KR101817997B1 - 퇴행성 뇌신경계 질환 개선용 건강기능성 식품 - Google Patents

퇴행성 뇌신경계 질환 개선용 건강기능성 식품 Download PDF

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Abstract

본 발명은 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 천연물 또는 천연물 유래 추출물을 포함하여 독성이 없으며 높은 뇌신경보호 활성을 가져 뇌질환 예방 또는 개선용으로 적합한 건강기능성 식품에 관한 것이다.

Description

퇴행성 뇌신경계 질환 개선용 건강기능성 식품{Health functional food for preventing neurodegenerative disease}
본 발명은 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 천연물 또는 천연물 유래 추출물을 포함하여 독성이 없으며 높은 뇌신경보호 활성을 가져 뇌질환 예방 또는 개선용으로 적합한 건강기능성 식품에 관한 것이다.
알츠하이머 병에서의 뇌 신경 세포 괴사의 원인은 산소 자유 라디컬(oxygen free radical)의 생성, 활성산소(reactive oxygen species ;ROS)에 의한 산화적 손상에 따른 뇌 신경 세포 파괴 및 병인(pathogenesis)과 관련되어 있을 것으로 추정된다. 알츠하이머 병 환자의 뇌를 관찰한 결과 산화 스트레스(ROS, lipid peroxidation, protein modification, mitochondrial DNA oxidation)의 증가를 보였다. 이러한 생리적 대사 이상이 아밀로이드 플라크(amyloid plaques) 및 신경섬유 농축체(neurofibrillary tangles ;NFT)와 같은 알츠하이머 환자 뇌고유의 임상적 결과를 초래한다.
또한, 알츠하이머 병의 치료는 주로 환자의 증세를 가볍게 하고, 병의 진행속도를 지연시키는데 주안을 두고 있다. 알츠하이머 환자가 보이는 주요 증세에는 기억력, 인지능력, 학습능력의 감퇴가 있고, 이어서 감정 장애와 이상행동을 나타낸다. 이 중에서 가장 보편적인 증세인 기억력과 인지능력 장애에 대한 증세를 가볍게 해주는 간접 치료가 유일한 치료법이 되었다.
이에, 현재까지 보고된 항치매 활성화 성분은 주로 식물기원성 저분자로 특히 노인성 치매 환자들에게 인지적 증상을 호전시키는 약물로서 cholinesterase inhibitors(ChEIs)를 많이 사용하고 있다. 제1세대 ChEIs로서 최초로 항치매 작용에 있어 적용 승인을 받은 tacrine은 작용지속 기간이 짧아 하루 4번 투여해야 하며, 간 독성이 있어 관찰의 번거로움이 있다. 요즈음 주목받고 있는 제2세대 ChEIs들로는 일본 에자이사에서 개발되어 96년말 미국 FDA 승인을 받고 97년부터 세계 30여국에서 판매되고 있는 Donepezil로 하루 한번 복용할 수 있고, 선택적인 저해로 말초 부작용을 줄였다. 또한, Rivastigmine은 미국 노바티스사에서 개발한 약물로, 스위스에서 1997년 12월에 승인받아 EU와 남아메리카 국가들에서 사용되고 있고, 미국, 캐나다에서도 승인 준비 중이며, 우리나라에는 97년 9월 도입되었다. Rivastigmine은 하루 2번 복용이 가능하고 중추신경계에 특이성이 높아 말초 부작용을 크게 감소시켰고 신장에서 대사되므로 간 독성이 거의 없는 것으로 보고되고 있다. Metrifonate가 치매환자에 3상 임상실험이 진행 중이며, 이는 비가역적인 AChEIs로서 작용기간이 길다.
종래기술들 중 공개특허 10-2013-0010042(공개일자: 2013년01월24일)에는 흑삼 건조분말 또는 흑삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 건망증 개선 및 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료를 위한 조성물, 특히 기억력 감퇴 동물군의 학습증진 및 공간지각 능력을 높은 수준으로 향상시키는 탁월한 효능을 나타내므로 건망증 개선 및 퇴행성 뇌질환 치료에 유용한 의약품 및 건강기능식품 또는 식품첨가물을 기재하고 있다.
또한, 현재까지 알츠하이머 병 약물개발의 주 표적은 병에서 나타나는 신경전달물질 이상으로 콜린성 신경 세포를 표적으로 한 콜린에스테라제 억제제들(Aricept, Exelon, Reminyl 등)과 글루타메이트 길항제인 Memantine이 FDA 승인을 얻어 현재 시판 중에 있는 것이 전부이다. 하지만 상기 언급한 바와 같이 이들 약물은 일시적으로 증상만 완화시킬 뿐이므로 병을 근원적으로 치료하거나 병의 진행 자체를 억제하는 약물 개발 기술이 절실히 요구되고 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 천연물 또는 천연물 유래 추출물을 포함하여 독성이 없으며 높은 뇌신경보호 활성을 가져 뇌질환 예방 또는 개선용으로 적합한 건강기능성 식품을 제공하려는 목적이 있다.
본 발명은 율무 및 두충을 포함하는 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 율무는 율무 분획물, 율무 분말 및 율무 추출물로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하고, 상기 두충은 두충 추출물 및 두충 분말로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 건강기능성 식품은 솔잎, 돌미나리, 인진호, 청피(Citrus unshiu) 및 차가버섯으로 이루어진 군 중 1종 이상을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 율무 100 중량부에 대하여 두충 80 ~ 200 중량부, 솔잎 100 ~ 180 중량부, 인진호 30 ~ 80 중량부 및 차가버섯 10 ~ 50 중량부를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 건강기능성 식품은 율무 100 중량부에 대하여 돌미나리 70 ~ 150 중량부를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 건강기능성 식품은 율무 100 중량부에 대하여 청피 20 ~ 90 중량부를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 건강기능성 식품은 상기 건강기능성 식품은 율무 100 중량부에 대하여, 두충 120 ~ 200 중량부, 솔잎 150 ~ 180 중량부, 인진호 50 ~ 80 중량부 및 차가버섯 30 ~ 50를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 건강기능성 식품은상기 건강기능성 식품은 두충, 솔잎, 인진호 및 차가버섯이 1: 0.5 ~ 2.25: 0.15 ~ 1: 0.05 ~ 0.625 의 중량비로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 건강기능성 식품은 율무 100 중량부에 대하여, 두충 120 ~ 150 중량부, 인진호 50 ~ 100 중량부 및 청피 70 ~ 90 중량부를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 건강기능성 식품은 율무 100 중량부에 대하여, 두충 120 ~ 200 중량부, 솔잎 150 ~ 180 중량부, 인진호 50 ~ 80 중량부 및 청피 70 ~ 90 중량부를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 뇌질환은 알츠하이머, 노인성 치매, 전두측두성 치매, 혈관성 치매, 헌팅턴 무도병 및 파킨슨병으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명은 천연물 또는 천연물 유래 추출물을 포함하여 독성이 없으며 높은 뇌신경보호 활성을 가져 뇌질환 예방 또는 개선용으로 적합한 건강기능성 식품을 제공하는 효과가 있다.
