BRPI0818437B1 - Anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo, composição farmacêutica, uso de pelo menos um dos anticorpos ou fragmentos funcionais dos anticorpos, e, hibridoma - Google Patents

Anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo, composição farmacêutica, uso de pelo menos um dos anticorpos ou fragmentos funcionais dos anticorpos, e, hibridoma Download PDF

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Yoshiharu Hiruma
Eisuke Tsuda
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Abstract

anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo, composição farmacêutica, uso de pelo menos um dos anticorpos ou fragmentos funcionais dos anticorpos, e, hibridoma. fornecer um método de detectar metabolismo ósseo anormal usando um gene fortemente expresso em um osteoclasto; um método de triar um composto tendo um efeito terapêutico e/ou preventivo para metabolismo ósseo anormal; e uma composição farmacêutica para tratar e/ou prevenir metabolismo ósseo anormal. fornecimento de um método de detectar metabolismo ósseo anormal usando a expressão de gene de siglec-15 humano como um índice; uma composição farmacêutica contendo um anticorpo que reconhece especificamente siglec-15 humano e tem uma atividade de inibir formação de osteoclastos; e os semelhantes.

Description

[Campo técnico]
[001] A presente invenção se refere a uma substância útil como um agente terapêutico e/ou preventivo para metabolismo ósseo anormal, um método de triar uma substância útil como um agente terapêutico e/ou preventivo para metabolismo ósseo anormal, um método de detectar metabolismo ósseo anormal, e um método de tratamento e/ou prevenção de metabolismo ósseo anormal.
[Estado da técnica anterior]
[002] Osso é conhecido por ser um órgão dinâmico que é continuamente remodelado por formação e reabsorção repetida de forma a mudar sua própria morfologia e manter níveis sanguíneos de cálcio. Osso saudável mantém um equilíbrio entre formação de ossos por osteoblastos e reabsorção óssea por osteoclastos, e a massa óssea é mantida constante. Em contraste, quando o equilíbrio entre formação de ossos e reabsorção óssea é perdido, metabolismo ósseo anormal tal como osteoporose ocorre (Endocrinological Review, (1992) 13, pp. 66-80, Principles of Bone Biology, Academic Press, Nova Iorque, (1996) pp. 87-102,).
[003] Como fatores que regulam metabolismo ósseo, muitos hormônios sistêmicos e citocinas locais foram relatados, e estes fatores colaboram com um outro para formar e manter osso (Endocrinological Review, (1992) 13, pp. 66-80, Endocrinological Review, (1996) 17, pp. 308-332). Como uma alteração em tecido ósseo devido a envelhecimento, a ocorrência de osteoporose é amplamente conhecida, mas o mecanismo de sua ocorrência abrange vários fatores tal como uma diminuição em secreção de hormônios sexuais e uma anormalidade nos receptores para os hormônios, variação em expressão de citocina localmente em osso, expressão de genes de envelhecimento, e insuficiência ou disfunção de diferenciação de osteoclastos ou osteoblastos, e assim, é difícil considerá-lo como um fenômeno simples fisiológico relacionado a idade. Osteoporose primária é amplamente divida em osteoporose pós-menopausa devido a uma diminuição em secreção de estrogênio e osteoporose senil devido a envelhecimento, mas avanço de pesquisa básica dos mecanismos de regulação de formação de ossos e reabsorção óssea é essencial para elucidar o mecanismo de sua ocorrência e para desenvolver um agente terapêutico destes.
[004] Osteoclastos são células multinucleadas derivadas de células- tronco hematopoiéticas, e liberando íons de cloreto e íons de hidrogênio em uma superfície óssea à qual osteoclastos aderem, osteoclastos acidificam uma lacuna entre a superfície óssea e os osteoclastos e também secretam catepsina K que é uma protease ácida ou os semelhantes (American Journal of Physiology, (1991) 260, C1315-C1324). Isto causa degradação de fosfato de cálcio, ativação de proteases ácidas e degradação de proteínas de matriz óssea, resultando em reabsorção óssea.
[005] Células precursoras de osteoclastos foram encontradas sendo diferenciadas em osteoclastos por estimulação com RANKL (receptor ativador de ligante de NF-KB) expressos na membrana celular de osteoblastos/células estromais presentes na superfície de osso (Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, (1998) 95, pp. 3597-3602, Cell, (1998) 93, pp. 165-176). Foi revelado que RANKL é uma proteína de membrana produzida por osteoblastos/células estromais, sua expressão sendo regulada por um fator de reabsorção óssea, RANKL induz diferenciação de células precursoras de osteoclastos em osteoclastos multinucleados, e os semelhantes (Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, (1998) 95, pp. 3597-3602, Journal of Bone and Mineral Research, (1998) 23, S222). Além disto, camundongos nocauteados desprovidos de RANKL foram encontrados desenvolvendo uma doença tipo osteopetrose, e, portanto, RANKL provou ser um fator indutor fisiológico de diferenciação de osteoclastos (Nature, (1999) 397, pp. 315323).
[006] Como drogas para tratar doenças de metabolismo ósseo ou encurtar a duração de tratamento, bisfosfonatos, vitamina D3 ativa, calcitonina e derivados desta, preparações hormonais tal como estradiol, SERMs (moduladores seletivos dos receptores de estrogênio), ipriflavona, vitamina K2 (menatetrenona), preparações de PTH (hormônio da paratireóide), preparações de cálcio e os semelhantes são usados. Entretanto, estas drogas nem sempre exibem um efeito terapêutico satisfatório e o desenvolvimento de um agente com um efeito terapêutico mais potente foi demandado.
[007] As membranas celulares de células imunes são cobertas com um revestimento denso de vários glicanos, tal como ácido siálico, que são reconhecidos por várias proteínas de ligação de glicanos. Lectinas tipo imunoglobulina de ligação de ácido siálico (daqui por diante referidas como “siglecs”) são uma família de proteínas de membrana tipo I que reconhecem glicanos sialilados e se ligam a estes. Muitos siglecs são expressos nas membranas celulares de células imunes e reconhecem ácido siálico similarmente presentes nas membranas celulares de células imunes e regulam interação celular ou função celular e são considerados como estando envolvidos na resposta imune (Nature Reviews Immunology, (2007) 7, pp. 255-266). Entretanto, também há várias moléculas siglec cujas funções fisiológicas ainda não foram elucidadas. Siglec-15 (lectina tipo imunoglobulina de ligação de ácido Siálico 15) é uma molécula que foi recentemente relatada como pertencendo aos Siglecs (Glycobiology, (2007) 17, pp. 838-846) e é idêntica a uma molécula chamada CD33L3 (molécula CD33 tipo 3). Esta molécula é altamente conservada evolutivamente de peixes a humanos e foi encontrada como sendo fortemente expressa em células dendríticas e/ou macrófagos de baço e linfonodos humanos. Além disto, como um resultado de um teste de ligação usando uma sonda de ácido siálico, também foi encontrado que Siglec-15 humano se liga a Neu5Acα2- 6GalNAc, e que Singlec-15 de camundongo se liga a Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc em adição a Neu5Acα2-6GalNAc (Glycobiology, (2007) 17, pp. 838-846). Até recentemente, o papel fisiológico de Siglec-15 não foi revelado, entretanto, foi relatado que a expressão de Siglec-15 aumenta com a diferenciação e maturação de osteoclastos, e a diferenciação de osteoclastos é inibida diminuindo a expressão de Siglec-15 por interferência de RNA (Patente Internacional 2007/093042). Entretanto, o efeito de um anticorpo anti-Siglec-15 em diferenciação de osteoclastos ainda não foi elucidado.
[Descrição da invenção] [Problemas que a invenção está para Resolver]
[008] Um objetivo da invenção é fornecer: um gene que é especificamente expresso em várias formas de metabolismo ósseo anormal tal como destruição óssea que são vistas em osteoporose, artrite reumatóide, metástase de câncer para osso ou os semelhantes; uma substância que inibe a diferenciação e maturação de osteoclastos e a atividade destes; um novo método para triar um agente terapêutico e/ou preventivo para metabolismo ósseo anormal; uma substância que inibe a diferenciação e maturação de osteoclastos e a atividade destes; e um agente terapêutico e/ou preventivo para metabolismo ósseo anormal.
[Meios para Solucionar os Problemas]
[009] Os presentes requerentes estudaram para elucidar o mecanismo de diferenciação, maturação e ativação de osteoclastos a fim de encontrar uma substância tendo um efeito terapêutico e/ou preventivo para metabolismo ósseo anormal. Como um resultado, os requerentes encontraram que a expressão do gene de Siglec-15 aumenta com a diferenciação e maturação de osteoclastos e também encontraram que a diferenciação de osteoclastos é inibida por um anticorpo que se liga especificamente a Siglec-15, e assim, a invenção foi completada.
[0010] Isto é, a invenção inclui as seguintes invenções.
[0011] (1) Um anticorpo que reconhece especificamente um ou mais polipeptídeos compreendendo uma seqüência de aminoácidos descrita em qualquer um dos seguintes (a) a (i) e inibe formação de osteoclastos e/ou reabsorção óssea osteoclástica, ou um fragmento funcional do anticorpo: (a) uma seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Seqüências; (b) uma seqüência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 21 a 328 da seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Seqüências; (c) uma seqüência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 1 a 260 da seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Seqüências; (d) uma seqüência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 21 a 260 da seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Seqüências; (e) uma seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Seqüências; (f) uma seqüência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 21 a 341 da seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Seqüências; (g) uma seqüência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 1 a 258 da seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Seqüências; (h) uma seqüência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 21 a 258 da seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Seqüências; e (i) uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção ou adição de um ou diversos resíduos de aminoácidos na seqüência de aminoácidos descrita em (a) a (h).
[0012] (2) Um anticorpo que reconhece especificamente um ou mais polipeptídeos compreendendo uma seqüência de aminoácidos codificada por uma seqüência de nucleotídeos descrita em qualquer um dos seguintes (j) a (n) e inibe formação de osteoclastos e/ou reabsorção óssea osteoclástica, ou um fragmento funcional do anticorpo: (j) uma seqüência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 1; (k) uma seqüência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 3; (l) uma seqüência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 19; (m) uma seqüência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 43; e (n) uma seqüência de nucleotídeos de um polinucleotídeo que hibridiza com um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeos complementar à seqüência de nucleotídeos descrita em (j) a (m) em condições estringentes.
[0013] (3) O anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com (1) ou (2) que inibe o processo de fusão celular de osteoclastos.
[0014] (4) O anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (3) que inibe formação de osteoclastos induzida por TNF-α.
[0015] (5) O anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (4) que inibe formação de osteoclastos IN VITRO em uma concentração de 30 μg/ml ou menos.
[0016] (6) O anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com (5) que inibe formação de osteoclastos IN VITRO em uma concentração de 3 μg/ml ou menos.
[0017] (7) O anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com (6) que inibe formação de osteoclastos IN VITRO em uma concentração de 1 μg/ml ou menos.
[0018] (8) O anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com (7) que inibe formação de osteoclastos IN VITRO em uma concentração de a partir de 63 ng/ml a 1 μg/ml.
[0019] (9) O anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (4) que inibe reabsorção óssea osteoclástica.
[0020] (10) O anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com (9) que inibe reabsorção óssea osteoclástica IN VITRO em uma concentração de 3 μg/ml ou menos.
[0021] (11) O anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com (10) que inibe reabsorção óssea osteoclástica IN VITRO em uma concentração de a partir de 0,3 μg/ml a 3 μg/ml.
[0022] (12) O anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (11) que é obtido por um método compreendendo as seguintes etapas 1) e 2): 1) uma etapa de produzir um anticorpo que reconhece especificamente qualquer uma ou mais seqüências das seqüências de aminoácidos descritas em qualquer um dos seguintes (a) a (i): (a) uma seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Seqüências; (b) uma seqüência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 21 a 328 da seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Seqüências; (c) uma seqüência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 1 a 260 da seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Seqüências; (d) uma seqüência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 21 a 260 da seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Seqüências; (e) uma seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Seqüências; (f) uma seqüência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 21 a 341 da seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Seqüências; (g) uma seqüência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 1 a 258 da seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Seqüências; (h) uma seqüência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 21 a 258 da seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Seqüências; e (i) uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção ou adição de um ou diversos resíduos de aminoácidos na seqüência de aminoácidos descrita em (a) a (h); e 2) uma etapa de triar um anticorpo que exibe uma atividade inibidora contra formação de osteoclastos e/ou uma atividade inibidora contra reabsorção óssea.
[0023] (13) O anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (11) que é obtido por um método compreendendo as seguintes etapas 1) e 2): 1) uma etapa de produzir um anticorpo que reconhece especificamente um ou mais polipeptídeos compreendendo uma seqüência de aminoácidos codificada por uma seqüência de nucleotídeos descrita em qualquer um dos seguintes (j) a (n): (j) uma seqüência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 1; (k) uma seqüência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 3; (l) uma seqüência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 19; (m) uma seqüência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 43; e (n) uma seqüência de nucleotídeos de um polinucleotídeo que hibridiza com um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeos complementar à seqüência de nucleotídeos descrita em (j) a (m) em condições estringentes; e 2) uma etapa de triar um anticorpo que exibe uma atividade inibidora contra formação de osteoclastos e/ou uma atividade inibidora contra reabsorção óssea.
[0024] (14) O anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (13), caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
[0025] (15) O anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com (14), caracterizado por ter a mesma especificidade de epítopo que um anticorpo produzido por hibridoma #32A1 (FERM BP-10999).
[0026] (16) O anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com (14), caracterizado por competir com um anticorpo produzido por hibridoma #32A1 (FERM BP-10999).
[0027] (17) O anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com (14), caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo produzido por hibridoma #32A1 (FERM BP-10999).
[0028] (18) O anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com (14), caracterizado por ter a mesma especificidade de epítopo que um anticorpo produzido por hibridoma #41B1 (FERM BP-11000).
[0029] (19) O anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com (14), caracterizado por competir com um anticorpo produzido por hibridoma #41B1 (FERM BP-11000).
[0030] (20) O anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com (14), caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo produzido por hibridoma #41B1 (FERM BP-11000).
[0031] (21) O anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (20), caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico.
[0032] (22) O anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (21), caracterizado pelo fato de que o anticorpo é humanizado.
[0033] (23) O anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (16), (18) e (19), caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humano.
[0034] (24) O anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (23), caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo IgG.
[0035] (25) O fragmento funcional do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (24) que é selecionado a partir do grupo consistindo de Fab, F(ab’)2, Fab’ e Fv.
[0036] (26) O anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (16), (18) e (19), caracterizado por ser um scFv.
[0037] (27) Uma composição farmacêutica caracterizada por compreender pelo menos um dos anticorpos ou fragmentos funcionais dos anticorpos de acordo com (1) a (26).
[0038] (28) A composição farmacêutica de acordo com (27), caracterizada por ser um agente terapêutico e/ou preventivo para metabolismo ósseo anormal.
[0039] (29) Uma composição farmacêutica para tratar e/ou prevenir metabolismo ósseo anormal caracterizado por compreendendo pelo menos um dos anticorpos ou fragmentos funcionais dos anticorpos de acordo com (1) a (26) e pelo menos um membro selecionado a partir do grupo consistindo de bisfosfonatos, vitamina D3 ativa, calcitonina e derivados desta, preparações hormonais tal como estradiol, SERMs (moduladores seletivos dos receptores de estrogênio), ipriflavona, vitamina K2 (menatetrenona), preparações de cálcio, preparações de PTH (hormônio da paratireóide), agentes antiinflamatórios não esteroidais, preparações de receptor solúvel de TNF, anticorpos anti-TNF-α ou fragmentos funcionais dos anticorpos, anticorpos anti-PTHrP (proteína relacionada ao hormônio da paratireóide) ou fragmentos funcionais dos anticorpos, antagonistas do receptor de IL-1, anticorpos antireceptor de IL-6 ou fragmentos funcionais dos anticorpos, anticorpos anti- RANKL ou fragmentos funcionais dos anticorpos e OCIF (fator inibidor de osteoclastogênese).
[0040] (30) A composição farmacêutica de acordo com (28) ou (29), caracterizada pelo fato de que o metabolismo ósseo anormal é selecionado a partir do grupo consistindo de osteoporose, destruição óssea acompanhando artrite reumatóide, hipercalcemia cancerosa, destruição óssea acompanhando mieloma múltiplo ou metástase de câncer para osso, tumor de células gigantes, perda de dentes devido a periodontite, osteólise ao redor de uma prótese de junta, destruição óssea em osteomielite crônica, doença de Paget do osso, osteodistrofia renal e osteogênese imperfeita.
[0041] (31) A composição farmacêutica de acordo com (28), caracterizada pelo fato de que o metabolismo ósseo anormal é osteoporose, destruição óssea acompanhando artrite reumatóide ou destruição óssea acompanhando metástase de câncer para osso.
[0042] (32) A composição farmacêutica de acordo com (29), caracterizado pelo fato de que a osteoporose é osteoporose pós-menopausa, osteoporose senil, osteoporose secundária devido ao uso de um agente terapêutico tal como um esteróide ou um imunossupressor, ou osteoporose acompanhando artrite reumatóide.
[0043] (33) Um método de tratamento e/ou prevenção de metabolismo ósseo anormal caracterizado por administrar pelo menos um dos anticorpos ou fragmentos funcionais dos anticorpos de acordo com (1) a (26).
[0044] (34) Um método de tratamento e/ou prevenção de metabolismo ósseo anormal caracterizado por administrar simultaneamente ou sucessivamente pelo menos um dos anticorpos ou fragmentos funcionais dos anticorpos de acordo com (1) a (26) e pelo menos um membro selecionado a partir do grupo consistindo de bisfosfonatos, vitamina D3 ativa, calcitonina e derivados desta, preparações hormonais tal como estradiol, SERMs (moduladores seletivos dos receptores de estrogênio), ipriflavona, vitamina K2 (menatetrenona), preparações de cálcio, preparações de PTH (hormônio da paratireóide), agentes antiinflamatórios não esteroidais, preparações de receptor solúvel de TNF, anticorpos anti-TNF-α ou fragmentos funcionais dos anticorpos, anticorpos anti-PTHrP (proteína relacionada ao hormônio da paratireóide) ou fragmentos funcionais dos anticorpos, antagonistas do receptor de IL-1, anticorpos anti-receptor de IL-6 ou fragmentos funcionais dos anticorpos, anticorpos anti-RANKL ou fragmentos funcionais dos anticorpos e OCIF (fator inibidor de osteoclastogênese).
[0045] (35) O método de tratamento e/ou prevenção de acordo com (33) ou (34), caracterizado pelo fato de que o metabolismo ósseo anormal é osteoporose, destruição óssea acompanhando artrite reumatóide ou destruição óssea acompanhando metástase de câncer para osso.
[0046] (36) O método de tratamento e/ou prevenção de acordo com (35), caracterizado pelo fato de que a osteoporose é osteoporose pós-menopausa, osteoporose senil, osteoporose secundária devido ao uso de um agente terapêutico tal como um esteróide ou um imunossupressor, ou osteoporose acompanhando artrite reumatóide.
[0047] (37) Hibridoma #32A1 (FERM BP-10999).
[0048] (38) Hibridoma #41B1 (FERM BP-11000). [Vantagem da invenção]
[0049] De acordo com a invenção, um agente terapêutico e/ou preventivo para metabolismo ósseo anormal cujo mecanismo de ação é inibir a diferenciação e maturação de osteoclastos e a atividade destes pode ser obtida. [Breve Descrição das Ilustrações] [Fig. 1]
[0050] Fig. 1 mostra gráficos descrevendo uma análise de perfil de expressão para genes de RANK, RANKL, catepsina K, e TRAP em tecidos humanos com tumor de células gigantes. [Fig. 2]
[0051] Fig. 2 mostra um gráfico descrevendo uma análise de perfil de expressão para o gene de Siglec-15 em tecidos humanos com tumor de células gigantes. [Fig. 3]
[0052] Fig. 3 mostra um gráfico descrevendo uma mudança no nível de expressão do gene de Siglec-15 quando diferenciação de osteoclastos foi induzida a partir de RAW 264.7 ou células de medula óssea de camundongo. [Fig. 4]
[0053] Fig. 4 mostra gráficos descrevendo a expressão de genes de catepsina K e TRAP acompanhando diferenciação de osteoclastos de células RAW 264.7. [Fig. 5]
[0054] Fig. 5 mostra um gráfico descrevendo a expressão do gene de Siglec-15 acompanhando diferenciação de osteoclastos de células RAW 264.7. [Fig. 6]
[0055] Fig. 6 mostra os resultados de detectar uma alteração na expressão de Siglec-15-His de camundongo em células 293F com tempo de cultura por eletroforese em SDS-poliacrilamida e Western blotting usando um anticorpo anti-6-His-HRP. [Fig. 7]
[0056] Fig. 7 mostra os resultados de detectar uma alteração na expressão de Siglec-15-Fc de camundongo em células 293F com tempo de cultura por eletroforese em SDS-poliacrilamida e Western blotting usando um anticorpo anti-IgG humana-Fc-HRP. [Fig. 8]
[0057] Fig. 8 mostra os resultados de avaliar a pureza de Siglec-15-His de camundongo purificado por cromatografia em coluna HisTrap HP e cromatografia em coluna Resource Q através de eletroforese em SDS- poliacrilamida e coloração com prata. [Fig. 9]
[0058] Fig. 9 mostra os resultados de detectar o comportamento de Siglec-15-His de camundongo purificado por cromatografia em coluna HisTrap HP e cromatografia em coluna Resource Q através de eletroforese em SDS-poliacrilamida e Western blotting usando um anticorpo anti-V5- HRP. [Fig. 10]
[0059] Fig. 10 mostra os resultados de avaliar a pureza de Siglec-15-Fc de camundongo purificado por cromatografia em coluna HiTrap Protein A através de eletroforese em SDS-poliacrilamida e coloração com prata. [Fig. 11]
[0060] Fig. 11 mostra os resultados de confirmar que um anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo purificado se liga não apenas a Siglec-15-Fc, mas também a Siglec-15-His por eletroforese em SDS- poliacrilamida e Western blotting usando um anticorpo policlonal anti- Singlec-15 de camundongo e um anticorpo anti-IgG de coelho-HRP. [Fig. 12]
[0061] Fig. 12 mostra um cromatograma de um anticorpo policlonal anti- Singlec-15 de camundongo purificado com uma coluna de afinidade tendo Siglec-15-Fc de camundongo imobilizado nesta. [Fig. 13]
[0062] Fig. 13 mostra os resultados de avaliar a pureza de Siglec-15-Fc de camundongo purificado por cromatografia usando uma coluna de afinidade tendo Siglec-15-Fc de camundongo imobilizado nesta. [Fig. 14]
[0063] Fig. 14 mostra cromatogramas de anticorpos policlonais anti- Singlec-15 de camundongo purificados com uma coluna de filtração em gel Superose 6. [Fig. 15]
[0064] Fig. 15 mostra os resultados de testar o efeito da adição de um anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo purificado por afinidade em diferenciação de osteoclastos (estimulação com RANKL) de células não aderentes de medula óssea de camundongo (N=3). [Fig. 16]
[0065] Fig. 16 mostra os resultados de testar o efeito da adição de um anticorpo policlonal anti-Siglec-15 de camundongo purificado por filtração em gel em diferenciação de osteoclastos (estimulação com RANKL) de células não aderentes de medula óssea de camundongo baseado na atividade enzimática de TRAP (N=3). [Fig. 17]
[0066] Fig. 17 mostra os resultados de testar neutralização por um antígeno de inibição de diferenciação de osteoclastos (estimulação com RANKL) de células não aderentes de medula óssea de camundongo pela adição de um anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo baseado na atividade enzimática de TRAP (N=3). [Fig. 18]
[0067] Fig. 18 mostra os resultados de testar o efeito da adição de um anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo em diferenciação de osteoclastos (estimulação com TNF-α) de células não aderentes de medula óssea de camundongo baseado na atividade enzimática de TRAP (N=3). [Fig. 19]
[0068] Fig. 19 mostra fotomicrografias usadas para avaliar o efeito da adição de um anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo em diferenciação de osteoclastos (estimulação com TNF-α) de células não aderentes de medula óssea de camundongo por coloração com TRAP. [Fig. 20]
[0069] Fig. 20 mostra gráficos descrevendo, pela atividade enzimática de TRAP, a inibição de diferenciação de osteoclastos (estimulação com vitamina D3 ativa) a partir de células de medula óssea de camundongo pela adição de um anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo (N=6). [Fig. 21]
[0070] Fig. 21 mostra fotomicrografias descrevendo, por coloração com TRAP, a inibição de formação de osteoclastos gigantes (estimulação com vitamina D3 ativa) a partir de células de medula óssea de camundongo pela adição de um anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo. [Fig. 22]
[0071] Fig. 22 mostra fotomicrografias descrevendo, por coloração com TRAP, a inibição de formação de osteoclastos gigantes (estimulação com RANKL humano) a partir de células de medula óssea de camundongo pela adição de um anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo. [Fig. 23]
[0072] Fig. 23 mostra fotomicrografias descrevendo, por coloração com TRAP, a inibição de formação de osteoclastos gigantes (estimulação com RANKL humano) a partir de células RAW 264.7 pela adição de um anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo e cancelamento do efeito inibitório por Siglec-15 solúvel. [Fig. 24]
[0073] Fig. 24 mostra os resultados de testar a ligação de um anticorpo monoclonal de rato anti-Singlec-15 de camundongo a uma placa tendo Siglec- 15-Fc de camundongo imobilizado nesta por um método ELISA. O símbolo (♦) denota anticorpo #1A1, o símbolo (■) denota anticorpo #3A1, o símbolo (A) denota anticorpo #8A1, o símbolo (X) denota anticorpo #24A1, o símbolo (•) denota anticorpo #32A1, o símbolo (O) denota anticorpo #34A1, o símbolo (+) denota anticorpo #39A1, o símbolo (-) denota anticorpo #40A1, o símbolo (—) denota anticorpo #41B1, o símbolo (O) denota anticorpo #61A1, e o símbolo (□) denota IgG de controle. [Fig. 25]
[0074] Fig. 25 mostra os resultados de testar o efeito da adição de um anticorpo monoclonal anti-Singlec-15 de camundongo (#3A1, #8A1, ou #32A1) em diferenciação de osteoclastos (estimulação com RANKL) de células não aderentes de medula óssea de camundongo. A IgG de rato de controle na figura é um controle negativo comum a Figs. 25 e 26. [Fig. 26]
[0075] Fig. 26 mostra os resultados de testar o efeito da adição de um anticorpo monoclonal anti-Singlec-15 de camundongo (#34A1, #39A1, ou #40A1) em diferenciação de osteoclastos (estimulação com RANKL) de células não aderentes de medula óssea de camundongo. O anticorpo policlonal de coelho anti-Singlec-15 de camundongo No. 3 na figura é um controle positivo comum a Figs. 25 e 26. [Fig. 27]
[0076] Fig. 27 mostra gráficos descrevendo uma alteração na expressão de catepsina K, TRAP ou do gene de Siglec-15 quando diferenciação de osteoclastos foi induzida a partir de células precursoras de osteoclastos humanos normais. [Fig. 28]
[0077] Fig. 28 mostra os resultados de examinar a pureza de Siglec-15- His humano purificado por cromatografia em coluna HisTrap HP e cromatografia em coluna Resource Q através de eletroforese em SDS- poliacrilamida. [Fig. 29]
[0078] Fig. 29 mostra os resultados de examinar a pureza de Siglec-15-Fc humano purificado por cromatografia em coluna de Proteína A através de eletroforese em SDS-poliacrilamida. [Fig. 30]
[0079] Fig. 30 mostra cromatogramas de anticorpos policlonais anti- Siglec-15 humano purificados usando uma coluna de afinidade tendo Siglec- 15-Fc humano imobilizado nesta. [Fig. 31]
[0080] Fig. 31 mostra fotomicrografias descrevendo, por coloração com TRAP, a inibição de formação de osteoclastos gigantes a partir de células precursoras de osteoclastos humanos normais pela adição de um anticorpo policlonal anti-Siglec-15 humano. [Fig. 32]
[0081] Fig. 32 mostra os resultados de avaliar o efeito da adição de um anticorpo policlonal anti-Siglec-15 humano em formação de osteoclastos multinucleados a partir de células precursoras de osteoclastos humanos normais contando o número de células positivas para TRAP tendo 5 ou mais núcleos com um microscópio invertido. [Fig. 33]
[0082] Fig. 33 mostra os resultados de testar a ligação de um anticorpo monoclonal de rato anti-Singlec-15 de camundongo a uma placa tendo Siglec- 15-Fc humano imobilizado nesta por um método ELISA. O símbolo (♦) denota anticorpo #1A1, o símbolo (■) denota anticorpo #3A1, o símbolo (A) denota anticorpo #8A1, o símbolo (X) denota anticorpo #24A1, o símbolo (•) denota anticorpo #32A1, o símbolo (O) denota anticorpo #34A1, o símbolo (+) denota anticorpo #39A1, o símbolo (-) denota anticorpo #40A1, o símbolo (—) denota anticorpo #41B1, o símbolo (O) denota anticorpo #61A1, e o símbolo (□) denota IgG de controle. [Fig. 34]
[0083] Fig. 34 mostra fotomicrografias descrevendo, por coloração com TRAP, a inibição de formação de osteoclastos gigantes a partir de células precursoras de osteoclastos humanos normais pela adição de um anticorpo monoclonal de rato anti-Singlec-15 de camundongo. [Fig. 35]
[0084] Fig. 35 mostra fotomicrografias descrevendo, por coloração com TRAP, a inibição de formação de osteoclastos gigantes a partir de células precursoras de osteoclastos humanos normais pela adição de um anticorpo monoclonal de rato anti-Singlec-15 de camundongo (anticorpo #32A1). [Fig. 36]
[0085] Fig. 36 mostra um gráfico descrevendo a inibição da atividade de reabsorção óssea de osteoclastos humanos normais pela adição de um anticorpo monoclonal de rato anti-Singlec-15 de camundongo (anticorpo #32A1) (N=6). [Melhor modo para realizar a invenção]
[0086] O termo “gene” como usado neste lugar inclui não apenas DNA, mas também mRNA, cDNA e cRNA.
[0087] O termo “polinucleotídeo” como usado neste lugar é usado no mesmo significado que um ácido nucléico e também inclui DNA, RNA, sondas, oligonucleotídeos e iniciadores.
[0088] Os termos “polipeptídeo” e “proteína” como usado neste lugar são usados sem distinção.
[0089] O termo “fração de RNA” como usado neste lugar se refere a uma fração contendo RNA.
[0090] O termo “célula” como usado neste lugar também inclui células em um indivíduo animal e células cultivadas.
[0091] O termo “Siglec-15” como usado neste lugar é usado no mesmo significado que proteína Siglec-15.
[0092] O termo “formação de osteoclastos” como usado neste lugar é usado no mesmo significado que “diferenciação de osteoclastos” ou “maturação de osteoclastos”.
[0093] O termo “fragmento funcional de um anticorpo” como usado neste lugar se refere a um fragmento parcial de um anticorpo tendo uma atividade de ligação a antígeno e inclui Fab, F(ab’)2, scFv e os semelhantes. O termo também abrange Fab’ que é um fragmento monovalente em uma região variável de um anticorpo obtido tratando F(ab’)2 em condições redutoras. Entretanto, o termo não é limitado a estas moléculas contanto que o fragmento tenha uma afinidade de ligação para um antígeno. Além disto, estes fragmentos funcionais incluem não apenas um fragmento obtido tratando uma molécula de comprimento completo de uma proteína de anticorpo com uma enzima apropriada, mas também uma proteína produzida em uma célula hospedeira apropriada usando um gene de anticorpo geneticamente modificado.
[0094] O termo “epítopo” como usado neste lugar se refere a um peptídeo parcial de Siglec-15 ao qual um anticorpo anti-Siglec-15 específico se liga. O epítopo mencionado acima que é um peptídeo parcial de Siglec-15 pode ser determinado por métodos bem conhecidos por aqueles versados na arte tal como um imunoensaio. Alternativamente, por exemplo, o método seguinte pode ser empregado. Várias estruturas parciais de Siglec-15 são produzidas. Na produção das estruturas parciais, uma técnica conhecida de síntese de oligopeptídeo pode ser usada. Por exemplo, uma série de polipeptídeos tendo comprimentos apropriadamente reduzidos obtidos encurtando seqüencialmente Siglec-15 a partir do término C ou término N são produzidos usando uma técnica de recombinação genética conhecida por aqueles versados na arte. Depois, a reatividade de um anticorpo contra estes polipeptídeos é avaliada e um sítio de reconhecimento é aproximadamente determinado. Então, peptídeos tendo comprimentos menores são sintetizados e a reatividade com estes peptídeos é avaliada, de maneira que o epítopo pode ser determinado. Se um segundo anticorpo anti-Siglec-15 se liga a um peptídeo parcial ao qual um primeiro anticorpo anti-Siglec-15 se liga, pode ser determinada que o primeiro anticorpo e o segundo anticorpo compartilham o mesmo epítopo. Além disto, confirmando que o segundo anticorpo anti- Siglec-15 compete com o primeiro anticorpo anti-Siglec-15 para a ligação com Siglec-15 (isto é, o segundo anticorpo inibe a ligação entre Siglec-15 e o primeiro anticorpo), pode ser determinada que o primeiro anticorpo e o segundo anticorpo compartilham o mesmo epítopo mesmo se a seqüência específica de epítopo não tenha sido determinada. Além disto, quando o primeiro anticorpo e o segundo anticorpo se ligam ao mesmo epítopo e também o primeiro anticorpo tem um efeito especial tal como uma atividade neutralizante de antígeno, pode ser esperado que o segundo anticorpo tenha a mesma atividade.
[0095] A frase “hibridização é realizada em condições estringentes” como usado neste lugar se refere a hibridização sendo realizada nas condições nas quais identificação pode ser efetuada realizando hibridização a 68°C em uma solução de hibridização comercialmente disponível, ExpressHyb Hybridization Solution (fabricada por Clontech, Inc.) ou realizando hibridização a 68°C na presença de 0,7 a 1,0 M de NaCl usando um filtro tendo DNA imobilizado neste, seguido por realização de lavagem a 68°C usando 0,1 a 2 x solução SSC (1 x solução SSC é composta de 150 mM de NaCl e 15 mM de citrato de sódio) ou em condições equivalentes a estas. 1. Siglec-15
[0096] Os presentes requerentes encontraram que o gene de Siglec-15 é especificamente expresso em tumores de células gigantes e também encontraram que o nível de expressão do gene de Siglec-15 aumenta quando uma linhagem celular derivada de monócito se diferencia em osteoclastos.
[0097] Como para Siglec-15 a ser usado na invenção, Siglec-15 é diretamente purificado de monócitos ou células de medula óssea de humano, mamífero não humano (tal como porquinho-da-índia, rato, camundongo, coelho, porco, ovelha, gado ou macaco) ou galinha e usado, ou uma fração de membrana celular das células mencionadas acima é preparada e pode ser usada. Além disto, Siglec-15 pode ser obtido por síntese IN VITRO deste ou produção deste em uma célula hospedeira através de engenharia genética. Na engenharia genética, especificamente, cDNA de Siglec-15 é integrado em um vetor capaz de expressar cDNA de Siglec-15, e Siglec-15 é sintetizado em uma solução contendo enzimas, substratos, e substâncias energéticas requeridos para transcrição e tradução, ou outra célula hospedeira procariótica ou eucariótica é transformada para expressar Siglec-15, de maneira que a proteína pode ser obtida.
[0098] A seqüência de nucleotídeos de cDNA de Siglec-15 humano foi registrada em GenBank com um número de acesso de NM_213602 e é representada por SEQ ID NO: 1 na Listagem de Seqüências, e sua seqüência de aminoácidos é representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Seqüências. A seqüência de nucleotídeos de cDNA de Siglec-15 de camundongo foi registrada em GenBank com um número de acesso de XM_884636 e é representada por SEQ ID NO: 3 na Listagem de Seqüências, e sua seqüência de aminoácidos é representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Seqüências. Siglec-15 humano maduro cuja seqüência sinal foi removida corresponde a uma seqüência de aminoácidos composta de resíduos de aminoácidos 21 a 328 da seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2. Além disto, Siglec-15 de camundongo cuja seqüência sinal foi removida corresponde a uma seqüência de aminoácidos composta de resíduos de aminoácidos 21 a 341 da seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4. Casualmente, Siglec-15 algumas vezes é chamado antígeno CD33 tipo 3, molécula CD33 tipo 3, CD33-tipo 3 ou CD33L3, e todos estes representam a mesma molécula.
[0099] cDNA de Siglec-15 pode ser obtido, por exemplo, por um assim chamado método de PCR no qual a reação em cadeia da polimerase (daqui por diante referido como “PCR”) é realizada usando uma biblioteca de cDNA expressando cDNA de Siglec-15 como um modelo e iniciadores que amplificam especificamente cDNA de Siglec-15 (Saiki, R. K., et al., Science, (1988) 239, 487-49).
[00100] Além disto, um polinucleotídeo que hibridiza com um polinucleotídeo composto de uma seqüência de nucleotídeos complementar a pelo menos uma seqüência de nucleotídeos selecionada a partir das seqüências de nucleotídeos representadas por SEQ ID NOS: 1 e 3 na Listagem de Seqüências em condições estringentes e que codifica uma proteína tendo uma atividade biológica comparável com aquela de Siglec-15 também está incluído em cDNA de Siglec-15. Além disto, um polinucleotídeo que é uma variante de processamento transcrita a partir do locus de Siglec-15 humano ou de camundongo ou um polinucleotídeo que hibridiza com este em condições estringentes e codifica uma proteína tendo uma atividade biológica comparável com aquela de Siglec-15 também está incluído em cDNA de Siglec-15.
