KR101057483B1

KR101057483B1 - 9-히드록시-알파-토코페론을 포함하는 신경세포 손상의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101057483B1
Application number: KR1020090030959A
Authority: KR
Inventors: 박해룡; 한창석; 한동열
Original assignee: 한동열; 한창석
Priority date: 2009-04-09
Filing date: 2009-04-09
Publication date: 2011-08-17
Also published as: KR20100112447A

Abstract

본 발명은 9-히드록시-알파-토코페론 또는 이의 염을 활성성분으로서 포함하는 신경세포 손상의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 조성물은 신경세포 손상에 대한 보호 효과로 인하여 퇴행성 뇌질환, 척수손상, 또는 말초신경 손상의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 본 발명은 본 발명에 따는 조성물을 포함하는 의약품 및 건강기능식품을 제공한다. 본 발명은 또한 제비꽃으로부터 9-히드록시-알파-토코페론을 제조하는 방법을 제공한다.

9-히드록시-알파-토코페론, 신경세포, 신경질환

Description

9-히드록시-알파-토코페론을 포함하는 신경세포 손상의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating damage of nerve cells comprising 9-hydroxy-α-tocopherone}

본 발명은 9-히드록시-알파-토코페론 또는 이의 염을 포함하는 조성물의 신경세포 손상에 대한 예방 또는 치료용도에 관한 것이다.

최근 생활환경과 식생활 패턴의 변화 등으로 현대인들은 생체조직의 노화를 비롯한 퇴행성 신경질환에 관심이 커지고 있다. 또한 급속한 노령 인구의 증가에 따라, 뇌, 척추, 말초신경의 손상을 포함한 퇴행성 신경질환이 계속해서 증가하고 있는 추세이다. 퇴행성 신경질환은 허혈에 기인한 신경손상 및 활성산소에 의한 신경손상과 관련된 질환을 포함한다.

뇌허혈과 관련한 신경세포사 기전으로는 2가지가 알려져 있다. 하나는 뇌 허혈에 의해서 세포 바깥에 과도한 글루타메이트(glutamate)가 축적되게 되면, 이러한 글루타메이트가 세포내로 유입되어 결국 과도한 세포내 칼슘의 축적으로 신경세포사가 유발된다는 기전(Kang TC, et al., Chronological changes of N-methyl-D-aspartate receptors and excitatory amino acid carrier immunoreactivities in CA1 area and subiculum after transient forebrain ischemia, J. Neurocytology, 30, pp945-955, 2001)과 허혈-재관류시에 갑작스런 산소 공급으로 인해 생체 내 라디칼의 증가로 인해 DNA 및 세포질에 손상을 입어 유발된다는 기전이다(Won MH, et al., Immunohistochemical detection of oxidative DNA damage induced by ischemia-reperfusion insults in gerbil hippocampus in vivo, Brain Res., 836, pp70-78, 1999; Sun AY, Chen YM, Oxidative stress and neurodegeneration disorders, J. Biomed. Sci., 5, pp 401-414, 1998).

본 발명자들은 국내·외에서 자생하고 있는 435가지의 약용식물 추출물을 대상으로 뇌신경세포계 hybridoma N18-RE-105 세포주를 이용하여 신경세포 보호효과를 갖는 천연물의 탐색을 시도하였다. 그 결과 제비꽃(Viola mandshurica)으로부터 강력한 신경세포 보호효과를 확인하고 이에 대한 내용을 2008. 3. 11자로 특허출원한 바 있으며 (특허출원번호 10-2008-22595) 이의 내용은 본 발명의 명세서에 도입된다.