도 1 내지 4는 실험예 1에서 측정한 산화적 스트레스에 의한 뇌신경 독성으로부터 뇌신경 세포 보호 활성 그래프이다.
도 5 내지 6은 실험예 2에서 측정한 아세틸콜린에스테라제 저해 활성 그래프이다.
본 발명의 "아세틸콜린에스터레이즈 저해 활성"은 아세틸콜린에스테라제를 억제함으로써 시냅스(synapse) 내의 아세틸콜린(acetylcholine) 농도를 증가시키고, 신경보호작용(neuroprotective effect) 및 신경손상을 회복시키는 작용을 의미한다. 예를 들어, 알츠하이머성 질환의 경우 뇌 안에서의 아밀로이드 베타 단백질의 축적에 의한 아세틸콜린(acetylcholine, ACh; neurotransmitter)의 레벨(level) 감소가 그 원인의 하나로 지목되고 있는바 아세틸콜린에스터레이즈 저해 활성이 알츠하이머성 질환의 치료를 위한 핵심요소가 될 수 있다.
또한, 상기 "아세틸콜린에스테라제"는 아세틸콜린 가수 분해 효소를 말한다. 뇌조직의 모든 신경세포에서 발견되는 신경전달물질로서 아세틸콜린(Acetylcholine; ACh)은 시냅스(synapse)와 시냅스 사이의 신경전달에 관계하는 중요한 신경전달물질로 알려져 있다. 뇌신경계의 특정부위에서 아세틸콜린(ACh)이 시냅스 전 말단에서 분비되면 그것이 시냅스 후 수용체와 결합하여 신경세포 사이의 자극을 전달한다. 그러나 제 2의 자극이 시냅스를 통해 전달하기 전에 제 1의 자극 시에 분비된 아세틸콜린(ACh)은 아세틸콜린에스터라제(acetylcholinesterase; AChE)에 의하여 가수분해되어야 한다. 그런데 아세틸콜린(ACh)의 함량과 합성효소로서 콜린아세틸트랜스퍼라제(choline acetyltransferase; ChAT)의 활성이 대부분의 사람 및 설치동물에서 연령과 함께 감소하는 것으로 알려져 있다. 또한 아세틸콜린에스터라제의 활성도 아세틸콜린(ACh)와 마찬가지로 감소한다는 사실도 밝혀지고 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이 현재까지 알츠하이머 병 약물개발의 주 표적은 병에서 나타나는 신경전달물질 이상으로 콜린성 신경 세포를 표적으로 한 콜린에스테라제 억제제들(Aricept, Exelon, Reminyl 등)과 글루타메이트 길항제인 Memantine이 FDA 승인을 얻어 현재 시판 중에 있는 것이 전부이다. 하지만 상기 언급한 바와 같이 이들 약물은 일시적으로 증상만 완화시킬 뿐이므로 병을 근원적으로 치료하거나 병의 진행 자체를 억제하는 약물 개발 기술이 절실히 요구되고 있다.
이에 본 발명은 율무 및 두충을 포함하는 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해, 일시적인 증상 완화뿐 아니라 뇌질환을 근원적으로 치료하거나 병의 진행을 억제할 수 있는 뇌신경보호 활성이 높은 건강기능성 식품을 제공하는 효과가 있다.
상기 율무(Coix lachryma - jobi var. ma- yuen)는 통상적으로 수확 및/또는 구매할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으며, 그 형태 또한 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 율무 분말, 율무 분획물 및 율무 추출물로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 율무 분말은 통상적으로 수확 및/또는 구매할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 율무의 열매를 분쇄 및/또는 파쇄하여 수득한 분말을 사용할 수 있다.
상기 율무 분획물은 율무를 이용하여 수득할 수 있는 통상적인 율무 분획물이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 율무를 유기용매 1로 추출한 후 유기용매 2로 분획하여 제조한 것일 수 있다.
상기 율무 추출물은 율무를 이용하여 수득할 수 있는 통상적인 율무 추출물이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 율무를 유기용매 1로 추출하여 제조한 것일 수 있다.
상기 유기용매 1은 통상적으로 천연물에서 추출물을 추출하는데 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 물, C1 ~ C4 알코올, 클로로포름, 디클로로메탄, 아세트로나이트릴, 헥산 및 아세트산으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 물, 에탄올, 클로로포름, 헥산 및 디클로로메탄으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 추출은 통상적으로 천연물에서 추출물을 추출하는데 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 초임계추출, 아임계추출, 고온추출, 고압추출 또는 초음파추출법을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 고온추출, 고압추출 또는 초음파추출법을 사용할 수 있다.
상기 유기용매 2는 통상적으로 천연물에서 추출물을 추출하는데 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 헥산, C1 ~ C4 알코올, 클로로포름, 디클로로메탄, 아세트로나이트릴, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 및 물로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 헥산, 부탄올 및 메탄올로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 분획은 통상적으로 천연물에서 분획물을 분획하는데 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 크로마토그래피법, 용매 분획 또는 전기영동법을 수행할 수 있다.
상기 두충(Eucommia ulmoides)은 산과 들에서 자라는 중국 특산식물로서, 높이는 10 m 정도이다. 잎은 마주나고 대개 타원형으로 끝이 뾰족하며 밑은 둥글고 고르지 못한 톱니가 있으며, 잎 길이는 5∼16cm, 너비 2∼7cm로 양면에 털이 거의 없으나 맥 위에는 잔 털이 있고 예리한 톱니가 있다. 상기 두충은 통상적으로 제조 및/또는 구매할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으며, 그 형태 또한 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 두충 뿌리, 줄기, 잎으로 이루어진 군 중 1종 이상으로부터 제조된 분말 또는 추출물을 포함할 수 있다.
