너지 소비를 촉진시키고 식욕을 억제하며 에너지 항상성을 유지시키는 호르몬이다(Campfield LA et al., 1995). 또한 지방축적의 정도를 알아볼 수 있는 지표로써 비만인은 혈중 렙틴 농도가 정상인 보다 높으며 in vitro에서도 지방세포의 지방축적에 비례하여 렙틴의 농도가 높아지는 것으로 알려져 있다(Havel PJ., 2000).

도16에 도시된 바와 같이, 지방세포에 각각의 화합물을 처리한 결과 compound 3과 compound 6은 렙틴 분비량에 영향을 미치지 못 했으나 compound 5는 약간의 억제활성을 보였으며 compound 2에서는 렙틴의 분비량을 24%감소시켰다. 이러한 결과를 통해서 compound 2가 렙틴 분비량을 유의적으로 감소시킴을 확인 할 수 있었다.

비만 관련 유전자 발현 측정

감태에 의한 지방축적의 감소가 지방생성의 억제와의 상관관계를 알아보기 위하여 각각의 화합물들을 50, 5 μM의 두 가지 농도로 처리한 후 지방생성 관련 유전자들의 발현 정도를 살펴보았다.

핵심 조절인자 발현

감태유래 화합물들이 세포 내 지방 축적과 분해에 미치는 영향을 알아보기 위해 비만 관련 핵심 조절인자로 불리우는 유전자 PPARγ, SREBP1c, C/EBPα의 mRNA의 발현을 보았다. Sample의 농도는 5와 50 μg/mL 두 가지 농도로 처리하였으며 sample을 처리하지 않은 control을 기준으로 mRNA발현양을 비교하였다.

도 17에 도시된 바와 같이, 두 가지 농도 모든 sample이 PPARγ, SREBP1c를 유의적인 수준으로 감소시켰으며, C/EBPRα의 경우에는 compound 2를 제외한 모든 화합물이 처리 농도에서 유의적으로 이를 감소시키는 것을 관측할 수 있었다. 세 가지 유전자 모두를 효과적으로 감소시키는 화합물은 compound 3과 compound 6이었으며 가장 강한 억제효과를 보이는 것은 compound 6이었다.

표적 유전자 발현

감태유래의 화합물들이 지방 전구세포의 분화에 미치는 추가적인 연구를 위해 세 가지 주요 전사인자들의 표적 유전자가 되는 대표적인 6가지 유전자(FATP1, FAS, FABP4, LPL, ACS1, leptin)에 대한 발현을 조사해 보았다.

도 18에 나타난 바와 같이, 5, 50 μM씩 sample을 각각 처리하여 mRNA발현양을 측정한 결과 두 가지 농도 모두에서 compound 2와 compound 5는 FABP4를, compound 3은 FABP4와 FATP1을 유의적으로 억제하는 것이 관찰되었다. 또한 compound 6이 6가지 모든 유전자를 크게 억제 시키는 양상이 나타났다.

지방분해 관련 유전자 발현

지방 생성 억제 효과를 관찰한 결과 지방구 크기의 감소와 렙틴 분비량이 유의적인 수준으로 감소되었다. 이러한 지방축적의 감소가 감태유래의 화합물들에 의한 지방분해 효과인지를 알아보기 위하여 대표적인 지방분해 유전자인 HSL, TNFα, Perilipin의 유전자 발현 수준을 측정하였다. Sample은 5, 50 μM 두 가지 농도로 각각 처리하였으며 이을 기준으로 mRNA발현양을 나타내었다.

도19에 나타난 바와 같이, 모든 sample이 두 가지 농도에서 모두 HSL의 발현을 유의적으로 증가 시켰다. TNFα는 compound 6에 의해 발현양이 농도 의존적으로 감소되었으며 perilipin의 발현은 compound 3과 compound 6에 의해 크게 감소됨을 확인 할 수 있었다.