제비꽃은 다년생 표본으로 줄기가 없고 잎은 뿌리로부터 총생하며 엽병이 길고 날개가 있다. 꽃은 보통 4~5월에 농자색으로 핀다. 과실은 원추형으로 성숙하면 3열로 갈라지며 다갈색의 종자가 튀겨서나간다. 주요성분은 지상부에 flavone 배당체로 orientin, isoorientin 등이 함유되어 있으며(Yook, C. S., Lee, W. T., Moon, C. K., (1989) Studies on flavonoid glycoside of the leaves of Viola diamantica. Yakhak Hoeji. 33: 124-128), 약리작용으로는 적리균, 황색포도상구균, 폐렴구균, 피부진균, 결핵간균의 성장을 억제, 소염효과 등이 알려져 있다. 하 지만 제비꽃에 관한 생리·약리학적 연구는 아직 초보적인 단계에 불과하며, 특히 신경세포 보호효과와 관련된 연구는 본 발명자들에 의하여 처음 수행되었다.

제비꽃에 함유되어 있는 신경세포 보호효과가 있는 성분을 찾아 동정하고 이를 분리하여, 효과가 뛰어난 신경질환 치료제 조성물을 제공하는 것이 본 발명에서 해결하고자 하는 과제이다.

본 발명의 연구자들은 제비꽃에 들어 있는 성분들 중에서 강력한 신경세포보호 활성을 나타내는 물질을 순수 분리 정제하고 그 물질이 9-히드록시-알파-토코페론임을 확인하고, 9-히드록시-알파-토코페론 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 신경세포의 손상에 대한 예방 또는 치료용 조성물을 제공함으로써 과제를 해결하였다.

본 발명에 따른 9-히드록시-알파-토코페론 또는 이의 염을 활성성분으로서 포함하는 조성물은 신경세포 보호 효과가 탁월하여 신경세포 손상으로 인한 각종 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 퇴행성 뇌질환, 뇌졸중 및 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 픽(Pick)병, 크로이츠펠트 야콥병, 척수손상 또는 말초신경손상의 예 방 또는 치료를 위하여 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

본 발명자들은 신경세포 보호 활성을 갖는 식물 생약을 발굴하기 위해 국내외에서 자생하고 있는 435가지의 약용식물 추출물을 대상으로 뇌신경세포계 하이브리도마 N18-RE-105 세포주와 PC12 세포주를 이용하여 신경세포 보호효과를 갖는 천연추출물의 탐색을 시도한 결과, 제비꽃 추출물이 탁월한 신경세포 보호 활성을 갖는다는 것을 발견하게 되었다.

나아가 본 발명의 연구자들은 제비꽃 추출물을 여러 종류의 용매를 사용하여 순차적으로 분획하여 silica gel chromatography, preparative thin-layer chromatography (prep.TLC), high performance liquid chromatography (HPLC)로 생리활성물질을 분리하였으며, 그 물질이 9-히드록시-알파-토코페론 (9-hydroxy-alpha-tocopherone) 임을 확인하였다.

본 발명의 발명자들은 9-히드록시-알파-토코페론이 글루타메이트에 의한 신경세포의 손상 또는 세포사멸을 억제하여 신경세포를 보호하는 효과가 있다는 것을 밝혔다. 글루타메이트를 N18-RE-105 신경 세포주에 처리하면 신경돌기가 거의 소멸된 양상을 보이며 형태학적으로 큰 변화가 유도되고 생존하는 세포의 수가 감소하나, 9-히드록시-알파-토코페론(a-TP)을 함께 처리하면 농도 의존적으로 신경세포의 신경돌기가 유지되며 생존율이 높다는 것을 밝혔다(도 5). 또한 MTT reduction assay를 통하여 정량적으로 9-히드록시-알파-토코페론의 신경보호효과를 관찰하였는데, 글루타메이트를 N18-RE-105 신경 세포주에 처리하면 세포생존율이 감소하나, 9-히드록시-알파-토코페론을 함께 처리하면 농도 의존적으로 세포 생존율이 회복된다는 것을 확인하였다 (도 6). 또한 동일한 조건 하에서 세포의 손상 정도를 확인하기 위하여 배양액 중에 들어 있는 LDH (lactate dehydrogenase)의 방출 양을 측정한 결과, 글루타메이트를 처리한 군은 약 58% 정도의 LDH 가 방출되었으나, 9-히드록시-알파-토코페론을 함께 처리하면 농도의존적으로 LDH의 방출량이 감소한다는 것을 확인하였다 (도 7). 이러한 결과들은 9-히드록시-알파-토코페론이 글루타메이트에 의해 유도된 N18-RE-105 신경세포 손상을 강력하게 억제한다는 것을 말해 준다.