[00101] Além disto, uma proteína que é composta de uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção ou adição de um ou diversos aminoácidos em pelo menos uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir das seqüências de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 2 e 4 na Listagem de Seqüências ou a seqüência de aminoácidos cuja seqüência sinal foi removida e tem uma atividade biológica comparável com aquela de Siglec-15 também está incluída em Siglec-15. Além disto, uma proteína que é composta de uma seqüência de aminoácidos codificada por uma variante de processamento transcrita a partir do locus de Siglec-15 humano ou de camundongo ou uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção ou adição de um ou diversos aminoácidos nesta e tem uma atividade biológica comparável com aquela de Siglec-15 também está incluída em Siglec-15. 2. Detecção de metabolismo ósseo anormal
[00102] Uma análise do nível de expressão do gene de Siglec-15 em um grupo de amostras de teste de vários tecidos ósseos humanos mostrou que o nível de expressão do gene aumenta significativamente em tumor de células gigantes (GCT) que é um tumor ósseo com um grande número de células gigantes multinucleadas tipo osteoclasto surgindo e é caracterizado por achados clínicos de destruição óssea osteolítica (Bullough et al., Atlas of Orthopedic Pathology 2nd edition, pp. 17.6-17.8, Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1992)).
[00103] Também foi encontrado que o nível de expressão do gene de Siglec-15 aumenta quando uma linhagem celular derivada de monócito é diferenciada em osteoclastos.
[00104] Por conseguinte, Siglec-15 é considerado como estando associado com patologia humana tal como GCT no qual reabsorção óssea é aumentada. Em outras palavras, medição do nível de expressão do gene de Siglec-15 e/ou Siglec-15 em cada célula e/ou cada tecido possibilita determinação do estado de metabolismo ósseo anormal acompanhado por superexpressão de Siglec- 15. Exemplos do metabolismo ósseo anormal como usado neste lugar incluem, mas não são limitados a, osteoporose (osteoporose pós-menopausa, osteoporose senil, osteoporose secundária devido ao uso de um agente terapêutico tal como um esteróide ou um imunossupressor, ou osteoporose acompanhando artrite reumatóide), destruição óssea acompanhando artrite reumatóide, hipercalcemia cancerosa, destruição óssea acompanhando mieloma múltiplo ou metástase de câncer para osso, tumor de células gigantes, perda de dentes devido a periodontite, osteólise ao redor de uma prótese de junta, destruição óssea em osteomielite crônica, doença de Paget do osso, osteodistrofia renal e osteogênese imperfeita.
[00105] Na invenção, a "amostra de teste" a ser usada para avaliar o nível de expressão do gene de Siglec-15 e/ou Siglec-15 se refere a uma amostra de um tecido de medula óssea, osso, próstata, testículos, pênis, bexiga, rim, cavidade oral, faringe, lábios, língua, gengiva, nasofaringe, esôfago, estômago, intestino delgado, intestino grosso, cólon, fígado, vesícula biliar, pâncreas, nariz, pulmão, tecido mole, pele, mama, útero, ovário, cérebro, tireóide, linfonodo, músculo, tecido adiposo ou os semelhantes, ou sangue, um fluido corporal ou uma excreção ou os semelhantes, entretanto, na invenção, é mais preferido sangue ou medula óssea. 3. Método de triar substância que inibe diferenciação em osteoclastos
[00106] Como uma forma de realização da invenção, um método de triar uma substância que inibe diferenciação em osteoclastos medindo o nível de expressão do gene de Siglec-15 e/ou Siglec-15 pode ser exemplificado.
[00107] Como outra forma de realização da invenção, um método de triar uma substância que tem um efeito terapêutico e/ou efeito preventivo em metabolismo ósseo anormal identificando uma substância que inibe a atividade de Siglec-15 de induzir diferenciação em osteoclastos maduros, pode ser exemplificado.
[00108] A “substância de teste” se refere a uma substância a ser usada para avaliar a atividade de inibir diferenciação em osteoclastos pelo método de triagem da invenção. Exemplos da substância de teste incluem um composto, um metabólito microbiano, um extrato de uma planta ou tecido animal, um derivado destes, e uma mistura destes. Além disto, um ácido nucléico projetado para diminuir o nível de expressão de Siglec-15 ou um derivado deste (tal como um oligonucleotídeo antisentido, uma ribozima, dsRNA ou siRNA) também podem ser usados como a substância de teste. A dose ou concentração da substância de teste pode ser apropriadamente ajustada ou uma pluralidade de doses pode ser ajustada, por exemplo, preparando séries de diluição destas. A substância de teste pode ser administrada em um estado apropriado tal como um sólido ou um líquido, e pode ser dissolvida em um tampão apropriado ou um estabilizante ou os semelhantes podem ser adicionados a esta. No caso de um método de triagem usando células cultivadas, a substância de teste é adicionada a um meio e células podem ser cultivadas neste. No caso onde a substância de teste é adicionada a um meio, a substância de teste pode ser adicionada no início do cultivo ou no meio do cultivo, e o número de operações de adição não é limitado a um. O período de cultivo na presença de uma substância de teste pode ser apropriadamente ajustado, entretanto, ele é preferivelmente de 30 minutos a 2 semanas, mais preferivelmente de 30 minutos a 72 horas. No caso onde a substância de teste é administrada a um indivíduo mamífero, a via de administração, incluindo administração oral, injeção intravenosa, injeção intraperitoneal, administração transdérmica, injeção subcutânea e os semelhantes, é adequadamente determinada dependendo das propriedades físicas e os semelhantes da substância de teste. Casualmente, um tempo adequado até a amostra de teste ser obtida, depois da administração da substância de teste, pode ser selecionado.
[00109] As células cultivadas a serem usadas no método de triagem da invenção podem ser células normais, uma linhagem celular estabelecida, ou células mostrando crescimento anormal tal como células cancerosas contanto que elas sejam células de mamíferos expressando Siglec-15. Exemplos destas incluem, mas não são limitados a, células precursoras de osteoclastos humanos normais (Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells, disponíveis a partir de Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. 2T-110), células derivadas de monócitos de camundongos RAW 264.7 (ATCC Cat. No. TIB- 71), células RAW 264 (ECACC Cat. No. 85062803), e células primárias cultivadas derivadas de medula óssea de camundongo. Como uma espécie animal das células cultivadas, humano, camundongo, ou outros mamíferos (porquinho-da-índia, rato, coelho, porco, ovelha, gado, macaco, etc.), galinha e os semelhantes são preferidos, mas a espécie não é limitada a estas. Casualmente, como as células cultivadas, é mais preferido usar células de mamíferos superexpressando Siglec-15, e, por exemplo, células RAW 264.7, células RAW 264, células 293, células CHO e células COS7 modificadas introduzindo o gene de Siglec-15 junto com a região promotora deste para superexpressar Siglec-15, e as semelhantes podem ser exemplificadas.
[00110] O método de triagem da invenção também inclui um método de detectar a expressão do gene de Siglec-15 em células de um órgão ou um tecido amputado de um indivíduo mamífero depois de administrar uma substância de teste ao indivíduo mamífero sem usar células cultivadas. O órgão ou tecido a ser usado para detectar a expressão do gene pode ser qualquer um contanto que ele expresse Siglec-15, entretanto, um tecido associado com metabolismo ósseo anormal é preferido, e um tecido ósseo e medula óssea são mais preferidos. Como uma espécie de mamífero, um mamífero não humano pode ser usado, e camundongo, rato ou hamster é preferido, e camundongo ou rato é mais preferido. Como um modelo animal tendo metabolismo ósseo anormal, um animal tendo o ovário removido, um animal tendo o testículo removido, um animal carregando câncer tendo células tumorais implantadas sob a pele, na pele, ventrículo esquerdo, medula óssea, veia, cavidade abdominal ou os semelhantes, um animal tendo um nervo ciático removido, um modelo animal de artrite adjuvante, um modelo animal de artrite induzida por colágeno, um modelo animal de osteoporose induzida por glicocorticóide, um camundongo com senescência acelerada (camundongo SAM P6, Matsushita et al., Am. J. Pathol. 125, 276-283 (1986)), um animal tendo a tireóide/paratireóide removida, um animal recebendo uma infusão contínua de um peptídeo relacionado a hormônio da paratireóide (PTHrP), um camundongo com nocaute de fator inibidor de osteoclastogênese (OCIF) (Mizuno et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., (1998) 247, 610-615), um animal com a administração de RANKL solúvel ou os semelhantes podem ser usados. Além disto, um modelo animal com perda de dentes devido a doença periodontal ou um animal modificado para superexpressar Siglec-15 também podem ser usados. Além disto, uma substância de teste selecionada por triagem é administrada a qualquer dos modelos animais mencionados acima, e cada parâmetro que pode ser obtido pela medição do número de osteoclastos maduros em um tecido ósseo, uma densidade óssea, uma força óssea ou uma morfologia óssea, parâmetros de metabolismo ósseo (CTx, NTx, etc.) em sangue e urina ou parâmetros que variam devido a metabolismo ósseo anormal tal como níveis sanguíneos de cálcio são medidos, através do que o efeito terapêutico e/ou efeito preventivo da substância de teste em metabolismo ósseo anormal pode ser avaliado.
[00111] As células cultivadas a serem usadas no método da invenção podem ser cultivadas em quaisquer condições contanto que as condições permitam que as células cultivadas expressem Siglec-15 sem a adição de uma substância de teste. Por exemplo, há condições de cultura conhecidas para as células cultivadas, e quando as células expressam Siglec-15 nas condições, as células podem ser cultivadas nas condições. Além disto, no caso onde a expressão de Siglec-15 em um órgão ou um tecido amputado de um indivíduo mamífero é detectada, condições de criação para o animal podem ser quaisquer contanto que as condições possibilitem que o animal expresse Siglec-15 sem a adição de uma substância de teste.
[00112] A fim de avaliar o efeito de uma substância de teste na expressão de Siglec-15, existe um método de medir o nível de expressão do gene de Siglec-15 e um método de medir o nível de expressão de Siglec-15 que é um produto de tradução do gene de Siglec-15. Uma substância de teste que inibe a expressão do gene de Siglec-15 e/ou Siglec-15 é considerada como sendo uma substância tendo um efeito terapêutico e/ou efeito preventivo em metabolismo ósseo anormal, preferivelmente osteoporose, ou destruição óssea acompanhando artrite reumatóide e/ou metástase de câncer para osso.
[00113] A medição do nível de expressão do gene de Siglec-15 ou Siglec- 15 em células cultivadas pode ser realizada por uma análise Northern, um método de PCR quantitativo, um método ELISA ou os semelhantes. No caso onde células cultivadas de mamíferos são usadas, uma quantidade apropriada de RANKL, TNF-α, M-CSF, vitamina D3 ativa, ou os semelhantes é adicionada, conforme necessário, a um meio junto com uma substância de teste, e também em um controle sem a adição da substância de teste, uma quantidade apropriada de RANKL, TNF-α, M-CSF, vitamina D3 ativa, ou os semelhantes é adicionada.
[00114] Além disto, um sistema experimental para medir a quantidade de ligação de um ligante endógeno para Siglec-15 é construído, e se ou não a ligação do ligante endógeno para Siglec-15 é inibida pela adição de uma substância de teste é avaliada, através do que triagem de uma substância que inibe diferenciação em osteoclastos pode ser realizada.
[00115] Os respectivos métodos de triagem serão descritos nos seguintes (1) a (3). (1) Método usando gene de Siglec-15
[00116] Como o método de triagem da invenção, por exemplo, existe um método usando células cultivadas de mamíferos e um método usando indivíduos mamíferos, que será descrito abaixo, respectivamente.
[00117] (a) Método usando células cultivadas de mamíferos (i) Um método incluindo as seguintes etapas a) a c): a) uma etapa de extrair RNA total de células cultivadas de mamíferos cultivadas em um meio com a adição de uma substância de teste; b) uma etapa de detectar uma diferença no nível de expressão do gene de Siglec-15 entre o RNA total obtido em a) e RNA total obtido de células cultivadas de mamíferos cultivadas sem a adição da substância de teste; e c) uma etapa de determinar o efeito terapêutico e/ou preventivo da substância de teste em metabolismo ósseo anormal analisando a diferença no nível de expressão do gene descrito em b). (ii) Um método incluindo as seguintes etapas a) a d): a) uma etapa de extrair RNA total de células cultivadas de mamíferos cultivadas em um meio com a adição de uma substância de teste; b) uma etapa de extrair RNA total de células cultivadas de mamíferos cultivadas em um meio sem a adição da substância de teste; c) uma etapa de medir o nível de expressão do gene de Siglec-15 no RNA total obtido em a) e no RNA total obtido em b), respectivamente; e d) uma etapa de determinar o efeito terapêutico e/ou preventivo da substância de teste em metabolismo ósseo anormal analisando uma diferença no nível de expressão do gene medido em c) entre o RNA total obtido em a) e o RNA total obtido em b).
[00118] (b) Método usando indivíduos mamíferos (i) Um método incluindo as seguintes etapas (a) a (c): a) uma etapa de extrair RNA total de uma amostra de teste coletada de um indivíduo mamífero com a administração de uma substância de teste; b) uma etapa de detectar uma diferença no nível de expressão do gene de Siglec-15 entre o RNA total obtido em a) e RNA total obtido de uma amostra de teste coletada de um indivíduo mamífero sem a administração da substância de teste; e c) uma etapa de determinar o efeito terapêutico e/ou preventivo da substância de teste em metabolismo ósseo anormal analisando a diferença no nível de expressão do gene descrito em b). (ii) Um método incluindo as seguintes etapas a) a d): a) uma etapa de extrair RNA total de uma amostra de teste coletada de um indivíduo mamífero com a administração de uma substância de teste; b) uma etapa de extrair RNA total de uma amostra de teste coletada de um indivíduo mamífero sem a administração da substância de teste; c) uma etapa de medir o nível de expressão do gene de Siglec-15 no RNA total obtido na etapa a) e no RNA total obtido na etapa b), respectivamente; e d) uma etapa de determinar o efeito terapêutico e/ou preventivo da substância de teste em metabolismo ósseo anormal analisando uma diferença no nível de expressão do gene descrito em c). (2) Método usando Siglec-15
[00119] Como o método de triagem utilizando a medição do nível de expressão de Siglec-15, existe um método usando células cultivadas de mamíferos e um método usando indivíduos animais cada um dos quais inclui as seguintes etapas.
[00120] (a) Método usando células cultivadas de mamíferos (i) Um método incluindo as seguintes etapas a) e b): a) uma etapa de medir o nível de expressão de Siglec-15 em células cultivadas de mamíferos cultivadas em um meio com a adição de uma substância de teste; e b) uma etapa de determinar o efeito terapêutico e/ou efeito preventivo da substância de teste em metabolismo ósseo anormal analisando uma diferença entre o nível de expressão da proteína medido em a) e o nível de expressão da proteína em células cultivadas de mamíferos cultivadas em um meio sem a adição da substância de teste. (ii) Um método incluindo as seguintes etapas a) a c): a) uma etapa de medir o nível de expressão de Siglec-15 em células cultivadas de mamíferos cultivadas em um meio com a adição de uma substância de teste; b) uma etapa de medir o nível de expressão da proteína descrito em a) em células cultivadas de mamíferos cultivadas em um meio sem a adição da substância de teste; e c) uma etapa de determinar o efeito terapêutico e/ou efeito preventivo da substância de teste em metabolismo ósseo anormal detectando uma diferença entre o nível de expressão da proteína medido em a) e o nível de expressão da proteína medido em b). (iii) Um método incluindo as seguintes etapas a) a c): a) uma etapa de imobilizar proteína total obtida de células cultivadas de mamíferos cultivadas em um meio com a adição de uma substância de teste; b) uma etapa de medir o nível de expressão de Siglec-15 na proteína imobilizada; e c) uma etapa de determinar o efeito terapêutico e/ou efeito preventivo da substância de teste em metabolismo ósseo anormal analisando uma diferença entre o nível de expressão de Siglec-15 detectado em b) e o nível de expressão da proteína em proteína total obtida de células cultivadas de mamíferos cultivadas em um meio sem a adição da substância de teste. (iv) Um método incluindo as seguintes etapas a) a e): a) uma etapa de imobilizar proteína total obtida de células cultivadas de mamíferos cultivadas em um meio com a adição de uma substância de teste; b) uma etapa de imobilizar proteína total obtida de células cultivadas de mamíferos cultivadas em um meio sem a adição da substância de teste; c) uma etapa de medir o nível de expressão de Siglec-15 na proteína imobilizada descrito na etapa a) usando um anticorpo ou um ligante se ligando especificamente à proteína; d) uma etapa de medir o nível de expressão de Siglec-15 na proteína imobilizada descrito na etapa b) usando um anticorpo ou um ligante se ligando especificamente à proteína; e e) uma etapa de determinar o efeito terapêutico e/ou efeito preventivo da substância de teste em metabolismo ósseo anormal analisando uma diferença entre o nível de expressão da proteína medido na etapa c) e o nível de expressão da proteína medido na etapa d).
[00121] (b) Método usando indivíduos mamíferos (i) Um método incluindo as seguintes etapas a) e b): a) uma etapa de medir o nível de expressão de Siglec-15 em uma amostra de teste coletada de um indivíduo mamífero ao qual uma substância de teste foi administrada; e b) uma etapa de determinar o efeito terapêutico e/ou efeito preventivo da substância de teste em metabolismo ósseo anormal analisando uma diferença entre o nível de expressão de Siglec-15 medido na etapa a) e o nível de expressão da proteína em uma amostra de teste coletada de um indivíduo mamífero sem a administração da substância de teste. (ii) Um método incluindo as seguintes etapas a) a c): a) uma etapa de medir o nível de expressão de Siglec-15 em uma amostra de teste coletada de um indivíduo mamífero, ao qual uma substância de teste foi administrada, usando um anticorpo ou um ligante se ligando especificamente à proteína; b) uma etapa de medir o nível de expressão da proteína em uma amostra de teste coletada de um indivíduo mamífero sem a administração da substância de teste; e c) uma etapa de determinar o efeito terapêutico e/ou efeito preventivo da substância de teste em metabolismo ósseo anormal analisando uma diferença entre o nível de expressão de Siglec-15 medido em a) e o nível de expressão da proteína medido em b). (iii) Um método incluindo as seguintes etapas a) a c): a) uma etapa de imobilizar proteína total em uma amostra de teste coletada de um indivíduo mamífero ao qual uma substância de teste foi administrada; b) uma etapa de medir o nível de expressão de Siglec-15 na proteína imobilizada; e c) uma etapa de determinar o efeito terapêutico e/ou preventivo da substância de teste em metabolismo ósseo anormal analisando uma diferença entre o nível de expressão de Siglec-15 detectado em b) e o nível de expressão da proteína em uma amostra de teste coletada de um indivíduo mamífero sem a administração da substância de teste. (iv) Um método incluindo as seguintes etapas a) a e): a) uma etapa de imobilizar proteína total em uma amostra de teste coletada de um indivíduo mamífero ao qual uma substância de teste foi administrada; b) uma etapa de imobilizar proteína total em uma amostra de teste coletada de um indivíduo mamífero sem a administração da substância de teste; c) uma etapa de detectar o nível de expressão de Siglec-15 na proteína imobilizada descrito na etapa a) usando um anticorpo ou um ligante se ligando especificamente à proteína; d) uma etapa de detectar o nível de expressão de Siglec-15 na proteína imobilizada descrito em b) usando um anticorpo ou um ligante se ligando especificamente à proteína; e e) uma etapa de determinar o efeito terapêutico e/ou efeito preventivo da substância de teste em metabolismo ósseo anormal analisando uma diferença entre o nível de expressão da proteína detectado em c) e o nível de expressão da proteína detectado em d). (3) Método de triagem usando ligante endógeno
[00122] Triagem de uma substância que inibe diferenciação em osteoclastos também pode ser realizada observando se ou não a ligação de um ligante endógeno para Siglec-15 é inibida pela adição de uma substância de teste. Exemplos de um glicano sialilado servindo como um ligante endógeno para Siglec-15 incluem Neu5Acα2-6GalNAc se ligando a Siglec-15 humano e de camundongo e Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc se ligando a Siglec-15 de camundongo. Entretanto, o ligante endógeno para Siglec-15 não é limitado a estes glicanos contanto que ele tenha uma afinidade de ligação para Siglec-15. Estes ligantes endógenos podem ser marcados com uma cauda apropriada, radioisótopo ou substância fluorescente para o propósito de examinar a ligação destes com Siglec-15. Por exemplo, poliacrilamida biotinilada à qual um oligossacarídeo sialilado tal como Neu5Acα2-6GalNAc foi ligado pode ser usada em triagem como uma sonda se ligando a Siglec-15. Como Siglec- 15 ao qual um ligante endógeno é ligado, células expressando Siglec-15 ou uma fração de membrana preparada a partir das células podem ser usadas. Além disto, Siglec-15 pode ser sujeito a triagem depois de Siglec-15 ser isolado de células expressando Siglec-15, seguido por purificação. Como as células expressando Siglec-15, qualquer de uma linhagem celular cultivada expressando Siglec-15, células induzidas a expressar transientemente ou constantemente o gene de Siglec-15 sujeitando células cultivadas apropriadas a engenharia genética, e células expressando Siglec-15 obtidas IN VIVO podem ser usadas. O método de triagem usando um tal ligante endógeno pode ser realizado de acordo com as etapas como descrito abaixo. (i) Um método incluindo as seguintes etapas a) e b): a) uma etapa de adicionar um ligante endógeno para Siglec-15 e uma substância de teste a células expressando Siglec-15; e b) uma etapa de determinar o efeito terapêutico e/ou preventivo da substância de teste em metabolismo ósseo anormal comparando a quantidade de ligação do ligante endógeno para as células expressando Siglec-15 entre o caso onde a substância de teste foi adicionada e o caso onde a substância de teste não foi adicionada. (ii) Um método incluindo as seguintes etapas a) a c): a) uma etapa de preparar uma fração de membrana celular de células expressando Siglec-15; b) uma etapa de adicionar um ligante endógeno para Siglec-15 e uma substância de teste à fração de membrana celular; e c) uma etapa de determinar o efeito terapêutico e/ou preventivo da substância de teste em metabolismo ósseo anormal comparando a quantidade de ligação do ligante endógeno para a fração de membrana celular entre o caso onde a substância de teste foi adicionada e o caso onde a substância de teste não foi adicionada. (iii) Um método incluindo as seguintes etapas a) a c): a) uma etapa de preparar Siglec-15; b) uma etapa de adicionar um ligante endógeno para Siglec-15 e uma substância de teste para Siglec-15 em a); e c) uma etapa de determinar o efeito terapêutico e/ou preventivo da substância de teste em metabolismo ósseo anormal comparando a quantidade de ligação do ligante endógeno para Siglec-15 entre o caso onde a substância de teste foi adicionada e o caso onde a substância de teste não foi adicionada.
[00123] No caso onde células apropriadas são induzidas a expressar Siglec-15 por engenharia genética e o Siglec-15 resultante é purificado e sujeito a triagem, Siglec-15 a ser triado pode ser selecionado a partir de polipeptídeos compostos das seqüências de aminoácidos mostradas nos seguintes (a) a (i): (a) uma seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Seqüências; (b) uma seqüência de aminoácidos composta de resíduos de aminoácidos 21 a 328 da seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Seqüências; (c) uma seqüência de aminoácidos composta de resíduos de aminoácidos 1 a 260 da seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Seqüências; (d) uma seqüência de aminoácidos composta de resíduos de aminoácidos 21 a 260 da seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Seqüências; (e) uma seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Seqüências; (f) uma seqüência de aminoácidos composta de resíduos de aminoácidos 21 a 341 da seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Seqüências; (g) uma seqüência de aminoácidos composta de resíduos de aminoácidos 1 a 258 da seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Seqüências; (h) uma seqüência de aminoácidos composta de resíduos de aminoácidos 21 a 258 da seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Seqüências; e (i) uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção ou adição de um ou diversos resíduos de aminoácidos na seqüência de aminoácidos descrita em (a) a (h).
[00124] Siglec-15 a ser triado também pode ser selecionado a partir de polipeptídeos compostos de seqüências de aminoácidos codificadas pelas seqüências de nucleotídeos mostradas nos seguintes (j) a (n): (j) uma seqüência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 1; (k) uma seqüência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 3; (l) uma seqüência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 19; (m) uma seqüência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 43; e (n) uma seqüência de nucleotídeos de um polinucleotídeo que hibridiza com um polinucleotídeo composto de uma seqüência de nucleotídeos complementar à seqüência de nucleotídeos descrita em (j) a (m) em condições estringentes.
[00125] Além disto, também é possível usar um polipeptídeo obtido acoplando uma cauda apropriada a qualquer destes polipeptídeos, ou um polipeptídeo fusionado com uma proteína solúvel diferente, como um alvo para triagem. Casualmente, o polipeptídeo composto dos resíduos de aminoácidos 1 a 20 da seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Seqüências corresponde ao peptídeo sinal de Siglec-15 humano, e o polipeptídeo composto dos resíduos de aminoácidos 21 a 260 deste corresponde ao domínio extracelular da proteína madura de Siglec-15 humano. Além disto, o polipeptídeo composto dos resíduos de aminoácidos 1 a 20 da seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Seqüências corresponde ao peptídeo sinal de Siglec-15 de camundongo, e o polipeptídeo composto dos resíduos de aminoácidos 21 a 258 deste corresponde ao domínio extracelular da proteína madura de Siglec- 15 de camundongo. Além disto, a seqüência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 43 codifica o domínio extracelular de Siglec-15 humano codificado pela seqüência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 1, e a seqüência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 19 codifica o domínio extracelular de Siglec-15 de camundongo codificado pela seqüência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 3.
[00126] Substâncias candidatas para uma substância que inibe diferenciação em osteoclastos selecionadas por qualquer dos métodos de triagem (1) a (3) podem ser secundariamente avaliadas usando a inibição de atividade de fosfatase ácida resistente a tartarato (TRAP) de osteoclastos como um índice conforme mostrado em Exemplos 17, 19 e 20. Além disto, a avaliação secundária destas também pode ser realizada usando a inibição de formação de osteoclastos multinucleados positivos para TRAP, i.e., a inibição de fusão celular de osteoclastos como um índice conforme mostrado em Exemplos 19, 21, 22 e 35. (4) Outros métodos
[00127] A taxa de incidência de metabolismo ósseo anormal ao longo do tempo, o grau de metabolismo ósseo anormal, e/ou a taxa de sobrevivência, etc. são determinados para o caso onde uma substância de teste foi administrada a um indivíduo mamífero induzido a superexpressar Siglec-15 e o caso onde a substância de teste não foi administrada a este. No caso onde, no mamífero com a administração da substância de teste, a taxa de incidência de metabolismo ósseo anormal é significativamente diminuída, o grau de metabolismo ósseo anormal é significativamente inferior, e/ou a taxa de sobrevivência é aumentada em cerca de 10% ou mais, preferivelmente cerca de 30% ou mais, mais preferivelmente cerca de 50% ou mais, a substância de teste pode ser selecionada como um composto tendo um efeito terapêutico e/ou preventivo para metabolismo ósseo anormal. 4. Produção de anticorpo anti-Siglec-15
[00128] O anticorpo contra Siglec-15 da invenção pode ser obtido imunizando um animal com Siglec-15 ou um polipeptídeo arbitrário selecionado a partir da seqüência de aminoácidos de Siglec-15, e coletando e purificando o anticorpo produzido IN VIVO de acordo com um procedimento comum. A espécie biológica de Siglec-15 a ser usado como um antígeno não é limitada um humano, e um animal pode ser imunizado com Siglec-15 derivado de um animal outro do que humano tal como camundongo ou rato. Neste caso, examinando a reatividade cruzada entre um anticorpo se ligando ao Siglec-15 heterólogo obtido e Siglec-15 humano, um anticorpo aplicável a uma doença humana pode ser selecionado.
[00129] Além disto, um anticorpo monoclonal pode ser obtido fusionando células produtoras de anticorpos que produzem um anticorpo contra Siglec-15 com células de mieloma para estabelecer um hibridoma de acordo com um método conhecido (por exemplo, Kohler e Milstein, Nature, (1975) 256, pp. 495-497; Kennet, R. ed., Monoclonal Antibody, pp. 365-367, Prenum Press, N.Y. (1980)).
[00130] Siglec-15 a ser usado como um antígeno pode ser obtido por engenharia genética para fazer com que uma célula hospedeira expresse o gene de Siglec-15.
[00131] Especificamente, a engenharia genética pode ser realizada como segue. Um vetor capaz de expressar o gene de Siglec-15 é produzido, e o vetor resultante é transfectado em uma célula hospedeira para expressar o gene, e então, o Siglec-15 expresso é purificado. A seguir, um método de obter um anticorpo contra Siglec-15 será especificamente descrito. (1) Preparação de antígeno
[00132] Exemplos do antígeno a ser usado para produzir o anticorpo anti- Siglec-15 incluem Siglec-15, um polipeptídeo composto de uma seqüência de aminoácidos parcial consistindo de pelo menos 6 resíduos de aminoácidos consecutivos de Siglec-15, e um derivado obtido adicionando uma dada seqüência de aminoácidos ou carreador a este. Além disto, na seção “3. Método de triar substância que inibe diferenciação em osteoclastos”, Siglec- 15 exemplificado como um alvo para triagem também pode ser exemplificado como um antígeno a ser usado para produzir o anticorpo anti-Siglec-15.
[00133] Siglec-15 pode ser usado depois de purificar diretamente a partir de tecidos tumorais ou células tumorais humanos. Além disto, Siglec-15 pode ser obtido sintetizando-o in vitro ou fazendo com que uma célula hospedeira o produza por engenharia genética.
[00134] Na engenharia genética, especificamente, cDNA de Siglec-15 é integrado em um vetor capaz de expressar cDNA de Siglec-15 e Siglec-15 é sintetizado em uma solução contendo enzimas, substratos, e substâncias energéticas requeridos para transcrição e tradução, ou outra célula hospedeira procariótica ou eucariótica é transformada para expressar Siglec-15, através do que o antígeno pode ser obtido.
[00135] Além disto, o antígeno também pode ser obtido como uma proteína secretora expressando uma proteína de fusão obtida ligando o domínio extracelular de Siglec-15 que é uma proteína de membrana para a região constante do anticorpo em um sistema hospedeiro-vetor apropriado.
[00136] cDNA de Siglec-15 pode ser obtido, por exemplo, por um assim chamado método de PCR no qual uma reação em cadeia da polimerase (daqui por diante referida como “PCR”) é realizada usando uma biblioteca de cDNA expressando cDNA de Siglec-15 como um modelo e iniciadores que amplificam especificamente cDNA de Siglec-15 (veja Saiki, R. K., et al., Science, (1988) 239, pp. 487-489).
[00137] Como o sistema de síntese IN VITRO do polipeptídeo, por exemplo, o Sistema de Tradução Rápida (RTS) fabricado por Roche Diagnostics, Inc. pode ser exemplificado, mas não é limitado a este.
[00138] Exemplos do hospedeiro procariótico incluem ESCHERICHIA COLI e BACILLUS SUBTILIS. A fim de transformar a célula hospedeira com um gene alvo, a célula hospedeira é transformada usando um plasmídeo vetor contendo um replicon, i.e., uma origem de replicação derivada de uma espécie compatível com o hospedeiro, e uma seqüência reguladora. Além disto, o vetor preferivelmente tem uma seqüência capaz de impor seletividade fenotípica na célula transformada.
[00139] Exemplos da célula hospedeira eucariótica incluem células de vertebrados, células de insetos, e células de leveduras. Como as células de vertebrados, por exemplo, linhagens deficientes em diidrofolato redutase (Urlaub, G. e Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 41264220) de células COS de símios (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, pp. 175-182, ATCC CRL-1650), fibroblastos murinos NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658), e células ovarianas de hamster Chinês (células CHO; ATCC: CCL-61); e as semelhantes são freqüentemente usadas, entretanto, elas não são limitadas a estas.
[00140] O transformante assim obtido pode ser cultivado de acordo com um procedimento comum, e pelo cultivo do transformante, um polipeptídeo alvo é produzido intracelularmente ou extracelularmente.
[00141] Um meio adequado para ser usado para o cultivo pode ser selecionado a partir de vários meios de cultura comumente usados dependendo da célula hospedeira empregada. Se ESCHERICHIA COLI é empregada, um meio LB suplementado com um antibiótico tal como ampicilina ou IPMG, se necessário, pode ser usado.
[00142] Uma proteína recombinante produzida intracelularmente ou extracelularmente pelo transformante através do cultivo pode ser separada e purificada por qualquer dos vários métodos de separação conhecidos utilizando uma propriedade física ou química da proteína.
[00143] Exemplos específicos dos métodos incluem tratamento com um precipitador de proteína comum, ultrafiltração, vários tipos de cromatografia líquida tal como cromatografia de peneira molecular (filtração em gel), cromatografia de adsorção, cromatografia de troca iônica e cromatografia de afinidade, diálise, e uma combinação destas.
[00144] Além disto, acoplando seis resíduos de histidina a uma proteína recombinante a ser expressa, a proteína pode ser eficientemente purificada com uma coluna de afinidade de níquel. Alternativamente, acoplando a região Fc de IgG a uma proteína recombinante a ser expressa, a proteína pode ser eficientemente purificada com uma coluna de proteína A.
[00145] Combinando os métodos mencionados acima, uma grande quantidade de um polipeptídeo alvo pode ser facilmente produzida em alto rendimento e alta pureza. (2) Produção de anticorpo monoclonal anti-Siglec-15
[00146] Exemplos do anticorpo se ligando especificamente a Siglec-15 incluem um anticorpo monoclonal se ligando especificamente a Siglec-15, e um método de obter o anticorpo é como descrito abaixo.
[00147] Produção de um anticorpo monoclonal geralmente requer as seguintes etapas operacionais de: (a) purificar um biopolímero a ser usado como um antígeno; (b) preparar células produtoras de anticorpos imunizando um animal por injeção do antígeno, coletar o sangue, ensaiar seu título de anticorpos e determinar quando o baço deve ser amputado; (c) preparar células de mieloma (daqui por diante referidas como "mieloma"); (d) fusionar as células produtoras de anticorpos com o mieloma; (e) triar um grupo de hibridomas produzindo um anticorpo alvo; (f) dividir os hibridomas em clones com única célula (clonagem); (g) opcionalmente, cultivar o hibridoma ou criar um animal implantado com o hibridoma para produzir uma grande quantidade de um anticorpo monoclonal; (h) examinar o anticorpo monoclonal assim produzida para atividade biológica e especificidade de ligação, ou ensaiar os mesmos para propriedades com um reagente marcado; e os semelhantes.
[00148] A seguir, o método de produzir um anticorpo monoclonal será descrito em detalhe seguindo as etapas acima, entretanto, o método não é limitado a este, e, por exemplo, células produtoras de anticorpos e mieloma outras do que células de baço podem ser usadas. (i) Purificação de antígeno
[00149] Como o antígeno, Siglec-15 preparado pelo método como descrito acima ou um peptídeo parcial deste podem ser usados.
[00150] Além disto, uma fração de membrana preparada a partir de células recombinantes expressando Siglec-15 ou as próprias células recombinantes expressando Siglec-15, e também um peptídeo parcial da proteína da invenção quimicamente sintetizado por um método conhecido por aqueles versados na arte também podem ser usados como o antígeno. (j) Preparação de células produtoras de anticorpos
[00151] O antígeno obtido em etapa (a) é misturado com um adjuvante tal como adjuvante completo ou incompleto de Freund, ou sulfato de alumínio- potássio e a mistura resultante é usada como um imunogene para imunizar um animal experimental. Como o animal experimental, qualquer animal usado em um método conhecido de produção de hibridoma pode ser usado sem nenhum problema. Especificamente, por exemplo, camundongo, rato, cabra, ovelha, gado, cavalo ou os semelhantes podem ser usados. Entretanto, do ponto de vista de facilidade de disponibilidade de células de mieloma para serem fusionadas com as células produtoras de anticorpos extraídas, camundongo ou rato é preferivelmente usado como o animal a ser imunizado.
[00152] Além disto, a linhagem de camundongo ou rato a ser usada de fato não é particularmente limitada, e no caso de camundongo, por exemplo, várias linhagens tal como A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB, e 129 podem ser usadas, e no caso de rato, por exemplo, Wistar, Low, Lewis, Sprague Dawley, ACI, BN, Fischer e os semelhantes podem ser usados.
[00153] Estes camundongos e ratos estão disponíveis comercialmente a partir de criadores/distribuidores de animais experimentais, por exemplo, CLEA Japan, Inc. e Charles River Laboratories Japan, Inc.
[00154] Dentre estes, em consideração de compatibilidade de fusão com células de mieloma descritas abaixo, no caso de camundongos, linhagem BALB/c, e no caso de ratos, linhagens Wistar e Low são particularmente preferidas.
[00155] Além disto, em consideração de homologia antigênica entre humanos e camundongos, também é preferido usar um camundongo tendo função biológica diminuída para remover auto-anticorpos, isto é, um camundongo com uma doença auto-imune.
