KR101087297B1 - 두충 추출물을 포함하는 신경계 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
두충 추출물을 포함하는 신경계 질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 뇌신경세포 보호물질을 포함하는 두충 추출물의 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 뇌신경 세포 보호물질인 두충 추출물의 유효 성분인, 4H-Furo [2,3-b] [1] 벤조피렌-4-원, 2,3-다이하이드로-2,2,3-트라이메틸-(4H-Furo [2,3-b] [1] benzopyran-4-one, 2,3-dihydro-2,2,3-trimethyl-)은 산화적인 스트레스(oxidative stress) 유발을 감소시키고 세포 활성(cell viability)을 증대시킬 뿐만 아니라 치매 모델 동물에서 기억 학습 능력을 유지시키는 효과가 있으므로, 두충 추출물 또는 그의 유효성분은 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 및 건강 기능 식품용 조성물로 유용하다.
두충 추출물, 아밀로이드 베타 펩타이드-유도 산화적인 스트레스, 4H-Furo [2,3-b] [1] benzopyran-4-one, 2,3-dihydro-2,2,3-trimethyl-
Description
본 발명은 뇌신경세포 보호물질을 포함하는 두충 추출물의 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 뇌신경 세포 보호물질인 두충 추출물의 유효 성분인, 4H-Furo [2,3-b] [1] 벤조피렌-4-원, 2,3-다이하이드로-2,2,3-트라이메틸-(4H-Furo [2,3-b] [1] benzopyran-4-one, 2,3-dihydro-2,2,3-trimethyl-)은 산화적인 스트레스(oxidative stress) 유발을 감소시키고 세포 활성(cell viability)을 증대시킬 뿐만 아니라 치매 모델 동물에서 기억 학습 능력을 유지시키는 효과가 있으므로, 두충 추출물 또는 그의 유효성분은 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 및 건강 기능 식품용 조성물로 유용하다.
최근 평균수명이 증가하고 사회의 고령화가 진행되면서 노화에 대한 관심 및
노화와 관련된 질병 특히, 뇌졸증, 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD), 파킨슨병 등의 뇌신경질환과 같이 뇌신경세포 손상과 관련된 퇴행성 신경질환 등에 대한 관심이 증대되고 있다.
상기 뇌신경계 질환들은 특정 뇌세포의 사멸 또는 퇴화가 일시적 또는 오랜 기간에 걸쳐 진행하는 것이 특징인데, 한번 죽은 뇌세포는 재생이 되지 않기 때문에 결국 치명적인 뇌기능의 손실로 이어진다. 특히, 인지기능, 감각기능, 운동기능, 전신기능의 진행성 저하를 수반하는 뇌기능 부전은 결국 성격과 행동의 변화를 가져오고, 환자들이 스스로 자신을 돌볼 수 없는 지경에 이르게 한다. 이러한 뇌세포 사멸의 주요 경로로는 산화적 스트레스에 의한 산화적 독성, 흥분적 독성, 아폽토시스(apoptosis) 등이 제시되고 있으며, 각각은 특이한 신호전달과정을 통하여 세포사멸을 유발하게 된다.
구체적으로, 뇌졸증, 뇌손상, 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD), 파킨슨 병 환자에서 뇌세포 사멸의 주원인으로 활성 산소종(Reactive Oxygen Species)의 축적 후 단백질, 핵산, 지질의 산화적인 손상이 제시되었다. 특히 자유 라디칼(free radicals)에 의한 산화적 스트레스는 체 내의 각 조직에서 일어나는 세포 사멸의 주원인으로 보고되고 있으며, 뇌신경질환에서 나타나는 세포사멸의 주기전의 하나로도 제시되어 왔다(Schapira, A. H., Curr. Opin. Neurol., 9(4):260-264, 1996). 뇌신경질환에서 신경세포의 사멸에 자유 라디칼이 관여한다는 증거로는, 허혈 후 활성 산소종의 생성 증가 및 항산화제에 의한 허혈성 신경세포의 사멸 억제효과(Flamm, E. S. et al., Stroke 9(5): 445-447, 1978; Chan, P. H., J. Neurotrauma 9 Suppl.2:S417-423, 1992); 헌팅턴병의 선조체에서 Fe2+의 증가(Dexter, E. T. et al., Ann. Neutol., 32 Suppl:S94-100,1992), 알츠하이머 질환에서 나타나는 베타 아밀로이드에 의한 자유 라디칼의 생성(Richardson J. S. et al., Ann. N. Y.Acad. Sci., 777:362-367, 1996), 가족성 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)에서 Cu/Zn SOD-1 유전자에서의 점 돌연변이(Rosen, D. R. et al., Nature, 362(6415):59-62, 1993) 등이 있다.
특히, 대표적인 뇌신경계 질환으로서 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD)은 퇴행성 신경계 질환으로, 80세 이상 노인의 50% 정도가 고통을 받고 있는 병이다. 알츠하이머병은 암, 심장질환 및 뇌졸증에 이어 노인 사망의 네 번째 원인이 되고 있으며, 미국에서는 매년 250,000명 이상이 알츠하이머병으로 진단받고 있고, 현재 400만 명의 환자가 이 병을 앓고 있는 것으로 추정되고 있다.
