FI89175B - Foerfarande och produkter foer paovisande av humant t-celleukemivirus - Google Patents

Description

*:v 1 89175

Menetelmä ja tuotteet ihmisen T-soluleukemiaviruksen toteamiseksi Tämä keksintö koskee uusia puhdistettuja glykoproteii-5 nimuotoja, jotka on löydetty ihmisen T-soluleukemiaviruksen infektoimien solujen solun pintakelmusta, ja koemenetelmää mainituissa glykoproteiineissa olevien antigeenideterminant-tien vasta-aineen läsnäolon osoittamiseksi biologisessa näytteessä .

10 Ihmisen T-soluleukemiaviruksen (HTLV) tiedetään liit tyvän läheisesti tietyn tyyppiseen ihmisen leukemiaan, T-so-lutyyppiseen leukemiaan aikuisissa. On myös osoitettu, että kaikki ihmiset, joiden keho sisältää tämän viruksen vasta-aineita, ilmeisesti ovat latenttisesti viruksen infektoimia.

15 Essex, J.N.C.I., voi. 69, s. 981-985 (1982). Viruksen ytimen tärkeimpiä proteiineja on tutkittu ja infektoituneiden solujen vasta-aineiden määrittämiseksi on kuvattu immunofluo-resenssimenetelmä, joka käsittää infektoituneiden ihmisso-lujen solulinjasta, kuten MT1 ja MT2 saatujen solujen kiin- 20 nittämisen, kiinnitettyjen solujen saattamisen kosketuksiin tutkittavan koeseerumin kanssa ja sen seikan määrittämisen, onko seerumia kiinnittynyt solun pintaan, saattamalla sen *’ · jälkeen kosketuksiin ihmis-IgG:n fluoresoivasti merkityn | ' vasta-aineen kanssa. Hinuma et ai., Proc. Natl. Acad. Sei., :* . 25 voi. 78, s. 6476-6480 (1981). Tämä koemenetelmä on vaival- : loinen ja vaikea käyttää, koska vain 1-5 %:lla kiinnite- tyistä soluista on tarvittavat antigeeniset ominaisuudet. On myös ehdotettu käytettäväksi jossakin määrin analogista so-lupinnan immunofluoresenssikoetta, jossa infektoitujen so-.. . 30 lujen viljelmää inkuboidaan koeseerumin kanssa, sitten ka- nin f luoresoivasti merkityn vasta-aineen kanssa, joka on ' vasta-aine ihmis-IgG:lie sen seikan määrittämiseksi, onko' : tapahtunut seerumin kiinnittymistä soluihin. Robert-Guroff et ai., Science, voi. 215, s. 975-978 (1982). Radioimmuno-, 35 analyysi vasta-aineille P24:ää ja p19:ää, kahta HTLV:n ; ; ydinproteiinia, vastaan on myös kuvattu. Posner et ai., 2 89175 J. Exp. Med., vol. 154, s. 333-344 (1981). Tällä analyysillä ei kuitenkaan onnistuta saamaan positiivisia tuloksia kaikille yksilöille, jotka ovat olleet altistettuina infek-toivalle virukselle ja ovat sen vuoksi vaarassa, mutta joil-5 la ei ole todettavissa olevia pitoisuuksia näiden kahden antigeenin vasta-aineita.

