CN108220383A - 一种rExendin-4药物活性的检测试剂盒及检测方法和应用 - Google Patents

一种rExendin-4药物活性的检测试剂盒及检测方法和应用 Download PDF

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CN108220383A CN201810013485.6A CN201810013485A CN108220383A CN 108220383 A CN108220383 A CN 108220383A CN 201810013485 A CN201810013485 A CN 201810013485A CN 108220383 A CN108220383 A CN 108220383A
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Abstract

本发明提供了一种rExendin‑4药物活性的检测试剂盒及检测方法和应用，属于医学检验与药物分析领域。本发明提供的rExendin‑4药物活性的检测试剂盒，通过简单的试剂能快速准确的测定rExendin‑4药物活性，将该试剂盒应用到rExendin‑4药物活性，能较好的提高检测的速度和准确性；rExendin‑4药物活性的检测方法通过简单的实验步骤，快速灵活的反应，测得药物的活性，具有较大的实际应用价值和社会价值。

Description

一种rExendin-4药物活性的检测试剂盒及检测方法和应用
技术领域
本发明涉及医学检验和药物分析领域，具体而言，涉及一种 rExendin-4药物活性的检测试剂盒及检测方法和应用。
背景技术
药物的研制过程中，生物学活性检测方法是药物筛选以及质量控 制的重要评价参数，该方法必须通过方法验证，满足专属性、精密度、 准确度等方法验证方面的要求，这样才能保证生物学活性检测结果的 可靠性，才能用于指导药物的筛选以及质量控制。
重组促胰岛素分泌素(rExendin-4)属于胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)类药物，可以控制胰岛素和胰高血糖素的分泌。目前常用 的针对rExendin-4的生物学活性测定方法，是酶联免疫吸附法(EIA 法)，该法依据药物引发细胞内第二信使cAMP含量上升，通过试剂 盒检测cAMP来间接反映药物生物学活性。大鼠胰岛素瘤细胞 RIN-m5f作为天然的细胞模型可用于检测GLP-1类似物的活性,但 RIN-m5f难以培养和生长缓慢,贴壁培养过程中易脱落，使其应用受 到限制。并且在利用cAMP检测试剂盒检验cAMP过程中操作步骤 繁琐，增加了人为操作引起误差的风险。实验响应值不高。更重要的 是，在已经报道的针对GLP-1药物的生物学活性检测方法中，缺乏 对检测体系专属性、精密度、准确度等方面的方法验证与评价，难以 确保检测结果的准确性与可靠性。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种rExendin-4药物活性的检测试 剂盒，该试剂盒能方便的用于检测胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类药 物的活性。
本发明的第二目的在于提供上述rExendin-4药物活性的检测试 剂盒在rExendin-4药物活性的检测中的应用。
本发明的第三目的在于提供一种rExendin-4药物活性的检测方 法，通过本检测方法能准确、特异且灵敏的检测rExendin-4药物活性， 操作简单快捷。
为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：
一种rExendin-4药物活性的检测试剂盒，检测试剂盒包括细胞生 长培养基、分析培养基、质量分数28％-33％的BSA溶液和化学发光 剂。
上述rExendin-4药物活性的检测试剂盒在rExendin-4药物活性的 检测中的应用。
一种rExendin-4药物活性的检测方法，包括：
将rExendin-4活性参考品和rExendin-4供试品分别使用分析培养 基溶解，然后进行倍比稀释，分别处理荧光效应细胞并培养，得到荧 光反应细胞；
将荧光反应细胞进行室温平衡后与化学发光剂进行混合反应，测 定荧光反应细胞的荧光数据；
通过荧光数据得到rExendin-4活性参考品和rExendin-4供试品半 数有效浓度值；