[00156] A idade do camundongo ou rato no momento de imunização é preferivelmente 5 a 12 semanas de idade, mais preferivelmente 6 a 8 semanas de idade.
[00157] A fim de imunizar um animal com Siglec-15 ou um recombinante deste, por exemplo, um método conhecido é descrito em detalhe em, por exemplo, Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. e Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Spigfield, Illinois (1964), ou os semelhantes.
[00158] Dentre estes métodos de imunização, um método específico preferido na invenção é, por exemplo, como segue.
[00159] Isto é, primeiro, uma fração de proteína de membrana servindo como o antígeno ou células induzidas a expressar o antígeno é/são intradermicamente ou intraperitonealmente administrado(as) a um animal.
[00160] Entretanto, a combinação de ambas as rotas de administração é preferida para aumentar a eficiência de imunização, e quando administração intradérmica é realizada na primeira metade e administração intraperitoneal é realizada na última metade ou apenas na última dosagem, a eficiência de imunização pode ser particularmente aumentada.
[00161] O esquema de administração do antígeno varia dependendo do tipo de animal a ser imunizado, diferenças individuais ou os semelhantes. Entretanto, em geral, a freqüência de administração do antígeno é de preferivelmente 3 a 6 vezes, mais preferivelmente 3 a 4 vezes, e o intervalo de dosagem é preferivelmente de 2 a 6 semanas, mais preferivelmente 2 a 4 semanas.
[00162] Além disto, a dose do antígeno varia dependendo do tipo de animal a ser imunizado, diferenças individuais ou os semelhantes. Entretanto, a dose geralmente é ajustada para 0,05 a 5 mg, preferivelmente cerca de 0,1 a 0,5 mg.
[00163] Uma imunização de reforço é realizada 1 a 6 semanas, preferivelmente 2 a 4 semanas, mais preferivelmente 2 a 3 semanas depois da administração do antígeno como descrito acima.
[00164] A dose do antígeno no momento de realizar a imunização de reforço varia dependendo do tipo ou tamanho de animal ou os semelhantes, entretanto, no caso de um camundongo, a dose geralmente é ajustada para 0,05 a 5 mg, preferivelmente 0,1 a 0,5 mg, mais preferivelmente cerca de 0,1 a 0,2 mg.
[00165] Células de baço ou linfócitos incluindo células produtoras de anticorpos são removidas assepticamente do animal imunizado 1 a 10 dias, preferivelmente 2 a 5 dias, mais preferivelmente 2 a 3 dias depois da imunização de reforço.
[00166] Neste momento, o título de anticorpos é medido, e se um animal tendo um título de anticorpos suficientemente aumentado é usado como uma fonte de abastecimento das células produtoras de anticorpos, o procedimento subseqüente pode ser realizado mais eficientemente.
[00167] O método de medir o título de anticorpos a ser usado aqui inclui, por exemplo, um método RIA e um método ELISA, mas não é limitado a este.
[00168] Por exemplo, se um método ELISA é empregado, a medição do título de anticorpos na invenção pode ser realizada de acordo com os procedimentos como descrito abaixo.
[00169] Primeiro, um antígeno purificado ou parcialmente purificado é adsorvido na superfície de uma fase sólida tal como uma placa de 96 poços para ELISA, e a superfície da fase sólida não tendo nenhum antígeno adsorvido nesta é coberta com uma proteína não relacionada ao antígeno tal como albumina de soro bovino (daqui por diante referido como "BSA"). Depois de lavar a superfície, a superfície é colocada em contato com uma amostra serialmente diluída (por exemplo, soro de camundongo) como um anticorpo primário para permitir que o anticorpo contido na amostra se ligue ao antígeno.
[00170] Além disto, como um anticorpo secundário, um anticorpo marcado com uma enzima contra um anticorpo de camundongo é adicionado e é deixada para se ligar ao anticorpo de camundongo. Depois de lavagem, um substrato para a enzima é adicionado e a alteração em absorbância que ocorre devido a desenvolvimento de cor induzida por degradação do substrato ou os semelhantes é medida para calcular o título de anticorpos.
[00171] A separação das células produtoras de anticorpos das células de baço ou linfócitos pode ser realizada de acordo com um método conhecido (por exemplo, Kohler et al., Nature (1975), 256, p. 495; Kohler et al., Eur. J. Immunol. (1977), 6, p. 511; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550; Walsh, Nature (1977), 266, p. 495).
[00172] Por exemplo, no caso de células de baço, um método geral no qual as células produtoras de anticorpos são separadas homogeneizando o baço para obter células através de filtração com uma malha de aço inoxidável e suspendendo as células em meio mínimo essencial de Eagle (MEM) pode ser empregado. (k) Preparação de células de mieloma (daqui por diante referidas como "mieloma")
[00173] As células de mieloma a serem usadas para fusão celular não são particularmente limitadas e células adequadas podem ser selecionadas a partir de linhagens celulares conhecidas. Entretanto, em consideração de conveniência quando um hibridoma é selecionado a partir de células fusionadas, é preferido usar uma linhagem deficiente em HGPRT (hipoxantina-guanina fosforribosil transferase) cujo procedimento de seleção foi estabelecido.
[00174] Mais especificamente, exemplos da linhagem deficiente em HGPRT incluem X63-Ag8(X63), NS1-ANS/1(NS1), P3X63- Ag8.U1(P3U1),X63-Ag8.653(X63.653), SP2/0-Ag14(SP2/0), MPC11- 45.6TG1.7(45.6TG), F0, S149/5XXO e BU.1 derivadas de camundongos, 210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3) derivadas de ratos; e U266AR(SKO- 007),GM1500.GTG-A12(GM1500),UC729-6,LICR-LOW-HMy2(HMy2) e 8226AR/NIP4-1(NP41) derivadas de humanos.
[00175] Estas linhagens deficientes em HGPRT estão disponíveis, por exemplo, a partir da American Type Culture Collection (ATCC) ou os semelhantes.
[00176] Estas linhagens celulares são subcultivadas em um meio apropriado tal como um meio de 8-azaguanina [um meio obtido adicionando 8-azaguanina a um meio RPMI-1640 suplementado com glutamina, 2- mercaptoetanol, gentamicina e soro fetal bovino (daqui por diante referido como "FCS")]; meio de Dulbecco modificado por Iscove (daqui por diante referido como "IMDM"), ou meio de Eagle modificado por Dulbecco (daqui por diante referido como "DMEM"). Neste caso, 3 a 4 dias antes de realizar fusão celular, as células são subcultivadas em um meio normal [por exemplo, um meio ASF104 (fabricado por Ajinomoto Co., Ltd.) contendo 10% de FCS] para obter não menos do que 2 x 107 células no dia de fusão celular. (l) Fusão celular
[00177] Fusão entre as células produtoras de anticorpos e as células de mieloma é apropriadamente realizada de acordo com um método conhecido (Weir, D. M. Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. e Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher, Springfield, Illinois (1964), etc.), em condições tais que a taxa de sobrevivência de células não é excessivamente reduzida.
[00178] Exemplos do método incluem um método químico no qual as células produtoras de anticorpos e as células de mieloma são misturadas em uma solução de polímero com alta concentração de polietilenoglicol ou os semelhantes, e um método físico usando estimulação elétrica.
[00179] Dentre estes métodos, um exemplo específico do método químico é como descrito abaixo.
[00180] Isto é, no caso onde polietilenoglicol é usado para a solução de polímero com alta concentração, as células produtoras de anticorpos e as células de mieloma são misturadas em uma solução de polietilenoglicol tendo um peso molecular de 1500 a 6000, mais preferivelmente 2000 a 4000 em uma temperatura de 30 a 40°C, preferivelmente 35 a 38°C por 1 a 10 minutos, preferivelmente 5 a 8 minutos. (m) Seleção de um grupo de hibridomas
[00181] O método de selecionar hibridomas obtidos pela fusão celular mencionada acima não é particularmente limitado. Normalmente, um método de seleção por HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina) (Kohler et al., Nature (1975), 256, p. 495; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550) é usado.
[00182] Este método é efetivo quando hibridomas são obtidos usando as células de mieloma de uma linhagem deficiente em HGPRT incapaz de sobreviver na presença de aminopterina.
[00183] Isto é, cultivando células não fusionadas e hibridomas em um meio HAT, apenas hibridomas resistentes a aminopterina são seletivamente deixados para sobreviver e se proliferar. (n) Divisão em clone com única célula (clonagem)
[00184] Como um método de clonagem para hibridomas, um método conhecido tal como um método de metilcelulose, um método de agarose maleável, ou um método de diluição limitante podem ser usados (veja, por exemplo, Barbara, B. M. e Stanley, M. S.: Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980)). Dentre estes métodos, particularmente, um método de diluição limitante é preferido.
[00185] Neste método, uma linhagem celular de fibroblasto derivada de um feto de rato ou células alimentadoras tal como células de baço normais de camundongo, células da glândula do timo, ou células de ascites são inseminadas em uma microplaca.
[00186] Por enquanto, hibridomas são diluídos em um meio para gerar uma densidade celular de 0,2 a 0,5 células por 0,2 ml. Uma alíquota de 0,1 ml da suspensão de hibridomas diluídos é colocada em cada poço e cultivo é continuado por cerca de 2 semanas embora substituindo cerca de 1/3 da solução de cultura por um meio fresco em intervalos pré-determinados de tempo (por exemplo, a cada 3 dias), de maneira que clones de hibridoma podem ser proliferados.
[00187] Os hibridomas em poços para os quais o título de anticorpos foi confirmado são sujeitos a, por exemplo, clonagem pelo método de diluição limitante repetidamente 2 a 4 vezes. Um hibridoma que foi confirmado ter um título de anticorpos estável é selecionado como uma linhagem de hibridoma produtora de anticorpo monoclonal anti-Siglec-15.
[00188] Exemplos da linhagem de hibridoma assim clonada incluem hibridoma #32A1 e hibridoma #41B1. Hibridoma #32A1 e hibridoma #41B1 foram depositados no International Patent Organism Depositary do National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (localizado em Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) em 28 de Agosto de 2008. O hibridoma #32A1 recebeu um número de depósito de FERM BP-10999 sob o nome de Hibridoma anti-Siglec-15 #32A1, e o hibridoma #41B1 recebeu um número de depósito de FERM BP-11000 sob o nome de Hibridoma anti-Siglec-15 #41B1. Nesta descrição, o anticorpo produzido pelo hibridoma #32A1 é representado por “anticorpo #32A1” ou simplesmente “#32A1”, e o anticorpo produzido pelo hibridoma #41B1 é representado por “anticorpo #41B1” ou simplesmente “#41B1”. Além disto, anticorpos obtidos nos Exemplos desta descrição outros do que de hibridoma #32A1 e hibridoma #41B1 também são representados pelos nomes de anticorpos da mesma maneira. (o) Preparação de anticorpo monoclonal cultivando hibridoma
[00189] Cultivando o hibridoma assim selecionado, um anticorpo monoclonal pode ser eficientemente obtido. Entretanto, antes do cultivo, é preferido realizar triagem de um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal alvo.
[00190] Na triagem, um método conhecido pode ser empregado.
[00191] A medição do título de anticorpos na invenção pode ser realizada, por exemplo, por um método ELISA explicado em item (b) descrito acima.
[00192] O hibridoma obtido pelo método como descrito acima pode ser armazenado em um estado congelado em nitrogênio líquido ou em um congelador a -80°C ou abaixo.
[00193] Depois de conclusão de clonagem, o meio é trocado de um meio HT para um meio normal, e o hibridoma é cultivado.
[00194] Cultura em larga escala é realizada por cultura agitada usando um frasco de cultura grande ou por cultura agitada.
[00195] A partir do sobrenadante obtido pela cultura em larga escala, um anticorpo monoclonal que se liga especificamente à proteína da invenção pode ser obtido por purificação usando um método conhecido por aqueles versados na arte tal como filtração em gel.
[00196] Além disto, o hibridoma é injetado na cavidade abdominal de um camundongo da mesma linhagem que o hibridoma (por exemplo, a BALB/c mencionada acima) ou um camundongo Nu/Nu para proliferar o hibridoma, de maneira que as ascites contendo uma grande quantidade do anticorpo monoclonal da invenção podem ser obtidas.
[00197] No caso onde o hibridoma é administrado na cavidade abdominal, se um óleo mineral tal como 2,6,10,14-tetrametil pentadecano (pristina) é administrado 3 a 7 dias antes deste, uma maior quantidade das ascites pode ser obtida.
[00198] Por exemplo, um imunossupressor é previamente injetado na cavidade abdominal de um camundongo da mesma linhagem que o hibridoma para inativar células T. 20 dias depois, 106 a 107 células de clones de hibridomas são suspensas em um meio livre de soro (0,5 ml), e a suspensão é injetada na cavidade abdominal do camundongo. Em geral, quando o abdômen está expandido e preenchido com as ascites, a ascite é coletada.
[00199] Através deste método, o anticorpo monoclonal pode ser obtido em uma concentração cerca de 100 vezes maior do que aquela da solução de cultura.
[00200] O anticorpo monoclonal obtido pelo método mencionado acima pode ser purificado pelo método descrito em, por exemplo, Weir, D. M.: Handbook of Experimental Immunology Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978).
[00201] Isto é, exemplos do método incluem um método de precipitação com sulfato de amônio, filtração em gel, cromatografia de troca iônica, e cromatografia de afinidade.
[00202] Como um método de purificação simples, um kit de purificação de anticorpo monoclonal comercialmente disponível (por exemplo, kit MAbTrap GII fabricado por Pharmacia, Inc.) ou os semelhantes também podem ser usados.
[00203] O anticorpo monoclonal assim obtido tem alta especificidade de antígeno para Siglec-15. (p) Ensaio de anticorpo monoclonal
[00204] O isotipo e subclasse do anticorpo monoclonal assim obtido podem ser determinados como segue.
[00205] Primeiro, exemplos do método de identificação incluem o método de Ouchterlony, um método ELISA e um método RIA.
[00206] O método de Ouchterlony é simples, mas quando a concentração do anticorpo monoclonal é baixa, uma operação de condensação é requerida.
[00207] Por outro lado, quando um método ELISA ou um método RIA é usado, reagindo diretamente o sobrenadante de cultura com um antígeno adsorvido em fase sólida e usando anticorpos correspondendo a vários tipos de isotipos e subclasses de imunoglobulina como anticorpos secundários, o isotipo e subclasse do anticorpo monoclonal podem ser identificados.
[00208] Em adição, como um método mais simples, um kit de identificação comercialmente disponível (por exemplo, kit Mouse Typer fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) ou os semelhantes também podem ser usados.
[00209] Além disto, determinação quantitativa de uma proteína pode ser realizada pelo método de Folin Lowry e um método de cálculo baseado na absorbância a 280 nm [1,4 (OD 280) = Imunoglobulina 1 mg/ml]. (3) Outros anticorpos
[00210] O anticorpo da invenção inclui não apenas o anticorpo monoclonal mencionado acima contra Siglec-15, mas também um anticorpo recombinante obtido por modificação artificial para o propósito de diminuir antigenicidade heteróloga para humanos tal como um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado e um anticorpo humano. Estes anticorpos podem ser produzidos usando um método conhecido.
[00211] Como o anticorpo quimérico, um anticorpo no qual regiões variáveis e constantes de anticorpo são derivadas de espécies diferentes, por exemplo, um anticorpo quimérico no qual uma região variável de anticorpo derivado de camundongo é conectada a uma região constante derivada de humano pode ser exemplificado (veja Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 68516855, (1984)).
[00212] Como o anticorpo humanizado, um anticorpo obtido integrando apenas uma região determinante de complementaridade (CDR) em um anticorpo derivado de humano (veja Nature (1986) 321, pp. 522-525), e um anticorpo obtido enxertando uma parte dos resíduos de aminoácidos do arcabouço assim como a seqüência de CDR em um anticorpo humano por um método de enxerto de CDR (Patente Internacional 90/07861) podem ser exemplificados.
[00213] Além disto, o anticorpo da invenção inclui um anticorpo humano. Um anticorpo humano anti-Siglec-15 se refere a um anticorpo humano tendo apenas uma seqüência de genes de um anticorpo derivado de um cromossomo humano. O anticorpo humano anti-Siglec-15 pode ser obtido por um método usando um camundongo produtor de anticorpo humano tendo um fragmento de cromossomo humano contendo genes de cadeia H e cadeia L de um anticorpo humano (veja Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, pp. 133-143; Kuroiwa, Y. et al., Nuc. Acids Res. (1998) 26, pp. 3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, pp. 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, pp. 722-727, etc.).
[00214] Um tal animal transgênico pode ser criado especificamente como segue. Um animal geneticamente modificado no qual loci de genes endógenos de cadeia pesada e leve de imunoglobulina de mamífero não humano foram rompidos, e ao invés, loci de genes endógenos de cadeia pesada e leve de imunoglobulina humana foram introduzidos através de um vetor de cromossomo artificial de levedura (YAC) ou os semelhantes é criado produzindo um animal nocaute e um animal transgênico e cruzando estes animais.
[00215] Além disto, de acordo com uma técnica de engenharia genética, usando cDNAs codificando uma tal cadeia pesada e uma cadeia leve de um anticorpo humano, respectivamente, preferivelmente um vetor contendo os cDNAs, células eucarióticas são transformadas, e um transformante que produz um anticorpo monoclonal humano recombinante é cultivado, de maneira que o anticorpo também pode ser obtido a partir do sobrenadante de cultura.
[00216] Aqui, como o hospedeiro, por exemplo, células eucarióticas, preferivelmente células de mamíferos tal como células CHO, linfócitos ou células de mieloma podem ser usadas.
[00217] Além disto, um método de obter um anticorpo humano derivado de apresentação em fago triado a partir de uma biblioteca de anticorpos humanos (veja Wormstone, I. M. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), pp. 2301-2308; Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), pp. 189-203; Siriwardena, D. et al., Opthalmology (2002) 109 (3), pp. 427-431, etc.) também é conhecido.
[00218] Por exemplo, o método de apresentação em fago no qual uma região variável de um anticorpo humano é expressa na superfície de um fago como um anticorpo de cadeia única (scFv), e um fago que se liga a um antígeno é selecionado (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), pp. 1105-1116) pode ser usado.
[00219] Analisando o gene do fago selecionado baseado na ligação com um antígeno, a seqüência de DNA codificando a região variável de um anticorpo humano que se liga a um antígeno pode ser determinada.
[00220] Se a seqüência de DNA de scFv que se liga a um antígeno é determinada, um anticorpo humano pode ser obtido preparando um vetor de expressão tendo a seqüência e introduzindo o vetor em um hospedeiro apropriado para expressá-lo (Patente Internacional 92/01047, Patente Internacional 92/20791, Patente Internacional 93/06213, Patente Internacional 93/11236, Patente Internacional 93/19172, Patente Internacional 95/01438, Patente Internacional 95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, pp. 433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), pp. 1105-1116).
[00221] No caso onde um anticorpo é produzido isolando uma vez um gene de anticorpo e então introduzindo o gene em um hospedeiro apropriado, uma combinação de hospedeiro e vetor de expressão apropriados pode ser usada.
[00222] No caso onde células eucarióticas são usadas como o hospedeiro, células animais, células vegetais e microorganismos eucarióticos podem ser usados.
[00223] Como as células animais, (1) células de mamíferos, por exemplo, linhagens deficientes em diidrofolato redutase (Urlaub, G. e Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 4126-4220) de células COS de símios (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, pp. 175-182, ATCC CRL-1650), fibroblastos murinos NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658), e células ovarianas de hamster Chinês (células CHO; ATCC: CCL-61); pode ser exemplificadas.
[00224] Em casos onde células procarióticas são usadas, por exemplo, ESCHERICHIA COLI e BACILLUS SUBTILIS podem ser exemplificadas.
[00225] Introduzindo um gene de um anticorpo alvo nestas células através de transformação, e cultivando as células assim transformadas IN VITRO, o anticorpo pode ser obtido.
[00226] Não existe limitação em isotipo do anticorpo da invenção, e exemplos destes incluem IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (IgA1, IgA2), IgD e IgE, e exemplos preferidos destes incluem IgG e IgM.
[00227] Além disto, o anticorpo da invenção pode ser um fragmento funcional do anticorpo tendo um sítio de ligação de antígeno do anticorpo ou um fragmento modificado deste. O fragmento do anticorpo pode ser obtido tratando o anticorpo com uma protease tal como papaína ou pepsina, ou modificando o gene de anticorpo de acordo com uma técnica de engenharia genética e expressando o gene modificado em células cultivadas adequadas. Dentre estes fragmentos de anticorpos, um fragmento tendo todas ou parte das funções da molécula de comprimento completo do anticorpo pode ser chamado de um fragmento funcional do anticorpo. Como as funções do anticorpo, geralmente uma atividade de ligação a antígeno, uma atividade de neutralizar a atividade de um antígeno, uma atividade de aumentar a atividade de um antígeno, uma atividade citotóxica dependente de anticorpo, uma atividade citotóxica dependente de complemento, e uma atividade citotóxica celular dependente de complemento podem ser exemplificadas. A função do fragmento funcional do anticorpo de acordo com a invenção preferivelmente é uma atividade de inibir a formação de osteoclastos, mais preferivelmente uma atividade de inibir o processo de fusão celular de osteoclastos.
[00228] Exemplos do fragmento do anticorpo incluem Fab, F(ab’)2, Fv, Fv de cadeia única (scFv) no qual moléculas de Fv da cadeia pesada e da cadeia leve são ligadas através de um ligante apropriado, um diacorpo (diacorpos), um anticorpo linear, e um anticorpo poliespecífico composto do fragmento de anticorpo. Além disto, Fab’ que é um fragmento monovalente em uma região variável de um anticorpo obtido tratando F(ab’)2 em condições redutoras também está incluído no fragmento do anticorpo.
[00229] Além disto, o anticorpo da invenção pode ser um anticorpo poliespecífico com especificidade para pelo menos dois antígenos diferentes.
[00230] Em geral, uma tal molécula se liga a dois antígenos (isto é, anticorpo biespecífico), entretanto, o “anticorpo poliespecífico” como usado neste lugar inclui um anticorpo tendo especificidade para dois ou mais (por exemplo, três) antígenos.
[00231] O anticorpo da invenção pode ser um anticorpo poliespecífico composto de um anticorpo de comprimento completo ou um fragmento de um tal anticorpo (por exemplo, anticorpo biespecífico F(ab’)2). O anticorpo biespecífico pode ser produzido ligando as cadeias pesadas e leves (pares HL) de dois tipos de anticorpos, ou também pode ser produzido fusionando hibridomas que produzem diferentes anticorpos monoclonais para preparar células fusionadas que produzem o anticorpo biespecífico (Millstein et al., Nature (1983) 305, pp. 537-539).
[00232] O anticorpo da invenção pode ser um anticorpo de cadeia única (também referido como scFv). O anticorpo de cadeia única pode ser obtido ligando as regiões V da cadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo através de um ligante de polipeptídeo (Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113 (editado por Rosenburg e Moore, Springer Verlag, Nova Iorque, pp. 269-315 (1994), Nature Biotechnology (2005), 23, pp. 11261136). Além disto, um fragmento BiscFv produzido ligando duas moléculas de scFv através de um ligante de polipeptídeo também pode ser usado como o anticorpo biespecífico.
[00233] Um método de produzir um anticorpo de cadeia única é conhecido neste campo técnico (veja, por exemplo, Patente Norte-Americana Nos. 4.946.778, 5.260.203, 5.091.513, 5.455.030, etc.). Neste scFv, as regiões V da cadeia pesada e da cadeia leve são ligadas através de um ligante que não forma um conjugado, preferivelmente através de um ligante de polipeptídeo (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988), 85, pp. 5879-5883). Neste scFv, as regiões V da cadeia pesada e da cadeia leve podem ser derivadas do mesmo anticorpo ou de anticorpos diferentes. Como o ligante de polipeptídeo a ser usado para ligar as regiões V, por exemplo, um dado peptídeo de cadeia única composto de 12 a 19 resíduos é usado.
[00234] DNA codificando scFv pode ser obtido realizando amplificação usando um DNA parcial codificando a seqüência de aminoácidos inteira ou uma desejada de um DNA selecionado a partir de um DNA codificando a cadeia pesada ou a região V da cadeia pesada do anticorpo mencionado acima e um DNA codificando a cadeia leve ou a região V da cadeia leve deste como um modelo por um método de PCR usando um par de iniciadores que define ambas as extremidades deste, e posteriormente realizando amplificação combinando um DNA codificando uma porção de ligante de polipeptídeo e um par de iniciadores que define ambas as extremidades deste de forma a ligar ambas as extremidades à cadeia pesada e à cadeia leve, respectivamente.
[00235] Além disto, uma vez que DNA codificando scFv é produzido, um vetor de expressão contendo o mesmo e um hospedeiro transformado pelo vetor de expressão pode ser obtido de acordo com um procedimento comum. Além disto, usando o hospedeiro resultante, scFv pode ser obtido de acordo com um procedimento comum.
[00236] Um fragmento de anticorpo deste pode ser produzido em um hospedeiro obtendo um gene e expressando o gene da mesma maneira como descrito acima.
[00237] O anticorpo da invenção pode ser multimerizado para aumentar a afinidade para um antígeno. O anticorpo a ser multimerizado pode ser um tipo de anticorpo ou uma pluralidade de anticorpos que reconhecem uma pluralidade de epítopos do mesmo antígeno. Como um método de multimerização do anticorpo, ligação do domínio CH3 de IgG com duas moléculas de scFv, ligação com estreptavidina, introdução de um motivo hélice-alça-hélice e os semelhantes podem ser exemplificados.
[00238] O anticorpo da invenção pode ser um anticorpo policlonal que é uma mistura de vários tipos de anticorpos anti-Siglec-15 tendo diferentes seqüências de aminoácidos. Como um exemplo do anticorpo policlonal, uma mistura de vários tipos de anticorpos tendo diferentes CDR pode ser exemplificada. Como um tal anticorpo policlonal, uma mistura de células que produzem anticorpos diferentes é cultivada, e um anticorpo purificado a partir da cultura resultante pode ser usado (veja Patente Internacional 2004/061104).
[00239] Como um anticorpo modificado, um anticorpo ligado a qualquer de vários tipos de moléculas tal como polietilenoglicol (PEG) também pode ser usado.
[00240] Além disto, o anticorpo da invenção pode estar na forma de um conjugado formado entre qualquer destes anticorpos e outro agente medicinal (imunoconjugado). Exemplos de um tal anticorpo incluem um no qual o anticorpo é conjugado com um material radioativo ou um composto tendo uma ação farmacológica (Nature Biotechnology (2005) 23, pp. 1137-1146).
[00241] O anticorpo obtido pode ser purificado para homogeneidade. A separação e purificação do anticorpo podem ser realizadas empregando um método convencional de separação e purificação de proteínas.
[00242] Por exemplo, o anticorpo pode ser separado e purificado selecionando apropriadamente e combinando uso de uma coluna de cromatografia, filtro, ultrafiltração, precipitação salina, diálise, eletroforese preparativa em gel de poliacrilamida, eletroforese de focalização isoelétrica, e os semelhantes (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), mas o método não é limitado a estes.
[00243] Exemplos de cromatografia incluem cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica, cromatografia hidrofóbica, cromatografia de filtração em gel, cromatografia de fase reversa, e cromatografia de adsorção.
[00244] Tal cromatografia pode ser realizada empregando cromatografia líquida tal como HPLC ou FPLC.
[00245] Como uma coluna a ser usada em cromatografia de afinidade, uma coluna de Proteína A e uma coluna de Proteína G podem ser exemplificadas.
[00246] Por exemplo, como uma coluna usando uma coluna de Proteína A, Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia) e as semelhantes podem ser exemplificadas.
[00247] Além disto, usando um carreador tendo um antígeno imobilizado neste, o anticorpo também pode ser purificado utilizando a propriedade de ligação do anticorpo ao antígeno. 5. Remédio contendo anticorpo anti-Siglec-15
[00248] A partir dos anticorpos anti-Siglec-15 obtidos pelo método descrito no item acima “4. Produção de anticorpo anti-Siglec-15”, um anticorpo que neutraliza a atividade biológica de Siglec-15 pode ser obtido. Um tal anticorpo que neutraliza a atividade biológica de Siglec-15 inibe a atividade biológica de Siglec-15 IN VIVO, i.e., a diferenciação e/ou maturação de osteoclastos, e, portanto, pode ser usado como um agente terapêutico e/ou preventivo para metabolismo ósseo anormal causado por diferenciação e/ou maturação anormal de osteoclastos como um remédio. O metabolismo ósseo anormal pode ser qualquer distúrbio caracterizado por perda óssea líquida (osteopenia ou osteólise). Em geral, o tratamento e/ou prevenção pelo anticorpo anti-Siglec-15 são/é aplicado(s) a um caso onde inibição de reabsorção óssea é requerida. Exemplos do metabolismo ósseo anormal que pode ser tratado e/ou prevenido pelo anticorpo anti-Siglec-15 incluem osteoporose (osteoporose pós-menopausa, osteoporose senil, osteoporose secundária devido ao uso de um agente terapêutico tal como um esteróide ou um imunossupressor, ou osteoporose acompanhando artrite reumatóide), destruição óssea acompanhando artrite reumatóide, hipercalcemia cancerosa, destruição óssea acompanhando mieloma múltiplo ou metástase de câncer para osso, tumor de células gigantes, perda de dentes devido a periodontite, osteólise ao redor de uma prótese de junta, destruição óssea em osteomielite crônica, doença de Paget do osso, osteodistrofia renal e osteogênese imperfeita, entretanto, o metabolismo ósseo anormal não é limitado a estes contanto que ele seja uma doença acompanhada por perda óssea líquida causada por osteoclastos. Exemplos do anticorpo anti-Siglec-15 a ser usado como o remédio mencionado acima incluem um anticorpo quimérico e um anticorpo humanizado produzido a partir do anticorpo #32A1 ou anticorpo #41B1 pelo método descrito em 4. (3) “Outros anticorpos”. Além disto, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado e um anticorpo humano compartilhando o mesmo epítopo que o anticorpo #32A1 ou anticorpo #41B1 também podem ser usados como um remédio. Se um certo anticorpo anti- Siglec-15 compartilha o mesmo epítopo que o anticorpo #32A1 ou anticorpo #41B1 pode ser confirmado observando se ou não estes anticorpos se ligam ao mesmo peptídeo parcial específico de Siglec-15. Além disto, também pode ser determinado que se o certo anticorpo anti-Siglec-15 compete com o anticorpo #32A1 ou anticorpo #41B1 por ligação com Siglec-15, estes anticorpos compartilham o mesmo epítopo.
[00249] A atividade IN VITRO do anticorpo anti-Siglec-15 de neutralizar a atividade biológica de Siglec-15 pode ser determinada, por exemplo, pela atividade de inibir a diferenciação das células que superexpressam Siglec-15 em osteoclastos. Por exemplo, o anticorpo anti-Siglec-15 é adicionado a células RAW 264.7 ou células Raw 264 que são uma linhagem celular derivada de monócito de camundongo em várias concentrações, e a atividade de inibir a diferenciação em osteoclastos por estimulação com RANKL ou TNF-α pode ser determinada. Além disto, o anticorpo anti-Siglec-15 é adicionado a células primárias cultivadas derivadas de medula óssea em várias concentrações, e a atividade de inibir a diferenciação em osteoclastos por estimulação com RANKL, TNF-α ou vitamina D3 ativa pode ser determinada. Além disto, o anticorpo anti-Siglec-15 é adicionado a células precursoras de osteoclastos humanos normais (Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells, disponíveis a partir de Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. 2T-110) em várias concentrações, e a atividade de inibir a diferenciação em osteoclastos por estimulação com RANKL ou M-CSF pode ser determinada. Um tal efeito inibitório em diferenciação de osteoclastos pode ser determinado usando a inibição de atividade de fosfatase ácida resistente a tartarato (TRAP) de osteoclastos como um índice conforme mostrado em Exemplos 17, 19, 20 e 26. Além disto, o efeito inibitório em diferenciação de osteoclastos também pode ser determinado usando a inibição de formação de osteoclastos multinucleados positivos para TRAP, i.e., a inibição de fusão celular de osteoclastos como um índice conforme mostrado em Exemplos 19, 21, 22 e 35. Os anticorpos da invenção exibiram um efeito inibitório em fusão celular em uma concentração de 30 μg/ml ou menos no sistema de teste mencionado acima para diferenciação de osteoclastos, e alguns anticorpos exibiram o efeito inibitório mesmo em uma concentração de 3 μg/ml ou menos ou 1 μg/ml ou menos. Além disto, no caso onde o efeito em uma concentração mais baixa foi testado, foi encontrado que uma pluralidade de anticorpos exibiram um efeito inibitório em diferenciação de osteoclastos mesmo em um intervalo de concentração de a partir de 63 ng/ml a 1 μg/ml. Além disto, em um experimento de um ensaio de lacunas de desmineralização (Takada et al., Bone and Mineral, (1992) 17, 347-359) usando células derivadas de fêmur e/ou tíbia, a atividade IN VITRO de inibir a reabsorção óssea por osteoclastos pode ser determinada adicionando o anticorpo anti-Siglec-15 a células derivadas de fêmur e/ou tíbia em várias concentrações, e observando formação de lacunas de desmineralização em discos de dentina. Como um sistema para determinar a atividade IN VITRO de inibir a reabsorção óssea por osteoclastos, como mostrado em Exemplo 37, também é possível usar uma placa revestida com colágeno humano conjugado com európio. No sistema de teste mencionado acima para reabsorção óssea por osteoclastos, o anticorpo da invenção inibiu reabsorção óssea em uma concentração de 3 μg/ml ou menos, isto é, em um intervalo de concentração de a partir de 0,3 μg/ml a 3 μg/ml. O efeito terapêutico ou preventivo in vivo do anticorpo anti-Siglec-15 em metabolismo ósseo anormal usando um animal experimental pode ser confirmada administrando o anticorpo anti- Siglec-15 a um animal modelo de osteoporose ou um animal transgênico que superexpressa siglec-15 e medindo uma alteração em osteoclastos.
[00250] O anticorpo assim obtido que neutraliza a atividade biológica de Siglec-15 é útil como um remédio, particularmente como uma composição farmacêutica para tratar ou prevenir metabolismo ósseo anormal tal como osteoporose, destruição óssea acompanhando artrite reumatóide ou destruição óssea acompanhando metástase de câncer para osso, ou como um anticorpo para diagnóstico imunológico de uma tal doença.
[00251] No tratamento de artrite reumatóide (RA), um grande problema é perda óssea acompanhando a ocorrência da doença. Foi relatado que nesta perda óssea acompanhando RA, osteoclastos desempenham um papel primário. As citocinas consideradas como sendo as mais importantes para indução (diferenciação e maturação) e ativação de osteoclastos e a causa de destruição óssea em RA são RANKL e TNF-α (Romas E. et al., Bone 30, pp. 340-346, 2002). Como mostrado em Exemplo 19 desta descrição, OCIF/OPG que é um receptor isca para RANKL pode inibir formação de osteoclastos induzida por RANKL, mas não inibe formação de osteoclastos induzida por TNF-α. Por outro lado, o anticorpo anti-Siglec-15 de acordo com a invenção inibiu efetivamente formação de osteoclastos induzida tanto por RANKL como TNF-α. Portanto, é esperado que o anticorpo anti-Siglec-15 da invenção possa inibir perda óssea e destruição de ossos induzidas por TNF-α em RA ou os semelhantes mais fortemente do que um bloqueador de RANKL (OCIF/OPG, um anticorpo anti-RANKL ou os semelhantes).
[00252] Como um exemplo, para o tratamento ou prevenção de metabolismo ósseo anormal, o anticorpo anti-Siglec-15 pode ser administrado sozinho ou junto com pelo menos um agente terapêutico para uma doença relacionada a ossos. Como outro exemplo, o anticorpo anti-Siglec-15 pode ser administrado junto com uma quantidade terapeuticamente efetiva de um agente terapêutico para metabolismo ósseo anormal. Exemplos do agente terapêutico que pode ser administrado junto com o anticorpo anti-Siglec-15 incluem, mas não são limitados a, bisfosfonatos, vitamina D3 ativa, calcitonina e derivados desta, preparações hormonais tal como estradiol, SERMs (moduladores seletivos dos receptores de estrogênio), ipriflavona, vitamina K2 (menatetrenona), preparações de cálcio, preparações de PTH (hormônio da paratireóide), agentes antiinflamatórios não esteroidais, preparações de receptor solúvel de TNF, anticorpos anti-TNF-α ou fragmentos funcionais dos anticorpos, anticorpos anti-PTHrP (proteína relacionada ao hormônio da paratireóide) ou fragmentos funcionais dos anticorpos, antagonistas do receptor de IL-1, anticorpos anti-receptor de IL-6 ou fragmentos funcionais dos anticorpos, anticorpos anti-RANKL ou fragmentos funcionais dos anticorpos e OCIF (fator inibidor de osteoclastogênese). Dependendo do estado de metabolismo ósseo anormal ou do grau pretendido do tratamento e/ou prevenção, dois ou três, ou mais tipos de agentes medicinais podem ser administrados, e estes agentes medicinais podem ser fornecidos juntos encapsulando-os na mesma preparação. Estes agentes medicinais e o anticorpo anti-Siglec-15 podem ser fornecidos juntos encapsulando-os na mesma preparação. Além disto, estes agentes medicinais e o anticorpo anti-Siglec-15 podem ser fornecidos juntos encapsulando-os como um kit a ser usado para tratamento e/ou prevenção. Além disto, estes agentes medicinais e o anticorpo anti-Siglec-15 podem ser fornecidos separadamente. No caso de administração em terapia gênica, um gene de um agente terapêutico proteináceo para uma doença óssea e um gene do anticorpo anti-Siglec-15 podem ser inseridos depois da mesma região promotora ou regiões promotoras diferentes, e podem ser introduzidos no mesmo vetor ou vetores diferentes.