Yhteenveto keksinnöstä

Nyt on havaittu, että HTLV:llä infektoitujen ihmisen T-solujen solupinnalla olevat tietyt polypeptidit tai gly-10 koproteiinit puhdistettuina ja eristettyinä sisältävät anti-geenideterminantin tai -determinantteja, joilla on hyvin suuri herkkyys ja immunospesifisyys vasta-aineelle HTLV:llä infektoituneita ihmisen soluja, ihmisen T-soluleukemiasolu-ja ja/tai HTLV:tä vastaan. Tämän johdosta olennaisesti puh-15 taat glykoproteiinit tai niiden glykosyloitumattomat osat ovat käyttökelpoisia diagnostisena välikappaleena biologisten näytteiden tutkimiseksi määritettäessä, sisältävätkö ne soluja, jotka ovat HTLV:n infektoimia. Muut polypeptidit, jotka sisältävät immunologisesti ristiin reaktiivisia anti-20 geenideterminantteja, ovat käyttökelpoisia samaan tarkoitukseen. Ilmaisulla "polypeptidit, jotka sisältävät immunologisesti ristiin reaktiivisia antigeenideterminantteja" tarkoitetaan polypeptidejä, joille on yhteisinä antigeenideterminantte ja , joiden kanssa tietty vasta-aine reagoi. Täl-25 laisiin muihin polypeptideihin kuuluvat glykoproteiinien glykosyloitumattomat osat. Muihin käyttökelpoisiin polypep-• tideihin tai proteiineihin, joissa on tarvittavia immuno- : geenisiä determinantteja, kuuluvat synteettiset polypepti dit. Niihin kuuluvat myös vasta-aineet tai näiden osat, 30 jotka ovat anti-idiotyyppisiä keksinnön mukaisella glyko-proteiinilla oleviin aktiivisiin determinantteihin tai determinanttiin nähden. Hiljattain on osoitettu, että anti-idiotyyppiset monoklonaaliset vasta-aineet voivat aiheuttaa immuunivasteen infektoivia organismeja vastaan, joissa on 35 antigeenideterminantteja, jotka ovat samoja tai olennaises-; ti samoja kuin anti-idiotyyppisillä vasta-aineilla olevat, li 3 89175 ja ne voivat suojata tällaisten organismien infektioilta (Fields et ai., Nature, 300:19-23 (1982); Sacks et ai., J. Exp. Med. 4:1108-1119 (1982). On myös osoitettu, että an-ti-idiotyyppiset reagenssit ovat käyttökelpoisia diagnosti-5 sinä välikappaleina sellaisten antigeenien osoittamiseksi, jotka sisältävät kohtia, jotka ovat vasta-aineilla olevien kohtien kanssa immunologisesti ristiin reaktiivisia (Potocnjak et ai., Science 215: 1637-1639 (1982), mainittu tässä vertailun vuoksi). Siten koe HTLV:n toteamiseksi voi-10 täisiin suorittaa käyttäen apuna anti-idiotyyppistä vasta-ainetta tai sen immunologisesti aktiivista osaa, jossa on antigeeninen kohta tai kohtia, jotka ovat immunologisesti samankaltaisia kuin keksinnön mukaisen glykoproteiinin an-tigeenikohta tai -kohdat. Tällaiset anti-idiotyyppiset vas-15 ta-aineet voidaan herättää vastustamaan ensimmäisiä vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä keksinnön mukaisen glykoproteiinin antigeenikohtia vastaan (s. anti-idiotyyppiset vasta-aineet ovat anti-vasta-aineita). Edullisesti käytetään monoklonaalisia anti-idiotyyppisiä vasta-aineita.

20 HTLV-infektion koemenetelmä on tärkeä, koska virus voi helposti siirtyä vasta-ainepositiivisten ihmisten peri-feeriveren valkosoluista vasta-ainenegatiivisten ihmisten ; valkosoluihin kun näitä kahta leukosyyttiä viljellään yh~ : dessä. Popovic et ai., Science, voi. 219, s. 856-859 (1983).

25 Tämän vuoksi näyttää siltä, että kokoveren siirtoihin liittyy suuri infektiovaara, kun siirretty veri sisältää infektoituneita soluja. Lisäksi koemenetelmä on tärkeä, koska biologiset näytteet yksilöistä, joilla on hankittu immuuni-puutosoireyhtymä (AIDS), myös antavat positiivisen tuloksen 30 uuden glykoproteiinin antigeenideterminantin vasta-aineen suhteen siten helpottaen tämän sairauden diagnoosia.

Siten keksintö käsittää myös menetelmän biologisen näytteen analysoimiseksi HTLV-infektoituneiden solujen vasta-aineen läsnäolon suhteen, jossa menetelmässä mainittua 35 näytettä inkuboidaan polypeptidin kanssa, jossa on antigee-nideterminantti tai -determinantteja, jotka ovat immunolo- 4 89175 gisesti ristiin reaktiivisia determinanttien kanssa, joita on glykoproteiinissa, jonka molekyylipaino on suunnilleen 61 000 - 68 000 daltonia ja josta suunnilleen 46 - 48 000 daltonia on glykosyloitumaton osa tai glykoproteiinin kans-5 sa, jonka molekyylipaino on suunnilleen 45 000 - 52 000 daltonia, joita glykoproteiineja esiintyy HTLV:n infektoimien solujen solupinnalla, ja määritetään, onko mainitun vasta-aineen ja mainitun polypeptidin välille muodostunut immuunikompleksi vai ei.

10 Keksintö käsittää myös biologisen näytteen analyysi menetelmän sen selvittämiseksi, onko läsnä antigeenideter-minantti tai -determinantteja, jotka ovat immunologisesti ristiin reaktiivisia molekyylipainoltaan 61 000 - 68 000 daltonia tai 45 000 - 52 000 daltonia olevien glykoproteii-15 nien determinanttien kanssa. Tutkittavia determinantteja voi esiintyä mainituissa glykoproteiineissa itsessään tai muissa polypeptideissä. Ne voivat olla vapaassa kierrossa kehon nesteissä tai lymfosyyteissä. Analyysi voidaan suorittaa tunnetuilla immunoanalyysimenetelmillä käyttäen 20 vasta-aineita, monoklonaalisia tai polyvalenttisia, jotka ovat immuunireaktiivisia mainituissa glykoproteiineissa havaittujen antigeenideterminanttien kanssa. Voidaan käyttää esimerkiksi kompetitiivisia immunoanalyysimenetelmiä tai immunometrisiä ("voileipä-") menetelmiä.

