WO2015093925A1 - Método de producción de anticuerpos específicos - Google Patents

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José de Jesús MONCADA ZUNO
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Definitions

  • Antibodies are naturally produced glycoproteins in response to invasion of foreign particles (antigens) such as microorganisms and viruses. They play a fundamental role in defending the immune system against infections and diseases.
  • the antigens recognized and bound by the antibodies could be proteins and / or sugars on bacterial and viral cell surfaces, but they can also be molecules found in cancer cells.
  • the region of an antigen that crizeracts with an antibody called the epitope
  • an animal's immune system will generate a large group of antibodies that recognize several epitopes of a particular antigen. Each antibody is secreted by a plasma cell producing different antibodies. As the antibodies found in it serum are collectively produced by many plasma cells (clones), which are described as polyclonal. This is an advantage for the fight against infections in nature, the heterogeneity of polyclonal antibodies limits their use as research tools.
  • Polyclonal antibodies are a mixture of many antibodies with different affinities and specificities.
  • the development cost of pAb may be small, but its requirement for purified antigen for its production increases its actual production cost.
  • the convenience of using the pAbs is the detection of different epitopes, in certain procedures that require a fixation, the epitopes of interest can be denatured by the fixative, having several antibodies that detect different epitopes is advantageous.
  • polyclonal antibodies Among the notable negative effects of polyclonal antibodies is cross reactions with other proteins that may arise in the i diagnostic tests or therapies, causing autoimmune diseases in the latter.
  • the antigen must be purified as much as possible, in the case that it is an antigenic but not immunogenic molecule (that is, unable to induce the immune response), a protein that functions as a vehicle will be used, such as bovine albumin.
  • the animal is chosen. Normally for the production of primary antibodies, rat or rabbit is used because a smaller amount of serum is required and other times goats or donkeys for a larger quantity production.
  • the adaptive immune response that is going to give rise to the antibodies will go through different phases.
  • Delay phase or lag phase Time required for B lymphocytes to be activated.
  • a second dose (hyperimmunization) of the same antigen is placed, the same phases are repeated as in the primary immunization process, but in a different way.
  • the lag phase is much shorter, the exponential phase is much more violent and the amount of Antibodies are much higher, and the decay phase is much slower than in primary immunization thus allowing to have more antibodies.
  • One aspect of the present invention to provide a platform for structural characterization to obtain information regarding the relative proportion of individual members in samples comprising (i) different homologous proteins having 'different variable regions or ( ii) cell lines producing such proteins.
  • the characterization platform can be used to evaluate different aspects during a production or purification process or during long-term storage of a composition comprising different homologous proteins.
  • the characterization platform of the present invention is used for one of the following purposes: i) to determine the relative representation of the individual members or some of the individual members in relation to each other within a single sample, ii) evaluate the relative proportion of one or more individual members in different samples for the determination of the consistency from batch to batch, and iii) to assess the actual proportion of one or more individual members.
  • this can be compared to the vector library originally used to generate the polyclonal manufacturing cell line.
  • the characterization platform is particularly useful in monitoring the clonal diversity of a polyclonal cell line and / or the representation of individual proteins in a polyclonal protein produced by the cell line. Both the stability of the composition during individual production and the consistency from batch to batch can be monitored.
  • the platform procedures can also be applied to purified compositions of different mixtures of homologous proteins, including a polyclonal protein or a mixture of monoclonal antibodies, for example, to evaluate the long-term stability of the individual members of a composition of this type .
  • An embodiment of the present invention is a method for characterizing samples comprising different homologous proteins that have different variable regions or cells producing such proteins, such that information is obtained regarding the relative proportion or presence of individual members. of said proteins or their coding sequences, said method comprising the analysis of aliquots of said samples by one or more protein characterization techniques and / or by one or more genetic analyzes of the protein coding sequences.