상기 두충 분말은 통상적으로 제조 및/또는 구매할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 두충을 분쇄 및/또는 파쇄하여 수득한 분말을 사용할 수 있다.
상기 두충 추출물은 통상적으로 제조 및/또는 구매할 수 있는 두충 추출물이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 두충와 추출용매를 포함하는 혼합물을 추출하여 제조한 것일 수 있다.
상기 추출용매는 통상적으로 천연물에서 추출물을 추출하는데 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 물, C1 ~ C4 알코올, 클로로포름, 디클로로메탄, 아세트로나이트릴, 메틸렌클로라이드, 아세톤 및 아세트산으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 물, 에탄올, 메틸렌클로라이드 및 아세톤으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 추출은 통상적으로 천연물에서 추출물을 추출하는데 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 초임계추출, 아임계추출, 고온추출, 고압추출 또는 초음파추출법을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 고온추출, 고압추출 또는 초음파추출법을 사용할 수 있다.
상기 건강기능성 식품은 율무와 두충을 포함하는 것이라면 그 함량을 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 율무 100 중량부에 대하여 두충 80 ~ 200 중량부를 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 율무 100 중량부에 대하여 두충 120 ~ 200 중량부로 포함할 수 있다.
만약, 율무 100 중량부에 대하여 두충 80 중량부 미만으로 포함할 경우, 뇌신경보호 활성이 낮아 건강기능성 식품으로 사용하기에 힘든 문제점이 발생할 수 있으며, 율무 100 중량부에 대하여 두충 200 중량부를 초과하여 포함할 경우, 첨가한 두충 대비 뇌신경보호 활성이 낮아 경제적이지 못한 문제점을 발생할 수 있다.
또한, 본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 건강기능성 식품은 솔잎, 돌미나리, 인진호(Artemisia capillaris Thunb.), 청피(Citrus unshiu) 및 차가버섯으로 이루어진 군 중 1종 이상을 더 포함할 수 있다.
상기 솔잎은 침엽상록수인 소나무의 잎 부분을 의미하는 것으로, 통상적으로 수득 및/또는 구매할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 솔잎 추출물, 솔잎 분획물 및 솔잎 분말로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 솔잎 분말은 통상적으로 제조 및/또는 구매할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 채취 및/또는 구매한 솔잎을 건조 후 분쇄 및/또는 파쇄하여 수득한 분말을 사용할 수 있다.
상기 솔잎 추출물은 통상적으로 제조 및/또는 구매할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 솔잎에 유기용매 7을 첨가하여 추출한 것일 수 있다.
상기 유기용매 3은 통상적으로 천연물에서 추출물을 추출하는데 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 물, C1 ~ C4 알코올, 아세트로나이트릴, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 1,3-부틸렌글리콜 및 에틸 아세테이트로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 물, 메탄올, 에탄올, 에틸 아세테이트 및 클로로포름으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 추출은 통상적으로 천연물에서 추출물을 추출하는데 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 초임계추출, 아임계추출, 고온추출, 고압추출 또는 초음파추출법을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 고온추출, 고압추출 또는 초음파추출법을 사용할 수 있다.
상기 솔잎 분획물은 통상의 분획 방법으로 수득할 수 있는 솔잎 분획물이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 솔잎 추출물을 유기용매 3으로 추출한 후 유기용매 4로 분획하여 제조한 것일 수 있다.
상기 유기용매 4는 통상적으로 천연물에서 분획물을 분획하는데 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 C1 ~ C4 알코올, 클로로포름, 디클로로메탄, 아세트로나이트릴, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 및 물로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 물, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 헥산, 부탄올, 에탄올 및 메탄올로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 분획은 통상적으로 천연물에서 분획물을 분획하는데 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 크로마토그래피법, 용매 분획 또는 전기영동법을 수행할 수 있다.
나아가, 상기 건강기능성 식품은 율무 100 중량부에 대하여 솔잎 10 ~ 130 중량부를 포함할 수 있고, 바람직하게는 솔잎 50 ~ 130 중량부를 포함하는 것이 좋다.
만약, 율무 100 중량부에 대하여 솔잎을 10 중량부 미만으로 포함할 경우, 솔잎의 첨가로 인해 유발될 수 있는 뇌신경보호 활성이 낮은 문제가 발생할 수 있으며, 율무 100 중량부에 대하여 130 중량부를 초과하는 솔잎을 포함할 경우, 첨가한 솔잎 함량에 비해 뇌신경보호 활성이 낮아 경제적이지 않은 문제점을 발생할 수 있다.
상기 돌미나리(Oenanthe javanica)는 미나리과에 속하는 여러해살이 쌍떡잎식물로서, 본래 계곡의 샘터나 들의 습지 또는 물가에서 야생하는 것으로, 물미나리에 비하여 줄기가 짧고 잎사귀가 많다. 그러나 요즘은 야생의 돌미나리를 채취하는 일은 흔하지 않고, 밭에서 재배하여 상품화한다. 밭미나리는 3기작 재배가 가능하고, 정식 후 35~45일이면 수확할 수 있다. 상기 돌미나리는 통상적으로 제조 및/또는 구매할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 돌미나리 추출물인 것이 바람직하다.
상기 돌미나리 추출물은 통상적으로 제조 및/또는 구매할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 돌미나리에 유기용매 5를 첨가하여 추출한 것일 수 있다.
상기 유기용매 5는 통상적으로 천연물에서 추출물을 추출하는데 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 물, C1 ~ C4 알코올, 아세트로나이트릴, 메틸렌클로라이드, 클로로포름 및 에틸 아세테이트로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 물, 메탄올, 에탄올 및 헥산으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 추출은 통상적으로 천연물에서 추출물을 추출하는데 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 초임계추출, 아임계추출, 고온추출, 고압추출 또는 초음파추출법을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 고온추출, 고압추출 또는 초음파추출법을 사용할 수 있다.
더불어, 상기 건강기능성 식품은 율무 100 중량부에 대하여 돌미나리 50 ~ 100 중량부를 포함할 수 있고, 바람직하게는 돌미나리 80 ~ 100 중량부를 포함하는 것이 좋다.