25 Esillä olevan keksinnön mukaisten glykoproteiinien molekyylipaino on suunnilleen 61 000 - 68 000 daltonia ja suunnilleen 45 000 - 52 000 daltonia määritettynä natrium-dodekyylisulfaatti- (SDS-) geelielektroforeesilla ja ne liukenevat SDS-puskuriin, jonka muodostaa 0,15 M natriumklori-30 di 0,05 M Tris-hydrokloridi pH 7,2, 1 % Triton X-100, 1 % natriumdeoksikolaatti, 0,1 % natriumdodekyylisulfaatti ja 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridi. Triton X-100 on io-niton detergentti (oktyylifenoksipolyetoksi- (9-10) etanoli). (>1 000 - 08 000 D:n glykoproteiinin glykosyloitumatto-35 man osan molekyylipaino on suunnilleen 46 000 - 48 000 daltonia ja se sisältää olennaisesti saman antigeenidetermi- li 5 89175 nantin tai samoja antigeenideterminantteja kuin itse glyko-proteiini.

Glykoproteiineja voidaan saada HTLV-infektoituneista soluista. On valmistettu lukuisia solulinjoja, jotka ovat 5 pysyvästi ja jatkuvasti HTLV:n infektoimia; näiden joukosta voidaan mainita MJ, C5-MJ, C91PL ja HUT-102. Saattaa olla, että uusien glykoproteiinien tarkat koot ovat lievästi erilaisia eri linjoissa; glykoproteiinien yhteinen immunolo-gisesti ristiin reaktiivinen osa on kuitenkin sama solulin-10 jasta riippumatta, koska se on HTLVrn aikaansaama proteiini. Siten mikä tahansa viruksen isäntäsoluna toimiva solu voi olla sopiva uusien glykoproteiinien lähde. Proteiinin saamiseksi mistä tahansa virusta kantavista infektoituneista 35 soluista, nämä merkitään metabolisesti (esim- S-metionii-15 nilla) ja immuunipresipitoidaan vasta-ainetta sisältävillä seerumeilla, jotka on saatu HTLV-infektoituneista kohteista. Uudet glykoproteiinit voidaan sitten todeta ja eristää geelielektroforeesilla. "HTLV" käytettynä tässä selityksessä ja patenttivaatimuksissa on tarkoitettu sisältämään vi-20 ruksen yleisesti. Se sisältää siten viruksen mitkä tahansa ja kaikki muodot, alatyypit tai variantit.

Glykoproteiineja on läsnä esimerkiksi ihmisen T-so-luleukemiasoluviljelmien MJ, C5-MJ, C91PL ja HUT-102 solu-pinnoilla. Näyte MJsstä ja C5-MJ:stä on talletettu laitok-25 seen American Type Culture Collection huhtikuun 26 päivänä 1983 ATCC-numeroilla CRL-8294 ja vastaavasti CRL-8293. Glykoproteiinit voidaan helposti eristää näiden solulinjojen soluista solujen hajotuksella (lyysillä) ja SDS-geelielek-troforeesilla.

30 Puhdistettuja ja eristettyjä glykoproteiineja tai mi tä tahansa niiden kanssa immunologisesti ristiin reaktiivista antigeeniä voidaan käyttää standardiantigeeninä missä tahansa tavanomaisessa analyysimenetelmässä tälle antigee-nille spesifisten vasta-aineiden läsnäolon osoittamiseksi .· . 35 ja siten HTLVrn infektoimien ja/tai AIDS:lie luonteenomais- - ’ ten solujen osoittamiseksi näytteessä. Tällaisille HTLV- 6 89175 antigeeneille spesifisiä vasta-aineita ei ole havaittu potilaissa, joilla on esimerkiksi hepatiitin kaltaisia sairauksia, joihin ei liity HTLV-infektiota.

Glykoproteiinit tai niiden kanssa immunologisesti 5 ristiin reaktiiviset polypeptidit voidaan merkitä tavanomai- 125 35 3 sin menetelmän I:llä tai S:llä tai Hilla käytettäviksi radioimmunoanalyysissä, fluoreseiinillä immunofluore-senssikoetta varten, entsyymillä entsyymi-immunokoetta varten tai biotiinilla biotiini-avidiini-liittymäkokeita var-10 ten. Sitä voidaan käyttää, valinnaisesti merkittynä tai merkitsemättömänä, kompetitiivisissä immunokokeissa sekä kak-soisvasta-ainekokeissa, joissa käytetään kahta vasta-ainetta, joko idiotyyppi/anti-idiotyyppivaihtoehtoa tai varsinkin toinen vasta-aine-tyyppiä käyttäen anti-Fc-vasta-ainet-15 ta tai muissa kokeissa.

