TWI598585B - 利用泛素檢測生物毒性的方法 - Google Patents
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Description
本發明係有關於一種利用泛素檢測生物毒性的方法，尤其係指將待檢測物質與帶有螢光泛素融合蛋白(fluorescent-ubiquitin fusion protein)的原核生物，於特定條件下培養一段時間，並檢測螢光強度之方法；藉此，本方法可快速得知待檢測物質是否具有生物毒性。
舉凡直接或間接施予人體之物質，皆須經過生物毒性(biological toxicity)測試，以了解對於人體是否具有傷害。目前用以檢測生物毒性的主要方法包括以老鼠及兔子等實驗動物做為測試對象，並由實驗動物之組織或器官反應，藉以判斷當該等物質施用於人體時是否造成不良影響。然而，使用實驗動物進行生物毒性測試非常昂貴，且耗費時間較長。因此，亦有利用以細胞為主的分析方式，例如細胞存活度分析法(Cell viability assay)，其係藉由將天然或人工合成的化合物等待檢測物質處理細胞一段時間，再觀察待檢測物質對於細胞是否造成增殖或毒殺等影響，藉以判斷是否具有生物毒性。
目前細胞存活度分析法雖然已廣泛地被採納為主要檢測生物毒性之方法，但此分析法仍需耗費多日先將細胞培養至一定的細胞密度才能用以檢測，且相較於原核生物(prokaryotes)培養，細胞培養較容易受到汙染，故此方法於使用上仍有其限制。有鑒於上述缺失，已有相關發明轉為利用原核生物取代習知常用之實驗動物或細胞，舉例而言，中華民國專利公告第TWI510628 (B)號即揭示一種「以乳酸菌快篩酸性廢棄液生物毒性之方法」，係包含：一培養步驟，將一乳酸菌培養於一培養液中，以製備成一乳酸菌液，取10 ml之酸性廢棄液添加於10 ml之培養液中，並在其中添加0.5 ml之乳酸菌液，維持乳酸菌菌數為10
8以上，以成一待檢測液；及一檢測步驟，持續培養乳酸菌液及待檢測液，且於持續培養過程中，分別計數並比較乳酸菌液及待檢測液之生長菌數，以由待檢測液之生長菌數相對乳酸菌液之生長菌數的減少趨勢作為生物毒性快篩之依據，藉此能夠於短時間內完成重金屬含量之檢測判定，提升檢測廢棄液生物毒性之時效性，並提供資訊判斷廢棄液是否需再次處理以免在環境中危害人體；然而，上述方法僅適用於檢測酸性廢棄液之生物毒性，且其主要係藉由計數並比較乳酸菌的生長菌數檢測酸性廢棄液是否含有過量重金屬，因此並不適用於檢測一般非含有重金屬之待檢測物質，如植物萃取物、化學合成之化合物、食品等等。
另，中國專利公告第CN 101071103 B號「檢測鮮肉鮮奶食品綜合毒性的方法」，其主要係藉由在特定的條件下，淡水發光細菌-青海弧菌Q67菌株的發光強度會隨外界毒物的含量而改變，用以檢測鮮肉鮮奶食品的綜合毒性，具體而言，其方法包括(a)準備發光細菌，(b)將鮮肉食品樣品的浸出液或鮮奶食品的樣品與青海弧菌Q67菌株的菌液混合均勻，以及(c)檢測青海弧菌Q67菌株的發光強度，以判定所測的鮮肉鮮奶食品的樣品中所有毒物合在一起的綜合毒性，給出所測的鮮肉鮮奶食品可否安全食用的結論；然而，上述方法每次檢測時，皆需要取已知符合標準的對照樣品與待測樣品進行比較，檢測方法較為複雜。
爰此，如何發展更佳的生物毒性檢測方法，以廣泛地適用於不同待檢測物質之檢測，且能快速並準確的判斷待檢測物質是否具有生物毒性，乃相關領域發明人所思及之方向。
今，發明人即是鑑於上述現有檢測生物毒性方法於實際實施使用時仍具有多處缺失，於是乃藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐，而加以改善，並據此研創出本發明。
本發明主要目的為提供一種可快速檢測生物毒性的方法，其係以特定條件先培養帶有螢光泛素融合蛋白的原核生物，再將待檢測物質與原核生物於特定條件下培養一段時間，並檢測螢光強度之方法；藉此，本方法可快速得知待檢測物質是否具有生物毒性。
為了達到上述實施目的，本發明一種利用泛素檢測生物毒性的方法，其包括：步驟一：建構一帶有核苷酸序列SEQ ID:NO1之一原核生物，以形成一表現螢光泛素融合蛋白質(fluorescent-ubiquitin fusion protein)之重組原核生物；步驟二：將重組原核生物於溫度25-37℃下培養一第一作用時間；步驟三：將重組原核生物於溫度0-20℃下培養一第二作用時間；步驟四：將一待檢測物質與重組原核生物於溫度0-20℃下共同培養一第三作用時間；以及步驟五：偵測螢光強度。
