이하 본 발명을 좀 더 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.
전술한 바와 같이, 본 발명에서는 해양 식용 갈조류에서 분리한 디벤조-p-디옥신(dibenzo-p-dioxine) 유도체가 협동적인 기작으로 신경세포를 보호할 뿐만 아니라 소염작용이 있음을 발견하였으며, 상기 디벤조-p-디옥신 유도체를 포함하는 신경통 개선제가 부작용 없이 노인들의 신경통증을 현저히 감소시키고, 생활의 질을 크게 높여주는 것을 확인하였다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 해조식물로부터 추출한 신경세포 보호작용 및 염증억제 작용 성분을 함유하는 신경통 개선제는 해조류로부터 분리한 신경세포보호 활성을 갖는 하기 화학식 1 내지 10으로 표시되는 화합물로부터 하나 또는 그 이상 선택된 디벤조-p-디옥신 유도체를 0.1 내지 99.9중량%로 함유한다.
[화학식 1] [화학식2]
[화학식 3] [화학식4]
[화학식5] [화학식6]
[화학식7] [화학식8]
[화학식9] [화학식10]
상기 화학식에서, R은 수소, 탄소수 1 내지 10의 알킬, 탄소수 2 내지 10의 알케닐, 페닐, 탄소수 7 내지 10의 페닐알킬, 탄소수 1 내지 10의 알카노일, 히드록시 페닐 또는 디히드록시페닐 기이며, 바람직하게 R은 수소이다.
상기 화학식 1 내지 10으로 표시되는 디벤조-p-디옥신 유도체는 본 발명의 신경통 개선제에서 최소 하나 또는 두개 이상의 혼합물로 0.1 내지 99.9중량%로 포함될 수 있다. 상기 화합물이 2이상의 혼합물로 사용되는 조성물의 경우는 화학식 1로 표시되는 디벤조-p-디옥신 유도체는 0.1 내지 6중량%, 화학식 2로 표시되는 디벤조-p-디옥신 유도체는 5 내지 60중량%, 화학식 3으로 표시되는 디벤조-p-디옥신 유도체는 1 내지 30중량%, 화학식 4로 표시되는 디벤조-p-디옥신 유도체는 0.5 내지 20중량%, 화학식 5로 표시되는 디벤조-p-디옥신 유도체는 0.1 내지 10중량%, 화학식 6으로 표시되는 디벤조-p-디옥신 유도체는 0.5 내지 15중량%, 화학식 7로 표 시되는 디벤조-p-디옥신 유도체는 0.1 내지 5중량%, 화학식 8로 표시되는 디벤조-p-디옥신 유도체는 0.1 내지 5중량%, 화학식 9로 표시되는 디벤조-p-디옥신 유도체는 0.1 내지 10중량%, 화학식 10으로 표시되는 디벤조-p-디옥신 유도체는 0.1 내지 12중량%의 범위로 혼합되는 것이 좋으며, 상기 혼합물을 위해 선택된 조성물은 상기에 기재된 조성비의 범위 내에서 서로 혼합되어 100중량%를 이루도록 구성된다. 상기 함량은 각각의 디벤조-p-디옥신 유도체가 갖는 신경세포보호활성 및 염증 억제활성을 나타내는 유효 용량을 고려한 범위이며 상기 범위를 벗어날 경우 신경세포보호 및 염증 억제 효과가 감소되는 경향이 있다.
