WO2023163087A1 - 抗変異ｃａｌｒ抗体と他の薬剤とを組み合わせてなる医薬 - Google Patents

抗変異ｃａｌｒ抗体と他の薬剤とを組み合わせてなる医薬 Download PDF

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antibody
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amino acid
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則夫 小松
陽治 石田
真理人 荒木
敏行 土屋
翼 近田
美沙 今井
弘志 深澤
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学校法人順天堂
Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ株式会社
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans

Definitions

  • the present invention relates to a drug that combines an antibody or functional fragment thereof with specificity for a mutant CALR protein and another drug.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 In some patients with Philadelphia chromosome-negative myeloproliferative neoplasms (MPNs), base deletions and insertions are found in the ninth exon of the Calreticulin (CALR) gene (Non-Patent Documents 1 and 2). . Mutant CALR protein produced from this CALR mutant gene constitutively activates thrombopoietin (TPO) receptor, and has tumorigenicity that causes myeloproliferative neoplasia (MPN) alone. It has already been clarified that there are (Non-Patent Documents 3 to 6).
  • CALR gene mutations found in MPN patients are always frameshift mutations localized to the final exon, and the C-terminus of the mutant CALR protein contains a sequence that does not exist in the wild type, particularly the C-terminus. 44 amino acids are common to almost all mutant CALR proteins.
  • the C-terminal sequence of the 52-base deletion type (Del 52), which is the most frequent CALR gene mutation found in MPN patients, and the 5-base insertion type (Ins 5), which is the second most frequent. is shown in FIG. 1 in comparison with the corresponding region of the wild-type CALR protein.
  • the sequence specific to the mutant CALR protein caused by the frameshift mutation can be used as a neoantigen as a marker for diagnosis or as a therapeutic target.
  • mutant CALR protein in addition to those represented by Del 52 and Ins 5, most of the sequences that were cleaved among the sequences specific to the mutant CALR protein and thought to be neoantigens clarified the existence of a truncated mutant CALR protein that lacks the So far, it has been clarified that when an antibody that binds to the amino acid sequence on the terminal side is produced, MPN therapeutic effect can be obtained.
  • anti-CALR/CD3 bispecific antibody as a more effective therapeutic agent is developed by taking advantage of the antibody's ability to specifically bind to two types of antigens for the purpose of enhancing antitumor activity. Acquired.
  • cancer low-molecular therapeutic agents alkylating agents, platinum agents, antimetabolites, ribonucleotide reductase inhibitors, nucleotide analogues, topoisomerase inhibitors, microtubule polymerization inhibitors, Bcl2 inhibitors, antitumor antibiotics , interferons, cytokine preparations, molecular target drugs, nucleic acid synthesis inhibitors, JAK inhibitors, cancer immunotherapy drugs, etc.
  • these have safety problems such as myelosuppressive effects and hematotoxicity and efficacy.
  • An object of the present invention is to provide a drug that exhibits a sufficient antitumor effect by using an antibody that binds to a mutant CALR protein in combination with another anticancer drug.
  • the present inventors have studied to solve the above problems, and found that the combination of an antibody that specifically recognizes the mutated amino acid sequence of CALR and a specific anticancer drug dramatically improves the antitumor effect. It has been clarified that an excellent therapeutic effect can be obtained by using a mutant CALR protein. The present invention was completed by finding that it is useful as a pharmaceutical.
  • the present invention provides the following (1) to (10).
  • (1) (A) an antibody or functional fragment thereof that specifically binds to a mutant calreticulin protein, and (B) an alkylating agent, a platinum agent, an antimetabolite, a ribonucleotide reductase inhibitor, a nucleotide analog, a topoisomerase
  • One or more drugs selected from inhibitors, microtubule polymerization inhibitors, Bcl2 inhibitors, antitumor antibiotics, interferons, cytokine preparations, molecular targeting drugs, nucleic acid synthesis inhibitors, JAK inhibitors and cancer immunotherapeutics
  • a drug for cancer prevention and/or treatment which is a combination of (2) Component (A) according to (1), wherein component (A) is an antibody or functional fragment thereof that does not bind to wild-type calreticulin protein and has high affinity for mutant calreticulin protein.
  • component (A) is an antibody or a functional fragment thereof that binds to the mutated amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 3 or a sequence exhibiting 80% or more homology with those sequences (1) or (2) The medicament as described.
  • Component (A) is a human antibody, a humanized antibody, a bispecific antibody, a multispecific antibody, a chimeric antibody of an animal-derived antibody and a human antibody, Fab, Fab', F(ab') 2 , The medicament according to any one of (1) to (3), which is one or more antibodies selected from main-chain antibodies (scFv) and diabodies, or functional fragments thereof.
  • Component (B) is one or more drugs selected from JAK inhibitors, nucleic acid synthesis inhibitors, interferons, cytokine preparations, molecular targeted drugs and cancer immunotherapeutic drugs, (1) to (4) The medicament according to any one of (6) The medicament according to any one of (1) to (5), wherein component (B) is one or more drugs selected from ruxonitilib, hydroxyurea, interferon ⁇ , and cancer immune checkpoint inhibitors.
  • cancer is lymphoma, leukemia, multiple myeloma, myeloproliferative neoplasm (MPN), gastrointestinal cancer (esophageal cancer, stomach cancer, duodenal cancer, etc.), liver cancer, biliary tract cancer (gallbladder bile duct cancer), pancreatic cancer, small bowel cancer, colon cancer (colorectal cancer, colon cancer, rectal cancer, etc.), gastrointestinal stromal tumor, lung cancer (non-small cell lung cancer, small cell lung cancer) ) and renal cancer, the medicament according to any one of (1) to (6).
  • MPN myeloproliferative neoplasm
  • gastrointestinal cancer esophageal cancer, stomach cancer, duodenal cancer, etc.
  • liver cancer biliary tract cancer (gallbladder bile duct cancer)
  • pancreatic cancer small bowel cancer
  • colon cancer colon cancer
  • colon cancer colon cancer
  • rectal cancer rectal cancer
  • gastrointestinal stromal tumor lung cancer (n
  • (9) (A) an antibody or functional fragment thereof that specifically binds to a mutant calreticulin protein, and (B) an alkylating agent, a platinum agent, or an antimetabolite for preventing and/or treating cancer agents, ribonucleotide reductase inhibitors, nucleotide analogues, topoisomerase inhibitors, microtubule polymerization inhibitors, Bcl2 inhibitors, antitumor antibiotics, interferons, cytokine preparations, molecular targeting drugs, nucleic acid synthesis inhibitors, JAK inhibitors and in combination with one or more agents selected from immunotherapeutic agents.
  • the antibody used in the present invention has an antigen-recognition site (epitope) in the aforementioned mutant CALR polypeptide chain, and when used in combination with the aforementioned anti-cancer drugs, it can suppress cancer cells more than when each is administered alone. It effectively injures and dramatically improves the antitumor effect. Therefore, the drug of the present invention can be used to specifically prevent and/or treat various cancers, particularly diseases expressing mutant CALR.
  • FIG. 2 shows the characteristics of mutant CALR proteins.
  • the CALR gene mutation that causes MPN patients is a +1 frameshift mutation, and an amino acid sequence common to the mutant proteins is found at the C-terminus of the resulting mutant CALR protein.
  • SP signal sequence
  • N N domain
  • P P domain.
  • the arrow indicates where the amino acid sequence different from wild type (WT) begins.
  • FIG. 2 shows the combined effect of anti-mutated CALR/CD3 bispecific antibody (Antibody No. 1) and hydroxyurea.
  • UT-7/TPO/Ins5-Luc cells expressing mutant CALR and Luciferase (target cells) were cultured with human peripheral blood T cells in the presence of CALR/CD3 bispecific antibody and hydroxyurea, and luciferase activity was measured.
  • FIG. 2 shows the combined effect of anti-mutated CALR/CD3 bispecific antibody (Antibody No. 2) and hydroxyurea.
  • FIG. 3 shows the combined effect of anti-mutant CALR/CD3 bispecific antibody (Antibody No. 3) and hydroxyurea.
  • FIG. 4 shows the combined effect of anti-mutated CALR/CD3 bispecific antibody (Antibody No. 4) and hydroxyurea.
  • FIG. 2 shows the combined effect of anti-mutant CALR/CD3 bispecific antibody (Antibody No. 5) and hydroxyurea.
  • FIG. 3 shows the combined effect of anti-mutant CALR/CD3 bispecific antibody (Antibody No. 6) and hydroxyurea.
  • Fig. 2 shows the combined effect of anti-mutant CALR/CD3 bispecific antibody (Antibody No. 7) and hydroxyurea.
  • Fig. 2 shows the combined effect of anti-mutant CALR/CD3 bispecific antibody (Antibody No. 8) and hydroxyurea.
  • FIG. 3 shows the combined effect of anti-mutated CALR/CD3 bispecific antibody (Antibody No. 9) and hydroxyurea.
  • Figure 3 shows the combined effect of anti-mutant CALR/CD3 bispecific antibody (antibody #1) and ruxolitinib on in vitro efficacy.
  • UT-7/TPO/Ins5/GFP-Luc cells expressing mutant CALR and Luciferase (target cells) were cultured with human peripheral blood T cells in the presence of CALR/CD3 bispecific antibody and ruxolitinib, followed by luciferase Using the activity as an index, the cell viability of the target cells was measured, and the T cell-dependent cellular cytotoxicity (hereinafter referred to as TDCC) was evaluated.
  • TDCC T cell-dependent cellular cytotoxicity
  • FIG. 10 shows the combined effect of an anti-mutated CALR/CD3 bispecific antibody (Antibody No. 7) and ruxolitinib.
  • FIG. 3 shows the combined effect of anti-mutant CALR/CD3 bispecific antibody (Antibody No. 8) and ruxolitinib.
  • FIG. 10 shows the combined effect of anti-mutated CALR/CD3 bispecific antibody (Antibody No. 9) and ruxolitinib.
  • 1 shows the combined effect of an anti-mutant CALR/CD3 bispecific antibody (Antibody No. 1) and interferon ⁇ .
  • UT-7/TPO/Ins5-Luc cells expressing mutant CALR and Luciferase were treated with human peripheral blood T cells in the presence of CALR/CD3 bispecific antibody and interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ).
  • IFN- ⁇ interferon- ⁇
  • the cell viability of the target cells was measured using luciferase activity as an index, and T cell-dependent cellular cytotoxicity (hereinafter referred to as TDCC) was evaluated.
  • the cell viability of each well was calculated with the chemiluminescence value of the group containing no CALR/CD3 bispecific antibody and concomitant drug as 100%.
  • FIG. 4 shows the combined effect of anti-mutant CALR/CD3 bispecific antibody (Antibody No. 4) and IFN- ⁇ .
  • FIG. 4 shows the combined effect of anti-mutant CALR/CD3 bispecific antibody (Antibody No. 4) and IFN- ⁇ .
  • FIG. 3 shows the combined effect of an anti-mutant CALR/CD3 bispecific antibody (Antibody No. 5) and IFN- ⁇ .
  • FIG. 3 shows the combined effect of anti-mutant CALR/CD3 bispecific antibody (Antibody No. 6) and IFN- ⁇ .
  • FIG. 3 shows the combined effect of an anti-mutant CALR/CD3 bispecific antibody (Antibody No. 8) and IFN- ⁇ .
  • FIG. 3 shows the combined effect of anti-mutant CALR/CD3 bispecific antibody (Antibody No. 9) and IFN- ⁇ .
  • the present invention provides methods for detecting and diagnosing mutant CALR proteins associated with MPN, and C-terminal polypeptides (Fig. An antibody that recognizes the 13 amino acids (SEQ ID NO: 4) in 1) and an antibody that recognizes the sequence (SEQ ID NO: 5) on the C-terminal side thereof are used in combination with the anticancer agent to effectively It has been found that cancer can be treated and/or prevented. That is, the present invention provides (A) an antibody that specifically recognizes a mutant CALR protein, and (B) a drug for cancer prevention and/or treatment, especially MPN, which is obtained by combining the anticancer drug. /or provide a medicament for treatment.
