NO159221B - Monoklonalt antistoff. - Google Patents

Description

Foreliggende o<p>pfinnelse angår nytt komplement-

fikserende monoklonalt antistoff til et antigen som finnes på alle normale humane T-celler og kutane T-lymfomceller.

Sammensmelting eller fusjon av musemyelomceller til miltceller fra immunisert mus av Kohler og Milstein i 1975 (Nature 256, 395-497) (1975) viste for første gang at det var mulig å oppnå en kontinuerlig cellelinje for fremstilling av homogent (såkalt "monoklonalt") antistoff. Etter dette epokegjørende arbeid har det vært gjort store undersøkelser for å finne frem til fremgangsmåter for fremstilling av forskjellige hybridceller (betegnet "hybridomer"), samt bruken av antistoff fremstilt ved hjelp av disse hybridceller for forskjellige vitenskapelige undersøkelser. Se f.eks. Current Topics in Microbiology and Immunology, vol. 81 - "Lymphocyte Hybridomas" av F. Melchers, M. Potter og N. Warner, redaktører, Springer-Verlag 1978 og referanser angitt der, C. J. Bernstable

14, 9-20 (mai 1978); P. Parham og W. F. Bodmer, Nature 276, 397-399 (november 1978); Handbook of Experimental Immunology, tredje utgave, vol. 2, D. M. Wier, redaktør, Blackwell 1978, kap. 25; og Chemical and Engineering News, januar 1, 1979, 15-17.

Ovennevnte arbeider viser på samme tid hvilke muligheter

som foreligger, samt de komplikasjoner og vanskeligheter som oppstår når man ønsker å fremstille monoklonalt antistoff fra hybridceller. Skjønt teknikken er velkjent og godt forstått rent teoretisk, så er det mange praktiske vanskeligheter som oppstår i hvert enkelt tilfelle. Før man har forsøkt å fremstille en gitt hybridcelle, kan man i virkeligheten ikke på forhånd være sikker på at man vil oppnå den ønskede hybridcelle, og at den vil frem-

stille det antistoff som er ønskelig, eller at dette har den ønskede spesifisitet. Hvorvidt man er heldig eller ikke, er i alt vesentlig avhengig av den type antigen som brukes, samt den seleksjonsteknikk som brukes for å

isolere den ønskede hybridcelle.

Forsøk på å fremstille monoklonalt antistoff til humane lymfocyttcelle-overflateantigener har bare vært angitt i et par tilfeller. Se f.eks. Current Topics in Microbiology and Immunology, ibid, 66-69 og 164-169. De antigener som ble brukt i de angitte eksperimenter, var dyrkede humane lymfoblastoid-leukemiceller og humane kroniske lym-focyttiske leukemiceller. Mange hybridceller som ble oppnådd på den måten, synes å gi antistoff til forskjellige antigener på alle humane celler. Ingen av de fremstilte hybridcellene ga antistoff mot en forutbestemt gruppe av humane lymfocytter.

Det tør være velkjent at det er to prinsipielle typer av lymfocytter involvert i immunsystemet i mennesker og dyr. Den første type (thymus-avledet celle eller T-celle) blir differensiert i thymuskjertelen fra hemopoetiske stamceller. Så lenge disse celler befinner seg inne i thymuskjertelen, blir de gjerne betegnet "thymocytter". Den modne T-cellen blir så skilt ut fra thymuskjertelen og sirkulerer mellom vevet, lymfekjertlene og blodstrømmen. Disse T-cellene utgjør en større del av de resirkulerende små lymfocytter. De har immunologisk spesifisitet, og er alle direkte involvert i cellestyrte immunreaksjoner (såsom avstøtning ved transplantasjon, etc.),som såkalte effektorceller. Skjønt T-cellene ikke utskiller humoralt antistoff, så er de i visse tilfelle nødvendige for å få en utskillelse av disse antistoffer ved hjelp av den annen gruppe av lymfocytter som er beskrevet nedenfor. Andre typer av T-celler har en regulerende funksjon i

andre deler av immunsystemet. Selve mekanismen ved denne prosessen hvor man har et samarbeid mellom celler, er ikke fullt ut forstått.

Den annen klasse av lymfocytter (benmargavledede celler, eller B-celler) er de som utskiller antistoff. De utvikles også fra hemopoetiske stamceller, mens deres differensiering er ikke bestemt ved hjelp av thymuskjertelen. Hos fugler blir de utskilt i organer som er analoge til thymuskjertelen, ofte kalt Bursa- eller Fabricius-kjertelen. Hos pattedyr har man ikke oppdaget noe tilsvarende organ, og det er vanligvis antatt at disse B-celler differensieres inne i benmargen.