미국의 경우 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD)은 전체 인구의 사망 원인 중 심혈관질환, 악성종양 및 뇌졸증에 이어 제4위를 차지하며, 치료경비 면에서도 암 및 심장병에 이어 제3위를 점유하고 있어 사회 경제적으로 미치는 영향도 상당한 것으로 보인다. 이러한 알츠하이머병의 특징은 환자의 사후 뇌의 세포 조직병리학 검사로 확인되는 신경섬유 엉킴(neurofibrillary tangles)과 노인반(amyloid plaques)을 형성하는 것으로, 이는 tau 단백질의 과다한 인산화와 아밀로이드 베타 펩타이드(amyloid β peptide, 이하 'Aβ'라 함)의 축적으로 각각 일어난다고 알려져 있다.
이러한 알츠하이머병의 특징은 환자의 사후 뇌의 세포 조직병리학 검사로 확 인되어지는 신경섬유 엉킴(neurofibrillary tangles)과 노인반(amyloid plaques)을 형성하는 것으로, 이는 tau 단백질의 과다한 인산화와 아밀로이드 베타 펩타이드(amyloid β peptide, 이하 'Aβ'라 함)의 축적으로 각각 일어난다고 알려져 있다.
특히, 유전성 AD 환자에서는 아밀로이드 전구 단백질(amyloid precursor protein, 이하 'APP'라 함) 또는 프리세닐린(presenilin) 유전자의 돌연변이로 Aβ가 증가하고 모두 AD로 진행되는 것으로 보아 Aβ가 AD를 유발하는 가장 중요한 인자로 알려져 있다. Aβ는 전구물질인 APP를 분해 효소인 베타 시크리타제(BACE1, beta-site APP-cleaving enzyme 1)가 먼저 자르고, 생성된 C 말단을 프리세닐린을 포함한 감마 시크리타제가 잘라서 생긴 40 또는 42개의 아미노산 조각을 이루게 된다. 뇌신경의 불활성화와 괴사는 APP의 비정상적 대사산물인 Aβ에 의한 세포독성으로 생각되어진다. 이의 신경독성은 산화적인 스트레스(oxidative stress)로 인한 뇌신경세포 파괴에서 시작된다. AD에서 뇌신경세포 괴사의 원인은 산소 유리 라디칼(oxygen free radical)의 생성, 반응성 산소종(reactive oxygen species, ROS)과 같은 산화적인 손상(oxidative injury)이 뇌신경세포 파괴 및 병인론(pathogenesis)과 관련되어 있을 것으로 추정된다.
최근, 알츠하이머병의 연구는 아밀로이드 베타 펩티드에 의한 뇌세포 파괴, 이들 단백질의 구조 및 생리작용, 뇌 안에서의 축적에 의한 아세틸콜린(acetylcholine, ACh)의 농도 감소 등을 중심으로 연구되고 있다. 알츠하이머병 의 증상으로는 기억력, 인지능력 및 학습능력의 상실이 서서히 진행되어 나타나며, 이어서 감정 장애와 이상행동을 가져온다. 따라서, 알츠하이머병의 치료는 주로 환자의 증상을 가볍게 하고, 병의 진행속도를 지연시키는데 주안을 두는 간접 치료가 유일한 치료법이 되어 왔다.
한편, 두충(Eucommia ulmoides)은 두충과의 낙엽교목으로 중국이 원산지이며, 우리나라에서는 중남부의 각지에서 재배하고 있다. 두충의 효능으로는 약리실험에서 혈압 감압작용, 혈중콜레스테롤 감소작용, 진정작용, 진통작용, 소염작용, 이뇨작용 등이 밝혀졌다. 또한 신경통, 고혈압병, 류머티즘성 관절염, 근무력증 등에도 사용되고 있으나, 두충 추출물의 아밀로이드 베타 유도 산화적인 스트레스에 의한 뇌 신경세포의 독성 저해 효과에 대한 연구결과는 없었다.
이에 본 발명자들은 고령화 질환 중 그 심각성이 날로 증대되는 뇌세포 괴사를 포함한 뇌질환의 예방 및 치료용 파이토케미칼(phytochemicals)을 탐색하고 이를 의약, 식품의약 및 건강기능식품의 원료로 소재화하기 위하여 식용식물자원을 탐색 대상으로 수십 종의 국내산 식약용류 식물을 대상으로 Aβ에 의한 산화적인 스트레스로부터 뇌신경 세포에 보호기능을 갖는 천연 신소재를 탐색하고자 예의 노력한 결과, 고유 식용식물자원인 두충으로부터 Aβ-유도 산화적인 스트레스에 의한 뇌신경세포 손상 보호 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 두충(Eucommia ulmoides Oliv.) 추출물을 포함하는 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 4H-Furo [2,3-b] [1] 벤조피렌-4-원, 2,3-다이하이드로-2,2,3-트라이메틸-(4H-Furo [2,3-b] [1] benzopyran-4-one, 2,3-dihydro-2,2,3-trimethyl-)을 포함하는 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 두충 추출물 또는 4H-Furo [2,3-b] [1] 벤조피렌-4-원, 2,3-다이하이드로-2,2,3-트라이메틸-(4H-Furo [2,3-b] [1] benzopyran-4-one, 2,3-dihydro-2,2,3-trimethyl-)을 포함하는 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 두충(Eucommia ulmoides Oliv.) 추출물을 포함하는 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서의 용어, '두충(Eucommia ulmoides Oliv.)'이란, 두충과의 갈잎 큰키나무로서, 높이는 20미터까지 자라고 잎의 길이가 5~16cm인 타원형으로 끝이 뾰족하며 가장자리에 날카로운 톱니가 있고, 잎을 찢으면 많은 가는 실을 볼 수 있다. 어린잎은 앞면에 보드라운 털이 성글게 나 있고 잎의 뒷면에 털이 조금 빽빽하게 나 있으나 오래된 잎은 앞면이 반들반들하고 뒷면은 잎맥 부위에 털이 성글게 나 있다. 암수딴그루이며 꽃은 4월 무렵 어린 가지의 기부(基部)에 퍼져서 많이 핀다. 한방(漢方)에서는 특히 나무껍질을 건조시킨 것을 두충 또는 당두충(唐杜沖)이라고 하여, 강장제(强壯劑), 관절염류머티즘 진통제로 사용되고 있으나, 근래에는 잎과 더불어 씨도 사용하고 있으며 산지(産地)에 따라 질적 차이가 있다.