만약, 율무 100 중량부에 대하여 돌미나리를 50 중량부 미만으로 포함할 경우, 돌미나리의 첨가로 인해 유발될 수 있는 뇌신경보호 활성이 낮은 문제가 발생할 수 있으며, 율무 100 중량부에 대하여 100 중량부를 초과하는 돌미나리를 포함할 경우, 첨가한 돌미나리의 함량에 비해 뇌신경보호 활성이 낮아 경제적이지 않은 문제점을 발생할 수 있다.
상기 인진호(茵蔯蒿)는 국화과의 사철쑥(Artemisia capillaris Thunb.)의 지상부를 말린 약재(한국)를 말하며, 상기 인진호는 통상적으로 재배 및/또는 구매할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 인진호 분말 및 인진호 추출물로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 인진호 분말은 통상적으로 제조 및/또는 구매할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 채취 및/또는 구매한 인진호을 건조 후 분쇄 및/또는 파쇄하여 수득한 분말을 사용할 수 있다.
상기 인진호 추출물은 통상적으로 제조 및/또는 구매할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 인진호에 유기용매 7을 첨가하여 추출한 것일 수 있다.
상기 유기용매 7은 통상적으로 천연물에서 추출물을 추출하는데 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 물, C1 ~ C4 알코올, 아세토나이트릴, 메틸렌클로라이드 및 아세트산으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 물, 에탄올, 메탄올 및 아세토나이트릴로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 추출은 통상적으로 천연물에서 추출물을 추출하는데 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 초임계추출, 아임계추출, 고온추출, 고압추출 또는 초음파추출법을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 고온추출, 고압추출 또는 초음파추출법을 사용할 수 있다.
게다가, 상기 건강기능성 식품은 율무 100 중량부에 대하여 인진호 30 ~ 80 중량부로 포함할 수 있고, 바람직하게는 50 ~ 80 중량부를 포함하는 것이 좋다.
만약, 율무 100 중량부에 대하여 인진호을 30 중량부 미만으로 포함할 경우, 인진호의 첨가로 인해 유발될 수 있는 뇌신경보호 활성이 낮은 문제가 발생할 수 있으며, 율무 100 중량부에 대하여 80 중량부를 초과하는 인진호을 포함할 경우, 첨가한 인진호 양에 비해 뇌신경보호 활성이 낮아 경제적이지 않은 문제점을 발생할 수 있다.
상기 청피(Citrusunshiu Marcor.)는 운향과의 귤나무(Citrus unshiu Markovich) 또는 동속 근연식물의 덜 익은 과피를 말한다. 상기 청피는 통상적으로 재배 및/또는 구매할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 청피 추출물 및 청피 분말로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 청피 분말은 통상적으로 제조 및/또는 구매할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 채취 및/또는 구매한 청피를 건조 후 분쇄 및/또는 파쇄하여 수득한 분말을 사용할 수 있다
상기 청피 추출물은 통상적으로 제조 및/또는 구매할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 청피에 유기용매 10을 첨가하여 추출한 것일 수 있다.
상기 유기용매 10은 통상적으로 천연물에서 추출물을 추출하는데 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 헥산, 물, C1 ~ C4 알코올, 아세토나이트릴, 디에틸에테르, 아세톤 및 에틸아세테이트로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 물, 헥산, 에탄올 및 디에틸에테르로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 추출은 통상적으로 천연물에서 추출물을 추출하는데 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 초임계추출, 아임계추출, 고온추출, 고압추출 또는 초음파추출법을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 고온추출, 고압추출 또는 초음파추출법을 사용할 수 있다.
또한, 상기 건강기능성 식품은 율무 100 중량부에 대하여 청피 20 ~ 150 중량부로 포함할 수 있고, 바람직하게는 청피 70 ~ 150 중량부를 포함하는 것이 좋고, 더욱 바람직하게는 청피 100 ~ 150 중량부를 포함하는 것이 좋다.
만약, 율무 100 중량부에 대하여 청피를 20 중량부 미만으로 포함할 경우, 청피 첨가로 인해 유발될 수 있는 뇌신경보호 활성이 낮은 문제가 발생할 수 있으며, 율무 100 중량부에 대하여 150 중량부를 초과하는 청피를포함할 경우, 첨가한 청피에 비해 뇌신경보호 활성이 낮아 경제적이지 않은 문제점을 발생할 수 있다.
상기 차가버섯(Inonotus Obliquus)은 통상적으로 제조 및/또는 구매할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으며, 그 형태 또한 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 차가버섯 분말, 차가버섯 추출물 및 차가버섯 분획물로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 차가버섯 분말은 통상적으로 제조 및/또는 구매할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 차가버섯을 건조한 후 분쇄 및/또는 파쇄하여 수득한 분말을 사용할 수 있다.
상기 차가버섯 추출물은 통상적으로 제조 및/또는 구매할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 차가버섯에 유기용매 8을 첨가하여 추출한 것일 수 있다.
상기 유기용매 8은 통상적으로 천연물에서 추출물을 추출하는데 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 물, C1 ~ C4 알코올, 아세토나이트릴 및 아세트산으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 물, 메탄올, 에탄올 및 디클로로메탄으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 추출은 통상적으로 천연물에서 추출물을 추출하는데 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 초임계추출, 아임계추출, 고온추출, 고압추출 또는 초음파추출법을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 고온추출, 고압추출 또는 초음파추출법을 사용할 수 있다.
상기 차가버섯 분획물은 통상의 분획 방법으로 수득할 수 있는 차가버섯 분획물이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 차가버섯을 유기용매 8로 추출한 후 유기용매 9로 분획하여 제조한 것일 수 있다.
상기 유기용매 9는 통상적으로 천연물에서 분획물을 분획하는데 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 C1 ~ C4 알코올, 클로로포름, 디클로로메탄, 아세토나이트릴, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 및 물로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 클로로포름, 에틸아세테이트, 헥산, 부탄올, 물 및 메탄올로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 분획은 통상적으로 천연물에서 분획물을 분획하는데 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 크로마토그래피법, 용매 분획 또는 전기영동법을 수행할 수 있다.
또한, 상기 건강기능성 식품은 율무 100 중량부에 대하여 차가버섯 10 ~ 50 중량부로 포함할 수 있고, 바람직하게는 차가버섯 20 ~ 50 중량부를 포함하는 것이 좋고, 더욱 바람직하게는 차가버섯 30 ~ 50 중량부를 포함하는 것이 좋다.
