CN105717296B - 一种抗pd-l1单克隆抗体的生物活性测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物药物活性检测领域，尤其涉及一种抗PD‑L1单克隆抗体的生物活性测定方法。本法利用PD1/PD‑L1阻断检测系统，当抗PD‑L1单克隆抗体与靶细胞表达的PD‑L1结合，阻断了PD1与PD‑L1蛋白的结合，通过信号转导激活了转录因子NFAT，启动荧光素酶的表达，其表达量与抗PD‑L1单克隆抗体的生物活性呈正相关，加入细胞裂解液和荧光素酶底物后，测定其化学发光值并绘制量效曲线，以此测定抗PD‑L1单克隆抗体生物学活性。此法操作简单，专属性强，耐用性高，对于抗PD‑L1单克隆抗体的质量控制和临床应用具有重要意义。

Description

一种抗PD-L1单克隆抗体的生物活性测定方法
技术领域
本发明涉及生物药物活性检测领域，特别涉及一种抗PD-L1单克隆抗体的生物活性测定方法。
背景技术
PD-1/PD-L1信号通路与肿瘤和病毒的免疫逃逸密切相关，是免疫治疗肿瘤和慢性传染病的重要新靶点。利用抗PD-1、PD-L1的单克隆抗体阻断PD-1/PD-L1信号通路，恢复T细胞的免疫杀伤功能，能够发挥良好的治疗效果，具有很好的应用前景。
PD-1是一种免疫共抑制分子，属于CD28家族成员，由268个氨基酸组成的Ⅰ型跨膜蛋白，定位于PDCD1基因上，它的结构主要包括胞外免疫球蛋白可变区(IgV)样结构域、疏水的跨膜区以及胞内区。胞内区包括C端和N端氨基酸残基，含有2个独立的磷酸化作用位点，分别为免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine based inhibitorymotif，ITIM)和免疫受体酪氨酸转换基序(immunoreceptor tyrosine based switch motif，ITSM)。PD-1主要表达在T细胞、B细胞、NK细胞及多种肿瘤细胞的膜表面。PD-1有2个配体，即PD-L1和PD-L2，是属于B7家族的跨膜分子，基因都定位于人染色体9p24.2。PD-L1是由290个氨基酸亚基组成的跨膜蛋白，胞外段为两个免疫球蛋白恒定区(IgC)和IgV样结构域，主要表达于成熟的CD4+T细胞、CD8+T细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞、树突状细胞等造血细胞，以及一些非造血细胞，如内皮细胞、胰岛细胞、肥大细胞等的膜表面，而且在多种肿瘤细胞均高表达PD-L1分子。PD-L2是由274个氨基酸残基组成的跨膜蛋白，与PD-L1有很高的相似性，但两者也具有一定的差异，如PD-L2的体内组织分布具有局限性，只在巨噬细胞、树突状细胞和一些B细胞亚类的膜表面表达。
PD-1/PD-L1信号通路在T细胞免疫过程中，起到重要作用。T细胞在静息状态下低表达PD-1，而激活则引起PD-1的表达上调。PD-1作为一种抑制共受体，与PD-L1相互作用后能够抑制T细胞的活性，使细胞阻滞在G0/G1期，从而抑制T细胞的增殖，阻碍其分化为浆细胞，并诱导T细胞的凋亡。这样就避免了T细胞的无限增殖，使其维持动态平衡。这种PD-1/PD-L1信号通路参与的T细胞负反馈调节作用对抗原的清除以及对维持机体的平衡起到至关重要的作用。
PD-1/PD-L1信号通路与肿瘤也有密切的关系。在肿瘤患者体内，PD-L1的高表达能够增强肿瘤的转移能力、导致患者死亡率上升。研究发现，多种肿瘤细胞高表达PD-L1，如黑素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、肾细胞癌等。肿瘤细胞在多种细胞因子的作用下高表达PD-L1，这一现象与肿瘤的免疫逃逸相关，但是在离体环境中，肿瘤细胞的PD-L1表达相对较低，表明PD-L1的表达与其所处的微环境密切相关。此外，肿瘤部位浸润性CD8+T细胞也受到肿瘤微环境的影响，PD-1的表达比外周血中的T细胞要高。当PD-1与肿瘤细胞表面的PD-L1作用，抑制T细胞的活化与增殖，使得T细胞丧失对肿瘤细胞的杀伤作用，故而引起免疫逃逸。因此，有针对性地阻断PD-1/PD-L1信号通路，能够增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