본 발명에서의 용어, '퇴행성 뇌신경질환'이란, 신경 특히 뇌신경과 관련된 여러 가지 질병을 총칭하는 용어를 의미한다. 바람직하게 본 발명에서의 상기 퇴행성 뇌신경질환은 아밀로이드 베타 펩타이드-유도 산화적인 스트레스에 의한 뇌신경 세포 손상이 유발되는 질환을 말하며, 구체적으로는 알츠하이머병, 치매, 파킨슨씨병(Parkinson's disease), 또는 헌팅턴병일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 알츠하이머병이다.
본 발명에서의 용어, '알츠하이머병'이란, 퇴행성 뇌질환으로 노인에게 주로 나타나는 치매의 주요 원인 중에 하나이며, 노화의 과정 속에서 뇌조직이 기능을 잃으면서 점차 정신 기능이 쇠퇴하는 병이다. 상기 질병으로 인해 기억력과 정서면에서 심각한 장애가 발생한다. 알츠하이머병과 치매를 동일시하는 경우가 있으나 치매는 알츠하이머병에 의해서만 생기는 것이 아니라 고혈압, 당뇨병, 심장질환 등과 같은 성인병이 원인이 되어 발생한다. 알츠하이머병 모델의 신경세포 미토콘드리아에서는 Aβ가 축적됨이 발견되었고, 미토콘드리아에서 활성산소의 생성이 증가되면서 산화에 의한 손상(oxidative damage)이 유발되며, 이러한 산화에 의한 손상이 알츠하이머병의 발병과 관련이 있는 것으로 알려져 있다(Manczak et al., Hum Mol Genet. 15(9): 1437-49); Reddy, J Neurochem. 96(1): 1-13(2006)).
특히, 본 발명에서 '아밀로이드 베타 펩티드'는 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein, APP)의 비정상적인 분리(abnormal cleavage)로부터 생성된 40-42개의 펩티드 물질로서, 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD)에서 중요한 병원성 물질(pathogenetic material)로 생각되어지고 있다. 알츠하이머병에서의 뇌신경세포 괴사의 원인은 아직 불분명하지만 산소 유리 라디칼(oxygen free radical)의 생성, 활성 산소 종(reactive oxygen species, ROS)와 같은 산화적인 손상(oxidative injury)이 뇌신경세포 파괴 및 병인(pathogenesis)과 관련되어 있을 것으로 추정된다. 알츠하이머병 환자의 뇌에서 이들 산화적 스트레스[oxidative stress (ROS, lipid peroxidation, protein modification, mitochondrial DNA oxidation)]의 증가는 증명되고 있으며 이러한 생리적 대사 이상은 아밀로이드 플라그(amyloid plaques)와 신경섬유 엉킴(neurofibrillary tangles, NFT)과 같은 알츠하이머병 뇌 고유의 임상적 결과를 초래한다. 또한 아밀로이드 베타 펩티드는 세포내 유리 라디칼 상태(intra-cellular free radical status)를 유발시키고 궁극적 으로 세포괴사를 유도하여 아밀로이드 베타 펩티드와 뇌신경세포 파괴는 상관성이 있는 것으로 보인다. 아밀로이드 베타 펩티드에 의한 ROS, 유리 라디칼(free radical) 등의 생성은 신경 독성을 유발하는 아밀로이드 베타 펩티드의 추정을 가능하게 하기 때문에 이들에 대한 연구는 필수적이라 할 수 있다.