이와 같은 결과를 기초로 본 발명은 9-히드록시-알파-토코페론 또는 그의 약제학적 또는 식품학적으로 허용가능한 염을 활성성분으로서 포함하는 신경세포 손상의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 9-히드록시-알파-토코페론의 염화합물에는 약업계 또는 식품업계의 통상의 지식을 가진 자의 기술 상식의 범위에 포함되는 것이라면 모두 포함된다.

상기 신경세포 손상은 퇴행성 뇌질환, 척수손상, 또는 말초신경 손상에 의해 유발될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 퇴행성 뇌질환은 신경세포사에 의해 유발되는 뇌졸중 및 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 픽(Pick)병, 및 크로이츠펠트 야콥병 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 본 발명에 따른 9-히드록시-알파-토코페론 또는 그의 염을 활성성분으로 하는 신경세포 손상의 예방 또는 치료용 조성물은 신경세포 손상에 대한 치료 또는 예방에 효과가 있는 의약품의 원료로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 9-히드록시-알파-토코페론을 포함하는 조성물, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 포함하는 의약품을 제공한다.

상기 의약품은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 약제학적 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 의약품은 경구투여제제, 주사제, 좌제, 경피투여제제, 및 경비투여제제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 임의의 제형으로 제제화되어 투여될 수도 있으나, 바람직하게는 액제, 현탁제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 또는 엑스제와 같은 경구 투여용 제형으로 제제화될 수 있다.

상기 각각의 제형으로 제제화 시, 각각의 제형의 제조에 필요한 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 부가하여 제조할 수 있다. 대표적으로 경구 투여용 제형으로 제제화 시 상기 담체로서 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제, 및 방부제 중에서 1 종 이상을 선택하여 사용할 수 있으며, 첨가제로는 향료, 비타민류, 및 항산화제 중에서 1 종 이상을 선택하여 사용할 수 있다.

상기 담체 및 첨가제는 약제학적으로 허용 가능한 것은 모두 가능하며, 구체적으로 희석제로는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘 또는 탈크, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필셀룰로오스가 바람직하다. 또한, 붕해제로는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산나트륨, 폴라크릴린칼륨, 또는 크로스포비돈, 감미제로는 백당, 과당, 솔비톨, 또는 아스파탐, 안정제로는 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 베타-사이클로덱스트린, 백납, 또는 잔탄검, 방부제로는 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 또는 솔빈산칼륨이 바람직하다.

또한, 상기 성분 이외에도 공지의 첨가제로서 미각을 돋구기 위하여, 매실향, 레몬향, 파인애플향, 허브향 등의 천연향료, 천연과즙, 클로로필린, 플라보노이드 등의 천연색소, 과당, 벌꿀, 당알코올, 설탕과 같은 감미성분, 또는 구연산, 구연산 나트륨과 같은 산미제를 혼합하여 사용할 수도 있다.

상기 의약품은 퇴행성 뇌질환, 척수 손상, 및 말초신경 손상 등에 의해 유발되는 신경세포 손상의 예방 또는 치료 효과를 얻기 위하여, 유효성분으로서 성인을 기준으로 1 일 총 투여량은 0.1～200 mg/kg을 한번에 또는 임의로 수회 나누어서 투여할 수 있다. 상기 투여량은 신경세포 손상을 유발한 질병의 종류, 질병의 진행 정도, 투여 경로, 성별, 나이, 체중 등에 따라 적절히 증감될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 9-히드록시-알파-토코페론 또는 그의 염을 활성성분으로 하는 신경세포 손상의 예방 또는 치료용 조성물은 신경세포 손상에 대한 개선 또는 예방에 효과가 있는 건강기능식품의 원료서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 9-히드록시-알파-토코페론을 포함하는 조성물, 및 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제공한다.