由此可见，提供一种方法来检测抗PD-1、PD-L1单克隆抗体的生物活性是必要的。生产抗PD-L1单克隆抗体，对其生物活性的检测则是一项必不可少的工作。近几年报告基因法发展迅速，尤其在生物学领域的运用上，是其他检测方法不能比拟的。萤火虫荧光素酶在报告基因法上的使用，更是拓宽了其在生物学领域上的运用。萤火虫荧光素酶是一类能够催化不同底物发生氧化作用并伴随发出生物荧光的酶，其检测速度快，灵敏度高、稳定性好、线性范围广等优点，具有其他报告基因无可替代的优势。
利用荧光素酶报告基因法所构建的细胞筛选模型，建立抗PD-L1单克隆抗体生物活性测定方法，从而对其进行评价和筛选，可作为此类药物早期研发与筛选过程中的一种有效措施。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种抗PD-L1单克隆抗体的生物活性测定方法。该方法基于荧光素酶报告基因法，通过因素考察与优化，建立了一种抗PD-L1单克隆抗体生物活性测定方法，可用于抗PD-L1单克隆抗体的快速评价与筛选。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了PD1细胞和PD-L1细胞在检测抗PD-L1单克隆抗体的生物活性中的应用。
本法利用PD1/PD-L1阻断检测系统，本检测系统的工具细胞株为转染细胞株，即分别转染荧光素酶基因luc和PD-L1基因，作为抗PD-L1单克隆抗体生物学活性检测的靶细胞和效应细胞。当抗PD-L1单克隆抗体与靶细胞表达的PD-L1结合，阻断了PD1与PD-L1蛋白的结合，通过信号转导激活了转录因子NFAT，启动荧光素酶的表达，其表达量与抗PD-L1单克隆抗体的生物活性呈正相关，加入细胞裂解液和荧光素酶底物后，测定其化学发光值并绘制量效曲线，以此测定抗PD-L1单克隆抗体生物学活性。此法操作简单，专属性强，耐用性高，对于抗PD-L1单克隆抗体的质量控制和临床应用具有重要意义。
在本发明的一些具体实施方案中，PD1细胞可以为CS187102-GloResponseTMNFAT-luc2/PD1 Jurkat Cell Line(PD1 cell)，PD-L1细胞可以为CS187108-PD-1Bioassay，PD-L1+CHOK1(PD-L1 cell)。两种工具细胞购于Promega公司。
本发明还提供了一种抗PD-L1单克隆抗体的生物活性的测定方法，取PD1细胞和PD-L1细胞与待测样品混合后孵育，通过荧光素酶报告基因法测定抗PD-L1单克隆抗体的生物活性；所述待测样品为抗PD-L1单克隆抗体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述PD-L1细胞的接种密度为3×105～5×105个/mL。
在本发明的一些具体实施方案中，所述PD1细胞的接种密度为1×106～4×106个/mL。
在本发明的一些具体实施方案中，所述待测样品的浓度为0g/mL～2.5×10-5g/mL。
在本发明的一些具体实施方案中，PD1细胞和PD-L1细胞与待测样品于37℃、5％CO2培养箱中培养6～8小时。
在本发明的一些具体实施方案中，所述荧光素酶报告基因法为取发光底物与孵育后的PD1细胞和PD-L1细胞与待测样品的体系混合，平衡后测定荧光强度，获得所述待测样品的EC50值。
在本发明的一些具体实施方案中，所述平衡的温度为15℃～25℃，所述平衡的时间为5～20min。
在本发明的一些具体实施方案中，所述PD-L1细胞的制备方法包括如下步骤：
步骤1：取出冻存的PD-L1细胞，将细胞快速融化复苏后，转入含有细胞生长培养基的培养瓶中，于37℃、5％CO2培养箱中培养；