만약, 율무 100 중량부에 대하여 차가버섯을 10 중량부 미만으로 포함할 경우, 차가버섯의 첨가로 인해 유발될 수 있는 뇌신경보호 활성이 낮은 문제가 발생할 수 있으며, 율무 100 중량부에 대하여 50 중량부를 초과하는 차가버섯을 포함할 경우, 첨가한 차가버섯에 비해 뇌신경보호 활성이 낮아 경제적이지 않은 문제점을 발생할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일구현예에 따르면, 상기 건강기능성 식품은 율무 100 중량부에 대하여 두충 80 ~ 200 중량부, 솔잎 10 ~ 130 중량부, 인진호 50 ~ 80 및 차가버섯 10 ~ 50 중량부를 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 건강기능성 식품은 율무 100 중량부에 대하여, 두충 120 ~ 200 중량부, 솔잎 50 ~ 130, 인진호 70 ~ 80 중량부 및 차가버섯 30 ~ 50 중량부를 포함하는 것이 좋다. 상기 율무, 두충, 솔잎, 인진호 및 차가버섯이 상기 범위로 포함되는 경우, 보다 우수한 뇌 신경 세포 보호활성 및 아세틸콜린에스터라제의 저해활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일구현예에 따르면, 상기 건강기능성 식품은 두충, 솔잎, 인진호 및 차가버섯을 1: 0.5 ~ 2.25: 0.15 ~ 1: 0.05 ~ 0.625의 중량비로 포함할 수 있고, 더욱 바람직하게는 두충, 솔잎, 인진호 및 차가버섯을 1: 0.75 ~ 1.5: 0.15 ~ 0.67: 0.05 ~ 0.42 의 중량비로 포함하는 것이 좋다. 상기 두충, 솔잎 및 차가버섯이 상기 범위로 포함되는 경우, 보다 우수한 뇌 신경 세포 보호활성 및 아세틸콜린에스터라제의 저해활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일구현예에 따르면, 상기 건강기능성 식품은 율무 100 중량부에 대하여, 두충 120 ~ 200 중량부, 인진호 50 ~ 80 중량부 및 청피 70 ~ 90 중량부를 포함할 수 있다. 상기 율무, 두충, 솔잎 및 차가버섯이 상기 범위로 포함되는 경우, 보다 우수한 뇌 신경 세포 보호활성 및 아세틸콜린에스터라제의 저해활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 다른 일구현예에 따르면, 상기 종양은 뇌질환은 알츠하이머, 노인성 치매, 전두측두성 치매, 혈관성 치매, 헌팅턴 무도병 및 파킨슨병으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 건강기능성 식품의 종류에는 통상적으로 제조 및/또는 판매되는 것이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있고 통상적인 의미에서의 건강기능성 식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 상술한 바와 같은 천연물 또는 천연물 유래 물질을 함유하는 것 외에는 액체성분에는 특별한 제한은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
통상적으로, 건강기능성 식품 조성물에 포함되는 상술한 바와 같은 천연물 또는 천연물 유래 물질의 함량은 전체 식품 중량의 0.1 ~ 50 중량%을, 바람직하게는 1 ~ 40 중량%을 포함할 수 있다. 또한, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수도 있다.
이하 첨부된 하기 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이러한 도면과 하기 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 또한 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경 가능함은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
[ 실시예 ]
준비예 1. 율무 분말
본 발명에서 사용한 율무는 경기도 연천군의 전곡시장에서 한국산으로 구매하여 세척한 후 동결 건조한 다음 분쇄하여 율무 분말 1㎏을 준비하였다.
준비예 2. 율무 에탄올 추출물
준비예 1에서 수득한 율무 분말 1㎏과 에탄올을 1 : 8 부피비로 혼합한 후 25 ℃에서 3회 추출하여 추출물을 제조하고, 추출물은 여과지에 여과한 후 감압농축하여 200 g의 율무 에탄올 추출물을 수득하였다.
준비예 3. 율무 수추출물
추출 용매로 물을 사용하고, 율무 분말과 물을 1 : 10 부피비로 혼합하며, 80 ℃에서 추출한 것을 제외하고는 준비예 2와 동일한 방법으로 율무 수추출물 100 g을 수득하였다.
준비예 4. 율무 분획물
추출 용매로 메탄올을 사용한 것을 제외하고는 준비예 2와 동일한 방법으로 율무 메탄올 추출물 200 g을 수득하였다. 이후 율무 메탄올 추출물 200 g을 증류수 2 ℓ에 현탁하고 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올로 분획하고, 각각 분획된 회전식 진공농축기를 이용하여 농축한 후 헥산 분획물, 디클로로메탄 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물을 수득하였다. 그 중 헥산 분획물과 부탄올 분획물을 선발하였다.
준비예 5. 두충 수추출물
연천군 두충재배 농장으로부터 공급받은 두충잎을 음건하여 파쇄한 후 추출기에 넣고 10배 가하여 80℃에서 10시간동안 추출한 후 여과하여 회전 감압농축기로 농축시켜 두충잎 물추출물을 제조하였다. 농축정도는 건시료 100g당 물추출물이 100 ml가 되도록 농축하여 두충 수추출물 500 g을 수득하였다.
준비예 6. 두충 에탄올 추출물
준비예 5의 두충 수추출물에 부피대비 8배의 80% 에탄올을 첨가한 후 40 ℃에서 10 시간 동안 진탕 추출하여 추출물을 제조하고, 추출물은 여과지에 여과한 후 감압농축하여 두충 에탄올 추출물을 수득하였다.
준비예 7. 돌미나리 메탄올 추출물
본 발명에서 사용한 돌미나리는 연천군 전곡재래시장에서 구입된 것으로 건조물 상태의 재료를 시중에서 구입하여 동결건조한 감국 10 kg에 80% 메탄올 28 L를 가하여 실온에서 일주일간 추출하였고, 이 과정을 3회 반복하여 여과지(Advantec no. 2 filter paper)에 여과하고 그 여과액을 45℃에서 증발기(EYELA사, N-1000, 일본)를 이용하여 감압농축하여 메탄올 추출물을 얻었다.
준비예 8. 돌미나리 분획물
상기 준비예 7의 감국 메탄올 추출물 200 g을 증류수 2 ℓ에 현탁하고 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올로 분획하고, 각각 분획된 회전식 진공농축기를 이용하여 농축한 후 헥산 분획물, 디클로로메탄 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물을 수득하였다. 그 중 헥산 분획물과 부탄올 분획물을 선발하였다.
