CN110573526B - 蜂王浆主蛋白的抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

特异性针对蜂王浆主蛋白的抗体可被用于纯化包括天然蜂王浆主蛋白的蜂王浆主蛋白的方法中。这些方法可产生富集天然蜂王浆主蛋白的组合物。纯化的蜂王浆主蛋白可被用于产生包含天然蜂王浆主蛋白的美容产品。特异性针对蜂王浆主蛋白的抗体可被用于纯化包括天然蜂王浆主蛋白的蜂王浆主蛋白的方法中。这些方法可产生富集天然蜂王浆主蛋白的组合物。纯化的蜂王浆主蛋白可被用于产生包含天然蜂王浆主蛋白的美容产品。分离的核酸编码与蜂王浆主蛋白特异性结合的单克隆抗体。

Description

蜂王浆主蛋白的抗体及其用途

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发明领域

本文中的一些实施方案总体上涉及特异性针对蜂王浆主蛋白(royalactin,RA)的抗体，以及使用此类抗体例如纯化天然蜂王浆主蛋白的方法。

发明概述

一些方面包括纯化天然蜂王浆主蛋白的方法。所述方法可包括使包含天然蜂王浆主蛋白的生物物质溶解在例如水性溶液中。所述方法可包括使包含溶解的生物物质的溶液(如上所述的，例如其可以为水性溶液)与被固定在基质上的单克隆抗体接触，其中所述单克隆抗体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列特异性结合，并且其中所述单克隆抗体与所述天然蜂王浆主蛋白结合。所述方法可包括从所述溶液中分离与天然蜂王浆主蛋白结合的单克隆抗体，例如经由洗涤。所述方法还可包括从所述单克隆抗体去除结合的天然蜂王浆主蛋白，例如通过洗脱，从而纯化天然蜂王浆主蛋白。在一些实施方案中，所述方法还包括制备包含纯化的天然蜂王浆主蛋白的组合物。所述组合物可包含冻干的天然蜂王浆主蛋白，或者可以为包含天然蜂王浆主蛋白的美容产品(例如外用美容产品)的一部分。因此，在一些实施方案中，所述方法产生富集天然蜂王浆主蛋白的组合物。所述组合物可包含至少1％(w/w)的天然蜂王浆主蛋白，例如，至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％13％、14％、15％、16,％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％或90％的天然蜂王浆主蛋白，包括所列值中任意两个之间的范围，例如1％-90％、1％-50％、1％-30％、1％-20％、1％-10％、5％-90％、5％-50％、5％-30％、5％-20％、5％-10％、10％-90％、10％-50％、10％-30％、10％-20％、20％-90％、20％-50％或20％-30％。在一些实施方案中，所述抗体包含小鼠抗体。在一些实施方案中，如本文中所述的用于纯化天然蜂王浆主蛋白的任何方法的抗体包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，所述重链可变区(HCVR)包含：SEQ NO:6的CDR3结构域的CDR3结构域；SEQ NO:6的CDR2结构域的CDR2结构域和SEQ NO:6的CDR1结构域的CDR1结构域，所述轻链可变区(LCVR)包含：SEQ NO:8的CDR3结构域的CDR3结构域；SEQ NO:8的CDR2结构域的CDR2结构域和SEQNO:8的CDR1结构域的CDR1结构域。在一些实施方案中，如本文中所述的用于纯化天然蜂王浆主蛋白的任何方法的抗体包含SEQ ID NO:6的HCVR的HCVR和SEQ ID NO:8的LCVR的LCVR。在一些实施方案中，所述抗体包括抗体4G6C5、抗体8C5C9、抗体8C5D3、抗体4G6E2或抗体9G6A2，或者它们的结合片段。在一些实施方案中，抗体包含：(a)重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，所述重链可变区(HCVR)具有抗体4G6C5的CDR3结构域的CDR3结构域、抗体4G6C5的CDR2结构域的CDR2结构域和抗体4G6C5的CDR1结构域的CDR1结构域，所述轻链可变区(LCVR)具有抗体4G6C5的CDR3结构域的CDR3结构域、抗体4G6C5的CDR2结构域的CDR2结构域和抗体4G6C5的CDR1结构域的CDR1结构域；或(b)HCVR和LCVR，所述HCVR具有抗体8C5C9的CDR3结构域的CDR3结构域、抗体8C5C9的CDR2结构域的CDR2结构域和抗体8C5C9的CDR1结构域的CDR1结构域，所述LCVR具有抗体8C5C9的CDR3结构域的CDR3结构域、抗体8C5C9的CDR2结构域的CDR2结构域和抗体8C5C9的CDR1结构域的CDR1结构域；或(c)HCVR和LCVR，所述HCVR具有抗体8C5D3的CDR3结构域的CDR3结构域、抗体8C5D3的CDR2结构域的CDR2结构域和抗体8C5D3的CDR1结构域的CDR1结构域，所述LCVR具有抗体8C5D3的CDR3结构域的CDR3结构域、抗体8C5D3的CDR2结构域的CDR2结构域和抗体8C5D3的CDR1结构域的CDR1结构域；或(d)HCVR和LCVR，所述HCVR具有抗体4G6E2的CDR3结构域的CDR3结构域、抗体4G6E2的CDR2结构域的CDR2结构域和抗体4G6E2的CDR1结构域的CDR1结构域，所述LCVR具有抗体4G6E2的CDR3结构域的CDR3结构域、抗体4G6E2的CDR2结构域的CDR2结构域和抗体4G6E2的CDR1结构域的CDR1结构域；或(e)HCVR和LCVR，所述HCVR具有抗体9G6A2的CDR3结构域的CDR3结构域、抗体9G6A2的CDR2结构域的CDR2结构域和抗体9G6A2的CDR1结构域的CDR1结构域，所述LCVR具有抗体9G6A2的CDR3结构域的CDR3结构域、抗体9G6A2的CDR2结构域的CDR2结构域和抗体9G6A2的CDR1结构域的CDR1结构域。在一些实施方案中，抗体与上文所列的抗体中的至少一种竞争结合蜂王浆主蛋白。在一些实施方案中，所述生物物质包含昆虫的蜂王浆。在一些实施方案中，所述生物物质包含经基因工程化以产生天然蜂王浆主蛋白的细胞提取物。在一些实施方案中，所述昆虫属于蜂(Apis)属。在一些实施方案中，所述基质包含琼脂糖。在一些实施方案中，分离和去除包括免疫沉淀。在一些实施方案中，使用亲和柱进行所述接触、分离和去除。在一些实施方案中，包含纯化的天然蜂王浆主蛋白(和富集的天然蜂王浆主蛋白)的组合物包含至少30％(w/w)的冻干的天然蜂王浆主蛋白。在一些实施方案中，包含所述天然蜂王浆主蛋白的外用美容产品包括外用洗剂、乳膏、糊剂、胶剂、喷雾剂、粉剂或眉笔。在一些实施方案中，外用美容产品包含至少10％的蜂王浆主蛋白(w/w)。在一些实施方案中，提供了包含如本文中所述的含有纯化的天然蜂王浆主蛋白的组合物的试剂盒。由此，在一些实施方案中，试剂盒包含如本文中所述的富含天然蜂王浆主蛋白的组合物。