步骤2：PD-L1细胞接种及培养：取处于对数生长期的PD-L1细胞，加0.25％胰蛋白酶(gibco 25200-056)1mL消化3～5min、230xg，离心5min，将细胞稀释至3×105～5×105个/mL；
所述PD1细胞的制备方法包括如下步骤：
步骤a：取出冻存的PD1细胞，将细胞快速融化复苏后，转入含有细胞生长培养基的培养瓶中，于37℃、5％CO2培养箱中培养；
步骤b：PD1细胞的培养：取处于对数生长期的PD1细胞，170xg，离心5min，将细胞稀释至1×106～4×106个/mL；
所述待测样品的制备方法为：配制待测样品溶液，通过BCA法测定其浓度，以含有2％FBS的RPMI 1640培养基对待测样品按倍比依次稀释，稀释梯度为10～11个；待测样品的浓度范围为0g/mL～2.5×10-5g/mL。
在本发明的一些具体实施方案中，所述测定方法包括如下步骤：
步骤1：取所述PD-L1细胞接种于96孔板，接种密度为每孔3×104～5×104个，于37℃、5％CO2培养箱中培养；将最大浓度为2.5×10-5g/mL，2.5倍稀释的待测样品和1×106～4×106个/mL的PD1细胞，以每孔40μL加至96孔板中，每个待测样品的浓度设置3个平行复孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养6～8h；
步骤2：荧光素酶与化学发光底物作用：将发色底物(Promega G7940)以每孔80μL加至上述孵育后的96孔板中，于20℃±5℃平衡5～20min；
步骤3：荧光强度测定：各孔的荧光强度，以相对光单位(RLU)表示；
步骤4：数据处理：以所述待测样品浓度的对数值(Log[M])为横坐标，以诱导倍数(FI＝RLUAb dilution/RLUno antibody control)为纵坐标绘制量效曲线；使用软件GraphPad Prism6.0对量效曲线进行四参数拟合，获得所述待测样品的半数有效浓度(EC50)。
本发明提供了一种抗PD-L1单克隆抗体生物活性测定方法。本发明基于荧光素酶报告基因法，通过因素考察与优化，建立了一种抗PD-L1单克隆抗体生物活性测定方法，可用于抗PD-L1单克隆抗体的快速评价与筛选。本方法的精密度和准确度较高，同时专属性强，耐用性良好，可用于测定抗PD-L1单克隆抗体的生物活性，以实现对该类药物的快速评价与筛选。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示不同批次的抗PD-L1单克隆抗体的生物活性测定的拟合曲线；
图2示抗PD-L1单克隆抗体的生物活性测定的方法学验证中的专属性考察所得的拟合曲线；其中，图2.1是CHO/PD-L1细胞专属性实验；图2.2是Jurkat/PD1细胞专属性实验；图2.3是抗PD-L1单克隆抗体专属性实验；
图3示抗PD-L1单克隆抗体的生物活性测定的方法学验证中的线性与范围考察所得的拟合曲线；
图4示抗PD-L1单克隆抗体的生物活性测定的方法学验证中的准确度考察所得的拟合曲线；
图5示抗PD-L1单克隆抗体的生物活性测定的方法学验证中的耐用性考察所得的拟合曲线——细胞密度考察实验，包括效靶比实验和效应细胞密度考察实验；其中，图5(a1、a2)示效靶比实验，其中a1是以相对光单位为y轴，a2是以诱导倍数为y轴；图5(b1、b2)示效应细胞密度实验，其中b1是以相对光单位为y轴，b2是以诱导倍数为y轴；
图6示抗PD-L1单克隆抗体的生物活性测定的方法学验证中的耐用性考察所得的拟合曲线——抗PD-L1单克隆抗体浓度梯度与稀释倍数考察实验；其中，图6(a)示最大浓度为20μg/mL，稀释倍数为2倍；图6(b)示最大浓度为25μg/mL，稀释倍数为2.5倍；图6(c)示最大浓度为30μg/mL，稀释倍数为3倍；图6(d)示最大浓度为40μg/mL，稀释倍数为4倍；
图7示抗PD-L1单克隆抗体的生物活性测定的方法学验证中的耐用性考察所得的拟合曲线——抗PD-L1单克隆抗体与细胞作用时间，即诱导时间考察实验；图7(a、b)示诱导时间实验，其中a是以相对光单位为y轴，b是以诱导倍数为y轴；
