NO159884B - Monoklonalt antistoff. - Google Patents

Abstract

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en hybridcellelinje for fremstilling av monoclonalt antistoff til et antigen som finnes på normale humane cytotoksiske og suppressor-T-celler. Hybriden fremstilles ved å smelte splenocytter fra immuniserte CAF- mus med P3X63AgUl-myelomceller.Oppfinnelsen tilveiebringer også diagnostiske og terapeutiske anvender av nevnte monoclonale antistoff.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår monoklonalt antistoff til et antigen som finnes på normale humane cytotoksiske og suppressor T-celler.

Sammensmeltingen eller fusjonen mellom muse-myelomceller'og miltceller fra immunisert mus av Kohler og Milstein i 1975 (Nature 256, 495-497 (1975)) viste for

første gang at det var mulig å oppnå en kontinuerlig cellelinje for fremstilling av homogent (såkalt "monoklonalt") antistoff. Etter dette banebrytende verk har det vært gjort store anstrengelser for å frembringe forskjellige hybrid-celler (betegnet "hybridomer") og å bruke det antistoff som fremstilles av slike hybridomer for forskjellige vitenskape-lige undersøkelser. Se f.eks. Current Topics in Microbiology and Immunology, bind 81, "Lymphocyte Hybridomas", F. Melchers, M. Potter og N. Warner, redaktører, Springer-Verlag, 1978, og der angitte referanser; C. J. Barnstable et al., Cell.

14, 9-20, mai 1978; P. Parham og W. F. Bodmer, Nature 276, 397-399, november 1978; Handbook of Experimental Immunology, tredje utgave, bind 2, D. M. Wier, redaktører, Blackwell,

1978, kapittel 25; og Chemical and Engineering News,

1. januar 1979, 15-17. Disse referanser belyser meget klart at man kan oppnå store fordeler, men også at det er meget komplisert å fremstille monoklonalt antistoff fra hybridomer. Skjønt den generelle teknikk er godt forstått som sådan,

så møter man i praksis mange vanskeligheter og variasjoner i hvert enkelt tilfelle. Man har i virkeligheten ingen garanti for at når man prøver å fremstille en gitt hybridom,

at denne når den blir fremstilt, vil fremstille antistoff eller at det fremstilte antistoff vil ha den ønskede effekt. Graden av suksess påvirkes primært av den type antigen som brukes, samt den seleksjonsteknikk som brukes for å isolere det ønskede hybridom.

Det har i den senere tid bare vært få referanser

til forsøk på å fremstille monoklonalt antistoff til humane lymfocyttcelle-overflategener. Se f.eks. Current Topics

til forsøk på å fremstille monoclonalt antistoff til :..mane lymfocyttcelle-overflateantigener. Se f.eks. Current topics in Microbiology and Immunology, ibid, 66 - 69 og 164 - 169. De antigener som ble brukt i nevnte eksperimenter var kulti-verte humanlymfoblastoid-leukenucelier og cellelinjer fra pasienter med kronisk lymfocytisk leukemi. Mange av de oppnådde hybridomer synes å gi antistoff til forskjellige antigener på alle de humane cellene. Inger, av de angitte hybri-dorr.er ga antistoff mot en forutbestemt gruppe av humane lymfocytter.

Det bor understrekes at det er to prinsipielle typer av lymfocytter som. inngår i immunsystemet hos mennesker og dyr. Den første gruppen (de thymusavledede celler eller T-cellene) blir differensiert i thymus fra næmopoetiske stamceller. Disse differensierende celler blir betegnet "thymocytter" så lenge de befinner seg inne i thymusk;ertel-en. De modne T-cellene kommer ut fra thymuskjer telen og sirkulerer mellom vev, lymfekjertiene og blodstrømmen.

Disse T-cellene utgjør en større del av de resirkulerende

små lymfocyttene. De har immunologisk spesifitet og Inngår direkte i en cellestyrt immunreaksjon (såsom forkastelse av innpodede organer etc.) som effektorceller. Skjønt nevnte T-celler ikke utskiller huraoralt antistoff, så er de i visse tilfeller nødvendige for at man skal få en utskillelse av visse antistoffer fra en annen gruppe av lymfocytter slik det vil bli beskrevet nedenfor. Andre typer av T-ceJler spil-ler en regulerende rolle når det gjelder andre sider av immunsys ternet.

Selve .v.e kan ismen bak dette cellesamar beidet er

ikke fullt ut forstått.

Den annen gruppe av lymfocytter (benmargavledede celler eller B-celicr) er de som utskiller antistoff. De utvikles også fra næmopoetiske stamceller, men deres differ-ensiering er ikke bestemt av thymuskjer telen. Hos fugler blir de differensiert i et organ som: er analogt til thymuskjer telen og som kalles Fabriciusbursa. Hos pattedyr har man imidlertid ikke oppdaget noe ekvivalent organ, og det er antatt au disse B-celiene differensieres ir.ne i benma: > on.

Det er nå velkjent at T-cellene kan oppdeles i minst et par under typer, og disse betegnes ofte som "hjelpe-", "suppressor-" og "drepe-"T-celler, og som har en funksjon henholdsvis for å fremme en reaksjon, undertrykke en reaksjon eller å drepe fremmede celler. Disse undergrupper er vel forstått hos mus, men er bare nylig beskrevet for mennesker. Se f.eks. R.L. Evans et al., Journal of Experimental Medicine, bind 145, 221 - 232, 1977 og L. Chess og S.F. Schlossinan - "Functional Analysis of Distinct Human T-Celi Subsets Bearing Unique Differentiation Antigens" i "Contemporary Topics in Immunobiology", 0. Stutman, redak-tør, Plenum Press, 1977, bind 7, 363 - 379.

Evne og mulighet til å identifisere eller å undertrykke typer eller undertyper av T-celler er meget vesentlig for diagnosen eller behandlingen av forskjellige immunoregulerende lidelser eller tilstander.

Således har visse typer leukemi og iymfoma forskjellige prognoser avhengig av hvorvidt de er av B-celle-eller T-celleopprinnelse.. Således vil en bedømmelse av selve lidelsens prognose være avhengig av at man kan skille mellom disse to typer av lymfocytter. Se f.eks. A.C. Aisen-berg og J.C. Long, The American Journal of Medicine, 55:300 (mars 1975); D. Belpomme et al. i "Immunological Diagnosis

of Leukemias and Lymphcraas", S. Thierfelder et al., redak-tører, Springer, Heidelberg, 1977, 33 - 45 og D. Belpomme et al, Britisk Journal of Haematclogy, 1973, 38, 85.