[00253] Conjugando um agente terapêutico para uma doença óssea com o anticorpo anti-Siglec-15 ou um fragmento deste, um conjugado de drogas direcionado como descrito em M. C. Garnet “Targeted drug conjugates: principles and progress”, Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171216 pode ser produzido. Para atingir este propósito, a molécula de anticorpo outra do que, qualquer fragmento de anticorpo pode ser aplicada contanto que ela não perca completamente a capacidade de reconhecer osteoclastos, e exemplos destas incluem fragmentos tal como Fab, F(ab’)2, e Fv. Na invenção, o anticorpo e o fragmento podem ser usados da mesma maneira. O conjugado formado pelo anticorpo anti-Siglec-15 ou um fragmento deste e um agente terapêutico para uma doença óssea pode ser qualquer das várias formas descritas em M. C. Garnet “Targeted drug conjugates: principles and progress”, Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216, G. T. Hermanson “Bioconjugate Techniques” Academic Press, California (1996), Putnam e J. Kopecek “Polymer Conjugates with Anticancer Activity” Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123 e os semelhantes. Isto é, uma forma conjugada na qual o anticorpo anti-Siglec-15 e um agente terapêutico para uma doença óssea são conjugados um ao outro quimicamente e diretamente ou através de um espaçador tal como um oligopeptídeo e uma forma conjugada através de um carreador de droga apropriado pode ser exemplificada. Exemplos de o carreador de droga incluem um lipossomo e um polímero solúvel em água. Exemplos mais específicos da forma conjugada através de um tal carreador de droga incluem uma forma conjugada na qual o anticorpo e um agente terapêutico para uma doença óssea são incorporados em um lipossomo e o lipossomo e o anticorpo são conjugados um ao outro, e uma forma conjugada na qual um agente terapêutico para uma doença óssea é conjugado com um polímero solúvel em água (um composto tendo um peso molecular de a partir de cerca de 1000 a 100000) quimicamente e diretamente ou através de um espaçador tal como um oligopeptídeo e o anticorpo é conjugado com um polímero solúvel em água. A conjugação do anticorpo (ou um fragmento deste) com um agente terapêutico para uma doença óssea ou um carreador de droga tal como um lipossomo ou um polímero solúvel em água pode ser efetuada por um método conhecido por aqueles versados na arte tal como o método descrito em G. T. Hermanson “Bioconjugate Techniques” Academic Press, California (1996), Putnam e J. Kopecek “Polymer Conjugates with Anticancer Activity” Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123. A incorporação de um agente terapêutico para uma doença óssea em um lipossomo pode ser efetuada por um método conhecido para aqueles versados na arte tal como o método descrito em D. D. Lasic “Liposomes: From Physics to Applications” Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam (1993) ou os semelhantes. A conjugação de um agente terapêutico para uma doença óssea com um polímero solúvel em água pode ser efetuada por um método conhecido para aqueles versados na arte tal como o método descrito em D. Putnam e J. Kopecek “Polymer Conjugates with Anticancer Activity” Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123. Um conjugado entre o anticorpo (ou um fragmento deste) e um agente terapêutico proteináceo para uma doença óssea (ou um fragmento deste) pode ser produzido por um método conhecido para aqueles versados na arte através de engenharia genética outra do que o método mencionado acima.
[00254] A invenção também fornece uma composição farmacêutica contendo uma quantidade terapeuticamente e/ou preventivamente efetiva do anticorpo anti-Siglec-15 e um diluente, carreador, agente solubilizante, agente emulsificante, conservante e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.
[00255] A invenção também fornece uma composição farmacêutica contendo uma quantidade terapeuticamente e/ou preventivamente efetiva do anticorpo anti-Siglec-15, uma quantidade terapeuticamente e/ou preventivamente efetiva de pelo menos um agente terapêutico para uma doença óssea, e um diluente, carreador, agente solubilizante, agente emulsificante, conservante e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável. Exemplos do agente terapêutico para uma doença óssea incluem, mas não são limitados a, bisfosfonatos, vitamina D3 ativa, calcitonina e derivados desta, preparações hormonais tal como estradiol, SERMs (moduladores seletivos dos receptores de estrogênio), ipriflavona, vitamina K2 (menatetrenona), preparações de cálcio, preparações de PTH (hormônio da paratireóide), agentes antiinflamatórios não esteroidais, preparações de receptor solúvel de TNF, anticorpos anti-TNF-α ou fragmentos funcionais dos anticorpos, anticorpos anti-PTHrP (proteína relacionada ao hormônio da paratireóide) ou fragmentos funcionais dos anticorpos, antagonistas do receptor de IL-1, anticorpos anti-receptor de IL-6 ou fragmentos funcionais dos anticorpos, anticorpos anti-RANKL ou fragmentos funcionais dos anticorpos e OCIF (fator inibidor de osteoclastogênese).
[00256] Uma substância a ser usada em uma preparação aceitável em uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção preferivelmente é não tóxica para uma pessoa à qual a composição farmacêutica está para ser administrada, em termos da dose e concentração.
[00257] A composição farmacêutica da invenção pode conter uma substância para uso farmacêutico que é capaz de alterar ou manter o pH, pressão osmótica, viscosidade, transparência, cor, isotonicidade, cor, condição asséptica, estabilidade, solubilidade, taxa de liberação, taxa de absorção, e permeabilidade. Exemplos da substância para uso farmacêutico incluem, mas não são limitados a, aminoácidos tal como glicina, alanina, glutamina, asparagina, arginina e lisina; agentes antimicrobianos; antioxidantes tal como ácido ascórbico, sulfato de sódio e sulfito hidrogenado de sódio; tampões tal como tampões de fosfato, citrato, borato, soluções de bicarbonato e Tris-HCl; cargas tal como manitol e glicina; agentes quelantes tal como ácido etilenodiaminotetracético (EDTA); agentes complexantes tal como cafeína, polivinilpirrolidina, β-ciclodextrina e hidroxipropil-β-ciclodextrina; expansores tal como glicose, manose e dextrina; outros carboidratos tal como monossacarídeos e dissacarídeos; agentes de cor; corantes; diluentes; agentes emulsificantes; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidina; conservantes tal como polipeptídeos de baixo peso molecular, contra-íons formadores de bases, cloreto de benzalcônio, benzoato, ácido salicílico, timerosal, álcool fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorexidina, ácido sórbico, e peróxido de hidrogênio; solventes tal como glicerina, propilenoglicol e polietilenoglicol; álcoois de açúcar tal como manitol e sorbitol; agentes suspensores; surfactantes tal como éster de sorbitan, polissorbatos incluindo polissorbato 20 e polissorbato 80, Triton, trometamina, lecitina e colesterol; agentes potencializadores de estabilidade tal como sacarose e sorbitol; agentes potencializadores de elasticidade tal como cloreto de sódio, cloreto de potássio e manitol e sorbitol; agentes de transporte; diluentes; excipientes; e/ou adjuvantes farmacêuticos. A quantidade de adição destas substâncias para uso farmacêutico é preferivelmente de 0,01 a 100 vezes, particularmente preferivelmente de 0,1 a 10 vezes o peso do anticorpo anti-Siglec-15. Aqueles versados na arte podem determinar apropriadamente uma formulação preferida da composição farmacêutica em uma preparação dependendo da doença a ser aplicada, da rota de administração a ser aplicada ou os semelhantes.
[00258] O excipiente ou carreador na composição farmacêutica pode estar na forma de um líquido ou um sólido. Um excipiente ou carreador apropriado pode ser água injetável, soro fisiológico, um fluido cérebro-espinhal artificial ou outra substância comumente usada para administração parenteral. Além disso, soro fisiológico neutro ou soro fisiológico contendo albumina de soro também podem ser usados como um carreador. A composição farmacêutica pode conter um tampão Tris de pH 7,0 a 8,5 ou um tampão de acetato de pH 4,0 a 5,5 que pode ser suplementado com sorbitol ou outro composto. Exemplos da composição farmacêutica da invenção incluem uma composição farmacêutica contendo o anticorpo anti-Siglec-15 e uma composição farmacêutica contendo o anticorpo anti-Siglec-15 e pelo menos um agente terapêutico para uma doença óssea. A composição farmacêutica da invenção é preparada na forma de um produto liofilizado ou um líquido como um agente medicinal tendo uma composição selecionada e uma pureza requerida. A composição farmacêutica contendo o anticorpo anti-Siglec-15 e a composição farmacêutica contendo o anticorpo anti-Siglec-15 e pelo menos um agente terapêutico para metabolismo ósseo anormal também podem ser formados em um produto liofilizado usando um excipiente apropriado tal como sacarose.
[00259] A composição farmacêutica da invenção pode ser preparada para administração parenteral ou para absorção gastrointestinal através de administração oral. A composição e concentração de uma preparação podem ser determinadas dependendo do método de administração. Como a afinidade do anticorpo anti-Siglec-15 contido na composição farmacêutica da invenção para Siglec-15 é maior, isto é, como a constante de dissociação (valor de Kd) para Siglec-15 é menor, o anticorpo anti-Siglec-15 pode exibir sua eficácia de droga em uma dose inferior para humanos, e, portanto, a dose da composição farmacêutica da invenção para humanos também pode ser determinada baseado neste resultado. Como para a dose, no caso onde um anticorpo humano anti-Siglec-15 é administrado a humanos, o anticorpo pode ser administrado em uma dose de a partir de cerca de 0,1 a 100 mg/kg uma vez por um a 180 dias.
[00260] Exemplos da forma de dosagem da composição farmacêutica da invenção incluem injeções incluindo infusões, supositórios, agentes transnasais, agentes sublinguais e absorventes percutâneos.
[00261] 6. Busca por substância que interage diretamente
[00262] Outra forma de realização da invenção inclui um método de planejamento de drogas baseado na conformação de Siglec-15 para obter uma substância que inibe a atividade de Siglec-15. Um tal método é conhecido como um método de planejamento racional de drogas e é usado para pesquisa de um composto que inibe ou ativa eficientemente a atividade enzimática ou ligação com um ligante, um cofator ou um DNA. Como um exemplo de um tal composto, um inibidor de protease servindo como um agente anti-HIV que já foi colocado no mercado é bem conhecido. Também em uma análise estrutural tridimensional de Siglec-15 da invenção, um método geralmente bem conhecido tal como uma análise cristalográfica de raios X ou um método de ressonância magnética nuclear pode ser usado. Além disto, para pesquisa de uma substância que inibe a função de Siglec-15, planejamento de drogas utilizando planejamento de drogas auxiliado por computador (CADD) também pode ser efetuado. Como um exemplo deste caso, um composto de baixo peso molecular (Patente Internacional 99/58515) que inibe a ação de AP-1 e é esperado que seja um nova droga genômica para tratar artrite reumatóide e os semelhantes são conhecidos. Em virtude de um tal método, é possível obter uma substância que inibe a função de Siglec-15 se ligando diretamente a Siglec-15 ou inibindo a interação entre Siglec-15 e outros fatores.
[00263] Além disto, outra forma de realização se refere a um polipeptídeo com o qual o Siglec-15 da invenção se associa, em outras palavras, uma proteína parceira do Siglec-15. Isto é, a invenção se refere a um método de triar uma proteína parceira que regula a atividade de Siglec-15.
[00264] Uma forma de realização deste método de triagem inclui uma etapa de colocar uma amostra de proteína de teste em contato com Siglec-15 e selecionar uma proteína que se liga a Siglec-15. Como um tal método, por exemplo, um método no qual Siglec-15 purificado é usado e purificação por afinidade de uma proteína se ligando a este é realizada pode ser exemplificado. Um exemplo específico do método será descrito abaixo. Uma seqüência composta de seis histidinas como uma cauda de afinidade é fusionada com Siglec-15 para preparar uma proteína de fusão, e a proteína resultante é incubada a 4°C por 12 horas junto com uma solução de extrato celular (uma fração passada através de uma coluna de níquel-agarose depois de carregar a coluna com uma solução celular). Então, outro carreador de níquel-agarose é adicionado à mistura e a mistura é incubada a 4°C por 1 hora. Depois do carreador de níquel-agarose ser suficientemente lavado com um tampão de lavagem, 100 mM de imidazol é adicionado à mistura para eluir e purificar uma proteína que se liga especificamente a Siglec-15 na solução de extrato celular. Então, a proteína purificada é analisada para determinar sua estrutura. Desta maneira, uma proteína que se liga diretamente a Siglec-15 e uma proteína que não tem uma atividade de ligação com Siglec- 15, mas se liga indiretamente a Siglec-15 formando um complexo com uma proteína como uma subunidade que se liga diretamente a Siglec-15 podem ser purificadas. Como um método alternativo, também é possível realizar clonagem por um ensaio far-Western blotting ou um ensaio do sistema de dois híbridos usando células de leveduras ou mamíferos, entretanto, ele não é limitado a estes métodos.
[00265] Se um cDNA de uma proteína parceira que interage diretamente ou indiretamente com Siglec-15 é obtido desta maneira, o cDNA pode ser usado em triagem funcional de uma substância que inibe a interação entre Siglec-15 e a proteína parceira. Especificamente, uma proteína de fusão entre Siglec-15 e glutationa-S-transferase é preparada e ligada a uma microplaca coberta com um anticorpo anti-glutationa-S-transferase. Então, uma proteína parceira biotinilada é colocada em contato com a proteína de fusão, e a ligação da proteína parceira com a proteína de fusão é detectada usando fosfatase alcalina conjugada a estreptavidina. Quando a proteína parceira biotinilada é adicionada, uma substância de teste também é adicionada para selecionar uma substância que promove ou inibe a ligação de a proteína de fusão com a proteína parceira. Através deste método, uma substância que age diretamente na proteína de fusão ou uma substância que age diretamente na proteína parceira pode ser obtida.
[00266] No caso onde a proteína de fusão se liga indiretamente à proteína parceira através de outro fator, o ensaio é realizado na presença de, por exemplo, uma solução de extrato celular contendo este fator. Neste caso, existe uma possibilidade de que uma substância que pode agir no fator também possa ser selecionada.
[00267] Além disto, no caso onde a proteína parceira obtida tem a atividade de promover a função de Siglec-15, é possível triar uma substância candidata útil como um agente terapêutico e/ou preventivo para metabolismo ósseo anormal, por exemplo, um agente terapêutico e/ou preventivo para osteoporose de acordo com um método de teste empregando um vetor de expressão do gene de Siglec-15 como descrito acima. Além disto, no caso onde a proteína parceira obtida tem uma atividade de inibir a função de Siglec-15, é possível usar um polinucleotídeo codificando um tal inibidor em terapia gênica para metabolismo ósseo anormal.
[00268] Um tal polinucleotídeo pode ser obtido, por exemplo, analisando a seqüência de aminoácidos do inibidor identificado, sintetizando uma sonda de oligonucleotídeo codificando a seqüência de aminoácidos, e realizando triagem de uma biblioteca de cDNA ou uma biblioteca genômica. Além disto, no caso onde um polipeptídeo tendo a atividade de inibir a função de Siglec- 15 é derivado de uma biblioteca de peptídeos artificiais aleatoriamente sintetizada, um DNA composto de uma seqüência de nucleotídeos codificando a seqüência de aminoácidos do peptídeo é quimicamente sintetizado.
[00269] Na terapia gênica, o gene assim obtido codificando o inibidor é integrado em, por exemplo, um vetor viral e um paciente é infectado com um vírus (atenuado) tendo o vetor viral recombinante resultante. No corpo do paciente, um fator anti-destruição óssea é produzido e funciona para inibir diferenciação de osteoclastos, e, portanto, tratamento e/ou prevenção de metabolismo ósseo anormal pode ser realizado.
[00270] Como um método de introduzir um agente terapêutico gênico em uma célula, ou um método de transferência gênica usando um vetor viral ou um método de transferência gênica não viral pode ser usado.
[00271] Exemplos do método de transferência gênica usando um vetor viral incluem um método de integrar um DNA codificando um inibidor de Siglec-15 ou um mutante deste em um vírus de DNA ou um vírus de RNA tal como um retrovírus, um adenovírus, um vírus adeno-associado, um vírus de herpes, um vírus de varíola, um vírus de sífilis, um vírus de pólio, ou um vírus sindbis, para efetuar transferência gênica. Dentre estes, um método usando um retrovírus, um adenovírus, um vírus adeno-associado, ou um vírus de varíola é particularmente preferido. Exemplos do método de transferência gênica não viral incluem um método de administrar um plasmídeo de expressão diretamente no músculo (um método de vacinação de DNA), um método do lipossomo, um método de lipofecção, um método de microinjeção, um método de fosfato de cálcio, e um método de eletroporação. Em particular, um método de vacinação de DNA e um método do lipossomo são preferidos.
[00272] Além disto, a fim de efetivamente usar o agente terapêutico gênico como um agente medicinal, existe um método IN VIVO no qual um DNA é introduzido diretamente no corpo e um método EX VIVO no qual um certo tipo de célula é tirado de um humano e um DNA é introduzido na célula EX VIVO, e a célula é colocada de volta no corpo.
[00273] Por exemplo, no caso onde o agente terapêutico gênico é administrado pelo método IN VIVO, ele é administrado através de uma via de administração apropriada tal como através de uma veia ou artéria, sob a pele, na pele, ou no músculo de acordo com a doença, sintomas ou os semelhantes. Além disto, no caso onde ele é administrado pelo método IN VIVO, o agente terapêutico gênico geralmente é formulado como uma injeção, entretanto, um carreador comumente usado pode ser adicionado conforme necessário. Além disto, no caso onde ele é formado em um lipossomo ou um lipossomo de fusão de membrana (tal como lipossomo de vírus Sendai), ele pode ser formulado em uma preparação de lipossomo tal como uma suspensão, um agente liofilizado, ou um agente concentrado por centrifugação e liofilizado.
[00274] Uma seqüência de nucleotídeos complementar a uma seqüência de comprimento completo ou parcial da seqüência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 1 ou 3 na Listagem de Seqüências pode ser usada para assim chamada terapia antisentido. Uma molécula antisentido pode ser usada como um DNA que é composto geralmente de a partir de 15 a 30 nucleotídeos e é complementar a uma parte de uma seqüência de nucleotídeos selecionada a partir das seqüências de nucleotídeos representadas por SEQ ID NOS: 1 e 3 na Listagem de Seqüências ou um derivado de DNA estável destas tal como um derivado de fosforotioato, metilfosfonato, ou morfolino destas, ou um derivado de RNA estável tal como RNA de 2’-O-alquil. Uma tal molécula antisentido pode ser introduzida em uma célula por um método conhecido no campo técnico da invenção, por exemplo, injetando uma quantidade extremamente pequena da molécula antisentido, formando a molécula em uma cápsula de lipossomo, ou expressando a molécula com o uso de um vetor tendo uma seqüência antisentido. Tal terapia antisentido é útil para tratar uma doença causada por aumentar excessivamente a atividade de uma proteína codificada pela seqüência de nucleotídeos representada por Seqüência ID NO: 1 ou 3 na Listagem de Seqüências.
[00275] Além disto, um método usando um RNA de fita dupla curto (siRNA) também pode ser exemplificado (Genes and Developments, January 15, 2001, vol. 15, No. 2, pp. 188-200). Por exemplo, siRNA contra gene de Siglec-15 é preparado e introduzido em uma célula de acordo com o método descrito no documento, de maneira que um agente terapêutico para uma doença metabólica óssea acompanhada por superexpressão de Siglec-15 pode ser preparado.
[00276] [Exemplos]
[00277] A seguir, a invenção será mais especificamente descrita com referência a exemplos, entretanto, a invenção não é limitada a estes. Observe que as respectivas operações relativas a manipulação gênica nos Exemplos seguintes foram realizadas de acordo com os métodos descritos em "Molecular Cloning" (escrito por Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T., publicado por Cold Spring Harbor Laboratory Press em 1989), ou no caso de usar reagentes ou kits comercialmente disponíveis, realizadas de acordo com os protocolos anexados a estes. Exemplo 1. Expressão de gene de Siglec-15 humano em tecido de tumor de células gigantes
[00278] Um tumor de células gigantes (GCT) é histologicamente um tumor ósseo com um grande número de células gigantes multinucleadas tipo osteoclasto surgindo e é caracterizado por achados clínicos de destruição óssea osteolítica (Bullough et al., Atlas of Orthopedic Pathology 2nd edition, 17.6-17.8, Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1992)). Uma análise de perfil de expressão foi realizada para uma sonda EST (sonda Affymetrix GeneChip HG-U133 215856_at: fabricada por Affymetrix, Inc.) tendo uma seqüência de nucleotídeos coincidindo parcialmente com aquela de gene de Siglec-15 humano em tecidos de GCT usando o banco de dados (Genesis 2006 Release 3.0) feito por Gene Logic, Inc. Além disto, uma análise de perfil de expressão também foi realizada para as sondas EST para RANK (sonda Affymetrix GeneChip HG-U133 207037_at, fabricada por Affymetrix, Inc.) e RANKL (sonda Affymetrix GeneChip HG-U133 210643_at, fabricada por Affymetrix, Inc.) que desempenham um papel chave em diferenciação em osteoclastos, e para catepsina K (sonda Affymetrix GeneChip HG-U133 202450_s_at, fabricada por Affymetrix, Inc.) e TRAP (sonda Affymetrix GeneChip HG-U133 204638_at, fabricada por Affymetrix, Inc.) que são marcadores para diferenciação em osteoclastos em tecidos de GCT da mesma maneira.
[00279] Quando os níveis de expressão foram comparados entre 13 casos de tecidos ósseos normais, 12 casos de tecidos de GCT e 16 casos de tecidos de tumores ósseos outros do que GCT, foi revelado que transcrição de RANK e RANKL é especificamente aumentada nos tecidos de GCT comparado com nos tecidos normais (Fig. 1-A). Por outro lado, nos tecidos de tumores ósseos outros do que GCT nos quais se acredita que um aumento em reabsorção óssea não seja sempre causado, transcrição de RANK e RANKL foi menor do que em GCT, e, portanto, foi sugerido que GCT fornece um ambiente no qual formação e ativação de osteoclastos são promovidas. Além disto, quando os níveis de expressão de genes de catepsina K e TRAP foram comparados, os genes foram transcritos em um alto nível em GCT (Fig. 1-B), e foi sugerido que surja um grande número de osteoclastos tendo uma atividade de reabsorção óssea. Similarmente, quando os níveis de transcrição de gene de Siglec-15 foram comparados, foi revelado que o gene foi transcrito em um nível alto especificamente em GCT da mesma maneira que os respectivos genes de RANK, RANKL, catepsina K e TRAP (Fig. 2). A partir destes resultados, foi sugerido que Siglec-15 está associado com patologia humana na qual reabsorção óssea é aumentada como GCT. Exemplo 2. Extração de RNA total de osteoclastos maduros derivados de camundongos
[00280] a) Células derivadas de monócitos de camundongos RAW 264.7 (ATCC Cat. No. TIB-71) foram preparadas a 4,5 x 104 células/ml em meio α- MEM contendo 10% de soro fetal bovino. A preparação celular resultante foi colocada em um frasco de 75 cm2 a 10 ml/frasco, e RANKL humano (fabricado por PeproTech Inc.) foi adicionado a este para gerar uma concentração final de 40 ng/ml, e as células foram cultivadas por 3 dias em uma incubadora de CO2. Além disto, o cultivo sem a adição de RANKL humano foi realizado da mesma maneira.
[00281] Depois de conclusão do cultivo, o RNA total foi extraído de RAW 264.7 cultivadas nas respectivas condições usando um reagente de extração de RNA total (ISOGEN, fabricado por Nippon Gene Co., Ltd.) de acordo com o protocolo anexado ao reagente. O RNA total coletado foi armazenado a - 80°C. b) Quando células primárias cultivadas derivadas de medula óssea de camundongo são cultivadas na presença de vitamina D3 ativa, um grande número de osteoclastos multinucleados positivos para TRAP surgem (Takahashi et al., Endocrinology, (1988) 122, 1373-1382).
[00282] Um camundongo macho ddY na idade de 8 semanas foi eutanasiado por deslocamento cervical sob anestesia com éter e o fêmur e tíbia foram amputados. Depois de tecidos moles terem sido removidos, ambas as extremidades do fêmur ou tíbia foram cortadas. Então, meio α-MEM contendo 10% de soro fetal bovino foi injetado na medula óssea usando um cilindro da seringa com uma agulha de injeção de calibre 25, e células de medula óssea foram coletadas. Depois do número de células ter sido contado, as células foram preparadas a 5 x 106 células/ml em meio α-MEM contendo 10% de soro fetal bovino. A preparação celular resultante foi emplacada em 60 poços de uma placa de 96 poços a 100 μl/poço, e vitamina D3 ativa (fabricada por Sigma Co., Ltd.) foi adicionada a estes para gerar uma concentração final de 2 x 10-8 M, e as células foram cultivadas por 8 dias em uma incubadora de CO2. Além disto, o cultivo sem a adição de vitamina D3 ativa foi realizado da mesma maneira. Casualmente, a substituição de meio e adição de vitamina D3 ativa foram realizadas em dias 3 e 6.
[00283] Depois, o RNA total foi extraído das células cultivadas nas respectivas condições usando um reagente de extração de RNA total (ISOGEN, fabricado por Nippon Gene Co., Ltd.) de acordo com o protocolo anexado ao reagente. O RNA total coletado foi armazenado a -80°C até uso.
[00284] Exemplo 3. Aquisição de seqüência de quadro de leitura aberta (ORF) para Singlec-15 de camundongo a) Síntese de cDNA de primeira fita
[00285] A 1 μg do RNA total produzido em a) de Exemplo 2, 1 μl de 1 U/μl de DNase I e 1 μl de 10 x tampão de DNase I (fabricado por Invitrogen, Inc.) foram adicionados, e então, o volume final foi levado a 10 μl com H2O. Depois de uma reação ter sido deixada prosseguir em temperatura ambiente por 15 minutos, 1 μl de 25 mM de EDTA foi adicionado a esta e a mistura resultante foi aquecida a 65°C por 10 minutos. Desta solução, foi tirada uma alíquota de 8 μl, e 1 μl de 50 μM de iniciador oligo(dT)20 e 1 μl de 10 mM de dNTPs foram adicionados a esta, e a mistura resultante foi aquecida a 65°C por 5 minutos e então incubada em gelo. A esta solução, 2 μl de 10 x tampão RT (fabricado por Invitrogen, Inc.), 4 μl de 25 mM de MgCl2, 2 μl de 0,1 M de ditiotreitol, 1 μl de inibidor de RNase (RNaseOUT, 40 U/μl, fabricado por Invitrogen, Inc.), e 1 μl de transcriptase reversa Superscript III (200 U/μl, fabricada por Invitrogen, Inc.) foram adicionados e o volume total foi levado a 20 μl. Depois de uma reação ter sido deixada prosseguir a 50°C por 50 minutos, a mistura foi aquecida a 85°C por 5 minutos e então incubada em gelo por 1 minuto. Depois, a mistura foi armazenada a -20°C. b) Reação de PCR
[00286] Oligonucleotídeos tendo as seqüências de: 5’-agaattccac cATGGAGGGG TCCCTCCAAC TC-3’ (mSiglec-15-EcoRI kozak-F: SEQ ID NO: 5 na Listagem de Seqüências); e 5’-cgccgctcga gTTATTTCTC ATGGTGAATG AC-3’ (mSiglec-15-XhoI-R: SEQ ID NO: 6 na Listagem de Seqüências) como iniciadores para amplificar o cDNA de ORF para Singlec- 15 de camundongo por PCR foram sintetizados de acordo com um procedimento comum. O PCR foi realizado usando esta combinação de iniciadores e o cDNA produzido em a) e polimerase de alta fidelidade (fabricada por Invitrogen, Inc.) de acordo com um procedimento comum. As condições para um termociclador foram ajustadas como segue: depois de aquecer a 94°C por 2 minutos, um ciclo de temperatura de “94°C por 0,5 minutos, 55°C por 0,5 minutos e 68°C por 1,5 minutos” foi repetido 35 vezes, seguido por aquecimento a 68°C por 5 minutos e incubação a 4°C. c) Clonagem em vetor pcDNA3.1(+)
[00287] A solução de reação de PCR obtida em b) e vetor pcDNA3.1(+) (fabricado por Invitrogen, Inc.) foram tratados com enzimas de restrição (EcoRI, XhoI), seguido por purificação em coluna, e então, uma reação de ligase foi realizada de acordo com um procedimento comum. ESCHERICHIA COLI DH5α-T1 foi transformada com o vetor resultante e emplacada em uma placa contendo ampicilina. A partir destas colônias de ESCHERICHIA COLI assim obtidas, ESCHERICHIA COLI transformada contendo o plasmídeo Siglec-15 de camundongo/pcDNA3.1(+) foi isolada.
[00288] A seqüência de nucleotídeos inteira do cDNA de ORF inserido no plasmídeo obtido foi analisada usando um seqüenciador de DNA, e como um resultado, foi encontrado ser a seqüência representada por SEQ ID NO: 3 na Listagem de Seqüências. Esta seqüência de nucleotídeos foi a mesma que uma região de codificação de ORF de uma seqüência predita registrada em banco de dados NCBI GeneBank como “mouse CD33L3” (número de acesso: XM_884636), e, além disto, a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 4 na Listagem de Seqüências) codificada pela seqüência de nucleotídeos foi 100% idêntica à seqüência de aminoácidos predita do CD33L3 de camundongo. Exemplo 4. Expressão de mRNA para Siglec-15 acompanhando diferenciação de osteoclastos de camundongo (análise de PCR em tempo real)
[00289] a) A 1 μg do RNA total produzido em a) ou b) de Exemplo 2, 1 μl de 1 U/μl DNase I e 1 μl de 10 x tampão de DNase I (fabricado por Invitrogen, Inc.) foram adicionados, e então, o volume final foi levado a 10 μl com H2O. Depois de uma reação ter sido deixada prosseguir em temperatura ambiente por 15 minutos, 1 μl de 25 mM de EDTA foi adicionado a esta e a mistura resultante foi aquecida a 65°C por 10 minutos. Desta solução, foi tirada uma alíquota de 8 μl, e 1 μl de 50 μM de iniciador oligo(dT)20 e 1 μl de 10 mM de dNTPs foram adicionados a esta, e a mistura resultante foi aquecida a 65°C por 5 minutos e então incubada em gelo. A esta solução, 2 μl de 10 x tampão RT (fabricado por Invitrogen, Inc.), 4 μl de 25 mM de MgCl2, 2 μl de 0,1 M de ditiotreitol, 1 μl de inibidor de RNase (RNaseOUT, 40 U/μl, fabricado por Invitrogen, Inc.), e 1 μl de transcriptase reversa Superscript III (200 U/μl, fabricada por Invitrogen, Inc.) foram adicionados e o volume total foi levado a 20 μl. Depois de uma reação ter sido deixada prosseguir a 50°C por 50 minutos, a mistura foi aquecida a 85°C por 5 minutos e então incubada em gelo.
[00290] Usando o cDNA fita simples assim produzido, PCR em tempo real foi realizado em uma combinação dos seguintes iniciadores e sondas marcadas fluorescentemente (sonda TaqMan, fabricada por Applied Biosystems, Inc.). Condições para PCR em tempo real: Iniciadores para amplificar Siglec-15 de camundongo: 5’-tcaggctcag gagtccaatt at-3’ (TqM-mSiglec-15-F: SEQ ID NO: 7 na Listagem de Seqüências) e 5’-ggtctagcct ggtactgtcc ttt-3’ (TqM-mSiglec-15-R: SEQ ID NO: 8 na Listagem de Seqüências) Sonda TaqMan para detectar Siglec-15 de camundongo: 5’-Fam-atttgagcca gatgagtcct ccaggcca-TAMRA-3’ (TqM- mSiglec-15-probe: SEQ ID NO: 9 na Listagem de Seqüências) Iniciadores para amplificar proteína ribossômica L32 de camundongo: 5’-aagaagttca tcaggcacca gt-3’ (TqM-mL32-F: SEQ ID NO: 10 na Listagem de Seqüências) e 5’-cttgacattg tggaccagga ac-3’ (TqM-mL32-R: SEQ ID NO: 11 na Listagem de Seqüências) Sonda TaqMan para detectar proteína ribossômica L32 de camundongo: 5’-Fam-aaacccagag gcattgacaa cagggtgc-TAMRA-3’ (TqM- mL32-probe: SEQ ID NO: 12 na Listagem de Seqüências)
[00291] Uma análise de PCR em tempo real foi realizada usando um sistema de PCR em tempo real (ABI Prism 7700 Sequence Detector, fabricado por Perkin Elmer Japan Applied Biosystems Division) nas seguintes condições. Na reação, TaqMan Universal PCR Master Mix (fabricado por Applied Biosystems, Inc.) foi usado. Primeiro, água destilada foi adicionada a 25 pmol de cada iniciador, 8 ng de cDNA de fita simples e 10 pmol de sonda TaqMan para levar o volume final a 25 μl, e então, 25 μl de TaqMan Universal PCR Master Mix foi adicionado a estes, de maneira que 50 μl de uma solução de reação foi preparado. Esta solução de reação foi aquecida a 50°C por 2 minutos e então aquecida a 95°C por 10 minutos, e depois sujeita a 40 ciclos de temperatura de “95°C por 0,25 minutos e 60°C por 1 minuto”, de maneira que uma análise de PCR em tempo real foi realizada. Casualmente, o nível de expressão de mRNA para Singlec-15 de camundongo foi corrigido pelo nível de expressão de mRNA para proteína ribossômica L32.
[00292] Como um resultado, o nível de expressão do gene de Siglec-15 aumentou significativamente em ambos os casos onde osteoclastos foram induzidos adicionando RANKL a RAW 264.7 e onde osteoclastos foram induzidos adicionando vitamina D3 ativa a células primárias cultivadas derivadas de medula óssea de camundongo (Fig. 3).
[00293] b) RAW 264.7 foi preparada a 4,5 x 104 células/ml em meio α- MEM contendo 10% de soro fetal bovino, e a preparação celular resultante foi colocada em um frasco de 75 cm2 a 10 ml/frasco, e então, RANKL humano (fabricado por PeproTech Inc.) foi adicionado a esta para gerar uma concentração final de 40 ng/ml. As células foram cultivadas por 0, 1, 2, e 3 dias em uma incubadora de CO2. Além disto, o cultivo sem a adição de RANKL humano foi realizado da mesma maneira.
[00294] Depois de conclusão do cultivo, o RNA total foi extraído de RAW 264.7 cultivadas nas respectivas condições usando um reagente de extração de RNA total (ISOGEN, fabricado por Nippon Gene Co., Ltd.) de acordo com o protocolo anexado ao reagente. O RNA total coletado foi armazenado a - 80°C.
[00295] A 1 μg do RNA total assim coletado, 1 μl de 1 U/μl de DNase I e 1 μl de 10 x tampão de DNase I (fabricado por Invitrogen, Inc.) foram adicionados, e então, o volume final foi levado a 10 μl com H2O. Depois de uma reação ter sido deixada prosseguir em temperatura ambiente por 15 minutos, 1 μl de 25 mM de EDTA foi adicionado a esta e a mistura resultante foi aquecida a 65°C por 10 minutos. Desta solução, foi tirada uma alíquota de 8 μl, e 1 μl de 50 μM de iniciador oligo(dT)20 e 1 μl de 10 mM de dNTPs foram adicionados a esta, e a mistura resultante foi aquecida a 65°C por 5 minutos e então incubada em gelo. A esta solução, 2 μl de 10 x tampão RT (fabricado por Invitrogen, Inc.), 4 μl de 25 mM de MgCl2, 2 μl de 0,1 M de ditiotreitol, 1 μl de inibidor de RNase (RNaseOUT, 40 U/μl, fabricado por Invitrogen, Inc.), e 1 μl de transcriptase reversa Superscript III (200 U/μl, fabricada por Invitrogen, Inc.) foram adicionados e o volume total foi levado a 20 μl. Depois de uma reação ter sido deixada prosseguir a 50°C por 50 minutos, a mistura foi aquecida a 85°C por 5 minutos e então incubada em gelo.