图8示抗PD-L1单克隆抗体的生物活性测定的方法学验证中的耐用性考察所得的拟合曲线——发色底物与细胞作用时间考察实验；图8(a、b)示发色底物与细胞作用时间实验，其中a是以相对光单位为y轴，b是以诱导倍数为y轴；
图9示抗PD-L1单克隆抗体的生物活性测定的方法学验证中的耐用性考察所得的拟合曲线——不同细胞代数对测定结果影响。
具体实施方式
本发明公开了一种抗PD-L1单克隆抗体的生物活性测定方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明是通过以下技术方案实现的：
利用工具细胞株PD1细胞和PD-L1细胞，测定抗PD-L1单克隆抗体生物活性的实验步骤如下：
(1)两种工具细胞的复苏培养:
从液氮罐取出冻存的PD1细胞和PD-L1细胞，将细胞快速融化复苏后，转入含有细胞生长培养基的培养瓶中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(2)PD-L1细胞接种及培养:
取处于对数生长期的PD-L1细胞，加0.25％胰蛋白酶(gibco 25200-056)1mL消化3-5分钟、230xg，离心5分钟，将细胞稀释至3×105-5×105个/mL，然后接种于96孔板，接种密度为每孔3×104-5×104个，于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)待测样品溶液的配制及稀释：
配制待测样品溶液，通过BCA法测定其浓度，以含有2％FBS的RPMI1640培养基对待测样品按倍比依次稀释，稀释梯度为10-11个。待测样品的浓度范围为0g/mL-2.5×10-5g/mL。
(4)PD1细胞准备
取处于对数生长期的PD1细胞，170xg，离心5分钟，将细胞稀释至1×106-4×106个/mL。
(5)添加待测样品和接种PD1细胞
将最大浓度为2.5×10-5g/mL，2.5倍稀释的的待测样品和PD1细胞，以每孔40微升加至96孔板中，每个待测样品的浓度设置3个平行复孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养6-8小时。
(6)荧光素酶与化学发光底物作用:
将发色底物(Promega G7940)以每孔80μL加至上述孵育后的96孔板中，20℃±5℃下平衡5-20分钟。
(7)荧光强度测定:
使用化学发光分析仪(200Pro，TECAN)，读取各孔的荧光强度，以相对光单位(RLU)表示。
(8)数据处理:
以所测样品浓度的对数值(Log[M])为横坐标，以诱导倍数(FI＝RLUAb dilution/RLUno antibody control)为纵坐标绘制量效曲线。使用软件GraphPad Prism6.0对量效曲线进行四参数拟合，计算样品的半数有效浓度(EC50)。
其中，步骤(1)中的细胞生长培养基是在F12基础培养基中，添加10％FBS、0.2mg/mL的潮霉素B和0.25mg/mL的G418配制而成。
其中，步骤(2)中接种于96孔板的细胞密度范围为：3×105-5×105个/mL，优选为4×105个/mL。
其中，步骤(3)中测样品的浓度范围为最高样品浓度是2.5×10-5g/mL，稀释倍数是2.5倍，共10个梯度。
其中，步骤(4)中的细胞生长培养基是在RPMI1640培养基中，添加10％FBS、0.1mg/mL的潮霉素B和0.5mg/mL的G418配制而成。
其中，步骤(4)中的PD1细胞密度为：1×106-4×106个/mL，优选为1.25×106个/mL。
其中，步骤(5)中加入的待测样品与细胞的作用时间范围为6-8小时，优选为6小时。
其中，步骤(6)中细胞经裂解后，其与化学发光底物的作用时间范围为：5-20分钟，优选为5-10分钟。
其中，步骤(8)中由数据绘制而成的量效曲线采用四参数法拟合并计算EC50值。
本发明提供了一种抗PD-L1单克隆抗体生物活性测定方法。本发明基于荧光素酶报告基因法，通过因素考察与优化，建立了一种抗PD-L1单克隆抗体生物活性测定方法，可用于抗PD-L1单克隆抗体的快速评价与筛选。本方法的精密度和准确度较高，同时专属性强，耐用性良好，可用于测定抗PD-L1单克隆抗体的生物活性，以实现对该类药物的快速评价与筛选。