Visse lidelsestilstander (f.eks. ungaommelig revma-tisk artritis, ondartede revmatiske lidelser og agammaglobu-linomi) er forbundet med en ubalanse mellom de forskjellige T-celletypene. Det har vært foreslått at autoimmunologiske lidelser generelt er forbundet med et overskudd av hjelpe-T-celi.er eller et underskudd av visse suppressor-T-celler, mens agammaglobulinemi er forbundet med et overskudd av visse suppressor-T-celler eller et underskudd på hjelp-T-celler. Ondartede revmatiske lidelser er generelt forbundet med et overskudd av suppressor-T-celler.

I visse typer leukemi vil et overskudd av T-oeller bli fremstilt mens det er stillstand i utviklingen. Diagnosen kan således være avhengig av en evne til å påvise denne ubalanse eller et eventuelt overskudd. Se f.eks. J. Kersey et al, "Surface Markers Define Human Lymphoid Malignancies with Differ ing Prognoses" i Haematology and Blood Transfusio, bind 20, Springer-Verlag, 1977, 17 - 24 og der angitte referanser .

Medfødt agammaglobulinemi, en sykdomstilstand

hvor det ikke blir fremstilt noe immunglobulin, består i det minste av to distinkte typer. I type I vil mangelen på er. produksjon av .immunglobulin skyldes et overskudd av suppressor-T-celler, mens type II skyldes en mangel på hjelpe-T-celler. I begge typer synes det å ikke være noen defekt eller mangel på pasientens B-celler, dvs. de lymfocytter som er ansvarlige for en utskillelse av antistoff, men disse B-celler ble enten undertrykt eller "ikke hjulpet", noe som resulterer i en sterke nedsatt eller en fraværende immun-globulinproduksjon. Denne type av medfødt agammaglobulinemi <1> kan således bestemmes ved å prøve å undersøke om det er et overskudd av suppressor-T-celler eller et fravær av hjelpe-T-celler.

Identifikasjon og undertrykkelse av human-T-celle-typer og undertyper har tidligere vært oppnådd ved å bruke spontane autoantistoffcr eller selektive antisera for humane T-celler som oppnås ved å immunisere dyr med humane T-celler, deretter tappe disse dyrene fer å fa oppnådd serum og adsor-bere antiserumet med (f.eks.) autologe, ir.«_-n ikke alloceniske B-celler for å fjerne antistoffer med uønsket reaktivitet. Fremstillingen av disse antisera er ekstremt vanskelig.- spesielt under adsorbsjons- og rensningstrinner.e. Selv adsorber-te og rensede antisera inneholder ofte urenheter i tillegg til det forønskede antistoff av flere årsaker. For det første vil serumet inneholde millioner av antistoffmolekyl-er selv før T-celie-im.muniseringen. Videre vil immur.iser-ingen frembringe en produksjon av antistoffer mot en rekke antigener som finnes hos alle de injiserte humane T-cellene-Det er ingen selektiv produksjon av antistoff mot ett enkelt antigen. Videre vil styrken på det spesifikke antistoffot som fremstilles ved slike fremgangsmåter være relativt lav (f.eks. inaktiv ved fortynninger på mar enn 1:100), og forholdet mellom sposifikK til ikke-spesiofikt antistoff er mindre enn 1/10^.

Se f.ens. ovennevnte refererte artikkel av Chess

og Schlossman (sidene 255 og etterfølgende) og den artikkel som er referert fra Chemical and Engineering News ovenfor, hvor ulempene ved tidligere kjente antisera samt fordelene ved såkalt monoclonalt antistoff er besKrevet.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebragt et monoklonalt antistoff av IgG-klassen (underklasse IgG^) som diagnostisk middel, kjennetegnet ved at det reagerer med mer enn 90% av cytotoksiske og suppressor-TH2<+->T-celler, men ikke med normale humane perifere B-celler, null-celler eller makrofager.

Fremstilling av nevnte monoklonale antistoff kan hensiktsmessig foretas ved at man

i) immuniserer mus med humane thymocytter;

ii) fjerner miltene fra nevnte mus og danner en

suspensjon av miltceller;

iii) sammensmelter nevnte miltceller med musemyelom-celler i nærvær av en sammensmeltingspromotor;

iv) fortynner og dyrker de sammensmeltede cellene

i separate brønner i et selektivt medium;

v) bedømmer supernatanten i hver brønn inneholdende en hybridom for nærvær av antistoff til E-rosett-positive rensede T-celler;

vi) selekterer og kloner en hybridom som gir antistoff som reagerer med mer enn 90% cytotoksiske og suppressor TH2<+> humane T-celler, men ikke med normale humane perifere B-celler, null-celler eller makrofager;

Videre er det en hensikt å tilveiebringe fremgangsmåter for diagnose av lidelser hvor man anvender disse antistoffer.

Andre hensikter og fordeler ved oppfinnelsen vil fremgå av den etterfølgende beskrivelse.

De forannevnte fordeler og hensikter tilveiebringes ved hjelp av foreliggende oppfinnelse ved at man anvender en ny hybridom som gir et nytt antistoff til et antigen som finnes på normale humane cytotosiske og suppressor-TH2<r->T-celler, selve antistoffet samt diagnostiske fremgangsmåter hvor man anvender antistoffet. Hybrido.net fremstilles generelt ved å bruke den fremgangsmåte sem er beskrevet av Milstein og Kohler. Etter immuniser ing av mus med normale humane thymocytter blir miltceliene hos de immuniserte mus smeltet sammen med celler fra en muse-myelom-linje, og de resulterende hybridomer blir undersøkt for å finne de hvor den overliggende væske inneholder et antistoff som gir en selektiv binding til normale E-rosettposi-tive humane T-celler. De forønskede hybridomer blir deretter clonet og karakterisert. Som et resultat av dette oppnådde man en hybridom som ga et antistoff (betegnet 0KT5) mot et antigen som finnes på normale humane cytotoksiske og suppressor-TH9<+->T-ceiler. Ikke bare reagerer dette antistoff med normale humane perifere cytotoksiske og suppressor-TH2 4.-T-celler, men det reagerer ikke med andre normale perifere blodlymfeceller, inklusive hjelpe-T-celler. Det celleoverflate-antigen som reagerer med dette antistoff ble videre påvist i ca. BO' l av de normale humane thymocytter.