Vaihtoehtoisesti uudet glykoproteiinit tai niiden kanssa immunologisesti ristiin reaktiiviset polypeptidit voitaisiin immobilisoida liukenemattomaan faasiin, kuten liukenemattomaan hartsiin ja glykoproteiinin vastaisten 20 vasta-aineiden toteaminen suoritetaan mittaamalla niiden sitoutuminen liukenemattomaan faasiin. Liukenemattomiin faaseihin kuuluvat myös lateksihiukkaset, jotka päällystettyinä uudella glykoproteiinilla tai sen kanssa immunologisesti ristiin reaktiivisilla polypeptideillä ja saatettuina kos-25 ketuksiin antiglykoproteiinivasta-aineen kanssa agglutinoi-tuvat. Muihin liukenemattomiin faaseihin kuuluvat koeputket, viaalit, titrauskuopat ja niiden kaltaiset, joihin uusi glykoproteiini tai sen kanssa immunologisesti ristiin reaktiivinen polypeptidi voidaan kiinnittää ja sen vasta-30 aine voidaan todeta kaksoisvasta-ainetekniikoilla tai käyttäen proteiini A:han perustuvia tekniikkoja.

HTLV:n vasta-aineen tutkimisessa voidaan käyttää gly-koproteiinia tai glykoproteiineja, joiden molekyylipaino on 61-68 000 ja vastaavasti 46 - 52 000, raakatuotteinä eikä 35 se rajoitu näiden proteiinien käyttöön olennaisesti puhtaina. Glykoproteiini(t) voidaan esimerkiksi ensin puhdistaa 7 89175

oleellisesti puhtaiksi ja sitten sekoittaa yhteen. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää myös raakatuotteiden seoksia. Eräässä sovellutusmuodossa HTLV:n vastaisten vasta-aineiden läsnäolon tutkiminen voi sisältää näytteessä olevien muiden 5 vasta-aineiden toteamisen, kuten vasta-aineiden HTLV:n ydin-proteiineja p19:ää, p24:ää tai molempien viimeksi mainittujen seosta vastaan. Tässä sovellutusmuodossa menetelmä käsittää näytteen inkuboinnin reagenssin kanssa, joka sisältää 1) toista tai kumpaakin keksinnön mukaisista glykopro-10 telineistä (so. 61 000 - 68 000 ja/tai 46 000 - 52 000 D

tai immunoristireaktiivisia polypeptidejä) ja mahdollisesti 2) HTLV:n ydinproteiineja p24 tai p19 tai näitä kumpaakin ja sen määrittämisen, onko immuunikompleksi muodostunut näytteessä olevien vasta-aineiden ja reagenssin välillä.

15 Edellä kuvatun diagnostisen metodologian toteuttami seen tarvittavat aineosat voivat olla yhdessä pakkauksessa. Tällainen pakkaus sisältää kantajan, joka on lokeroitu, niin että siinä on yksi tai useampia säiliöitä kunkin näistä säiliöistä sisältäessä yhtä tai useampaa kokeiden suorittami-20 seen tarvittavaa aineosaa.

Ensimmäinen säiliö voi esimerkiksi sisältää toista tai kumpaakin puhdistetuista glykoproteiineista tai sen kanssa immunologisesti ristiin reaktiivisia polypeptidejä leimattuina niin, että ne voidaan todeta tai saatettuina 25 liukenemattomaan muotoon.

- - Toinen säiliö voi sisältää polyklonaalista tai mono- klonaalista anti-IgG-vasta-ainetta, joka on käyttökelpoista kaksoisvasta-ainekiinnittymiskokeessa tai aineosia, jotka ovat tarpeen glykoproteiinissa tai sen kanssa immunologi-.. . 30 sesti ristiin reaktiivisissa polypeptideissä olevan leiman / toteamiseksi (esim. kromogeenisia kantajia).

Muut säiliöt voivat sisältää vaihtelevia määriä yh-:· tä glykoproteiineista tai sen kanssa immunologisesti ris- tiin reaktiivisista polypeptideistä, jota voidaan käyttää / . 35 valmistettaessa standardikäyrä, jonka avulla koetulokset ; ; voidaan interpoloida. Aineet voivat olla pakkauksessa e 89175 sellaisinaan, liuoksessa, jäädytyskuivattuina tai seoksina muiden inerttien aineiden, kuten inerttien proteiinien ja niiden kaltaisten kanssa.

Tutkittaviin biologisiin näytteisiin voi kuulua ve-5 rl, seerumi, lymfosyytit, virtsa, kudokset, sylki, ulosteet ynnä muut sellaiset. Erityisen mielenkiinnon kohteena on veripankeissa olevan veren seulonta sen varmistamiseksi, ettei veri ole HTLV:n saastuttamaa. Myös verestä peräisin olevien tuotteiden, kuten rokotteiden seulonta voidaan suorittaa 10 keksinnön mukaisilla menetelmillä.