於本發明之一實施例中，步驟一係將核苷酸序列SEQ ID:NO1接合至一載體(vector)以建構重組原核生物，且載體(vector)可例如為T&A選殖載體。
於本發明之一實施例中，螢光泛素融合蛋白質之螢光發射波長(emission wavelength)係介於380nm至700nm。
於本發明之一實施例中，原核生物係格蘭氏陰性菌或格蘭氏陽性菌，其中格蘭氏陰性菌可例如為大腸桿菌(
Escherichia coli)。
於本發明之一實施例中，第一作用時間與第二作用時間可例如為12-24小時，以及第三作用時間可例如為1-6小時。
於本發明之一實施例中，待檢測物質可例如為植物萃取物、化學合成之化合物或者食品。
藉此，本發明利用特定培養條件(包含培養溫度與培養時間)建立所得之重組原核生物可穩定表現螢光泛素融合蛋白質，且可進一步用於檢測植物萃取物、人工合成之化合物或者食品是否具有生物毒性。
本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示之結構，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。
泛素－蛋白酶體系統（ubiquitin-proteasome system，UPS）在真核生物(eukaryote)細胞內大多數的蛋白質降解(degradation)扮演重要角色，發明人在進行相關研究時，發現帶有螢光泛素融合蛋白質(fluorescent-ubiquitin fusion protein)之重組原核生物，在特定條件的培養條件下，不僅能穩定並大量地表達螢光泛素融合蛋白質，且其對於生物毒性具有極高的靈敏度，因此將此特性研發為一種檢測生物毒性的方法，以達到快速檢測各種待檢測物質是否具有生物毒性之目的。
請參閱第一圖，本發明一種利用泛素(ubiquitin)檢測生物毒性的方法，其包括下列步驟：
步驟一(S1)：建構一帶有核苷酸序列SEQ ID:NO1之一原核生物，以形成一表現螢光泛素融合蛋白質之重組原核生物，較佳而言，可將核苷酸序列SEQ ID:NO1接合至一T&A選殖載體(vector)以建構重組原核生物，螢光泛素融合蛋白質之螢光發射波長(emission wavelength)可例如介於380nm至700nm；又，原核生物可例如選自格蘭氏陰性菌或格蘭氏陽性菌，較佳而言，原核生物可例如為大腸桿菌；
步驟二(S2)：將重組原核生物於溫度25-37℃下培養一第一作用時間；
步驟三(S3)：將重組原核生物於溫度0-20℃下培養一第二作用時間；
步驟四(S4)：將一待檢測物質與重組原核生物於溫度0-20℃下共同培養一第三作用時間，其中第一作用時間可例如為12-24小時，第二作用時間可例如為12-24小時，以及第三作用時間可例如為1-6小時；以及
步驟五(S5)：偵測螢光強度，藉由螢光強度以得知待檢測物質是否具有生物毒性；較佳而言，待檢測物質可例如為植物萃取物、化學合成之化合物、食品。
此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。
實施例
一
：
利用習知細胞
檢測法檢測生物毒性
將人類肺腺癌A549細胞以0.24x10
6的細胞密度分別加入白色非透明的24孔盤(24-well microtitre plates)的各孔中，每孔含有500 μl DMEM培養液(Cellgro, Mediatech, Inc., Manassas, VA, USA)培養24小時(37℃、5% CO
2)，其中DMEM培養液含10% (v/v) 胎牛血清、0.5 g/L葡萄糖、3.7 g/L碳酸氫鈉和0.1g/L卡那黴素/鏈黴素(kanamycin/streptomycin)；接著，根據PolyJet
TM的操作流程，於每一孔內加入1 µg 帶有泛素與黃螢光蛋白(YFP)的質體去氧核糖核酸(Ub
G76V-YFP plasmid DNA)以轉染轉染(transfect)至A549細胞中(