一些方面包含分离的单克隆抗体，其与蜂王浆主蛋白特异性结合。在一些实施方案中，所述抗体包括抗体4G6C5、抗体8C5C9、抗体8C5D3、抗体4G6E2或抗体9G6A2，或者这些抗体中的一种的LCVR和HCDR，或者这些抗体中的一种HCDR1、HCDR2、HDCR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，分离的单克隆抗体与上文所列的抗体中的一种竞争结合蜂王浆主蛋白。在一些实施方案中，所述抗体包括小鼠抗体。一些方面包括试剂盒，其包含特异性针对蜂王浆主蛋白的抗体。在一些实施方案中，分离的单克隆抗体包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，所述重链可变区(HCVR)包含：SEQ NO:6的CDR3结构域的CDR3结构域；SEQ NO:6的CDR2结构域的CDR2结构域和SEQ NO:6的CDR1结构域的CDR1结构域，所述轻链可变区(LCVR)包含：SEQ NO:8的CDR3结构域的CDR3结构域；SEQ NO:8的CDR2结构域的CDR2结构域和SEQ NO:8的CDR1结构域的CDR1结构域。在一些实施方案中，所述分离的单克隆抗体包含SEQ ID NO:6的HCVR的HCVR和SEQ ID NO:8的LCVR的LCVR。