Sett på bakgrunn av de vanskeligheter man tidig-ere har hatt ved br.ik av ondartede cellelinjer som anti-genet, så var det overraskende at foreliggende fremgangsmåte skulle gi det forønskede hybridom. Det skal understrekes at de uforutsigbare resultater ved en hybridcellefrem-stilling ikke muliggjør å ekstrapolere fra ett antigen eller cellesystem til et annet. Man har oppdaget at ved bruke en T-celle-ondaret cellelinje som antigen ga en fremstilling av hybridomer som ikke ga det forønskede antistoff.

Fremstillingen og karakteriseringen av nevnte hybridom og det resulterende.antistoff vil fremgå av den etterfølgende beskrivelse samt eksemplene.

Fremgangsmåten for fremstilling av nevnte

hybridom innbefatter generelt de følgende trinn:

A. Immunisering av mus med normale humane thymocytter. Skjønt man har funnet at CAF^ hunnmus er foretrukket, så kan man også bruke andre musestammer. Selve immuniserin-gen og thymocyttkonsentrasjonen må være slik at man får fremstilt brukbare mengder av egnede splenocytter. Dette kan effektivt gjøres ved at man utfører 2 immuniseringer med 14 dagers mellomrom og bruker 2 x 10 7 celler/mus/injeksjon i 0,2 ml fosfatbufret saltoppløsning.

B. Fjerning av milten fra de immuniserte mus og fremstilling av en miltsuspensjon i et passende medium. Ca. 1 ml medium pr. milt er tilstrekkelig. Denne eksperiment-teknikk er velkjent.

C. Sammensmelting av de suspenderte miltceliene med muse-myelomceller fra en egnet cellelinje ved å bruke en egnet forbindelse for å fremme en slik sammensmelting. Det foretrukne forholdet er ca. 5 miltceller pr. myelomcelle. Det er passende å bruke et totalt volum på 0,5-1,0 ml av sammensmeltingsmediet for ca. 10 g splenocytter. Mange muse-myelomcellelinjer er kjente og tilgjengelige, vanligvis fra forskjellige akademiske forskningsinstitusjoner eller lignende, såsom the Salk Institute Cell Distribution Center, La Jolla, California. Den cellelinje som brukes, bør fortrinnsvis være av den såkalte "legemiddelresistent"-typen, slik at usammensmeltede myelomceller ikke vil overleve i et selektivt medium, mens hybridene vil overleve i samme medium. Den mest brukte typen er 8-azaguanidin-resistente cellelinjer, som mangler enzymet hypoxantin-guanin-fosforibosyl-transferase og vil følgelig ikke kunne understøttes av et HAT (hypoxantin, aminopterin og thymidin)-medium. Det er også generelt

foretrukket at myelomcellelinjen er av den såkalte "ikke-utskillende" typen, dvs. at den i seg selv ikke fremstiller

noe antistoff, skjønt utskillende typer også kan brukes.

I visse tilfeller er det imidlertid foretrukket å bruke såkalte utskillende myelomlinjer. Skjønt den foretrukne forbindelse for å fremme en sammensmeltning er pclyetylen-glykol med en midlere molekylvekt fra ca. 1.000 - ca. 4.000 (kommersielt tilgjengelig som "?3G 1000", etc), så kan man også bruke andre velkjente forbindelser. D. Fortynning og kultivering i separate behol-dere av blandingen av usammensmeltede miltceller, usammensmeltede myelomceller og sammensmeltede celler i et selektivt medium som ikke vil understøtte de usammensmeltede myelomceller i et tilstrekkelig langt tidsrom til at de usammesmeltede cellene dør (ca. 1 uke). Fortynningen kan være av den såkalt begrensende type, hvor f or tynnir.gsvolum-et er statistisk beregnet til.at man får isolert et visst antall celler (f.eks. 1 - 4) i hver enkelt beholder (f.eks.

i en brøn.i i en mikrctiterplate) . Mediet er et ett (f.eks. et HAT-rr.edium) som ikke vil understøtte de drug-resistente

(f.eks. S-azaguanin-resistente) usammensmeltede myolo...celle-linjcne. Disse myelomceller vil derfor gå tilgrunne. ettersom de usammensmeltede miltceliene er ikke-ondc.rcedo, så vil de bare overleve i et visst antall generasjoner. Disse usammensmeltede miltceliene vil således ikke lenger reprodusere seg etter et visst tidsrom (vanligvis ca. 1 uke).

De sammensmeltede cellene vil på den annen side fortsette

å reprodusere seg fordi do har den ondartede egenskapen man hadde i niyelomforeicrecc. ilene foruten at de har evne tii å overleve i det selektive mediet fra miltcelleroreldrccellene.

E. Bedømmelse av den overliggende væske i hver beholder eller bronn som inneholder en hybridom. for å under-søke om det er tilstede et antistoff til E-rosette-positive rensede humane T-celler.

F. Seleksjon (f.eks. ved begrensende fortynning) og c ion ing av hybridomer for fremstilling av det f orør.sr.ede antistoff.

Så snart det forønskede hybridom er utvalgt og clo.net, så kan det resulterende antistoff fremstilles på

én av to måter. Det reneste monocloniske antistoff blir fremstilt ved at man kultiverer' in vitro den forønskede hybridom i et egnet medium i et egnet tidsrom hvoretter man inn-vinner det forønskede antistoff fra den overliggende væske. Egnet medium og egnet kultiveringslengde er kjent eller kan lett bestemmes. Denne in vitro-teknikk gir et i alt vesentlig monospesifikt monoclonalt antistoff, i alt vesentlig fritt for' andre spesifikke antihumane immunglobuliner.

Det vil være en mindre mengde andre immunglobuliner tilstede ettersom mediet inneholder xenogenisk serum (f.eks. kalve-serum fra foster). Denne in vitro-fremgangsmåte gir imidlertid ikke tilstrekkelig mengde eller konsentrasjon av antistoff for visse formal, ettersom konsentrasjonen av m:ono-clonalt antistoff bare er 50 ug/ml.

For å fremstille langt større konsentrasjoner av noe mindre rent monoclonalt antistoff kan den forønskede hybridom injiseres i raus, fortrinnsvis syngenisk eller semi-syngtnisk mus. I nevnte mus vil nevnte hybridom frembringe en dannelse av antistoff-produserende svulster etter en egnet inkubasjonstid, og dette vil resultere i en høy konsentrasjon av dot foronskodc antistoff (fra 5-20 mg/ml) i blod-strcmmer. og i det peritoneale exudat (ascites) hos nevnte nus. Skjønt disse vertsmus også har normale antistoffer i sitt blod dg i nevnte ascites, så vil konsentrasjonen av disse normale antistoffer bare være 51 av konsentrasjonen av d e t : ug n o c1 o r. a 1 o antistoff.