  • Component (A) used in the medicament of the present invention is an antibody that specifically recognizes the mutant CALR protein.
  • antibodies or functional fragments thereof refer to monoclonal antibodies and chimeric antibodies produced by genetic recombination technology, humanized antibodies, human antibodies, bispecific antibodies, multispecific antibodies, engagers, Fab, Fab ', F(ab') 2 , single chain antibodies (scFv), diabodies, minibodies, etc., proteins that specifically bind to mutant CALR, protein fragments thereof and derivatives including protein fragments thereof.
  • Monoclonal antibody forms include human and non-human animal IgG, IgM, IgA, IgE, IgD.
  • the form of bispecific and multispecific antibodies is not particularly limited, and may be any form known in the art, as long as it retains specificity for two or more antigens. , may be in other forms.
  • Forms of bispecific antibodies are roughly classified into IgG-like type and low-molecular-weight type.
  • An IgG-like form is a form that retains the Fc region.
  • IgG-like antibodies include, but are not limited to, CrossMab, DAF (two-in-one), DAF (four-in-one), DutaMab, DT-IgG, knobs-into-holes , knobs-into-holes common LC, SEEDbody, Triomab, ⁇ -body, DVD-Ig, IgG-scFv, DuoBody and the like. Since an IgG-like antibody retains an Fc region, it is expected to exhibit effector functions such as ADCC and CDC, facilitate purification, improve stability, extend blood half-life, and the like.
  • the low-molecular-weight type usually refers to a form having an Fv region consisting of a heavy chain variable region and a light chain variable region as a basic component.
  • Forms of low-molecular-weight antibodies include, but are not limited to, Diabody (Db), BiTE, DART, TandAb, scDb, triple body, minibody, minibody, scFv, tandem scFv, F(ab') 2 etc.
  • the low-molecular-weight type is expected to have improved tissue permeability and high productivity due to its size.
  • proteins with amino acid sequences deleted, substituted, or added while maintaining the ability to bind to antigens those with part or all of the sugar chains deleted or added, those with linkers or the like added, and other proteins and modified antibodies such as antibody-drug conjugates (ADC) in which an antibody and a low-molecular-weight drug are bound via a linker.
  • ADC antibody-drug conjugates
  • the antibodies of the present invention have domains that specifically bind to mutant calreticulin proteins. Said domain competes with an antibody that binds to an epitope of the mutant calreticulin protein of SEQ ID NO:4 or 5.
  • the mutant calreticulin protein is a polypeptide chain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 5, or deletion, substitution or addition of one or several amino acids in SEQ ID NO: 4 or 5. It preferably has an antigen-recognition site in the polypeptide chain consisting of the amino acid sequence described above.
  • the domain does not bind to the wild-type calreticulin protein and has high affinity to the mutant calreticulin protein.
  • the truncated CALR protein includes a polypeptide (i) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 5 and an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 4 or 5.
  • Polypeptide (ii) consisting of In (ii) amino acid sequences in which 1 to 4 amino acids have been deleted, substituted or added are preferred, and amino acid sequences in which 1 to 3 amino acids have been deleted, substituted or added are more preferred.
  • the identity between the amino acid sequence of polypeptide (ii) and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, and even more preferably 90% or more.
  • the binding domain of the antibody may be an antibody that has an antigen recognition site (epitope) in the polypeptide chain of (i) or (ii), and that binds only to the truncated mutant CALR protein. may bind to both the truncated mutant CALR protein and the full-length mutant CALR protein, and binds to both the truncated mutant CALR protein and the full-length mutant CALR protein. Antibodies specific to "mutant CALR protein" are preferred.
  • binding domains include the heavy chain variable region and light chain variable region of the anti-mutant CALR antibodies (clones B3, C6 and G1 antibodies) found by the present inventors, as well as the heavy chain complementarity determining regions (CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3) and light chain complementarity determining regions (CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3).
  • the first domain comprises the heavy chain variable region and light chain variable region of the anti-mutant CALR antibody (clones B3, C6 and G1 antibodies), and the heavy chain complementarity determining region (CDR-H1 , CDR-H2 and CDR-H3) and light chain complementarity determining regions (CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3).
  • the second domain in the bispecific antibody is preferably a domain that specifically binds to the CD3 antigen, and includes a heavy chain variable region and a light chain variable region derived from an existing anti-CD3 antibody, and a heavy chain variable region derived from a known anti-CD3 antibody.
  • CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3 are chain complementarity determining regions and the light chain complementarity determining regions.
  • Existing anti-CD3 antibodies include OKT3 or UCTH1.
  • antibodies of the present invention include heavy chain variable regions and light chain variable regions of anti-mutant CALR antibodies (clone B3, C6 and G1 antibodies), and heavy chain complementarity determining regions (CDR-H1, CDR-H2 and CDR -H3) and light chain complementarity determining regions (CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3), examples of amino acid sequences of which are shown in Table 1.
  • Table 1 shows preferred examples of the first and second domains of the bispecific antibody, anti-mutant CALR antibodies (clone B3, C6 and G1 antibodies) and anti-CD3 antibodies (OKT3, UCHT1).
  • Heavy chain variable region and light chain variable region as well as heavy chain complementarity determining region (CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3) and light chain complementarity determining region (CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3) is also shown in Table 1.
  • sequence information of the obtained antibody can be produced as a recombinant antibody by genetic engineering techniques.
  • Sequence information regarding anti-CD3 antibodies can be obtained from existing information. That is, the antibody heavy chain and light chain genes are synthesized from the obtained genetic information, inserted into a vector (e.g., plasmid), and then introduced into host cells (e.g., CHO cells, HEK cells, etc.). By culturing the cells, the recombinant antibody can be collected from the culture. Codon optimization is preferred in synthesizing the antibody heavy and light chain genes.
  • Preferred bispecific antibodies of the present invention include amino acid sequences in which the CDRs of the first domain have (a) 80% or more homology with the amino acid sequences shown in SEQ ID NOS: 14-16 (VHCDR), and sequences (b) having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NOS: 20-22 (VHCDR); and an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NOS: 23-25 (VLCDR), or (c) with the amino acid sequence shown in SEQ ID NOS: 26-28 (VHCDR)
  • Bispecific antibodies having amino acid sequences with 80% or more homology and 80% or more homology with the amino acid sequences shown in SEQ ID NOS:29-31 (VLCDR) are included.
  • the first domain is (d) a VH region having an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and 80% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 (e) a VH region having an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, and an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 and 80 or (f) a VH region having an amino acid sequence with 80% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, and a VH region with SEQ ID NO: 11 bispecific antibodies having a VL region with an amino acid sequence that shares 80% or more homology with the amino acid sequence described in
  • the CDR of the second domain has an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NOS: 32-34 (VHCDR), and the amino acid sequence shown in SEQ ID NOS: 35-37 (VLCDR).
  • VHCDR amino acid sequence shown in SEQ ID NOS: 32-34
  • VLCDR amino acid sequence shown in SEQ ID NOS: 35-37
  • a bispecific antibody having an amino acid sequence that shares 80% or more homology with the amino acid sequence represented by 224 (VLCDR) is preferred.
  • the second domain has a VH region having an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, and 80% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13.
  • a bispecific antibody having a VL region having an amino acid sequence, or a VH region having an amino acid sequence in which the second domain has 80% or more homology to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:217, and SEQ ID NO:218 A bispecific antibody having a VL region with an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in is preferred.
  • the CDR of the first domain has (a) an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14-16 (VHCDR), and (b) having an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NOS: 17-19 (VLCDR), and (b) 80% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NOS: 20-22 (VHCDR) and an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23-25 (VLCDR), or (c) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26-28 (VHCDR) and an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 29-31 (VLCDR); , an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32-34 (VHCDR), and an amino acid having 80% or more homology with the amino acid sequence
  • the first domain is (d) a VH region having an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and a VH region shown in SEQ ID NO: 7 (e) a VH region having an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, which has a VL region having an amino acid sequence with 80% or more homology with the amino acid sequence, and SEQ ID NO: (f) VH having an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 and a VL region having an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, and the second domain (g) with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 having a VH region with an amino acid sequence with 80% or more homology and a VL region with an amino acid sequence with 80% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, or
  • the form of the antibody of the present invention may be any form, IgG-like or low-molecular-weight, as long as it retains the specificity for the two antigens. Specifically, it may have an Fc region, a heterozygous heavy chain, or the like.
  • bispecific antibodies include antibodies selected from the following (I) to (IX).
  • a bispecific antibody (Antibody 1) consisting of an H chain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 174 and an L chain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 202.
  • a bispecific antibody (antibody 2) consisting of an H chain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 186 and an L chain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 201.
  • a bispecific antibody (antibody 3) consisting of an H chain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 174 and an L chain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 201.
  • a bispecific antibody consisting of an H chain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:180 and an L chain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:202.
  • a bispecific antibody consisting of an H chain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:181 and an L chain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:202.
  • a bispecific antibody consisting of an H chain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 161 and an L chain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 171.
  • a bispecific antibody (Antibody 7) consisting of an H chain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:225 and an L chain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:202.
  • the above antibodies (I) to (VII) all have the same structure, and a single-chain Fv that specifically binds to CD3 is attached to the heavy chain C-terminus of the Fab fragment that specifically binds to mutant CALR via a peptide linker. It is a bispecific antibody in which an Fc is further fused to the polypeptide to which it was fused.
  • VIII A bispecific antibody (antibody 8) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:226.
  • a bispecific antibody consisting of an H chain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 227 and an L chain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 228, wherein the single chain specifically binds to the CD3 antigen
  • a bispecific antibody (Antibody 9) in which the N-terminus of an IgG light chain that specifically binds to mutant CALR is fused to the C-terminus of Fv via a peptide linker.
  • a preferred specific example of the bispecific antibody of the present invention has each of the above sequences, and the amino acid sequences of regions other than these regions are not particularly limited.
  • Antibodies of the present invention may also be humanized antibodies and non-human mammalian antibodies. More specifically, it may be a chimeric antibody consisting of a non-human mammal, for example, a rat antibody heavy chain or light chain variable region and a human antibody heavy chain or light chain constant region.
  • An antibody can be obtained by ligating a DNA encoding a variable region of a rat antibody with a DNA encoding a constant region of a human antibody, inserting this into an expression vector, and introducing it into a host for production.
  • An example of a humanized antibody is shown below VH1-5 and VL1-5 (Table 2).
  • human lymphocytes are sensitized in vitro with the desired antigen or cells expressing the desired antigen, the sensitized lymphocytes are fused with human myeloma cells such as U266, and the desired human antibody having antigen-binding activity is obtained. can also be obtained (see Japanese Patent Publication No. 1-59878).
  • desired human antibodies can be obtained by immunizing transgenic animals having an entire repertoire of human antibody genes with desired antigens (WO93/12227, WO92/03918, WO94/02602, WO94/25585, See WO96/34096, WO96/33735).
  • a technique for obtaining human antibodies by panning using a human antibody library is also known.
  • variable region of a human antibody can be expressed on the surface of phage as a single chain antibody (scFv) by the phage display method, and phage that bind to the antigen can be selected. Genetic analysis of the selected phage allows determination of the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen. Once the DNA sequence of the scFv that binds to the antigen has been identified, a suitable expression vector can be constructed using this sequence to obtain a human antibody.
  • WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, and WO95/15388 can be referred to.
  • Bispecific antibodies for example, construct a bispecific antibody expression vector using DNA and an expression vector encoding an anti-mutant CALR antibody and an anti-CD3 antibody, introduce the expression vector into CHO cells or HEK293 cells, and induce plasma Transformed cells can be obtained.
  • a culture medium in which the transformed cells are cultured can be purified by chromatography. Methods for producing bispecific antibodies are already well known, and JP2019022497, JP2017137329, and JP2015110628 can be referred to.
  • the class of antibody is not particularly limited, and includes antibodies having any isotype such as IgG, IgM, IgA, IgD or IgE. Considering the ease of purification, etc., IgG is preferable.