  • the structural characterization platform is composed of a number of analysis techniques selected from protein characterization techniques, as well as genetic analyzes. Therefore, the structural characterization platform may be composed of any number of the individual embodiments described in the following sections. It may be sufficient to obtain information about a sample of only one of the analytical techniques described in the embodiments. It is, however, preferable to obtain information from at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 of these analytical techniques, thereby combining the individual embodiments indicated below to generate the characterization platform.
  • the combination of several analytical techniques to allow the generation of a more descriptive data set in relation to the relative or absolute composition of the polyclonal mixture.
  • the information obtained from these techniques can be quantitative, as well as a qualitative character, which when compiled together provide a general characterization of the analyzed samples.
  • an analytical technique is a protein characterization technique and another analytical technique is a genetic analysis.
  • Genetic analyzes refer to techniques such as restriction fragment length polymorphism (RFLP), terminal - RFLP (T-RFLP), analysis of microarrays, quantitative PCR, such as real-time PCR, and nucleic acid sequencing.
  • RFLP restriction fragment length polymorphism
  • T-RFLP terminal - RFLP
  • quantitative PCR such as real-time PCR
  • nucleic acid sequencing
  • the polyclonality of a homologous protein pool or the expression system for the production of homologous proteins is controlled by one or more protein characterization techniques.
  • Protein characterization techniques refer to any technique that alone or in combination with other techniques is capable of providing information regarding the presence and relative proportion of individual members of a mixture of monoclonal proteins or a recombinant polyclonal protein in solution or on the surface of a cell present in a polyclonal cell line.
  • one or more of the following techniques may be used: i) chromatographic separation techniques, ii) analysis of proteolytic digestions of the polyclonal protein for the identification of single marker peptide representing the individual members of polyclonal protein, iii) "bulk" N-terminal sequencing, and ivjTanalysis using specific detector molecules, for example, for characterization of the sentinel protein members of the polyclonal protein.
  • the sample containing the different homologous proteins can be a mixture of purified monoclonal proteins, or a polyclonal protein.
  • the polyclonal protein can for example be derived from a cell culture supernatant obtained from a polyclonal cell culture, for example, in the form of a "raw" supernatant, which has only been separated from the cells for example, by centrifugation, or supernatants that have been purified, for example, by protein A affinity purification, immunoprecipitation or gel filtration.
  • These pre-purification steps are, however, not a part of the characterization of the recombinant polyclonal protein, since they do not provide any separation of the different homologous proteins in the composition.
  • the sample subjected to the characterization process of the present invention has been subjected to at least one purification step. Most preferred are samples comprising 90%, 95% or 99% pure homologous proteins.
  • the different homologous proteins that constitute the polyclonal protein can be monitored in samples obtained from a single polyclonal cell culture at different time points during the culture thereby monitoring the relative proportions of the individual polyclonal protein members throughout the production cycle to assess its compositional stability.
  • different homologous proteins that constitute the polyclonal protein can be monitored in samples obtained from different polyclonal cell cultures at a particular time, thereby monitoring the relative proportions of the individual coding sequences in different batches to assess the consistency of batch to lot.
  • the chromatographic separation of the individual members of the polyclonal protein may be based on differences in physicochemical properties, such as i) net charge (exemplified by ion exchange chromatography (IEX)), ii) hydrophobicity (exemplified by phase chromatography reverse (RP-HPLC), and hydrophobic interaction chromatography based on salt concentration (HIC)), iii) isoelectric points (pl values) (exemplified by chromato-focus) or iv) affinity (exemplified by affinity chromatography using peptides anti-idiotype / antibodies / or proteins L chromatography for separation of kappa and lambda antibody light chains).
  • IEX ion exchange chromatography
  • RP-HPLC phase chromatography reverse
  • HIC hydrophobic interaction chromatography based on salt concentration
  • pl values isoelectric points
  • affinity exemplified by affinity chromatography using peptides anti-idiotype / antibodies / or proteins
  • a well known fifth chromatographic technique is based on the following physical-chemical property: Size. This is, however, not a particularly suitable technique for the characterization of homologous proteins such as a polyclonal antibody or polyclonal TcR, since all members are essentially the same size. The separation by size can be omitted completely from the platform of characterization.