본 발명에서 디벤조-p-디옥신 유도체를 추출하기 위해 사용하는 상기 갈조류는 아이세니아 바시클리스(Eisenia bicyclis), 아이세니아 아르보레아(Eisenia arborea), 아이세니아 데스마레스티오데스(Eisenia desmarestioides), 아이세니아 갈라파제니스(Eisenia galapagensis), 아이세니아 매소니(Eisenia masonii), 에클로니아 쿠로메(Ecklonia kurome), 에클로니아 카바(Ecklonia cava), 에클로니아 스톨로니페라(Ecklonia stolonifera), 에클로니아 맥시마(Ecklonia maxima), 에클로니아 라디아타(Ecklonia radiata), 에클로니아 바이시클리스(Ecklonia bicyclis), 에클로니아 바이런시네이트(Ecklonia biruncinate), 에클로니아 부시날리스(Ecklonia buccinalis), 에클로니아 카에파에스팁스(Ecklonia caepaestipes), 에클로니아 엑사스퍼타(Ecklonia exasperta), 에클로니아 파스티기아타(Ecklonia fastigiata), 에클로니아 브레빕스(Ecklonia brevipes), 에클로니아 아라보레아(Ecklonia arborea), 에클로니아 라티폴리아(Ecklonia latifolia), 에클 로니아 무라티(Ecklonia muratii), 에클로니아 라디코사(Ecklonia radicosa), 에클로니아 리타디아나(Ecklonia richardiana), 및 에클로니아 라이티(Ecklonia wrightii)이며, 바람직하게는 아이세니아 바이시클리스(Eisenia bicyclis), 에클로니아 카바(Ecklonia cava), 에클로니아 쿠로메(Ecklonia kurome) 및 에클로니아 스톨로니페라(Ecklonia stolonifera)이다.
상기 갈조류로부터 디벤조-p-디옥신을 추출하는 방법은 통상적인 유기 용매 추출법으로 수행된다. 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 에틸 아세테이트, 아세토니트릴, 아세톤, 물, 및 이들의 혼합물이며, 바람직하게는 물/에탄올이다. 선택적으로, 수득율을 높이기 위해 추출과정을 2회 이상 반복하여 실시할 수 있다. 추출물에 함유된 잔사 및 용매는 원심분리기 및 회전증발 농축기와 같은 통상적인 분리, 농축 수단을 이용하여 제거하며, 보다 순도 높은 형태가 요구될 경우 추가적인 분리 정제과정을 거칠 수도 있으나, 별도의 추가공정 없이도 상기 추출물을 사용할 수 있어 경제적으로 유리한 장점이 있다.
본 발명의 신경통 개선제는 의약품 및 식품의 형태로 제조될 수 있다. 이때, 본 발명의 신경통 개선제는 약학적 유효량으로 함유되며, 상기 유효성분인 디벤조-p-디옥신 유도체 또는 그 혼합물의 유효량은 전체 신경통 개선제의 0.1 내지 99.9중량%의 범위에서 선택하여 사용되며, 제제의 제조용이성 및 투여의 용이성 등으로 바람직하게는 20 내지 70 중량%이다.
본 발명의 신경통 개선제는 상기 유효성분이외에 이 기술분야에서 통상적으로 사용되는 부형제를 사용할 수 있다. 부형제는 폴리올(만니톨, 소르비톨, 수크로 오스 등)과 같이 희석제 및 향미제, 크럼블링 제제 또는 팽윤제(나트륨 크로스카르멜로스, 녹말 및 유도체, 셀룰로오스 및 유도체 등), 윤활제(마그네슘 스테아레이트 등), 유동제(에어로실 200등) 등이 사용될 수 있으며, 또한, 대추엑기스, 포도추출액 , 다시마추출물, 과당, 과당글루코오즈액당, 스타치, 로얄젤리, 액당, 식용당근 분말, 정제벌꿀, 정제 슈크로오스, 탈지분유, 매실액기스, 설탕가루, 녹차분말 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 개선제를 의약품으로 제조 시 약제학적으로 허용가능한 모든 형태로 제조되며, 약제학적 분야의 통상적인 방법에 따라 주사제, 액상제, 환제, 정제, 캅셀제, 산제 및 현탁제 등의 제제로 제형화 시킬 수 있으며, 바람직하게는 정제, 캅셀제, 또는 액상제이다.