Det er nå kjent at T-cellene kan deles i flere undergrupper, ofte betegnet "hjelper"-, "suppressor"- og "dreper"-T-celler, som henholdsvis har en funksjon til å fremme en reaksjon, undertrykke en reaksjon eller å drepe (oppløse.)' fremmede celler. Disse underklasser er relativt godt kjent fra mus, men er bare nylig blitt beskrevet i forbindelse med mennesker. Se f.eks. R. L. Evans, et al., Journal of Experimental Medicine, vol. 145, 221-232, 1977, og L. Chess og S.F. Schlossman - "Functional Analysis of Distinct Human T-Cell subsets Bearing Unique Differentiation Anto-gens", og Contemporary Topics in Immunobiology", av 0. Stut-man, redaktør, Plenum 1977, vol. 363-379.

Evnen til å kunne identifisere eller undertrykke klasser eller undergrupper av T-celler er meget viktig for diagnose eller for behandling av forskjellige immunregulerte lidelser eller sykdommer.

For eksempel har visse typer leukemi og lymfoidlidelser forskjellige prognoser hvorvidt de er av B-celle eller T-celle-opprinnelse. Således vil en bedømmelse av sykdommens prognose være avhengig av hvorvidt man kan skille mellom disse to typer lymfocytter. Se f.eks. A. C. Aisenberg og J. C. Long, "The American Journal of Medicine", etc.

mars 1975; D. Belpomme et al., i "Immunological Diagnosis of Leukemias and Lymphomas", S. Thierfelder et al.,

redaktør Springer Heidelberg, 1977, 33-45, og D. Belpomme et al., "British Journal of Haematology, 1978, 38, 85.

Visse sykdomstilstander (f.eks. tidlige stadier av reuma-tiske lidelser, visse typer leukemi og agammaglobulinemi) er forbundet med en ubalanse m.h.t. T-celle-undergruppene. Det har vært antatt og foreslått at autoimmune lidelser

er forbundet med et overskudd av "hjelper"-T-celler, eller et underskudd av visse "suppressor"-T-celler, mens agammaglobulinemi er forbundet med et overskudd av visse "suppressor"-T-celler eller et underskudd på "hjelper"-T-celler. Ondartede svulster er vanligvis forbundet med et overskudd av "suppressor"-T-celler.

I visse typer leukemi blir overskudd av T-celler fremstilt på et stillestående stadium av sykdommens utvikling. Diagno-sen kan således være avhengig av evnen til å påvise denne ubalanse eller overskudd. Se f.eks. J. Kersey et al., "Surface Markers Define Human Lymphoid Malignancies with Differing Prognoses" i Haematology and Blood Transfusion, vol. 20, Springer-Verlag, 1977, 17-24, med de referanser som der er angitt.

Identifikasjonen og undertrykkelse av forskjellige klasser eller grupper av humane T-celler har tidligere vært utført ved å bruke autoantistoff eller selektivt antisera for humane T-celler, vanligvis fremstilt ved å immunisere dyr med humane celler, tappe disse dyrene for blod for derved å oppnå serum og adsorbere antiserum med f.eks. autologe, men ikke-allogene B-celler for derved å fjerne antistoffer med uønsket reaktivitet. Fremstillingen av disse antisera er meget vanskelig, spesielt er det meget komplisert å utføre adsorpsjon og rensing. Selv de adsorberte og rensede antisera vil vanligvis inneholde urenheter i tillegg til det ønskede antistoff av flere grunner. For det første vil serumet inneholde millioner av antistoffmolekyler selv før T-celleimmunoseringen.

Videre vil selve immuniseringen frembringe en fremstilling av antistoffer mot en rekke antigener som finnes på alle de injiserte T-celler. Det er ingen selektiv produksjon av antistoff mot et enkelt antigen. For det tredje vil aktiviteten på det spesifikke antistoff fremstilt ved slike fremgangsmåter, vanligvis være relativt lite

(dvs. inaktiv ved fortynninger på mer enn 1:100), og for-holdet spesifikt til ikke-spesifikt antistoff er mindre enn 1/10<6>.

Se f.eks. Chess og Schlossmans artikkel som det er vist til ovenfor (side 365 og følgende), og artikkelen i Chemical and Engineering News som er angitt ovenfor, hvor man har beskrevet ulempene ved tidligere kjente antisera og for-delene man eventuelt kunne oppnå ved å bruke monoklonalt antistoff.

Man har nå oppdaget en ny hybridcelle (betegnet OKT3) som

er i stand til å fremstille et nytt komplement-fikserende monoklonalt antistoff mot et antigen som finnes på i alt vesentlig alle normale humane, perifere T-celler og kutane T-lymfomaceller. Det fremstilte antistoff er monospesifikt for en enkeltdeterminant på normale humane T-celler og kutane lymfomaceller og inneholder i alt vesentlig intet annel anti-humant immunoglobulin, noe som står i motsetning til tidligere kjente antisera (som alltid var forurenset med antistoff som var reaktivt i forhold til en rekke humane antigener), og tidligere kjente monoklonale antistoffer (som ikke var monospesifikt for et enkelt humant T-celleantigen). Videre kan nevnte hybridcelle dyrkes slik at man får fremstilt antistoff uten at man nødvendigvis trenger å immunisere og drepe prøvedyr, fulgt av en meget omfattende adsorpsjon og rensing for å oppnå selv et urent antiserum ifølge tidligere kjente fremgangsmåter.