  • Domain structures include low-molecular-weight antibodies such as antibody fragments and modified antibodies.
  • antibody fragments include, but are not limited to, Fab, Fab', F(ab') 2 , Fv, scFv, diabodies, and the like.
  • human IgG H chain constant regions and heterozygous 349, 354, 366, 368, 407 amino acid mutations for H chain are shown, but not limited to.
  • antibodies that bind to the polypeptides of (i) or (ii) may bind to these polypeptides.
  • the antibody used for prevention and/or treatment of MPN is preferably an antibody that binds to the polypeptide (i) or (ii) and has cytotoxic activity.
  • the antibody that binds to the truncated mutant CALR protein may be an antibody that binds to the polypeptide chain having the sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 3. It is preferably an antibody that competes with at least any one of the above antibodies or functional fragments thereof in binding to the amino acid sequence portion represented by .
  • Component (B) includes alkylating agents, platinum agents, antimetabolites, ribonucleotide reductase inhibitors, nucleotide analogues, topoisomerase inhibitors, microtubule polymerization inhibitors, Bcl2 inhibitors, antitumor antibiotics, interferons, cytokines.
  • One or more drugs selected from pharmaceuticals, molecular targeted drugs, nucleic acid synthesis inhibitors, JAK inhibitors and cancer immunotherapeutic drugs, among which JAK inhibitors, antimetabolites (including ribonucleotide reductase inhibitors) ), nucleic acid synthesis inhibitors, interferons, cytokine preparations, molecular targeted drugs and cancer immunotherapeutic drugs are preferred.
  • Alkylating agents include cyclophosphamide, ifosfamide, dacardine, temozolomide, nimustine, busulfan, ranimustine and the like.
  • Platinum agents include cisplatin, carboplatin, oxaliplatin and the like.
  • Antimetabolites, ribonucleotide reductase inhibitors, nucleotide analogs include hydroxyurea, methotrexate, 5-FU, tegafur, 6-mercaptopurine, capecitabine, pendostatin, and the like.
  • Topoisomerase inhibitors include doxorubicin, daunorubicin, epirubicin, idarubicin, mitoxantrone, pirarubicin, amrubicin, etoposide, irinotecan, and the like.
  • Bcl2 inhibitors include benecclexta and the like.
  • Antitumor antibiotics include mitomycin C, actinomycin D, bleomycin, beplomycin, dinostatin stimmer and the like.
  • Microtubule polymerization inhibitors include paclitaxel and docetaxel.
  • JAK inhibitors include tofacitinib, baricitinib, peficitinib, upadacitinib, filgotinib, agrocitinib, ruxolitinib, and the like.
  • Interferons include interferon- ⁇ , interferon- ⁇ , interferon- ⁇ and the like.
  • Cytokine preparations include interleukin 2 and the like.
  • Nucleic acid synthesis inhibitors include azathioprion, mizoribine, cyclophosphamide and the like.
  • Molecular target drugs and cancer immunotherapeutic drugs include antibody drugs such as anti-EGFR antibody, anti-HER2 antibody, anti-VEGF antibody, anti-VEGFR antibody, anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody, anti-CTLA-4 antibody, EGFR agonists such as gefitinib, erlotinib, afatinib, osimertinib and dakocitinib, HER2 agonists such as lapatinib, mTOR agonists such as eperolimus, temsirolimus and sirolimus, anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody, anti-CTLA-4 antibody , CTLA-4-Ig and other cancer immune checkpoint inhibitors (cancer immune checkpoint inhibitors are also classified as molecular targeted drugs).
  • antibody drugs such as anti-EGFR antibody, anti-HER2 antibody, anti-VEGF antibody, anti-VEGFR antibody, anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody, anti-CTLA-4 antibody
  • anti-PD-1 antibodies include nivolumab and pembrolizumab.
  • Anti-PD-L1 antibodies include atezolizumab, durvalumab, avelumab and the like.
  • Anti-CTLA-4 antibodies include ipilimumab, tremelimumab and the like.
  • CTLA-4-Igs include abatacept.
  • these components (B) one or more agents selected from ruxolitinib, hydroxyurea, interferon ⁇ and cancer immune checkpoint inhibitors are particularly preferred.
  • component (A) and the component (B) are used in combination (used in combination), the antitumor effect on various cancers is enhanced, and the antitumor effect for cancer prevention and / or treatment is enhanced. It is useful as a medicine.
  • component (A) is useful as an antitumor effect enhancer for component (B).
  • component (B) is useful as an antitumor effect enhancer for component (A).
  • the form of the combination drug of the present invention is not particularly limited, and specific examples thereof include the following forms (i) and (ii).
  • each formulation may be administered at the same time, or may be administered separately at appropriate time intervals, and the desired cancer preventive and / or therapeutic effect can be obtained. Appropriate dosing regimens can be employed to achieve this.
  • both formulations may be provided as a kit formulation containing both formulations in a single package.
  • cancers targeted by the present invention include lymphoma, leukemia, multiple myeloma, myeloproliferative neoplasia (MPN), head and neck cancer, gastrointestinal cancer (esophageal cancer, gastric cancer, duodenal cancer).
  • cancer liver cancer
  • biliary tract cancer gallbladder, bile duct cancer, etc.
  • pancreatic cancer small intestine cancer, colon cancer (colorectal cancer, colon cancer, rectal cancer, etc.), gastrointestinal tract cancer Stromal tumor, lung cancer (non-small cell lung cancer, small cell lung cancer), breast cancer, ovarian cancer, uterine cancer (cervical cancer, endometrial cancer, etc.), kidney cancer, bladder cancer, prostate cancer, Skin cancer etc.
  • lung cancer non-small cell lung cancer, small cell lung cancer
  • breast cancer breast cancer
  • kidney cancer bladder cancer, prostate cancer, Skin cancer etc.
  • the term cancer includes not only primary tumors but also cancers that have metastasized to other organs (such as the liver).
  • the medicament of the present invention is useful for lymphoma, leukemia, multiple myeloma, myeloproliferative neoplasm (MPN), gastrointestinal cancer (esophageal cancer, stomach cancer, duodenal cancer, etc.), liver cancer, biliary tract cancer (gallbladder, bile duct cancer, etc.), pancreatic cancer, small bowel cancer, colon cancer (colorectal cancer, colon cancer, rectal cancer, etc.), gastrointestinal stromal tumor, lung cancer (non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, etc.) ), renal cancer, etc., and further useful for lymphoma, leukemia, multiple myeloma, myeloproliferative neoplasm (MPN), etc., and even more cancers in which mutated CALR is detected, especially against MPN Useful.
  • MPN myeloproliferative neoplasm
  • the medicament of the present invention may be in the form of a composition containing component (A), a composition containing component (B), or a composition containing component (A) and component (B).
  • compositions are prepared by mixing, dissolving, emulsifying, encapsulating, or freeze-drying, etc., together with components (A) and/or (B) and a pharmaceutically acceptable carrier. be able to.
  • Suitable formulations for oral administration contain component (A) and/or component (B) in the form of liquid preparations in which an effective amount is dissolved in a diluent such as water or physiological saline, or in the form of solids or granules in an effective amount.
  • a diluent such as water or physiological saline
  • capsules, granules, powders, or tablets, suspensions in which an effective amount is suspended in a suitable dispersion medium, emulsions in which a solution in which an effective amount is dissolved are dispersed and emulsified in a suitable dispersion medium, etc. is.
  • component (A) and/or component (B) are combined with pharmaceutically acceptable solvents, excipients, binders, stabilizers, dispersants and the like for injection solutions and suspensions. It can be formulated into dosage forms such as liquids, emulsions, creams, ointments, inhalants, and suppositories.
  • component (A) and/or component (B) are dissolved in an aqueous solution, preferably in a physiologically compatible buffer such as Hank's solution, Ringer's solution, or physiological saline buffer. be able to.
  • the medicaments of the present invention can take such forms as suspensions, solutions, or emulsions in oily or aqueous vehicles.
  • component (A) and/or component (B) may be produced in the form of powder, and an aqueous solution or suspension may be prepared using sterilized water or the like before use.
  • component (A) and/or component (B) can be powdered and made into a powder mixture with a suitable base such as lactose or starch.
  • Suppository formulations can be prepared by mixing component (A) and/or component (B) with a conventional suppository base such as cocoa butter.
  • the medicament of the present invention can be formulated as a sustained release formulation, such as by encapsulating it in a polymer matrix.
  • component (B) When using a commercially available component (B), it can be administered according to its dosage and administration.
  • component (A) it is preferable to administer 0.3 mg or more at a time, more preferably 0.3 mg to 300 mg, even more preferably 3 mg to 300 mg.
  • sequence information of the heavy chain and light chain of the antibody of the present invention was obtained by extracting mRNA from antibody-producing cells using the PureLinc RNA Mini Kit (Thermo Fisher). prepared. Using the obtained mRNA as a template, cDNA was synthesized by the Rapid amplification of cDNA ends method using a heavy chain- or light chain-specific reverse transcription primer, and then cloned into a plasmid. The obtained plasmid was subjected to Sanger sequence analysis to determine the full-length cDNA sequences of the heavy and light chains.
  • Example 1 Preparation of bispecific antibody Materials and test methods DNA encoding bispecific antibody based on sequence information of clones B3, C6, G1 antibody and anti-CD3 antibody (Table 1) and expression vector (pcDNA3.4, Thermo Fisher) was used to construct the bispecific antibody expression vector.
  • the above expression vector is introduced into CHO cells or HEK293 cells using ExpiFectamine CHO Transfection Kit (Thermo Fisher) or ExpiFectamine 293 Transfection Kit (Thermo Fisher), the transformed cells are cultured, and then the cells are separated by centrifugation and filtration. It was removed and the culture medium was collected.
  • Antibody purification was performed by a combination of affinity chromatography and gel filtration chromatography using nickel-bound agarose, a combination of Protein A affinity chromatography and gel filtration chromatography, or affinity chromatography and gel using CaptureSelect kappa XL resin (Thermo Fisher). A combination of filtration chromatography was performed.
  • Bispecific antibodies based on the sequence information described in Patent Document 4 and Patent Document 2 (antibody 32: SEQ ID NO: 114 and SEQ ID NO: 115, antibody 33: SEQ ID NO: 116 and SEQ ID NO: 117, antibody 34: SEQ ID NO: 118 and SEQ ID NO: 119) and B3 chimeric antibodies (SEQ ID NO: 52 and SEQ ID NO: 64) were prepared.
  • Example 2 Confirmation of recognition of cell surface mutant CALR protein by flow cytometry analysis
  • Materials and test methods UT-7/TPO vec cells transfected with only the vector used for gene transfer as a control, mutant CALR UT-7/TPO CALR Ins 5 cells and UT-7/TPO CALR Del 52 cells expressing cultured in After 5 ⁇ 10 4 cells in the growth phase were centrifuged (400 g ⁇ 5 minutes, 4° C.), various antibodies were prepared in a FBS/PBS solution at a concentration of 5 ⁇ g/mL and allowed to react on ice for 30 minutes.
  • the cells were washed twice using MACS buffer, and an anti-human Fc antibody was prepared as a secondary antibody to a concentration of 2.5 ⁇ g/mL in FBS/PBS solution and allowed to react on ice for 30 minutes. .
  • MACS buffer was added and centrifuged (400 g ⁇ 5 minutes, 4 ° C.), the supernatant was discarded to wash the cells twice, and flow cytometry was performed using BD LSRFortessa X-20 (BD Biosciences). The analysis quantified the signal.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells isolated from healthy human donors were treated with anti-CD3 antibody (Takara Bio). After 2 days of culture on the coated plates for 4-24 hours, T-LAK cells were induced by further culture for 10-21 days in RPMI-1640 medium (Sigma-Aldrich) containing IL-2 and 10% FBS.