  • Some of these chronograph-graphic techniques - mentioned above have been used in the separation of immunoglobulin classes such as IgA, IgG and IgM (or subclasses, such as, lgG1, lgG2, lgG3 from human serum. However, previously the separation with respect to the diversity of the individual antibodies in a serum-derived immunoglobulin or a recombinant polyclonal antibody has not been performed.
  • the antibody classes are selected from the group consisting of IgG antibodies, Ig antibodies, IgA antibodies, IgM antibodies, Ig-like antibodies, scFv single chain antibodies, scFv-Fe antibodies, Fab antibody fragments, and related combinations.

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Abstract

Un método basado en células para la fabricación de, por medios recombinantes, formulaciones de anticuerpos policlonales completamente humanos compuestos de proporciones variables de las clases y subclases de anticuerpos. Preferiblemente, las clases de anticuerpos se seleccionan del grupo que consiste de anticuerpos IgG, anticuerpos Ig, anticuerpos IgA, anticuerpos IgM, anticuerpos similares a Ig, scFv anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos scFv - Fe, fragmentos de anticuerpos Fab, y combinaciones relacionadas. Anticuerpos o inmunoglobulinas Naturalmente circulantes son producidos por diferentes células B con cada celda individuales B productoras de inmunoglobulinas con una estructura específica. La estructura natural de inmunoglobulinas (Igs) es una construcción de cadena de cuatro polipéptido y la estructura compuesta de dos pesadas (H ) idénticas cadenas (alrededor de 450- 600 aminoácidos) y dos cadenas ligeras (L) idénticas (alrededor de 230 aminoácidos). Las diferentes clases de anticuerpos se definen por las cadenas H y clasifican en las cinco clases principales o isotipos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM.

Description

MÉTODO DE PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS
ANTECEDENTES
Los anticuerpos (inmunoglobulinas) son glicoproteínas producidas naturalmente en respuesta a la invasión de partículas extrañas (antígenos) tales como microorganismos y virus. Desempeñan un papel fundamental en la defensa del sistema inmune contra las infecciones y las enfermedades.
Los antígenos reconocidos y unidos por los anticuerpos podrían ser proteínas y / o azúcares en las superficies celulares bacterianas y virales, pero también pueden ser moléculas encontradas en las células cancerosas. La región de un antígeno que iriteractüa con un anticuerpo que se denomina el epítopo
Típicamente, el sistema inmunológico de un animal va a generar un gran grupo de anticuerpos que reconocen varios epítopos de un antígeno particular. Cada anticuerpo se secreta por una célula plasmática productora de anticuerpos diferentes. Como los anticuerpos que se encuentran en él suero se producen colectivamente por muchas células plasmáticas (clones), que se describen como policlonales. Esto es una ventaja para la lucha contra las infecciones en la naturaleza, la heterogeneidad de los anticuerpos policlonales limita su uso como herramientas de investigación.
Los anticuerpos policlonales (pAbs.) son una mezcla de muchos anticuerpos con diferentes afinidades y especificidades . El costo de desarrollo de pAb puede ser pequeña , pero su requerimiento antígeno purificado para su producción aumenta su costo de producción real.
La conveniencia de utilizar los pAbs es la detección de distintos epítopos, en ciertos procedimientos que requieren un fijado, los epítopos de interés pueden quedar desnaturalizados por el fijador, tener varios anticuerpos que detectan diferentes epítopos es ventajoso.
Dentro de los efectos negativos resaltables de los anticuerpos policlonales se encuentra las reacciones cruzadas con otras proteínas que puedan surgir en las i pruebas de diagnóstico o terapias, provocando enfermedades autoinmunes en las últimas.