Det er følgelig en hensikt ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe antistoffer mot et antigen som i alt vesentlig finnes på alle normale humane T-celler og kutane T-lymfomaceller.

Videre er det en hensikt ved oppfinnelsen å tilveiebringe fremgangsmåter for fremstilling av disse antistoffer.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebragt et monoklonalt antistoff av IgG2~klassen for bruk som diagnostisk middel for påvisning av T-céllelymfomer, kjennetegnet ved at det fikserer komplement og reagerer med vesentlig alle humane perifere T-celler, men ikke med normale humane perifere B-celler, null-celler eller makrofager.

Det er foretrukket at dette monoklonale antistoffet er produsert med en hybridom med deponeringsnr. ATCC CRL

8001 (OKT3) dannet ved fusjon av celler fra en musemyelomlinje og miltceller fra en mus som på forhånd er immunisert med humane T-celler.

Hybridomen som produserer foreliggende antistoff, ble fremstilt ved at man generelt fulgte fremgangsmåten til Milstein og Kohler. Etter immunisering av mus med normale E-rosett-positive humane T-celler ble miltcellene i de immuniserte mus sammenkoblet eller smeltet sammen med celler fra en musemyelomlinje, og de resulterende hybridceller ble under-søkt m.h.t. hvilke som ga en væske inneholdende antistoff, som ga en selektiv blanding til normale E-rosett-positive humane T-celler. De ønskede hybridomer ble så klonet og karakterisert. Som et resultat av dette fikk man en hybridcelle som ga et antistoff (betegnet OKT3) mot et antigen som i alt vesentlig finnes på alle normale humane T-celler. Ikke bare reagerer dette antistoff i alt vesentlig på alle normale humane, perifere T-celler, men det reagerer ikke i det hele tatt med andre normale, perifere blodlymfoidceller. Det celleoverflateantigen som reagerer med dette antistoff, er i tillegg bare påvist på modne thymocytter, og mange fullstendig på mer enn 90% av normale humane thymocytter.

Sett på bakgrunn av de vanskeligheter man tidligere har hatt i forbindelse med ondartede cellelinjer som antigenet, så var det relativt overraskende at man skulle oppnå den ønskede hybridcelle. Det skal understrekes at den uforutsigbare natur man har på en slik hybridcellepreparering ikke gjør det mulig å ekstrapolere fra et antigen eller cellesystem 7

til et annet. Man har således oppdaget at ved å bruke en T-celle ondartet cellelinje som antigen, så fikk man dannelse av hybridcelle som ikke ga det ønskede antistoff. Forsøk på å bruke rensede antigener utskilt fra celle-overflatene lykkes ikke.

Både hybridomen og foreliggende antistoff som fremstilles ved hjelp av denne, blir her identifisert ved betegnelsen "0KT3", og denne betegnelse brukes i det etterfølgende.

Hybridomen 0KT3 ble deponert hos American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852

den 26. april 1979, og ble gitt aksesjonsnummer CRL 8001.

Fremstillingen og karakteriseringen av hybridomen og det resulterende antistoff vil fremgå fra det etterfølgende.

Fremgangsmåten for fremstilling av den benyttede hybridcelle innbefatter generelt de følgende trinn: A. Immunisering av mus med E-rosett-positive rensede normale humane perifere T-celler. Skjønt man har funnet at CAF^ hunnmus (en første generasjons-hybrid mellom Balb/cJ og A/J mus) er å foretrekke, så kan man også bruke andre musestammer. Selve immuniseringen og T-cellekonsentrasjonen bør være slik' at man får fremstilt brukbare mengder av egnede splenocytter. Man har funnet det effek-tivt å utføre tre immuniseringer med 14 dagers mellomrom med 2 x 10 7 celler/mus/injeksjon i 0,2 ml fosfatbufret saltoppløsning.

B. Fjerning av milten fra de immuniserte mus og fremstilling av miltsuspensjon i et passende medium. Ca. 1 ml medium pr. milt er tilstrekkelig. Denne eksperimentteknikk er velkjent.