本发明提供的一种抗PD-L1单克隆抗体的生物活性测定方法中所用原料及试剂均可由市场购得。其中，PD1细胞和PD-L1细胞均购自Promega公司。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1测定6批不同批次的抗PD-L1单克隆抗体的生物活性
6批不同批次的抗PD-L1单克隆抗体分别为本公司生产的抗PD-L1单克隆抗体，测定步骤如下：
(1)从液氮罐取出冻存的PD1细胞和PD-L1细胞，将细胞快速融化复苏后，转入含有细胞生长培养基的培养瓶中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(2)取处于对数生长期的PD-L1细胞，消化、离心，将细胞稀释至4×105个/mL，然后接种于96孔板，接种密度为每孔4×104个，于37℃、5％CO2培养箱中过夜培养。
(3)配制6批不同批次的抗PD-L1单克隆抗体样品溶液，通过BCA法测定其浓度，以含有2％FBS的RPMI 1640培养基对待测样品按2.5倍比依次稀释，稀释梯度为10个，待测样品最高浓度为2.5×10-5g/mL。
(4)取处于对数生长期的PD1细胞，离心，将细胞稀释至1.25×106个/mL。
(5)将不同浓度的6批不同批次的抗PD-L1单克隆抗体样品和PD1细胞，以每孔40微升加至96孔板中，每个待测样品的浓度设置3个平行复孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养6h。
(6)将发色底物以每孔80μL加至上述孵育后的96孔板中，室温下平衡5-10分钟。
(7)使用化学发光分析仪(200Pro，TECAN)，读取各孔的荧光强度，以相对光单位(RLU)表示。
(8)数据处理:以所测样品浓度的对数值(Log[M])为横坐标，以诱导倍数(FI＝RLUAb dilution/RLUno antibody control)为纵坐标绘制量效曲线。使用软件GraphPad Prism6.0对量效曲线进行四参数拟合，计算样品的半数有效浓度(EC50)。
结果如图1所示，本法测得抗PD-L1单克隆抗体(Anti-PD-L1 body1-6)的半数有效浓度(EC50)的范围在2.589e-007g/mL～3.322e-007g/mL之间(分别为：3.322e-007g/mL、2.786e-007g/mL、3.017e-007g/mL、2.877e-007g/mL、2.775e-007g/mL、2.589e-007g/mL；)，其相关系数大于0.990(分别为：1.610、1.613、1.359、1.753、1.617、1.448)。由结果可知：使用本法对抗PD-L1单克隆抗体生物活进行检测，符合一般生物制品活性检测要求，说明本法对抗PD-L1单克隆抗体生物活性的检测是可行的。
实施例2利用抗PD-L1单克隆抗体，对本方法进行方法学验证
除下述各项中的特殊说明外，实验材料、方法与实施例1中的操作基本相同。
1专属性
本实验分别考察靶细胞、效应细胞和抗PD-L1单克隆抗体的专属性。具体分别为：
1.1靶细胞专属性：效应细胞为Jurkat/PD1，抗体为抗PD-L1单克隆抗体，靶细胞分别是CHO/PD-L1、CHO/PD-L1negative cell和Dilution buffer。
1.2效应细胞专属性：靶细胞为CHO/PD-L1，抗体为抗PD-L1单克隆抗体，效应细胞分别是Jurkat/PD1、Jurkat/PD1 negative cell和Dilution buffer。
1.3抗PD-L1单克隆抗体专属性：靶细胞为CHO/PD-L1，效应细胞为Jurkat/PD1，抗体分别为：抗PD-L1单克隆抗体、HER2和Dilution buffer。
结果如图2所示：