J Funct Foods2015 August;17:857–71)；轉染24小時之後，將各待檢測物質，包括乳胞素(lactacystin，簡稱L)、沒食子酸甲酯(methyl gallate，M) 、沒食子酸(gallic acid，G)、鞣花酸(ellagic acid，E)、單寧酸(tannic acid，T)、單寧酸+槲皮素(tannic acid plus quercetin，T+Q)、冰片(borneol，Bo)、甘草素(liquiritigenin，LG)、甘草甙(liquiritin，LQ)、異甘草素(isoliquiritigenin，ILG)、菊花、甘草、決明子，以及蓮子心，分別加入細胞內培養24小時，其中控制組為DMSO。由於各待檢測物質加入細胞後，會阻斷泛素－蛋白酶體系統(ubiquitin-proteasome system，UPS)而造成黃螢光蛋白(YFP)在細胞內累積，因此藉由顯微鏡倒立顯微鏡(Nikon ECLIPSE TE2000-U)檢測不同時間的螢光變化量，並利用Image Quant進行螢光定量分析，實驗結果請參閱第二圖。
實施例二：建構帶有螢光泛素融合蛋白質(fluorescent-ubiquitin fusion protein)之重組原核生物
利用GenTaq DNA 聚合酶(polymerase)以及如SEQ ID:NO2的正股引子(forward primer)與如SEQ ID:NO3的反股引子(reverse primer)，藉由聚合酶連鎖反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)將質體mRFP-Ub(購自Addgene；Cambridge, MA)的編碼區(coding region)基因(如SEQ ID:NO1)擴增(amplified)出來；接著，將基因接合(ligate)至T&A選殖載體(cloning vector)相對應限制酶切位上以形成一環狀重組質體；再將環狀重組質體轉形(transform)至大腸桿菌(
Escherichia coliDH5a)內表現形成重組大腸桿菌，最後篩選具有氨苄青黴素抗藥性(ampicillin-resistant)的重組殖株(clone)進行定序(sequence)確認(
J Funct Foods2014 March;7:462-70；
J Funct Foods2015 August;17:857–71)。
實施例三：利用泛素檢測生物毒性實驗I
取10 ml離心管，將帶有螢光泛素融合蛋白質mRFP-Ub的重組大腸桿菌於溫度37℃下培養20小時；再將重組大腸桿菌於溫度0-4℃下培養20小時；接著，將各待檢測物質，包括乳胞素(L)、沒食子酸甲酯(M) 、沒食子酸(G)、鞣花酸(E)、單寧酸(T)、單寧酸+槲皮素(T+Q)、冰片(Bo)、甘草素(LG)、甘草甙(LQ)、異甘草素(ILG)、菊花、甘草、決明子，以及蓮子心，分別加入2 ml含有重組大腸桿菌的LB培養液內，於溫度0-4℃共同培養3小時；最後以BioTek FL800 plate reader (Excitation wavelength : Emission wavelength = 530 nm : 590 nm)偵測螢光強度，並與未加入藥物之控制組mRFP-Ub螢光表現量進行比較。
結果請參閱第三圖，利用本案方法測得的結果與習知細胞存活度檢測法測得的結果相較下，本方法之結果當中僅冰片(Bo)組有差異，其它十三種待測物質，包括乳胞素(L)、沒食子酸甲酯(M) 、沒食子酸(G)、鞣花酸(E)、單寧酸(T)、單寧酸+槲皮素(T+Q)、甘草素(LG)、甘草甙(LQ)、異甘草素(ILG)、菊花、甘草、決明子，以及蓮子心，其測得的結果與習知方法測得的結果趨勢一致，例如沒食子酸甲酯(M)、單寧酸(T)與單寧酸+槲皮素(T+Q)測得的結果皆較控制組低。
實施例四：利用泛素檢測生物毒性實驗II
取10 ml離心管，將帶有螢光泛素融合蛋白質mRFP-Ub的重組大腸桿菌於溫度37℃下培養20小時；再將重組大腸桿菌於溫度0-4℃下培養20小時；接著，將各待檢測物質，包括乳胞素(L)、沒食子酸甲酯(M) 、沒食子酸(G)、鞣花酸(E)、單寧酸(T)、單寧酸+槲皮素(T+Q)、冰片(Bo)、甘草素(LG)、甘草甙(LQ)、異甘草素(ILG)、菊花、甘草、決明子，以及蓮子心，分別加入2 ml含有重組大腸桿菌的LB培養液內，於溫度25℃共同培養5小時；最後以BioTek FL800 plate reader (Excitation wavelength : Emission wavelength = 530 nm : 590 nm)偵測螢光強度，並與未加入藥物之控制組mRFP-Ub螢光表現量進行比較。