Ettersom disco normale antistoffer videre ikke

er antihumane i sin spesifitet, så vil det monoclonale antistoff sen oppnås fra de' innhøstede ascites eller fra nevnte serum være i ai c vesentlig fritt for forurenser.de antihumant immunglobulin. Dette monoclonale antistoffet har høy aktivitet (aktivt ved en fortynning på 1:50.000 eller høyere) og høyt fornold mellom spesifikk til ikke-spssifikk immunglobu-

globulin (ca. 1/20). De immunglobuliner sor:..:ran;sti_i*_s og son innbefatter såkalte k lette myelomkjeder, er ikke-spesifikke, "non-sense" peptider som bare fortynner det monoclonale antistoff uten at det svekker dets spesifitet. ;Eksempel I ;Fremstilling av monoclonale antistoffer ;A. Immunisering og somatisk cellehybridisering ;Hunnlige CAF,-mus (Jackson Laboratories, 6-8 uker gamle) ble immunisert intraperitonealt med 2 x IO<7 >humane thymocytter i 0,2 ml fosfatbufret saltopplosning med 2 ukers mellomrom. 4 døgn etter tredje immunisering ble miltene tatt ut av nevnte mus, og det ble fremstilt en enkelt cellesuspensjon ved å presse vevet gjennom et nett av rustfritt stål. ;Cellesammensmeltingen ble utført ved hjelp av ;den fremgangsmåte som er utviklet av Kohler og Milstein. ;1 x 10 8 splenocytter ble smeltet i 0,5. ml av et sammensmel-tningsmedium bestående av 35% polyetylengiykol ("PEG 1C00") og 5%.dimetylsulfoksyd i "RPMI 1640"-mediam (Gibco, Grand Islands, Nev; York) med 2 x IO<7> "P3X63Ag8Ul" myelomceller som var levert av dr. M. Scharff, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, Nev/ York. Disse myelomceller utskiller IgG-, k lette kjeder. ;B. Seleksjon og vekst av hybridom ;Etter cellesammensmeltningen ble cellene dyrket iet et HAT-medium (i.ypoxantin, aminopterin og thymidin) ved 37°C med 5% C02 i en fuktig atmosfære. Flere uker senere ble 40 - 100 iil av den overliggende væske fra kulturer inneholdende hybridomer tilsatt en sammensentrifugert masse av 10^ perifere lymfocytter som var separert i E-rosett-positive (E<+>) og E-rosett-negative (E ) populasjoner, og som var fremstilt fra blod hos friske mennesker slik dette er beskrevet av Mendes (J. Immunol. 111:860, 1973). En påvisning av muse-hybridom-antistoffer som binder seg tii disse cellene ble bestemt ved indirekte immunofiucrescens. Celler inkubert med kulturvæskene ble farget med et fluorescerende gjeite-anti-mus IgG ("G/M FITC") (Meloy Laboratories, Springfield, VA, F/p = 2,5), og fluorescerende antistoff-belagte celler ble deretter analysert på en "Cytofluorograf FC200/4800A" (Ortho Instruments, Westwood, Maryland) som beskrevet i eksempel III. Hybridomkulturer inneholdende antistoffer som reagerte spesifikt med E 4--lymfocytter (T-celler) ble utvalgt og clonet to ganger med en såkalt begrensende fortynningsmetode i nærvær av tilforseisceller. Deretter ble clonene overført intraperitonealt ved injeksjon av 1 x 10 7 celler av et gitt clon (.0,2 ml volum) i CAF^-mus som på forhånd var behandlet med 2,5,10,14-tetrametylenpentadekan som selges av Aldrich Chemical Company under navnet "Pristine". De ondartede ascites fra nisse mus ble så brukt for å karakterisere lymfocytter slik det er beskrevet i eksempel II nedenfor. Man kunne ved hjelp av standardteknikker vise at foreliggende hybrid-antistoff 0KT5 var av IgG^-undergruppen. ;Eksempel II ;Karakter is er ing av 0KT5- reaktivitet ;A. Isolas jon av lymfocyttpopulasjoner ;Humane perifere blodmononukleære celler ble isolert fra friske frivillige paseinter (alder 15 - 40) ved en Ficoll-Hypaque tetthetsgradientssentrifugering (Pharmacia Fine Chemicals. Piscataway,NJ) ved å bruke den teknikk som ;er beskrevet av Boyum, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21 (supplement 97): 77, 1968. Ufraksjonerte mononukleære celler ble skilt i overflate lg' (3) og lg (T pluss null) populasjoner ved hjelp av "Sephadex G-200" anti-F(ab<1>)? kolonnekromatografi slik det tidligere er beskrevet av Chess et al., J. Immunol. 113:1113 (1974). T-cellene ble ;så innvunnet ved såkalt E-rosetting av lg -populasjonen med 5". saue-ery trocyttor (Microbiological Associates, Bethescla , Maryland). Det rosettdannede laget ble overlagt med Ficoll-Hypaque og så innvunnet som et E+-sentr if uger x. stykke behandlet med 0,155M NH.Ci (10 ml pr. IO<8> celler). Den således fremstilte T-celle-populasjonen var mer enn 2% EAC-rosett-positiv og mindre enn 95% E-rosett-positiv slik det kunne bestemmes ved standardmetoder. I tillegg til dette ;ble den ikke-rosettdannende lg (nullcalle) populasjonen inn-høstet fra Ficoll-interflaten. Denne sistnevnte populasjonen ;+ + + ,■ ;var større enn 5% E og -2% sig . Overflaten lg MB) populasjonen ble oppnådd fra "Sephadex G-200"-kolonnen etter eluering med normalt humant gammaglobulin sem tidligere beskrevet. Denne overflaten var mer enn 95% overflate Ig<+> og mindre enn 51 E+. ;Normale humane makrofager ble oppnådd fra den mononukleære populasjonen ved tilfestning til polystyren. De mononukleære celler ble således resuspendert i det endelige kulturmediet (RPMI 1640 , 2,5 mnol HEPES [4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazin-propansulfonsyre]-buffer, 0,5% natriumbikarbonat, 200 mmol L-glutamin og 1% penicillin-streptomycin, supple-mentert med 205 varme-inaktivert humant A3-serum) i en konsentrasjon på 2 x 10 celler og inkubert i petriskåler av plast (100 x 20 mm) ("Falcon Tissue Culture Dish", Falcon, Oxnard, California) ved 37°C over natten. Etter vedvarende vasking for å fjerne ikke-tilfestede celler, ble den tilfestede populasjonen fjernet ved kraftig vasking med kaldt serumfritt medium inneholdende 2,5 mmol EDTA og eventuell skraping rr.ed gummispissen av stempelet på en éngangssprøy te. ;Her enn 85% av cellepopulasjonen var istand til å nedbryte latekspartikler og hadde morfologiske egenskaper som til-svarer de man finner hos monocytter ved Wright-Giemsa-farg- ;ing . ;B. Isolasjon av thymocytter ;Normale humane thymuskjer tier ble oppnådd fra pasienter med en alder på 2 måneder til 14 år og som ble under-kastet korrigerende karkirurgi. Nylig oppnådde porsjoner av thymuskjertelen ble snart plassert i 51 kalvefosterserum i medium 199 (Gibco), finfordelt ved hjelp av pinsetter og sakser, og deretter opparbeidet til en enkel cellesuspensjon ved å presses gjennom et fint nett. Cellene ble så overlagt Ficoll-Hypaque og deretter sentrifugert og vasket som be- •.