한편, 유전성 AD 환자에서는 아밀로이드 전구 단백질(amyloid precursor protein, 이하 'APP'라 함) 또는 프리세닐린(presenilin) 유전자의 돌연변이로 Aβ가 증가하고 모두 AD로 진행되는 것으로 보아 Aβ가 AD를 유발하는 가장 중요한 인자로 알려져 있다. Aβ는 전구물질인 APP를 분해 효소인 베타 시크리타제(BACE1, beta-site APP-cleaving enzyme 1)가 먼저 자르고, 생성된 C 말단을 프리세닐린을 포함한 감마 시크리타제가 잘라서 생긴 40 또는 42개의 아미노산 조각을 이루게 된다. 뇌신경의 불활성화와 괴사는 APP의 비정상적 대사산물인 Aβ에 의한 세포독성으로 생각되어진다. 이의 신경독성은 산화적인 스트레스(oxidative stress)로 인한 뇌신경세포 파괴에서 시작된다. AD에서 뇌신경세포 괴사의 원인은 산소 유리 라디칼(oxygen free radical)의 생성, 반응성 산소종(reactive oxygen species, ROS)과 같은 산화적인 손상(oxidative injury)이 뇌신경세포 파괴 및 병인론(pathogenesis)과 관련되어 있을 것으로 추정된다.
본 발명에 따른 조성물이 아밀로이드 베타 펩타이드-유도 산화적인 스트레스에 의한 퇴행성 뇌신경계 질환, 특히 알츠하이머병에 대하여 유의적인 효과를 보임 을 확인하였다(실시예 1 및 3).
바람직한 일 양태로서, 본 발명에 따른 조성물에 포함되는 두충 추출물은 당해 업계에 널리 공지된 추출방법을 제한 없이 사용하여 제조될 수 있다. 따라서 추출시간, 용매 및 온도 등의 조건은 당업자가 적절히 조절할 수 있으나, 바람직하게 본 발명에서는 에탄올을 사용하여 추출한다. 상기와 같은 방법으로 추출한 본 발명에 따른 두충 추출물은 아밀로이드 베타 펩타이드-유도 산화적인 스트레스에 의한 뇌신경세포 손상에 대한 보호활성을 갖는다. 또한, 시험관 내(In vitro)에서 두충 에탄올 추출물을 극성에 따라 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 순으로 각각 분획한 후 산화적인 스트레스 유발정도 및 MTT 환원 어세이를 통해 세포 활성(viability)을 측정한 결과 클로로포름 1의 분획이 가장 우수한 신경세포 보호활성을 보임을 확인하였다 (실시예 1 및 2). 한편, 생체 내(in vivo)에서 마우스에 Aβ를 주사하여 치매 모델을 확립한 후 두충 추출물을 400 mg/kg, 800 mg/kg 및 1,200 mg/kg로 식이 섭취한 군에서 대안 행동(alternative behavior) 및 스텝 쓰루 레이턴시(step through latency)를 확인한 결과 치매군보다 우수한 효과를 확인하였다 (도 10 및 11).
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표기되는 4H-Furo [2,3-b] [1] 벤조피렌-4-원, 2,3-다이하이드로-2,2,3-트라이메틸-(4H-Furo [2,3-b] [1] benzopyran-4-one, 2,3-dihydro-2,2,3-trimethyl-)을 포함하는 퇴행성 뇌신경질환 의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 바람직하게는 두충 추출물로부터 획득한 4H-Furo [2,3-b] [1] 벤조피렌-4-원, 2,3-다이하이드로-2,2,3-트라이메틸-의 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 두충 추출물은 두충의 뿌리, 줄기, 잎, 열매 및 나무 껍질 등 두충나무 전체에서 제한없이 추출하여 사용할 수 있으나, 바람직하게 본 발명은 수피와 잎을 사용하였다. 상기 두충 추출물에 포함되는 아밀로이드 베타 펩타이드-유도 산화적인 스트레스에 의한 뇌 신경세포 손상에 대한 보호활성을 갖는 유효성분인 4H-Furo [2,3-b] [1] 벤조피렌-4-원, 2,3-다이하이드로-2,2,3-트라이메틸-(4H-Furo [2,3-b] [1] benzopyran-4-one, 2,3-dihydro-2,2,3-trimethyl-)또한 본 발명에 따른 조성물에 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 유효성분은 하기와 같은 방법으로 추출 분리하여 제조된다.
먼저 두충(Eucommia ulmoides)을 마쇄하여 얻은 두충 조말에 에탄올을 가하 여 두충 에탄올 추출물을 조제하고 (수피와 잎 모두 비슷한 효과를 보이므로 추출물 조제 시 두충의 수피, 잎 사용 가능), 에탄올 추출물에 극성이 다른 유기용매를 이용하여 분획하고 그 분리물을 수득하는 단계; 상기 단계에서 수득한 물질을 오픈 실리카젤 컬럼을 사용하여 뇌손상 저해 활성 성분을 수득하는 단계; 및 상기 단계에서 수득한 활성 획분을 역상 컬럼을 이용한 HPLC를 사용하여 분리하는 단계를 포함하여 아밀로이드 베타 펩타이드-유도 산화적인 스트레스에 의한 뇌신경 독성 저해 활성을 갖는 두충 에탄올 추출물 제조 방법에 의한다 (실시 예 2). 이와 같은 제조방법을 도식화하면 다음과 같다.
상기 추출물로서 메탄올, 에탄올, 이소프로필 알콜 또는 부탄올 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게 본 발명에서는 에탄올을 사용하였다. 또한 극성이 다른 유기용매로 헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트를 사용한다.