  • VH chain of SEQ ID NO: 2 VL chain of SEQ ID NO: 3
  • VH chain of SEQ ID NO: 8 VH chain of SEQ ID NO: 8
  • An anti-truncated mutant CALR-CD3 bispecific antibody prepared using the VL chain of SEQ ID NO:9 was adjusted to a concentration of 5 ⁇ g/mL and allowed to react on ice for 30 minutes. After the reaction, the cells were washed twice with MACS buffer, and an anti-human Fc antibody was prepared as a secondary antibody at a concentration of 5 ⁇ g/mL in FBS/PBS solution and reacted on ice for 30 minutes.
  • Example 4 In vitro cytotoxic activity evaluation (materials and test method) After culturing UT-7/TPO/Ins5-Luc cells, which are target cells, with T cells in the presence of a bispecific antibody and hydroxyurea, ruxolitinib, or interferon- ⁇ , cell survival of target cells is measured using luciferase activity as an index. The rate was measured and T cell-dependent cellular cytotoxicity (hereinafter referred to as TDCC) was evaluated. T cells were isolated from healthy human blood using RosetteSep Human T Cell Enrichment Cocktail (STEMCELL technologies) or from healthy human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) using Pan T cell isolation kit (Miltenyi biotech). Concentrated.
  • TDCC T cell-dependent cellular cytotoxicity
  • the combination effect was evaluated using a combination index (CI).
  • CI combination index
  • Calculation of CI was based on the Chou-Talalay method (Chou TC & Talalay, P.: Adv. Enz. Regul. 22:27-55, 1984) and was performed using CompuSyn software (Combosyn, Inc.). Ta. If the CI is less than 0.7, it is determined that there is a synergistic effect, and if it is less than 0.3, it is determined that there is a strong synergistic effect. A CI of around 1 is judged to be an additive effect. Table 3 summarizes the CI values of combinations at the minimum concentration at which the cytotoxic activity exceeded 85% and the combination effect was observed, as representative CI values.
  • the combination of the antibody of the present invention and the drug has cytotoxic activity against UT-7/TPO CALR Ins 5 cells expressing mutant CALR. showed that.

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Abstract

変異型ＣＡＬＲタンパク質に結合する抗体と他の抗がん剤とを併用することで十分な抗がん効果を示す医薬を提供すること。　（Ａ）変異カルレティキュリンタンパク質に特異的に結合する抗体又はその機能的断片と、（Ｂ）アルキル化剤、白金製剤、代謝拮抗剤、リボヌクレオチドリダクターゼ阻害薬、ヌクレオチドアナログ、トポイソメラーゼ阻害薬、微小管重合阻害薬、抗腫瘍性抗生物質、インターフェロン、サイトカイン製剤、分子標的薬、核酸合成阻害薬、ＪＡＫ阻害薬及びがん免疫治療薬から選択される一以上の薬剤とを組み合わせてなるがん予防及び／又は治療用医薬。

Description

抗変異ＣＡＬＲ抗体と他の薬剤とを組み合わせてなる医薬
　本発明は、変異型ＣＡＬＲタンパク質に対する特異性を有する抗体又はその機能性断片と他の薬剤とを組み合わせてなる医薬に関する。
　フィラデルフィア染色体陰性骨髄増殖性腫瘍（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ－ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ　ｎｅｏｐｌａｓｍｓ；ＭＰＮｓ）患者の一部では、Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ（ＣＡＬＲ）遺伝子の第９エクソンに、塩基欠失や挿入が見出される（非特許文献１、２）。このＣＡＬＲ変異遺伝子から産生される変異型ＣＡＬＲタンパク質は、トロンボポエチン（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ；ＴＰＯ）受容体を恒常的に活性化することで、単独で骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）を引き起こす腫瘍原性を有していることがすでに明らかにされている（非特許文献３～６）。
　ＭＰＮ患者で見出されるＣＡＬＲ遺伝子変異は、必ず最終エクソンの限局された場所におけるフレームシフト変異であり、変異型ＣＡＬＲタンパク質のＣ末端には、野生型に存在しない配列が存在し、特にそのＣ末端の４４アミノ酸は、ほぼすべての変異型ＣＡＬＲタンパク質に共通している。その例として、ＭＰＮ患者で見出されるＣＡＬＲ遺伝子変異の中で最も頻度の高い、５２塩基欠失型（Ｄｅｌ　５２）、その次に頻度が高い、５塩基挿入型（Ｉｎｓ　５）のＣ末端の配列を野生型ＣＡＬＲタンパク質の当該領域と比較したものを図１に示した。
　ＭＰＮを引き起こす原因である変異型ＣＡＬＲタンパク質は腫瘍細胞に発現していることから、フレームシフト変異により生じた変異型ＣＡＬＲタンパク質に特異的な配列はネオ抗原として、診断時のマーカーや、治療標的となる可能性が示唆されていた（特許文献１～２）。
　さらに変異型ＣＡＬＲタンパク質の機能解析の結果、Ｄｅｌ　５２、Ｉｎｓ　５に代表されるものに加え、変異型ＣＡＬＲタンパク質に特異的な配列の中で切断され、ネオ抗原と考えられていた配列の大部分が失われた切断型の変異型ＣＡＬＲタンパク質が存在していることを明らかにし、ネオ抗原中の切断部位よりＮ末端側に位置する極めて短いアミノ酸配列を特異的に認識する抗体とそれよりもＣ末端側のアミノ酸配列に結合する抗体を作製したところ、ＭＰＮ治療効果が得られることをこれまでに明らかにした。さらに抗腫瘍活性の増強を目的にそれぞれ２種の抗原に対して特異的に結合することが可能な抗体の特性を生かして、より有効な治療薬としての抗ＣＡＬＲ／ＣＤ３二重特異性抗体を取得した。
　一方、がん低分子治療薬においては、アルキル化剤、白金製剤、代謝拮抗剤、リボヌクレオチドリダクターゼ阻害薬、ヌクレオチドアナログ、トポイソメラーゼ阻害薬、微小管重合阻害薬、Ｂｃｌ２阻害薬、抗腫瘍性抗生物質、インターフェロン、サイトカイン製剤、分子標的薬、核酸合成阻害薬、ＪＡＫ阻害薬、がん免疫治療薬などが報告されているものの、これらにおいては骨髄抑制作用や血液毒性など安全性における問題点及び有効性において未だ満足のいくものは無い。
国際公開第２０１５／０３６５９９号 国際公開第２０１６／０８７５１４号 国際公開第１９９９／０５４４４０号 国際公開第２０１９／１７８３６２号 国際公開第２０２０／１７５６８９号
Ｋｌａｍｐｆｌ　Ｔ，Ｇｉｓｓｌｉｎｇｅｒ　Ｈ，Ｈａｒｕｔｙｕｎｙａｎ　ＡＳ，ｅｔ　ａｌ．　Ｓｏｍａｔｉｃ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ　ｉｎ　ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ　ｎｅｏｐｌａｓｍｓ．　Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１３；３６９：２３７９－９０． Ｎａｎｇａｌｉａ　Ｊ，Ｍａｓｓｉｅ　ＣＥ，Ｂａｘｔｅｒ　ＥＪ，ｅｔ　ａｌ．　Ｓｏｍａｔｉｃ　ＣＡＬＲ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ　ｎｅｏｐｌａｓｍｓ　ｗｉｔｈ　ｎｏｎｍｕｔａｔｅｄ　ＪＡＫ２．　Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１３；３６９：２３９１－４０５． Ａｒａｋｉ　Ｍ，Ｙａｎｇ　Ｙ，Ｍａｓｕｂｕｃｈｉ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ．　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｂｙ　ｍｕｔａｎｔ　ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ　ｉｎ　ＣＡＬＲ－ｍｕｔａｎｔ　ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ　ｎｅｏｐｌａｓｍｓ．　Ｂｌｏｏｄ．２０１６；１２７：１３０７－１６． Ｅｌｆ　Ｓ，Ａｂｄｅｌｆａｔｔａｈ　ＮＳ，Ｃｈｅｎ　Ｅ，ｅｔ　ａｌ．　Ｍｕｔａｎｔ　Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ　Ｒｅｑｕｉｒｅｓ　Ｂｏｔｈ　Ｉｔｓ　Ｍｕｔａｎｔ　Ｃ－ｔｅｒｍｉｎｕｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｆｏｒ　Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｉｓｃｏｖ．２０１６；６：３６８－８１． Ｍａｒｔｙ　Ｃ，Ｐｅｃｑｕｅｔ　Ｃ，Ｎｉｖａｒｔｈｉ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．　Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｉｎ　ｍｉｃｅ　ｉｎｄｕｃｅ　ａｎ　ＭＰＬ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｓｉｓ　ｗｉｔｈ　ｆｒｅｑｕｅｎｔ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｔｏ　ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ．　Ｂｌｏｏｄ．２０１６；１２７：１３１７－２４． Ｖａｉｎｃｈｅｎｋｅｒ　Ｗ，Ｋｒａｌｏｖｉｃｓ　Ｒ．　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｂａｓｉｓ　ａｎｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｃｌａｓｓｉｃａｌ　ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ　ｎｅｏｐｌａｓｍｓ．　Ｂｌｏｏｄ．２０１７；１２９：６６７－７９．
　本発明の課題は、変異型ＣＡＬＲタンパク質に結合する抗体と他の抗がん薬とを併用することで十分な抗腫瘍効果を示す医薬を提供することにある。
　そこで、本発明者は、前記課題を解決すべく検討したところ、ＣＡＬＲの変異アミノ酸配列を特異的に認識する抗体と特定の抗がん薬とを併用することで抗腫瘍効果が飛躍的に向上し優れた治療効果が得られることを明らかとし、変異型ＣＡＬＲタンパク質に特異的に結合する抗体と特定の抗がん薬とを組み合わせてなる医薬は、より効果的ながん予防及び／又は治療用医薬として有用であることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、次の（１）～（１０）を提供するものである。
（１）（Ａ）変異カルレティキュリンタンパク質に特異的に結合する抗体又はその機能的断片と、（Ｂ）アルキル化剤、白金製剤、代謝拮抗剤、リボヌクレオチドリダクターゼ阻害薬、ヌクレオチドアナログ、トポイソメラーゼ阻害薬、微小管重合阻害薬、Ｂｃｌ２阻害薬、抗腫瘍性抗生物質、インターフェロン、サイトカイン製剤、分子標的薬、核酸合成阻害薬、ＪＡＫ阻害薬及びがん免疫治療薬から選択される一以上の薬剤とを組み合わせてなるがん予防及び／又は治療用医薬。
（２）成分（Ａ）が、野生型カルレティキュリンタンパク質に結合せず、変異型カルレティキュリンタンパク質に対して高い親和性を有する抗体又はその機能的断片である（１）に記載の医薬。
（３）成分（Ａ）が、配列番号２又は３で表される変異アミノ酸配列又はそれらの配列と８０％以上の相同性を示す配列に結合する抗体又はその機能的断片である（１）又は（２）に記載の医薬。