이러한 건강보조식품은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강보조식품의 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 건강보조식품은 예를 들어 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 액제, 엑스제, 차, 젤리, 엑스, 또는 음료 등으로 제조될 수 있다. 상기 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제로는 제조하고자 하는 제형의 제조에 당해 기술분야에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다. 이와 같이 다양한 형태로 가공된 본 발명의 건강보조식품은 신경세포 보호 작용에 의해 퇴행성 뇌질환, 척수 손상, 및 말초신경 손상을 포함한 각종질환의 예방 및 개선에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 복용이 용이하여 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 (a) 제비꽃을 아세톤으로 추출하는 단계; (b) 아세톤 추출물을 극성이 다른 용매(들)를 사용하여 분획하는 단계; 및 (c) 크로마토그래피 방법을 사용하여 (b)의 분획으로부터 9-히드록시-알파-토코페론을 분리하는 단계를 포함하는 제비꽃으로부터 9-히드록시-알파-토코페론을 제조하는 방법을 제공한다.

상기 아세톤 추출물의 분획을 위해서는 헥산(hexane), 디에틸에테르(diethyl ether), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 이 기술 분야에서 알려진 같은 목적을 위하여 사용하는 용매는 모두 사용이 가능하다. 상기 아세톤 추출물의 분획물로부터 활성성분인 9-히드록시-알파-토코페론을 분리하기 위해서는 silica gel chromatography, preparative thin-layer chromatography (prep.TLC), high performance liquid chromatography (HPLC) 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 이 기술 분야에서 알려진 같은 목적을 위하여 사용하는 분리방법은 모두 사용이 가능하다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

<실시예>

시약 및 실험재료

본 실험에서 사용된 제비꽃은 경상남도 산청군 지리산 근처에서 채집하여 음건, 추출하여 실험에 사용하였다. 신경세포 보호효과 실험에 사용된 시약으로 L-Glutamic acid (Monosodium salt hydrate) 와 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide), Ascorbic acid는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)제품을 구입하였으며, LDH (Lactate dehydrogenase) release assay kit 는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan)로부터 구입하였다. 세포주 배양을 위해 필요한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), horse serum (HS) 및 HAT supplement 등은 Gibco-BRL(Grand Island, NT, USA)에서 구입하였다. 시료 추출용 유기용매는 99%이상의 1급 시약(Daejung Chemical, Ltd, Korea)으로 ethanol, hexane, diethyl ether, ethyl acetate 등을 사용하였고, HPLC 분석용매는 Baker사 (USA)의 특급용매를 사용하였으며, 그 외 연구에 사용된 용매 및 시약은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.

세포주 및 배양

본 실험에 사용된 세포주는 hybridoma N18-RE-105 cell로써 한국생명공학연구원에서 분양 받아 사용하였다. 사용된 배지는 DMEM medium에 10% FBS, 5% HS 및 1 × HAT supplement를 첨가하여 사용하였고, 95%의 습도가 유지되는 37℃, 5% CO₂ incubator(MCO-18AIC, Sanyo, Osaka, Japan)에서 배양하였다.

기기 분석

Single peak의 분리를 위해 Waters ACQUITY Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) system을 사용하였다. Column은 Waters ACQUITY UPLC BEH C18 column (1.7 ㎛, 2.1 × 50 mm)을 사용하였고, Mass detector와 UV detector 는 각각 Waters LCT-Premier XE mass spectrometer와 Waters 2996 photodiode array detector를 사용하였다. Flow rate는 1 ml/mim으로 실시하였고, 용매계는 95% acetonitrile을 사용하였다.