또한 본 발명의 개선제는 인체에 대한 독성이 전혀 없어 장기적으로 섭취 가능하므로 건강보조식품으로도 사용될 수 있다. 건강기능성식품으로 제조되는 경우 환제, 정제, 캅셀제, 음료나 제빵 류에 포함된 형태가 가능하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 개선제는 매일 1㎎ 내지 1000mg/㎏, 바람직하게는 1 내지 100㎎/㎏씩 섭취하는 것이 효과적이며, 섭취방법은 특별히 한정되는 것은 아니나, 경구투여가 바람직하다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하나, 이에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
근해에서 채취한 해조류인 감태(Ecklonia cava)와 대황(Eisenia bicyclis)을 먼저 증류수로 세척하여 이물질을 제거한 뒤 음지에서 건조한 후에 이를 파쇄한다. 상기 해조류로 이루어진 해조류 500g(감태 350g, 대황150g)을 함량 대비 20배량의 10% 알코올성 용매를 사용하여 활성물질을 용출시키기 위해 2시간 동안 환류 추출한다. 이러한 과정을 2회 반복하여 추출하였다. 그 다음, 잔사를 걸러서 제거하고 회전 증발농축기를 사용하여 용매 추출액을 감압 농축하였다. 농축액을 20배량의 95% 에탄올에 현탁하고, 3회 추출하여 여과하고, 추출액을 감압농축 하여 조추출물을 얻었다.
실시예 2 내지 11
상기 실시예 1로부터 제조한 조추출물을 15 배량의 실리카겔에 로딩한 후 에틸아세테이트/아세톤(부피비9/1)의 혼합용매를 사용하여 디벤조-p-디옥신 유도체를 유출시켜 농축한 후, 0.2㎛ 막여과지로 여과하여 고속 액체 크로마토그라피에 로딩(loading)하였다. 고속 액체 크로마토그라피에서는 컬럼은 HP ODS Hypersil 컬럼을, 용매로는 증류수와 메탄올을 사용하였으며, 용매의 공급은 1.0㎖/분의 유속으로 메탄올 15% 에서 70%까지 30분간에 걸쳐 선형구배 (linear gradient)를 걸어 디벤조-p-디옥신 유도체 들을 10개의 단일물로 분리하였다. (표1)
실시예 12 내지 16
상기 실시예 2 내지 11의 시료 및 그들의 혼합물을 표1과 같은 다양한 조성의 조성물을 만들었다. (표1 참조)
비교예 1 내지 5
염증억제를 통한 신경보호작용으로 알려진 천연성분인 EGCG, 레스베라트롤, 케르세틴, 녹차 추출물, 포도씨 추출물을 대조군으로 사용하였다. (표1)
실시예 17
LPS에 의해 유도된 염증반응에 대한 신경세포 보호활성
IMR-32 뇌종양 세포주(neuroblastoma cell line)는 미국의 ATCC로부터 구입 하였다. IMR-32를 최소필수 배양배지(Minimum Essential Medium[MEM])에 10%의 송아지 혈청을 함유한 배지로 배양하였다. 각 시료를 디멜틸설폭사이드(DMSO) 중 10㎎/㎖이 되도록 넣었고, 이를 배양 배지를 사용하여 1000:1로 희석하였다. 최종 DMSO의 농도는 0.1%이었는데, 이 농도에서는 본 세포주의 세포성장이나 사멸에 영향이 없었다. IMR-32 세포주를 2 × 105cell/ml 농도로 96웰 플레이트(well plate)에 180㎕씩 분주(loading)하고, 24시간 경과 후, 세포가 웰 플레이트 바닥에 잘 부착했는지 확인하고, LPS를 최종농도 1ug/mL이 되도록 처리하고, 각 샘플를 최종농도 10㎍/㎖이 되도록 처리하여 24시간 반응시킨 후, XTT 분석(XTT assay)을 다음과 같이 수행하였다. 1㎎/㎖ XTT 5㎖과 0.383㎎/㎖의 N-메틸디벤조피라진(N-methyl dibenzopyrazine (PMS)) 0.1㎖을 37℃ 수욕조(waterbath)에서 깨끗이 녹인 후 섞어서 XTT 표지 혼합물(labeling mixture)을 만들었다. 이 혼합물을 시료를 처리한 세포에 50㎕/well씩 넣고, 3 내지 4시간 동안 발색시켰으며, 450nm에서 광학 밀도(optical density; OD)를 측정하였다. 대조군으로 LPS를 포함하지 않는 비히클과 음성 대조군으로 LPS를 포함한 vehicle을 사용하였다. 세포보호효과는 다음 식에 의해 결정하였으며 표3에 정리되어있다.