通过rExendin-4活性参考品和rExendin-4供试品半数有效浓度值 计算得到rExendin-4供试品的活性数据。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供的 rExendin-4药物活性的检测试剂盒，通过简单的试剂能快速准确的测 定rExendin-4药物活性，将该试剂盒应用到rExendin-4药物活性，能 较好的提高检测的速度和准确性；rExendin-4药物活性的检测方法通 过简单的实验步骤，快速灵活的反应，测得药物的活性，具有较大的 实际应用价值和社会价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中 所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发 明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通 技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图 获得其他相关的附图。
图1为本发明实验例1提供的量效曲线；
图2为本发明实验例2提供的量效曲线；
图3为本发明实验例2提供的量效曲线；
图4为本发明实验例3提供的量效曲线。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领 域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限 制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造 商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通 过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的一种rExendin-4药物活性的检测试剂盒 及检测方法和应用进行具体说明。
一种rExendin-4药物活性的检测试剂盒，检测试剂盒包括细胞生 长培养基、分析培养基、28％-33％的BSA溶液和化学发光剂。
进一步地，本发明的较佳实施例中，细胞生长培养基包括 DMEM/F12培养基、9％-12％的FBS溶液和120-130μg/mL的潮霉素 B溶液，分析培养基包括DMEM/F12培养基、0.22％-0.28％的FBS 溶液和0.4％-0.7％的BSA溶液。
进一步地，本发明的较佳实施例中，化学发光剂为荧光素酶发光 试剂。
上述rExendin-4药物活性的检测试剂盒在rExendin-4药物活性的 检测中的应用。
一种rExendin-4药物活性的检测方法，包括：
将rExendin-4活性参考品和rExendin-4供试品分别使用分析培养 基溶解，然后进行倍比稀释，分别处理荧光效应细胞并培养，得到荧 光反应细胞；
将荧光反应细胞进行室温平衡后与化学发光剂进行混合反应，测 定荧光反应细胞的荧光数据；
通过荧光数据得到rExendin-4活性参考品和rExendin-4供试品半 数有效浓度值；
通过rExendin-4活性参考品和rExendin-4供试品半数有效浓度值 计算得到rExendin-4供试品的活性数据。
本方法利用培养简单方便的导入了人源GLP-1R基因和荧光素 酶基因的CHO-K1/GLP1R细胞作为受体细胞。rExendin-4能与 CHO-K1/GLP1R细胞的GLP-1受体相互作用，通过cAMP/PKA信号 通路促进荧光素酶报告基因的表达，促进荧光素酶的合成,荧光素酶 能够催化荧光素进行化学反应，产生与酶的量成正相关的荧光。将 rExendin-4样品稀释到一系列浓度梯度刺激细胞一段时间后，通过多 功能酶标仪在全波长(230nm-1000nm)下检测相对荧光素酶发光单 位(RLU)并进行四参数拟合浓度效应曲线分析，得出能够反映样品 生物学活性的半数有效稀释浓度(EC50)。为了减少细胞状态、数量 及试剂等因素造成的系统误差，通过活性参考品的效价和EC50值计 算rExendin-4的生物学活性。
进一步地，本发明的较佳实施例中，荧光效应细胞的制备，包括 将GLP-1R基因和荧光素酶基因导入受体细胞，制得荧光效应细胞。
进一步地，本发明的较佳实施例中，受体细胞为CHO-K1细胞、 Hela细胞、胰岛细胞、293细胞和HepG2细胞中的一种。
进一步地，本发明的较佳实施例中，处理荧光效应细胞前包括将 荧光效应细胞进行铺板，铺板的密度为2×103个/孔-5×104个/孔。
进一步地，本发明的较佳实施例中，室温平衡的时间为8-13min。
进一步地，本发明的较佳实施例中，化学发光剂的加入量为 43-58μL/孔，震荡反应的条件为450-600rpm，反应10-35min。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种rExendin-4药物活性的检测试剂盒，该检测试 剂盒包括细胞生长培养基、分析培养基、质量分数为28％BSA溶液 和化学发光试剂。
细胞生长培养基包括DMEM/F12培养基、质量分数为9％的FBS 溶液和终浓度为120μg/mL的潮霉素B溶液。