<실시예 1> 제비꽃으로부터 신경세포 보호물질의 분리 및 정제

건조된 제비꽃 500 g에 아세톤 14L 를 가하여 3일 동안 상온에서 침출시켜 추출 한 후, 여지(5C. 110 mm, Advantec, Tokyo Roshi Kaisha, Ltd, Tohyo, Japan)로 여과하여 불순물을 제거하고, 이 여액을 감압농축기(EYELA N-1000, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 감압 농축하여 아세톤추출물을 얻었다. 아세톤추출물은 서로 극성을 달리하여 헥산(hexane), 디에틸에테르(diethyl ether), 에틸아세테이트(ethyl acetate)로 순차적으로 용매 분획 하였다. 즉, 헥산과 물을 같은 비율로 사용하여 헥산층을 분획하고 동일한 방법으로 남은 수용액 층에 디에틸에테르, 에틸아세테이트, 물 층으로 분획하여 각각의 용매 분획물을 얻었다.

아세톤추출물로부터 얻은 분획물들의 활성을 측정 비교한 후, 활성을 나타낸 헥산분획물로부터 유효성물을 검색할 목적으로 실리카겔크로마토그래피(silica gel chromatography)를 실시하였다. 즉, 헥산분획물 7 g을 얻은 후, 실리카겔이 충전 된 컬럼에 넣어 CHCl₃:MeOH=100:1의 전개용매를 이용하여 컬럼크로마토그래피를 실시하여 100개의 fraction을 얻었다. 활성 층으로부터 prep. TLC를 실시하기 위해 silica gel TLC plate (20 cm × 20 cm × 0.5 mm, Merck)에 시료를 loading하여 hexane:ethyl acetate = 4:1용매로 전개시켜 10개의 소분획으로 나누었고, 이 중 활성이 우수한 fraction No.5를 단일 분리하기 위해 HPLC(high performance liquid chromatography) 분석을 실시하여 5.3 mg의 활성물질을 분리 및 정제하였다 (도 1).

분리한 물질이 단일 물질인지 확인하기 위해서 HPLC로 확인해 본 결과 UV 254 nm에서 90% MeOH로 이동상을 흘렸을 때 약 30분경에 활성물질로 추측되는 피크를 확인할 수 있었고 분리된 물질은 단일 물질임을 알 수 있었다. (도 2)

<실시예 2> 활성물질의 구조 결정

최종적으로 순수한 화합물을 분리하기 위하여 활성분획에 대해서 UPLC를 수행하였으며, 용매계는 95% 아세토니트릴 (acetonitrile)에서 등용매 용리하였다.

순수분리된 생리활성 화합물의 물리화학적 특성을 조사하였다. 본 화합물은 모두 황색분말이었고, HRESIMS spectrum의 분석결과 m/z 445 [M-H]^-에서 분자이온의 peak가 나타났으며, m/z 429 [M-H₂O]⁺ 에서 ion fragment peak가 검출되었다. HRESIMS spectrum의 결과로부터 순수분리된 생리활성 화합물의 분자량은 446으로 결정되었고, 분자식은 C₂₉H₅₀O₃로 결정되었다(도3). 또 자외선 흡수는 292 nm(aqueous acetonitrile)에서 최대 흡수파장을 보이고 있었고 (도4), 230 nm (aqueous acetonitrile)에서 shoulder가 관측되었다. 이것은 a-tocopherol의 특징적인 자외선 최대흡수 파장과 똑같았으며, 230 nm에서 관측된 shoulder를 통해 순수 분리된 생리활성 물질이 a-tocopherol의 유도체로 존재하고 있을 가능성이 제시되었다 (W. Urckheimer and L. Cohen. 1964. The Chemistry of 9-hydroxy-a-tocopherone, a quinine hemiacetal. J. Am. Chem. Soc., 86:4388-4393).