（４）成分（Ａ）が、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、動物由来抗体とヒト抗体のキメラ抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）及びダイアボディから選択される一以上の抗体又はその機能的断片である（１）～（３）のいずれかに記載の医薬。
（５）成分（Ｂ）が、ＪＡＫ阻害薬、核酸合成阻害薬、インターフェロン、サイトカイン製剤、分子標的薬及びがん免疫治療薬から選択される一以上の薬剤である、（１）～（４）のいずれかに記載の医薬。
（６）成分（Ｂ）が、ルキソニチリブ、ヒドロキシウレア、インターフェロンα及びがん免疫チェックポイント阻害薬から選択される一以上の薬剤である、（１）～（５）のいずれかに記載の医薬。
（７）がんが、リンパ腫、白血病、多発性骨髄種、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）、消化器がん（食道がん、胃がん、十二指腸がんなど）、肝臓がん、胆道がん（胆嚢・胆管がんなど）、膵臓がん、小腸がん、大腸がん（結腸直腸がん、結腸がん、直腸がんなど）、消化管間質腫瘍、肺がん（非小細胞肺がん、小細胞肺がん）及び腎がんから選ばれるがんである（１）～（６）のいずれかに記載の医薬。
（８）がん予防及び／又は治療用医薬を製造するための、（Ａ）変異カルレティキュリンタンパク質に特異的に結合する抗体又はその機能的断片と、（Ｂ）アルキル化剤、白金製剤、代謝拮抗剤、リボヌクレオチドリダクターゼ阻害薬、ヌクレオチドアナログ、トポイソメラーゼ阻害薬、微小管重合阻害薬、Ｂｃｌ２阻害剤、抗腫瘍性抗生物質、インターフェロン、サイトカイン製剤、分子標的薬、核酸合成阻害薬、ＪＡＫ阻害薬及びがん免疫治療薬から選択される一以上の薬剤とを組み合わせの使用。
（９）がんを予防及び／又は治療するための、（Ａ）変異カルレティキュリンタンパク質に特異的に結合する抗体又はその機能的断片と、（Ｂ）アルキル化剤、白金製剤、代謝拮抗剤、リボヌクレオチドリダクターゼ阻害薬、ヌクレオチドアナログ、トポイソメラーゼ阻害薬、微小管重合阻害薬、Ｂｃｌ２阻害薬、抗腫瘍性抗生物質、インターフェロン、サイトカイン製剤、分子標的薬、核酸合成阻害薬、ＪＡＫ阻害剤及びがん免疫治療薬から選択される一以上の薬剤とを組み合わせ。
（１０）（Ａ）変異カルレティキュリンタンパク質に特異的に結合する抗体又はその機能的断片と、（Ｂ）アルキル化剤、白金製剤、代謝拮抗剤、リボヌクレオチドリダクターゼ阻害薬、ヌクレオチドアナログ、トポイソメラーゼ阻害薬、微小管重合阻害薬、Ｂｃｌ２阻害薬、抗腫瘍性抗生物質、インターフェロン、サイトカイン製剤、分子標的薬、核酸合成阻害薬、ＪＡＫ阻害薬及びがん免疫治療薬から選択される一以上の薬剤とを組み合わせて投与することを特徴とする、がんの予防及び／又は治療方法。
　本発明に用いられる抗体は前記変異型のＣＡＬＲポリペプチド鎖中に抗原認識部位（エピトープ）を有し、前記抗がん薬と併用することで、各々単独で投与した場合に比べがん細胞を効果的に傷害し、抗腫瘍効果が飛躍的に向上する。従って、本発明の医薬を用いれば、種々のがん、特に変異型ＣＡＬＲを発現する疾患を特異的に予防及び／又は治療できる。
変異型ＣＡＬＲタンパク質の特徴を示す図である。ＭＰＮ患者の発症原因であるＣＡＬＲ遺伝子変異は、＋１フレームシフト変異であり、その結果できる変異型ＣＡＬＲタンパク質のＣ末端には、変異型タンパク質に共通したアミノ酸配列が見出される。ＳＰ：シグナル配列、Ｎ：Ｎドメイン、Ｐ：Ｐドメイン。矢印は、野生型（ＷＴ）と異なるアミノ酸配列が始まる部分を示している。 抗変異ＣＡＬＲ／ＣＤ３二重特異性抗体（抗体番号１）とヒドロキシウレアの併用効果を示す。変異型ＣＡＬＲ、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを発現させたＵＴ－７／ＴＰＯ／Ｉｎｓ５－Ｌｕｃ細胞（標的細胞）を、ＣＡＬＲ／ＣＤ３二重特異性抗体とヒドロキシウレア存在下でヒト末梢血Ｔ細胞と培養後、ルシフェラーゼ活性を指標として標的細胞の細胞生存率を測定し、Ｔ細胞依存的な細胞傷害活性（Ｔ　ｃｅｌｌ―ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：以下ＴＤＣＣ）を評価した。ＣＡＬＲ／ＣＤ３二重特異性抗体と併用薬物を含まない群の化学発光値を１００％として各ウェルの細胞生存率を算出した。 抗変異ＣＡＬＲ／ＣＤ３二重特異性抗体（抗体番号２）とヒドロキシウレアの併用効果を示す。 抗変異ＣＡＬＲ／ＣＤ３二重特異性抗体（抗体番号３）とヒドロキシウレアの併用効果を示す。 抗変異ＣＡＬＲ／ＣＤ３二重特異性抗体（抗体番号４）とヒドロキシウレアの併用効果を示す。 抗変異ＣＡＬＲ／ＣＤ３二重特異性抗体（抗体番号５）とヒドロキシウレアの併用効果を示す。 抗変異ＣＡＬＲ／ＣＤ３二重特異性抗体（抗体番号６）とヒドロキシウレアの併用効果を示す。 抗変異ＣＡＬＲ／ＣＤ３二重特異性抗体（抗体番号７）とヒドロキシウレアの併用効果を示す。 抗変異ＣＡＬＲ／ＣＤ３二重特異性抗体（抗体番号８）とヒドロキシウレアの併用効果を示す。 抗変異ＣＡＬＲ／ＣＤ３二重特異性抗体（抗体番号９）とヒドロキシウレアの併用効果を示す。 抗変異ＣＡＬＲ／ＣＤ３二重特異性抗体（抗体番号１）とルキソリチニブのｉｎ　ｖｉｔｒｏ有効性における併用効果を示す。変異型ＣＡＬＲ、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを発現させたＵＴ－７／ＴＰＯ／Ｉｎｓ５／ＧＦＰ－Ｌｕｃ細胞（標的細胞）を、ＣＡＬＲ／ＣＤ３二重特異性抗体とルキソリチニブ存在下でヒト末梢血Ｔ細胞と培養後、ルシフェラーゼ活性を指標として標的細胞の細胞生存率を測定し、Ｔ細胞依存的な細胞傷害活性（Ｔ　ｃｅｌｌ―ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：以下ＴＤＣＣ）を評価した。ＣＡＬＲ／ＣＤ３二重特異性抗体（抗体番号１）と併用薬物を含まない群の化学発光値を１００％として各ウェルの細胞生存率を算出した。 抗変異ＣＡＬＲ／ＣＤ３二重特異性抗体（抗体番号７）とルキソリチニブの併用効果を示す。 抗変異ＣＡＬＲ／ＣＤ３二重特異性抗体（抗体番号８）とルキソリチニブの併用効果を示す。 抗変異ＣＡＬＲ／ＣＤ３二重特異性抗体（抗体番号９）とルキソリチニブの併用効果を示す。 抗変異ＣＡＬＲ／ＣＤ３二重特異性抗体（抗体番号１）とインターフェロンαの併用効果を示す。変異型ＣＡＬＲ、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを発現させたＵＴ－７／ＴＰＯ／Ｉｎｓ５－Ｌｕｃ細胞（標的細胞）を、ＣＡＬＲ／ＣＤ３二重特異性抗体とインターフェロンα（ＩＦＮ－α）存在下でヒト末梢血Ｔ細胞と培養後、ルシフェラーゼ活性を指標として標的細胞の細胞生存率を測定し、Ｔ細胞依存的な細胞傷害活性（Ｔ　ｃｅｌｌ―ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：以下ＴＤＣＣ）を評価した。ＣＡＬＲ／ＣＤ３二重特異性抗体と併用薬物を含まない群の化学発光値を１００％として各ウェルの細胞生存率を算出した。 抗変異ＣＡＬＲ／ＣＤ３二重特異性抗体（抗体番号４）とＩＦＮ－αの併用効果を示す。 抗変異ＣＡＬＲ／ＣＤ３二重特異性抗体（抗体番号５）とＩＦＮ－αの併用効果を示す。 抗変異ＣＡＬＲ／ＣＤ３二重特異性抗体（抗体番号６）とＩＦＮ－αの併用効果を示す。 抗変異ＣＡＬＲ／ＣＤ３二重特異性抗体（抗体番号８）とＩＦＮ－αの併用効果を示す。 抗変異ＣＡＬＲ／ＣＤ３二重特異性抗体（抗体番号９）とＩＦＮ－αの併用効果を示す。
　本発明は、ＭＰＮに関連する変異型ＣＡＬＲタンパク質の検出及び診断方法並びにＭＰＮの予防又は治療として用いられる変異型ＣＡＬＲタンパク質に特異的な配列中で切断されて残存するＣ末端側のポリペプチド（図１）の中の１３アミノ酸（配列番号４）を認識する抗体、それよりもＣ末端側の配列（配列番号５）を認識する抗体と前記抗がん剤とを併用することにより効果的にがんを治療及び／又は予防できることを見出した。
　すなわち、本発明は、（Ａ）変異型ＣＡＬＲタンパク質を特異的に認識する抗体と、（Ｂ）前記抗がん薬とを組み合わせてなるがん予防及び／又は治療用医薬、特にＭＰＮを予防及び／又は治療するための医薬を提供する。
　本発明の医薬に用いられる成分（Ａ）は、変異型ＣＡＬＲタンパク質を特異的に認識する抗体である。
　本明細書において、抗体又はその機能的断片とは、モノクローナル抗体及び遺伝子組み換え技術により作製されたキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、ｅｎｇａｇｅｒ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディなどを含む変異ＣＡＬＲに特異的に結合するタンパク質、そのタンパク質断片及びそのタンパク質断片を含む誘導体を意味する。
　モノクローナル抗体の形態としては、ヒト及びヒト以外の動物のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤが含まれる。
　また、二重特異性及び多重特異性抗体の形態としては、特に限定されず、当該技術分野で公知の形態のいずれであってもよく、２種以上の抗原に対する特異性を保持している限り、それ以外の形態であってもよい。
　二重特異性抗体の形態は、ＩｇＧ様型と低分子型に大別される。ＩｇＧ様型とは、Ｆｃ領域を保持した形態である。ＩｇＧ様型抗体の形態としては、これらに限定されるものではないが、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＤＡＦ（ｔｗｏ－ｉｎ－ｏｎｅ）、ＤＡＦ（ｆｏｕｒ－ｉｎ－ｏｎｅ）、ＤｕｔａＭａｂ、ＤＴ－ＩｇＧ、ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ、ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ　ｃｏｍｍｏｎ　ＬＣ、ＳＥＥＤｂｏｄｙ、Ｔｒｉｏｍａｂ、κλ－ｂｏｄｙ、ＤＶＤ－Ｉｇ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ＤｕｏＢｏｄｙ等が挙げられる。ＩｇＧ様型抗体では、Ｆｃ領域を保持しているため、ＡＤＣＣやＣＤＣといったエフェクター機能の発揮、精製の容易化、安定性の改善、血中半減期の延長等が期待される。一方、低分子型とは、通常、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とからなるＦｖ領域を基本の構成要素とした形態である。低分子型抗体の形態としては、これらに限定されるものではないが、Ｄｉａｂｏｄｙ（Ｄｂ）、ＢｉＴＥ、ＤＡＲＴ、ＴａｎｄＡｂ、ｓｃＤｂ、ｔｒｉｐｌｅ　ｂｏｄｙ、ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ、ｍｉｎｉｂｏｄｙ、ｓｃＦｖ、ｔａｎｄｅｍ　ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）2等が挙げられる。低分子型では、その大きさから、組織透過性の向上や生産性の高さ等が期待される。その他、抗原との結合能を保持したままアミノ酸配列を欠失、置換若しくは付加させたもの、糖鎖の一部又は全部を欠失又は付加させたもの、リンカー等が付加したもの、他のタンパク質と融合させたもの、抗体と低分子医薬とをリンカーを介して結合した抗体薬物複合体（ＡＤＣ）等の改変抗体も包含される。
　本発明の抗体は、変異型カルレティキュリンタンパク質に特異的に結合するドメインを有する。
　前記ドメインは、配列番号４又は５の変異型カルレティキュリンタンパク質のエピトープに結合する抗体と競合する。ここで、変異型カルレティキュリンタンパク質は、配列番号４又は５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖中、又は配列番号４又は５において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖中に抗原認識部位を有するものであるのが好ましい。
　前記ドメインは、野生型カルレティキュリンタンパク質に結合せず、変異型カルレティキュリンタンパク質に対して高い親和性を有する。
　切断型のＣＡＬＲタンパク質としては、配列番号４又は５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｉ）及び配列番号４又は５において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｉｉ）が挙げられる。（ｉｉ）においては、１～４個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が好ましく、１～３個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列がより好ましい。また、ポリペプチド（ｉｉ）のアミノ酸配列と配列番号１のアミノ酸配列の同一性は、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましい。
　抗体の結合ドメインとしては、（ｉ）又は（ｉｉ）のポリペプチド鎖中に抗原認識部位（エピトープ）を有する抗体であればよいが、切断型の変異型ＣＡＬＲタンパク質にのみ結合するものであっても、切断型の変異型ＣＡＬＲタンパク質と全長型の変異型ＣＡＬＲタンパク質の両方に結合するものであってもよく、切断型の変異型ＣＡＬＲタンパク質と全長型の変異型ＣＡＬＲタンパク質の両方に結合する「変異型ＣＡＬＲタンパク質」に特異的な抗体であることが好ましい。
　このような結合ドメインは、本発明者らが見出した抗変異ＣＡＬＲ抗体（クローンＢ３、Ｃ６及びＧ１抗体）の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、さらに重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３）及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３）であることが好ましい。
　二重特異性抗体においては、第１のドメインは、前記抗変異ＣＡＬＲ抗体（クローンＢ３、Ｃ６及びＧ１抗体）の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、さらに重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３）及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３）であることが好ましい。