Seuraavat yksityiskohtaiset esimerkit on tarkoitettu valaisemaan täydellisemmin keksinnön luonnetta niiden vaikuttamatta rajoittavasti keksinnön alueeseen.

Esimerkki 1 15 Leimatun glykoproteiinin valmistus A. Kahdesta solulinjasta MJ ja C5-MJ kerättiin erikseen ihmisen T-soluleukemiasoluja niiden kasvun log-vaihees-sa. Kun näytteet oli pesty kerran metioniinittomalla McCoyn 5A-väliaineella, kukin näyte suspendoitiin uudelleen leimaus-20 väliaineeseen, jonka muodostivat metioniiniton McCoyn 5A, - 10 % fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS), dialysoitu si- " 35 kiöasteisen vasikan seerumi ja 100 ^uCi/ml S-metioniini.

2-4 tunnin käsittelyn jälkeen radioaktiivisesti leimatut solut pestiin kolmesti kylmällä PBS:llä. Solupelletti hajotet-25 tiin sitten 0,6 - 1,0 ml :11a kylmää lyysipuskuria (RIPA) (0,15 M natriumkloridi, 0,05 M Tris-hydrokloridi pH 7,2, 1 % Triton X-100 kostutusaine, 1 % natriumdeoksikolaatti, 0,1 % natriumdodekyylisulfaatti ja 1 mM fenyylimetyylisul-fonyylifluoridi). 10-minuuttisen jaksoittaisen sekoittami-30 sen jälkeen seosta lingottiin tunti voimalla 100 000 x g 4°C:ssa. Hajotustuotteen (lysaatin) emäliuos esiselkeytet-tiin puhtaaksi epäspesifisistä kiinnittymistuotteista absorboimalla tunnin ajan 4°C:ssa hiilihydraattihelmille (Sepha-rose CL-4B), jotka oli päällystetty proteiini A:lla.

35 B. Solun pintakalvon proteiinin leimaaminen suori tettiin laktoperoksidaasin katalysoimalla radiojodioinnilla.

Il 9 89175

Jokaisesta linjasta kolme näytettä, joissa oli 5 x ΙΟ** solua elinkelpoisuuden ollessa yli 99 %, jodioitiin erik- 125 seen 1 mCi:llä kantajatonta natrium jodidia käyttäen apuna 50 yUl kantajaan sidottua laktoperoksidaasia ja glukosidaa-5 siä (Entsymobeads, Bio-Rad Labs.) ja 25 ^ul 1-%:ista beetta-D-glukoosia. Kun reaktio oli päättynyt, kolme jodioitujen solujen näytettä yhdistettiin ja saatettiin samoihin lysoin-ti- ja esiselkeytysmenettelyihin kuin edellä kohdassa (A) on kuvattu.

10 C. MJ- ja C5-MJ-soluja kerättiin erikseen niiden kas vun log-vaiheen huipussa ja suspendoitiin sitten uudelleen glukoosittomaan RPMI-1640-väliaineeseen, jota oli täydennetty 1 mg:lla/ml natriumpyruvaattia, kahdeksi tunniksi. Tämän glukoosipuutostilan jälkeen solut leimattiin määrällä 3 15 100 ^uCi/ml H-glukosamiinia (New England Nuclear) 5-6 tun nin ajan. Menettelyn tuloksena saadaan tritiumleima vain soluissa oleviin glykoproteiineihin. Leimatut solut saatettiin sitten edellä kohdassa (A) kuvattuihin lysointi- ja esiselkeytysmenettelyihin .

20 Glykoproteiinin leimatun glykosyloitumattoman osan valmistus D. MJ- ja C5-MJ-soluja kerättiin erikseen niiden kas- "1 vun log-vaiheen huipussa ja suspendoitiin uudelleen McCoyn "· 5A -väliaineeseen, jota oli täydennetty 10 %:lla sikiövai- : ; 25 heisen vasikan seerumia, 1 %:lla antibiootti-antimykootti- seosta ja 20 ^ugrlla/ml tunikamysiiniä kahdeksi tunniksi.

Tämän tasapainotusvaiheen jälkeen solut leimattiin määrällä 35 100 ^uCi/ml S-metioniinia käyttäen mukana 20 ^ug/ml tunikamysiiniä kahden tunnin ajan. Leimattu materiaali saatet-30 tiin sitten samoihin lysointi- ja esiselkeytysmenettelyihin kuin edellä kohdassa (A) on kuvattu.