한편, 본 발명에 따른 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 두충 추출물 또는 4H-Furo [2,3-b] [1] 벤조피렌-4-원, 2,3-다이하이드로-2,2,3-트라이메틸-에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 더 나아가 본 발명의 조성물은 두충 추출물 또는 4H-Furo [2,3-b] [1] 벤조피렌-4-원, 2,3-다이하이드로-2,2,3-트라이메틸-과 함께 신경세포 보호 및 신경독성 억제 또는 예방의 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있으며, 이들 약제학적으로 허용되는 담체, 약제학적 조성물의 제제, 이들 제제를 제조하는 방법의 실례는 공지된 방법에 의한다.
또한, 이들 약학적 조성물은 상기 기술된 바와 같이, 신경퇴행 및/또는 이와 연관된 증상을 비롯한 다양한 질환을 치료하기 위하여 본 발명의 두충 추출물을 개체에 투여하는데 유용하다. 두충 추출물은 이러한 약제학적 조성물이 투여되는 개체에서 퇴행성 신경질환을 치료하는데 유효한 양으로 제공되며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 당업자는 적절한 양을 편의하게 결정할 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 바에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여 (예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내, 근육 내, 혈관 내 또는 피하투여)할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다. 경구투여를 위해서, 두충 추출물 제제는 캡슐, 정제, 분말, 과립 또는 현탁액으로 제공될 수 있다. 또한, 이들 제제는 락토오스, 만니톨, 옥수수 전분 또는 감자 전분과 같은 통상적인 첨가제를 함유할 수 있으며, 이들 제제에 사용될 결합제로는 결정성 셀룰로오스, 셀룰로오스 유사체, 아카시아, 옥수수 전분 또는 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스가 제공될 수도 있다. 이들 제제에는 또한 이염기성 인산칼슘 또는 무수성 나트륨 전분 글리콜레이트가 제공될 수도 있다. 최종적으로 이들 제제에는 윤활제, 예를 들면 활석 또는 스테아르산 마그네슘이 제공될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 두충 추출물은 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 두충 추출물 또는 4H-Furo [2,3-b] [1] 벤조피렌-4-원, 2,3-다이하이드로-2,2,3-트라이메틸-을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, '건강기능식품'이란, 건강보조의 목적으로 특정성분을 원료로 하거나 식품 원료에 들어있는 특정성분을 추출, 농축, 정제, 혼합 등의 방법으로 제조, 가공한 식품을 말하며, 상기 성분에 의해 생체방어, 생체리듬의 조절, 질병의 방지와 회복 등 생체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발휘할 수 있도록 설계되고 가공된 식품을 말하는 것으로서, 상기 건강식품용 조성물은 질병의 예방 및 질병의 회복 등과 관련된 기능을 수행할 수 있다.
또한, 본 발명의 추출물이 사용될 수 있는 건강식품의 종류에는 제한이 없 다. 아울러 본 발명의 두충 추출물은 당업자의 선택에 따라 건강기능식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 추출물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시 예를 제시한다. 그러나 하기의 실시 예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시 예에 의해 본 발명의 내용이 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 두충 추출물은 독성, 부작용 등의 우려가 거의 없는 천연산물이며, 특히 산화적인 스트레스에 의한 뇌신경세포 손상에의 보호물질을 포함하고 있다. 따라서 본 발명에 따른 두충 추출물 또는 벤조피렌-4-원, 2,3-다이하이드로-2,2,3-트라이메틸-을 포함하는 조성물은 퇴행성 뇌신경계 질환, 바람직하게는 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
산화적인 스트레스(oxidative stress)는 DCF-DA(2＇,7'-dichlorofluorescin diacetate) 어세이를 이용하여 형광분광광도계(spectrofluorometer)를 통해서 두충 추출물의 저해활성을 확인하였으며, 세포활성(cell viability)은 MTT 환원 어세이를 통해 측정하였다.
실시예 1. 두충 에탄올 추출물 제조 및 뇌신경세포 보호물질 분리
1-1. 두충 에탄올 추출물에 극성이 다른 유기용매를 이용하여 분획
선정된 두충(Eucommia ulmoides)을 핸드 믹서로 곱게 마쇄한 후 1.66 kg의 두충 조말을 에탄올 5배 부피로 24시간 동안 흔들어(shaking) 5회 추출한 후 감압 농축하여 두충 에탄올 추출물을 조제하였다. 추출물로부터 에탄올을 완전히 제거한 후 극성에 따라 헥산(hexane), 클로로포름(chloroform), 에틸 아세테이트(ethyl acetate)순으로 각각 3회씩 분획한 후 산화적 스트레스 유발 정도 및 세포 활성([cell viability(%)]을 확인하였다. 클로로포름층의 첫 번째 분획 층(C1)이 가장 높은 산화적인 스트레스 저해 활성 및 가장 높은 세포보호 활성을 보임을 확인하였다 (도 5 및 6).
1-2. 분리된 클로로포름 분획을 오픈 실리카 젤 컬럼을 통해 분획
상기 단계에서 가장 높은 저해 활성을 보인 클로로포름 층의 C 1층을 오픈 실리카 젤 컬럼 크로마토그래피(open silica gel column chromatography)를 시행하 여 33개의 소분획으로 분획하였다. 33분획의 구성 비율은 CHCl3 : EtOH (100:0, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80, 10:90 및 0:100)의 11개 분획에 대해 각각의 분획을 3번씩 시행하여 얻은 분획이다. 총 33개의 소분획에 대한 산화적인 스트레스를 유도하여 그 유도 정도가 작고 세포 보호 활성이 높은 분획을 선별하였다. 그 결과, 산화적인 스트레스(%)와 세포보호 활성(cell viability(%))을 볼 때, CHCl3 : EtOH의 90:10 비율의 첫 번째 분획이 가장 좋은 효과를 보이는 것을 알 수 있었다 (도 7 및 8).