图2.1为靶细胞专属性，由图可知：当效应细胞为Jurkat/PD1，抗体为抗PD-L1单克隆抗体，靶细胞为CHO/PD-L1时，随着抗PD-L1单克隆抗体的浓度梯度的变化，其相对光单位也发生变化，并显示出了量效关系；当靶细胞为CHO/PD-L1 negative cell和Dilutionbuffer时，效应细胞、抗PD-L1单克隆抗体和靶细胞之间没有量效关系。
图2.2为效应细胞专属性，由图可知：当靶细胞为CHO/PD-L1，抗体为抗PD-L1单克隆抗体，效应细胞为Jurkat/PD1时，随着抗PD-L1单克隆抗体的浓度梯度的变化，其相对光单位也发生变化，并显示出了量效关系；当效应细胞为Jurkat/PD1 negative cell和Dilution buffer时，效应细胞、抗PD-L1单克隆抗体和靶细胞之间没有量效关系。
图2.3为抗PD-L1单克隆抗体专属性，本专利选择HER2抗体作为抗PD-L1单克隆抗体的参比品。由图可知：当靶细胞为CHO/PD-L1，效应细胞为Jurkat/PD1，抗体为抗PD-L1单克隆抗体时，随着抗PD-L1单克隆抗体的浓度梯度的变化，其相对光单位也发生变化，并显示出了量效关系；当抗体为HER2和Dilution buffer时，效应细胞、抗PD-L1单克隆抗体和靶细胞之间没有量效关系。
综上，由图2可见，抗PD-L1单克隆抗体生物活性检测实验的成功依赖于专属的靶细胞CHO/PD-L1、效应细胞Jurkat/PD1及抗PD-L1单克隆抗体的共同存在。
2线性与范围
配制浓度为25μg/mL的抗PD-L1单克隆抗体溶液，以含2％FBS的RPMI1640培养基按2.5倍倍比对其稀释至10个浓度梯度。
结果如图3所示，所拟合的抗PD-L1单克隆抗体量效曲线呈典型的“S”型。用GraphPad Prism 6.0非线性四参数拟合而得到的曲线为：Y＝(A1-A2)/(1+(X/C)^B)+A2。其中：A1：曲线上渐近线估值即最大诱导倍数(3.949)；B:曲线的斜率(1.314)；C:最大有效量一半时所对应的浓度(3.041e-007g/mL)；A2：曲线下渐近线估值即最小诱导倍数(1.032)。
3精密度
3.1重现性
根据本发明内容中具体步骤及线性与范围要求，配制6分相同的抗PD-L1单克隆抗体溶液，测定并计算每份样品的EC50和RSD值。
表1本方法的重复性验证实验结果
结果计算所得6份样品的EC50值在2.677e-007g/mL-3.389e-007g/mL之间，其相关系数大于0.990，RSD为7.802％，RSD≤20％，符合一般生物制品活性检测精密度要求，表明该方法重复性良好。
3.2中间精密度
由3名人员分别在第1、2、3天测定，每人每次测定3分相同的抗PD-L1单克隆抗体样品，计算每份样品的EC50和RSD值。
表2本方法的中间精密度验证实验结果
结果9份样品所测得的EC50值在2.846e-007g/mL-3.379e-007g/mL之间，其相关系数大于0.990，RSD为6.204％，表明该方法的中间精密度良好。
4准确度
在本方法下，比较抗PD-L1单克隆抗体对照品和供试品的量效曲线并计算EC50和相对效价。
结果如图4所示，抗PD-L1单克隆抗体对照品和供试品的剂量效应曲线具有平行性，且抗PD-L1单克隆抗体对照品和供试品的EC50值在为：2.392e-007g/mL-2.505e-007g/mL之间；R平方值大于0.990；相对效价：与对照品相比，Anti-PD-L1 body-1的相对效价为105％，而Anti-PD-L1 body-2的相对效价为104％，样品相对结合活性应不低于对照品的60％，表明该方法的准确度良好。
5耐用性
本实验分别考察不同细胞密度；不同抗体浓度梯度与稀释倍数；抗体作用不同时间(诱导时间)；发色底物与细胞不同作用时间；不同细胞代数对测定结果影响。具体分别为：
5.1不同细胞密度：a:主要考察效靶比，即1：0.25，1：0.5，1：1，1：1.25，1：2.5，1：5；b:主要考察效应细胞密度，即1×105-6×105。