->■ skrevet ovenfor. De oppnådde thymocytter var mer enn 95% levende og mer enn 90% av dem var E-rosett-positive. ;C. Cellelinje ;En Epstein-Barr-virus (EBV) omdannet B-celleiinje fra et normalt individ (Laz 156) var tilveiebragt av dr. ;H. Lazarus, Signey Farber Institute, Boston, MA. ;Eksempel III ;Cytofluorografisk analyse og ceileseparasjon ;Det ble utført cytofluorografisk analyse av monocloniske antistoffer med alle cellepopulasjoner ved en indirekte immunofluorescens med fluorescens-konjugert gjeit-anti-mus IgG ("G/M FITC") (Meloy Laboratories) idet man brukte en "Cytofluorograf FC200/4800A" (Ortho Instruments). Kort forklart ble 1 x IO<6> celler behandlet med 0,15 ml 0KT5 ;i en 1:500-fortynning, inkubert ved 4°C i 30 minutter og så vasket 2 ganger. Cellene ble så reagert med 0,15 ml av en 1:40-fortynning "G/M FITC" ved 4°C i 3C minutter, så sentrifugert og vasket 3 ganger/ Cellene ble så analysert på "Cytofluorograf"en og intensiteten på fluorescensen pr. ;celle ble målt ved hjelp av en analysator for måling av puls-høyden. Et lignende reaktivitetsmønster kunne sees ved en fortynning på 1:10.000, men ytterligere fortynning ga et tap av reaktiviteten. Bakgrunnsfarging ble oppnådd ved å bruke en 0,15 ml porsjon 1:500 ascites fra en CAF^-rr.us som var intraperitonealt injisert med en ikke-produserende hybrid-clon. Reaktiviteten pa lymfoidpopulasjonene med hest-anti-Th'2 og normal hekst-IgG ble bestemt som tidligere beskrevet ;i ovennevnte referanse av Reinherz et ai. ;I de eksperimenter som er utformet for å separere T-celle-undergruppene, ble 100 x 10^ ufraksjonerte T-celler merket med 4 ml av on 1:500-for tynning av OKT4 eller 0KT5 og så utviklet med "G/M FITC". På forhånd var det vist at 0KT4 var reaktivt spesielt med fra 55 - 60% av de perifere blod-T-lymfocyttene som representerer humane hjelpe-uncergrupper. ;Ved å bruke en fluorescensaktivert cellesorterer ("FACS-I") ;(Becton, Dickinson, Mountain View, California), ble T-cellene skilt i OKT4 - og 0KT4 -undergrupper såvel som OKT5 - og OKT5 - undergrupper fra samme individ. Leveprosenten etter dette var mer enn 95' h slik dette kunne påvises ved "Trypan"-blå- ;utelukkelse. Renheten på alle de utskilte populasjonene var mer enn 95%. ;Eksempel IV ;Analyse av T- celle- undergrupper med hest- anti- TH0 ;På lignende måte som i eksempel III ble hest-anti-TH~ brukt for å skille TH2+- og TH2~-ceiler på "FACS" ved ;å merke 60 x 10^ ufraksjonerte T-celler med 0,12 ml hest-anti-TII2 og'0,1 ml "R/H FITC" (Cappei Laboratories, Down-ington, PA) som tidligere beskrevet av Reinherz et al. Ren-1 het og leveprosent pa de utsorterte cellene var den samme som: for de sorterte populasjonene beskrevet ovenfor. "FACS"-sorterte undergrupper av T-cellene ble isolert med hest-anti-TH n, OKT4 eller OKT5 og plassert i kultur i 48 timer med "RPMI 1640" inneholdende 20% humant AB-serum, 1% peniciilin-»streptomycin, 200 mmol L-glutamin, 25 mmol "HEPES"-buffer (Microbiologicai Associates) og 0,5% natriumbikarbonat ved 37°C i en 5% C02 fuktig atmosfære. De dyrkede cellene ole så analysert på cytofluorografen som beskrevet ovenfor. Bak-grunnsfarg ing ble bestemt ved a bruke normalt hest-IgG for •spesifikt antistoff og utfore farging som beskrevet ovenfor. ;Eksempel V ;Funksjonelle studier ;A. Undersøkelser over formering ;Den mitogeniske reaksjon for 10D useparerte og ;>"FACS"-fraksjonerto T-lymfocytter ble undersøkt i mikroKul-tur overfor optimale doser av "Concanavalin A" (Con A) (Calbiochem, La Jolla, CA) og fytohemagglutinin (PilA) (Burroughs-Wellcome Company, Grcenville, NC) . Alloantiger. formcrings-reaksjon ble målt samtidig for samme populasjoner med mito-<1>mycin-bohandlet Laz 156, en EBV-transformert human B-lymfo-blastoid cellelinjestimulans. Formering overfor tetanustoksoid (Massachusetts Department of Public Health Biologicai Laboratories, Boston, MA) og kusmaantigen (Microbiologicai Associates) ble provet ved å bruke 10 ug/ml endelig konsentrasjon og en 1:20-for tynning henholdsvis. 5% makrofager oppnådd på den måte som er beskrevet ovenfor, ble tilsatt alle populasjoner ved begynnelsen av in vitro-kulturene. ;Mitogenstimulerte kulturer ble pulset etter 4 døgn me6 J,2 iCi av 311-thymidin (<3>H-TdR; 1,9 Ci/mmol spesifikk aktivitet) ;(Schwarz/Mann, Division of Becton, Dickinson, Orangeburg, NY) ;og høstet 18 timer senere på et "MASH II"-apparat (Microbiologicai Associates). ^H-TdR-inkorporeringen ble målt på en Packard scintillasjonsteller (Packard Instrument Company, Dov/ner ' s Grove, IL). Bakgrunns-^H-TdR-inkorporer-ing ble oppnådd ved å erstatte mediet med mitogen. Oppløse-lige og celleoverflate-alloantigenkulturer ble pulset etter 5 døgn med 3II—Td R i 18 timer, høstet og tellet' som beskrevet ovenfor. ;B. Cytotoksiske undersøkelser ;Sensitiveringskulturer for cellestyrt lymfolyse (CML) ble etablert ved å plassere ufraksjonerte T-celler med mitomycinbehandlede stimulatorceller, alle ved 2 x 1C° celler pr. ml i multiple mikrotiterplatebrønner. Etter 5 døgn ble de uf raks joner te T-cellene fraksjonert i 0KT5"<*>"- og 0KT5 - T-celleundergrupper på "FACS". Disse T-celleundergruppene ble så tilsatt . 51 Cr-natriumkromatmerkede målceller og spesifikk cytotoksisitet ole bestemt etter en 6-timers celieinku-bering. Prosent cytotoksisitec ble bestemt på følgende måte: 5x1 Cr frig jort ved eksp eriment - 51 Cr frigjort spontant,. , „n Cr frigjort ved frysing/tining - Cr frigitt spontant