이것을 더욱 확실하게 동정하기 위해서 HRESIMS spectrum으로부터 계산된 분자식을 통하여 여러 문헌을 조사한 결과, 최종적으로 알파-토코페롤의 산화형 유도체인 9-히드록시-알파-토코페론 (9-hydroxy-a-tocopherone; a-TP) 으로 동정할 수 있었다(M. F. Marcus and M. D. Hawley. 1970. Electrochemical studies of the redox behavior of a-tocopherol. Biochim. Biophys. Acta., 201:1-8). a-TP는 현재까지 알파-토코페롤로부터 산화적 유기합성 방법에 의한 보고가 있었지만, 천연물로서는 전혀 보고되어 있지 않았고, 제비꽃 추출물로부터 최초로 분리되었다.

9-히드록시-알파-토코페론의 구조

<실시예 3> 글루타메이트에 의한 신경세포의 형태학적 변화에 대한 9-히드록시-알파-토코페론의 효과

신경세포가 외부환경에 민감하게 자극을 받으면 신경상해를 입는 것과 동시 에 세포사의 발생으로 인한 세포의 형태학적인 변화가 나타난다(Yoon, M. Y., Lee, B. B., Kim, J. Y., Kim, Y. S., Park, E. J., Lee, S. C. and Park, E. J., Lee, S. C. and Park, H. R. (2007) Antioxidant activity and neuroprotective effect of Psoralea corylifolia Linne extracts. Kor. J. Pharmacogn. 38, 84-89). 따라서 글루타메이트로 유도된 스트레스 상태의 N18-RE-105 세포주에서 본 발명에서 분리한 9-히드록시-알파-토코페론이 세포의 형태학적 변화에 미치는 영향을 알아보기 위해 광학 현미경 하에서 관찰하였다.

N18-RE-105 세포주를 6-well plate에 1 × 10⁵cells/ml로 24시간 동안 배양하였다. 본 발명에서 분리정제한 9-히드록시-알파-토코페론을 농도별(50, 100 ng/ml)로 처리한 후 20 mM의 글루타메이트를 24시간 노출시켜 phase-contrast microscope(TS 100-F, Nikon, Tokyo, Japan)로 각 well의 세포형태를 관찰하고 100배로 사진 촬영하였다 (도 5, a: control, b: 20 mM 글루타메이트, c: 20 mM 글루타메이트 + a-TP 50 ng/ml, d: 20 mM glutamate + a-TP 100 ng/ml).

a-TP 및 글루타메이트를 처리하지 않은 군(도5a)에 비해 글루타메이트 처리군(도5b)은 스트레스로 인하여 신경돌기가 거의 소멸된 양상을 보임으로써 신경세포의 형태학적으로 큰 변화가 유도된 것을 확인할 수 있으나, a-TP를 50 ng/ml, 100 ng/ml 처리하였을 때는(도5c, 도5d) 농도 의존적으로 신경세포의 신경돌기가 유지되며 생존율이 높았다. 따라서 이러한 신경세포의 형태학적인 변화를 통하여 a-TP는 글루타메이트에 의한 신경세포 손상을 억제하거나 보호하는 효과가 있다는 것을 확신할 수 있었다.

<실시예 4> 글루타메이트에 의해 유도되는 신경세포성장억제에 대한 9-히드록시-알파-토코페론의 효과 (MTT 분석을 통한 세포 생존율 측정)