5.2不同抗体浓度梯度与稀释倍数：主要考察不同抗体浓度梯度，即最大浓度分别为20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、40μg/mL；稀释倍数为2倍、2.5倍、3倍和4倍。
5.3抗体作用不同时间(诱导时间)：主要考察不同诱导时间，即2h、4h、6h、8h、24h。
5.4发色底物与细胞不同作用时间：主要考察发色底物与细胞不同作用时间，即0min、5min、10min、30min。
5.5不同细胞代数：主要考察不同细胞代数对测定结果影响，本实验第一次实验靶细胞为4代，效应细胞为8代；第二次实验靶细胞为25代，效应细胞为28代。
具体结果如下:
图5考察效靶比和效应细胞密度，由图a1、a2可知，最适效靶比为1：1.25；由图b1、b2可知，最适效应细胞密度为3×105-5×105个/mL。
图6考察抗体的浓度梯度与稀释倍数，由图M1、M2、M3和M4可知，图M2即抗体最大浓度为25μg/mL，稀释倍数为2.5倍，符合标准“S”型曲线要求。
图7考察诱导时间，由图a和b可知，最适诱导时间为6-8h。
图8考察发色底物与细胞作用时间，由图a和b可知，随着发色底物与细胞作用时间变长，其在同一浓度下的相对光单位越小，说明发色底物在反应过程中发生了荧光猝灭现象。故选择发色底物与细胞作用时间为5-10min。
图9考察细胞代数对测定结果影响，由图可知，第一次实验其EC50值为：2.634e-007g/mL，R平方值为0.990；第二次实验其EC50值为：2.547e-007g/mL，R平方值为0.994。其第二次实验的相对效价是第一次实验的96.70％，说明细胞的耐用性良好。
综上所述，本方法的精密度和准确度较高，符合《生物制品质量控制分析方法验证技术一般原则》的要求；同时专属性强，耐用性良好，可用于抗PD-L1单克隆抗体的生物活性测定，实现该类药物的快速评价与筛选。
对比例
分别用本法和ELISA间接法测定相同批次的抗PD-L1单克隆抗体生物活性，本次实验采用1批抗PD-L1单克隆抗体，独立重复实验3次；本法实验步骤同实施例，ELISA间接法测定步骤如下：
1、用磷酸盐缓冲液将重组人PD-L1/His(Sino Biological 10084-H08H)稀释为0.5μg/ml，每孔100μl，2-8℃包被过夜；
2、洗板后，用300μl/孔1％的Casein(Sigma C6854)磷酸盐缓冲液在20℃±5℃条件下，用Abson MicBio-II酶标板恒温振荡器170rpm震摇封闭2小时；
3、洗板后，用1％Casein-PBS将抗PD-L1单克隆抗体稀释至1000ng/ml，5×稀释至浓度为200ng/ml，40ng/ml，8ng/ml，1.6ng/ml，0.32ng/m和0.064ng/ml，用稀释液做阴性对照，100μl/孔，每个浓度3个复孔，在20℃±5℃条件下，用Abson MicBio-II酶标板恒温振荡器170rpm震摇1小时；
4、洗板后，用1％Casein-PBS按1:10000的比例稀释羊抗人IgG-Fc-HRP(BethylA80-104P)，100μl/孔，在20℃±5℃条件下，用Abson MicBio-II酶标板恒温振荡器170rpm震摇1小时；
5、洗板后，加入100μl/孔TMB显色液(BD 555214)，在20℃±5℃条件下避光放置10分钟；
6、加入100μl/孔1N H2SO4终止反应，450nm测定吸光度；
7、以浓度(X轴)对0D450nm(Y轴)四参数logistic拟合(R2≥0.99)。
表3萤火虫荧光素酶报告基因法与ELISA间接法比较
结果如表3所示，同1批次抗PD-L1单克隆抗体，本法测得的相对效价分别为103％、97％和101％；而ELISA间接法所测相对效价分别为77％、126％和82％且相关系数大于0.990。由结果可知：使用本法对抗PD-L1单克隆抗体生物活进行检测在灵敏度、稳定性和重现性上优于ELISA间接法。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.PD1细胞和PD-L1细胞在检测抗PD-L1单克隆抗体的生物活性中的应用；所述PD1细胞转染荧光素酶基因luc和PD1基因，所述PD-L1细胞转染PD-L1基因。