[00296] Usando o cDNA fita simples assim produzido, PCR em tempo real foi realizado em uma combinação dos seguintes iniciadores e sondas marcadas fluorescentemente (sonda TaqMan, fabricada por Applied Biosystems, Inc.). Condições para PCR em tempo real: Iniciadores para amplificar catepsina K de camundongo: 5’-ggcatctttc cagttttaca gc-3’ (TqM-mcatK-F: SEQ ID NO: 13 na Listagem de Seqüências) e 5’-gttgttctta ttccgagcca ag-3’ (TqM-mcatK-R: SEQ ID NO: 14 na Listagem de Seqüências) Sonda TaqMan para detectar catepsina K de camundongo: 5’-Fam-atgtgaacca tgcagtgttg gtggtggg-TAMRA-3’ (TqM-mcatK- probe: SEQ ID NO: 15 na Listagem de Seqüências) Iniciadores para amplificar TRAP de camundongo: 5’-gaacttcccc agcccttact ac-3’ (TqM-mTRAP-F: SEQ ID NO: 16 na Listagem de Seqüências) e 5’-aactgctttt tgagccagga c-3’ (TqM-mTRAP-R: SEQ ID NO: 17 na Listagem de Seqüências) Sonda TaqMan para detectar TRAP de camundongo: 5’-Fam-ttgccagtca gcagcccaaa atgcct-TAMRA-3’ (TqM-mTRAP- probe: SEQ ID NO: 18 na Listagem de Seqüências) Iniciadores para amplificar Siglec-15 de camundongo: 5’-tcaggctcag gagtccaatt at-3’ (TqM-mSiglec-15-F: SEQ ID NO: 7 na Listagem de Seqüências) e 5’-ggtctagcct ggtactgtcc ttt-3’ (TqM-mSiglec-15-R: SEQ ID NO: 8 na Listagem de Seqüências) Sonda TaqMan para detectar Siglec-15 de camundongo: 5’-Fam-atttgagcca gatgagtcct ccaggcca-TAMRA-3’ (TqM- mSiglec-15-probe: SEQ ID NO: 9 na Listagem de Seqüências) Iniciadores para amplificar proteína ribossômica L32 de camundongo: 5’-aagaagttca tcaggcacca gt-3’ (TqM-mL32-F: SEQ ID NO: 10 na Listagem de Seqüências) e 5’-cttgacattg tggaccagga ac-3’ (TqM-mL32-R: SEQ ID NO: 11 na Listagem de Seqüências) Sonda TaqMan para detectar proteína ribossômica L32 de camundongo: 5’-Fam-aaacccagag gcattgacaa cagggtgc-TAMRA-3’ (TqM- mL32-probe: SEQ ID NO: 12 na Listagem de Seqüências)
[00297] Uma análise de PCR em tempo real foi realizada usando um sistema de PCR em tempo real (ABI Prism 7700 Sequence Detector, fabricado por Perkin Elmer Japan Applied Biosystems Division) nas seguintes condições. Na reação, TaqMan Universal PCR Master Mix (fabricado por Applied Biosystems, Inc.) foi usado. Primeiro, água destilada foi adicionada a 25 pmol de cada iniciador, 8 ng de cDNA de fita simples e 10 pmol de sonda TaqMan para levar o volume final a 25 μl, e então, 25 μl de TaqMan Universal PCR Master Mix foi adicionado a estes, de maneira que 50 μl de uma solução de reação foi preparado. Esta solução de reação foi aquecida a 50°C por 2 minutos e então aquecida a 95°C por 10 minutos, e depois sujeita a 40 ciclos de temperatura de “95°C por 0,25 minutos e 60°C por 1 minuto”, de maneira que uma análise de PCR em tempo real foi realizada. Casualmente, o nível de expressão de mRNA para cada gene foi corrigido pelo nível de expressão de mRNA para proteína ribossômica L32.
[00298] Como um resultado, os níveis de expressão de genes de catepsina K e TRAP que são conhecidos como moléculas marcadoras para osteoclastos aumentaram significativamente a partir de dia 2 a dia 3 depois da adição de RANKL (Figs. 4-A, B). Similarmente, o nível de expressão do gene de Siglec-15 também aumentou significativamente a partir de dia 2 a dia 3 depois da adição de RANKL (Fig. 5). A partir destes resultados, foi revelado que a expressão do gene de Siglec-15 aumenta acompanhando diferenciação de osteoclastos, e particularmente, o gene de Siglec-15 é fortemente expresso em um estágio de diferenciação tardio. Exemplo 5. Produção de construção de expressão de proteína Singlec-15 de camundongo solúvel
[00299] Uma seqüência parcial de ácidos nucléicos codificando o domínio extracelular de proteína Siglec-15 de camundongo é representada por SEQ ID NO: 19 na Listagem de Seqüências e a seqüência de aminoácidos desta é representada por SEQ ID NO: 20 na Listagem de Seqüências. Utilizando uma tal seqüência parcial, proteína Singlec-15 de camundongo solúvel pode ser produzida em um sobrenadante de cultura de uma célula animal ou os semelhantes. a) Amplificação de gene de Singlec-15 de camundongo solúvel por PCR
[00300] Oligonucleotídeos tendo as seqüências de: 5’-ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt caccATGGAG GGGTCCCTCC AACTC-3’ (mSiglec- 15-ECD-F: SEQ ID NO: 21 na Listagem de Seqüências); e 5’-ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc TCCGGGGGCG CCGTGGAAGC GGAAC-3’ (mSiglec-15-ECD-R: SEQ ID NO: 22 na Listagem de Seqüências) como iniciadores para amplificar o cDNA de domínio extracelular de Siglec-15 de camundongo por PCR foram sintetizados de acordo com um procedimento comum. Casualmente, estes iniciadores foram projetados, como iniciadores de amplificação para produzir um clone de entrada do gateway, de forma que uma seqüência de attB1 é adicionada a mSiglec-15-ECD-F e uma seqüência de attB2 é adicionada a mSiglec-15-ECD-R. O PCR foi realizado usando esta combinação de iniciadores e o plasmídeo Siglec-15 de camundongo/pcDNA3.1(+)produzido em Exemplo 3 como um modelo de acordo com um procedimento comum. As condições para um termociclador foram ajustadas como segue: depois de aquecer a 94°C por 2 minutos, um ciclo de temperatura de “94°C por 0,5 minutos, 55°C por 0,5 minutos e 68°C por 1,5 minutos” foi repetido 15 vezes, seguido por aquecimento a 68°C por 5 minutos e incubação a 4°C. b) Produção de clone de entrada por reação BP de Gateway
[00301] Um clone de entrada no qual o cDNA de domínio extracelular de Siglec-15 de camundongo foi integrado pela tecnologia Gateway (Invitrogen, Inc.) empregando um sistema de recombinação sítio específico de fago lambda foi produzido pelo método seguinte. Primeiro, uma reação BP usando BP Clonase foi realizada entre o produto de PCR tendo uma seqüência de attB em ambas as extremidades produzido em a) e pDNOR221 (fabricado por Invitrogen, Inc.) que é um vetor doador tendo uma seqüência de attP. Usando esta solução de reação, ESCHERICHIA COLI DH10B foi transformada, e PCR de colônia foi realizado para clones resistentes à droga, e o tamanho de insertos foi confirmado. Então, para um clone confirmado ter um inserto com um tamanho correto, uma análise de seqüências da seqüência de DNA total do inserto foi realizada. Como um resultado, um clone de entrada que é completamente idêntico à seqüência de ácidos nucléicos alvo (SEQ ID NO: 19 na Listagem de Seqüências) codificando o domínio extracelular de proteína Siglec-15 de camundongo foi obtido. c) Produção de clone de expressão por reação LR de Gateway
[00302] Um clone de expressão no qual o cDNA de domínio extracelular de Siglec-15 de camundongo foi integrado pela tecnologia Gateway (Invitrogen, Inc.) empregando um sistema de recombinação sítio específico de fago lambda foi produzido pelo método seguinte. O clone de entrada produzido em b) contém um inserto tendo uma seqüência de attL em ambas as extremidades. Uma reação LR usando LR Clonase foi realizada entre este clone de entrada e dois tipos de vetores de destinação tendo uma seqüência de attR. Casualmente, como os vetores de destinação, dois tipos de vetores de destinação: pDONM projetado de forma que uma cauda de epítopo V5 e uma cauda de 6 x His são adicionadas ao término C do inserto; e phIgFc projetado de forma que uma cauda de Fc humano é adicionada ao término C do inserto foram usados. Usando a solução de reação obtida pela reação LR, ESCHERICHIA COLI DH10B foi transformada, e PCR de colônia foi realizado para os clones resistentes à droga obtidos, e o tamanho de insertos foi confirmado. Então, para um clone confirmado ter um inserto com um tamanho correto, uma análise de seqüências de ambas as extremidades do lado do inserto ao lado do vetor foi realizada. Seqüências de iniciadores para análise de seqüências 5’-tgcgtgaagg tgcagggcag-3’ (mSiglec-15-ECD-seq-upstm: SEQ ID NO: 23 na Listagem de Seqüências) e 5’-cctcgcctgg tcgggtc-3’ (mSiglec-15-ECD-seq-dnstm: SEQ ID NO: 24 na Listagem de Seqüências)
[00303] Como um resultado da análise de seqüências, clones de expressão (Siglec-15 de camundongo solúvel/pDONM e Siglec-15 de camundongo solúvel/phIgFc) nos quais recombinação correta ocorreu foram obtidos tanto para pDONM como phIgFc, respectivamente. Transfectando o Siglec-15 de camundongo solúvel/pDONM em uma célula animal ou os semelhantes, mRNA tendo a seqüência de base representada por SEQ ID NO: 25 na Listagem de Seqüências é transcrito e traduzido em uma proteína (Siglec-15- His de camundongo) tendo a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 26 na Listagem de Seqüências. Além disto, transfectando o Siglec-15 de camundongo solúvel/phIgFc em uma célula animal ou os semelhantes, mRNA tendo a seqüência de base representada por SEQ ID NO: 27 na Listagem de Seqüências é transcrito e traduzido em uma proteína (Siglec-15- Fc de camundongo) tendo a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 28 na Listagem de Seqüências. Exemplo 6. Análise de tempo de cultura ótimo para produzir proteína Singlec- 15 de camundongo solúvel a) Expressão de proteína usando células 293-F
[00304] Os dois tipos de plasmídeos de expressão (Siglec-15 de camundongo solúvel/pDONM e Siglec-15 de camundongo solúvel/phIgFc) obtidos em Exemplo 5 foram preparados em uma quantidade de cerca de 100 μg, respectivamente. 50 μg de cada um dos plasmídeos preparados foi misturado com Opti-MEM (fabricado por Invitrogen, Inc.), seguido por esterilização em filtro. Então, 64 μl de um reagente de transfecção 293fectin (fabricado por Invitrogen, Inc.) foi adicionado a esta, e a mistura resultante foi incubada em temperatura ambiente por 25 minutos. Cada uma das misturas assim obtidas foi adicionada a células FreeStyle 293-F (fabricadas por Invitrogen, Inc.) cultivadas em um frasco agitado de forma que a densidade celular atingiu 1,0 x 106 células/ml x 50 ml em Meio de Expressão de FreeStyle 293 (fabricado por Invitrogen, Inc.), e as células foram sujeitas uma cultura agitada (125 rotações/min) em uma concentração de CO2 de 8,0% por 96 horas (4 dias) a 37°C. Uma pequena porção da solução de cultura foi coletada em intervalos de 24 horas (tempo de cultura: 0, 24, 48, 72, 96 horas), e centrifugada para preparar um sobrenadante de cultura. É considerado que nos sobrenadantes de cultura assim preparados, uma proteína na qual uma cauda de epítopo V5 e uma cauda de 6 x His foram adicionadas ao lado C- terminal do domínio extracelular de Siglec-15 de camundongo (Siglec-15-His de camundongo) e uma proteína na qual uma cauda de Fc humano foi adicionada ao lado C-terminal do domínio extracelular de Siglec-15 de camundongo (Siglec-15-Fc de camundongo) são expressas, respectivamente. b) Alteração em nível de expressão com tempo de cultura de células 293F expressando Siglec-15-His de camundongo
[00305] Usando a solução de cultura (tempo de cultura: 0, 24, 48, 72, 96 horas) amostras de células 293F expressando Siglec-15-His de camundongo preparadas em a) e uma proteína comercialmente disponível contendo cauda de His, osteoprotegerina humana recombinante/his (OPG-Fc-His) (fabricado por R&D systems, Inc.), os níveis de expressão foram analisados por eletroforese em SDS-poliacrilamida em condições redutoras e Western blotting. Isto é, a 5 μl de uma amostra obtida concentrando cada solução de cultura em 20 vezes usando Microcon YM-10 (fabricado por Millipore Co., Ltd.) ou 5 μl de uma solução de OPG-Fc-His, uma quantidade equivalente de uma solução de tratamento com SDS (10 mM de tampão Tris-HCl (pH 8,0) contendo 1 mM de EDTA, 2,5% de SDS, 0,1% de azul de bromofenol, e 5% de 2-mercaptoetanol) foi adicionada, e a mistura resultante foi aquecida a 95°C por 10 minutos. 0,8 μl de cada uma das amostras tratadas termicamente foi usado para eletroforese em SDS-poliacrilamida. Como um gel para eletroforese, um gel de poliacrilamida com gradiente de 8-25% (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.) foi usado, e a eletroforese foi realizada usando PhastSystem (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.). Além disto, como marcadores de peso molecular, ECL DualVue Western Blotting Markers (fabricados por Amersham Biosciences, Inc.) foram usados. Depois de conclusão da eletroforese, a proteína no gel foi transferida para uma membrana de PVDF (Hybond-P, fabricado por Amersham Biosciences, Inc.) usando PhastTransfer Semi-dry Transfer Kit (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.) e PhastSystem. Esta membrana de PVDF foi transferida para 10 ml de um agente bloqueador (BlockAce, fabricado por Snow Brand Milk Products, Co., Ltd.) contendo 0,1% de Tween 20 e agitada suavemente em temperatura ambiente por 1 hora. A esta solução bloqueadora, 5 μl de uma solução de HRP com S-proteína (ECL DualVue Western Blotting Markers, fabricados por Amersham Biosciences, Inc.) e 2 μl de um anticorpo anti-6- His-HRP (PentaHis HRP Conjugate kit, fabricado por Qiagen, Inc.) foram adicionados e a membrana na solução foi agitada suavemente em temperatura ambiente por um adicional de 1 hora. Esta membrana de PVDF foi lavada 4 vezes agitando-a suavemente em 50 mL de salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,01% de Tween 20 por 5 minutos. Depois de lavagem, a membrana de PVDF foi tratada de acordo com o protocolo anexado a um kit de detecção de ECL (reagentes de detecção e sistema de análise de Western blotting de ECL, fabricados por Amersham Biosciences, Inc.) para desenvolver a cor da banda da proteína contendo cauda de His, e a cor desenvolvida foi detectada usando uma Mini-Câmera de ECL (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) e filme Polaroid (Polapan 3200B, fabricado por Polaroid, Inc.). Os resultados são mostrados em Fig. 6. A partir destes resultados, um tempo de cultura de 96 horas foi selecionado como o tempo de cultura para células 293F que produziram a maior concentração de uma proteína (Siglec-15-His de camundongo) que tem um peso molecular de cerca de 35 kDa e reage com um anticorpo anti-6-His-HRP. c) Alteração em nível de expressão com tempo de cultura de células 293F expressando Siglec-15-Fc de camundongo
[00306] Usando a solução de cultura (tempo de cultura: 0, 24, 48, 72, 96 horas) amostras de células 293F expressando Siglec-15-Fc de camundongo preparadas em a) e IgG humana (fabricada por Sigma Co., Ltd), os níveis de expressão foram analisados por eletroforese em SDS-poliacrilamida em condições não redutoras e Western blotting. Isto é, a 5 μl de cada amostra de solução de cultura ou 5 μl de uma solução de IgG humana, uma quantidade equivalente de uma solução de tratamento com SDS foi adicionada, e a mistura resultante foi aquecida a 95°C por 10 minutos. Da mesma maneira que o método descrito no b) acima usando 0,8 μl de cada uma das amostras tratadas termicamente, eletroforese em SDS-poliacrilamida, transferência (blotting) para uma membrana de PVDF, e bloqueio da membrana de PVDF foram realizados. À membrana de PVDF depois de bloqueio, 5 μl de uma solução de HRP com S-proteína (ECL DualVue Western Blotting Markers, fabricados por Amersham Biosciences, Inc.) e 2 μl de um anticorpo anti-IgG humana-Fc-HRP (Anti-Humam IgG (Fc specific) Peroxidase Conjugate, fabricado por Sigma Co., Ltd) foram adicionados e a membrana na solução foi agitada suavemente em temperatura ambiente por um adicional de 1 hora. Depois de lavagem ter sido realizada da mesma maneira que o método descrito no b) acima, a cor desenvolvida da banda da proteína contendo Fc foi detectada. Os resultados são mostrados em Fig. 7. A partir destes resultados, um tempo de cultura de 96 horas foi selecionado como o tempo de cultura para células 293F que produziram a maior concentração de uma proteína (Siglec-15-Fc de camundongo) que tem um peso molecular de cerca de 110 kDa e reage com um anticorpo anti-Fc humano. Exemplo 7. Preparação em larga escala de solução de cultura contendo proteína Singlec-15 de camundongo solúvel usando células 293-F
[00307] Os dois tipos de plasmídeos de expressão (Siglec-15 de camundongo solúvel/pDONM e Siglec-15 de camundongo solúvel/phIgFc) obtidos em Exemplo 5 foram preparados em uma quantidade de cerca de 5 mg, respectivamente. Casualmente, na purificação de plasmídeos de ESCHERICHIA COLI cultivada em uma larga escala, Invitrogen PureLink HiPure Plasmid Gigaprep Kit (fabricado por Invitrogen, Inc.) foi usado. Os plasmídeos assim preparados foram misturados com Opti-MEM (fabricado por Invitrogen, Inc.), seguido por esterilização em filtro. Então, 10 ml de um reagente de transfecção 293fectin (fabricado por Invitrogen, Inc.) foi adicionado a esta, e a mistura resultante foi incubada em temperatura ambiente por 20 minutos. Cada uma das misturas assim obtidas foi adicionada a células FreeStyle 293-F (fabricadas por Invitrogen, Inc.) cultivadas em frascos Erlenmeyer de forma que a densidade celular atingiu 1,1 x 106 células/ml x 5 L (1 L/frasco x 5 frascos) em Meio de Expressão de FreeStyle 293 (fabricado por Invitrogen, Inc.). Depois das células terem sido sujeitas uma cultura agitada (125 rotações/min) em uma concentração de CO2 de 8,0% por 96 horas (4 dias) a 37°C, a solução de cultura foi coletada e centrifugada para preparar um sobrenadante de cultura. É considerado que nos sobrenadantes de cultura assim preparados, uma proteína na qual uma cauda de epítopo V5 e uma cauda de 6 x His foram adicionadas ao lado C-terminal do domínio extracelular de Siglec-15 de camundongo (Siglec-15-His de camundongo) e uma proteína na qual uma cauda de Fc humano foi adicionada ao lado C-terminal do domínio extracelular de Siglec-15 de camundongo (Siglec-15-Fc de camundongo) são expressas, respectivamente. Exemplo 8. Purificação de Siglec-15-His de camundongo a) Cromatografia em coluna HisTrap HP
[00308] A 2 L da solução de cultura de células 293F expressando Siglec- 15-His de camundongo preparada em Exemplo 7, 225 mL de 10 x tampão (500 mM de Tris, 1,5 M de NaCl, 200 mM de imidazol, pH 8,0) foi adicionado, e a mistura resultante foi agitada bem e filtrada através de um filtro Sterivex-GV (fabricado por Millipore Co., Ltd.). Esta solução de cultura foi aplicada a uma coluna que compreendia três colunas HisTrap HP de 5 ml (fabricadas por Amersham Biosciences, Inc.) conectadas em série e foi previamente tratada com um agente removedor de pirogênio PyroCLEAN (fabricado por ALerCHEK, Inc.) e lavada com água destilada para injeção em uma vazão de 2 ml/min. Depois de a coluna ter sido lavada com 60 ml de tampão Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) contendo 300 mM de NaCl em uma vazão de 1 ml/min, uma proteína adsorvida na coluna foi eluída com 50 ml de tampão Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) contendo 300 mM de NaCl e 500 mM de imidazol em uma vazão de 1 ml/min. O eluato foi fracionado a 1 ml por fração em tubos mini-sorp (fabricados por Nunc, Inc.) aos quais 10 μl de 10% de Tween 20 havia sido previamente adicionado. Depois de cerca de 20 ml de uma solução obtida combinando as frações (frações 14 a 20) contendo a proteína eluída ter sido concentrado para 2,5 ml com um concentrador centrífugo de membranas Amicon Ultra-15 (fabricado por Millipore Co., Ltd.), o concentrado foi aplicado a uma coluna de dessalinização PD-10 (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que foi previamente equilibrada com salina tamponada com fosfato contendo Tween 20 a 0,01% (T-PBS), seguido por eluição com T-PBS, de maneira que 3,5 ml de uma amostra cujo solvente foi substituído por T-PBS foi obtido. b) Cromatografia em coluna Resource Q
[00309] A 3,5 ml da amostra que foi purificada por cromatografia em coluna HisTrap HP e cujo solvente foi substituído por TBS-P, 22,5 ml de tampão Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) contendo 0,1% de CHAPS foi adicionado e a mistura resultante foi agitada. Então, a mistura foi centrifugada a 4°C por 30 minutos a 3.000 rpm e o precipitado foi removido. Depois de o sobrenadante resultante ter sido filtrado através de um filtro Millex-GV (fabricado por Millipore Co., Ltd.), o filtrado foi aplicado a uma coluna Resource Q de 6 ml (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.) que foi previamente equilibrada com tampão Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) contendo 0,1% de CHAPS em uma vazão de 1 ml/min. Depois, a coluna foi lavada com este tampão em uma vazão de 1 ml/min e uma fração de proteína que não foi adsorvida na coluna foi coletada. Uma proteína adsorvida na coluna foi eluída com tampão Tris- HCl 50 mM (pH 7,5) contendo 0,1% de CHAPS e 1 M de NaCl em uma vazão de 1 ml/min. Depois de 26,5 ml da fração que não foi adsorvida na coluna ter sido concentrado para 2,0 ml com um concentrador centrífugo de membranas Amicon Ultra-15 (fabricado por Millipore Co., Ltd.), o concentrado foi centrifugado a 4°C por 10 minutos a 3.000 rpm e o precipitado foi removido. Depois de centrifugação o sobrenadante foi criopreservado a -80°C até uso. O procedimento de purificação mencionado acima (cromatografia em coluna HisTrap HP e cromatografia em coluna Resource Q) foi realizado repetindo-o duas vezes. c) Detecção e ensaio de pureza de Siglec-15-His de camundongo purificado
[00310] Usando uma amostra preparada pelo procedimento de purificação mencionado acima (cromatografia em coluna HisTrap HP e cromatografia em coluna Resource Q), eletroforese em SDS-poliacrilamida em condições redutoras e coloração com prata foram realizadas. Istoé, a 5 μl de cada uma das amostras purificadas pelas respectivas etapas de purificação, uma quantidade equivalente de uma solução de tratamento com SDS foi adicionada, e a mistura resultante foi termicamente tratada a 95°C por 10 minutos. 0,3 μl de cada uma das amostras tratadas termicamente foi usado para eletroforese em SDS-poliacrilamida. O procedimento de eletroforese foi realizado da mesma maneira que no b) mencionado acima de Exemplo 6 exceto que Rainbow Molecular Weight Markers (fabricados por Amersham Biosciences, Inc.) foram usados como os marcadores de peso molecular. Depois de conclusão da eletroforese, coloração com prata foi realizada usando PhastGel Silver Kit (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.) e PhastSystem. Os resultados são mostrados em Fig. 8. Foi mostrado que uma proteína tendo um peso molecular de cerca de 35 kDa (Siglec-15-His de camundongo) foi eficientemente purificada e concentrada na fração de proteína que não foi adsorvida na coluna Resource Q.
[00311] Eletroforese foi realizada nas mesmas condições exceto que ECL DualVue Western Blotting Markers (fabricados por Amersham Biosciences, Inc.) foram usados como os marcadores de peso molecular, e a proteína no gel foi transferida (blotted) para uma membrana de PVDF (Hybond-P, fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) usando PhastTransfer Semi-dry Transfer Kit (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.) e PhastSystem. Esta membrana de PVDF foi agitada suavemente em 10 ml de um agente bloqueador (BlockAce, fabricado por Snow Brand Milk Products, Co., Ltd.) contendo Tween 20 a 0,1% em temperatura ambiente por 1 hora. A esta solução bloqueadora, 10 μl de S-protein HRP (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.) e 10 μl de um anticorpo anti-V5-HRP (Anticorpo monoclonal para Pk- TAG-HRP, fabricado por Acris Antibodies GmbH) foram adicionados e a membrana na solução foi agitada suavemente em temperatura ambiente por um adicional de 1 hora. A membrana de PVDF foi lavada 4 vezes agitando-a suavemente em 50 mL de salina tamponada com fosfato (PBS) contendo Tween 20 a 0,01% por 5 minutos. Depois de lavagem, a membrana de PVDF foi tratada de acordo com o protocolo anexado a um kit de detecção de ECL (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.) para desenvolver a cor da banda da proteína, e a cor desenvolvida foi detectada usando uma Mini-Câmera de ECL (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) e filme Polaroid (Polapan 3200B, fabricado por Polaroid, Inc.). Os resultados são mostrados em Fig. 9. Também a partir destes resultados, pode ser confirmado que uma proteína que tem um peso molecular de cerca de 35 kDa (Siglec-15-His de camundongo) e reage com um anticorpo anti-V5-HRP foi eficientemente purificada e concentrada na fração de proteína que não foi adsorvida na coluna Resource Q. d) Medição de concentração de proteína de Siglec-15-His de camundongo purificado
[00312] Para o Siglec-15-His de camundongo purificado (a fração de proteína que não foi adsorvida na coluna Resource Q), a concentração de proteína foi medida com um DC-Protein Assay kit (fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) usando albumina de soro bovino como uma amostra padrão. Como mostrado em Tabela 1, um total de 1,66 mg de proteína Siglec- 15-His de camundongo purificada foi obtido realizando o procedimento de purificação duas vezes.
[00313] Tabela 1
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Exemplo 9. Purificação de Siglec-15-Fc de camundongo a) Cromatografia em coluna HiTrap Protein A
[00314] 1,8 L da solução de cultura de células 293F expressando Siglec- 15-Fc de camundongo preparada em Exemplo 7 foi filtrado através de um filtro Sterivex-GV (fabricado por Millipore Co., Ltd.), e então, o filtrado foi aplicado a uma coluna HiTrap Protein A de 5 ml (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que havia sido previamente equilibrada com PBS de Dulbecco (D-PBS, fabricado por Invitrogen, Inc.) em uma vazão de 5 ml/min. Depois de a coluna ter sido lavada com D-PBS em uma vazão de 5 ml/min, uma proteína adsorvida na coluna foi eluída com 50 ml de tampão citrato de sódio 0,1 M (pH 3,0) em uma vazão de 5 ml/min. O eluato foi fracionado a 5 ml por fração em tubos mini-sorp (fabricado por Nunc, Inc.), e imediatamente depois, 1,3 ml de Tris 1 M foi adicionado a estes para neutralizar o eluato. Depois de uma solução obtida combinando as frações (frações 1 e 2) nas quais a proteína eluída foi detectada ter sido concentrada para 2,5 ml com um concentrador centrífugo de membranas Amicon Ultra-15 (fabricado por Millipore Co., Ltd.), o concentrado foi aplicado a uma coluna de dessalinização PD-10 (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.) que foi previamente equilibrada com Otsuka Physiological Saline for Injection (TOSS, fabricado por Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) contendo Tween 20 a 0,01%, seguido por eluição com TO-SS, de maneira que 3,5 ml de uma amostra cujo solvente foi substituído por TO-SS foi obtido. Esta amostra foi criopreservada a -80°C até uso. Usando 2,9 L de uma solução de cultura de células 293F, o mesmo procedimento de purificação foi realizado repetindo-o novamente. b) Detecção e ensaio de pureza de Siglec-15-Fc de camundongo purificado
[00315] Usando uma amostra preparada pelo procedimento de purificação mencionado acima, eletroforese em SDS-poliacrilamida em condições redutoras e coloração com prata foram realizadas. Isto é, a 5 μl de cada uma das amostras purificadas pelas respectivas etapas de purificação, uma quantidade equivalente de uma solução de tratamento com SDS foi adicionada, e a mistura resultante foi aquecida a 95°C por 10 minutos. 0,3 μl de uma amostra obtida diluindo cada uma das amostras tratadas termicamente para 1/300 ou 1/900 com uma meia concentração da solução de tratamento com SDS foi usado para eletroforese em SDS-poliacrilamida. A eletroforese e coloração com prata foram realizadas da mesma maneira que o ensaio de pureza de Siglec-15-His de camundongo descrito em c) de Exemplo 8. Os resultados são mostrados em Fig. 10 junto com os resultados de avaliação de condições preliminares de purificação em uma pequena escala (o pH da solução de cultura aplicada foi 8,9 ou 7,0). Foi mostrado que uma proteína tendo um peso molecular de cerca de 55 kDa (Siglec-15-Fc de camundongo) foi eficientemente purificada e concentrada na fração de proteína que foi eluída da coluna HiTrap Protein A. c) Medição de concentração de proteína de Siglec-15-Fc de camundongo purificado
[00316] Para o Siglec-15-Fc de camundongo purificado (a fração de proteína eluída da coluna de dessalinização PD-10), a concentração de proteína foi medida com um DC-Protein Assay kit (fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) usando albumina de soro bovino como uma amostra padrão. Como mostrado em Tabela 2, um total de 92 mg de proteína Siglec- 15-Fc de camundongo purificada foi obtido realizando o procedimento de purificação duas vezes. Tabela 2
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Exemplo 10. Produção de anticorpo policlonal de coelho anti-Singlec-15 de camundongo (imunização de coelho) a) Preparação de antígeno
[00317] A proteína Siglec-15-Fc de camundongo produzida em Exemplo 9 foi preparada a 100 μg/0,5 ml, e uma quantidade equivalente de um adjuvante foi adicionada a esta e uma emulsão foi produzida usando uma seringa de vidro. Como o adjuvante, adjuvante completo de Freund (FCA, Fabricado por Difco Laboratories, Inc.) foi usado apenas para a primeira imunização, e adjuvante incompleto de Freund (FICA, Fabricado por Difco Laboratories, Inc.) foi usado para a segunda e subseqüentes imunizações. b) Imunização de coelho
[00318] Três coelhos (coelhos brancos japoneses fêmeas com um peso corporal de 3 kg) foram usados como animais imunizados. Casualmente, o sangue foi coletado antes de imunização, e 1 ml de soro pré-imune foi obtido por coelho. A emulsão obtida em a) foi injetada subcutaneamente e intradermicamente usando uma agulha de injeção 27 G a 1 ml/coelho. Imunização foi realizada um total de 8 vezes a cada 14 dias depois da primeira imunização. O sangue inteiro foi coletado depois de 7 dias da data da oitava imunização, e 76 a 79 ml de anti-soro foi obtido por coelho. Os títulos de anticorpos no soro pré-imune e no anti-soro foram confirmados por um método ELISA usando um antígeno imobilizado. Como um resultado, um aumento em título de anticorpos no anti-soro foi confirmado em todos os três coelhos. O anti-soro foi armazenado a -20°C até uso. Exemplo 11. Purificação de anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo a) Cromatografia em coluna HiTrap Protein A
[00319] A 20 ml de cada um dos três lotes de anti-soro de coelho preparados em Exemplo 10, 20 ml de PBS de Dulbecco (D-PBS, fabricado por Invitrogen, Inc.) foi adicionado e misturado, e a mistura resultante foi filtrada através de um filtro Sterivex-GV (fabricado por Millipore Co., Ltd.). Então, o filtrado foi aplicado a uma coluna HisTrap Protein A de 5 ml (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que havia sido previamente equilibrada com D-PBS em uma vazão de 2 ml/min. Depois de a coluna ter sido lavada com 37,5 ml de D-PBS em uma vazão de 2,5 ml/min, uma proteína adsorvida na coluna foi eluída com 50 ml de tampão citrato de sódio 0,1 M (pH 3,0) em uma vazão de 2,5 ml/min. O eluato foi fracionado a 2,5 ml por fração em tubos mini-sorp (fabricado por Nunc, Inc.), e imediatamente depois, 0,65 ml de Tris 1 M foi adicionado a estes para neutralizar o eluato. Depois de cerca de 10 ml de uma solução obtida combinando as frações (frações 2 a 5) contendo a proteína eluída ter sido concentrado para 2,5 ml com um concentrador centrífugo de membranas Amicon Ultra-15 (fabricado por Millipore Co., Ltd.), o concentrado foi aplicado a uma coluna de dessalinização PD-10 (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.) que havia sido previamente equilibrada com Otsuka Physiological Saline for Injection (TO-SS) contendo Tween 20 a 0,01%, seguido por eluição com TO-SS, de maneira que 3,5 ml de uma amostra cujo solvente foi substituído por TO-SS foi obtido. A amostra assim preparada foi criopreservada a -80°C até uso. b) Detecção e ensaio de pureza de anticorpo policlonal anti- Singlec-15 de camundongo
[00320] Usando as amostras (três lotes, Nos. 1, 2, e 3) preparadas pelo procedimento de purificação descrito no a) acima, eletroforese em SDS- poliacrilamida em condições redutoras e coloração com prata foram realizadas. Isto é, a 5 μl de cada uma das amostras purificadas pelas respectivas etapas de purificação, uma quantidade equivalente de uma solução de tratamento com SDS (tampão Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) contendo 1 mM de EDTA, SDS a 2,5%, 0,1% de azul de bromofenol, e 5% de 2- mercaptoetanol) foi adicionada, e a mistura resultante foi aquecida a 95°C por 10 minutos. 0,3 μl de uma amostra obtida diluindo cada uma das amostras tratadas termicamente para 1/100, 1/300 ou 1/900 com uma meia concentração da solução de tratamento com SDS foi usado para eletroforese em SDS-poliacrilamida. A eletroforese e coloração com prata foram realizadas da mesma maneira que o ensaio de pureza de Siglec-15-His de camundongo descrito em c) de Exemplo 8. Foi mostrado que uma proteína IgG composta de uma cadeia pesada tendo um peso molecular de cerca de 45 kDa e uma cadeia leve tendo um peso molecular de cerca de 21 kDa foi eficientemente purificada e concentrada na fração de proteína que foi eluída da coluna de dessalinização PD-10. c) Medição de concentração de proteína de anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo purificado
[00321] Para o anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo purificado (a fração de proteína eluída da coluna de dessalinização PD-10), a concentração de proteína foi medida com um DC-Protein Assay kit (fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) usando IgG bovina como uma amostra padrão. Como mostrado em Tabela 3, 100 a 170 mg do anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo pode ser purificado em cada um dos lotes, Nos. 1 a 3. Tabela 3
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d) Análise de reatividade de anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo purificado com domínio extracelular de Siglec-15
[00322] Um teste para confirmar que o anticorpo policlonal anti-Singlec- 15 de camundongo preparado no item a) acima se liga não apenas a uma cauda de Fc, mas também ao domínio extracelular de proteína Siglec-15 foi realizado. A 5 μl da amostra de Siglec-15-His de camundongo purificado (Exemplo 8) ou 5 μl da amostra de Siglec-15-Fc de camundongo purificado, uma quantidade equivalente de uma solução de tratamento com SDS (com ou sem a adição de 5% de 2-mercaptoetanol) foi adicionada, e a mistura resultante foi aquecida a 95°C por 10 minutos. 0,3 μl de cada uma das amostras tratadas termicamente foi usado para eletroforese em SDS- poliacrilamida, e eletroforese e transferência (blotting) para uma membrana de PVDF foram realizadas da mesma maneira que o método descrito no b) acima de Exemplo 6. Esta membrana de PVDF foi agitada suavemente em 8 ml de um agente bloqueador (BlockAce, fabricado por Snow Brand Milk Products, Co., Ltd.) contendo Tween 20 a 0,1% em temperatura ambiente por 1 hora. A esta solução bloqueadora, 1,6 μl do anticorpo policlonal anti- Singlec-15 de camundongo No. 1 (Tabela 3) foi adicionado, e a membrana de PVDF na solução foi agitada suavemente em temperatura ambiente por um adicional de 1 hora. Esta membrana de PVDF foi lavada 4 vezes agitando-a suavemente em 50 mL de PBS contendo Tween 20 a 0,01% por 5 minutos. A membrana de PVDF lavada foi imersa 8 ml de Antibody Diluent ECL Advance Blocking Agent (ECL Advance Western Blotting Detection Kit, fabricado por Amersham Biosciences, Inc.), e anti-IgG de coelho-HRP (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.) foi adicionado a esta para gerar uma concentração final de 1/200.000. Então, 0,8 μl de uma solução de HRP com S-proteína (ECL DualVue Western Blotting Markers, fabricados por Amersham Biosciences, Inc.) foi adicionado a esta, e a membrana na solução foi suavemente agitada em temperatura ambiente por um adicional de 1 hora. Esta membrana de PVDF foi lavada 4 vezes agitando-a suavemente em 50 mL de PBS contendo Tween 20 a 0,01% por 5 minutos. Depois de lavagem, a membrana de PVDF foi tratada de acordo com o protocolo anexado a ECL Advance Western Blotting Detection Kit (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.), e a cor desenvolvida da banda da proteína foi detectada usando uma Mini-Câmera de ECL (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) e filme Polaroid (Polapan 3200B, fabricado por Polaroid, Inc.). Os resultados são mostrados em Fig. 11. A partir destes resultados, foi mostrado que o anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo purificado também se liga a Siglec-15-His de camundongo, e pode ser confirmado que o anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo se liga não apenas a uma cauda de Fc, mas também ao domínio extracelular da proteína Siglec-15. O mesmo teste foi realizado repetindo-o, e foi confirmado que os anticorpos policlonais anti-Singlec-15 de camundongo No. 2 e No. 3 também se ligam a Siglec-15-His de camundongo. Exemplo 12. Purificação de IgG de coelho pré-imune
[00323] Sangue havia sido previamente coletado de cada um dos três coelhos usados em Exemplo 10, antes de iniciação de imunização com Siglec- 15-Fc de camundongo, e soro pré-imune foi preparado a partir deste. Depois de uma alíquota de 0,8 ml de cada uma destas amostras de soro ter sido misturada uma com a outra, 2,4 ml de PBS de Dulbecco (D-PBS, fabricado por Invitrogen, Inc.) foi adicionado a esta, e a mistura resultante foi filtrada através de um filtro Millex-GV (fabricado por Millipore Co., Ltd.). Então, a amostra de soro resultante foi aplicada a uma coluna HiTrap Protein A de 5 ml (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que havia sido previamente equilibrada com D-PBS em uma vazão de 1 ml/min. Depois de a coluna ter sido lavada com 50 ml de D-PBS em uma vazão de 2,5 ml/min, uma proteína adsorvida na coluna foi eluída com 50 ml de tampão citrato de sódio 0,1 M (pH 3,0) em uma vazão de 2,5 ml/min. O eluato foi fracionado a 2,5 ml por fração em tubos mini-sorp (fabricados por Nunc, Inc.), e imediatamente depois, 0,65 ml de Tris 1 M foi adicionado a estes para neutralizar o eluato. Depois de uma solução obtida combinando as frações (frações 2 a 4) contendo a proteína eluída ter sido concentrada para 2,5 ml com um concentrador centrífugo de membranas Amicon Ultra-15 (fabricado por Millipore Co., Ltd.), o concentrado foi aplicado a uma coluna de dessalinização PD-10 (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que foi previamente equilibrada com Otsuka Physiological Saline for Injection (TO-SS) contendo Tween 20 a 0,01%, seguido por eluição com TO-SS, de maneira que 3,5 ml de uma amostra cujo solvente foi substituído por TO-SS foi obtido. A amostra de IgG de coelho pré-imune assim purificada foi sujeita a eletroforese em poliacrilamida e coloração com prata pelo método descrito no c) acima de Exemplo 8 para confirmar que a proteína IgG foi suficientemente purificada, e então a concentração de proteína foi medida. A amostra assim purificada foi criopreservada a -80°C até uso. Exemplo 13. Preparação de coluna de afinidade tendo Siglec-15-Fc de camundongo imobilizado nesta
[00324] Depois de 0,54 ml do solvente dos 18,5 mg/ml da solução de Siglec-15-Fc de camundongo purificado descrita em Exemplo 9 (um total de 10 mg de proteína) ter sido substituído por um tampão de acoplamento (0,2 M de NaHCO3, 0,5 M de NaCl, pH 8,3) usando uma coluna de dessalinização PD-10, a solução resultante foi concentrada para 1 ml usando um concentrador centrífugo de membranas Amicon Ultra-4 (fabricado por Millipore Co., Ltd.). Depois de isopropanol em uma coluna HiTrap ativada por NHS (1 ml, fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) ter sido substituída por 1 mM de ácido clorídrico, 1 ml de um tampão de acoplamento contendo 10 mg/ml de Siglec-15-Fc de camundongo foi injetado na coluna usando uma seringa. Depois de uma reação ter sido deixada prosseguir em temperatura ambiente por 30 minutos, a fim de inativar grupos ativos em excesso, 6 ml de um tampão de bloqueio (um tampão etanolamina contendo 0,5 M de NaCl, pH 8,3), 6 ml de um tampão de lavagem (um tampão acetato de sódio contendo 0,5 M de NaCl, pH 4,0), e 6 ml do tampão de bloqueio foram injetados em seqüência de acordo com o protocolo de Amersham Biosciences, Inc., e então, a coluna foi deixada em temperatura ambiente por 30 minutos. Depois, 6 ml do tampão de lavagem, 6 ml do tampão de bloqueio, e 6 ml do tampão de lavagem foram injetados na coluna em seqüência novamente, e finalmente, o tampão na coluna foi substituído por tampão Tris- HCl 50 mM (pH 7,0) contendo 1 M de NaCl e Tween 20 a 0,01%. Esta coluna foi armazenada a 4°C até uso. Exemplo 14. Purificação de anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo com coluna de afinidade a) Cromatografia em coluna de afinidade