分析培养基包括DMEM/F12培养基、质量分数为0.22％的FBS 溶液和0.7％的BSA溶液。
质量分数为28％的BSA溶液：将28g的BSA溶于100mL的PBS 溶液中，0.22μm的滤膜进行过滤除菌，2-8℃保存。
化学发光剂为荧光素酶发光试剂。
实施例2
本实施例提供一种rExendin-4药物活性的检测试剂盒，该检测试 剂盒包括细胞生长培养基、分析培养基、质量分数为33％BSA溶液 和化学发光试剂。
细胞生长培养基包括DMEM/F12培养基、质量分数为12％的FBS 溶液和终浓度为130μg/mL的潮霉素B溶液。
分析培养基包括DMEM/F12培养基、质量分数为0.28％的FBS 溶液和0.4％的BSA溶液。
质量分数为33％的BSA溶液：将33g的BSA溶于100mL的PBS 溶液中，0.22μm的滤膜进行过滤除菌，2-8℃保存。
实施例3
本实施例提供一种rExendin-4药物活性的检测试剂盒，该检测试 剂盒包括细胞生长培养基、分析培养基、质量分数为30％BSA溶液 和化学发光试剂。
细胞生长培养基包括DMEM/F12培养基、质量分数为10％的FBS 溶液和终浓度为125μg/mL的潮霉素B溶液。
分析培养基包括DMEM/F12培养基、质量分数为0.25％的FBS 溶液和0.5％的BSA溶液。
质量分数为30％的BSA溶液：将30g的BSA溶于100mL的PBS 溶液中，0.22μm的滤膜进行过滤除菌，2-8℃保存。
实施例4
本实施例提供一种rExendin-4药物活性的检测方法，具体检测方 法如下：
包括荧光效应细胞的制备，具体步骤如下：
将含有荧光素酶基因的质粒pGL4.29和含有人源GLP-1R基因的 质粒pcDNA3.3-GLP1R共转染到以CHO-K1细胞作为受体细胞中， 筛选并获得CHO-K1/GLP1R的阳性细胞。
rExendin-4药物活性的检测，具体的方法如下：
1.1将rExendin-4药物活性参考品和rExendin-4药物供试品用 1mL超纯水溶解混匀得到rExendin-4药物活性参考品溶液和 rExendin-4药物供试品溶液，用实施例3提供的分析培养基将 rExendin-4药物活性参考品溶液和rExendin-4药物供试品溶液分别稀 释到120ng/mL；
1.2将rExendin-4药物活性参考品溶液和rExendin-4药物供试品 溶液按照3倍倍比稀释，得到120ng/mL-0.006ng/mL的10个梯度浓 度；
1.3取对数生长期的CHO-K1/GLP1R细胞，用细胞生长培养基培 养CHO-K1/GLP1R细胞，并计数培养的浓度，每孔CHO-K1/GLP1R 细胞2×103个/孔；
1.4用10个梯度浓度的rExendin-4药物活性参考品溶液和 rExendin-4药物供试品溶液分别处理CHO-K1/GLP1R细胞，每个孔 加入100μL的溶液，每个浓度分别设置三个平行孔，另外设置一个 对照组(对照组加入100μL的细胞生长培养基)；
1.5将细胞培养板于37℃、5％的二氧化碳的培养箱中培养；
1.6取出细胞培养板，在室温中平衡8min，在每个培养孔中加入 作为化学发光底物的荧光素酶发光试剂43μL；
1.7室温下，微孔振荡器上，450rpm的转震荡培养35min；
1.8通过酶标仪，测定每个孔的荧光数据；计算得到rExendin-4 药物活性参考品和rExendin-4药物供试品的EC50值；
1.9通过rExendin-4药物活性参考品和rExendin-4药物供试品的 EC50值得到rExendin-4药物供试品的活性数据。
rExendin-4药物供试品的活性数据的计算方法如下：
式中：Pr为rExendin-4药物活性参考品生物学的活性： 23000AU/mL；
Ds为rExendin-4药物供试品预稀释倍数；
Dr为rExendin-4药物活性参考品预稀释倍数；
Es为rExendin-4药物供试品相当于活性参考品EC50值的稀释倍 数；
Er为rExendin-4药物活性参考品EC50值。
实施例5
本实施例提供一种rExendin-4药物活性的检测方法，具体检测方 法如下：
包括荧光效应细胞的制备，具体步骤如下：
将含有荧光素酶基因的质粒pGL4.29和含有人源GLP-1R基因的 质粒pcDNA3.3-GLP1R共转染到以CHO-K1细胞作为受体细胞中， 筛选并获得CHO-K1/GLP1R的阳性细胞。
rExendin-4药物活性的检测，具体的方法如下：
1.1将rExendin-4药物活性参考品和rExendin-4药物供试品用 1mL超纯水溶解混匀得到rExendin-4药物活性参考品溶液和 rExendin-4药物供试品溶液，用实施例3提供的分析培养基将 rExendin-4药物活性参考品溶液和rExendin-4药物供试品溶液分别稀 释到120ng/mL；