2.一种抗PD-L1单克隆抗体的生物活性的测定方法，其特征在于，取PD1细胞和PD-L1细胞与待测样品混合后孵育，通过荧光素酶报告基因法测定抗PD-L1单克隆抗体的生物活性；所述待测样品为抗PD-L1单克隆抗体；
所述PD1细胞转染荧光素酶基因luc和PD1基因，所述PD-L1细胞转染PD-L1基因。
3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述PD-L1细胞的接种密度为3×105～5×105个/mL。
4.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述PD1细胞的接种密度为1×106～4×106个/mL。
5.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述待测样品的浓度为0g/mL～2.5×10-5g/mL。
6.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，PD1细胞和PD-L1细胞与待测样品于37℃、5％CO2培养箱中培养6～8小时。
7.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述荧光素酶报告基因法为取发光底物与孵育后的PD1细胞和PD-L1细胞与待测样品的体系混合，平衡后测定荧光强度，获得所述待测样品的EC50值。
8.根据权利要求7所述的测定方法，其特征在于，所述平衡的温度为15℃～25℃，所述平衡的时间为5～20min。
9.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述PD-L1细胞的制备方法包括如下步骤：
步骤1：取出冻存的PD-L1细胞，将细胞快速融化复苏后，转入含有细胞生长培养基的培养瓶中，于37℃、5％CO2培养箱中培养；
步骤2：PD-L1细胞接种及培养：取处于对数生长期的PD-L1细胞，加0.25％胰蛋白酶1mL消化3～5min、230xg，离心5min，将细胞稀释至3×105～5×105个/mL；
所述PD1细胞的制备方法包括如下步骤：
步骤a：取出冻存的PD1细胞，将细胞快速融化复苏后，转入含有细胞生长培养基的培养瓶中，于37℃、5％CO2培养箱中培养；
步骤b：PD1细胞的培养：取处于对数生长期的PD1细胞，170xg，离心5min，将细胞稀释至1×106～4×106个/mL；
所述待测样品的制备方法为：配制待测样品溶液，通过BCA法测定其浓度，以含有2％FBS的RPMI 1640培养基对待测样品按倍比依次稀释，稀释梯度为10～11个；待测样品的浓度范围为0g/mL～2.5×10-5g/mL。
10.根据权利要求2至9任一项所述的测定方法，其特征在于，所述测定方法包括如下步骤：
步骤1：取所述PD-L1细胞接种于96孔板，接种密度为每孔3×104～5×104个，于37℃、5％CO2培养箱中培养；将最大浓度为2.5×10-5g/mL，2.5倍稀释的待测样品和1×106～4×106个/mL的PD1细胞，以每孔40μL加至96孔板中，每个待测样品的浓度设置3个平行复孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养6～8h；
步骤2：荧光素酶与化学发光底物作用：将发色底物以每孔80μL加至上述孵育后的96孔板中，于20℃±5℃平衡5～20min；
步骤3：荧光强度测定：各孔的荧光强度，以相对光单位表示；
步骤4：数据处理：以所述待测样品浓度的对数值Log[M]为横坐标，以诱导倍数FI为纵坐标绘制量效曲线，FI＝RLUAb dilution/RLUno antibody control；对量效曲线进行四参数拟合，获得所述待测样品的半数有效浓度。
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