[00325] A 2 ml de cada um dos anticorpos policlonais anti-Singlec-15 de camundongo purificados Nos. 1, 2 e 3 preparados em Exemplo 11, 8 ml de um Apply Buffer (tampão Tris-HCl 10 mM contendo 0,15 M de NaCl, pH 7,2) foi adicionado, e a mistura resultante foi aplicada à coluna de afinidade (Exemplo 13) que havia sido previamente equilibrada com o Apply Buffer em uma vazão de 0,25 ml/min. Depois de a coluna ter sido lavada com 5 ml do Apply Buffer em uma vazão de 0,25 ml/min, primeiro, uma proteína adsorvida na coluna foi eluída com 5 ml de tampão cloridrato de glicina 0,1 M (pH 2,7) contendo 0,5 M de NaCl em uma vazão de 0,25 ml/min, e subseqüentemente, uma proteína adsorvida na coluna foi eluída com 5 ml de tampão citrato de sódio 0,1 M (pH 2,0) contendo 0,5 M de NaCl em uma vazão de 0,25 ml/min. O cromatograma do anticorpo policlonal anti-Singlec- 15 de camundongo No. 3 purificado com a coluna de afinidade é mostrado em Fig. 12. O eluato foi fracionado a 0,5 ml por fração em tubos mini-sorp (fabricados por Nunc, Inc.), e imediatamente depois, 16 μl de Tris 1 M foi adicionado a 0,5 ml de cada fração eluída com o tampão cloridrato de glicina, e 150 μl de Tris 1 M foi adicionado a 0,5 ml de cada fração eluída com o tampão citrato de sódio para neutralizar o eluato. A maioria do anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo foi eluído com o tampão cloridrato de glicina 0,1 M (pH 2,7) contendo 0,5 M de NaCl. Cerca de 2,5 ml de uma solução, obtida combinando as frações (frações 3 a 7) nas quais a proteína IgG eluída com o tampão cloridrato de glicina foi detectada para cada lote, foi aplicado a uma coluna de dessalinização PD-10 (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que havia sido previamente equilibrada com Otsuka Physiological Saline for Injection (TO-SS) contendo Tween 20 a 0,01%, seguido por eluição com TO-SS, de maneira que 3,5 ml de uma amostra cujo solvente foi substituído por TO-SS foi obtido. Com respeito às frações de proteína IgG (frações 16 a 19) eluídas com o tampão citrato de sódio em uma quantidade de cerca de 2,5 ml, as frações para todos os três lotes foram combinadas e a solução resultante foi concentrada para 2,5 ml com um concentrador centrífugo de membranas Amicon Ultra-4 (fabricado por Millipore Co., Ltd.). Então, o concentrado foi aplicado a uma coluna de dessalinização PD-10 (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.) que foi previamente equilibrada com TO-SS, seguido por eluição com TO-SS, de maneira que 3,5 ml de uma amostra (Citrato-E) cujo solvente foi substituído por TO-SS foi obtida. As amostras assim preparadas foram criopreservadas a -80°C até uso. b) Medição de concentração de proteína de anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo purificado por afinidade
[00326] Para as amostras de anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo purificado (as frações de proteínas eluídas a partir da coluna de dessalinização PD-10), a concentração de proteína foi medida com um DC- Protein Assay kit (fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) usando IgG bovina como uma amostra padrão. As amostras nas quais a concentração de proteína foi medida foram preparadas de forma que a concentração de anticorpo foi 15 ou 50 μg/ml, e sujeitas a eletroforese e coloração com prata da mesma maneira que em b) de Exemplo 11. Os resultados são mostrados em Fig. 13. Foi mostrado que uma proteína IgG composta de uma cadeia pesada tendo um peso molecular de cerca de 45 kDa e uma cadeia leve tendo um peso molecular de cerca de 21 kDa foi eficientemente purificada e concentrada nas frações de proteínas eluídas a partir da coluna PD-10. Como mostrado em Tabela 4, cerca de 2,3 a 7,4 mg de um anticorpo policlonal anti- Singlec-15 de camundongo purificado por afinidade pode ser preparado em cada um dos lotes Nos. 1 a 3 ou como fração de Citrato-E. Tabela 4
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Exemplo 15. Purificação de anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo purificado por afinidade com coluna de filtração em gel a) Cromatografia em coluna Superose 6
[00327] A fim de remover completamente endotoxina e impurezas de baixo peso molecular do anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo purificado por afinidade preparado em Exemplo 14, purificação foi posteriormente realizada com uma coluna de filtração em gel. 1 ml de cada um dos anticorpos policlonais anti-Singlec-15 de camundongo purificados por afinidade Nos. 2 e 3 foi aplicado a uma coluna Superose 6 HR 10/30 (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que foi previamente tratada com um agente removedor de pirogênio PyroCLEAN (fabricado por ALerCHEK, Inc.) e equilibrada com PBS de Dulbecco (D-PBS, fabricado por Invitrogen, Inc.) contendo Tween 20 a 0,01%, seguido por eluição com D-PBS contendo Tween 20 a 0,01% em uma vazão de 0,4 ml/min. Os cromatogramas destes são mostrados em Fig. 14. O eluato foi fracionado a 0,5 ml por fração em tubos mini-sorp (fabricados por Nunc, Inc.), e 2,0 ml de uma amostra de anticorpo policlonal anti-Siglec-15 de camundongo purificado por filtração em gel (frações 28 a 31) foi obtido. A amostra assim preparada foi criopreservada a -80°C até uso. b) Medição de concentração de proteína de IgG de Coelho purificada com coluna de filtração em gel
[00328] Também para a amostra de anticorpo policlonal anti-Siglec-15 de camundongo purificada por filtração em gel (as frações de proteínas eluídas a partir da coluna Superose 6), a concentração de proteína foi medida. Como mostrado em Tabela 5, o anticorpo policlonal anti-Siglec-15 de camundongo purificado por filtração em gel em uma quantidade de 2,25 mg e 3,34 mg pode ser preparado em lote Nos. 2 e 3, respectivamente. Tabela 5
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Exemplo 16. Preparação de células não aderentes de medula óssea de camundongo
[00329] O fêmur e tíbia foram amputados de um camundongo macho ddY na idade de 5 a 8 semanas e tecidos moles foram removidos. Ambas as extremidades do fêmur ou tíbia foram cortadas, e D-PBS foi injetado usando uma seringa com uma agulha de injeção de calibre 25 para empurrar células de medula óssea, que foram coletadas em um tubo de centrífuga. Centrifugação foi realizada em temperatura ambiente por 5 minutos a 100 g, e o sobrenadante foi removido. Ao glóbulo celular, 1 ml de um tampão hemolítico (Red Blood Cell Lysing Buffer, fabricado por Sigma Co., Ltd.) foi adicionado para suspendê-lo, e a suspensão resultante foi deixada em temperatura ambiente por 5 minutos. 20 ml de D-PBS foi adicionado a esta, e a suspensão foi centrifugada em temperatura ambiente por 5 minutos a 100 g, e o sobrenadante foi removido. Ao glóbulo celular, 10 ml de meio MEM-α (fabricado por Invitrogen, Inc.) contendo 5 ng/ml de M-CSF (fabricado por R&D systems, Inc.) e 10% de soro fetal bovino (FBS) foi adicionado para suspendê-lo. Então, a suspensão resultante foi passada através de um filtro celular (40 μm Nylon, fabricado por BD Falcon) para remover agregados. As células resultantes foram transferidas para um frasco T de 75 cm2 (para o uso de células aderentes) e cultivadas durante a noite em uma incubadora de CO2. Depois da cultura noturna, as células que não aderiram ao frasco T foram recuperadas e usadas como células não aderentes de medula óssea de camundongo. Exemplo 17. Efeito de adição de anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo em diferenciação de osteoclastos de células não aderentes de medula óssea de camundongo (estimulação com RANKL)
[00330] Usando os anticorpos policlonais anti-Singlec-15 de camundongo produzidos em Exemplos 14 e 15, um efeito em diferenciação de osteoclastos de células não aderentes de medula óssea de camundongo foi estudado. Células não aderentes de medula óssea de camundongo preparadas pelo método mencionado acima em Exemplo 16 foram preparadas a 1,5 x 105 células/ml em meio α-MEM contendo 10% de FBS e 10 ng/ml de M-CSF (fabricado por R&D systems, Inc.), e a preparação celular resultante foi inseminada em cada poço de uma placa de 96 poços em uma quantidade de 200 μl e as células foram cultivadas por 2 dias em uma incubadora de CO2. A solução de cultura velha na placa de 96 poços foi removida, e 100 μl de meio MEM-α contendo 10% de FBS ao qual RANKL humano (RANKL, fabricado por Peprotech, Inc.) e M-CSF foram adicionados para gerar concentrações finais de 20 ng/ml e 10 ng/ml, respectivamente, foi adicionado a cada poço. À solução de cultura celular, o anticorpo No. 3 purificado por afinidade, anticorpo Citrato-E, anticorpo No. 2 purificado por filtração em gel, anticorpo No. 3 purificado por filtração em gel, IgG de coelho pré-imune (produzida em Exemplos 12, 14, e 15), ou IgG de coelho de controle comercialmente disponível (Non-immune Rabbit IgG CLRB00, fabricado por Cedarlane Laboratories Ltd.) foi adicionado em uma concentração de a partir de 30 a 1.000 ng/ml, e as células foram cultivadas por um adicional de 3 dias em uma incubadora de CO2. Depois de conclusão do cultivo, a atividade de fosfatase ácida resistente a tartarato (TRAP) dos osteoclastos formados foi medida pelo procedimento seguinte. A solução de cultura em cada poço da placa de 96 poços foi removida por sucção, e 50 μl de tampão citrato de sódio 50 mM (pH 6,1) contendo Triton X-100 a 1% foi adicionado a cada poço. Então, a placa foi agitada por 5 minutos em um agitador de placas para lisar as células. A cada poço, 50 μl de uma solução de substrato (tampão citrato de sódio 50 mM (pH 6,1) contendo 5 mg/ml de p-nitrofenil fosfato e 0,46% de tartarato de sódio) foi adicionado, e a placa foi incubada em temperatura ambiente por 5 minutos. Depois da incubação, 50 μl de uma solução 1 N de hidróxido de sódio foi adicionado a cada poço da placa de 96 poços para parar a reação enzimática. Depois de parar a reação enzimática, uma absorbância de cada poço a 405 nm foi medida, e a medida foi usada como um índice de atividade de TRAP. Os resultados são mostrados em Figs. 15 e 16. Uma inibição significativa de atividade de TRAP não foi observada nos casos da IgG de coelho pré-imune e da IgG de coelho de controle comercialmente disponível. Por outro lado, uma inibição significativa de atividade de TRAP foi observada nos casos do anticorpo No. 3 purificado por afinidade a 30 ng/ml ou mais e do anticorpo Citrato-E a cerca de 130 ng/ml ou mais (Fig. 15). Também no caso do anticorpo No. 3 purificado por filtração em gel, uma inibição significativa de atividade de TRAP foi observada a 30 ng/ml ou mais. Além disso, uma atividade inibitória mais potente foi observada no caso do anticorpo No. 3 purificado por filtração em gel do que no caso do anticorpo No. 2 purificado por filtração em gel (Fig. 16). Uma vez que a atividade de inibir formação de osteoclastos também foi observada no anticorpo purificado por filtração em gel, foi mostrado que a atividade de inibir formação de osteoclastos observada no anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo não é atribuída a endotoxina ou impurezas de baixo peso molecular contidas na amostra de anticorpo, mas é atribuída à atividade da própria molécula de anticorpo. A partir dos resultados acima, foi mostrado que o anticorpo policlonal anti- Singlec-15 de camundongo tem um efeito inibitório potente em formação de osteoclastos (diferenciação e maturação de osteoclastos). Exemplo 18. Neutralização por antígeno de inibição de diferenciação de osteoclastos de células não aderentes de medula óssea de camundongo por adição de anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo (estimulação com RANKL)
[00331] Foi confirmado que o efeito do anticorpo policlonal anti-Singlec- 15 de camundongo depende da ligação deste com um antígeno adicionando previamente o antígeno ao anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo para formar um precipitado imune. A 10 μg/ml do anticorpo No. 3 purificado por afinidade produzido em Exemplo 14, o Siglec-15-His de camundongo ou Siglec-15-Fc preparado em Exemplo 8 ou 9 foi adicionado em uma concentração de 10, 30, 100 ou 300 μg/ml, e a mistura resultante foi incubada a 37°C por 2 horas. Depois da incubação, a mistura foi centrifugada por 5 minutos por Chibitan, e o sobrenadante resultante foi esterilizado por filtração através de um filtro Millex-GV (fabricado por Millipore Co., Ltd.). Células não aderentes de medula óssea de camundongo preparadas pelo método em Exemplo 16 foram inseminadas em uma placa de 96 poços a 200 μl/poço, e as células foram cultivadas por 2 dias em uma incubadora de CO2. A solução de cultura velha na placa de 96 poços foi removida, e 100 μl de meio MEM-α contendo 10% de FBS ao qual RANKL humano (RANKL, fabricado por Peprotech, Inc.) e M-CSF foram adicionados para gerar concentrações finais de 20 ng/ml e 10 ng/ml, respectivamente, foi adicionado a cada poço. À solução de cultura celular, cada uma das amostras de teste preparadas acima foi adicionada a 1/200 (v/v), e as células foram cultivadas por um adicional de 3 dias em uma incubadora de CO2. Depois de conclusão do cultivo, a atividade de fosfatase ácida resistente a tartarato (TRAP) dos osteoclastos formados foi medida pelo método descrito em Exemplo 17. Os resultados são mostrados em Fig. 17. Em ambos os casos onde o anticorpo foi neutralizado por Siglec-15-His e onde o anticorpo foi neutralizado por Siglec- 15-Fc, o efeito do anticorpo foi neutralizado e perdido. Estes resultados demonstraram que o efeito inibitório do anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo em formação de osteoclastos é devido a ligação deste com proteína Siglec-15 e bloqueio de sua função. Exemplo 19. Efeito de adição de anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo em diferenciação de osteoclastos de células não aderentes de medula óssea de camundongo (estimulação com TNF)
[00332] Usando o anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo, um efeito em diferenciação de osteoclastos de células não aderentes de medula óssea de camundongo por estimulação com TNF foi estudado. Células não aderentes de medula óssea de camundongo preparadas pelo método em Exemplo 16 foram preparadas a 1,5 x 105 células/ml em meio α-MEM contendo 10% de soro fetal bovino (FBS), 10 ng/ml de M-CSF e 2 ng/ml de TGF-β (fabricado por R&D systems, Inc.), e a preparação celular resultante foi inseminada em cada poço de uma placa de 96 poços em uma quantidade de 200 μl e as células foram cultivadas por 2 dias em uma incubadora de CO2. A solução de cultura velha na placa de 96 poços foi removida, e 100 μl de meio MEM-α contendo 10% de FBS ao qual TNF-α humano recombinante (fabricado por R&D systems, Inc.) e M-CSF foram adicionados para gerar concentrações finais de 30 ng/ml e 10 ng/ml, respectivamente, foi adicionado a cada poço. À solução de cultura celular, a IgG pré-imune produzida em Exemplo 12 ou o anticorpo No. 3 anti-Singlec-15 de camundongo purificado por filtração em gel produzido em Exemplo 15 foi adicionado em uma concentração de a partir de 30 a 1.000 ng/ml, e as células foram cultivadas por um adicional de 3 dias em uma incubadora de CO2. Ao mesmo tempo, um poço no qual as células foram cultivadas adicionando OCIF/OPG humano recombinante preparado pelo método descrito na descrição de Patente No. WO 96/26217 em uma concentração de a partir de 3 a 100 ng/ml também foi preparado. Depois de conclusão do cultivo, a atividade de fosfatase ácida resistente a tartarato (TRAP) dos osteoclastos formados foi medida pelo método descrito em Exemplo 17. Os resultados são mostrados em Fig. 18. Nos casos da IgG pré-imune e OCIF/OPG, uma inibição significativa de atividade de TRAP não foi observada. Por outro lado, no caso do anticorpo No. 3 anti-Singlec-15 de camundongo purificado por filtração em gel, cerca de 50% de inibição de atividade de TRAP foi observada em uma concentração de 250 ng/ml ou mais. A partir destes resultados, foi mostrado que o anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo também pode inibir formação de osteoclastos induzida por TNF (diferenciação e maturação de osteoclastos) que não pode ser inibida por OCIF/OPG.
[00333] Para cada poço de uma placa de 96 poços preparada realizando cultivo da mesma maneira como descrito acima, coloração com TRAP foi realizada usando um Leukocyte Acid Phosphatase kit (fabricado por Sigma Co., Ltd.) de acordo com o protocolo anexado ao kit, e a formação de osteoclastos multinucleados positivos para TRAP foi observada. Como um resultado, a formação de osteoclastos multinucleados gigantes positivos para TRAP foi inibida pela adição do anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo (Fig. 19). Uma vez que osteoclastos mononucleares foram formados mesmo no caso onde o anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo foi adicionado, foi mostrado que o anticorpo policlonal anti- Singlec-15 de camundongo inibe fortemente o processo de fusão celular em diferenciação e maturação de osteoclastos induzido por TNF. Exemplo 20. Efeito de adição de anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo em diferenciação de osteoclastos de células primárias cultivadas derivadas de medula óssea de camundongo (atividade de TRAP)
[00334] Um camundongo macho ddY na idade de 7 semanas foi eutanasiado por deslocamento cervical sob anestesia com éter e o fêmur e tíbia foram amputados. Depois de tecidos moles terem sido removidos, ambas as extremidades do fêmur ou tíbia foram cortadas. Então, meio α-MEM contendo 10% de soro fetal bovino foi injetado na medula óssea usando um cilindro da seringa com uma agulha de injeção de calibre 25, e células de medula óssea foram coletadas. Depois do número de células ter sido contado, as células foram preparadas a 5 x 106 células/ml em meio α-MEM contendo 10% de soro fetal bovino. A preparação celular resultante foi emplacada em uma placa de 96 poços a 100 μl/poço, e vitamina D3 ativa (fabricada por Sigma Co., Ltd.) foi adicionada a esta para gerar uma concentração final de 2 x 10-8 M. A este sobrenadante de cultura celular, o anticorpo No. 3 anti- Singlec-15 de camundongo purificado por afinidade produzido em Exemplo 14 ou a IgG de coelho pré-imune produzida em Exemplo 12 foi adicionado para gerar uma concentração final de 4,57, 13,7, 41,2, 123, 370, 1.111, 3.333, ou 10.000 ng/ml, e as células foram cultivadas por 8 dias em uma incubadora de CO2. Casualmente, a substituição de meio e adição de uma substância de teste foram realizadas em dias 3 e 6. O sobrenadante de cultura foi removido em dia 8 de cultura, e formalina neutra a 10% foi adicionada para fixar as células. Depois de fixar as células, as células foram lavadas duas vezes com água destilada, e uma solução de substrato TRAP (15 mM de p-nitrofenil fosfato, 50 mM de tartarato de sódio, tampão acetato de sódio 0,1 M (pH 5,0)) foi adicionada a estas a 100 μl/poço, e uma reação foi deixada prosseguir em temperatura ambiente por 30 minutos. Então, 1 N de NaOH foi adicionado a esta a 50 μl/poço para parar a reação, e uma absorbância a 405 nm foi medida usando um leitor de microplacas, de maneira que a atividade de TRAP nas células foi avaliada. Como um resultado, a atividade de TRAP foi inibida dependendo da dose do anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo adicionado (Fig. 20-A). Por outro lado, no caso onde a IgG pré-imune foi adicionada, uma diminuição na atividade de TRAP não foi observada (Fig. 20-B). Desta maneira, foi revelado que a formação de osteoclastos positivos para TRAP a partir de células de medula óssea de camundongo induzida por vitamina D3 ativa é inibida pelo anticorpo se ligando especificamente a Siglec-15. Exemplo 21. Efeito de adição de anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo em fusão celular de osteoclastos a partir de células primárias cultivadas derivadas de medula óssea de camundongo (Coloração com TRAP)
[00335] Um camundongo macho ddY na idade de 7 semanas foi eutanasiado por deslocamento cervical sob anestesia com éter e o fêmur e tíbia foram amputados. Depois de tecidos moles terem sido removidos, ambas as extremidades do fêmur ou tíbia foram cortadas. Então, meio α-MEM contendo 10% de soro fetal bovino foi injetado na medula óssea usando um cilindro da seringa com uma agulha de injeção de calibre 25, e células de medula óssea foram coletadas. Depois do número de células ter sido contado, as células foram preparadas a 5 x 106 células/ml em meio α-MEM contendo 10% de soro fetal bovino. A preparação celular resultante foi emplacada em uma placa de 96 poços a 100 μl/poço. Adicionando vitamina D3 ativa (fabricada por Sigma Co., Ltd.) em uma concentração final de 2 x 10-8 M ou RANKL humano (fabricado por PeproTech Inc.) em uma concentração final de 80 ng/ml a este sobrenadante de cultura como um fator indutor de diferenciação de osteoclastos, sobrenadantes de culturas celulares foram preparados. A cada um destes sobrenadantes de culturas celulares, o anticorpo No. 3 anti-Singlec-15 de camundongo purificado por afinidade produzido em Exemplo 14 foi adicionado para gerar uma concentração final de 370 ou 3.333 ng/ml, ou a IgG de coelho pré-imune produzida em Exemplo 12 foi adicionada para gerar uma concentração final de 3.333 ng/ml. No sistema de cultura de induzir diferenciação de osteoclastos por vitamina D3 ativa, as células foram cultivadas por 8 dias em uma incubadora de CO2, e no sistema de induzir a diferenciação por RANKL humano, as células foram cultivadas por 6 dias em uma incubadora de CO2. Casualmente, a substituição de meio e adição de uma substância de teste foram realizadas em dias 3 e 6. Depois do cultivo, o sobrenadante foi removido, e formalina neutra a 10% foi adicionada para fixar as células. Depois de fixar as células, as células foram lavadas duas vezes com água destilada, e uma solução de coloração com TRAP (0,27 mM de naftol AS-MX fosfato (fabricado por Sigma Co., Ltd.), 1,6 mM de fast red violet LB salt (fabricado por Sigma Co., Ltd.), 1% de dimetilformamida, 50 mM de tartarato de sódio, tampão acetato de sódio 0,1 M (pH 5,0)) foi adicionado a 100 μl/poço, e uma reação foi deixada prosseguir em temperatura ambiente por 5 minutos. Então, as células foram lavadas duas vezes com água destilada, e então, observadas por microscopia. Como um resultado, no caso onde diferenciação de osteoclastos foi induzida ou por vitamina D3 ativa (Fig. 21) ou RANKL humano (Fig. 22), fusão celular de osteoclastos foi inibida pela adição do anticorpo policlonal anti-Singlec- 15 de camundongo, e a formação de osteoclastos gigantes não foi observada. Por outro lado, no caso onde a IgG pré-imune foi adicionada, tal inibição de fusão celular de osteoclastos não foi observada. Desta maneira, foi revelado que multinucleação e fusão celular de osteoclastos positivos para TRAP a partir de células de medula óssea de camundongo induzidas por vitamina D3 ativa ou RANKL humano são inibidas pelo anticorpo se ligando especificamente a Siglec- 15. Exemplo 22. Efeito de adição de anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo em fusão celular de osteoclastos a partir de células RAW 264.7 (Coloração com TRAP) a) Produção de anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo absorvido em proteína antigênica
[00336] Cinco soluções misturadas (A a E) foram preparadas usando D- PBS (fabricado por Invitrogen, Inc.) contendo Tween 20 a 0,01%, de forma que as respectivas concentrações do anticorpo No. 3 anti-Singlec-15 de camundongo purificado por afinidade produzido em Exemplo 14, da proteína Siglec-15-His de camundongo e da proteína Siglec-15-Fc de camundongo produzida em Exemplos 8 e 9 foram como mostrado em Tabela 6. Estas soluções misturadas foram incubadas a 37°C por 2 horas e centrifugadas a 20.000 x g por 10 minutos. Os sobrenadantes resultantes foram usados como amostras de teste com concentração de 20 vezes. Tabela 6
Figure img0007
(Unidade: μg/ml) b) Avaliação usando RAW 264.7 por coloração com TRAP
[00337] RAW 264.7 foi preparada a 2,25 x 104 células/ml em meio α- MEM contendo 10% de soro fetal bovino, e a preparação celular resultante foi emplacada em uma placa de 96 poços a 200 μl/poço, e RANKL humano (fabricado por PeproTech Inc.) foi adicionado a esta para gerar uma concentração final de 40 ng/ml. A este sobrenadante de cultura celular, cada uma das amostras de teste A a E produzidas em a) foi adicionada em uma concentração final de 1/20, e as células foram cultivadas por 3 dias em uma incubadora de CO2. Depois do cultivo, o sobrenadante foi removido, e formalina neutra a 10% foi adicionada para fixar as células. Depois de fixar as células, as células foram lavadas duas vezes com água destilada, e uma solução de coloração com TRAP (0,27 mM de naftol AS-MX fosfato (fabricado por Sigma Co., Ltd.), 1,6 mM de fast red violet LB salt (fabricado por Sigma Co., Ltd.), 1% de dimetilformamida, 50 mM de tartarato de sódio, tampão acetato de sódio 0,1 M (pH 5,0)) foi adicionado a 100 μl/poço, e uma reação foi deixada prosseguir em temperatura ambiente por 5 minutos. Então, as células foram lavadas duas vezes com água destilada, e então, observadas por microscopia. Como um resultado, adicionando o anticorpo policlonal anti- Singlec-15 de camundongo, fusão celular de osteoclastos foi significativamente inibida (Fig. 23-A) se comparada com o caso do controle (Fig. 23-0) sem a adição da amostra de teste. Entretanto, absorvendo o anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo na proteína Siglec-15-Fc de camundongo usada como o antígeno imunizante, o efeito inibitório do anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo em fusão celular de osteoclastos foi cancelado (Figs. 23-B, C). Além disto, absorvendo também o anticorpo policlonal anti-Singlec-15 de camundongo na proteína Siglec-15- His de camundongo, o efeito inibitório do anticorpo policlonal anti-Singlec- 15 de camundongo em fusão celular de osteoclastos foi cancelado da mesma maneira (Figs. 23-D, E). A partir destes resultados, foi revelado que multinucleação e fusão celular de osteoclastos positivos para TRAP a partir de células RAW 264.7 induzidas por RANKL humano são inibidas pelo anticorpo se ligando especificamente a Siglec-15. Casualmente, os resultados representados pelos símbolos A a E em Fig. 23 correspondem às amostras de teste A a E em Tabela 6, respectivamente. Exemplo 23. Estabelecimento de hibridoma produtor de anticorpo monoclonal de rato anti-Singlec-15 de camundongo a) Preparação de antígeno
[00338] A proteína Siglec-15-His de camundongo produzida em Exemplo 8 foi preparada a 100 μg/0,5 ml, e uma quantidade equivalente de um adjuvante foi adicionada a esta e uma emulsão foi produzida usando uma seringa de vidro. Como o adjuvante, adjuvante completo de Freund (FCA, Fabricado por Difco Laboratories, Inc.) foi usado apenas para a primeira imunização, e adjuvante incompleto de Freund (FICA, Fabricado por Difco Laboratories, Inc.) foi usado para a segunda e subseqüentes imunizações. b) Imunização de rato
[00339] Quatro ratos (Wistar, fêmeas, 6 semanas de idade, adquiridos de CLEA Japan, Inc.) foram usados como animais imunizados. A emulsão obtida em a) foi injetada subcutaneamente e intradermicamente usando uma agulha de injeção de 27 G de forma que a quantidade do antígeno foi de 50 μg por rato. Imunização foi realizada um total de 4 vezes a cada 7 dias depois da primeira imunização. Uma pequena quantidade (200 μl) do sangue foi coletada da veia caudal depois de 7 dias a partir da data da quarta imunização, e um anti-soro foi preparado. A fim de confirmar o título de anticorpos do anti-soro, ELISA usando proteína Siglec-15-His de camundongo imobilizada usada como o antígeno, a proteína Siglec-15-Fc de camundongo produzida em Exemplo 9, ou albumina de soro bovino (BSA) foi realizado. Como um resultado, a reatividade com a proteína Siglec-15-His de camundongo e proteína Siglec-15-Fc de camundongo foi observada em todos os quatro ratos (rato Nos. 1 a 4). Por outro lado, a reatividade com BSA não foi observada. A partir destes resultados, foi confirmado que o título de anticorpos no soro de cada um dos ratos imunizados aumentou, e, portanto, o rato No. 2 que mostrou o maior título de anticorpos foi sujeito a um procedimento de fusão celular. c) Fusão celular
[00340] Fusão celular foi realizada de acordo com um método comum de fusionar células de baço de camundongo (rato) com células de mieloma. O sangue inteiro foi coletado do coração do rato sob anestesia com éter e o rato foi eutanasiado, e então, o baço foi amputado. As células de baço coletadas e células P3X63Ag8.653 (ATCC CRL 1580) que são células de mieloma de camundongo foram sujeitas a fusão celular usando polietilenoglicol (PEG). As células resultantes foram inseminadas em uma placa de 96 poços, e um meio contendo hipoxantina (H), aminopterina (A) e timidina (T) (meio de seleção HAT) foi adicionado a esta, e então, as células foram cultivadas por 7 a 10 dias. O sobrenadante de cultura foi coletado de 61 poços nos quais a sobrevivência de hibridomas obtidos por fusão celular foi confirmada. Então, o título de anticorpos foi avaliado por ELISA usando proteína Siglec-15-His de camundongo imobilizada, proteína Siglec-15-Fc de camundongo produzida em Exemplo 9, ou BSA como o antígeno, e hibridomas produtores de anticorpo monoclonal anti-Siglec-15 de camundongo foram triados. A partir dos resultados da triagem, 12 poços mostrando um alto título de anticorpos foram selecionados e os hibridomas contidos nos poços foram sujeitos a um procedimento de clonagem. d) Clonagem de hibridoma
[00341] Para os hibridomas assim selecionados, primeira clonagem foi realizada por um método de diluição limitante. Depois de diluição limitante, os hibridomas foram cultivados por 2 semanas, e o título de anticorpos no sobrenadante de cultura foi confirmado por ELISA usando proteína Siglec- 15-Fc de camundongo imobilizada produzida em Exemplo 9 ou BSA. Para 11 clones que foram confirmados serem clones positivos, segunda clonagem foi realizada (da mesma maneira que a primeira clonagem), de maneira 10 clones dos hibridomas produtores de anticorpo monoclonal anti-Siglec-15 de camundongo (#1A1, #3A1, #8A1, #24A1, #32A1, #34A1, #39A1, #40A1, #41B1, #61A1) foram estabelecidos no final. Casualmente, os hibridomas #32A1 e #41B1 foram depositados no International Patent Organism Depositary do National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (localizado em Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki- ken, 305-8566, Japão) em 28 de Agosto de 2008. O hibridoma #32A1 recebeu um número de depósito de FERM BP-10999 sob o nome de anti-Siglec-15 Hybridoma #32A1, e o hibridoma #41B1 recebeu um número de depósito de FERM BP-11000 sob o nome de anti-Siglec-15 Hybridoma #41B1. Exemplo 24. Preparação de anticorpo monoclonal de rato anti-Singlec-15 de camundongo a) Preparação de ascites de camundongos nus
[00342] Os hibridomas estabelecidos em Exemplo 23 foram cultivados usando meio TIL Media I (fabricado por Immuno-biological Laboratories Co., Ltd.) contendo 10% de FCS. Foi realizado subcultivo das células realizando um procedimento no qual a solução de cultura foi diluída para cerca de um quarto a cada dois a três dias usando o momento quando as células foram cultivadas a cerca de 5 x 105 células/ml como uma orientação. Cada hibridoma assim cultivado foi intraperitonealmente implantado em um camundongo nu ao qual pristano havia sido previamente administrado intraperitonealmente (0,2 ml/ camundongo) a 1 x 107 células por camundongo. Na implantação, três camundongos nus foram usados para cada um dos 10 clones de hibridomas. Depois da implantação, a ascite foi coletada no momento quando acumulação suficiente de ascites foi observada, que foi combinada com aquelas coletadas dos outros dois camundongos implantados com o mesmo hibridoma e a quantidade das ascites assim combinadas foi medida, e a ascite foi criopreservada até purificação do anticorpo. As quantidades das ascites coletadas para os respectivos hibridomas foram resumidas em Tabela 7. Tabela 7
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b) Purificação de anticorpo
[00343] A quantidade total das ascites coletadas foi sujeita a purificação de IgG usando uma coluna de Proteína G de 20 ml (fabricada por GE Healthcare, Co., Ltd.). A IgG purificada foi ensaiada para pureza por uma análise de filtração em gel (cromatografia em coluna Superdex 200), e alguns dos anticorpos foram sujeitos a concentração centrífuga de membranas. Isto é, 9 tipos de anticorpos exceto para o anticorpo #24A1 foram concentrados para cerca de um sexto a um oitavo do volume original centrifugando anticorpos a 3.000 rpm por 30 a 60 minutos a 4°C usando um concentrador centrífugo de membranas Amicon Ultra-15 (fabricado por Millipore Co., Ltd.). Subseqüentemente, para o anticorpo #24A1 e os outros 9 tipos de anticorpos concentrados, a concentração de proteína foi medida com um DC-Protein Assay kit (fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) usando albumina de soro bovino (BSA) como uma amostra padrão. Pelo procedimento mencionado acima, o anticorpo monoclonal anti-Singlec-15 de camundongo foi preparado. Exemplo 25. Avaliação de propriedade de ligação de anticorpo monoclonal de rato anti-Singlec-15 de camundongo para proteína Singlec-15 de camundongo
[00344] A propriedade de ligação do anticorpo monoclonal de rato anti- Singlec-15 de camundongo para proteína Singlec-15 de camundongo foi avaliada por um método ELISA. A proteína Siglec-15-Fc de camundongo produzida em Exemplo 9 foi diluída para 5 μg/ml com tampão carbonato de sódio 0,1 M (pH 9,5), e a solução resultante foi adicionada a uma placa de 96 poços (fabricada por Nalge Nunc International, Inc., Cat. No. 430341) a 100 μl/poço. Depois de a placa ter sido deixada em temperatura ambiente por 1 hora, a solução foi removida e um tampão de lavagem (salina tamponada com fosfato contendo Tween 20 a 0,05%) foi adicionado a 300 μl/poço e removido. Depois deste procedimento de lavagem ter sido realizado mais uma vez, salina tamponada com fosfato contendo 25% de BlockAce (fabricada por Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) foi adicionada a 200 μl/poço, e a placa foi deixada em temperatura ambiente por 1 hora, através do que bloqueio foi efetuado. O líquido foi removido, e a placa foi lavada duas vezes com 300 μl/poço de tampão de lavagem. Então, cada um dos anticorpos monoclonais de rato anti-Singlec-15 de camundongo preparados em Exemplo 24 ou IgG de controle de rato (fabricado por R&D systems, Inc.) foi diluída para uma concentração final de a partir de 1,28 a 20.000 ng/ml (série de diluição de 5 vezes) com um tampão de ELISA (salina tamponada com fosfato contendo 12,5% de BlockAce e Tween 20 a 0,05%), e a solução de anticorpo diluída resultante foi adicionada à placa a 100 μl/poço. Depois de a placa ter sido deixada em temperatura ambiente por 1 hora, o líquido foi removido, e a placa foi lavada três vezes com 300 μl/poço de tampão de lavagem. Subseqüentemente, Anticorpo de cabra anti-IgG de rato marcado com HRP (peroxidase de rábano) (fabricado por Beckman Coulter, Inc.) diluído para 1.000 vezes com o tampão de ELISA foi adicionado a 100 μl/poço, e a placa foi deixada em temperatura ambiente por 1 hora. O líquido foi removido e a placa foi lavada três vezes com 300 μl/poço de tampão de lavagem, e então, usando um kit de desenvolvimento de cor para peroxidase (fabricado por Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), a cor foi desenvolvida de acordo com o protocolo anexado ao kit. Depois de desenvolver a cor, a absorbância a 492 nm foi medida usando um leitor de microplacas (fabricado por Molecular Devices Corporation, Japão). Como um resultado, foi confirmado que todas as 10 substâncias de teste dos anticorpos monoclonais de rato anti-Singlec-15 de camundongo avaliadas se ligam à proteína Singlec-15 de camundongo de uma maneira dependente de concentração de anticorpo (Fig. 24). Por outro lado, no caso da IgG de rato de controle, ligação com a proteína Singlec-15 de camundongo não foi observada. Exemplo 26. Avaliação de atividade biológica de anticorpo monoclonal de rato anti-Singlec-15 de camundongo baseado em teste para formação de osteoclastos de camundongo
[00345] Usando todas as 10 substâncias de teste dos anticorpos monoclonais anti-Singlec-15 de camundongo produzidas em Exemplo 24, um efeito em diferenciação de osteoclastos de células não aderentes de medula óssea de camundongo foi avaliado. Células não aderentes de medula óssea de camundongo preparadas pelo método em Exemplo 16 foram preparadas a 1,5 x 105 células/ml em meio α-MEM contendo 10% de FBS e 10 ng/ml de M- CSF (fabricado por R&D systems, Inc.), e a preparação celular resultante foi inseminada em cada poço de uma placa de 96 poços em uma quantidade de 200 μl e as células foram cultivadas por 2 dias em uma incubadora de CO2. A solução de cultura velha na placa de 96 poços foi removida, e 100 μl de meio MEM-α contendo 10% de FBS ao qual RANKL humano (RANKL, fabricado por Peprotech, Inc.) e M-CSF foram adicionados para gerar concentrações finais de 20 ng/ml e 10 ng/ml, respectivamente, foi adicionado a cada poço. À solução de cultura celular, cada um dos anticorpos monoclonais de rato anti- Singlec-15 de camundongo produzidos em Exemplo 24, uma amostra obtida removendo azida de sódio de IgG de rato de controle comercialmente disponível (IgG de rato purificada, fabricada por R&D systems, Inc.) ou o anticorpo policlonal de coelho anti-Singlec-15 de camundongo (No. 3) produzido em Exemplo 14 foi adicionado em uma concentração de a partir de 32 a 1.000 ng/ml, e as células foram cultivadas por um adicional de 3 dias em uma incubadora de CO2. Depois de conclusão do cultivo, a atividade de fosfatase ácida resistente a tartarato (TRAP) dos osteoclastos formados foi medida pelo método descrito em Exemplo 17. Depois de parar a reação enzimática, a absorbância de cada poço a 405 nm foi medida, e a medida foi usada como um índice de atividade de TRAP. Os resultados são mostrados em Figs. 25 e 26. Uma inibição significativa de atividade de TRAP não foi observada no caso da IgG de rato de controle comercialmente disponível. Por outro lado, uma inibição significativa de atividade de TRAP foi observada nos casos do anticorpo #32A1 no intervalo de a partir de 32 ng/ml a 1000 ng/ml, do anticorpo #8A1 e do anticorpo No. 3 policlonal de coelho purificado por afinidade no intervalo de a partir de 63 ng/ml a 1000 ng/ml. Também nos casos do anticorpo #3A1, anticorpo #34A1, e anticorpo #39A1, uma inibição dose dependente de atividade de TRAP foi observada em uma concentração relativamente maior de 500 ng/ml ou mais. A inibição de formação de osteoclastos de camundongo pelos outros anticorpos não foi observada. A partir dos resultados acima, anticorpos que inibem fortemente formação de osteoclastos de camundongo (diferenciação e maturação de osteoclastos) foram encontrados entre os anticorpos monoclonais de rato anti-Singlec-15 de camundongo preparados. Além disto, como uma propriedade comum ao anticorpo #3A1, anticorpo #8A1, anticorpo #32A1, anticorpo #34A1, e anticorpo #39A1, uma atividade de inibir formação de osteoclastos em uma concentração de 1000 ng/ml, i.e., 1 μg/ml ou menos pode ser exemplificada. Exemplo 27. Extração de RNA total de osteoclastos maduros derivados de humanos
[00346] Quando células precursoras de osteoclastos humanos normais (Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells, adquiridas de Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. 2T-110) são cultivadas em um meio essencial mínimo para células precursoras de osteoclastos (OPBM, adquiridas de Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. PT-8201) suplementado com um conjunto de suplemento OPGM (Osteoclast SingleQuotTM Kit, adquirido de Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. PT-9501) contendo soro fetal bovino (concentração final: 10%), RANKL humano, M-CSF humano e os semelhantes, um grande número de osteoclastos multinucleados positivos para TRAP surgem depois de 3 a 7 dias. Usando este sistema de cultivo de células de acordo com o protocolo anexado ao kit, osteoclastos maduros derivados de humanos foram produzidos.