글루타메이트에 의해 유도되는 신경세포주의 손상에 대한 보호효과를 확인하기 위해 본 발명에서 분리정제한 9-히드록시-알파-토코페론의 신경세포 보호효과를 측정하기 위하여 MTT reduction assay를 실시하였다. 세포주를 5x10⁴ cells/ml로 맞추고 96-well 플레이트에 각각 100 μl 씩 첨가하여 24시간 동안 37^oC, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양한 후, DMSO에 녹인 본 발명에서 분리정제한 9-히드록시-알파-토코페론을 0, 10, 50, 100 ng/ml의 최종농도로 처리하였다. 30분 동안 배양한 후 20 mM 글루타메이트를 처리하여 24시간 배양하고 각 well에 인산완충액(PBS)에 녹인 MTT(5 mg/ml) 용액을 10 μl 씩 첨가하여 1시간 동안 다시 배양하였다. 반응 후 well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO 100 μl 첨가하여 녹이고 ELISA reader(Model680, BioRad, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

a-TP 및 글루타메이트를 처리하지 않은 군 세포수를 100%로 하였을 때 상대적인 세포성장 억제율을 구하였다(도 6). 글루타메이트만 처리한 군의 세포 생존율은 40.7%로 감소하였으나, 이 때 a-TP를 10, 50, 100 ng/ml의 농도로 세포주에 처리했을 때 신경세포 생존율은 41.8%, 51.6%, 72.4% 로, 농도 의존적으로 세포가 회복되는 것을 확인 할 수 있었다.

<실시예 5> 글루타메이트로 유도된 신경세포손상에 의한 LDH (lactate dehydrogenase)의 방출에 대한 9-히드록시-알파-토코페론의 효과

본 발명에서 분리정제한 9-히드록시-알파-토코페론의 신경세포 보호효과를 측정하기 위한 방법으로 LDH release assay를 실시하였다. N18-RE-105 세포주를 5 × 10⁴ cells/ml로 맞춘 후, 100 μl씩 96-well plate에 분주하여 CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양한 뒤 10, 50, 100 ng/ml의 최종농도로 본 발명에서 분리정제한 9-히드록시-알파-토코페론을 세포주에 처리하였다. 30분 후 20 mM 글루타메인트를 처리하여 24시간 배양한 다음, 배양액을 새로운 96-well plate에 50 μl 분주하고, 이 배양액에 LDH reagent를 50 μl씩 첨가하여 상온에서 정치시킨 후, 20분간 반응하였다. 반응이 완료되면 stop solution인 1 N HCl을 100 μl씩 첨가하여 반응을 중지시킨 후, ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 살아남은 세포의 LDH 측정을 위해 배양액을 제거한 후, 0.5% Triton X-100용액을 50 μl 첨가하여 40 rpm으로 10분 동안 shaking시켜 세포벽을 깨트린 다음, 같은 방법으로 LDH reagent 50 μl를 첨가하여 반응 시키고, 반응이 끝나면 반응 정지액을 넣은 뒤, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. LDH에 의한 세포독성의 백분율은 배양액과 살아있는 세포에서 유리된 총 LDH에 대한 배양액으로부터 유리된 LDH의 값으로 계산하여 글루타메이트 실험군과 비교한 값을 나타내었다(도 7).

a-TP 및 글루타메이트를 처리하지 않은 군에 비해 대조군은 약 58% 정도의 LDH 방출을 확인 할 수 있는데 반해 a-TP를 10, 50, 100 ng/ml로 처리했을 때는 40.9%, 30.8%, 25.9%로 감소하였다. 이 결과는 a-TP가 글루타메이트에 의해 유도된 N18-RE-105 신경세포 손상을 강력하게 억제한다는 것을 시사한다.

<제조예>

<제조예 1> 캡슐제

9-히드록시-알파-토코페론 20.0% (w/w) / 유당 79.5% (w/w) / 스테아르산 마그네슘 0.5%(w/w)

성분들을 혼합하고 각각 약 100 mg을 함유하는 캡슐로 분산한다. 하나의 캡슐은 대략 총 일일 투여량이다.

<제조예 2> 경구투여용 현탁액

9-히드록시-알파-토코페론 1.0g / 퓨마르산 0.5g / 염화나트륨 2.0g /메틸 파라벤 0.15g / 프로필 파라벤 0.05g / 과립화된 설탕 25.5g / 소르비톨 (70% 용액) 12.85g / 비검(Veegum) K 1.0g / 향미제 0.035ml / 착색제 0.5mg

증류수로 총 100ml이 되도록 한다.