1-3. HPLC를 통한 활성물질 확인
가장 높은 활성을 나타낸 클로로포름(Chloroform) : EtOH = 90:10 첫 번째 부분의 활성 성분(active compound)을 분리 해내기 위하여 HPLC를 실시하였다. 이때 HLPC 사용 조건은 다음과 같다.
Data detection: PDA, 210 nm, Column: C18μbondapakTM (reverse phase column, size: 3.9 x 300 mm), Mobile phase: 10 min of 50% methanol in water, Flow rate: 0.3 ㎖/min, Injection volume was 10 ㎕.
HPLC로 분리하여 분자량이 230.26 m/z인 4H-Furo [2,3-b] [1] 벤조피렌-4-원, 2,3-다이하이드로-2,2,3-트라이메틸-(4H-Furo [2,3-b] [1] benzopyran-4-one, 2,3-dihydro-2,2,3-trimethyl-)을 확인하였다 (도 9 참조).
실시예 2. 두충 에탄올 추출물의 뇌신경세포 보호 활성 확인
PC12 세포를 항진균제/항생제를 함유한 RPMI-1640 배지에서 배양하여 세포 수가 104-106 cell/㎖이 되었을 때, 100 μM의 H2O2를 처리하여 산화적인 스트레스(oxidative stress)를 유도하였다. 세포 활성(cell viability)은 MTT 환원 어세이를 통해 측정하였다.
2-1. MTT 환원 어세이를 통한 세포 활성 측정
상기 실험은 세포의 활성(viability)을 측정하는 실험으로 Aβ25-35 또는 H2O2를 처리하여 생성되는 독성 물질에 의해 유도되는 산화적인 스트레스를 식용식물자원 추출물이 얼마나 보호할 수 있는지를 측정하는 실험이다. 세포에 샘플(sample)을 처리하고 48시간이 지난 후 독성 효과를 보이는 Aβ25-35 또는 H2O2를 처리하였다. 다시 24시간이 지난 후, MTT 시약 [3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide]을 넣어 그 반응을 보았다. Aβ25-35 또는 H2O2의 독성에도 견뎌내어 세포가 살아있다면 미토콘드리아의 호흡이 일어나고, 호흡에 의해 생성되는 NADH나 NADPH와 반응하여 보라색의 포마잔(formazan)을 형성하였다. 상기 포마잔 형성을 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 측정하였다 (wavelength : measurement 570 ㎚, reference 630 ㎚).
두충 추출물의 효과를 확인하기 위하여 잎 부분과 수피층으로 나누어 MTT 환 원 어세이를 실시한 결과, 두 부분 모두 비슷한 보호 효과를 나타냈다 (도 2). 보호 효과의 안정성을 확인하기 위하여 LDH 분비 어세이(lactate dehydrogenase release assay) 와 생존율(survival rate)을 측정하였다. 그 결과, 두충 추출물이 Aβ로부터 PC12 세포를 보호함을 확인하였다 (도 3 및 도 4). 여러 가지 식용 자원을 대상으로 Aβ에 의한 뇌신경세포 손상 저해효과를 확인한 결과, 두충 추출물이 유의적인 효과를 보였다 (도 1).
실시예 3. 동물을 이용한 활성 효과 확인
생체 내(in vivo)에서 두충 추출물의 활성을 측정하기 위하여 마이스(mice)에 Aβ를 410 pmol/마리로 주사하여 치매 모델을 확립하였다. 기억력 및 학습능력 활동량을 측정하기 위한 Y-미로 실험(Y-maze test) 및 수동 회피 검사(passive avoidance test)를 실시하였다. ICR-수컷 마이스(ICR-male mice)는 사료(feed)에 두충 추출물을 혼합해 약 3주간 ad lib.의 상태로 공급하였다. 치매 유발성 물질로는 Aβ를 ICV (intracerebroventricular) 투여하여 각각 ⓐ, ⓑ, ⓒ 세 개의 arms를 갖는 Y-maze에서 행동실험을 실시하였다. Y-maze는 길이 32.5 cm, 높이 15 cm 그리고 넓이 4 cm로써 각각의 arm을 A, B, C로 정한 다음 들어간 arms를 기록했다. 마우스를 arm에 넣고 아무런 자극 없이 8분 동안 자유롭게 움직이도록 두었다. 꼬리를 제외하고 arm에 두 뒷발이 들어간 것을 측정하여 그 수치를 계산하였다.
수동 회피 검사(passive avoidance test)는 위의 동물모델을 실제 실험에 들어가기 전날에 기억상자와 같은 장소에서 훈련(training) 시킨 다음 행동 실험을 실시하였다. 모든 마우스를 실험 전날 실험 상자에서 적응 훈련 (명(明)실-명(明)실, 쇼크 없음-명(明)실, 쇼크 있음)을 실시한 후에 24시간 뒤에 쇼크는 없고, 빛은 있는 상태에서 1마리당 300 sec 동안 실험하였다.