[00347] a) As células precursoras de osteoclastos humanos normais foram inseminadas em 60 poços de uma placa de 96 poços a 1 x 104 células/poço, e RANKL humano foi adicionado a esta para gerar uma concentração final de 66 ng/ml, e as células foram cultivadas por 4 dias em uma incubadora de CO2. Então, o RNA total foi extraído dos osteoclastos multinucleados usando um reagente de extração de RNA total (ISOGEN, fabricado por Nippon Gene Co., Ltd.) de acordo com o protocolo anexado ao reagente. O RNA total coletado foi armazenado a -80°C até uso.
[00348] b) As células precursoras de osteoclastos humanos normais foram inseminadas em 84 poços de cada uma das duas placas de 96 poços a 1 x 104 células/poço, e RANKL humano foi adicionado a cada poço de uma das placas para gerar uma concentração final de 53,2 ng/ml, e RANKL humano não foi adicionado à outra placa, e as células foram cultivadas por 3 dias em uma incubadora de CO2. Então, o RNA total foi extraído das células usando um reagente de extração de RNA total (ISOGEN, fabricado por Nippon Gene Co., Ltd.) de acordo com o protocolo anexado ao reagente. O RNA total coletado foi armazenado a -80°C até uso. Exemplo 28. Aquisição de seqüência de quadro de leitura aberta (ORF) para Siglec-15 humano a) Síntese de cDNA de primeira fita
[00349] Usando o RNA total produzido em a) de Exemplo 27 como um modelo, síntese de cDNA foi realizada usando iniciador oligo(dT) (fabricado por Invitrogen, Inc.) e transcriptase reversa Superscript III (fabricada por Invitrogen, Inc.). O procedimento foi realizado de acordo com o protocolo anexado à enzima. b) Reação de PCR
[00350] Oligonucleotídeos tendo as seqüências de: 5’-attaagcttc accATGGAAA AGTCCATCTG GCTGC-3’ (hSiglec-15-HindIII kozak-F: SEQ ID NO: 29 na Listagem de Seqüências); e 5’-agtggatccT CACGGTGAGC ACATGGTGGC-3’ (hSiglec-15-BamHI-R: SEQ ID NO: 30 na Listagem de Seqüências) como iniciadores para amplificar o cDNA de ORF para Siglec-15 humano por PCR foram sintetizados de acordo com um procedimento comum. Este PCR foi realizado usando esta combinação de iniciadores e o cDNA produzido em a) de acordo com um procedimento comum. A solução de reação de PCR resultante foi purificada usando PureLink PCR Purification Kit (fabricado por Invitrogen, Inc.). c) Clonagem em vetor pcDNA3.1(+)
[00351] A solução de reação de PCR purificada obtida em b) e vetor pcDNA3.1(+) (fabricado por Invitrogen, Inc.) foram tratados com enzimas de restrição (BamHI, HindIII), seguido por remoção e purificação em gel, e então, uma reação de ligase foi realizada de acordo com um procedimento comum. ESCHERICHIA COLI TOP10 foi transformada, e PCR de colônia foi realizado para os clones resistentes a drogas resultantes. A seqüência de nucleotídeos inteira do cDNA de ORF inserida em um plasmídeo foi analisada usando um seqüenciador de DNA para um clone no qual um produto amplificado com um tamanho predito foi obtido, e como um resultado, foi encontrado ser a seqüência representada por SEQ ID NO: 1 na Listagem de Seqüências. Esta seqüência de nucleotídeos foi a mesma que a região de codificação de ORF da seqüência registrada em banco de dados NCBI GeneBank como “Siglec-15 humano” (número de acesso: NM_213602), e, além disto, a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 2 na Listagem de Seqüências) codificada pela seqüência de nucleotídeos foi 100% idêntica à seqüência de aminoácidos de Siglec-15 humano. Exemplo 29. Expressão de mRNA para Siglec-15 humano acompanhando diferenciação de osteoclastos humanos (análise de PCR em tempo real)
[00352] A 1 μg do RNA total produzido em b) de Exemplo 27, 1 μl de 1 U/μl de DNase I e 1 μl de 10 x tampão de DNase I (fabricado por Invitrogen, Inc.) foram adicionados, e então, o volume final foi levado a 10 μl com H2O. Depois de uma reação ter sido deixada prosseguir em temperatura ambiente por 15 minutos, 1 μl de 25 mM de EDTA foi adicionado a esta e a mistura resultante foi aquecida a 65°C por 10 minutos. Desta solução, foi tirada uma alíquota de 8 μl, e 1 μl de 50 μM de iniciador oligo(dT)20 e 1 μl de 10 mM de dNTPs foram adicionados a esta, e a mistura resultante foi aquecida a 65°C por 5 minutos e então incubada em gelo. A esta solução, 2 μl de 10 x tampão RT (fabricado por Invitrogen, Inc.), 4 μl de 25 mM de MgCl2, 2 μl de 0,1 M de ditiotreitol, 1 μl de inibidor de RNase (RNaseOUT, 40 U/μl, fabricado por Invitrogen, Inc.), e 1 μl de transcriptase reversa Superscript III (200 U/μl, fabricada por Invitrogen, Inc.) foram adicionados e o volume total foi levado a 20 μl. Depois de uma reação ter sido deixada prosseguir a 50°C por 50 minutos, a mistura foi aquecida a 85°C por 5 minutos e então incubada em gelo.
[00353] Usando o cDNA fita simples assim produzido, PCR em tempo real foi realizado usando uma combinação dos seguintes iniciadores e sondas marcadas fluorescentemente (sonda TaqMan, fabricada por Applied Biosystems, Inc.). Condições para PCR em tempo real: Iniciadores para amplificar catepsina K humana: 5’-ccgcagtaat gacacccttt-3’ (TqM-hcatK-F: SEQ ID NO: 31 na Listagem de Seqüências) e 5’-aaggcattgg tcatgtagcc-3’ (TqM-hcatK-R: SEQ ID NO: 32 na Listagem de Seqüências) Sonda TaqMan para detectar catepsina K humana: 5’-Fam-tcagggtcag tgtggttcct gttgggct-TAMRA-3’ (TqM-hcatK- probe: SEQ ID NO: 33 na Listagem de Seqüências) Iniciadores para amplificar TRAP humano: 5’-ctgtcctggc tcaagaaaca-3’ (TqM-hTRAP-F: SEQ ID NO: 34 na Listagem de Seqüências) e 5’-ccatagtgga agcgcagata-3’ (TqM-hTRAP-R: SEQ ID NO: 35 na Listagem de Seqüências) Sonda TaqMan para detectar TRAP humano: 5’-Fam-tgagaatggc gtgggctacg tgctgagt-TAMRA-3’ (TqM- hTRAP-probe: SEQ ID NO: 36 na Listagem de Seqüências) Iniciadores para amplificar Siglec-15 humano: 5’-cagccaccaa catccatttc-3’ (TqM-hSiglec-15-F: SEQ ID NO: 37 na Listagem de Seqüências) e 5’-cgctcaagct aatgcgtgta-3’ (TqM-hSiglec-15-R: SEQ ID NO: 38 na Listagem de Seqüências) Sonda TaqMan para detectar Siglec-15 humano 5’-Fam-aagaacaaag gccagtgcga ggcttggc-TAMRA-3’ (TqM- hSiglec-15-probe: SEQ ID NO: 39 na Listagem de Seqüências) Iniciadores para amplificar proteína ribossômica L32 humana: 5’-gagatcgctc acaatgtttc ct-3’ (TqM-hL32-F: SEQ ID NO: 40 na Listagem de Seqüências) e 5’-gatgccagat ggcagtttttac-3’ (TqM-hL32-R: SEQ ID NO: 41 na Listagem de Seqüências) Sonda TaqMan para detectar proteína ribossômica L32 humana: 5’-Fam-accgcaaagc catcgtggaa agagctg-TAMRA-3’ (TqM-hL32- probe: SEQ ID NO: 42 na Listagem de Seqüências)
[00354] Uma análise de PCR em tempo real foi realizada usando um sistema de PCR em tempo real (ABI Prism 7700 Sequence Detector, fabricado por Perkin Elmer Japan Applied Biosystems Division) nas seguintes condições. Na reação, TaqMan Universal PCR Master Mix (fabricado por Applied Biosystems, Inc.) foi usado. Primeiro, água destilada foi adicionada a 25 pmol de cada iniciador, 8 ng de cDNA de fita simples e 10 pmol de sonda TaqMan para levar o volume final a 25 μl, e então, 25 μl de TaqMan Universal PCR Master Mix foi adicionado a estes, de maneira que 50 μl de uma solução de reação foi preparado. Esta solução de reação foi aquecida a 50°C por 2 minutos e então aquecida a 95°C por 10 minutos, e depois sujeita a 40 ciclos de temperatura de “95°C por 0,25 minutos e 60°C por 1 minuto”, de maneira que uma análise de PCR em tempo real foi realizada. Casualmente, o nível de expressão de mRNA para cada gene foi corrigido pelo nível de expressão de mRNA para proteína ribossômica L32.
[00355] Como um resultado, foi revelado que o nível de expressão do gene de Siglec-15 aumentou significativamente no caso onde diferenciação de osteoclastos humanos foi induzida adicionando RANKL da mesma maneira que genes de catepsina K e TRAP que são conhecidos como moléculas marcadoras para osteoclastos (Fig. 27). Exemplo 30. Produção de construção de expressão de proteína Siglec-15 humana solúvel
[00356] Uma seqüência parcial de ácidos nucléicos codificando o domínio extracelular de proteína Siglec-15 humana é representada por SEQ ID NO: 43 na Listagem de Seqüências e a seqüência de aminoácidos desta é representada por SEQ ID NO: 44 na Listagem de Seqüências. Utilizando uma tal seqüência parcial, proteína Siglec-15 humana solúvel pode ser produzida em um sobrenadante de cultura de uma célula animal ou os semelhantes. a) Amplificação de gene de Siglec-15 humana solúvel por PCR
[00357] Oligonucleotídeos tendo as seqüências de: 5’-ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt caccATGGAA AAGTCCATCT GGCTGC-3’ (hSiglec- 15-ECD-F: SEQ ID NO: 45 na Listagem de Seqüências); e 5’-ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc CCCGCTGGCG CCATGGAAGC GG-3’ (hSiglec-15- ECD-R: SEQ ID NO: 46 na Listagem de Seqüências) como iniciadores para amplificar o cDNA de domínio extracelular de Siglec-15 humano por PCR foram sintetizados de acordo com um procedimento comum. Casualmente, estes iniciadores foram projetados, como iniciadores de amplificação para produzir um clone de entrada do gateway, de forma que uma seqüência de attB1 é adicionada a hSiglec-15-ECD-F e uma seqüência de attB2 é adicionada a hSiglec-15-ECD-R. O PCR foi realizado usando esta combinação de iniciadores e o Siglec-15 humano/plasmídeo pcDNA3.1(+) produzido em Exemplo 28 como um modelo de acordo com um procedimento comum. A solução de reação de PCR resultante foi purificada usando PureLink PCR Purification Kit (fabricado por Invitrogen, Inc.). b) Produção de clone de entrada por reação BP de Gateway
[00358] Um clone de entrada no qual o cDNA de domínio extracelular de Siglec-15 humano foi integrado pela tecnologia Gateway (Invitrogen, Inc.) empregando um sistema de recombinação sítio específico de fago lambda foi produzido no método seguinte. Primeiro, uma reação BP usando BP Clonase foi realizada entre o produto de PCR tendo uma seqüência de attB em ambas as extremidades produzido em a) e pDNOR221 (fabricado por Invitrogen, Inc.) que é um vetor doador tendo uma seqüência de attP. Usando esta solução de reação, ESCHERICHIA COLI TOP10 foi transformada, PCR de colônia foi realizado para clones resistentes a droga, e o tamanho de insertos foi confirmado. Então, para um clone confirmado ter um inserto com um tamanho correto, uma análise de seqüências da seqüência de DNA total do inserto foi realizada. Como um resultado, um clone de entrada que é completamente idêntico à seqüência de ácidos nucléicos alvo (SEQ ID NO: 43 na Listagem de Seqüências) codificando o domínio extracelular de proteína Siglec-15 humana foi obtido. c) Produção de clone de expressão por reação LR de Gateway
[00359] Um clone de expressão no qual o cDNA de domínio extracelular de Siglec-15 humano foi integrado pela tecnologia Gateway (Invitrogen, Inc.) empregando um sistema de recombinação sítio específico de fago lambda foi produzido pelo método seguinte. O clone de entrada produzido em b) contém um inserto tendo uma seqüência de attL em ambas as extremidades. Uma reação LR usando LR Clonase foi realizada entre este clone de entrada e dois tipos de vetores de destinação tendo uma seqüência de attR. Casualmente, como os vetores de destinação, dois tipos de vetores de destinação: pDONM projetado de forma que uma cauda de epítopo V5 e uma cauda de 6 x His são adicionadas ao término C do inserto; e phIgFc projetado de forma que uma cauda de Fc humano é adicionada ao término C do inserto foram usados. Usando a solução de reação obtida pela reação LR, ESCHERICHIA COLI TOP10 foi transformada, e uma análise de seqüências foi realizada para os clones resistentes a drogas resultantes para confirmar se recombinação correta ocorreu.
[00360] Como um resultado da análise de seqüências, clones de expressão (Siglec-15 humano solúvel/pDONM e Siglec-15 humano solúvel/phIgFc) nos quais recombinação correta ocorreu foram obtidos tanto para pDONM como phIgFc, respectivamente. Transfectando o Siglec-15 humano solúvel/pDONM em uma célula animal ou os semelhantes, mRNA tendo a seqüência de base representada por SEQ ID NO: 47 na Listagem de Seqüências é transcrito e traduzido em uma proteína (Siglec-15-His humano) tendo a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 48 na Listagem de Seqüências. Além disto, transfectando o Siglec-15 humano solúvel/phIgFc em uma célula animal ou os semelhantes, mRNA tendo a seqüência de base representada por SEQ ID NO: 49 na Listagem de Seqüências é transcrito e traduzido em uma proteína (Siglec-15-Fc humano) tendo a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 50 na Listagem de Seqüências. Exemplo 31. Preparação em larga escala de solução de cultura contendo proteína Siglec-15 humana solúvel usando células 293-F a) Preparação de solução de cultura contendo Siglec-15-His humano
[00361] O Siglec-15 humano solúvel/pDONM obtido em Exemplo 30 foi preparado em uma quantidade de cerca de 25 mg. Casualmente, na purificação de um plasmídeo de ESCHERICHIA COLI cultivada em uma larga escala, Invitrogen PureLink HiPure Plasmid Gigaprep Kit (fabricado por Invitrogen, Inc.) foi usado. O plasmídeo assim preparado foi misturado com Opti-MEM (fabricado por Invitrogen, Inc.), e 50 ml de um reagente de transfecção 293fectin (fabricado por Invitrogen, Inc.) foi adicionado a esta, e a mistura resultante foi incubada em temperatura ambiente por 20 minutos. Esta mistura foi adicionada a células FreeStyle 293-F (fabricadas por Invitrogen, Inc.) cultivadas em meio de expressão de FreeStyle 293 (fabricado por Invitrogen, Inc.) contendo 1% de penicilina-estreptomicina de forma que a densidade celular atingiu 1,0 a 3,4 x 106 células/ml usando um aparelho de bioprocessamento de cultura de 25 L (WAVE Bioreactor). Depois das células terem sido sujeitas a cultura agitada (30 rotações/min) em uma concentração de CO2 de a partir de 6 a 12% por 96 horas (4 dias) a 37°C, a solução de cultura foi coletada e centrifugada para preparar um sobrenadante de cultura. É considerado que no sobrenadante de cultura assim preparado, uma proteína na qual uma cauda de epítopo V5 e uma cauda de 6 x His foram adicionadas ao lado C-terminal do domínio extracelular de Siglec-15 humano (Siglec-15- His humano) é expressa. b) Preparação de solução de cultura contendo Siglec-15-Fc humano
[00362] O Siglec-15 humano solúvel/phIgFc obtido em Exemplo 30 foi preparado em uma quantidade de cerca de 5 mg. Casualmente, na purificação de plasmídeo de ESCHERICHIA COLI cultivada em uma larga escala, Invitrogen PureLink HiPure Plasmid Gigaprep Kit (fabricado por Invitrogen, Inc.) foi usado. O plasmídeo assim preparado foi misturado com Opti-MEM (fabricado por Invitrogen, Inc.), seguido por esterilização em filtro. Então, 10 ml de um reagente de transfecção 293fectin (fabricado por Invitrogen, Inc.) foi adicionado a esta, e a mistura resultante foi incubada em temperatura ambiente por 20 minutos. Esta mistura foi adicionada a células FreeStyle 293- F (fabricadas por Invitrogen, Inc.) cultivadas em frascos Erlenmeyer de forma que a densidade celular atingiu 1,0 a 3,0 x 106 células/ml x 5 L (1 L/frasco x 5 frascos) em meio de expressão de FreeStyle 293 (fabricado por Invitrogen, Inc.). Depois das células terem sido sujeitas uma cultura agitada (125 rotações/min) em uma concentração de CO2 de 8,0% por 96 horas (4 dias) a 37°C, a solução de cultura foi coletada e centrifugada para preparar um sobrenadante de cultura. É considerado que no sobrenadante de cultura assim preparado, uma proteína na qual uma cauda de Fc humano foi adicionada ao lado C-terminal do domínio extracelular de Siglec-15 humano (Siglec-15-Fc humano) é expressa. Exemplo 32. Purificação de proteína Siglec-15 humana solúvel a) Purificação de Siglec-15-His humana solúvel a-i) Cromatografia em coluna HisTrap HP
[00363] A 12 L da solução de cultura de células 293F expressando Siglec- 15-His humano preparadas em a) de Exemplo 31, 1350 mL de 10 x tampão (500 mM de Tris, 1,5 M de NaCl, 200 mM de imidazol, pH 8,0) foi adicionado, e a mistura resultante foi agitada bem e filtrada através de um filtro MilliPak-60 (fabricado por Millipore Co., Ltd.). Esta solução de cultura foi aplicada a uma coluna Ni-Sepharose HP de 100 ml (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que havia sido previamente lavada com água pura (água Milli-Q) em uma vazão de 10 ml/min. Depois de a coluna ter sido lavada com 400 ml de tampão Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) contendo 300 mM de NaCl em uma vazão de 8 mL/min, uma proteína adsorvida na coluna foi eluída com 200 ml de tampão Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) contendo 300 mM de NaCl e 500 mM de imidazol em uma vazão de 2,5 ml/min, e o eluato foi fracionado em tubos mini-sorp (fabricados por Nunc, Inc.). A fim de prevenir precipitação da proteína, 8 ml de uma solução de NaCl 5 M foi adicionado a cerca de 40 ml de uma fração contendo a proteína eluída, seguido por agitação, e então, a mistura resultante foi concentrada para cerca de 20 ml com um concentrador centrífugo de membranas Amicon Ultra-15 (fabricado por Millipore Co., Ltd.). Matéria insolúvel gerada durante a concentração foi removida por centrifugação a 3000 rpm por 30 minutos a 4°C, e 2,5 ml do sobrenadante resultante foi aplicado a uma coluna de dessalinização PD-10 (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que foi previamente equilibrada com salina tamponada com fosfato contendo 1 M de NaCl (N-PBS), seguido por eluição com N-PBS, de maneira que 3,5 ml de uma amostra cujo solvente foi substituído por N-PBS foi obtido. Este procedimento foi realizado mais 7 vezes repetindo-o, e cerca de 28 ml de uma solução de Siglec-15-His humano parcialmente purificado foi obtido. a-ii) Cromatografia em coluna Resource Q
[00364] 12 ml da amostra que foi purificada por cromatografia em coluna Ni-Sepharose HP e cujo solvente foi substituído por N-PBS foi dialisado durante a noite a 4°C contra tampão Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) contendo 0,1% de CHAPS (1 L, três vezes) e o dialisado resultante foi centrifugado a 3.000 rpm por 30 minutos a 4°C, e o precipitado foi removido. Depois de o sobrenadante resultante ter sido filtrado através de um filtro Millex-GV (fabricado por Millipore Co., Ltd.), o filtrado foi aplicado a uma coluna Resource Q de 6 ml (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que foi previamente equilibrada com tampão Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) contendo 0,1% de CHAPS em uma vazão de 1 ml/min. Depois, a coluna foi lavada com este tampão em uma vazão de 1 ml/min e uma fração de proteína que não foi adsorvida na coluna foi coletada. Uma proteína adsorvida na coluna foi eluída com tampão Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) contendo 0,1% de CHAPS e 1 M de NaCl em uma vazão de 1 ml/min. Depois de 26,5 ml da fração que não foi adsorvida na coluna ter sido concentrado para 3,0 ml com um concentrador centrífugo de membranas Amicon Ultra-15 (fabricado por Millipore Co., Ltd.), o concentrado foi centrifugado a 3.000 rpm por 10 minutos a 4°C e o precipitado foi removido. 2,5 ml do sobrenadante resultante foi aplicado a uma coluna de dessalinização PD-10 (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que havia sido previamente equilibrada com salina tamponada com fosfato contendo 50 mM de cloridrato de arginina (pH 7,0, A-PBS), seguido por eluição com A-PBS, de maneira que 3,5 ml de uma amostra cujo solvente foi substituído por A-PBS foi obtido. O cloridrato de arginina no solvente da amostra preparada foi adicionado para prevenir Siglec-15-His humano solúvel de precipitar. Depois de centrifugação o sobrenadante foi criopreservado a - 80°C até uso. O procedimento de purificação mencionado acima (Cromatografia em coluna Resource Q) foi realizado duas vezes repetindo-o. a-iii) Detecção e ensaio de pureza de Siglec-15-His humano purificado
[00365] Usando uma amostra preparada pelo procedimento de purificação mencionado acima (cromatografia em coluna Ni-Sepharose HP e cromatografia em coluna Resource Q), eletroforese em SDS-poliacrilamida em condições redutoras e coloração com prata foram realizadas. Isto é, a 5 μl de cada uma das amostras purificadas pelas respectivas etapas de purificação, uma quantidade equivalente de uma solução de tratamento com SDS foi adicionada, e a mistura resultante foi termicamente tratada a 95°C por 10 minutos. 0,3 μl de cada uma das amostras tratadas termicamente foi usado para eletroforese em SDS-poliacrilamida. O procedimento de eletroforese foi realizado da mesma maneira que o método descrito em Exemplo 8 exceto que Rainbow Molecular Weight Markers (fabricados por Amersham Biosciences, Inc.) foram usados como os marcadores de peso molecular. Depois de conclusão da eletroforese, coloração com prata foi realizada usando PhastGel Silver Kit (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.) e PhastSystem. Os resultados são mostrados em Fig. 28. Foi mostrado que uma proteína tendo um peso molecular de cerca de 35 kDa (Siglec-15-His humano) foi eficientemente purificada e concentrada na fração de proteína que não foi adsorvida na coluna Resource Q. a-iv) Medição de concentração de proteína de Siglec-15-His humano purificado
[00366] Para o Siglec-15-His humano purificado (a fração de proteína que não foi adsorvida na coluna Resource Q), a concentração de proteína foi medida com um DC-Protein Assay kit (fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) usando albumina de soro bovino como uma amostra padrão. Realizando o procedimento de purificação duas vezes, um total de 1,66 mg de Siglec-15- His humano purificado foi obtido. b) Purificação de Siglec-15-Fc humano solúvel b-i) Cromatografia em coluna HiTrap Protein A
[00367] 1,5 L da solução de cultura de células 293F expressando Siglec- 15-Fc humano preparadas em b) de Exemplo 31 foi filtrado através de um filtro Sterivex-GV (fabricado por Millipore Co., Ltd.), e então, o filtrado foi aplicado a uma coluna HiTrap Protein A de 5 ml (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que foi previamente equilibrada com PBS de Dulbecco (D- PBS, fabricado por Invitrogen, Inc.) em uma vazão de 5 ml/min. Depois de a coluna ter sido lavada com 70 ml de D-PBS em uma vazão de 5 ml/min, uma proteína adsorvida na coluna foi eluída com 24 ml de tampão citrato de sódio 0,1 M (pH 3,0) em uma vazão de 1,2 ml/min. O eluato foi fracionado a 1,2 ml por fração em tubos mini-sorp (fabricados por Nunc, Inc.), e imediatamente depois, 0,31 ml de Tris 1 M foi adicionado a estes para neutralizar o eluato. Uma alíquota de 2,5 ml de uma solução (cerca de 7,5 ml) obtida combinando as frações de proteínas eluídas (frações 5 a 9) foi aplicada a uma coluna de dessalinização PD-10 (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que havia sido previamente equilibrada com salina tamponada com fosfato contendo 50 mM de cloridrato de arginina (pH 7,0, A-PBS), seguido por eluição com A- PBS, de maneira que 3,5 ml de uma amostra cujo solvente foi substituído por A-PBS foi obtido. Este procedimento foi realizado duas vezes repetindo-o. O cloridrato de arginina no solvente foi adicionado para prevenir Siglec-15-Fc humano solúvel de precipitar. 2,5 ml da solução remanescente das frações de proteínas eluídas (frações 5 a 9) foi aplicado a uma coluna de dessalinização PD-10 (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que havia sido previamente equilibrada com salina tamponada com fosfato contendo 1 M de NaCl (pH 6,7, N-PBS), seguido por eluição com N-PBS, de maneira que 3,5 ml de uma amostra cujo solvente foi substituído por N-PBS foi obtido. NaCl no solvente na amostra preparada foi adicionado para prevenir Siglec-15-Fc humano solúvel de precipitar sem adicionar um composto contendo grupo amino tal como arginina. A amostra de Siglec-15-Fc humano cujo solvente foi substituído por N-PBS foi usada apenas quando uma coluna imobilizada foi preparada no seguinte c) de Exemplo 34, e em todos os outros Exemplos, Siglec-15-Fc humano cujo solvente foi substituído por A-PBS foi usado. As amostras preparadas pelo procedimento mencionado acima foram criopreservadas a -80°C até uso. b-ii) Detecção e ensaio de pureza de Siglec-15-Fc humano purificado
[00368] Usando as amostras preparadas pelo procedimento de purificação mencionado acima, eletroforese em SDS-poliacrilamida em condições redutoras e coloração com prata foram realizadas. Isto é, a 5 μl de cada uma das amostras purificadas pelas respectivas etapas de purificação, uma quantidade equivalente de uma solução de tratamento com SDS foi adicionada, e a mistura resultante foi aquecida a 95°C por 10 minutos. 0,3 μl de uma amostra obtida diluindo cada uma das amostras tratadas termicamente para 1/100 ou 1/300 com uma meia concentração da solução de tratamento com SDS foi usado para eletroforese em SDS-poliacrilamida. A eletroforese e coloração com prata foram realizadas da mesma maneira que o ensaio de pureza de Siglec-15-His humano descrito em a-iii). Os resultados são mostrados em Fig. 29. Foi mostrado que uma proteína tendo um peso molecular de cerca de 55 kDa (Siglec-15-Fc humano) foi eficientemente purificada e concentrada na fração de proteína que foi eluída da coluna HiTrap Protein A. b-iii) Medição de concentração de proteína de Siglec-15-Fc humano purificado
[00369] Para o Siglec-15-Fc humano purificado (a fração de proteína eluída da coluna de dessalinização PD-10), a concentração de proteína foi medida com um DC-Protein Assay kit (fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) usando albumina de soro bovino como uma amostra padrão. Como mostrado em Tabela 8, um total de 25,2 mg de Siglec-15-Fc humano purificado foi obtido realizando o procedimento de purificação duas vezes. Tabela 8
Figure img0009
Exemplo 33. Produção de anticorpo policlonal de coelho anti-Siglec-15 humano (imunização de coelho) a) Preparação de antígeno
[00370] A proteína Siglec-15-Fc humana produzida em b) de Exemplo 32 foi preparada a 100 μg/0,5 ml, e uma quantidade equivalente de um adjuvante foi adicionada a esta e uma emulsão foi produzida usando uma seringa de vidro. Como o adjuvante, adjuvante completo de Freund (FCA, Fabricado por Difco Laboratories, Inc.) foi usado apenas para a primeira imunização, e adjuvante incompleto de Freund (FICA, Fabricado por Difco Laboratories, Inc.) foi usado para a segunda e subseqüentes imunizações. b) Imunização de coelho
[00371] Três coelhos (coelhos brancos japoneses fêmeas com um peso corporal de 3 kg) foram usados como animais imunizados. Casualmente, sangue foi coletado antes de imunização, e 10 ml de soro pré-imune foi obtido por coelho. A emulsão obtida em a) foi injetada subcutaneamente e intradermicamente usando uma agulha de injeção de 27 G de forma que a quantidade do antígeno foi de 50 μg por coelho. Imunização foi realizada um total de 8 vezes a cada 14 dias depois da primeira imunização. O sangue inteiro foi coletado depois de 7 dias da data da oitava imunização, e 74,4 a 74,9 ml de anti-soro foi obtido por coelho. Os títulos de anticorpos no soro pré-imune e no anti-soro foram confirmados por um método ELISA usando um antígeno imobilizado. Como um resultado, um aumento em título de anticorpos no anti-soro foi confirmado em todos os três coelhos. O anti-soro foi armazenado a -20°C até uso. Exemplo 34. Purificação de anticorpo policlonal de coelho anti-Siglec-15 humano a) Cromatografia em coluna HiTrap Protein A
[00372] A 40 ml de cada um dos três lotes de anti-soro de coelho preparados em b) de Exemplo 33, 40 ml de PBS de Dulbecco (D-PBS, fabricado por Invitrogen, Inc.) foi adicionado e misturado, e a mistura resultante foi filtrada através de um filtro Sterivex-GV (fabricado por Millipore Co., Ltd.). Então, o filtrado foi aplicado a uma coluna que compreendia duas colunas HiTrap Protein A de 5 ml (as duas colunas foram conectadas em série, fabricadas por Amersham Biosciences, Inc.) e havia sido previamente equilibrada com D-PBS em uma vazão de 2 ml/min. Depois de a coluna ter sido lavada com 35 ml de D-PBS em uma vazão de 1 ml/min, uma proteína adsorvida na coluna foi eluída com 50 ml de tampão citrato de sódio 0,1 M (pH 3,0) em uma vazão de 1 ml/min. O eluato foi fracionado a 2,5 ml por fração em tubos mini-sorp (fabricados por Nunc, Inc.), e imediatamente depois, 0,6 ml de Tris 1 M foi adicionado a estes para neutralizar o eluato. Depois de cerca de 15,5 ml de uma solução obtida combinando as frações (frações 3 a 7) contendo a proteína eluída ter sido concentrado para 5 ml com um concentrador centrífugo de membranas Amicon Ultra-15 (fabricado por Millipore Co., Ltd.), uma alíquota de 2,5 ml do concentrado foi aplicado a uma coluna de dessalinização PD-10 (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que havia sido previamente equilibrada com Otsuka Physiological Saline for Injection (TO-SS) contendo Tween 20 a 0,01%, seguido por eluição com TO-SS, de maneira que 3,5 ml de uma amostra cujo solvente foi substituído por TO-SS foi obtido. Este procedimento foi realizado duas vezes repetindoo. As amostras assim preparadas foram criopreservadas a -80°C até uso. b) Purificação de IgG de coelho pré-imune
[00373] Sangue havia sido previamente coletado dos três coelhos usados em Exemplo 33, antes de iniciação de imunização com Siglec-15-Fc humano, e soro pré-imune foi preparado. Depois de alíquotas de 5 ml de cada uma destas amostras de soro terem sido misturadas umas com as outras, 15 ml de D-PBS foi adicionado a estas, e a mistura resultante foi filtrada através de um filtro Millex-GV (fabricado por Millipore Co., Ltd.). Então, a amostra de soro resultante foi aplicada a uma coluna que compreendia duas colunas HiTrap Protein A de 5 ml (fabricadas por Amersham Biosciences, Inc.) e havia sido previamente equilibrada com D-PBS em uma vazão de 1 ml/min. Depois de a coluna ter sido lavada com 35 ml de D-PBS em uma vazão de 1 ml/min, uma proteína adsorvida na coluna foi eluída com 50 ml de tampão citrato de sódio 0,1 M (pH 3,0) em uma vazão de 1 ml/min. O eluato foi fracionado a 2,5 ml por fração em tubos mini-sorp (fabricados por Nunc, Inc.), e imediatamente depois, 0,6 ml de Tris 1 M foi adicionado a estes para neutralizar o eluato. Depois de uma solução obtida combinando as frações (frações 4 a 6) contendo a proteína eluída ter sido concentrada para 2,5 ml com um concentrador centrífugo de membranas Amicon Ultra-15 (fabricado por Millipore Co., Ltd.), o concentrado foi aplicado a uma coluna de dessalinização PD-10 (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que havia sido previamente equilibrada com Otsuka Physiological Saline for Injection (TO-SS) contendo Tween 20 a 0,01%, seguido por eluição com TO-SS, de maneira que 3,5 ml de uma amostra cujo solvente foi substituído por TO-SS foi obtido. A amostra de IgG de coelho pré-imune assim purificada foi sujeita a eletroforese em poliacrilamida e coloração com prata pelo método descrito em Exemplo 8 para confirmar que a proteína IgG foi suficientemente purificada, e então, a concentração de proteína foi medida. A amostra de IgG de coelho pré-imune assim purificada foi criopreservada a -80°C até uso. c) Preparação de coluna de afinidade tendo Siglec-15-Fc humano imobilizado nesta
[00374] 3 ml do Siglec-15-Fc humano purificado cujo solvente foi substituído por N-PBS produzido em b) de Exemplo 32 (um total de 7,8 mg de proteína) foi concentrado para 2 ml usando um concentrador centrífugo de membranas Amicon Ultra-4 (fabricado por Millipore Co., Ltd.). Ao concentrado, um tampão de acoplamento (0,2 M de NaHCO3, 0,5 M de NaCl, pH 8,3) foi adicionado para levar o volume final para 2,5 ml, e o solvente foi substituído por 3,5 ml do tampão de acoplamento usando uma coluna de dessalinização PD-10. Depois de isopropanol em uma coluna HiTrap ativada por NHS (1 ml, fabricado por Amersham Biosciences, Inc.) ter sido substituído por 1 mM de ácido clorídrico, 3 ml do Siglec-15-Fc humano preparado foi injetado na coluna usando uma seringa, e o líquido foi alternadamente injetado nesta usando outra seringa conectada à saída da coluna para efetuar uma reação de acoplamento. Depois de a reação ter sido deixada prosseguir em temperatura ambiente por 30 minutos, a fim de inativar grupos ativos em excesso, 6 ml de um tampão de bloqueio (um tampão etanolamina contendo 0,5 M de NaCl, pH 8,3), 6 ml de um tampão de lavagem (um tampão acetato de sódio contendo 0,5 M de NaCl, pH 4,0), e 6 ml do tampão de bloqueio foram injetados em seqüência de acordo com o protocolo de Amersham Biosciences, Inc., e então, a coluna foi deixada em temperatura ambiente por 30 minutos. Depois, 6 ml do tampão de lavagem, 6 ml do tampão de bloqueio, e 6 ml do tampão de lavagem foram injetados na coluna em seqüência novamente, e finalmente, o tampão na coluna foi substituído por tampão Tris-HCl 10 mM (pH 7,2) contendo 0,15 M de NaCl. Esta coluna foi armazenada a 4°C até uso. d) Purificação de anticorpo policlonal de coelho anti-Siglec-15 humano com coluna de afinidade d-i) Cromatografia em coluna de afinidade
[00375] Depois que 7 ml de cada um dos anticorpos policlonais anti- Siglec-15 humanos purificados (Nos. 1, 2 e 3) preparados em a) foi filtrado através de um filtro Millex-GV (fabricado por Millipore Co., Ltd.), o filtrado resultante foi aplicado à coluna produzida em c) que tinha o Siglec-15-Fc humano imobilizado nesta e havia sido previamente equilibrada com o Apply Buffer em uma vazão de 0,25 ml/min. Depois de a coluna ter sido lavada com 5 ml do Apply Buffer em uma vazão de 0,25 ml/min, uma proteína adsorvida na coluna foi eluída com 5 ml de tampão cloridrato de glicina 0,1 M (pH 2,7) contendo 0,5 M de NaCl em uma vazão de 0,25 ml/min. Os cromatogramas dos anticorpos policlonais anti-Siglec-15 humanos (Nos. 1, 2 e 3) purificados com a coluna de afinidade são mostrados em Fig. 30. O eluato foi fracionado a 0,5 ml por fração em tubos mini-sorp (fabricados por Nunc, Inc.), e imediatamente depois, 16 μl de Tris 1 M foi adicionado a estes para neutralizar o eluato. Cerca de 2,5 ml de uma solução obtida combinando as frações de proteína IgG (frações 3 a 7) eluídas com o tampão cloridrato de glicina para cada anticorpo foi aplicado a uma coluna de dessalinização PD- 10 (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que havia sido previamente equilibrada com solução salina balanceada tamponada com fosfato de Dulbecco contendo Tween 20 a 0,01% (T-PBS), seguido por eluição com T- PBS, de maneira que 3,5 ml de uma amostra cujo solvente foi substituído por T-PBS foi obtido. As amostras assim preparadas foram criopreservadas a - 80°C até uso. d-ii) Medição de concentração de proteína de anticorpo policlonal de coelho anti-Siglec-15 humano purificado por afinidade