<제조예 3> 정제

9-히드록시-알파-토코페론 20% (w/w) / 스테아르산 마그네슘 0.5% (w/w)

크로스카멜로스 나트륨 2.0% (w/w) / 유당 76.5% (w/w)

PVP(폴리비닐피롤리딘) 1.0% (w/w)

성분들을 결합하고 용매, 예컨대 메탄올을 사용하여 과립화한다. 그 후, 제형을 건조하고 적절한 타정기로 정제를 형성한다.

도 1은 제비꽃으로부터 활성물질을 분리 및 정제하는 단계를 도식화한 것이다.

도 2는 제비꽃으로부터 분리한 활성물질의 HPLC spectrum이다.

도 3은 제비꽃으로부터 분리한 활성물질의 Mass spectrum이다.

도 4는 제비꽃으로부터 분리한 활성물질의 UV spectrum이다.

도 5는 글루타메이트에 의해 유도된 N18-RE-105 신경세포주의 형태학적 변화에 대한 9-히드록시-알파-토코페론의 효과를 나타낸 것이다. a: control, b: 20 mM glutamate, c: 20 mM glutamate + a-TP 50 ng/ml, d: 20 mM glutamate + a-TP 100 ng/ml

도 6은 글루타메이트로 유도된 N18-RE-105세포주의 세포생존율 감소에 대한 9-히드록시-알파-토코페론(a-TP)의 효과를 나타낸 것이다.

도 7은 글루타메이트로 유도된 세포손상에 의한 N18-RE-105세포주의 LDH (lactate dehydrogenase)의 방출에 대한 9-히드록시-알파-토코페론의 효과를 나타낸 것이다.

Claims

9-히드록시-알파-토코페론 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 신경세포 손상의 예방 또는 치료용 조성물.
제 1 항에 있어서, 퇴행성 뇌질환, 척수손상, 또는 말초신경 손상의 예방 또는 치료를 위한 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 신경세포사에 의해 유발되는 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 픽(Pick)병, 및 크로이츠펠트 야콥병으로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 조성물 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 포함하는, 퇴행성 뇌질환, 척수손상, 말초신경 손상, 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 픽(Pick)병, 및 크로이츠펠트 야콥병으로 구성된 그룹에서 선택되는 질병의 예방 또는 치료를 위한 의약품.
제 4 항에 있어서, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 액제, 에어로졸, 엑스제, 주사제, 경피 투여제, 또는 좌제의 형태인 것을 특징으로 하는, 퇴행성 뇌질환, 척수손상, 말초신경 손상, 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 픽(Pick)병, 및 크로이츠펠트 야콥병으로 구성된 그룹에서 선택되는 질병의 예방 또는 치료를 위한 의약품.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 조성물 및, 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 포함하는, 퇴행성 뇌질환, 척수손상, 말초신경 손상, 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 픽(Pick)병, 및 크로이츠펠트 야콥병으로 구성된 그룹에서 선택되는 질병의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품.
제 6 항에 있어서, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 액제, 에어로졸, 엑스제, 차, 젤리, 또는 음료의 형태인 것을 특징으로 하는, 퇴행성 뇌질환, 척수손상, 말초신경 손상, 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 픽(Pick)병, 및 크로이츠펠트 야콥병으로 구성된 그룹에서 선택되는 질병의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품.
(a) 제비꽃을 아세톤으로 추출하는 단계;

(b) 아세톤 추출물을 극성이 다른 용매(들)를 사용하여 분획하는 단계; 및

(c) 크로마토그래피 방법을 사용하여 (b)의 분획으로부터 9-히드록시-알파-토코페론을 분리하는 단계를 포함하는 제비꽃으로부터 9-히드록시-알파-토코페론을 제조하는 방법.