Alle prevene ble utført i 3 paralleller og resul-tatet uttrykt som midlet - standard avvik.

C. Con A-aktivering av suppressorceller og undertrykkelse

av MLC

[/fraksjonerte T-celler bie aktivert med 20 ug "Concanavalin A" (Con A) (Calbiochem) pr. 10 celler. Disse Con A-behandlede celler bie dyrket i stående kulturflasker med et overflateareal på 25 cm 2 (Falcon, Oxnard, CA) i "RPMI 164C" (Grand Island Bioiogical Company) inneholdende 20% humant AB-serum, 11 penicillin-streptomycin, 200 mmol L-glutamin, 25 mmol "HEPES"-buffer (Microbiologicai Associates) og 0,5% na tr iumbikarbonat i 48 timer ved 37°C i en fuktig atmosfære inneholdende 5% CO^. Ubehandlede kontroll-T-celler

ble dyrket på samme måte men uten Con A. Deretter bli. cellene sentrifugert, vasket 5 ganger og tilsatt friske autologe reaktive celler i en énveisblandet lymfocyttkultur (MLC) som beskrevet ovenfor. I prøven på undertrykkelse ble enveis MLC etablert i rundbunnede mikrotiterplater (Linbro Chemical Company, Nev? Haven, CT) med tre paralleller i orønnene, hver inneholoende 0,C5 x 10 rea ktive lymfocytter (helmononukle-ære); 0,05 x 10° enten av uaktiverte eller Con A-aktiverte autologe ufraksjoner te eller fraksjonerte T-celler; og 0,1 x 10 mitomycinbchundlede stimulerte celler (Laz 156).

3-

Etter 5 degn ole kulturene pulset med 0,2 pCi av H-TdR og høstet 18 timer senere. Prosent hemming av MLC-former ing ble så beregnet ved hjelp av følgende formel:

hvor cpm Con A<+> representerer resultatene av "^H-TdR-inkor-pororing i MLC når man tilsatte Con A-aktiverte autologe T-celler eller -T-celle-undergrupper, og hvor cpm representerer resultatene når man tilsatte uaktiverte autologe T-celler. Kort beskrivelse av teg ningene

Fig. 1 viser det fluorescensmønster man fikk på cytofluorografon etter i ha reagert normale humane perifere T-celler, 3-ceJJer, null-celler og makrofager r..ed OKT5 ved en 1:10C0-f or tynning og 'o/M FITC" i øvre rad. For' sammen--ligning har man i nedre rag vist resultatene med hest-anti-

TF

2"

Fig. 2 viser oet fluorescensmønster man fikk på cytofluorografen etter a reagert humane thymocytter med OKT5 og "G/M FITC(A)" og hest-anti-TH^(E). Fig. 3 viser det fluorescensmønster man fikk pa cytofluorografen etter å ha reagert hest-anti-TH2-utskilte T-celle-undergrupper med OKT5. Fig. 4 viser det fluorescensmønster man fikk på cytofluorografen etter å ha reagert OKT4-utskilte T-celle-undergrupper med OKT5. Fig. 5 viser der. cytotoksiske kapasiteten på uf r ak sjoner te T-celleundergrupper utskilt med 0KT5 eller en allosensitiver-i ng i MLC.

Produksjon av hybridomet og fremstillingen og karakteriseringen av det resulterende monoclonale antistoff ble utfort som i de ovennevnte eksempler. Skjønt man fremstilte store mengder av det foreliggende antistoff ved å injisere det foreliggende hybridom intraperitonealt i mus og høste de ondartede ascites, så er det innlysende at nevnte hybridom (også kan kultiveres in vitre ved velkjent teknikk og antistoffet fjernes den overliggende væske.

Som vist i der. øvre raden på fig. 1, så er ca.

20% av den humane perifere blod-T-cellepopuiasjonen hos en gitt normal pasient reaktiv med OKT5, mens hele B-celle-, inull-celle- og makrofagpopulasjenene isolert fra samme individ, er ureaktive med OKT5. På lignende måte reagerer hest-anti-TK0 ureaktivt

med B-celler, null-celler og makrofager. Det monoclor.iske antistoff er således karakterisert ved at det er reaktivt imed et antigen som finnes på overflaten av ca. 20 l av de normale humane perifere T-celler, mens det ikke reagerer med eventuelle andre antigener på overflaten av de andre tre celletypene slik dette er beskrevet ovenfor. Slik det vil bli nevnt i det etterfølgende, vil 0KT5<+->delon den humane iperifere T-cellepopulasjonen vtvre inkludert i do cytotoksiske og suopr ossor-T-celiounder c ruppen . Denne di i f or ensie 1.1c rcak-tiviteten er en prøve ved hjelp av hvilken det doreliggende antistoff OKT5 kan påvises og skilles fra andre antistoffer.