Proteiini-vasta-aine-kompleksin muodostaminen E. Erille proteiini A:11a päällystettyjä helmiä kiin- - nitettiin (a) positiivista vertailuveriseerumia, joka oli 35 saatu yksilöstä, jossa tiedettiin olevan vasta-aineita HTLV:n infektoimia soluja vastaan; (b) negatiivista 10 89 1 75 kontrolliseerumia, joka oli saatu yksilöistä, joilla ei ollut infektiota ja (c) tutkittavaa seerumia tuntemattomista yksilöistä. Jokainen päällystettyjen helmien erä saatettiin sitten reagoimaan 4°C:ssa jokaisen edellä kohdassa (A) MJ:stä 5 ja C5-MJ:stä saadun esiselkeytetyn lysaatin näytteen kanssa 1-2 tunnin ajan, jotta kiinnitetyn lysaattiproteiinin ja seerumeissa olevien vasta-aineiden välillä voi muodostua kompleksi tai tapahtua immunopresipitaatio. Reaktion lopussa helmet pestiin neljä kertaa puskurilla (RIPA) ja kerran 10 puskurilla, joka sisälsi 0,05 M Tris-hydrokloridia pH 7,2 ja 0,15 M natriumkloridia kompleksiin sitoutumattoman lysaattiproteiinin poistamiseksi.

Helmet upotettiin sitten näytepuskuriin (0,1 M Cleland-reagenssia, 2 % natriumdodekyylisulfaattia 0,08 M 15 Tris-hydrokloridia pH 6,8, 10 % glyserolia ja 0,2 % bromi-fenolisinistä) ja kiehutettiin 100°C:ssa kaksi minuuttia proteiinien eluoimiseksi helmistä ja kompleksien dissosioi-miseksi.

Proteiinin karakterisointi 20 F. Kukin edellä esitetystä menettelystä (A) saatu näyte analysoitiin elektroforeesilla, jolloin proteiinit erotettiin 12,5-%:isella SDS-polyakryyliamidigeelillä ja 3,5-%:isella kokoamisgeelillä käyttäen Laemmli-puskurijärjestelmää. Molekyylipainomerkkiaineet ajettiin samanaikai- 25 sesti rinnakkaiskolonnissa. Käytettyihin merkkiaineisiin 14 kuuluivat C-leimattu fosforylaasi b (92 500) , häränseeru-min albumiini (68 000) ja ovalbumiini (46 000) ja hiilihap-poanhydraasi (30 000) ja sytokromi C (12 000). Fluorografiän tekemiseksi näkyväksi geelit kiinnitettiin ensin 10 %:lla 30 etikkahappoa, 10 %:lla trikloorietikkahappoa ja 30 %:lla metanolia yksi tunti, upotettiin sitten Enhancer-liuokseen yhdeksi tunniksi. Kun geelit oli huuhdottu tislatulla vedellä ja kuivattu tyhjiössä, ne valotettiin Kodak SB-5 -filmillä autodiografien aikaansaamiseksi.

35 Puhdistetun ja eristetyn 61 000 - 68 000 -molekyy- lipainoisen glykoproteiinin ja 45 000 - 52 000 -molekyyli- ii 11 89175 painoisen glykoproteiinin täplät esiintyivät huomattavina kaikissa seerumin (a) kolonneissa, mutta ei missään seerumin (b) kolonnissa. Ydinproteiineja p19 ja p24 sitä vastoin ei tullut näkyviin missään seerumin (a) näytteessä. Glyko-5 proteiinin esiintyminen tuntemattomissa seerumeissa (c) osoitti seerumeissa olevan HTLV:n infektoimia soluja. Myös yksilöistä, joilla oli AIDS, saadut seerumit antoivat tässä menetelmässä selvän osoituksen vasta-aineista 61 000 -68 000 -molekyylipainoista glykoproteiinia vastaan.

10 Samankaltaisia tuloksia on saatu korvaamalla kohdan A leimatut glykoproteiinit jommallakummalla kohdissa B tai C saaduista. Se voitaisiin korvata myös kohdan D leimatulla glykosyloitumattomalla osalla, missä tapauksessa puhdistettu ja eristetty leimattu osa esiintyy geelikolonnissa koh-15 dassa, joka vastaa molekyylipainoa 46 000 - 48 000. Leimaa-maton glykoproteiini ja leimaamaton glykosyloitumaton osa voidaan saada jättämällä edellä kuvatuista menetelmistä pois leimaamisvaiheet.

Samankaltaisia tuloksia on saatu korvaamalla solulin-20 jät MJ tai C5MJ solulinjoilla C91PL tai HUT-102.