結果請參閱第四圖，調整重組大腸桿菌的培養溫度以及藥物與重組大腸桿菌的作用溫度後，實驗結果亦顯示類似於第三圖的趨勢，但其差異量較小。由此可知，本案方法係在特定溫度與培養時間搭配之條件下，才能達到較佳(如實施例三)做為檢測生物毒性之目的。
由上述之實施說明可知，本發明與現有技術相較之下，本發明具有以下優點:
1.本發明藉由特定培養步驟與溫度的調控，可使帶有螢光泛素融合蛋白質之重組原核生物穩定且大量地表現螢光物質，並能用以作為檢測生物毒性之方法，達到有效分析待測物質是否具有生物毒性之功目的。
2.本發明使用泛素檢測生物毒性無需經過細胞培養等繁瑣步驟，故可解決習知細胞檢測法具有培養時間長且耗費成本較高等缺失，亦達到快速分析待測物質是否具有生物毒性之功效。
3.本發明可將經由第二作用時間培養後的重組原核生物製備成檢測套組(kit)使用，故於實際實施使用時，僅需將待檢測物質與含有重組原核生物的套組共同作用約1-6小時，並偵測螢光強度，即可快速得知待測物質是否具有生物毒性。
綜上所述，本發明之利用泛素檢測生物毒性的方法，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。
惟，上述所揭之圖示及說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。
(S1)‧‧‧步驟一
(S2)‧‧‧步驟二
(S3)‧‧‧步驟三
(S4)‧‧‧步驟四
(S5)‧‧‧步驟五
第一圖：本發明其較佳實施例之步驟流程圖。
第二圖：習知使用細胞檢測生物毒性之分析圖。
第三圖：本發明其一較佳實施例之生物毒性分析圖。
第四圖：本發明其二較佳實施例之生物毒性分析圖。
＜110＞ 翠玲, 張 ＜120＞ 利用泛素檢測生物毒性的方法 ＜160＞ 3 ＜170＞ PatentIn version 3.5 ＜210＞ 1 ＜211＞ 975 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ 螢光泛素融合蛋白質 ＜223＞ mRFP-Ub的編碼區(coding region) ＜400＞ 1 gctagcacca ccatggcctc ctccgaggac gtcatcaagg agttcatgcg cttcaaggtg 60 cgcatggagg gctccgtgaa cggccacgag ttcgagatcg agggcgaggg cgagggccgc 120 ccctacgagg gcacccagac cgccaagctg aaggtgacca agggcggccc cctgcccttc 180 gcctgggaca tcctgtcccc tcagttccag tacggctcca aggcctacgt gaagcacccc 240 gccgacatcc ccgactactt gaagctgtcc ttccccgagg gcttcaagtg ggagcgcgtg 300 atgaacttcg aggacggcgg cgtggtgacc gtgacccagg actcctccct gcaggacggc 360 gagttcatct acaaggtgaa gctgcgcggc accaacttcc cctccgacgg ccccgtaatg 420 cagaagaaga ccatgggctg ggaggcctcc accgagcgga tgtaccccga ggacggcgcc 480 ctgaagggcg agatcaagat gaggctgaag ctgaaggacg gcggccacta cgacgccgag 540 gtcaagacca cctacatggc caagaagccc gtgcagctgc ccggcgccta caagaccgac 600 atcaagctgg acatcacctc ccacaacgag gactacacca tcgtggaaca gtacgagcgc 660 gccgagggcc gccactccac cggcgccaga tctcgagctc aagcttcggg ccgcatgcag 720 atcttcgtga agactctgac tggtaagacc atcaccctcg aggttgagcc cagtgacacc 