C. Sammensmelting av de suspenderte miltcellene med musemyelomceller fra en egnet cellelinje ved hjelp av en egnet sammensmeltingsforbindelse. Det fore-trukne forhold er ca. 5 miltceller/myeloma-celle. Man bør bruke et totalt volum på 0,5 til 1,0 ml medium for ca. 10 g splenocytter. Mange musemyelomceller er kjente og tilgjengelige, og man vil kunne få disse fra forskjellige universitetsmiljøer eller forskningssentra, såsom Salk Institute Cell Distribution Center, La Jolla, CA. Den cellelinje som brukes, bør fortrinnsvis være såkalt "legemiddelresistent", slik at de usammensmeltede myelomceller ikke vil overleve i selektivt medium, noe som er tilfellet med hybridene. Den mest van-lige gruppe er såkalte 8-azaguaninresistente cellelinjer, idet disse mangler enzymet hypoxantin-guaninfosforibosyl-transferase, og vil således ikke kunne ernære seg ved hjelp av HAT-mediet (hypoxantin, aminopterin og thymidin). Det er også vanligvis foretrukket at myeloma-cellelinjen er av en såkalt "ikke-utskillende" type, dvs. at den i seg selv ikke fremstiller noe antistoff skjønt man også kan bruke såkalt utskillende typer. I visse tilfeller kan imidlertid sistnevnte type myelomlinje være foretrukket. Den forbindelse som er foretrukket for å fremme sammensmeltingen, er vanligvis polyetylenglykol med en midlere molekylvekt fra 1000 til 4000 (kommersielt tilgjengelig som PEG 1000, etc.), så kan man også bruke andre kjente forbindel-ser .

D. Fortynning og dyrking i separate beholdere, blandingen av usammensmeltede miltceller, usammensmeltede myelomceller og sammensmeltede celler i et selektivt medium som ikke vil understøtte de usammensmeltede myelomceller i et tilstrekkelig langt tidsrom til at de sistnevnte celler dør (ca. 1 uke). Fortyn-ningen kan være av en begrensende, dvs. at volumet fortynningsmiddel er statisk beregnet slik at man isolerer et visst antall celler (f.eks. 1-4) i hver separat beholder (f.eks. i en brønn i en mikro-plate). Mediet et et (f.eks. et HAT medium) som ikke vil understøtte såkalte legemiddelresistente (f.eks. 8-azaguaninresistente) usammensmeltede myelomcellelinjer. Disse celler vil således dø. Ettersom de usammensmeltede miltcellene er ikke-ondartede, så har de bare et begrenset antall gene-rasjoner. Således vil de etter et visst tidsrom (vanligvis ca. 1 uke) ikke lenger kunne reprodusere seg selv. De sammensmeltede celler vil på den annen side fortsette å reprodusere seg ettersom de har den samme ondartede evne som den opprinnelige myelomcellen, og har dessuten en evne til å overleve i det selektive mediet fra den opprinnelige miltcellen.

E. Bedømmelse av væsken i hver beholder inneholdende en hybridcelle for et nærvær av antistoff til E-rosett-positive rensede humane T-celler.

F. Seleksjonen (f.eks. ved begrensende fortynning) og kloning av hybridceller som fremstiller det ønskede antistoff.

Så snart den ønskede hybridcelle er valgt og klonet, vil det resulterende antistoff kunne fremstilles på en av to måter. Man får fremstilt det rensede monoklonale antistoff ved en in vitro dyrking av den ønskede hybridcelle i et egnet medium i et egnet tidsrom, hvoretter man ut-vinner det ønskede antistoff fra supernatanten. Et egnet medium og egnet dyrkningstid kan lett bestemmes. Denne in vitro-teknikk gir i alt vesentlig et monospesifikt monoklonalt antistoff som i alt vesentlig er fritt for andre spesifikke antihumane immunglobuliner. Det vil ofte være en mindre mengde av andre immune globuliner til stede, ettersom mediet inneholder xenogent serum (f.eks. serum fra kalvefoster). Imidlertid vil denne in vitro-fremgangsmåte vanligvis ikke gi tilstrekkelig mengde eller konsentrasjon av antistoff for visse formål, ettersom konsentrasjonen av monoklonalt antistoff bare er ca. 50^ug/ml.

For å fremstille en langt større konsentrasjon av noe

mindre rent monoklonalt antistoff kan den ønskede hybridcelle injiseres i mus, fortrinnsvis syngenisk eller semi-syngenisk i mus. Hybridcellen vil frembringe en dannelse av antistoffproduserende svulster etter en egnet inkubasjons-tid, og dette vil resultere i en høy konsentrasjon av det ønskede antistoff (ca. 5-20 mg/ml) i blodstrømmen eller i det peritoneale ascites i vertmusen. Skjønt disse vertmus også kan ha normale antistoffer i sitt blod og ascites, så vil konsentrasjonen av disse normale antistoffer bare være ca. 5% av konsentrasjonen av det monoklonale antistoff. Ettersom disse normale antistoffer videre ikke er antihumant

i sin spesifisitet, så vil det monoklonale antistoff som oppnås fra det innhøstede ascites eller fra serum i alt vesentlig være fritt for et eventuelt forurensende antihumant ammunglobulih.