Para la obtención de los pAbs hay que purificar lo máximo posible el antígeno, en el caso de que sea una molécula antigénica pero no inmunogénica (es decir incapaz de inducir la respuesta inmune) se utilizará una proteína que funcione como vehículo, como por ejemplo la albúmina bovina.
Una vez purificado el antígeno y preparado para inyectar con adyuvantes, se elige el animal. Normalmente para la producción de anticuerpos primarios se utiliza rata o conejo porque se requiere una menor cantidad de suero y en otras ocasiones cabras o burros para una producción en mayores cantidades.
Una vez que se inyecta el antígeno la respuesta inmunitaria adaptativa que es la que va a dar lugar a los anticuerpos va a pasar por distintas fases.
1. Fase de retardo o fase de lag; Tiempo que requiere los linfocitos B para ser activados.
2. Fase de crecimiento exponencial; La producción de anticuerpos es mayor a la degradación.
3. Fase estacionaria; Donde la síntesis es igual a la degradación (Mayor concentración de pAbs).
4. Fase de decaimiento; la degradación es alta, disminuyendo la concentración de Anticuerpos.
Por tanto hay tendencia a pensar que el mejor momento para extraer el antisuero del animal es durante la fase estacionaria pero no es así.
Después proceso de inmunización primaria se pone una segunda dosis (hiperinmunización) del mismo antígeno se repiten las mismas fases que en el proceso de inmunización primaria pero de forma distinta. La fase lag es mucho más corta, la fase exponencial es mucho más violenta y la cantidad de anticuerpos es mucho mayor, y la fase de decaimiento es mucho más lenta que en la inmunización primaria permitiendo así tener mayor cantidad de anticuerpos.
DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA Un aspecto de la presente invención es proporcionar una plataforma para la caracterización estructural para obtener información con respecto a la proporción relativa de los miembros individuales en muestras que comprenden (i) diferentes proteínas homologas que tienen' diferentes regiones variables o (ii) las líneas celulares de producción de tales proteínas. La plataforma de caracterización se puede utilizar para evaluar diferentes aspectos durante un proceso de producción o la purificación o durante el almacenamiento a largo plazo de una composición que comprende diferentes proteínas homologas.
Preferiblemente , la plataforma de caracterización de la presente invención se utiliza para uno de los siguientes propósitos : i) para determinar la representación relativa de los miembros individuales o algunos de los miembros individuales en relación entre sí dentro de una sola muestra , ii) evaluar la relativa proporción de uno o más miembros individuales en diferentes muestras para la determinación de la consistencia de lote a lote , y iii ) para evaluar la proporción real de uno o más miembros individuales. Opcionalmente, esto puede ser comparado con la biblioteca de vectores usadas originalmente para generar la línea celular de fabricación policlonal. La plataforma de caracterización es particularmente útil en el seguimiento de la diversidad clonal de una línea celular policlonal y / o la representación de las proteínas individuales en una proteína policlonal producido por la línea celular. Tanto la estabilidad de la composición durante la producción individuales y la consistencia de lote a lote se pueden monitorear. Alternativamente , los procedimientos de la plataforma también se pueden aplicar a composiciones purificadas de diferentes mezclas de proteínas homologas, incluyendo una proteína policlonal o una mezcla de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, para evaluar la estabilidad a largo plazo de los miembros individuales de una composición de este tipo . Una realización de la presente invención es un procedimiento para caracterizar muestras que comprenden diferentes proteínas homologas que tienen diferentes regiones variables o las células productoras de tales proteínas , de tal manera que se obtiene información con respecto a la proporción relativa o la presencia de los miembros individuales de dichas proteínas o su codificación secuencias , dicho procedimiento que comprende el análisis de alícuotas de dichas muestras por una o más técnicas de caracterización de proteínas y / o por uno o más análisis genéticos de las secuencias de codificación de proteínas . En una forma de realización adicional de la presente invención, la plataforma de caracterización estructural se compone de un número de técnicas de análisis seleccionados de técnicas de caracterización de proteínas, así como los análisis genéticos. Por lo tanto, la plataforma de caracterización estructural puede estar compuesto de cualquier número de las realizaciones individuales que se describen en las siguientes secciones. Puede ser suficiente para obtener información acerca de una muestra de sólo una de las técnicas analíticas descritas en las realizaciones. Es , sin embargo , preferible obtener información de al menos 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , o 10 de estas técnicas analíticas, combinando de ese modo las formas de realización individuales se indican a continuación para generar la plataforma de caracterización . La combinación de varias técnicas analíticas para permitir la generación de un conjunto de datos más descriptivos en relación a la composición relativa o absoluta de la mezcla policlonal. La información obtenida de estas técnicas puede ser de forma cuantitativa, así como un carácter cualitativo, que cuando se compila en conjunto proporcionan una caracterización general de las muestras analizadas.