1.2将rExendin-4药物活性参考品溶液和rExendin-4药物供试品 溶液按照3倍倍比稀释，得到120ng/mL-0.006ng/mL的10个梯度浓 度；
1.3取对数生长期的CHO-K1/GLP1R细胞，用细胞生长培养基培 养CHO-K1/GLP1R细胞，并计数培养的浓度，每孔CHO-K1/GLP1R 细胞5×104个/孔；
1.4用10个梯度浓度的rExendin-4药物活性参考品溶液和 rExendin-4药物供试品溶液分别处理CHO-K1/GLP1R细胞，每个孔 加入100μL的溶液，每个浓度分别设置三个平行孔，另外设置一个 对照组(对照组加入100μL的细胞生长培养基)；
1.5将细胞培养板于37℃、5％的二氧化碳的培养箱中培养；
1.6取出细胞培养板，在室温中平衡13min，在每个培养孔中加 入作为化学发光底物的荧光素酶发光试剂58μL；
1.7室温下，微孔振荡器上，600rpm的转震荡培养10min；
1.8通过酶标仪，测定每个孔的荧光数据；计算得到rExendin-4 药物活性参考品和rExendin-4药物供试品的EC50值；
1.9通过rExendin-4药物活性参考品和rExendin-4药物供试品的 EC50值得到rExendin-4药物供试品的活性数据。
rExendin-4药物供试品的活性数据的计算方法如下：
式中：Pr为rExendin-4药物活性参考品生物学的活性： 23000AU/mL；
Ds为rExendin-4药物供试品预稀释倍数；
Dr为rExendin-4药物活性参考品预稀释倍数；
Es为rExendin-4药物供试品相当于活性参考品EC50值的稀释倍 数；
Er为rExendin-4药物活性参考品EC50值。
实施例6
本实施例提供一种rExendin-4药物活性的检测方法，具体检测方 法如下：
包括荧光效应细胞的制备，具体步骤如下：
将含有荧光素酶基因的质粒pGL4.29和含有人源GLP-1R基因的 质粒pcDNA3.3-GLP1R共转染到以CHO-K1细胞作为受体细胞中， 筛选并获得CHO-K1/GLP1R的阳性细胞。
rExendin-4药物活性的检测，具体的方法如下：
1.1将rExendin-4药物活性参考品和rExendin-4药物供试品用 1mL超纯水溶解混匀得到rExendin-4药物活性参考品溶液和 rExendin-4药物供试品溶液，用实施例3提供的分析培养基将 rExendin-4药物活性参考品溶液和rExendin-4药物供试品溶液分别稀 释到120ng/mL；
1.2将rExendin-4药物活性参考品溶液和rExendin-4药物供试品 溶液按照3倍倍比稀释，得到120ng/mL-0.006ng/mL的10个梯度浓 度；
1.3取对数生长期的CHO-K1/GLP1R细胞，用细胞生长培养基培 养CHO-K1/GLP1R细胞，并计数培养的浓度，每孔CHO-K1/GLP1R 细胞5×104个/孔；
1.4用10个梯度浓度的rExendin-4药物活性参考品溶液和 rExendin-4药物供试品溶液分别处理CHO-K1/GLP1R细胞，每个孔 加入100μL的溶液，每个浓度分别设置三个平行孔，另外设置一个 对照组(对照组加入100μL的细胞生长培养基)；
1.5将细胞培养板于37℃、5％的二氧化碳的培养箱中培养；
1.6取出细胞培养板，在室温中平衡10min，在每个培养孔中加 入作为化学发光底物的荧光素酶发光试剂50μL；
1.7室温下，微孔振荡器上，500rpm的转震荡培养20min；
1.8通过酶标仪，测定每个孔的荧光数据；计算得到rExendin-4 药物活性参考品和rExendin-4药物供试品的EC50值；
1.9通过rExendin-4药物活性参考品和rExendin-4药物供试品的 EC50值得到rExendin-4药物供试品的活性数据。
rExendin-4药物供试品的活性数据的计算方法如下：
式中：Pr为rExendin-4药物活性参考品生物学的活性： 23000AU/mL；
Ds为rExendin-4药物供试品预稀释倍数；
Dr为rExendin-4药物活性参考品预稀释倍数；
Es为rExendin-4药物供试品相当于活性参考品EC50值的稀释倍 数；
Er为rExendin-4药物活性参考品EC50值。
实验例1
本实验例提供采用实施例6提供的rExendin-4药物活性的检测方 法对研制的rExendin-4药物制剂A和制剂B，以及rExendin-4药物 活性参考品、百泌达药物的生物活性进行检测。
具体检查方法参考实施例6；检查数据见表1。
表1样本检测检测数据
从上述表1数据以及图1可以看出，供试品rExendin-4药物的制 剂A、制剂B、百泌达与活性参考品量效曲线线性较好，相关系数达 到0.99以上，并且各组量效曲线能够很好地拟合。
实验例2
本实验例提供对重组促胰岛素分泌素rExendin-4注射液生物学 活性测定方法学验证，本实验例中，对rExendin-4注射液制剂中的加 入的甘露醇等辅料是否对对细胞以及活性有干扰，进行鉴定。