준비예 9. 솔잎 분말
본 발명에서 사용한 솔잎은 경기도 연천군 전곡재래시장에서 구매하여 수세하고 건조한 후 세절하여 100 mesh 이내로 분말화하여 솔잎 분말을 수득하였다.
준비예 10. 솔잎 수추출물
준비예 9의 솔잎 분말 중량대비 8배의 물을 첨가한 후 70 ℃에서 24 시간 동안 추출하여 추출물을 제조하고, 추출물은 여과지에 여과한 후 증발기(EYELA사, N-1000, 일본)를 이용하여 감압농축하여 솔잎 수추출물을 수득하였다.
준비예 11. 솔잎 분획물
추출 용매로 메탄올을 사용한 것을 제외하고는 준비예 2와 동일한 방법으로 솔잎 메탄올 추출물 200 g을 수득하였다. 이후 솔잎 메탄올 추출물 200 g을 증류수 2 ℓ에 현탁하고 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올로 분획하고, 각각 분획된 회전식 진공농축기를 이용하여 농축한 후 헥산 분획물, 디클로로메탄 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물을 수득하였다. 그 중 헥산 분획물과 부탄올 분획물을 선발하였다.
준비예 12. 인진호 에탄올 추출물
본 발명에서 사용한 인진호는 전라남도 장흥에서 채취하여 수세하고 세절하여 동결 건조한 후 분쇄하여 인진호 분말을 준비하였다. 이후 인진호 분말 중량대비 10배의 에탄올을 첨가한 후 90 ℃에서 5 시간 동안 환류 추출하여 추출물을 제조하고, 추출물은 여과지에 여과한 후 증발기(EYELA사, N-1000, 일본)를 이용하여 감압농축하여 인진호 에탄올 추출물을 수득하였다.
준비예 13. 인진호 수추출물
준비예 10에서 수득한 인진호 분말과 물을 1 : 8 중량비로 혼합한 후 80 ℃에서 2 시간 동안 환류 추출하는 것을 1회로 총 3회 추출하여 추출물을 제조하고, 추출물은 여과지에 여과한 후 증발기(EYELA사, N-1000, 일본)를 이용하여 감압농축하여 인진호 수추출물을 수득하였다.
준비예 14. 차가버섯 분말
본 발명에서 사용한 차가버섯은 경기도 연천군 전곡재래시장에서 중국산으로 구매하고 분쇄하여 차가버섯 분말을 준비하였다.
준비예 15. 차가버섯 메탄올 추출물
상기 실시예 14의 차가버섯 분말을 준비한 후 차가버섯 분말과 메탄올을 1 : 10 부피비로 혼합하고, 80 ℃에서 5 시간 동안 추출하는 것을 1회로 총 3회 추출한 후 여과지에 여과하고 증발기(EYELA사, N-1000, 일본)를 이용하여 감압농축하여 차가버섯 메탄올 추출물을 수득하였다.
준비예 16. 청피 수추출물
본 발명에서 사용한 청피는 경기도 연천군 전곡재래시장에서 한국산으로 건조상태의 것을 구입하였고, 불순물 제거를 위해 2회 수세한 후 건조시킨 것을 물과 1 : 3 중량비로 혼합한 후 90 ℃에서 5 시간 동안 교반하여 추출하는 것을 1회로 총 3회 추출하여 추출물을 제조하고, 추출물은 여과지에 여과한 후 증발기(EYELA사, N-1000, 일본)를 이용하여 감압농축하여 청피 수추출물을 수득하였다.
실시예 1. 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품의 제조
준비예 1의 율무 분말 10 g과 준비예 5의 두충 수추출물 15 g을 혼합하여 혼합물을 제조하였다.
실시예 2 ~ 15. 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품의 제조
하기 표 1의 혼합비로 혼합하여 혼합물을 제조하였다.
성분 및 함량
실시예 2 준비예 1 율무 분말 10g 준비예 5 두충 수추출물 12g 준비예 6 돌미나리 에탄올 추출물 10g
실시예 3 준비예 2의 율무 에탄올 추출물 10g 준비예 5 두충 수추출물 12g 준비예 6 돌미나리 에탄올 추출물 15g
실시예 4 준비예 2의 율무 에탄올 추출물 10g 준비예 6 두충 에탄올 추출물 18 g 준비예 7 돌미나리 메탄올 추출물 15g
실시예 5 준비예 3의 율무 수추출물 10g 준비예 6 두충 수추출물 18g 준비예 7 솔잎 분말 10 g
실시예 6 준비예 3의 율무 수추출물 10g 준비예 6 두충 에탄올 추출물 18 g 준비예 9 솔잎 분말 15 g
실시예 7 준비예 4의 율무 헥산 분획물 10g 준비예 5 두충 수추출물 18 g 준비예 10 솔잎 수추출물 18 g
실시예 8 준비예 4의 율무 헥산 분획물 10g 준비예 6 두충 에탄올 추출물 18 g 준비예 11 솔잎 부탄올 분획물 18 g 준비예 13 인진호 수추출물 10g
실시예 9 준비예 4의 율무 헥산 분획물 10g 준비예 5 두충 수추출물 18 g 준비예 10 솔잎 수추출물 18 g 준비예 13 인진호 수추출물 10g
실시예 10 준비예 4의 율무헥산 분획물 10g 준비예 5 두충 수추출물 18 g 준비예 10 솔잎 수추출물 18 g 준비예 15 차가버섯 메탄올 추출물 3g
실시예 11 준비예 4의 율무 헥산 분획물 10g 준비예 5 두충 수추출물 18 g 준비예 10 솔잎 수추출물 18 g 준비예 15 차가버섯 메탄올 추출물 5g
실시예 12 준비예 4의 율무 헥산 분획물 10g 준비예 6 두충 에탄올 추출물 18 g 준비예 9 솔잎 분말 18 g 준비예 15 차가버섯 메탄올 추출물 5g
실시예 13 준비예 4의 율무 헥산 분획물 10g 준비예 5 두충 수추출물 18 g 준비예 10 솔잎 수추출물 18 g 준비예 15 차가버섯 메탄올 추출물 5g 준비예 16 청피 분말 5 g
실시예 14 준비예 4의 율무 헥산 분획물 10g 준비예 5 두충 수추출물 18 g 준비예 10 솔잎 수추출물 18 g 준비예 15 차가버섯 메탄올 추출물 5g 준비예 16 청피 분말 5 g
실시예 15 준비예 4의 헥산 분획물 10g 준비예 6 두충 에탄올 추출물 18 g 준비예 10 솔잎 수추출물 18 g 준비예 15 차가버섯 메탄올 추출물 5g 준비예 13 인진호 수추출물 3 g
실시예 16 준비예 4의 헥산 분획물 10g 준비예 5 두충 수추출물 18g 준비예 10 솔잎 수추출물 18 g 준비예 15 차가버섯 메탄올 추출물 5g 준비예 13 인진호 수추출물 5 g
실시예 17 준비예 4의 헥산 분획물 10g 준비예 5 두충 수추출물 18 g 준비예 10 솔잎 수추출물 18 g 준비예 15 차가버섯 메탄올 추출물 5g 준비예 12 인진호 에탄올 추출물 8 g
실시예 18 준비예 4의 헥산 분획물 10g 준비예 5 두충 수추출물 18g 준비예 10 솔잎 수추출물 18 g 준비예 12 인진호 에탄올 추출물 8 g 준비예 16 청피 분말 5 g
실시예 19 준비예 4의 헥산 분획물 10g 준비예 5 두충 수추출물 18g 준비예 10 솔잎 수추출물 18 g 준비예 12 인진호 에탄올 추출물 8 g 준비예 16 청피 분말 9 g
실험예 1. 뇌 신경 세포 보호 활성 확인
실시예 1 내지 19의 혼합물 및 준비예 1 내지 16의 천연물 또는 천연물 유래 물질의 신경 세포 괴사 저해능을 측정하였다.