En formas de realización preferidas de la presente invención una técnica analítica es una técnica de caracterización de proteínas y otra técnica analítica es un análisis genético.
Los análisis genéticos se refieren a técnicas tales como polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción ( RFLP) , el terminal - RFLP ( T-RFLP ) , el análisis de microarrays , PCR cuantitativa , tales como PCR en tiempo real , y la secuenciación de ácido nucleico.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En formas de realización de la presente invención, la policlonalidad de una piscina de proteínas homologas o el sistema de expresión para la producción de las proteínas homologas se controla mediante una o más técnicas de caracterización de proteínas. Técnicas de caracterización de proteínas se refieren a cualquier técnica que solo o en combinación con otras técnicas es capaz de proporcionar información con respecto a la presencia y la proporción relativa de los miembros individuales de una mezcla de proteínas monoclonales o una proteína policlonal recombinante en solución o en la superficie de una célula presente en una línea celular policlonal.
Dependiendo de la complejidad de la proteína policlonal recombinante una o más de las siguientes técnicas pueden ser usados: i) técnicas de separación cromatográfica , ii) análisis de digestiones proteolíticas de la proteína policlonal para la identificación de péptido marcador único que representa los miembros individuales de la proteína policlonal , iii ) secuenciación N-terminal "a granel " , y ivjTanálisis usando moléculas detectores específicas , por ejemplo, para la caracterización de los miembros de proteína centinela de la proteína policlonal.
La muestra que contiene las diferentes proteínas homologas puede ser una mezcla de proteínas monoclonales purificados, o una proteína policlonal. La proteína policlonal puede por ejemplo ser derivado de un sobrenadante de cultivo celular obtenido a partir de un cultivo celular policlonal, por ejemplo, en forma de un sobrenadante de " cruda ", que sólo se ha separado de las células por ejemplo, por centrifugación, o sobrenadantes que se han purificado, por ejemplo, por proteína A purificación por afinidad, inmunoprecipitación o filtración en gel. Estos pasos de pre - purificación son, sin embargo, no una parte de la caracterización de la proteína policlonal recombinante, ya que no proporcionan ninguna separación de las diferentes proteínas homologas en la composición. Preferiblemente, la muestra sometida al proceso de caracterización de la presente invención ha sido sometido a por lo menos una etapa de purificación. Los más preferidos son muestras que comprenden 90%, 95% o 99% de proteínas homologas puros.
Las diferentes proteínas homologas que constituyen la proteína policlonal se pueden monitorizar en muestras obtenidas a partir de un único cultivo celular policlonal a diferentes puntos de tiempo durante el cultivo de ese modo el seguimiento de las proporciones relativas de los miembros de la proteína policlonal individuales durante todo el ciclo de producción para evaluar su estabilidad composicional. Alternativamente, diferentes proteínas homologas que constituyen la proteína policlonal se pueden monitorizar en muestras obtenidas de diferentes cultivos celulares policlonales en un momento particular, el seguimiento de ese modo las proporciones relativas de las secuencias de codificación individuales en diferentes lotes para evaluar la consistencia de lote a lote.