Som vist på fig. 2 så er ca. 80% av de normale 'humane thyrnocyttene fra et 6 måneder gammelt soobarn reaktivt med OKT5. Ligiier.de resultater (ca. 80% reaktivitet) ble oppnådd ved å bruke ytterligere thymusprøver fra normale indi-vider hvis alder variertte fra 2 måneder til 19 år. Denne verdi er den,samme som for hest-anti-TH^. Reaktivitets-mønsteret på fig. 2 tilveiebringer en annen fremgangsmåte for å påvise det foreliggende antistoff OKT5 og skille det fra andre antistoffer.

Som vist på fig. 3 så reagerer det foreliggende antistoff med TI?2<+->, men ikke med TH9~-T-celler. Ca. 5 - 10% av TH^-undergruppen var ureaktiv med 0KT5. Reaktivitets-mønsteret på fig. 3 tilveieoringer en tredje fremgangsmåte for å påvise det foreliggende antistoff OKT5 og skille det fra andre antistoffer.

Som vist på fig. 4 er hele OKT4<+->T-celleundergruppen fullstendig ureaktiv med CKT5. I motsetning til dette er 0KT4~-r-celleundergruppen i alt vesentlig OKT5<+> (6.800

av 10.000 celler'som ble prøvet). Disse resultatene indi-kerer at OKT5"<1->undergruppen av T-cellene på lignende måte som dc tidligere definerte TH^-uncergrupper, er resiproke og distinkte fra OKT4+-under<g>ru<p>pen. Mens OXT4<+->undergruppen inneholder hjelpe-T-celler, så vil OKT5'-undergruppen (og på samme måte TH^'-undergruppen) inneholder cytotoksiske celler suppressor-T-ceIler. Dette reaktivitetsmønsteret på fig. 4 gir en ytcerligere fremgangsmåte for å identifisere OKT5-antistoff og skille det fra andre antistoffer.

Fig. 5 viser at OKT5<+->T-ceileundergruppen utfører CML. Graden av oppløsning som styres av denne populasjonen er større enn den man fikk for en ufraksjonert T-cellepopu-lasjon. I kontrast til dette vil OKT5 -T-ceilepopulasjonen være minimalt opploser.de. Etter aktivering i MLC mot Laz . 156, ble de ufraksjoner te T-celler separert i 0KT5<+-> og 0KT5 -undergrupper. Både ufraksjoner te og fraksjonerte T-celler ble analysert i CML mot <51>Cr-merket Laz 156-mål ved forskjellige forhold mellom effextor og målceller (E:T). OKT5<+->T-celleundorgruppone inneholdt effektorpopulasjonen

i en cellestyrt iymfolyse. Ved E:T-forhold på 5:1, 10:1 og 20:1, så utførte OKT5<+->T-cellepopulasjonen 40%, 58% og 77% spesifikk oppløsning henholdsvis. Den oppløsende kapasiteten på den isolerte 0KT5'-undergruppen var betydelige større enn for den ufraksjonerte T-cellepopulasjonen. Videre frembragte 0KT5 -T-celiepopulasjonen betydelig mindre opp-løsning ved ethvert E:T-forhold som ble prøvet. I forhold til den tidligere observasjon av TH2<+->T-celleundergruppen

i mennesker utforte CML, så vil de foreliggende resultater kunne understøtte den teori at TH2 - og 0KT5 -T-celleur.c.er-gruppene definerer tilsvarende populasjoner av funksjonelt aktive T-lymfocytter. Denne differensielle cytotoksiske kapasiteten tilveiebringer ytterligere en fremgangsmåte for å identifisere 0KT5-antistoff og skille det fra andre antistoffer.

Funksjonelle studier ble utført på lymfoidpopula-sjoner som var utskilt ved hjelp av en fluorescensaktivert "'ce<l>ieseparator ("FACS''). Resultatene av disse undersøkel-ser er vist i tabellene I til og med III i det etterfølgende, og gir ytterligere støtte tii den tidligere beskrevne karakteriseringen av det foreliggende monoclonale antistoff.

I disse undersøkelser ble en ufraksjonert T-celie-'pcpulasjon behandlet med en 1:5C0-fortynning av 0KT5 og

"G/M FITC" og så skilt på "FACS" i CXT5<+-> og 0KT5~-undergrupper. Med den gitte renheten på de oppnådde populasjoner (mer eller lik 955), ble 5i makrofager tilsatt de se-parerte populasjonene før ir. an utforte en in vitro-kultur. ^Den ufraksjoner te T-celle-popuiasjonen og isolerte 0KT5'-

og 0KT5~-T-celleundergruppene bie så stimulert med PHA,

Con A, oppløselige antigener og ailoantigener for å bedømme deres in vitro-cciledciingsreaksjoner.

Den proliferative reaksjon for de <3>ufraksjonerte T-coilepopuiasjonene overfor PHA og Con A er vist i tabell I. Man oppnådde en maksimal celledelende reaksjon av den ufraksjoner te T-cellepcpuiasjonen med 1 ug PHA pr. 10^ celler og med svekket reaksjon mod 0,5 ;.g og 0,1 ug PHA pr. 10° celler. Behandling av de ufraksjonerte T-cellene med OKT5 og gjeit-muo-FITC uten etterfolgende fraksjonering, endret ikke den cel]euelonue■reaksjonen. I motsetning til dette fikk man forskjeller med hensyn tii PHA med de utskilte OKT5<+-> og OKT5~-T-celleundergruppene. 0:'T5 -populasjonen av celler reagerte overfor alle doser av PHA på samme måte som 'den useparerte T-cellepopulasjonen. Den celledelende reaksjonen på 0KT5<+->cellene var imidlertid betydelig lavere ved alle de provede doser av PHA. Videre fant mar. at ved en dose PHA på 0,1 (j.g pr. 10° celler så delte OKT5'+-T-cellene seg ikke i det hele tatt, mens OKT5 T-celleundergruppen og de ufraksjoner te cellene stadig var i celledeling. Den celle-deler.de reaksjonen på disse undergruppene overfor Con A var på den annen side lik og de to undergrupper av celler kunne ikke skilles fra hverandre eller fra den ufraksjoner te T-cellepopulasjonen.

Deretter undersøkte man reaksjonen overfor allo-ar.tigL.-n i MLC og oppløselige antigener. Det fremgår fra tabell II at den ufraksjonerte T-cellepopuiasjonen, den ufraksjonerte T-cellepopulasjonen behandlet med OKT5 og "G/M FITC" og togge OKT5+- og OKT5~-T-ceIleundergruppene reagerte på samme måte i MLC overfor Laz 156. I motsetning til dette ga den celledelende reaksjonen overfor oppløselige antigener den klareste distinksjonen mellom undergruppene.