Dette monoklonale antistoff har høy aktivitet (aktivt ved fortynninger på 1:100.000 eller, høyere), og har høyt forhold av spesifikt til ikke-spesifikt immunglobulin (ca. 1/20). Det immunglobulin som fremstilles, vil innbefatte såkalte K-lette myelomkjeder, og disse er ikke-spesifikke, dvs. "nonsens"-peptider som bare fortynner det monoklonale antistoff uten at dets spesifisitet svekkes.

Eksempel I

F remstilling av monoklonalt antistoff

A. Immunisering og somatisk celle- hybridisering

CAF^ hunnmus (Jackson Laboratories; 6-8 uker gamle) ble immunisert intraperitonealt med 2 x 10 7 E-rosett-rensede T-celler i 0,2 ml fosfatbufret saltoppløsning med 14 dagers mellomrom. Fire døgn etter den tredje immunisering ble miltene tatt ut av nevnte mus, og det ble fremstilt en cellesuspensjon ved å presse vevet gjennom et nett av rust-fritt stål.

Cellefusjon eller -sammensmelting ble utført ved hjelp av

den fremgangsmåte som er utviklet av Kohler og Milstein.

1 x 10 g splenocytter ble koblet i et 0,5 ml av et sammen-smeltningsmedium bestående av 35% polyetylenglykol (PEG 1000) og 5% dimetylsulfoksyd i RPMI .1640 medium (Gibco, Grand Island> N.Y.) med 2 x 10 7 P3X63Ag8UI myelomceller levert

av dr. Scharff, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, N.Y. Disse myelomceller utskiller IgG^ K-lette kjeder.

B. Seleksjon og vekst av hybridceller

Etter sammensmeåting ble cellene dyrket i et HAT-medium (hypoxantin, aminopterin og thymidin) ved 37°C med 5% C02 i en fuktig atmosfære. Flere uker senere ble 40 til lOO^ul av supernatanten fra kultur inneholdende hybridcellene tilsatt en pellet av 10 perifere lymfocytter skyld i et E-rosett-positiv (E + ) og i en E-rosett-negativ (E _)-populasjon som var fremstilt fra blod fra friske mennesker, slik det er beskrevet av Mendes (J. Immunol. 111:860, 1973). Påvisning av muse-hybridcelleantistoffer som bandt seg til disse celler,

ble bestemt ved en radioimmunologisk prøve og/eller in-direkte immunofluorescens. I den første fremgangsmåte ble cellene først omsg att med 100/,ul affinitets-renset <125>I geit-anti-mus IgG 10 cpm/^ug; SOO^ug/^ul. (Detaljer med hensyn til iodisering av geit-anti-mus IgG er beskrevet av Kung,

et al., J. Biol. Chem. 251(8):2399, 1976). Alternativt ble cellene inkubert med væskekulturen og farget med en fluorescerende geit-anti-mus IgG (G/MFITC) (Meloy Laboratories, Springfield, VA; F/p = 2,5), og de fluorescerende antistoff-belagte celler ble deretter analysert på en cytofluorograf

FC200/4800A, slik det er beskrevet i eksempel III. Hybrid-cellekulturene inneholdende antistoffer som reagerte spesifikt med E<+> lymfocytter (T-celler) ble så utvalgt og klonet. Deretter ble klonene overført intraperitonealt ved injeksjon av 1 x 10 7 celler angitt klon (0,2 ml volum) inn i CAF^ mus som var behandlet med 2, 6, 10, 14-tetrametylpentadekan ("Pristine"). De ondartede ascites fra disse mus ble så brukt for å karakterisere lymfocyttene slik det er beskrevet i eksempel II. Hybridantistoff OKT3 ble bestemt ved hjelp av standardteknikk til å være av underklassen IgG2 og fiksererkomplement.

Eksempel II

Karakterisering av 0KT3 reaktivitet

^ A. Isolering av lymfocyttpopulasjoner

Humane perifere blodmononukleære celler ble isolert fra friske pasienter (alder 15-40) ved en Ficoll-Hypaque-tetthetsgradientsentrifugering, idet man brukte den teknikk som er beskrevet av Boyum, Scand., J. Clin. Lab. Invest. 21 (Suppl. 96): 77, 1968. Ufraksjonerte mononukleære celler ble separert i overflate Ig<+> (B) og Ig~ (T pluss null) populasjonen ved hjelp av Sephadex G-200 anti-F (ab1)9 kolonne-kromatografi, slik den er beskrevet av Chess, et al., J. Immunol. 113:1113 (1974). T-cellene ble innvunnet ved såkalte E-rosetting av lg populasjonen med 5% saue-eytrocytter (Microbiological Associates, Bethesda, MD). Blandingen ble lagt over Ficoll-Hypaque, og den innvundne