　二重特異性抗体における第２のドメインは、ＣＤ３抗原に特異的に結合するドメインが好ましく、既存の抗ＣＤ３抗体由来の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、さらに既知の抗ＣＤ３抗体由来の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３）及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３）であることが好ましい。既存の抗ＣＤ３抗体としては、ＯＫＴ３又はＵＣＴＨ１が挙げられる。
　本発明の抗体の好ましい例は、抗変異ＣＡＬＲ抗体（クローンＢ３、Ｃ６及びＧ１抗体）の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、さらに重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３）及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３）であり、そのアミノ酸配列の例を表１に示す。
　また、表１には、二重特異性抗体の第１のドメイン及び第２のドメインの好ましい例として、抗変異ＣＡＬＲ抗体（クローンＢ３、Ｃ６及びＧ１抗体）及び抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、ＵＣＨＴ１）の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、さらに重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３）及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３）のアミノ酸配列も表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
　これらの領域は、切断型の変異型ＣＡＬＲタンパク質の一部又は全長を動物に免疫又はリンパ球をｉｎ　ｖｉｔｒｏで感作しミエローマと融合させることで得た抗体やファージディスプレイ等の抗体ライブラリー等により得られた抗体の配列情報を基に遺伝子工学的手法でリコンビナント抗体として作製することができる。抗ＣＤ３抗体に関する配列情報は、既存の情報より得ることができる。すなわち、得られた遺伝子情報より抗体の重鎖及び軽鎖の遺伝子を合成し、これをベクター（例えば、プラスミド）に挿入後、宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞等）に導入し、宿主細胞を培養することにより、培養物からリコンビナント抗体を採取することができる。抗体の重鎖及び軽鎖の遺伝子を合成するにあたっては、コドンを最適化することが好ましい。
　本発明の好ましい二重特異性抗体としては、第１のドメインのＣＤＲが、（ａ）配列番号１４－１６（ＶＨＣＤＲ）で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び配列番号１７－１９（ＶＬＣＤＲ）で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する、（ｂ）配列番号２０－２２（ＶＨＣＤＲ）で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び配列番号２３－２５（ＶＬＣＤＲ）で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する、又は（ｃ）配列番号２６－２８（ＶＨＣＤＲ）で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び配列番号２９－３１（ＶＬＣＤＲ）で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する、二重特異性抗体が挙げられる。
　さらに、第１のドメインが、（ｄ）配列番号６で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＶＨ領域、及び配列番号７で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＶＬ領域を有する、（ｅ）配列番号８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＶＨ領域、及び配列番号９で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＶＬ領域を有する、又は（ｆ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＶＨ領域、及び配列番号１１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＶＬ領域を有する、二重特異性抗体が挙げられる。
　また、第２のドメインのＣＤＲが、配列番号３２－３４（ＶＨＣＤＲ）で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び配列番号３５－３７（ＶＬＣＤＲ）で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する、二重特異性抗体、又は配列番号２１９－２２１（ＶＨＣＤＲ）で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び配列番号２２２－２２４（ＶＬＣＤＲ）で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する、二重特異性抗体が好ましい。
　さらに、第２のドメインが、配列番号１２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＶＨ領域、及び配列番号１３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＶＬ領域を有する、二重特異性抗体、又は第２のドメインが、配列番号２１７で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＶＨ領域、及び配列番号２１８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＶＬ領域を有する、二重特異性抗体が好ましい。
　本発明のより好ましい二重特異性抗体としては、第１のドメインのＣＤＲが、（ａ）配列番号１４－１６（ＶＨＣＤＲ）で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び配列番号１７－１９（ＶＬＣＤＲ）で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する、（ｂ）配列番号２０－２２（ＶＨＣＤＲ）で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び配列番号２３－２５（ＶＬＣＤＲ）で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する、又は（ｃ）配列番号２６－２８（ＶＨＣＤＲ）で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び配列番号２９－３１（ＶＬＣＤＲ）で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものであり；第２のドメインのＣＤＲが、配列番号３２－３４（ＶＨＣＤＲ）で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び配列番号３５－３７（ＶＬＣＤＲ）で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する、又は配列番号２１９－２２１（ＶＨＣＤＲ）で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び配列番号２２２－２２４（ＶＬＣＤＲ）で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものである二重特異性抗体が挙げられる。
　さらに好ましい二重特異性抗体としては、第１のドメインが、（ｄ）配列番号６で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＶＨ領域、及び配列番号７で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＶＬ領域を有する、（ｅ）配列番号８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＶＨ領域、及び配列番号９で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＶＬ領域を有する、又は（ｆ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＶＨ領域、及び配列番号１１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＶＬ領域を有するものであり、第２のドメインが、（ｇ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＶＨ領域、及び配列番号１３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＶＬ領域を有する、又は（ｈ）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＶＨ領域、及び配列番号２１８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＶＬ領域を有する二重特異性抗体が挙げられる。
　前記のように、本発明の抗体の形態としては、前記２種の抗原に対する特異性を保持している限り、どのような形態であってもよく、ＩｇＧ様型でも低分子型でもよい。具体的には、Ｆｃ領域又はヘテロＨ鎖等を有していてもよい。
　前記二重特異性抗体の具体例としては、次の（Ｉ）～（ＩＸ）から選ばれる抗体が挙げられる。
（Ｉ）配列番号１７４に示されるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２０２に示されるアミノ酸配列を含むＬ鎖からなる二重特異性抗体（抗体１）。
（ＩＩ）配列番号１８６に示されるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２０１に示されるアミノ酸配列を含むＬ鎖からなる二重特異性抗体（抗体２）。
（ＩＩＩ）配列番号１７４に示されるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２０１に示されるアミノ酸配列を含むＬ鎖からなる二重特異性抗体（抗体３）。
（ＩＶ）配列番号１８０に示されるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２０２に示されるアミノ酸配列を含むＬ鎖からなる二重特異性抗体（抗体４）。
（Ｖ）配列番号１８１に示されるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２０２に示されるアミノ酸配列を含むＬ鎖からなる二重特異性抗体（抗体５）。
（ＶＩ）配列番号１６１に示されるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号１７１に示されるアミノ酸配列を含むＬ鎖からなる二重特異性抗体（抗体６）。
（ＶＩＩ）配列番号２２５に示されるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２０２に示されるアミノ酸配列を含むＬ鎖からなる二重特異性抗体（抗体７）。
　上記（Ｉ）～（ＶＩＩ）の抗体はすべて同じ構造をしており、変異ＣＡＬＲに特異的に結合するＦａｂ断片の重鎖Ｃ末端にＣＤ３に特異的に結合する単鎖Ｆｖがペプチドリンカーを介して融合したポリペプチドにさらにＦｃが融合している二重特性抗体である。
（ＶＩＩＩ）配列番号２２６に示されるアミノ酸配列からなる二重特異性抗体（抗体８）。
（ＩＸ）配列番号２２７に示されるアミノ酸配列を含むＨ鎖、及び配列番号２２８に示されるアミノ酸配列を含むＬ鎖からなる二重特異性抗体であって、ＣＤ３抗原に特異的に結合する単鎖ＦｖのＣ末端に変異ＣＡＬＲに特異的に結合するＩｇＧの軽鎖Ｎ末端がペプチドリンカーを介して融合している二重特異性抗体（抗体９）。
　本発明の二重特異性抗体の好ましい具体例は、前記の各配列を有するものであって、これらの領域以外の領域のアミノ酸配列は特に制限されない。また、本発明の抗体は、ヒト化抗体及びヒト以外の哺乳動物抗体でもよい。より具体的には、ヒト以外の哺乳動物、例えば、ラット抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなるキメラ抗体であってもよく、このような抗体はラット抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体の一例として、以下にＶＨ１～５及びＶＬ１～５を示す（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
　また、別のヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ　ｖｉｔｒｏで所望の抗原又は所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１－５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９３／１２２２７，ＷＯ９２／０３９１８，ＷＯ９４／０２６０２，ＷＯ９４／２５５８５，ＷＯ９６／３４０９６，ＷＯ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／２０７９１，ＷＯ９３／０６２１３，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９３／１９１７２，ＷＯ９５／０１４３８，ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。