I alle de prøvede tilfeller så viste det seg at OKT5<+->T-celleundergruppen hadde minimal celledeling overfor opp-løselige- antigener nem tetanustoksoid og kusma, mens OKT5 - T-celleundergruppen ga god reaksjon.

Tidligere- undersøkelser viste at TH9+-populasjonen av T-lymfocytter kunne induseres med Con A til å undertrykke autologe lymfocytter i MLC. For å bestemme hvorvidt 0KT5 - T-celieundergruppen på lignende måte kunne uttrykke en under-trykkende funksjon, så ble T-cellene aktivert i 48 timer med Con A og deretter sortert med 0KT5- og CKT4-monoclonalt antistoff til distinkte T-celleundergrupper. Deretter ble disse utskilte T-celleunderpopulasjonene tilsatt autologe reaktive lymfocytter ved starten av MLC. Som vist i tabell III så undertrykket ufraksjonerto T-ceiler aktivert med Con A en autolog celledeling i MLC. Behandling med monoclonalt antistoff og "G/M FITC". endret ikke dette resultat. Skjønt både OKT4+- og OKT5<+->T-celler ga celledeling overfor Con A, så ble bare OKT5 '"-T-cellene undertrykket ved en aktivering med Con A. 0KT4<+->undergrupoen ble ikke undertrykket. I tillegg til dette viste det seg at 0KT5-ur.derpopulasjonen som inneholder både OKT4<+-> og OKT4--TH9 -subpopulasjoner, var minimalt undertrykket når de ble sammenlignet med aen sterkt undertrykkede OKT54-populasjonen.

Tabell IV viser forholdet mellom mengden av perifere T-celler og T-celleundergrupper og forskjellige lidelsestilstander. pisse forhold kan brukes for diagnostiske formål (f.eks. for å påvise akutt infiserende mononukieose) ved å analysere en blodprøve fra en pasient man mistenker for å ha en av disse lidelsestilstander for så å bestemme nivået av T-celler og T-cell'eundergruppene. Disse forhold kan også brukes for terapeutiske formål hvor lidelsens år-sak er et for høyt nivå av en T-ceileur.dergruppe (f.eks. type I av nedarvet agammaglobulinemi). ror terapeutiske formål

s'å vil en tilførsel av et passende monoclonalt antistoff til en pasient med forhøyet nivå av T-celleundergruppen senke eller eliminere dette overskudd. De forhold som er vist i tabell IV er dessuten en fremgangsmåte ved hjelp av hvilken 0KT5-antistoff kan påvises cg skilles fra andre antistoffer.

Andre monoklonale antistoff-produserende hybridomer er beskrevet i de følgende norske patentsøknader: 800.793; 301.214; og 801.216.

S <6>kjønt bare en enkl hybridom som gir et enkelt, monoclonalt antistoff mot humant cytotoksisk cg suppressor-T-celleantigen er beskrevet, så er det underforstått at foreliggende oppfinnelse innbefatter alle monoclonale antistoffer som har de egenskaper som er beskrevet ovenfor. Det ble bestemt at foreliggende antistoff 0KT5 hører til under-klassen IgG^, som er én av fire underklasser av muse-IgG. Disse underklasser av immunogobulin G skiller seg fra hverandre ved såkalte "faste" områder, skjønt et antistoff til et spesifikt antigen vil ha et såkalt "variabelt" område som er funksjonelt identisk uten hensyn til hvilken underklasse immunglobulin G det hører til.

Skjønt bare ett eksempel på en hybridom er gitt

i det ovenstående, så er det underforstått at man ved å

bruke de fremgangsmåter for immunisering, sammensmelting og seleksjon som er beskrevet her, kan fremstille andre hybridomer som er i stand til å gi antistoffer med samme reaktivitetsegenskaper. Ettersom individuelle hybridomer fremstilt fra en kjent musemyelom-cellelinje og miltceller fra en kjent art av mus ikke ytterligere kan identifiseres uten ved en referanse til det antistoff som fremstilles av nevnte hybridom, så er det underforstått at alle hybridomer som gir antistoff med de reaktivitetsegenskaper som er beskrevet ovenfor, inngår i foreliggende oppfinnelse, så vel som fremgangsmåter for fremstilling av dette antistoff når man bruker nevnte hybridom.

Ved diagnose av lidelser eller sykdommer anvendes det monoklonale antistoff 0KT5. Det foreliggende antistoff kan brukes for å påvise et overskudd av cytotoksisk eller suppressor-T-celleaktivitet ved å reagere en T-celle-sammensetning fra et individ med 0KT5-antistoff. Overskudd av cytotoksisk eller suppressor-T-celleaktivitet vil da kunne påvises ved nærværet av mer enn 20-30% av den totale perifere T-cellepopulasjonen som reagerer med 0KT5. Denne diagnose-teknikk kan anvendes ved å bruke 0KT5-antistoff alene eller'

i kombinasjon med andre antistoffer (f.eks. 0KT3 og 0KT4)

som vist i tabell IV. Reaktivitetsmønstre med en rekke antistoffer til T-cellene og T-celleundergruppene vil kunne gi en mer presis påvisning av visse sykdomstilstander som det hittil ikke har vært mulig å gjøre ved hjelp av tidligere diagnostiske fremgangsmåter.

Hybridomen OKT5 er innlevert til the American Type

Culture Collection, 12391 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 den 28. september 1979 og ble gitt aksesjons-nr. CRL 8016.

Claims (3)

1. Monoklonalt antistoff av IgG-klassen (underklasse lgG^ som in-vitro diagnostisk middel, karakterisert ved at det reagerer med mer enn 90% av cytotoksiske og suppressor-TH2<+->celler, men ikke med normale humane perifere B-celler, null-celler eller makrofager.

2. Monoklonalt antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det er produsert av en hybridom med deponeringsnummer ATCC CRL 8016 (OKT5) dannet ved sammensmelting av celler fra en musemyelomlinje og miltceller fra en mus som på forhånd er immunisert med humane thymocytter.

3. Monoklonalt antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det definerer en T-celle-populasjon (OKT5<+>) som er sterkt cytotoksisk, og som har lavere nivåer enn normalt i primær gallecirrhose, multippel sklerose og nyper IgG; normale nivåer i alle trinn av Hodskin's sykdom; og høyere nivåer enn normalt i type I ervervet av gammaglobulinemi og akutt infektiøs mono-nukleose.