그 결과, 두충 추출물 (400 mg/kg, 800 mg/kg, 1,200 mg/kg per day)을 섭취시킨 군에서 Aβ 투여군에 비해 기억 학습 능력이 유의할 정도로 향상, 유지됨을 확인하였다(도 10 및 11).
도 1은 두충 에탄올 추출물의 산화적인 스트레스에 의한 뇌신경세포의 손상 저해 활성을 나타낸 도이다.
그룹 C 는 아무것도 처리하지 않은 대조군이다. 그룹 H 는 100 μM H2O2 를 처리한 군이다. 그룹 V 는 H2O2 처리 전 48시간 동안 100 μM Vit. C 를 사전 처리한 군이다. 샘플 그룹은 H2O2 처리 전 48시간 동안 샘플(20 ㎕, 1 ㎎/㎖)을 처리한 군이다. 데이타는 평균 ± S.D. (n=4)을 나타낸다.
도 2는 두충 에탄올 추출물이 산화적인 스트레스에 의한 뇌신경세포 보호 효과를 보임을 확인한 도이다.
V: 100 μM Vit C + 100 μM H2O2
EB: 두충 추출물(Eucommia ulmoides extract) 수피(Bark) + 100 μM H2O2
EL: 두충 추출물(Eucommia ulmoides extract) 잎(Leaf) + 100 μM H2O2
데이타는 평균 ± S.D. (n=8)을 나타낸다.
도 3은 두충 에탄올 추출물이 뇌 신경세포 보호 효과를 보임을 LDH 분비 어세이(lactate dehydrogenase release assay)로 확인한 도이다.
그룹 C 는 아무것도 처리하지 않은 대조군이다. 그룹 A는 10 μM Aβ25-35 를 처리한 군이고, 그룹 V 는 Aβ25-35 처리 전 48시간 동안 100 μM Vit. C 를 사전 처리한 군이다. 그룹 E 는 Aβ25-35 처리 전 48시간 동안 두충 에탄올 추출물(100 ㎕, 1 ㎎/㎖)을 사전 처리한 군이다. 데이타는 평균 ± S.D. (n=4)을 나타낸다.
도 4는 두충 추출물이 PC12 세포에서 뇌신경세포를 손상시키는 아밀로이드 베타 펩타이드로부터 보호하여 세포의 생존율을 높임을 확인한 도이다.
그룹 C 는 아무것도 처리하지 않은 대조군이다. 그룹 A는 10 μM Aβ25-35 를 처리한 군이고, 그룹 V 는 Aβ25-35 처리 전 48시간 동안 100 μM Vit. C 를 사전 처리한 군이다. 그룹 E 는 Aβ25-35 처리 전 48시간 동안 두충 에탄올 추출물(200 ㎕, 1 ㎎/㎖)을 사전 처리한 군이다. 데이타는 평균 ± S.D. (n=4)을 나타낸다.
도 5는 두충 에탄올 추출물에 극성이 다른 유기용매를 이용하여 분획한 후, 각 분획에 대한 산화적인 손상에 대한 저해 활성을 나타낸 도이다.
그룹 C 는 아무것도 처리하지 않은 대조군이다. 그룹 A는 10 μM Aβ25-35 를 처리한 군이고, 그룹 V 는 Aβ25-35 처리 전 48시간 동안 100 μM Vit. C 를 사전 처리한 군이다. 샘플 그룹 (H1 ～ H3: 헥산 분획, C1 ～ C3: 클로로포름 분획, E1 ～ E3: 에틸 아세트산 분획) 은 Aβ25-35 처리 전 48시간 동안 샘플(20 ㎕, 1 ㎎/㎖)을 처리한 군이다. 데이타는 평균 ± S.D. (n=4)을 나타낸다.
도 6은 두충 에탄올 추출물에 극성이 다른 유기용매를 이용하여 분획한 후, 각 분획의 Aβ25-35 유도에 의한 뇌 신경세포 독성으로부터 보호 활성을 나타낸 도이다.
그룹 C 는 아무것도 처리하지 않은 대조군이다. 그룹 A는 10 μM Aβ25-35 를 처리한 군이고, 그룹 V 는 Aβ25-35 처리 전 48시간 동안 100 μM Vit. C 를 사전 처리한 군이다. 샘플 그룹 (H1 ～ H3: 헥산 분획, C1 ～ C3: 클로로포름 분획, E1 ～ E3: 에틸 아세트산 분획) 은 Aβ25-35 처리 전 48시간 동안 샘플(30 ㎕, 1 ㎎/㎖)을 처리한 군이다. 데이타는 평균 ± S.D. (n=4)을 나타낸다.
도 7은 오픈 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리한 분획 후, 각 분획에 대한 산화적 스트레스에 대한 저해 활성을 나타낸 도이다.