요약 및 결론

Oil Red O 염색약을 통한 지방구의 관찰실험에서 조추출물(CE)은 22%의 약한 지방구 억제 효과를 나타냈으나 n-BuOH fraction에서는 56.4%의 높은 비만 억제효과를 보였다. 감태의 4가지 fractions중 특히 n-BuOH fraction이 PPARγ와 SREBP1c를 유의적으로 억제하였다. 그 밖에 FAS, FABP4, LPL, ACS1 유전자에 대해서도 4가지 fractions 모두 유전자의 발현을 유의적인 수준으로 감소시켰으며 특히 n-BuOH fraction은 이들 유전자들의 발현을 크게 감소시키는 양상을 보였다. 이와 같이 지방축적에 대해 좋은 억제활성을 보이는 n-BuOH fraction으로부터 여러 가지 크로마토그래피를 이용하여 총 6개의 화합물을 분리 하였으며, 이 화합물들에 대한 항비만 실험을 실시한 결과 모든 sample이 세포 내 TG 함량을 유의적으로 감소시켰으며 특히 compound 2의 농도가 20, 50 μM일 때 각각 42, 74%로 TG 생성이 감소되는 것을 확인 할 수 있었다. Leptin의 수준 또한 5 μM의 다소 적은 농도인 compound 2에서도 유의적으로 감소하는 것이 관측되었다. 이러한 지방함량이 감소되는 과정을 알아보기 위해 glycerol과 glucose 함량을 각각 측정하였으며 그 결과 glucose함량은 모든 sample에서 유의적인 감소를 보였는데 그 중에서 compound 2는 5, 50 μM의 농도일 때 각각 41, 49%, compound 5는 47, 48%, compound 6은 61,53%의 감소를 보였다. 또한 compound 3은 60, 63%의 비율로 glucose의 함량이 감소시킴을 알 수 있었다. glycerol 함량은 모든 sample에서 유의적으로 증가하였고 특히 compound 6에서 sample 처리를 하지 않은 control에 비해 glycerol 함량이 2배 증가하였다. 본 발명에서는 감태유래 화합물들의 항비만 효과를 검증하기 위하여 3T3-L1 지방세포에서 지방축적 저해 효과를 측정하였으며 아울러 mRNA에서 비만관련 유전자들의 발현 정도를 관찰함으로써 지방축적 저해에 관한 기작을 살펴볼 수 있었다. 감태유래 활성화합물의 지방분화 억제활성은 지방분화 과정중에 분비되는 세 가지 주요 전사인자들(PPARγ, SREBP1c, C/EBPα)의 발현 감소로 인해 지방세포에서 생성 되는 특이적인 유전자들인 FATP1, FAS, FABP4, LPL, ACS1의 발현 억제를 확인하였으며 또한 지방 분해 효소인 HSL을 증가 시키고 perilipin과 TNFα를 억제 시킨다는 것이 확인되어 이러한 adipogenic protein들의 저해가 지방축적 저해에 크게 기여하는 것으로 여겨진다. 이러한 결과는 감태 유래된 phlorotannin 계열의 활성화합물들이 지방분화과정에 관련된 기초 및 임상연구에 이용될 수 있는 유용한 물질들일 뿐만 아니라 비만을 치료할 수 있는 선도물질로 사용 가능함을 알 수있다.

Claims (6)

1. 비만 억제용 으로 사용하기 위한 갈조류 감태(Ecklonia cava)를 건조, 파쇄하여 분말로 제작 후, 메탄올에서 조추출된 조추출물을 다시 이차적으로 n-부탄올에서 재차 추출된 추출물임을 특징으로 하는 비만억제의 기능을 가지는 갈조류 감태의 n-부탄올 추출물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 n-부탄올 추출물은,
   감태 분말을 메탄올(methanol(MeOH)) 용매를 끓는점 까지 가열하여 추출하고, 얻어진 추출액을 다시 상온 상태의 메탄올(MeOH)에 녹인 후 농축하여 디솔팅(desalting)된 조추출물을 용매 극성에 따라 순차적으로 분획하여, n-헥산(n-hexane), 85%수용액메탄올(85% aq. MeOH), n-부탄올(n-BuOH), 수(H₂O) 분획물중 얻어진 n-부탄올 추출물임을 특징으로 하는 비만억제의 기능을 가지는 갈조류 감태의 n-부탄올 추출물.
3. 제1항 또는 제2 항에 있어서,
   상기 n-부탄올 추출물은 비만 억제용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 비만 억제의 기능을 가지는 갈조류 감태의 n-부탄올 추출물.
4. 갈조류 감태의 n-부탄올 추출물을 실리카 컬럼크로마트그래피(silica column chromatography)를 통해 세부적인 분획물로 나누고, 각 분획물을 적정 농도의 MeOH in CHCl₃ 에 녹인후 sephadex LH20 column chromatography를 통하여 활성화합물을 분리해 내는 것을 특징으로 하는 비만 억제의 기능을 가지는 갈조류 감태의 n-부탄올 추출물.
5. 제 4항에 있어서,
   상기 분리된 활성추출물은 트리플로레솔-A(Triphlorethol-A),엑콜(Eckol), 엑스토로놀(Eckstolonol), 플로로푸코로엑콜(Phlorofuroeckol) 또는 디엑콜(Dieckol)중 어느 하나임을 특징으로 하는 비만 억제 기능을 가지는 갈조류 감태의 n-부탄올 추출물.
6. 제 4항 또는 제 5항에 있어서,
   상기 각 활성화합물은, 감태의 n-BuOH 분획에 대해 MeOH과 CHCl₃의 혼합용매를 사용하여 silica gel flash column chromatography를 실시하였으며 100% CHCl₃(nfc 1), 5% (nfc 2), 10% (nfc 3), 20% (nfc 4), 30% (nfc 5), 40% (nfc 6), 50% (nfc 7), 70% (nfc 8) MeOH in CHCl₃과 100% MeOH (nfc 9) 그리고 90% MeOH in H₂O (nfc 10) 용매 분획 을 얻고, nfc 4번을 40% MeOH in CHCl₃로 LH20 실행 하여 엑콜(Eckol) 플로로푸코로엑콜(Phlorofuroeckol)을 얻고, 그 중 subfraction 4와 subfraction 8을 30% MeOH in CHCl₃로 sepadex LH20하여 엑스토로놀(Eckstolonol)과 트리플로레솔-A(Triphlorethol-A)을 언으며, nfc 5번 2.6 g을 100% MeOH 용매로 LH20를 수행하였으며, 얻어진 subfraction 5를 reLH20 (30% MeOH in CHCl₃)를 실행하여 디엑콜(Dieckol)을 분리하여 얻는 것을 특징으로 하는 비만 억제의 기능을 가지는 갈조류 감태의 n-부탄올 추출물.

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