Aminohapposekvenssianalyysi 35 [ S/-kysteiinileimatut glykoproteiinit, joiden mole- kyylipainot olivat suunnilleen 61 000 daltonia ja vastaavas- ti suunnilleen 45 000 - 46 000 daltonia, saostettiin 36 x 25 106 Hut-102-solusta, jotka oli leimattu metabolisesti 5 mCi:llä 35 [ S,/-kysteiiniä (ominaisaktiivisuus 1011,2 Ci/mmol, New England Nuclear) 30 ml:ssa kysteiinitöntä RPMI-1640-väliai-netta, joka sisälsi 15 % sikiöasteisen vasikan seerumia (Grand Island Biological Co.) 10 tunnin ajan. Mainitut kak-30 si glykoproteiinia erotettiin NaDodSO^-polyakryyliamidigee-leiltä ja eluoitiin sitten erikseen elektroforeettisesti käyttäen 50 mM Tris-asetaatti pH 7,8 -puskuria, joka sisälsi 0,01 % NaDodSO^ 12-16 tuntia. Näytteet dialysoitiin ker-ran 10 mM ammoniumbikarbonaattipuskurilla, jossa oli 0,002 % 35 NaDodSO^ 12-16 tuntia. Vielä yksi dialyysi tehtiin 10 mM ammoniumbikarbonaattipuskurilla ilman NaDodSO^:ää 12-16 12 891 75 tunnin ajan. Jokainen näyte lyofilisoitiin sitten ja amino-happosekvenssianalyysi suoritettiin menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Coligen et ai., J. Immun. Meth., voi. 47, 1-11 (1981) ja Meth. Enzymol., voi. 91, s. 413-434 (1983). Ly-5 hyesti sanottuna radioaktiivisesti leimattujen peptidien automatisoitu Edman-hajotus suoritettiin käyttäen kylmäloukku-modifioitua Beckman 890C -sekvensseriä ja 0,1 M Quadrol-oh-jelmaa 121078. Jokaisesta sekvenssivaiheesta saatu butyyli-kloridiuute kuivattiin käyttäen ^-haihdutusta 7,0 ml:n tui-10 kepulloissa. Kun oli lisätty Biofluoria (NEN), määritettiin radioaktiivisuus Beckman LS9080 -nestetuikelaskimella.

-J C

[ S^-huiput havaittiin jäännöksissä 6, 7, 21 ja 23, mikä osoitti kysteiinin olevan 61 000 - 68 000 D:n glykoproteii-nin proteiinisekvenssin näissä kohdissa. Tämän sekvenssin 15 toistuva saanto oli 88 %, mikä osoitti, että kaikki ryhmät ovat samassa sekvenssissä. Pienet huiput kohdissa 4 ja 13 ovat oletettavasti peräisin pienistä määristä (alle 5 %) epäpuhtauksina olevia proteiineja. Nämä tulokset osoittavat, että molekyylipainoltaan 61 000 - 68 000 D:n glykoproteiini 20 on ainakin osaksi HTLV:n env-geenin koodaama ja että env-geenin pääjakso sisältää 20 ryhmää.

Samanlainen analyysi suoritettiin /^Sj-kysteiinillä leimatuilla glykoproteiineilla, joiden molekyylipainot olivat suunnilleen 67 000 D ja vastaavasti 50 000 - 52 000 D.

25 Kysteiiniryhmät todettiin kohdissa 6, 7 ja 21, kun analysoitiin ensimmäiset 22 NH2~pääteryhmäjäännöstä. Tämä osoittaa, että tämäkin glykoproteiini on ainakin osaksi saman env-geenin NH2~pääteryhmäjakson koodaama.

li

Claims (25)

1. Oleellisesti puhdas, ihmisen T-soluleukemiavi-ruksen tyypin I (HTLV-I) infektoimien solujen tuottama 5 polypeptidi, tunnettu siitä, että mainitussa polypeptidissä on antigeenisiä determinantteja, jotka ovat immunologisesti ristiin reaktiivisia noin 61 000 - 68 000 daltonin molekyylipainoisen glyko-proteiinin determinanttien kanssa, jonka glykoproteiinin 10 molekyylipainosta noin 46 000 - 48 000 daltonia on glyko-syloitumattoman osan molekyylipaino, tai noin 45 000 -52 000 daltonin molekyylipainoisen glykoproteiinin determinanttien kanssa, jotka mainitut glykoproteiinit saadaan uuttamalla ihmisen T-soluleukemiasolulinjan ATCC CRL-8294 15 tai ATCC CRL-8293 solut.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että se on patenttivaatimuksessa 1 mainittu glykoproteiini, jonka molekyylipaino on 61 000 - 68 000 daltonia.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että se on patenttivaatimuksessa 1 mainitun glykoproteiinin glykosyloitumaton osa, jonka molekyylipaino on 46 000 - 48 000 daltonia.

4. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen polypepti-25 di, tunnettu siitä, että se saadaan ihmisen T- soluleukemiasolulinjojen ATCC CRL-8294 tai ATCC CRL-8293 soluista.