PC12 세포(ATCC, CRL-1721)를 항진균제/항생제(antimycotics/antibiotics) 를 함유하는 RPMI-1640 배지(GIBCO-Invitrogen Corp.,Grand Island, NY, USA)에서 배양하여 세포수가 104 ~ 106 cell/㎖가 되었을 때 100 μM의 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 유도하였다. 산화적 손상 정도를 DCF-DA(2',7'-dichlorofluorescin diacetate)(Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA) 분석법을 이용하여 형광분광광도계(spectrofluorometer)를 통해서 측정함으로써 실시예 1 내지 19의 혼합물 및 준비예 1 내지 16의 천연물 또는 천연물 유래 물질의 산화적 스트레스로 인한 독성에 대한 뇌 신경 세포 보호활성을 확인하였다.
구체적으로, PC12 cell을 이용하여 세포 수가 105 cells/㎖일 때 96 well에 100 ㎕씩 분주(seeding)한 후 하루밤 경과(overnight) 후에 실시예 1 내지 19의 혼합물 및 준비예 1 내지 15의 천연물 또는 천연물 유래 물질을 증류수(distilled water; DW)로 녹여 1 ㎎/㎖로 20 ㎕씩 전처리하였다. 전처리 이틀(48시간) 후 세포에 상해를 줄 수 있는 과산화수소(H2O2)(최종 농도: 100 μM)를 처리하고 2시간 후 DCF-DA용액을 제조하여 세포에 처리한 후 어두운 조건 하에 인큐베이터(incubator)에서 50분 배양하고 spectrofluorometer(파장: excitation 485 ㎚, emission 535 ㎚)를 이용하여 측정한다. 과산화수소(H2O2)의 독성을 견뎌낸 세포가 있다면 DCF-DA는 세포 내부의 슈퍼옥사이드(superoxide)와 반응하여 아세트초산염(diacetate; DA)이 떨어져 나가면서 형광을 나타내게 된다. 이를 이용한 DCF-DA assay로 이 형광의 정도로 세포 독성(cell cytotoxicity)을 측정하였다. 측정 결과는 도 1 내지 2 및 표 2에 나타냈다.
또한, 세포 생존율(Cell viability)은 MTT Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA) reduction assay를 통해 측정하였다. PC12 cell을 이용하여 세포 수가 105 cell/㎖일 때 96 well에 실시예 1 내지 19의 혼합물 또는 준비예 1 내지 16의 천연물 또는 천연물 유래 물질을 증류수(distilled water; DW)로 녹여 1 ㎎/㎖로 100 ㎕씩 분주(seeding)한 후 하루밤 경과(overnight) 후에 추출물을 증류수로 녹여 1 ㎎/㎖로 30 ㎕씩 전처리하였다. 이틀(48시간) 후 세포에 상해를 줄 수 있는 과산화수소(H2O2)를 처리하고 2시간 후 MTT 용액을 2.5 ㎎/㎖로 제조하여 세포에 처리해주어 어두운 조건하에 인큐베이터(incubator)에서 3시간 배양하였다. 그 후에 디메틸설폭사이드(DMSO; Dimethyl sulfoxide)를 처리한 후 microplate reader(파장: measurement 570 ㎚, reference 630 ㎚)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 살아있는 세포들은 호흡을 통하여 환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(Nicotinamide adenine dinucleotide H; NADH)를 생성하게 되고 이 NADH는 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)와 반응하여 보라색의 포르마잔 결정(formazan crystal)을 형성한다. MTT reduction assay를 통하여 이 보라색의 formazan crystal의 흡광도를 측정하였다. 측정한 세포 생존율은 도 3 내지 4 및 표 2에 나타냈다.
DCF 형성(%) 세포 생존율(%)
무처리구 100 100
H2O2 처리구 245 28
실시예 1 215 35
실시예 2 202 36
실시예 3 198 38
실시예 4 195 39
실시예 5 160 44
실시예 6 165 47
실시예 7 155 48
실시예 8 240 50
실시예 9 146 53
실시예 10 140 58
실시예 11 146 59
실시예 12 135 60
실시예 13 130 60
실시예 14 130 61
실시예 15 115 71
실시예 16 110 72
실시예 17 112 74
실시예 18 136 66
실시예 19 138 69
준비예 1 230 30
준비예 2 222 33
준비예 3 225 30
준비예 4(부탄올) 215 36
준비예 5 220 37
준비예 6 223 32
준비예 7 235 34
준비예 8 228 35
준비예 9 238 29
준비예 10 227 31
준비예 11 229 33
준비예 12 219 34
준비예 13 226 32
준비예 14 224 31
준비예 15 224 30
준비예 16 221 34
도 1 내지 4 및 표 1에서 확인되는 바와 같이, 실시예 1 내지 19의 혼합물이 준비예 1 내지 16의 천연물 또는 천연물 유래 물질보다 뇌신경세포 보호 활성이 높은 것을 알 수 있었다.