[00376] Para as amostras de anticorpo policlonal de coelho anti-Siglec-15 humano purificado (as frações de proteínas eluídas a partir da coluna de dessalinização PD-10), a concentração de proteína foi medida com um DC- Protein Assay kit (fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) usando IgG bovina como uma amostra padrão. Como mostrado em Tabela 9, cerca de 9,1 a 11,9 mg do anticorpo policlonal anti-Siglec-15 humano purificado por afinidade podem ser preparados em cada um dos lotes Nos. 1 a 3. Tabela 9
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Exemplo 35. Efeito de adição de anticorpo policlonal de coelho anti-Siglec-15 humano em fusão celular de células precursoras de osteoclastos humanos normais (Coloração com TRAP)
[00377] Células precursoras de osteoclastos humanos normais (Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells, adquiridas de Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. 2T-110) foram inseminadas em uma placa de 96 poços a 1 x 104 células/poço de acordo com o protocolo anexado às células. Como o meio, um meio essencial mínimo para células precursoras de osteoclastos (OPBM, adquirido de Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. PT-8201) suplementado com um conjunto de suplemento OPGM (Osteoclast SingleQuotTM Kit, adquirido de Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. PT-9501) contendo soro fetal bovino (concentração final: 10%), RANKL humano (concentração final: 69 ng/ml), M-CSF humano (concentração final: 33 ng/ml) e os semelhantes foi usado. Ao sobrenadante de cultura resultante, o anticorpo No. 2 anti-Singlec-15 humano purificado por afinidade produzido em d) de Exemplo 34 em uma concentração final de 3 ou 30 μg/ml, ou a IgG de coelho pré-imune produzida em b) de Exemplo 34 em uma concentração final de 30 μg/ml foi adicionado, e as células foram cultivadas por 5 dias em uma incubadora de CO2. Depois do cultivo, o sobrenadante foi removido, e formalina neutra a 10% foi adicionada para fixar as células. Depois de fixar as células, as células foram lavadas duas vezes com água destilada, e uma solução de coloração com TRAP (0,27 mM de naftol AS-MX fosfato (fabricado por Sigma Co., Ltd.), 1,6 mM de fast red violet LB salt (fabricado por Sigma Co., Ltd.), 1% de dimetilformamida, 50 mM de tartarato de sódio, tampão acetato de sódio 0,1 M (pH 5,0)) foi adicionado a 100 μl/poço, e uma reação foi deixada prosseguir em temperatura ambiente por 5 minutos. Então, as células foram lavadas duas vezes com água destilada, e então, observadas por microscopia (Fig. 31). Como um resultado, a formação de osteoclastos gigantes resultando de um alto grau de fusão celular foi significativamente inibida pela adição de o anticorpo policlonal anti-Singlec-15 humano. Por outro lado, no caso onde a IgG pré-imune foi adicionada, tal inibição de fusão celular de osteoclastos não foi observada. O número de células multinucleadas positivas para TRAP nas quais o número de núcleos é 5 ou mais foi contado com um microscópio invertido (Fig. 32). Como um resultado, uma inibição significativa de formação de osteoclastos multinucleados foi observada no poço ao qual o anticorpo No. 2 anti-Singlec- 15 humano purificado por afinidade foi adicionado em uma concentração final de 30 μg/ml. Também no caso onde a IgG pré-imune foi adicionada a 30 μg/ml, uma tendência de inibição de formação de osteoclastos multinucleados foi observada. Entretanto, quando foi feita comparação com tais poços, foi mostrado que formação de osteoclastos multinucleados foi significativamente inibida pela adição do anticorpo No. 2 anti-Singlec-15 humano. Desta maneira, foi revelado que multinucleação e fusão celular de osteoclastos positivos para TRAP a partir de células precursoras de osteoclastos humanos normais são inibidas pelo anticorpo se ligando especificamente a Siglec-15. Exemplo 36. Avaliação de propriedade de ligação de anticorpo monoclonal de rato anti-Singlec-15 de camundongo com proteína Siglec-15 humana
[00378] A propriedade de ligação do anticorpo monoclonal de rato anti- Singlec-15 de camundongo com proteína Siglec-15 humana foi avaliada por um método ELISA. A proteína Siglec-15-Fc humana produzida em b) de Exemplo 32 foi diluída para 5 μg/ml com tampão carbonato de sódio 0,1 M (pH 9,5), e a solução resultante foi adicionada a uma placa de 96 poços (fabricada por Nalge Nunc International, Inc., Cat. No. 430341) a 100 μl/poço. Depois de a placa ter sido deixada em temperatura ambiente por 1 hora, a solução foi removida e um tampão de lavagem (salina tamponada com fosfato contendo Tween 20 a 0,05%) foi adicionado a 300 μl/poço e removido. Depois deste procedimento de lavagem ter sido realizado mais uma vez, salina tamponada com fosfato contendo 25% de BlockAce (fabricado por Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) foi adicionado a 200 μl/poço, e a placa foi deixada em temperatura ambiente por 1 hora, através do que bloqueio foi efetuado. O líquido foi removido, e a placa foi lavada duas vezes com 300 μl/poço de tampão de lavagem. Então, cada um dos anticorpos monoclonais de rato anti-Singlec-15 de camundongo preparados em Exemplo 24 ou IgG de rato de controle (fabricado por R&D systems, Inc.) foi diluída para uma concentração final de a partir de 1,28 a 20.000 ng/ml (série de diluição de 5 vezes) com um tampão de ELISA (salina tamponada com fosfato contendo 12,5% de BlockAce e Tween 20 a 0,05%), e a solução de anticorpo diluída resultante foi adicionada à placa a 100 μl/poço. Depois de a placa ter sido deixada em temperatura ambiente por 1 hora, o líquido foi removido, e a placa foi lavada três vezes com 300 μl/poço de tampão de lavagem. Subseqüentemente, anticorpo de cabra anti-IgG de rato marcado com HRP (peroxidase de rábano) (fabricado por Beckman Coulter, Inc.) diluído para 1.000 vezes com o tampão de ELISA foi adicionado a 100 μl/poço, e a placa foi deixada em temperatura ambiente por 1 hora. O líquido foi removido e a placa foi lavada três vezes com 300 μl/poço de tampão de lavagem, e então, usando um kit de desenvolvimento de cor para peroxidase (fabricado por Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), a cor foi desenvolvida de acordo com o protocolo anexado ao kit. Depois de desenvolver a cor, a absorbância a 492 nm foi medida usando um leitor de microplacas (fabricado por Nihon Molecular Devices Corporation). Como um resultado, foi confirmado que todas as 10 substâncias de teste dos anticorpos monoclonais de rato anti- Singlec-15 de camundongo avaliadas se ligam à proteína Siglec-15 humana de uma maneira dependente de concentração de anticorpo (Fig. 33). Em particular, a atividade de ligação de 5 substâncias de teste: #1A1, #3A1, #24A1, #32A1, e #61A1, foi alta, e a atividade de ligação de 3 substâncias de teste: #8A1, #34A1, e #39A1, foi baixa. Por outro lado, no caso da IgG de rato de controle, ligação com a proteína Siglec-15 humana não foi observada. A partir dos resultados acima, foi mostrado que os anticorpos monoclonais de rato anti-Singlec-15 de camundongo preparados em Exemplo 24 se ligam não apenas a Singlec-15 de camundongo, mas também a Siglec-15 humano, e, além disso, foi encontrado que alguns anticorpos se ligam fortemente a Siglec-15 humano. Exemplo 37. Efeito de adição de anticorpo monoclonal de rato anti-Singlec- 15 de camundongo em fusão celular e atividade de reabsorção óssea de células precursoras de osteoclastos humanos normais (avaliação de atividade biológica in vitro)
[00379] Uma vez que foi confirmado que os anticorpos monoclonais de rato anti-Singlec-15 de camundongo também se ligam a Siglec-15 humano em Exemplo 36, os efeitos destes anticorpos em atividade de formação e reabsorção óssea de osteoclastos humanos foram avaliados. a) Efeito de adição de anticorpo monoclonal de rato anti-Singlec- 15 de camundongo em fusão celular de osteoclastos a partir de células precursoras de osteoclastos humanos normais (Coloração com TRAP)
[00380] Células precursoras de osteoclastos humanos normais (Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells, adquiridas de Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. 2T-110) foram inseminadas em uma placa de 96 poços a 1 x 104 células/poço de acordo com o protocolo anexado às células. Como o meio, um meio essencial mínimo para células precursoras de osteoclastos (OPBM, adquirido de Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. PT-8201) suplementado com um conjunto de suplemento OPGM (Osteoclast SingleQuotTM Kit, adquirido de Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. PT-9501) contendo soro fetal bovino (concentração final: 10%), RANKL humano (concentração final: 66 ng/ml), M-CSF humano (concentração final: 33 ng/ml) e os semelhantes foi usado. Ao sobrenadante de cultura resultante, cada um dos anticorpos monoclonais de rato anti-Singlec-15 de camundongo preparados em Exemplo 24 ou IgG de rato de controle (fabricado por R&D systems) foi adicionado para gerar uma concentração final de 30 μg/ml, e as células foram cultivadas por 4 dias em uma incubadora de CO2. Depois do cultivo, o sobrenadante foi removido, e formalina neutra a 10% foi adicionada para fixar as células. Depois de fixar as células, as células foram lavadas duas vezes com água destilada, e uma solução de coloração com TRAP (0,27 mM de naftol AS-MX fosfato (fabricado por Sigma Co., Ltd.), 1,6 mM de fast red violet LB salt (fabricado por Sigma Co., Ltd.), 1% de dimetilformamida, 50 mM de tartarato de sódio, tampão acetato de sódio 0,1 M (pH 5,0)) foi adicionado a 100 μl/poço, e uma reação foi deixada prosseguir em temperatura ambiente por 5 minutos. Então, as células foram lavadas duas vezes com água destilada, e então, observadas por microscopia (Fig. 34). Como um resultado, a formação de osteoclastos gigantes resultando de um alto grau de fusão celular foi inibida quase completamente pela adição do anticorpo #32A1. Além disto, também no caso do anticorpo #41B1, a formação de osteoclastos gigantes resultando de um alto grau de fusão celular foi significativamente inibida. Por outro lado, no caso dos outros anticorpos monoclonais de rato anti-Singlec-15 de camundongo (tal como o anticorpo #1A1) e da IgG de rato de controle, uma tal inibição significativa de fusão celular de osteoclastos não foi observada. Desta maneira, foi revelado que multinucleação e fusão celular de osteoclastos positivos para TRAP a partir de células precursoras de osteoclastos humanos normais são inibidas pelo anticorpo monoclonal se ligando especificamente à proteína Siglec-15. b) Efeito de adição de anticorpo monoclonal de rato anti-Singlec- 15 de camundongo (#32A1) em fusão celular de osteoclastos a partir de células precursoras de osteoclastos humanos normais (Coloração com TRAP)
[00381] Células precursoras de osteoclastos humanos normais (Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells, adquiridas de Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. 2T-110) foram inseminadas em uma placa de 96 poços a 1 x 104 células/poço de acordo com o protocolo anexado às células. Como o meio, um meio essencial mínimo para células precursoras de osteoclastos (OPBM, adquirido de Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. PT-8201) suplementado com um conjunto de suplemento OPGM (Osteoclast SingleQuotTM Kit, adquirido de Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. PT-9501) contendo soro fetal bovino (concentração final: 10%), RANKL humano (concentração final: 68,4 ng/ml), M-CSF humano (concentração final: 33 ng/ml) e os semelhantes foi usado. Ao sobrenadante de cultura resultante, o anticorpo monoclonal de rato anti-Singlec-15 de camundongo (#32A1) preparado em Exemplo 24 foi adicionado para gerar uma concentração final de 0,1, 0,3, 1, ou 3 μg/ml, e as células foram cultivadas por 3 dias em uma incubadora de CO2. Depois do cultivo, o sobrenadante foi removido, e formalina neutra a 10% foi adicionada para fixar as células. Depois de fixar as células, as células foram lavadas duas vezes com água destilada, e uma solução de coloração com TRAP (0,27 mM de naftol AS-MX fosfato (fabricado por Sigma Co., Ltd.), 1,6 mM de fast red violet LB salt (fabricado por Sigma Co., Ltd.), 1% de dimetilformamida, 50 mM de tartarato de sódio, tampão acetato de sódio 0,1 M (pH 5,0)) foi adicionado a 100 μl/poço, e uma reação foi deixada prosseguir em temperatura ambiente por 5 minutos. Então, as células foram lavadas duas vezes com água destilada, e então, observadas por microscopia (Fig. 35). Como um resultado, a formação de osteoclastos multinucleados positivos para TRAP foi inibida de uma maneira dependente de concentração de anticorpo #32A1 dentro do intervalo de a partir de 0,3 μg/ml a 3 μg/ml. c) Efeito de adição de anticorpo monoclonal de rato anti-Singlec- 15 de camundongo (#32A1) em atividade de reabsorção óssea de células precursoras de osteoclastos humanos normais (Avaliação usando placa recoberta por colágeno)
[00382] Sabe-se que osteoclastos liberam uma protease tal como catepsina K e degradam colágeno tipo I que é um componente constitucional de tecido ósseo. OsteoLyse Assay Kit (fabricado por Lonza, Inc., Cat. No. PA-1500) fornece um colágeno humano conjugado com placa de 96 poços revestida com európio (placa de cultura celular de 96 poços de OsteoLyse), e é possível avaliar a atividade de reabsorção óssea de osteoclastos IN VITRO medindo a quantidade de fragmentos fluorescentes de colágeno liberados no sobrenadante quando osteoclastos são cultivados na placa.
[00383] Células precursoras de osteoclastos humanos normais (Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells, adquiridas de Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. 2T-110) foram inseminadas em uma placa de cultura celular de 96 poços de OsteoLyse a 1 x 104 células/poço de acordo com o protocolo anexado às células. Como o meio, um meio essencial mínimo para células precursoras de osteoclastos (OPBM, adquirido de Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. PT-8201) suplementado com um conjunto de suplemento OPGM (Osteoclast SingleQuotTM Kit, adquirido de Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. PT-9501) contendo soro fetal bovino (concentração final: 10%), RANKL humano (concentração final: 68,4 ng/ml), M-CSF humano (concentração final: 33 ng/ml) e os semelhantes foi usado. Ao sobrenadante de cultura resultante, o anticorpo monoclonal de rato anti-Singlec-15 de camundongo (anticorpo #32A1) preparado em Exemplo 24 foi adicionado para gerar uma concentração final de 0,1, 0,3, 1, ou 3 μg/ml, e as células foram cultivadas por 3 dias em uma incubadora de CO2. Uma alíquota de 10 μl do sobrenadante de cultura foi coletada, e 200 μl de Fluorophore Releasing Reagent incluído no OsteoLyse Assay Kit foi adicionado a esta, e uma intensidade de fluorescência foi medida (Excitação: 340 nm, Emissão: 615 nm) usando um leitor de fluorescência de placa (ALVO MX, fabricado por Perkin Elmer Inc.), de maneira que a quantidade de fragmentos fluorescentes de colágeno livres liberados no sobrenadante de cultura foi determinada (Fig. 36). Como um resultado, a quantidade de fragmentos fluorescentes de colágeno aumentada pela adição de RANKL foi reduzida pelo anticorpo #32A1 de uma maneira dependente de concentração dentro do intervalo de a partir de 0,3 μg/ml a 3 μg/ml. A partir deste resultado, foi revelado que a atividade de reabsorção óssea de osteoclastos humanos é inibida pelo anticorpo monoclonal se ligando especificamente à proteína Siglec-15. Exemplo 38. Produção de anticorpo monoclonal de camundongo anti-Siglec- 15 humano
[00384] É possível produzir um anticorpo anti-Siglec-15 humano pelas etapas descritas abaixo. (1) Imunização
[00385] A proteína Siglec-15 humana solúvel obtida em Exemplos 30 a 32 é intraperitonealmente administrada a um camundongo BALB/c fêmea na idade de 4 a 10 semanas. Depois de 2 semanas, a mesma solução de fração de membrana é intraperitonealmente administrada ao camundongo para imunização de reforço. (2) Fusão celular
[00386] O baço é amputado do camundongo em três dias depois da imunização de reforço, colocado em um meio livre de soro e triturado em uma malha com uma espátula. A suspensão celular passada através da malha é centrifugada para precipitar as células de baço.
[00387] Por outro lado, células de mieloma NS1 (American Type Culture Collection TIB-18) são lavadas com um meio livre de soro e suspensas da mesma maneira.
[00388] Usando as células expressando Siglec-15 assim obtidas e células de mieloma, fusão celular é realizada de acordo com um procedimento comum. (3) Triagem
[00389] Células fusionadas produtoras de anticorpo anti-Siglec-15 humano podem ser triadas por um método usando cell-ELISA e um método usando um citômetro de fluxo. (4) Clonagem
[00390] Para um grupo de células triadas no (3) acima, uma série de etapas compreendendo o método usando cell-ELISA e o método usando um citômetro de fluxo descrito em (3) é repetida 5 vezes, de maneira que podem ser obtidos diversos clones de hibridomas capazes de produzir um único anticorpo que se liga a células expressando Siglec-15 humano, mas não se liga às células antes de transfecção. (5) Purificação de anticorpo
[00391] Um hibridoma camundongo-camundongo produzido através de etapas (1) a (4) é cultivado, e o sobrenadante resultante é coletado. Depois que o sobrenadante obtido é coletado e dialisado, purificação parcial do anticorpo é realizada usando um equipamento de cromatografia líquida de alta eficiência. O título de anticorpos anti-Siglec-15 humano em cada fração de cromatografia é ensaiado por um método ELISA usando a proteína Siglec-15 humana. Frações tendo um alto título de anticorpos são coletadas e aplicadas a uma coluna de purificação da afinidade dos anticorpos. Depois do interior da coluna ser lavado com um tampão de equilíbrio de coluna, o anticorpo é eluído com um tampão de eluição em coluna. Imediatamente depois de conclusão da eluição, cada eluato é aplicado ao topo de um ultrafiltro centrífugo e centrifugado. Depois do filtrado coletado no fundo do filtro ser removido, lavagem é realizada 5 vezes adicionando PBS ao topo. O líquido remanescente no topo do filtro é usado como uma amostra de anticorpo anti- Siglec-15 humano. Exemplo 39. Produção de anticorpo monoclonal de rato anti-Siglec-15 humano
[00392] Um anticorpo monoclonal de rato anti-Siglec-15 humano pode ser produzido usando a proteína Siglec-15 humana solúvel obtida em Exemplos 30 a 32 pelo método descrito em Exemplos 23 e 24. Exemplo 40. Efeito de anticorpo monoclonal anti-Siglec-15 humano em diferenciação de osteoclastos
[00393] Usando o anticorpo monoclonal anti-Siglec-15 humano obtido em Exemplo 38 ou 39, o efeito inibitório do anticorpo em formação de osteoclastos pode ser testado. Para testar o efeito em formação de osteoclastos de camundongos, o método de Exemplo 17, 19, 20, 21, 22 ou 26 pode ser usado. Para testar o efeito inibitório em formação de osteoclastos humanos, o método de Exemplo 35 ou 37 pode ser usado.
[Aplicabilidade industrial]
[00394] O anticorpo anti-Siglec-15 da invenção tem a capacidade de inibir atividade de diferenciação ou reabsorção óssea de osteoclastos, e uma composição farmacêutica contendo o anticorpo anti-Siglec-15 pode ser um agente terapêutico ou preventivo para uma doença de metabolismo ósseo anormal.

Claims (30)

1. Anticorpo monoclonal ou fragmento funcional deste que reconhece especificamente um ou mais polipeptídeos Siglec-15, caracterizado pelo fato de que os polipeptídeos Siglec-15 consistem em uma sequência de aminoácidos descrita em qualquer um dos seguintes (a) a (h) e o anticorpo monoclonal ou fragmento funcional deste inibe formação de osteoclastos e/ou reabsorção óssea osteoclástica: (a) uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequências; (b) uma sequência de aminoácidos consistindo nos resíduos de aminoácidos 21 a 328 da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequências; (c) uma sequência de aminoácidos consistindo nos resíduos de aminoácidos 1 a 260 da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequências; (d) uma sequência de aminoácidos consistindo nos resíduos de aminoácidos 21 a 260 da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequências; (e) uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Sequências; (f) uma sequência de aminoácidos consistindo nos resíduos de aminoácidos 21 a 341 da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Sequências; (g) uma sequência de aminoácidos consistindo nos resíduos de aminoácidos 1 a 258 da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Sequências; e (h) uma sequência de aminoácidos consistindo nos resíduos de aminoácidos 21 a 258 da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Sequências.
2. Anticorpo monoclonal ou fragmento funcional deste que reconhece especificamente um ou mais polipeptídeos Siglec-15, caracterizado pelo fato de consistir em uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de nucleotídeos descrita em qualquer um dos seguintes (j) a (m) e inibir a formação de osteoclastos e/ou reabsorção óssea osteoclástica: (j) uma sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 1; (k) uma sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 3; (l) uma sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 19; e (m) uma sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 43.
3. Anticorpo monoclonal ou fragmento funcional do anticorpo monoclonal de acordo com reivindicação 1 ou 2, caracterizado por inibir o processo de fusão celular de osteoclastos.
4. Anticorpo monoclonal ou fragmento funcional do anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de inibir formação de osteoclastos induzida por TNF- α.
5. Anticorpo monoclonal ou fragmento funcional do anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de inibir formação de osteoclastos in vitro em uma concentração de 30 μg/mL ou menos, preferencialmente 3 μg/mL ou menos, mais preferencialmente entre 63 ng/mL e 1 μg/mL.
6. Anticorpo monoclonal ou fragmento funcional do anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de inibir reabsorção óssea osteoclástica.
7. Anticorpo monoclonal ou fragmento funcional do anticorpo monoclonal de acordo com reivindicação 6, caracterizado pelo fato de inibir reabsorção óssea osteoclástica in vitro em uma concentração de 3 μg/mL ou menos, preferencialmente entre 0,3 μg/mL a 3 μg/mL.
8. Anticorpo monoclonal ou fragmento funcional do anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por competir com um anticorpo produzido por hibridoma FERM BP-10999 (#32A1) ou hibridoma FERM BP-11000 (#41B1).
9. Anticorpo monoclonal ou fragmento funcional do anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo produzido por hibridoma FERM BP-10999 (#32A1) ou hibridoma FERM BP-11000 (#41B1).
10. Anticorpo monoclonal ou fragmento funcional do anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico.
11. Anticorpo monoclonal ou fragmento funcional do anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é humanizado.
12. Anticorpo monoclonal ou fragmento funcional do anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humano.
13. Anticorpo monoclonal ou fragmento funcional do anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo IgG.
14. Fragmento funcional do anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado por ser selecionado a partir do grupo consistindo de Fab, F(ab’)2, Fab’ e Fv.
15. Anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de ser um scFv.
16. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender pelo menos um dos anticorpos monoclonais ou fragmentos funcionais dos anticorpos monoclonais como definidos em reivindicações 1 a 15.
17. Composição farmacêutica para tratar e/ou prevenir metabolismo ósseo anormal, caracterizada pelo fato de compreender os seguintes A) e B): A) pelo menos um anticorpo ou fragmento funcional deste que reconhece especificamente um ou mais polipeptídeos Siglec-15 que consiste em uma cadeia de aminoácidos descrita em qualquer um dos itens (a) a (h) bem como inibe a formação de osteoclastos e a consequente reabsorção óssea osteoclástica: (a) uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequências; (b) uma sequência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 21 a 328 da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequências; (c) uma sequência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 1 a 260 da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequências; (d) uma sequência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 21 a 260 da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequências; (e) uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Sequências; (f) uma sequência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 21 a 341 da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Sequências; (g) uma sequência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 1 a 258 da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Sequências; (h) uma sequência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 21 a 258 da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Sequências; e B) pelo menos um membro selecionado a partir do grupo consistindo de bisfosfonatos, vitamina D3 ativa, calcitonina e derivados desta, preparações hormonais tal como estradiol, SERMs (moduladores seletivos dos receptores de estrogênio), ipriflavona, vitamina K2 (menatetrenona), preparações de cálcio, preparações de PTH (hormônio da paratireóide), agentes antiinflamatórios não esteroidais, preparações de receptor solúvel de TNF, anticorpos anti-TNF-α ou fragmentos funcionais dos anticorpos, anticorpos anti-PTHrP (proteína relacionada ao hormônio da paratireóide) ou fragmentos funcionais dos anticorpos, antagonistas do receptor de IL-1, anticorpos anti-receptor de IL-6 ou fragmentos funcionais dos anticorpos, anticorpos anti-RANKL ou fragmentos funcionais dos anticorpos e OCIF (fator inibidor de osteoclastogênese).
18. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou fragmento funcional deste que inibe a formação de osteoclastos e/ou a consequente reabsorção óssea osteoclástica é um anticorpo monoclonal ou fragmento funcional deste como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.
19. Composição farmacêutica de acordo com reivindicação 17 ou 18, caracterizada pelo fato de que o metabolismo ósseo anormal é osteoporose, destruição óssea acompanhando artrite reumatóide ou destruição óssea acompanhando metástase de câncer para osso.
20. Composição farmacêutica de acordo com reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que a osteoporose é osteoporose pós-menopausa, osteoporose senil, osteoporose secundária devido ao uso de um agente terapêutico tal como um esteróide ou um imunossupressor, ou osteoporose acompanhando artrite reumatóide.
21. anticorpo ou fragmento funcional deste para tratar e/ou prevenir metabolismo ósseo anormal, caracterizado pelo fato de reconhecer especificamente um ou mais polipeptídeos Siglec-15, os quais consistem em uma sequência de aminoácidos descrita em qualquer um dos seguintes (a) a (h), e inibir a formação de osteoclastos e/ou reabsorção óssea osteoclástica: (a) uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequências; (b) uma sequência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 21 a 328 da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequências; (c) uma sequência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 1 a 260 da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequências; (d) uma sequência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 21 a 260 da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequências; (e) uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Sequências; (f) uma sequência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 21 a 341 da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Sequências; (g) uma sequência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 1 a 258 da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Sequências; (h) uma sequência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 21 a 258 da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Sequências.
22. Anticorpo ou fragmento funcional deste para tratar e/ou prevenir metabolismo ósseo anormal de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento funcional deste é um anticorpo monoclonal ou fragmento funcional deste conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.
23. Uso de um anticorpo ou fragmento funcional deste, caracterizado pelo fato de ser para preparar um medicamento para prevenir ou tratar metabolismo ósseo anormal, em que o anticorpo ou fragmento funcional deste reconhece especificamente um ou mais polipeptídeos Siglec-15 que consiste em uma cadeia de aminoácidos descrita em qualquer um dos itens (a) a (h) bem como inibe a formação de osteoclastos e a consequente reabsorção óssea osteoclástica: (a) uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequências; (b) uma sequência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 21 a 328 da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequências; (c) uma sequência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 1 a 260 da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequências; (d) uma sequência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 21 a 260 da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequências; (e) uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Sequências; (f) uma sequência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 21 a 341 da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Sequências; (g) uma sequência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 1 a 258 da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Sequências; (h) uma sequência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 21 a 258 da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Sequências.
24. Uso de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento funcional deste é um anticorpo monoclonal ou fragmento funcional deste conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.
25. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que contém os seguintes itens A) e B): A) pelo menos um anticorpo ou fragmento funcional deste que reconhece especificamente um ou mais polipeptídeos Siglec-15 que consiste em uma cadeia de aminoácidos descrita em qualquer um dos itens (a) a (h) bem como inibe a formação de osteoclastos e a consequente reabsorção óssea osteoclástica: (a) uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequências; (b) uma sequência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 21 a 328 da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequências; (c) uma sequência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 1 a 260 da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequências; (d) uma sequência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 21 a 260 da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequências; (e) uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Sequências; (f) uma sequência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 21 a 341 da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Sequências; (g) uma sequência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 1 a 258 da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Sequências; (h) uma sequência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácidos 21 a 258 da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Sequências; e B) pelo menos um membro selecionado a partir do grupo consistindo de bisfosfonatos, vitamina D3 ativa, calcitonina e derivados desta, preparações hormonais tal como estradiol, SERMs (moduladores seletivos dos receptores de estrogênio), ipriflavona, vitamina K2 (menatetrenona), preparações de cálcio, preparações de PTH (hormônio da paratireóide), agentes antiinflamatórios não esteroidais, preparações de receptor solúvel de TNF, anticorpos anti-TNF-α ou fragmentos funcionais dos anticorpos, anticorpos anti-PTHrP (proteína relacionada ao hormônio da paratireóide) ou fragmentos funcionais dos anticorpos, antagonistas do receptor de IL-1, anticorpos anti-receptor de IL-6 ou fragmentos funcionais dos anticorpos, anticorpos anti-RANKL ou fragmentos funcionais dos anticorpos e OCIF (fator inibidor de osteoclastogênese), em uma preparação combinada para uso simultâneo ou sucessivo no tratamento e/ou prevenção de metabolismo ósseo anormal.
26. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um anticorpo ou fragmento funcional deste que inibe a formação de osteoclasto e/ou a consequente reabsorção óssea osteoclástica é um anticorpo monoclonal ou fragmento funcional deste conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.
27. Anticorpo ou fragmento funcional deste para tratar e/ou prevenir metabolismo ósseo anormal de acordo com a reivindicação 21 ou 22, uso de acordo com a reivindicação 23 ou 24, ou as composições farmacêuticas de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizados pelo fato de que o metabolismo ósseo anormal é osteoporose, destruição óssea acompanhando artrite reumatóide ou destruição óssea acompanhando metástase de câncer para osso.
28. Anticorpo ou fragmento funcional deste, uso, ou composições farmacêuticas de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a osteoporose é osteoporose pós-menopausa, osteoporose senil, osteoporose secundária devido ao uso de um agente terapêutico tal como um esteróide ou um imunossupressor, ou osteoporose acompanhando artrite reumatóide.
29. Hibridoma, caracterizado pelo fato de ser hibridoma FERM BP-10999 (#32A1).
30. Hibridoma, caracterizado pelo fato de ser pelo fato de ser hibridoma FERM BP-11000 (#41B1).
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