5. Leimattu oleellisesti puhdas, ihmisen T-solu-leukemiaviruksen tyypin I (HTLV-I) infektoimien solujen 30 tuottama polypeptidi, tunnettu siitä, että polypeptidi on missä tahansa patenttivaatimuksista 1-4 määritelty polypeptidi.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että mainittu leima on radioiso- 35 tooppileima, fluorogeeninen leima, entsyymileima tai bio-tiinileima. 14 89 1 75

7. Liukenemattomaan faasiin kiinnitetty oleellisesti puhdas, ihmisen T-soluleukemiaviruksen tyypin I (HTLV-1) infektoimien solujen tuottama polypeptidi, tunnettu siitä, että polypeptidi on missä tahansa 5 patenttivaatimuksista 1-4 määritelty polypeptidi.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että mainittu kiinteä faasi on lateksipartikkeli tai liukenematon hartsi.

9. Menetelmä patenttivaatimuksen 2 mukaisen poly- 10 peptidin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään solulinjan ATCC CRL 8294 tai ATCC CRL 8293 soluja sopivissa viljelyolosuhteissa ja uutetaan polypeptidi soluista.

10. Menetelmä HTLV-I:n infektoimia soluja vastaan 15 muodostuneen vasta-aineen läsnäolon määrittämiseksi bio logisesta näytteestä, tunnettu siitä, että näytettä inkuboidaan mahdollisesti leimatun polypeptidin kanssa, jolla on antigeenisiä determinantteja, jotka ovat immunologisesti ristiin reaktiivisia noin 61 000 - 68 000 -20 daltonin molekyylipainoisen glykoproteiinin determinant tien kanssa, jonka glykoproteiinin molekyylipainosta noin 46 000 - 48 000 daltonia on glykosyloitumattoman osan molekyylipa ino, tai noin 45 000 - 52 000 daltonin molekyylipainoisen glykoproteiinin determinanttien kanssa, jotka 25 mainitut glykoproteiinit saadaan uuttamalla ihmisen T-so-luleukemiasolulinjan ATCC CRL-8294 tai ATCC CRL-8293 solut ja määritetään muodostuuko mainitun vasta-aineen ja mainitun polypeptidin välinen immuunikompleksi.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että polypeptidi on glykoproteii-ni, jonka molekyylipaino on noin 61 000 - 68 000 daltonia .

12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidi on glykosyloitu- 35 maton osa, jonka molekyylipaino on noin 46 000 - 48 000 daltonia. Il 15 891 75

13. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidi on glykoproteii-ni, jonka molekyylipaino on noin 45 000 - 52 000 dalto-nia.

13 891 75

14. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 10 - 13 mu kainen menetelmä, tunnettu siitä, että se sisältää polypeptidin leimausvaiheen.

15. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 10 - 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se on 10 entsyymiin liittyvä immunoanalyysi.

16. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 10 - 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se on ra-dioimmunoanalyysi.

17. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 10 - 13 mu- 15 kainen menetelmä, tunnettu siitä, että se on la- teksipartikkeliagglutinaatiokoe.

18. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 10 - 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se on fluoresenssikoe.

19. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 10 - 13 mu kainen menetelmä, tunnettu siitä, että se on kaksoisvasta-aineimmunoanalyysi.

20. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen polypeptidin determinanttien kanssa immunologisesti ristiin 25 reaktiivisen antigeenisen determinantin tai determinant tien läsnäolon toteamiseksi biologisessa näytteessä, tunnettu siitä, että inkuboidaan mainittua näytettä patenttivaatimuksen 1 mukaista polypeptidiä vastaan muodostetun vasta-aineen 30 kanssa ja määritetään, muodostuuko vasta-aineiden ja poly-peptidien välinen immuunikompleksi.

21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että näyte sisältää ihmisen lym- 35 fosyyttejä. 16 891 75

22. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aineet ovat vasta-aineita mainitulle glykoproteiinille, jonka molekyylipaino on 61 000 - 68 000 daltonia.

23. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aineet ovat vasta-aineita glykoproteiinille, jonka molekyylipaino on suunnilleen 45 000 - 52 000 daltonia.

24. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että vasta-aineet ovat vasta-aineita glykoproteiinille, joka esiintyy solulinjojen ATCC CRL-8294 tai ATCC CRL-8293 solujen solupinnalla.

25. Pakkaus, joka on käyttökelpoinen näytteen tutkimiseksi HTLV-I:n infektoimien solujen vasta-aineiden 15 suhteen, tunnettu siitä, että se on lokeroitu niin, että se sisältää pienessä tilassa yhden tai useampia säiliöitä, joihin sisältyy ensimmäinen säiliö, joka sisältää minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-8 mukaista polypeptidiä, ja - 20 toinen säiliö, joka sisältää välineet vasta-aineen ja mainitun polypeptidin välisen immuunikompleksin muodostumisen toteamiseksi. 17 891 75