그룹 C 는 아무것도 처리하지 않은 대조군이다. 그룹 A는 10 μM Aβ25-35 를 처리한 군이고, 그룹 V 는 Aβ25-35 처리 전 48시간 동안 100 μM Vit. C 를 사전 처리한 군이다. 샘플 그룹은 (분획 1 ～ 33) Aβ25-35 처리 전 48시간 동안 샘플 (20 ㎕, 1 ㎎/㎖)을 사전 처리한 군이다. 상기 분획은 클로로포름과 에탄올 (100:0, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80, 10:90, 0:100, 각각 3회 반복 실행)로 구성된 스텝와이즈 그라디언트(stepwise gradient)에 의해 분리되었다. 데이타는 평균 ± S.D. (n=4)을 나타낸다.
도 8은 오픈 실리카 젤 컬럼 크로마토그래피로 분리한 분획 후, 각 분획의 Aβ25-35 유도에 의한 뇌 신경세포 독성으로부터 보호 활성을 나타낸 도이다.
그룹 C 는 아무것도 처리하지 않은 대조군이다. 그룹 A는 10 μM Aβ25-35 를 처리한 군이고, 그룹 V 는 Aβ25-35 처리 전 48시간 동안 100 μM Vit. C 를 사전 처리한 군이다. 샘플 그룹은 (분획 1 ～ 33) Aβ25-35 처리 전 48시간 동안 샘플 (30 ㎕, 1 ㎎/㎖)을 사전 처리한 군이다. 상기 분획은 클로로포름과 에탄올(100:0, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80, 10:90, 0:100, 각각 3회 반복 실행)로 구성된 스텝와이즈 그라디언트(stepwise gradient)에 의해 분리되었다. 데이타는 평균 ± S.D. (n=4)을 나타낸다.
도 9는 가장 높은 활성을 나타낸 클로로포름(Chloroform) : EtOH = 90 : 10 첫 번째 분획의 활성성분을 확인하기 위한 HLPC 결과를 나타낸 도이다.
상기 데이터는 200 내지 800 nm 범위에서 수집하였으며, 210 nm 에서 확인 하였다. 현저한 단일 피크(peak)는 1 분에서 확인되었다. μ-bondapak C18 reverse column: 3.9×300 ㎜, mobile phase: 10 min of 50% methanol in water, 유속: 0.3 ㎖/min, 디텍터(detector): PDA. 투여 볼륨은 10 ㎕ 이다.
도 10은 생체 내 치매 모델에서 두충 추출물의 뇌신경세포 보호 효과를 확인 하기 위해 자발적 대안 행동 및 Y-미로 실험(Y-maze test)을 시행한 결과를 나타낸 도이다.
그룹 C는 Aβ42-1를 투여한 군이다. 그룹 A 는 마우스 1 마리 당 Aβ1-42 를 410 p㏖ 투여한 군이다. 샘플 그룹은(E400, E800, E1200) 두충 에탄올 추출물(400 ㎎/㎏, 800 ㎎/㎏, 1,200 ㎎/㎏ per day)을 공급한 후 Aβ1-42 를 투여한 군이다.
자발적 대안 행동(alternation behavior) 및 arm entries 수는 8 분 동안 측정하였다. arm entries 수는 변화하지 않았다. 데이터는 평균±S.D.(n=8)을 나타내며, *P<0.01 대조군과 비교한 값, #P<0.01 Aβ1-42 군과 비교한 값이다.
도 11은 생체 내 치매 모델에서의 두충 추출물의 뇌신경세포 보호 효과를 확인하기 위해 수동 회피 실험(passive avoidance test)에서의 스텝 쓰루 레이턴시(step-through latency)를 시행한 결과를 나타낸 도이다.
그룹 C는 Aβ42-1 를 투여한 군이다. 그룹 A 는 마우스 1 마리 당 Aβ1-42 410 p㏖ 을 투여한 군이다. 샘플 그룹(E400, E800, E1200)은 두충 에탄올 추출물 (400 ㎎/㎏, 800 ㎎/㎏, 1,200 ㎎/㎏ per day)을 공급한 후 Aβ1-42 를 투여한 군이다.
Arm entries 수는 8 분 동안 측정하였다. 값은 평균 ± S.D. (n=8)을 나타내며, *P<0.01 대조군과 비교한 값, #P<0.01 Aβ1-42 군과 비교한 값이다.
Claims (10)
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- 하기 화학식 1로 표기되는 화합물을 포함하는 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.[화학식]
- 제5항에 있어서, 상기 화합물은 두충에서 분리한 것인 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 신경질환은 아밀로이드 베타 펩타이드-유도 산화적인 스트레스에 의한 뇌신경 세포 손상이 유발되는 질환인 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 신경질환은 알츠하이머병 또는 치매인 조성물.
- 제5항에 있어서, 화합물은,ⅰ) 두충 추출물에 극성이 다른 유기용매를 이용하여 분획하고 그 분리물을 수득하는 단계;ⅱ) 상기 ⅰ) 단계에서 수득한 분리물을 오픈 실리카 젤 컬럼을 통해서 뇌손상 저해 활성 성분을 수득하는 단계; 및ⅲ) 상기 ⅱ) 단계에서 수득한 활성 분획을 역상 컬럼을 이용한 HPLC를 사용하여 화학식 1의 화합물을 수득하는 단계를 포함하는 제조 방법에 의하여 얻어진 것인 조성물.
- 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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| 동의생리병리학회지 제20권 5호, 1334-1336쪽 (2006)* |
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