세포보호효과(%) = 100 x (ODs -ODp)/(ODn - ODp)
ODs : LPS 와 샘플이 처리된 군의 OD 값
ODp : LPS 만 처리된 군의 OD 값
ODn : LPS 처리안된 군의 OD 값
실험결과, 디벤조-p-디옥시 유도체 및 이들로 이루어진 조성물은 비교군에 비해 현저하게 우수한 세포보호 활성을 나타내었다.
실시예 18
염증유발 cytokine 생성 억제 효과:
TNF-α, IL-1β 및 IL-6 는 proinflammatory cytokine 들로서 염증반응을 유발시켜 신경세포의 파괴를 촉발하는 것으로 잘 알려져 있다. 이에 따라 각 샘플들의 이들을 억제하는 효과를 연구하였다.
랫트 대식세포 (RAW 264.7)를 10%의 송아지 혈청과 1% penicillin /streptomycin 이 함유된 최소필수 배양배지 (DMEM) 로 배양하였다. 배양조건을 37℃, 5% CO2, 포화습도로 하였다. 세포주를 2 × 105cell/ml 농도로 96웰 플레이트(well plate)에 분주(loading)하고, 24시간 경과 후, 세포가 웰 플레이트 바닥에 잘 부착했는지 확인하고, LPS(E. coli, serotype 055:B5)를 최종농도 1ug/mL이 되도록 처리하고, 각 샘플를 최종농도 10㎍/㎖이 되도록 처리하여 18시간 반응시켰다. TNF-α, IL-1β 및 IL-6 의 농도를 ELISA 법을 이용하여 결정하였으며, 억제율은 다음 식을 사용하여 결정하였다.
억제율(%) = 100 x (Cp-Cs)/(Cp-Cn)
Cs : LPS 와 샘플이 처리된 군의 cytokine 농도
Cp : LPS 만 처리된 군의 cytokine 농도
Cn : LPS 처리 안된 군의 cytokine 농도
LPS를 처리하지 않은 세포에서는 cytokine의 발현이 나타나지 않았으며, LPS 처리군 및 샘플군의 각각의 cytokine 농도 (pg/mL)는 표2에 정리되어있다.
식에 의하여 각 성분의 억제율을 표3 에 정리하였다.
실험결과, 염증유발인자인 사이토카인의 발현을 억제하는 효과에 있어서 디벤조-p-디옥시 유도체 및 이들로 이루어진 조성물이 비교군에 비해 현저하게 우수한 효과를 나타내었다.
실시예 19
랫트에서의 단회 독성시험
5주령의 SD 랫트를 7일간의 순화기간을 거친 후 시험에 사용하였다. 물과 사료에 대한 접근을 자유롭게 하였으며, 23±1 ℃, 습도 55±5%, 12시간 명암주기를 유지하였다. 실시예 1 조성물의 투여용량을 2000, 667, 222, 0 mg/kg/일 하여 군당 암수 각 10마리씩 나누어 단회 경구 투여 후 2주간 관찰하고 부검하였다. 결과는 다음과 같다.
1. 사망률: 관찰기간동안 암·수 대조군 및 시험물질투여군에서 사망례는 관찰되지 않았다.
2. 일반증상관찰: 관찰기간동안 투여에 기인한 일반증상은 관찰되지 않았다.
3. 체중변화: 관찰기간동안 시험물질투여군의 수컷에서 7일째와 14일째 대조군에 비하여 유의성 있게 체중증가억제가 관찰되었다(p<0.05).
4 .육안적 부검소견: 모든 동물의 부검결과 특기할 만한 육안적 병변은 관찰되지 않았다.
이상의 결과로, 랫드를 이용한 경구 단회투여시 개략의 치사량은 각각 2,000 mg/kg 이상으로 판단되었다.
실시예 20
마우스에서의 4주간 반복투여 독성시험
5주령의 ICR 마우스를 7일간의 순화기간을 거친 후 시험에 사용하였다. 물과 사료에 대한 접근을 자유롭게 하였으며, 23±1 C, 습도 55±5%, 12시간 명암주기를 유지하였다. 실시예 1의 조성을 투여용량을 200, 67, 22 및 0 mg/kg/일 하여 군당 암수 각 10마리씩 나누어 4주간 반복 경구투여 하였다. 시험항목 및 결과는 다음과 같았다.