实验样品分为五个组，活性参考品组、rExendin-4注射液组、 rExendin-4注射液原液组、辅料A组(不含rExendin-4蛋白)、活性 参考辅料B组(不含rExendin-4蛋白)；按照实施例6提供的检测方 法进行检测。
专属性评价合格标准：rExendin-4空白对照组，应不呈现剂量效 应曲线，对样品活性测定无干扰；活性参考品组、制剂组和原液组化 学发光值应与样品各梯度浓度具有良好的线性关系，且线性相关系数 R2≥0.990。
从图2和图3可以看出，活性参考品组和供试品组，相对发光单 位(RLU)与样品浓度呈现良好的剂量效应关系。rExendin-4注射液 辅料和活性参考品辅料相关化学发光单位与样品浓度无剂量关系，证 明辅料对rExendin-4生物学活性测定无干扰，该方法专属性较好。
实验例3
本试验例对活性参考品及供试品的浓度范围和线性关系的置信 区间进行验证。
取rExendin-4活性参考品、rExendin-4药物原液和rExendin-4药 物制剂A分别梯度稀释，360ng/ml、120ng/ml、40ng/ml、13.333ng/ml、 4.444ng/ml、1.481ng/ml、0.494ng/ml、0.164ng/ml、0.055ng/ml、 0.018ng/ml、0.006ng/ml、0.002ng/ml、0.0007ng/ml、0.00023ng/ml 共12个稀释度，以RLU为纵坐标，样品浓度为横坐标，通过Softmax 软件进行四参数分析。验证在该浓度梯度下与细胞所产生效应的线性 相关性。验证结果见表2和图4。
表2荧光值与浓度效应曲线
线性和范围合格标准：四参数拟合曲线的线性相关系数R2≥ 0.990。从表2和图4可以看出，在药物选择的浓度范围内，药物浓 度和荧光效应具有良好线性关系，且R2≥0.990。说明选择将rExendin-4活性参考品、rExendin-4药物供试品的浓度范围选择在120ng/mL的范围得到的检测结果是比较可信的。
实验例4
本实验例对检测方法的准确性进行了验证。将rExendin-4活性参 考品分别与rExendin-4药物原液和rExendin-4药物注射液等体积混 合，然后分别测定混合前后的rExendin-4药物原液和rExendin-4药物 注射液的生物学活性。具体数据见表3。
表3 rExendin-4药物原液和rExendin-4药物注射液回收率
结果如表3所示，经计算，rExendin-4药物原液和rExendin-4药 物注射液回收率分别为：91.54％和104.58％，回收率在80％～120％ 的标准范围内，说明该方法的准确度高。
实验例5
本实验例对rExendin-4药物原液和rExendin-4药物注射液的精密 度进行验证。
首先对rExendin-4药物原液和rExendin-4药物注射液的实验结果 重复性进行验证。分别测定rExendin-4药物原液和rExendin-4药物注 射液6次的生物学活性数据，并对rExendin-4药物原液和rExendin-4 药物注射液6次的数据分析。具体数据见表4。
表4rExendin-4药物原液和rExendin-4药物注射液重复实验结果
从表4的rExendin-4药物原液和rExendin-4药物注射液6次重复 实验结果可以看出，注射液活性测定结果的CV％为14.21％；原液活 性测定结果的CV％为10.47％，符合标准(CV％≤30％)，说明该方 法的重复性好。
对rExendin-4药物原液和rExendin-4药物注射液的中间精密度进 行验证。具体结果如表5所示。
表5中间精密度结果
从表5的数据可以看出，经计算，rExendin-4注射液活性测定结 果的CV％＝12.04％＜30％；rExendin-4原液活性测定结果的 CV％＝16.29％＜30％，方法重复性较好。
精密度综合评价
结合重复性、中间精密度考察结果，统计12份数据结果，具体 数据见表6。
表6精密度分析结果
从表6的数据可以看出，经计算，RSD均小于2.0％，该方法精 密度良好。使用F-检验的方法对该方法的精密度进行分析：rExendin-4 注射液生物学活性的检测结果经统计，得F＝S12/ S22＝3217042/2357192＝1.86<5.05(F0)；rExendin-4原液生物学活性的 检测结果经统计，得F＝S12/S22＝3535692/2359822＝2.24 <5.05(F0)。方法的重复性和中间精密度之间无显著性差异，证明该方 法具有较好的精密度。