　二重特異性抗体は、例えば抗変異ＣＡＬＲ抗体及び抗ＣＤ３抗体をコードするＤＮＡと発現ベクターを用いて二重特異性抗体発現ベクターを構築し、発現ベクターをＣＨＯ細胞又はＨＥＫ２９３細胞に導入し、形質転換した細胞を得ることができる。この形質転細胞を培養した培養液をクロマトグラフィーにより精製し得ることができる。二重特異性抗体の作製方法は既に周知であり、ＪＰ２０１９０２２４９７、ＪＰ２０１７１３７３２９、ＪＰ２０１５１１０６２８を参考にすることができる。
　抗体のクラスは特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有する抗体を包含する。精製の容易性等を考慮すると、好ましくはＩｇＧである。
　ドメイン構造としては、抗体断片（フラグメント）等の低分子化抗体や抗体の修飾物が挙げられる。抗体断片の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ等を挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。後述の実施例では、Ｆｃ受容体への結合親和性を抑制するとされる２２８、２３３－２３８、２６５、２６８、３０９、３１８、３２８－３３１のアミノ酸変異を有するヒトＩｇＧのＨ鎖定常領域やヘテロＨ鎖のための３４９、３５４、３６６、３６８、４０７アミノ酸変異を示すが、これらに限定されるものではない。
　また、本発明の抗体のうち、前記（ｉ）又は（ｉｉ）のポリペプチドに結合する抗体はこれらのポリペプチドに結合すればよい。一方、ＭＰＮの予防及び／又は治療に用いる抗体は、前記（ｉ）又は（ｉｉ）のポリペプチドに結合し、細胞傷害活性を有する抗体が好ましい。
　切断型の変異型ＣＡＬＲタンパク質に結合する抗体としては、配列番号２又は３で表される配列を有するポリペプチド鎖に結合する抗体であればよいが、変異型ＣＡＬＲタンパク質中の配列番号２又は３で表されるアミノ酸配列部分への結合において、少なくとも前記抗体、又はその機能的断片のいずれか一つと競合する抗体であることが好ましい。
　成分（Ｂ）としては、アルキル化剤、白金製剤、代謝拮抗剤、リボヌクレオチドリダクターゼ阻害薬、ヌクレオチドアナログ、トポイソメラーゼ阻害薬、微小管重合阻害薬、Ｂｃｌ２阻害薬、抗腫瘍性抗生物質、インターフェロン、サイトカイン製剤、分子標的薬、核酸合成阻害薬、ＪＡＫ阻害薬及びがん免疫治療薬から選択される一以上の薬剤が挙げられるが、このうちＪＡＫ阻害薬、代謝拮抗剤（リボヌクレオチドリダクターゼ阻害剤を含む）、核酸合成阻害薬、インターフェロン、サイトカイン製剤、分子標的薬及びがん免疫治療薬から選択される一以上の薬剤が好ましい。
　アルキル化剤としては、シクロホスファミド、イホスファミド、ダカルジン、テモゾロミド、ニムスチン、ブスルファン、ラニムスチンなどが挙げられる。白金製剤としては、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチンなどが挙げられる。代謝拮抗剤、リボヌクレオチドリダクターゼ阻害剤、ヌクレオチドアナログとしては、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、５－ＦＵ、テガフール、６－メルカプトプリン、カペシタビン、ペンドスタチンなどが挙げられる。トポイソメラーゼ阻害剤としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ピラルビシン、アムルビシン、エトポシド、イリノテカンなどが挙げられる。Ｂｃｌ２阻害薬としては、べネクレクスタなどが挙げられる。抗腫瘍性抗生物質としては、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、ベプロマイシン、ジノスタチンスチマーなどが挙げられる。微小管重合阻害薬としては、パクリタキセル、ドセタキセルなどが挙げられる。ＪＡＫ阻害薬としては、トファシチニブ、バリシチニブ、ペフィシチニブ、ウパダシチニブ、フィルゴチニブ、アグロシチニブ、ルキソリチニブなどが挙げられる。インターフェロンとしては、インターフェロン－α、インターフェロン－β、インターフェロン－γなどが挙げられる。サイトカイン製剤としては、インターロイキン２などが挙げられる。核酸合成阻害薬としては、アザチオプリオン、ミゾリビン、シクロホスファミドなどが挙げられる。分子標的薬及びがん免疫治療薬としては、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体などの抗体医薬、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、ダコシチニブなどのＥＧＦＲ作用薬、ラパチニブなどのＨＥＲ２作用薬、エペロリムス、テムシロリムス、シロリムスなどのｍＴＯＲ作用薬、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇなどのがん免疫チェックチェックポイント阻害薬などが挙げられる（がん免疫チェックポイント阻害薬は、分子標的薬にも分類される）。
　ここで、抗ＰＤ－１抗体としては、ニボルマブ、ペムブロリズマブ等が挙げられる。抗ＰＤ－Ｌ１抗体としては、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ等が挙げられる。抗ＣＴＬＡ－４抗体としては、イピリムマブ、トレメリムマブ等が挙げられる。ＣＴＬＡ－４－Ｉｇとしては、アバタセプトが挙げられる。
　これらの成分（Ｂ）のうち、ルキソリチニブ、ヒドロキシウレア、インターフェロンα及びがん免疫チェックポイント阻害薬から選択される一以上の薬剤が特に好ましい。
　後記実施例に示すように、成分（Ａ）と成分（Ｂ）とを併用すれば（組み合わせて用いれば）、種々のがんに対する抗腫瘍効果が増強され、がんの予防及び／又は治療用医薬として有用である。
　また、成分（Ａ）は、成分（Ｂ）の抗腫瘍効果増強剤として有用である。さらに、成分（Ｂ）は、成分（Ａ）の抗腫瘍効果増強剤として有用である。
　本発明の組み合わせ医薬の形態は特に限定されず、具体的には例えば、以下の（ｉ）、（ｉｉ）の形態が挙げられる。
（ｉ）成分（Ａ）及び成分（Ｂ）の両成分を共に含有する単一製剤（配合剤）の形態。
（ｉｉ）成分（Ａ）を含有する製剤と成分（Ｂ）を含有する製剤とを別々に投与するための形態。
　なお、当該（ｉｉ）に係る形態の場合においては、各製剤を同時に投与するか、又は適宜の時間間隔をあけて別々に投与してもよく、所望のがんの予防及び／又は治療効果が達成されるように、適切な投与計画を採用することが可能である。成分（Ａ）を有する製剤、及び成分（Ｂ）を含有する製剤を別々に投与するための形態においては、両製剤を単一包装中に含むキット製剤として提供することもできる。
　本発明の対象となるがんとしては、具体的には、リンパ腫、白血病、多発性骨髄種、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）、頭頚部がん、消化器がん（食道がん、胃がん、十二指腸がんなど）、肝臓がん、胆道がん（胆嚢・胆管がんなど）、膵臓がん、小腸がん、大腸がん（結腸直腸がん、結腸がん、直腸がんなど）、消化管間質腫瘍、肺がん（非小細胞肺がん、小細胞肺がん）、乳がん、卵巣がん、子宮がん（子宮頚がん、子宮体がんなど）、腎がん、膀胱がん、前立腺がん、皮膚がん等が挙げられる。なお、ここでがんには、原発巣のみならず、他の臓器（肝臓など）に転移したがんをも含む。
　本発明の医薬は、リンパ腫、白血病、多発性骨髄種、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）、消化器がん（食道がん、胃がん、十二指腸がんなど）、肝臓がん、胆道がん（胆嚢・胆管がんなど）、膵臓がん、小腸がん、大腸がん（結腸直腸がん、結腸がん、直腸がんなど）、消化管間質腫瘍、肺がん（非小細胞肺がん、小細胞肺がんなど）、腎がんなどにより有用であり、更にリンパ腫、白血病、多発性骨髄種、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）などに有用であり、よりさらに変異ＣＡＬＲが検出されるがん、特にＭＰＮに対して有用である。
　本発明の医薬は、前記のように、成分（Ａ）を含有する組成物、成分（Ｂ）を含有する組成物、又は成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を含有する組成物の形態とすればよいが、これらの組成物は、成分（Ａ）及び／又は（Ｂ）と薬学的に許容しうる担体とともに、混合、溶解、乳化、カプセル封入、あるいは凍結乾燥等により、製剤化して製造することができる。
　経口投与用の好適な製剤は、成分（Ａ）及び／又は成分（Ｂ）を、水あるいは生理食塩水のような希釈剤に有効量を溶解させた液剤、有効量を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、顆粒剤、散剤、又は錠剤、適当な分散媒中に有効量を懸濁させた懸濁液剤、有効量を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
　非経口投与用には、成分（Ａ）及び／又は成分（Ｂ）を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、注射用溶液、懸濁液、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、吸入剤、坐剤等の剤形に製剤化することができる。注射用の処方においては、成分（Ａ）及び／又は成分（Ｂ）を水性溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、又は生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中に溶解することができる。さらに、本発明の医薬は、油性又は水性のベヒクル中で、懸濁液、溶液、又は乳濁液等の形状をとることができる。あるいは、成分（Ａ）及び／又は成分（Ｂ）を粉体の形態で製造し、使用前に滅菌水等を用いて水溶液又は懸濁液を調製してもよい。吸入による投与用には、成分（Ａ）及び／又は成分（Ｂ）を粉末化し、ラクトース又はデンプン等の適当な基剤とともに粉末混合物とすることができる。坐剤処方は、成分（Ａ）及び／又は成分（Ｂ）をカカオバター等の慣用の坐剤基剤と混合することにより製造することができる。さらに、本発明の医薬は、ポリマーマトリクス等に封入して、持続放出用製剤として処方することができる。
　成分（Ｂ）は、すでに市販されているものを使用する場合には、その用法用量に従って投与することができる。成分（Ａ）については、１回０．３ｍｇ以上を投与することが好ましく、０．３ｍｇ～３００ｍｇ投与することがより好ましく、３ｍｇ～３００ｍｇ投与することが更に好ましい
　次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されない。
［試験例１］切断型を含む変異型ＣＡＬＲタンパク質を認識する抗体の作製
　Ｄｉａｎｏｖａ社製マウスモノクローナル抗体クローンＣＡＬ２（Ｃａｔ＃ＤＩＡ－ＣＡＬ）又は配列番号２－５に含まれるアミノ酸配列のＣ末端あるいはＮ末端にシステインを付加したペプチドを合成し、キャリアータンパク質キーホールリンペットヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｌｉｍｐｅｔ　Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ；ＫＬＨ）と結合させてから、８週齢のメスのＷＫＹ／Ｉｚｍラットに免疫し、追加免疫後にリンパ球を回収した。リンパ球をマウスミエローマＳＰ２細胞とＰＥＧ法により細胞融合させてから、選択培地で培養しハイブリドーマを取得した。培養上清中の抗体の特異性を、免疫したペプチドや精製タンパク質を用いたＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングすることで、切断型を含む変異型ＣＡＬＲタンパク質に結合する抗体を産生するハイブリドーマ（クローンＢ３、Ｃ６及びＧ１）を取得した。これらのハイブリドーマから産生された抗体を精製し、試験に用いた（クローンＢ３抗体、Ｃ６抗体及びＧ１抗体）。
［試験例２］変異型ＣＡＬＲ発現細胞の作製
　ヒト巨核芽球性白血病細胞株ＵＴ－７／ＴＰＯ細胞に、Ｄｅｌ　５２あるいはＩｎｓ　５型の変異型ＣＡＬＲタンパク質を発現させることで腫瘍性に増殖するＵＴ－７／ＴＰＯ　ＣＡＬＲ　Ｄｅｌ　５２細胞及びＵＴ－７／ＴＰＯ　ＣＡＬＲ　Ｉｎｓ　５細胞と、コントロールとして遺伝子導入に使用したベクターのみを導入したＵＴ－７／ＴＰＯ　ｖｅｃ細胞を、６．０×１０5個／ｍＬの密度でＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ）に播種し、５％ＣＯ2存在下において３７℃で３２時間培養した。この際、ＵＴ－７／ＴＰＯ　ｖｅｃ細胞は、１０ｎｇ／ｍＬ　ＴＰＯを含む培地で培養した。
［試験例３］変異型ＣＡＬＲタンパク質を認識することの確認
　Ｎ末端のシグナル配列の下流にＦＬＡＧタグを挿入したＤｅｌ　５２型あるいはＩｎｓ　５型の変異型ＣＡＬＲを発現するＵＴ－７／ＴＰＯ細胞を培養し、分泌された変異型ＣＡＬＲタンパク質を含む培養上清を遠心分離（１，６００ｇ×５分、４℃）により調製した。得られた培養上清をＳＤＳと還元剤存在下で加熱処理したあと、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法によりゲル上に展開した上で、ポリビリニデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に電気的に転写し、５％スキムミルクを含むＴＢＳ－Ｔ溶液と室温で１時間反応させてから、ラットクローンＢ３、Ｃ６、Ｇ１抗体、あるいはマウス抗ＤＹＫＤＤＤＤＫ　ｔａｇ抗体（富士フイルム和光純薬）を含む５％ＢＳＡ／ＴＢＳ－Ｔ溶液と４℃において一晩反応させた。ＴＢＳ－Ｔ溶液による洗浄を行なった後、それぞれ、ペルオキシダーゼ標識されたヤギ抗ラットＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ．）、あるいはペルオキシダーゼ標識されたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ．）を含む５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔ溶液と室温で１時間反応を行なった。ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ－Ｔ溶液で洗浄した後に、ペルオキシダーゼ発光試薬と反応させて得られたシグナルを、ＦＵＳＩＯＮ撮像装置を使用して検出した。