(1) 시험물질의 투여와 관련된 사망동물은 관찰되지 않았다.
(2) 시험물질의 투여와 관련된 일반증상의 변화는 관찰되지 않았다.
(3) 체중변화에서는 암수 모두 시험물질투여와 관련된 변화는 관찰되지 않았다.
(4) 사료 및 물 섭취량에서도 암수의 모든 투여군에서 시험물질의 투여와 관련된 이상은 인정되지 않았다.
(5) 안검사에서는 암수의 모든 투여군에서 이상이 관찰되지 않았다.
(6) 요검사에서도 암수의 모든 투여군에서 시험물질 투여에 의한 독성학적인 이상은 관찰되지 않았다.
(7) 혈액학적 검사에서는 암수의 모든 투여군에서 시험물질 투여에 의한 독성학적인 변화는 관찰되지 않았다.
(8) 혈액생화학적 검사에서도 시험물질의 투여와 관련된 독성학적인 변화는 관찰되지 않았다.
(9) 부검소견에서는 암수의 모든 투여군에서 시험물질의 투여에 의한 이상소견이 관찰되지 않았다.
(10) 장기중량에서는 암수의 모든 투여군에서 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
(11) 병리조직학적인 검사에서도 시험물질의 투여에 의한 어떠한 독성학적인 변화도 관찰되지 않았다.
이상의 결과로 보아 본 시험에서 랫트에서의 4주간 반복 경구투여에 의한 독성학적인 변화는 관찰되지 않았다. 따라서 본 시험물질의 무영향량(NOEL)은 200㎎/㎏/day 이상으로 판단되었다.
실시예 21
액상제제의 제조
체내 흡수를 촉진하고, 거부감이 없는 액상 제제 및 위약을 다음과 같이 제조하였다.
대추엑기스 (36brix, 15ml), 포도추출액 (12brix, 65ml), 실시예 1의 추출물 (0.5 g), 다시마추출물(1.0g),를 상온에서 1시간 동안 혼합한 후, 폴리에틸렌 파우치로 포장하였다. (내용량 80mL)
위약은 실시예 1의 성분만 제외하고는 위의 조성 및 포장이 동일하도록 하였다. 시료와 위약은 맛을 구별할 수 없었다.
실시예 22
본 발명의 성분이 함유된 식품을 이용한 인체에서의 신경통완화효과를 확인하기 위하여 표 4a의 조건으로 시험하였고, 그 결과는 표 4c 및 표4d에 나타내었다.
시료군과 위약군은 나이, 성별, 신장, 체중 및 0주차의 증상에 있어서 통계적으로 유의적인 차이가 없었다. (P >0.1)
피험자의 전반적 증상평가에 있어서, 위약군의 경우, 0주차 대비 2주(P=0.479), 4주 (P=0.070) 째에서 미약하게 개선되는 경향이 보이나 유의성이 없었다. 반면, 실험군의 경우, 2주차에 15% (P=0.051), 4주차에 32% (P<0.001) 의 현저한 개선효과를 보였다. 시험군과 위약군의 평가 주 별 비교 결과 (표), 0주차에는 시험군과 위약군이 유의적인 차이를 보이지 않았으나, 2주차 및 4주차 에는 유의적인 차이를 보였으며, 그 차이 또한 4주차에는 더욱 커졌다.
Visual analogue scale of Pain 에 있어서도, 위약군의 경우, 0주차 대비 2주(P=0.361), 4주 (P=0.102) 째에서 미약하게 개선되는 경향이 보이나 유의성이 없었다. 반면, 실험군의 경우, 2주차에는 유의성은 없었으나 21% (P=0.109)의 개선효과를 보였고, 4주차에는 유의성을 보이면서 39% (P=0.002) 의 현저한 개선효과를 보였다. 시험군과 위약군의 평가 주 별 비교 결과 (표), 0주차에는 시험군과 위약군이 유의적인 차이를 보이지 않았으나(P=0.087), 2주차 및 4주차 에는 유의적인 차이를 보였으며, 그 차이 또한 4주차에는 더욱 커졌다.