<E+> pellet ble behandlet med 0,155 NH4C1 (10 ml pr. IO<8> celle). Den oppnådde cellepopulasjon var mindre enn 2% EAC rosett-positiv og mer. enn 9 5% E-rosett-positiv slik dette kunne bestemmes ved standardmetoder. I tillegg til dette ble en ikke-rosettdannende lg (nullcelle) populasjon innhøstet fra Ficoll-grenseflatén. Sistnevnte populasjon var mindre enn 5% E og mindre enn lik 2% slg<+>. Overflate Ig<+> (B) populasjonen ble oppnådd fra en Sephadex G-200 kolonne etter levering med normalt humangammaglobulin som beskrevet tidligere. Denne overflate var mer enn 95% overflate Ig<+>

og mindre enn 5% E<+>.

Normale humane makrofager ble oppnådd fra den mononukleære populasjonen med tilsetning til polystyren. Således ble de mononukleære celler resuspendert i det endelige kultur-medium (RPMI 1640, 2. 5 mM HEPES [4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazinpropansulfonsyre], 0,5% natriumbikarbonat, 200 mM-glutamin og 1% penicillin-streptomycin supplementert med 20% varmeinaktivert humant AB serum) i en konsentrasjon på 2 x 10 celler og inkubert i plastpetriskåler (100 x 20 mm) ved 37°C over natten. Etter langvarig vasking for å fjerne ikke-tilfestede celler ble den tilfestede populasjonen løsnet ved rask vasking med kaldt serumfritt medium inneholdende 2,5 mM EDTA og en viss skraping med gummispissen på en tynn engangspipette. Mer enn 85% av cellepopulasjonen var i stand til å oppta latekspartikler og hadde morfologiske egenskaper av den type man finner i monocytter, vist ved Wright-Giemsa-farging.

B. Normal thymus

Normale humane thymuskjertler ble oppnådd fra pasienter fra to måneder til 14 år som var underkastet korrigerende hjerte-kirurgi. Nylig oppnådde porsjoner av thymuskjertelen ble umiddelbart plassert i 5% serum fra kalvefoster i medium 199 og finfordelt med en saks og en pinsett, og deretter opp-arbeidet til en enkelt cellesuspensjon ved pressing gjennom et fint nett. Cellen ble så lagt over Ficoll-Hypaque og sentrifugert og vasket som beskrevet ovenfor. De oppnådde thymocytter var mer enn 95% levende og mer enn 90% E-rosett-positive.

C. Cellelinjer

Epstein-Barr-virus (EBV) transformerte B-cellelinjer

fra fire normale individer (Laz 007, Laz 156, Laz 256 og SB) er beskrevet tidligere. T-cellelinjer CEM, HJD-1,

Laz 191 og HM1 ble etablert fra leukemipasienter, og ble tilveiebragt av dr. H. Lazarus, Sidney Faber Cancer Institute, Boston, VA.

D. Akutt lymfoblastisk leukemi ( T- All) T- celler og kroniske

lymfatiske leukemi( T- CLL) T- celler

Leukemiceller ble oppnådd fra 12 pasienter med T-ALL. Disse individuelle celler var på forhånd blitt bestemt til å til-høre en T-cellegruppe p.g.a. sin spontane rosett-dannelse med saue-erytrocytter (mer enn 20% E<+>) og reaktivitet med T-cellespesifikt hetero-antisera, anti-HTL (anti-B.K.) og

A99 slik det er beskrevet av Schlossman, et al., Proe. Nat. Acad. Sei. 73:1288 (1976). Svulstceller fra tre individer var reaktive (TH2<+>) med kanin og/eller anti-TH2, mens celler fra de gjenværende ni var ikke-reaktive (TH2). Leukemiceller fra to pasienter med TH2~ T-CLL ble så brukt. Både akutte og kroniske T-celle-leukemiceller ble konservert i

-19 6°C flytende nitrogen i 10% dimetylsulfoksyd og 20%

AB humant serum inntil de skulle overflatekarakteriseres. Svulstpopulasjonene ble analysert ved hjelp av Wright-Giemsa-morfologi, og man fant at i alle tilfeller var mer enn 90% såkalte utblåste.