특히, 실시예 15 내지 17과 같이 율무 100 중량부에 대하여, 두충 120 ~ 200 중량부, 솔잎 150 ~ 180 중량부, 차가버섯 50 ~ 120 중량부 및 인진호 50 ~ 80 중량부를 포함하는 혼합물이 산화적 스트레스에 의한 뇌신경 독성으로부터 뇌신경세포 보호 활성이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2. 아세틸콜린에스테라제 ( acetylcholinesterase , AChE ) 저해 활성
아세틸콜린에스테라제 저해 활성 측정은 아세틸콜린 아이오다이드(acetylcholine iodide)를 기질을 사용하여 측정하였다.
구체적으로, 효소는 PC12 세포배양액 1 ㎖에 균질화를 위한 버퍼(1 M NaCl, 50 mM MgCl2, 1% Triton X-100 혼합액에 10 mM Tris-HCl로 pH 7.2로 조정) 5 ㎖를 첨가하여 글라스-콜 호모게나이져(Glass-Col homogenizer)로 균질화하였다. 균질화한 세포배양액을 10,000 rpm에서 30분 동안 원심 분리하였으며, 그 상징액을 효소실험을 위하여 사용하였다. 모든 추출공정은 4℃에서 수행하였으며, 추출한 효소액의 단백질 함량을 측정하기 위하여 BCA kit(bicin-choninic acid; Sigma Co., St. Louis, Mo, USA)를 이용하였고, 소혈청 알부민(vine serum albumin)으로 작성한 검량곡선에 준하여 함량을 환산하였다. 정제효소(단백질 함량: 2.38 ㎎/㎖) 10 ㎕에 실시예 1 내지 19의 혼합물 및 준비예 1 내지 15의 천연물 또는 천연물 유래 물질을 증류수(distilled water; DW)로 녹여 1 ㎎/㎖로 30 ㎕를 넣어 37℃에서 15분간 반응시켰으며, 반응 혼합물에 50 mM 소디움 포스페이트 버퍼(sodium phosphate buffer ; pH 8.0)에 용해시킨 Ellman's reaction mixture[0.5 mM acetylthiocholine, 1 mM 5,5'dithio-bis(2-nitro benzoic acid)] 70 ㎕를 첨가한 후 405 ㎚에서 10분 동안 2분 간격으로 흡광도를 측정하였다. 측정 결과는 도 5 내지 6 및 표 3에 나타냈다.
아세틸콜린에스터라제의 저해활성(%)
무처리구 0
실시예 1 68
실시예 2 65
실시예 3 61
실시예 4 67
실시예 5 70
실시예 6 76
실시예 7 81
실시예 8 85
실시예 9 77
실시예 10 78
실시예 11 79
실시예 12 85
실시예 13 87
실시예 14 88
실시예 15 96
실시예 16 97
실시예 17 98
실시예 18 91
실시예 19 92
준비예 1 41
준비예 2 44
준비예 3 42
준비예 4(부탄올) 50
준비예 5 51
준비예 6 46
준비예 7 45
준비예 8 50
준비예 9 41
준비예 10 40
준비예 11 44
준비예 12 47
준비예 13 44
준비예 14 46
준비예 15 43
준비예 16 47
도 5 내지 6 및 표 2에서 확인되는 바와 같이, 실시예 1 내지 19의 혼합물이 준비예 1 내지 16의 천연물 또는 천연물 유래 물질보다 아세틸콜린에스터라제의 저해 활성이 높은 것을 알 수 있었다. 또한, 실시예 1 내지 8의 혼합물보다 실시예 9 내지 15의 혼합물이 아세틸콜린에스터라제의 저해 활성이 현저히 높았으며, 특히, 실시예 15 내지 17과 같이 율무 100 중량부에 대하여, 두충 120 ~ 200 중량부, 솔잎 150 ~ 180 중량부, 차가버섯 50 ~ 120 중량부 및 인진호 50 ~ 80 중량부를 포함하는 혼합물에서 가장 높은 아세틸콜린에스터라제의 저해 활성을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
준비예, 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 천연물 또는 천연물 유래 추출물을 포함하는 혼합물은 독성이 없으며 높은 뇌신경보호 활성을 가져 뇌질환 예방 또는 개선용으로 적합한 건강기능성 식품을 제공하는 것을 알 수 있었다.
이하, 본 발명의 바람직한 일구현예에 따른 조성물을 함유하는 건강기능성 식품의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
< 제조예 >
뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 70중량%, 인삼 추출물 5중량%, 헛개나무 열매 추출물 5중량%, 포도당 1중량%, 꿀 1중량%, 솔비톨(sorbitol) 1중량%, 자일리톨(xylitol) 1중량%, 만니톨(mannitol) 1중량%, 람니톨(rhamnitol) 1중량%, 이노시톨(Inositol) 1중량%, 에리스리톨(Erythritol) 1중량%, 파라티노스 1중량%, 쿠에르시톨(quercitol) 1중량% 및 잔량을 정제수로 첨가하여 기능성 음료를 제조하였다.

Claims (2)

  1. 율무 메탄올 추출물의 헥산 분획물, 두충 추출물, 솔잎 수추출물, 차가버섯 메탄올 추출물 및 인진호 추출물을 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 뇌신경계 질환의 예방용 건강기능성 식품으로서;
    상기 두충 추출물은 두충 잎의 수추출물 또는 에탄올 추출물 중 어느 하나이고, 상기 인진호 추출물은 인진호 수추출물 또는 인진호 메탄올 추출물 중 어느 하나이며;
    상기 율무 메탄올 추출물의 헥산 분획물 100 중량부에 대하여, 상기 두충 추출물은 120 ~ 200 중량부로 포함하고, 상기 솔잎 수추출물은 180 중량부로 포함하며, 상기 차가버섯 메탄올 추출물은 30 ~ 50 중량부로 포함하고, 상기 인진호 추출물은 30 ~ 80 중량부로 포함하는;
    퇴행성 뇌신경계 질환의 예방용 건강기능성 식품.
  2. 제1항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌신경계 질환은 알츠하이머, 노인성 치매, 전두측두성 치매, 혈관성 치매, 헌팅턴 무도병 및 파킨슨병으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌신경계 질환의 예방용 건강기능성 식품.
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