780 attgagaatg tcaaggcaaa gatccaagat aaggaaggca tccctcctga ccagcagagg 840 ctgatctttg ctggaaaaca gctggaagat gggcgcaccc tgtctgacta caacatccag 900 aaagagtcca ccctgcacct ggtactccgt ctcagaggtg ggtgaggtac cgcgggcccg 960 ggatccaccg gatct 975 ＜210＞ 2 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜223＞ forward primer ＜400＞ 2 gctagcacca ccatggcct 19 ＜210＞ 3 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜223＞ reverse primer ＜400＞ 3 tagatccggt ggatcccgg 19
(S1)‧‧‧步驟一
(S2)‧‧‧步驟二
(S3)‧‧‧步驟三
(S4)‧‧‧步驟四
(S5)‧‧‧步驟五
Claims (5)
- 一種利用泛素(ubiquitin)檢測生物毒性的方法，其包括下列步驟：步驟一：建構一帶有核苷酸序列SEQ ID：NO1之一原核生物，以形成一表現螢光泛素融合蛋白質(fluorescent-ubiquitin fusion protein)之重組原核生物，其中該原核生物係大腸桿菌；步驟二：將該重組原核生物於溫度25-37℃下培養一第一作用時間；步驟三：將該重組原核生物於溫度0-20℃下培養一第二作用時間；步驟四：將一待檢測物質與該重組原核生物於溫度0-20℃下共同培養一第三作用時間，其中該待檢測物質係植物萃取物、化學合成之化合物或食品；以及步驟五：偵測螢光強度。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該步驟一係將該核苷酸序列SEQ ID：NO1接合至一載體(vector)以建構該重組原核生物。
- 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該載體(vector)為T&A選殖載體。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該螢光泛素融合蛋白質之螢光發射波長(emission wavelength)係介於380nm至700nm。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該第一作用時間係12-24小時，該第二作用時間係12-24小時，以及該第三作用時間係1-6小時。
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Family Applications (1)
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Chang TL et al,"Phenolic compounds stage an interplay between the ubiquitin–proteasome system and ubiquitin signal autophagic degradation for the ubiquitin-based cancer chemoprevention.", J Funct Foods 2015 August;17:857–71. 袁秋英等人，"生物感測器檢測環境汙染物之研發與應用"，農政與農情，98年7月(第205期)，第83-87頁 * |
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| 石婕等人，"用一種新方法檢測尼古丁減輕魚藤酮對UPS的毒性"，西安交通大學學報，2014年1月第35卷第1期，第132-138頁 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW201809666A (zh) | 2018-03-16 |
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