Eksempel III

Cytofluorografisk analyse

Cytofluorografisk analyse av alle cellepopulasjoner blir ut-ført ved en direkte immunofluorescens med fluorocein, kon-jugert geit-anti-mus IgG (G/M FITC) (Meloy Laboratories) på en cytofluorograf FC200/4800A. Kort fortalt ble 1-2 x IO<6 >celler behandlet med 0,15 ml OKT3 ved en 1:1000 fortynning inkubert ved 4°C i 30 min., og vasket to ganger. Cellene ble så omsatt med en 0,15 ml av en 1:40 fortynning G/M FITC

i 4°C i 30 min., så sentrifugert og vasket tre ganger. Disse cellene ble så analysert på cytofluorografen, og intensiteten på fluorescensen pr. celle ble målt på en pulshøyde-analysator. Et lignende mønster m.h.t. reaktivitet ble observert ved en fortynning på 1:1000.000, men ytterligere fortynning ga et tap av reaktivitet. Bakgrunnsfargen ble oppnådd ved å bruke 0,15 ml porsjon av en 1:1000 ascites fra en Balb/cJ-mus som var intraperitonealt immunisert med en ikke-produserende hybridklon. Fig. 1 viser det fluorescensmønster man fikk på cytofluorograf en etter at man hadde reagert normale humane, perifere T-celler med OKT3 ved en 1:1.000 fortynning og G/M FITC. For sammenligning er resultatene med monoklonalt antistoff OKT1 og OKT4 vist under tilsvarende betingelser på fig. 1-5. Fig. 2 viser det fluorescensmønster man fikk på cytofluro-grafen etter reaksjon mellom humane thymocytter og OKT3 og

G/M FITC.

Fig. 3 viser det fluorescensmønster man fikk på cytofluorograf en etter å ha reagert leukemiceller fra B-celle-kroniske, lymfoblastiske leukemipasienter med OKT3 og G/M FITC. Fig. 4 viser det f luorescensmønster mari fikk på cytof luoro-grafen etter å ha reagert human T-cellelinje HJD-1 med 0KT3 og G/M FITC. Fig. 5 viser det fluorescensmønster man fikk på cytofluorograf en etter å ha reagert en human T-cellelinje CEM med OKT3 og G/M FITC.

De data som er vist på fig. 1-5 samt ytterligere data for 0KT3 (så vel som 0KT1 og OKT4) er satt sammen i tabell I.

Fremstillingen av hybridcellen og produksjon og karakterisering av det resulterende monoklonale antistoff ble utført som beskrevet i ovennevnte eksempler. Skjønt større mengder av det foreliggende antistoff ble fremstilt ved å injisere ovennevnte hybridcelle intraperitonealt i mus og deretter innhøste den ondartede ascites, så er det klart at hybridcellen kan også dyrkes in vitro ved hjelp av velkjent teknikk, hvoretter antistoffet kan fjernes fra vevsvæsken over kul-turen.

Som vist på fig. 1 så er hele den humane, perifere blod-T-celle-populasjonen fra et gitt normalt individ reaktivt med 0KT3, mens hele B-celle, null-celle og makrofagpopulasjonen som blir isolert fra samme individ, ureaktive med 0KT3. Tilsvarende resultater ble oppnådd på populasjoner av lymfocytter fra 15 andre normale individer. Det monoklonale antistoff er således karakterisert ved at det er reaktivt med et antigen som forefinnes på overflaten av i alt vesentlig alle normale humane, perifere T-celler, men er ureaktivt med eventuellt andre antigener på overflaten av de andre: tre celletyper som er nevnt ovenfor. Denne differensielle reaktivitet er en prøve ved hjelp av hvilken man kan påvise det foreliggende antistoff 0KT3 og skille det fra antistoffer .

Som vist på fig. 2 så vil hovedmengden av normale humane thymocytter fra et 6 måneders spedbarn være fullstendig ureaktivt med 0KT3, mens fra ca. 5 til ca. 10% av thymocyttene er reaktive. Dette betyr at under differensierings-prosessen ved hjelp av hvilken stamcellene blir omdannet til modne T-celler, så vil thymocyttene på et visst trinn oppnå det samme overflateantigen som finnes på T-cellene, og som er reaktivt med OKT3. Man antar at disse thymocytter befinner seg i de senere trinn m.h.t. differensiering, dvs. like før de kommer ut fra thymuskjertelen og skylles ut i blodstrømmen. Tilsvarende resultater (5-10% reaktivitet) ble oppnådd ved å bruke seks ytterligere thymusprøver fra normale individer hvis alder varierte fra to måneder til nitten år. Reaktivitetsmønsteret på fig. 2 tilveiebringer en annen fremgangsmåte for å påvise det foreliggende antistoff 0KT3 og skille det fra andre antistoffer.

Foreliggende antistoff kan også brukes for å bestemme mengden av sirkulerende lymfocytter som er T-celler. Som vist på tabell I så vil mer enn 95% av alle T-celler reagere med 0KT3 antistoff. For i et individ å bestemme mengden av sirkulerende lymfocytter som er T-celler blandes 0KT3 antistoff med en lymfocyttsammensetning fra et individ og bestemmer mengden av lymfocytter som er 0KT3<+> og således T-celler.