　その結果、クローンＢ３、Ｃ６及びＧ１抗体はいずれも全長型と切断型の変異型ＣＡＬＲタンパク質を認識し、ＣＡＬ２は、全長型とＢ３、Ｃ６及びＧ１抗体の認識配列よりＣ末端側配列を認識することが確認された。
［試験例４］本発明抗体の配列情報の決定
　本発明の抗体の重鎖及び軽鎖の配列情報を、抗体を産生する細胞から、ＰｕｒｅＬｉｎｃ　ＲＮＡ　Ｍｉｎｉキット（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、ｍＲＮＡを調製した。得られたｍＲＮＡを鋳型に、重鎖あるいは軽鎖特異的な逆転写プライマーを用いて、Ｒａｐｉｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｅｎｄｓ法によりｃＤＮＡを合成した後、プラスミドにクローニングした。得られたプラスミドをサンガーシークエンス解析することで、重鎖と軽鎖のｃＤＮＡの全長配列を決定した。
［実施例１］二重特異性抗体の調製
　材料及び試験方法
　クローンＢ３、Ｃ６、Ｇ１抗体及び抗ＣＤ３抗体の配列情報（表１）を元にした二重特異性抗体をコードするＤＮＡと発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．４、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて二重特異性抗体発現ベクターを構築した。上記の発現ベクターをＣＨＯ細胞又はＨＥＫ２９３細胞にＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ　ＣＨＯ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ）又はＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ　２９３　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ）により導入し、形質転換した細胞を培養したのちに遠心分離及びフィルトレーションにより細胞を除去し、培養液を回収した。抗体の精製はニッケル結合アガロースを用いたアフィニティクロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーの組み合わせ、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティクロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーの組み合わせ、又はＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ　ｋａｐｐａ　ＸＬレジン（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ）を用いたアフィニティクロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーの組み合わせで実施した。また、上記と同様の手法により特許文献４及び特許文献２に記載の配列情報を元にした二重特異性抗体（抗体３２：配列番号１１４及び配列番号１１５、抗体３３：配列番号１１６及び配列番号１１７、抗体３４：配列番号１１８及び配列番号１１９）及びＢ３キメラ抗体（配列番号５２及び配列番号６４）を調製した。
［実施例２］フローサイトメトリー解析による細胞表面の変異型ＣＡＬＲタンパク質を認識することの確認
　材料及び試験方法
　コントロールとして遺伝子導入に使用したベクターのみを導入したＵＴ－７／ＴＰＯ　ｖｅｃ細胞、変異型ＣＡＬＲを発現するＵＴ－７／ＴＰＯ　ＣＡＬＲ　Ｉｎｓ　５細胞及びＵＴ－７／ＴＰＯ　ＣＡＬＲ　Ｄｅｌ　５２細胞をウシ胎児非働化血清（ＦＢＳ）１０％を含むＩＭＤＭ培地を用いて、５％ＣＯ2存在下において３７℃で培養した。増殖期の細胞５×１０4個を遠心分離（４００ｇ×５分、４℃）後、ＦＢＳ／ＰＢＳ溶液中で各種抗体を５μｇ／ｍＬの濃度に調製し、氷上で３０分間反応させた。反応後、ＭＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒを用いて２回細胞を洗浄した後、２次抗体として、抗ヒトＦｃ抗体をＦＢＳ／ＰＢＳ溶液中において２．５μｇ／ｍＬの濃度に調製し、氷上で３０分間反応させた。
　反応終了後にＭＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒを加えて遠心分離（４００ｇ×５分、４℃）し、上清を廃棄することで細胞を２回洗浄し、ＢＤ　ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ　Ｘ－２０（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてフローサイトメトリー解析により、シグナルを定量した。
　配列番号６のＶＨ鎖、配列番号３のＶＬ鎖、配列番号８のＶＨ鎖及び配列番号９のＶＬ鎖を用いて作製した、代表的な抗切断型変異ＣＡＬＲ－ＣＤ３二重特異性抗体を用いて、〔ａ〕ＵＴ－７／ＴＰＯ　ｖｅｃ細胞、〔ｂ〕ＵＴ－７／ＴＰＯ　ＣＡＬＲ　Ｉｎｓ　５細胞及び〔ｃ〕ＵＴ－７／ＴＰＯ　ＣＡＬＲ　Ｄｅｌ　５２細胞をフローサイトメトリー解析した。
［実施例３］フローサイトメトリー解析による細胞表面のＣＤ３抗原を認識することの確認
　材料及び試験方法
　健康なヒトドナーから単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を抗ＣＤ３抗体（タカラバイオ）で４～２４時間コーティングしたプレートで２日間培養後、ＩＬ－２と１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）でさらに１０～２１日間培養してＴ－ＬＡＫ細胞を誘導した。Ｔ－ＬＡＫ細胞５×１０5個を遠心分離（４００ｇ×５分、４℃）後、ＦＢＳ／ＰＢＳ溶液中で配列番号２のＶＨ鎖、配列番号３のＶＬ鎖、配列番号８のＶＨ鎖及び配列番号９のＶＬ鎖を用いて作製した抗切断型変異ＣＡＬＲ－ＣＤ３二重特異性抗体を５μｇ／ｍＬの濃度に調製し、氷上で３０分間反応させた。
　反応後、ＭＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒを用いて２回細胞を洗浄した後、２次抗体として、抗ヒトＦｃ抗体をＦＢＳ／ＰＢＳ溶液中において５μｇ／ｍＬの濃度に調製し、氷上で３０分間反応させた。反応終了後にＭＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒを加えて遠心分離（４００ｇ×５分、４℃）し、上清を廃棄することで細胞を２回洗浄し、ＢＤ　ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ　Ｘ－２０（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてフローサイトメトリー解析により、シグナルを定量した。
　その結果、二重特異性抗体は、Ｔ－ＬＡＫ細胞表面に発現するＣＤ３抗原を特異的に認識することが確認された。
［実施例４］ｉｎ　ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性評価
　（材料及び試験方法）
　標的細胞であるＵＴ－７／ＴＰＯ／Ｉｎｓ５－Ｌｕｃ細胞を、二重特異性抗体とハイドロキシウレア、ルキソリチニブあるいはインターフェロンαの存在下で、Ｔ細胞と培養後、ルシフェラーゼ活性を指標として標的細胞の細胞生存率を測定し、Ｔ細胞依存的な細胞傷害活性（Ｔ　ｃｅｌｌ―ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：以下ＴＤＣＣ）を評価した。
　Ｔ細胞は、健常人血液からＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、または健常人末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からＰａｎ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて分離・濃縮した。
　３８４ウェルプレートにおいて、各ウェルにＴ細胞懸濁液２０μＬ、標的細胞２０μＬ、抗二重特異性抗体希釈液５μＬ、併用薬物希釈液５μＬを加え（最終容量５０μＬ／ｗｅｌｌ、Ｔ細胞５ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、標的細胞５ｘ１０3ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、Ｅ／Ｔ＝１０）、３７℃、５％ＣＯ2で４８時間培養後、各ウェルに２５μＬのＳｔｅａｄｙ―Ｇｌｏ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ試薬を加え、各ウェルの化学発光を測定した。
　二重特異性抗体と併用薬物を含まないコントロールウェルの化学発光値を１００％として各ウェルの細胞生存率を算出した。
　併用効果は併用指数（ＣＩ：ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｉｎｄｅｘ）を用いて評価した。ＣＩの算出は、Ｃｈｏｕ－Ｔａｌａｌａｙ法に基づいて（Ｃｈｏｕ　Ｔ．Ｃ．＆Ｔａｌａｌａｙ，Ｐ．：Ａｄｖ．Ｅｎｚ．Ｒｅｇｕｌ．２２：２７－５５，１９８４）、ＣｏｍｐｕＳｙｎソフトウェア（Ｃｏｍｂｏｓｙｎ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。ＣＩが０．７を下回る場合に相乗効果があると判定され、０．３を下回る場合には強い相乗効果があると判定される。ＣＩが１前後は相加的な効果と判定される。表３に、ＣＩの代表値として、細胞傷害活性が８５％を上回り、かつ併用効果が認められた最小濃度の組み合わせにおけるＣＩの値をまとめた。
　図２－Ａ～図４及び表３に示すように、本発明の抗体と前記薬剤との組み合わせは、変異型ＣＡＬＲを発現させたＵＴ－７／ＴＰＯ　ＣＡＬＲ　Ｉｎｓ　５細胞に対して細胞傷害害活性を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009

Claims (10)

  1. 　（Ａ）変異カルレティキュリンタンパク質に特異的に結合する抗体又はその機能的断片と、（Ｂ）アルキル化剤、白金製剤、代謝拮抗剤、リボヌクレオチドリダクターゼ阻害薬、ヌクレオチドアナログ、トポイソメラーゼ阻害薬、微小管重合阻害薬、Ｂｃｌ２阻害薬、抗腫瘍性抗生物質、インターフェロン、サイトカイン製剤、分子標的薬、核酸合成阻害薬、ＪＡＫ阻害薬及びがん免疫治療薬から選択される一以上の薬剤とを組み合わせてなるがん予防及び／又は治療用医薬。
  2. 　成分（Ａ）が、野生型カルレティキュリンタンパク質に結合せず、変異型カルレティキュリンタンパク質に対して高い親和性を有する抗体又はその機能的断片である請求項１に記載の医薬。
  3. 　成分（Ａ）が、配列番号２又は３で表される変異アミノ酸配列又はそれらの配列と８０％以上の相同性を示す配列に結合する抗体又はその機能的断片である請求項１又は２に記載の医薬。
  4. 　成分（Ａ）が、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、動物由来抗体とヒト抗体のキメラ抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）及びダイアボディから選択される一以上の抗体又はその機能的断片である請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬。
  5. 　成分（Ｂ）が、ＪＡＫ阻害薬、核酸合成阻害薬、インターフェロン、サイトカイン製剤、分子標的薬及びがん免疫治療薬から選択される一以上の薬剤である請求項１～４のいずれか１項に記載の医薬。
  6. 　成分（Ｂ）が、ルキソニチリブ、ヒドロキシウレア、インターフェロンα及び免疫チェックポイント阻害薬から選択される一以上の薬剤である請求項１～５のいずれか１項に記載の医薬。
  7. 　がんが、リンパ腫、白血病、多発性骨髄種、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）、消化器がん（食道がん、胃がん、十二指腸がんなど）、肝臓がん、胆道がん（胆嚢・胆管がんなど）、膵臓がん、小腸がん、大腸がん（結腸直腸がん、結腸がん、直腸がんなど）、消化管間質腫瘍、肺がん（非小細胞肺がん、小細胞肺がん）及び腎がんから選ばれるがんである請求項１～６のいずれか１項に記載の医薬。
  8. 　がん予防及び／又は治療用医薬を製造するための、（Ａ）変異カルレティキュリンタンパク質に特異的に結合する抗体又はその機能的断片と、（Ｂ）アルキル化剤、白金製剤、代謝拮抗剤、リボヌクレオチドリダクターゼ阻害薬、ヌクレオチドアナログ、トポイソメラーゼ阻害薬、微小管重合阻害薬、Ｂｃｌ２阻害薬、抗腫瘍性抗生物質、インターフェロン、サイトカイン製剤、分子標的薬、核酸合成阻害薬、ＪＡＫ阻害薬及びがん免疫治療薬から選択される一以上の薬剤とを組み合わせの使用。
  9. 　がんを予防及び／又は治療するための、（Ａ）変異カルレティキュリンタンパク質に特異的に結合する抗体又はその機能的断片と、（Ｂ）アルキル化剤、白金製剤、代謝拮抗剤、リボヌクレオチドリダクターゼ阻害薬、ヌクレオチドアナログ、トポイソメラーゼ阻害薬、微小管重合阻害薬、Ｂｃｌ２阻害薬、抗腫瘍性抗生物質、インターフェロン、サイトカイン製剤、分子標的薬、核酸合成阻害薬、ＪＡＫ阻害薬及びがん免疫治療薬から選択される一以上の薬剤とを組み合わせ。
  10. 　（Ａ）変異カルレティキュリンタンパク質に特異的に結合する抗体又はその機能的断片と、（Ｂ）アルキル化剤、白金製剤、代謝拮抗剤、リボヌクレオチドリダクターゼ阻害薬、ヌクレオチドアナログ、トポイソメラーゼ阻害薬、微小管重合阻害薬、Ｂｃｌ２阻害薬、抗腫瘍性抗生物質、インターフェロン、サイトカイン製剤、分子標的薬、核酸合成阻害薬、ＪＡＫ阻害薬及びがん免疫治療薬から選択される一以上の薬剤とを組み合わせて投与することを特徴とする、がんの予防及び／又は治療方法。
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