La separación cromatográfica de los miembros individuales de la proteína policlonal puede estar basada en diferencias en las propiedades físico- químicas , tales como i ) carga neta ( ejemplificado por cromatografía de intercambio iónico ( IEX ) ) , ii ) hidrofobicidad ( ejemplificado por cromatografía de fase inversa ( RP - HPLC ) , y cromatografía de interacción hidrófoba basada en la concentración de sal ( HIC ) ) , iii ) puntos isoeléctricos (valores de pl ) (ejemplificados por cromatoenfoque ) o iv ) de afinidad (ejemplificado por cromatografía de afinidad utilizando péptidos anti-idiotipo / anticuerpos/o proteínas cromatografía de L para la separación de kappa y lambda cadenas ligeras de anticuerpos) . Una técnica cromatográfica quinta bien conocido, se basa en la siguiente propiedad físico- química: Tamaño. Esta es, sin embargo, no es una técnica particularmente adecuada para la caracterización de proteínas homologas tales como un anticuerpo policlonal o TcR policlonal, ya que todos los miembros son de esencialmente el mismo tamaño. La separación por tamaño se puede omitir por completo de la plataforma de caracterización. Algunas de estas técnicas crómate-gráficas - mencionados anteriormente se han empleado en la separación de clases de inmunoglobulina tales como IgA , IgG e IgM (o sub- clases, tales como , lgG1 , lgG2, lgG3 a partir de suero humano . Sin embargo, previamente no se ha realizado la separación con respecto a la diversidad de los anticuerpos individuales en una inmunoglobulina derivada de suero o un anticuerpo policlonal recombinante.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Un método basado en células para la fabricación de, por medios recombinantes, formulaciones de anticuerpos policlonales completamente humanos compuestos de proporciones variables de las clases y subclases de anticuerpos. Preferiblemente , las clases de anticuerpos se seleccionan del grupo que consiste de anticuerpos IgG, anticuerpos Ig, anticuerpos IgA, anticuerpos IgM, anticuerpos similares a Ig, scFv anticuerpos de cadena sencilla , anticuerpos scFv - Fe , fragmentos de anticuerpos Fab, y combinaciones relacionadas.

Claims

REIVINDICACIONES Habiendo descrito con detalle y amplitud, la invención de mi única y exclusiva propiedad, que considero novedosa, solicito y reclamo como de mi propiedad lo contenido en las siguientes cláusulas:
1.- Un método para la identificación de proteínas en una muestra policlonal recombinante que comprende anticuerpos individuales que tienen diferentes regiones variables, comprendiendo dicho método.
2.- El método de la reivindicación 1 , que comprende además al menos una técnica de caracterización proteína seleccionada a partir de i ) análisis de digestiones proteolíticas de los anticuerpos individuales que , ¡i ) secuenciación N- terminal "a granel " , y iii ) análisis usando moléculas detectaras específicas para los anticuerpos individuales.
3. - El método de la reivindicación 1, en el que dos o más análisis cromatográficos se realizan como una cromatografía multidimensional.
4. - El método de la reivindicación 2, en el que el análisis de digestiones proteolíticas de los anticuerpos individuales que se lleva a cabo con el fin de aislar péptidos marcadores N-terminales o péptidos con funcionalidad de la cadena lateral de aminoácidos característica.
5. - El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dichas moléculas de detector específico son péptidos anti-idiotipo o anticuerpos anti-idiotipo.
6. - El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho péptido de anticuerpos anti-idiotipo o anti - idiotipo se utiliza en la determinación de células productoras de proteínas individuales en una línea celular policlonal.
7. - El método de la reivindicación 1 , en el que dicha caracterización se basa en el análisis de una o más proteínas centinela presentes en dicha muestra.
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