综上所述，本发明实施例提供的rExendin-4药物活性的检测试剂 盒可以方便检测，使用该检测试剂盒应用于检测的检测方法，具有操 作简单、步骤简略，检测结果重复性好，结果可靠，且精密度较高的 特点；具有较高的实用性和较高的推广应用价值。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施 例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范 围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本 领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种rExendin-4药物活性的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括细胞生长培养基、分析培养基、质量分数为28％-33％的BSA溶液和化学发光剂。
2.根据权利要求1所述rExendin-4药物活性的检测试剂盒，其特征在于，所述细胞生长培养基包括DMEM/F12培养基、9％-12％的FBS溶液和120-130μg/mL的潮霉素B溶液，所述分析培养基包括DMEM/F12培养基、0.22％-0.28％的FBS溶液和0.4％-0.7％的BSA溶液。
3.根据权利要求2所述rExendin-4药物活性的检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光剂为荧光素酶发光试剂。
4.如权利要求1-3任一项所述rExendin-4药物活性的检测试剂盒在rExendin-4药物活性的检测中的应用。
5.一种rExendin-4药物活性的检测方法，其特征在于，包括：
将rExendin-4活性参考品和rExendin-4供试品分别使用分析培养基溶解，然后进行倍比稀释，分别处理荧光效应细胞并培养，得到荧光反应细胞；
将所述荧光反应细胞进行室温平衡后与化学发光剂进行振荡反应，测定所述荧光反应细胞的荧光数据；
通过所述荧光数据得到所述rExendin-4活性参考品和所述rExendin-4供试品半数有效浓度值；
通过所述rExendin-4活性参考品和所述rExendin-4供试品半数有效浓度值计算得到所述rExendin-4供试品的活性数据。
6.根据权利要求5所述rExendin-4药物活性的检测方法，其特征在于，包括荧光效应细胞的制备，包括将GLP-1R基因和荧光素酶基因导入受体细胞，制得所述荧光效应细胞。
7.根据权利要求6所述rExendin-4药物活性的检测方法，其特征在于，所述受体细胞为CHO-K1细胞、Hela细胞、胰岛细胞、293细胞和HepG2细胞中的一种。
8.根据权利要求5所述rExendin-4药物活性的检测方法，其特征在于，处理所述荧光效应细胞前包括将所述荧光效应细胞进行铺板，所述铺板的密度为2×103个/孔-5×104个/孔。
9.根据权利要求5所述rExendin-4药物活性的检测方法，其特征在于，所述室温平衡的时间为8-13min。
10.根据权利要求5所述rExendin-4药物活性的检测方法，其特征在于，所述化学发光剂的加入量为43-58μL/孔，所述振荡反应的条件为450-600rpm，反应10-35min。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102649947A (zh) * 2012-04-20 2012-08-29 无锡和邦生物科技有限公司 一种用于测定glp-1及其功能类似物生物活性的细胞株及其应用
CN103966171A (zh) * 2014-05-29 2014-08-06 昆明贝尔吉科技有限公司 一种用于筛选肽类和非肽类glp-1类似物的细胞株及其制备方法与应用
CN104846061A (zh) * 2015-05-07 2015-08-19 中国药科大学 一种glp-1受体激动剂的受体亲和力测定方法
CN107462559A (zh) * 2017-08-16 2017-12-12 中国食品药品检定研究院 Glp‑1样化合物的生物学活性的体外检定方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102649947A (zh) * 2012-04-20 2012-08-29 无锡和邦生物科技有限公司 一种用于测定glp-1及其功能类似物生物活性的细胞株及其应用
CN103966171A (zh) * 2014-05-29 2014-08-06 昆明贝尔吉科技有限公司 一种用于筛选肽类和非肽类glp-1类似物的细胞株及其制备方法与应用
CN104846061A (zh) * 2015-05-07 2015-08-19 中国药科大学 一种glp-1受体激动剂的受体亲和力测定方法
CN107462559A (zh) * 2017-08-16 2017-12-12 中国食品药品检定研究院 Glp‑1样化合物的生物学活性的体外检定方法

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