En ytterligere egenskap ved foreliggende antistoff 0KT3 er vist ved dets reaktivitet overfor forskjellige humane T-cellelinjer slik dette er vist på fig. 4 og fig. 5. Det fremgår at reaktiviteten på det foreliggende antistoff overfor humane T-cellelinjer var heterogen, idet reaktiviteten var svak for linjen HJD-1 og ikke-eksisterende for linjene CEM, Laz 191 og HM1. Denne differensielle reaktivitet for 0KT3 for forskjellige lett tilgjengelige humane T-cellelinjer gir ytterligere en fremgangsmåte for å karakterisere og beskrive det foreliggende antistoff.

Mangler på reaksjon mellom 0KT3 og de humane B-cellelinjer Laz 007, Laz 156, Laz 256 og SB er vist i tabell I. Dette ytterligere understøtter mangelen på reaktivitet for OKT3 med B-celler oppnådd fra det perifere blod i normal human populasjon og tilveiebringer ytterligere en fremgangsmåte for å karakterisere og skille ut det foreliggende antistoff 0KT3.

Den spesifikke reaksjonen mellom OKT3 antistoff og et antigen på kutane T-cellelymfomer er vist i tabell II, hvor også forskjellen fra OKT1 og OKT4 er vist. Det foreliggende antistoff tilveiebringer således en reagens for å bekrefte en diagnose på kutan T-cellelymfom i en pasient man antar har denne sykdom.

Skjønt bare en enkelt hybridcelle gir et enkelt monoklonalt antistoff mot humant T-celleantigen, så er det innlysende at foreliggende oppfinnelse også innbefatter alle monoklonale antistoffer som har de egenskaper som er beskrevet her. Det ble bestemt at foreliggende antistoff 0KT3 hører til under-gruppen IgG2 som er en av de fire undergrupper av muse-IgG. Disse underklasser av immunoglobulin G skiller seg fra andre

i at de har såkalte "fikserte" områder, skjønt et antistoff til et spesifikt antigen vil også ha et såkalt "variabelt" område, som er funksjonelt identisk uansett til hvilken underklasse av immunoglobulin G det tilhører. Dette betyr at et monoklonalt antistoff som viser de egenskaper som er beskrevet her, kan høre til underklassen IgG^, IgG2af IgG^b eller IgG^, eller fra klassene IgM, IgA eller andre kjente Ig-klasser. Forskjellen mellom disse klassene eller under-klassene vil ikke påvirke selektiviteten på reaksjons-mønsteret for antistoffet, men kan påvirke ytterligere reaksjon mellom antistoffet og andre materialer, f.eks. komplement eller anti-mus antistoffer. Skjønt det foreliggende antistoff er spesifik- IgG2, så forstås det slik at antistoffet med samme reaktivitetsmønster som vist her, inngår i foreliggende oppfinnelse uansett hvilken immunglobulin-klasse eller underklasse de tilhører.

Skjønt bare ett eksempel på en hybridcelle er gitt her, så

er det innlysende at en fagmann lett kan utføre immunisering, sammensmelting og seleksjon som beskrevet her, og oppnå andre hybridceller som er i stand til å fremstille antistoffer med samme reaktivitetsegenskaper som beskrevet her. Ettersom individuelle hybridceller fremstilt fra en kjent musemyelom-cellelinje og miltceller fra en kjent museart ikke ytterligere kan indentifiseres uten med referanse til det antistoff som fremstilles av hybridomen, så er det underforstått at alle hybridomer som gir antistoff med de reaktivitetsegenskaper som er beskrevet ovenfor, inngår i foreliggende oppfinnelse så vel som fremgangsmåter for fremstilling av dette antistoff ved å bruke nevnte hybridcelle eller hybridom.

Ved behandling eller diagnose av lidelser ved sykdommer an-vendes monoklonalt antistoff 0KT3 eller annet monoklonalt antistoff som har samme reaktivitetsmønster. Foreliggende antistoff gjør det også mulig å påvise kutan T-cellelymfom i en pasient ved at man blander en lymfoma T-cellesammenset-ning av nevnte individ med en diagnostisk effektiv mengde av 0KT3 antistoff. Et nærvær av en reaksjon vil så bekrefte identiteten på sykdommen. Diagnostiske preparater innbefatter henholdsvis en diagnostisk effektiv mengde av 0KT3 antistoff med et diagnostisk akseptabelt bærestoff eller fortynningsmiddel.

Claims (2)

1. Monoklonalt antistoff av IgG2~klassen for bruk som diagnostisk middel for påvisning av T-cellelymfomer, karakterisert ved at det fikserer komplement og reagerer med vesentlig alle humane perifere T-celler, men ikke med normale humane perifere B-celler, null-celler eller makrofager.

2. Monoklonalt antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det er produsert med en hybridom med deponeringsnr. ATCC CRL 8001 (OKT3) dannet ved fusjon av celler fra en musemyelomlinje og miltceller fra en mus som på forhånd er immunisert med humane T-celler.