一些方面包括分离的核酸，其包含编码与蜂王浆主蛋白特异性结合的分离的单克隆抗体的核酸序列、基本上由编码与蜂王浆主蛋白特异性结合的分离的单克隆抗体的核酸序列组成，或者由编码与蜂王浆主蛋白特异性结合的分离的单克隆抗体的核酸序列组成。在一些实施方案中，分离的单克隆抗体包含(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，所述(HCVR)包含：SEQ NO:6的CDR3结构域的CDR3结构域；SEQ NO:6的CDR2结构域的CDR2结构域和SEQ NO:6的CDR1结构域的CDR1结构域，所述轻链可变区(LCVR)包含：SEQ NO:8的CDR3结构域的CDR3结构域；SEQ NO:8的CDR2结构域的CDR2结构域和SEQ NO:8的CDR1结构域的CDR1结构域。在一些实施方案中，分离的核酸编码与蜂王浆主蛋白特异性结合的抗体，所述蜂王浆主蛋白包含SEQ ID NO:2，基本上由SEQ ID NO:2组成，或者由SEQ ID NO:2组成。在一些实施方案中，编码HCVR的核酸和编码LCVR的核酸包含在同一多核苷酸中。在一些实施方案中，编码HCVR的核酸和编码LCVR的核酸包含在不同的多核苷酸(例如，单独的载体或单独的染色体)中。在一些实施方案中，核酸包含SEQ ID NO:5的核酸和SEQ ID NO:7的核酸，基本上由SEQ IDNO:5的核酸和SEQ ID NO:7的核酸组成，或者由SEQ ID NO:5的核酸和SEQ ID NO:7的核酸组成。SEQ ID NO:5的核酸能够编码重链可变区，并且SEQ ID NO:7的核酸能够编码轻链可变区。在一些实施方案中，SEQ ID NO:5的核酸和SEQ ID NO:7的核酸包含在同一的核酸分子(例如单一载体)中，，并且处于单独的启动子的控制下，或者处于单一启动子的控制下，并且被IRES或2A序列隔开。在一些实施方案中，SEQ ID NO:5的核酸和SEQ ID NO:7的核酸包含在不同的核酸分子中。在一些实施方案中，SEQ ID NO:5的核酸和SEQ ID NO:7的核酸包含在在同一组合物中的不同的核酸分子中。在一些实施方案中，分离的核酸编码与蜂王浆主蛋白特异性结合的分离的单克隆抗体，所述蜂王浆主蛋白包含SEQ ID NO:2的多肽，基本上由SEQ ID NO:2的多肽组成，或者由SEQ ID NO:2的多肽组成。在一些实施方案中，用于表达与蜂王浆主蛋白特异性结合的分离的单克隆抗体的杂交瘤细胞包含SEQ ID NO:5的核酸和的SEQ ID NO:7核酸。

附图简述

图1A是编码蜜蜂的蜂王浆主蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)(GenBank:AF000633.1)的图。图1B是蜂王浆主蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的图。

图2A是在一些实施方案中编码可被用于产生特异性针对蜂王浆主蛋白的抗体的蜂王浆主蛋白融合蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)的图。图2B是蜂王浆主蛋白融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的图。示出了融合蛋白的特定元件，其包括与天然蛋白质共享同一性的区域、FLAG标签和多His标签。

图3A和图3B是根据本文中的一些实施方案的测量特异性针对RA的单克隆抗体的亲和力的斑点免疫印迹测定的图像。

图4A和图4B是根据本文中的一些实施方案的通过与蜂王浆主蛋白结合的五种单克隆抗体中的每一种免疫沉淀蜂王浆主蛋白的考马斯染色的凝胶的图像。五种抗体(抗体19、20、21、22和23)已通过免疫印迹被鉴定为对蜂王浆主蛋白具有最高的亲和力。图4A显示了使用单克隆抗体19和20的500ng RA起始物质的免疫沉淀的结果。图4B显示了使用单克隆抗体21、22和23的500ng RA起始物质的免疫沉淀的结果。

图5A是根据本文中的一些实施方案的使用与蜂王浆主蛋白结合的单克隆抗体免疫沉淀来自蜂王浆的天然蜂王浆主蛋白的考马斯染色SDS-PAGE凝胶的图像。图5B是基于免疫沉淀的投入、NB、洗涤和洗脱物的RA的蛋白质印迹的图像。

图6A-D是示出了一些实施方案的抗体4G6C5的重链可变区和轻链可变区的序列的一系列图。图6A示出了一些实施方案的编码抗体4G6C5的重链可变区的核酸(SEQ ID NO:5)。图6B示出了一些实施方案的包含抗体4G6C5的重链可变区的多肽(SEQ ID NO:6)。图6C示出了一些实施方案的编码抗体4G6C5的轻链可变区的核酸(SEQ ID NO:7)。图6D示出了一些实施方案的包含抗体4G6C5的轻链可变区的多肽(SEQ ID NO:8)。

发明详述

本文中描述了用于纯化蜂王浆主蛋白(RA)蛋白的方法和组合物，以及包含纯化的蜂王浆主蛋白的组合物。在一些实施方案中，使用特异性针对蜂王浆主蛋白的抗体(例如如本文中所述的与天然蜂王浆主蛋白结合的单克隆抗体)纯化蜂王浆主蛋白，以便产生包含纯化的天然蜂王浆主蛋白的组合物。可使包含天然蜂王浆主蛋白的生物物质溶解在水性溶液中，并与特异性针对蜂王浆主蛋白的抗体接触。在一些实施方案中，蜂王浆主蛋白以其天然构象得到纯化，从而产生包含纯化的以其天然构象的蜂王浆主蛋白的组合物。在一些实施方案中，描述了制备包含纯化的天然蜂王浆主蛋白的组合物的方法。在一些实施方案中，提供了特异性针对蜂王浆主蛋白并且与天然蜂王浆主蛋白结合的一种或多种单克隆抗体。

雌性蜜蜂的幼虫可以发育成工蜂或蜂王。蜂王浆是由工蜂分泌的物质。蜂王浆是多种维生素、碳水化合物、脂肪酸和蛋白质的复杂混合物。只有用蜂王浆喂养的雌性幼虫才能发育成蜂王。蜂王浆主蛋白(例如，如SEQ ID NO:2中所示的)是无已知家族成员(即旁系同源物)的单体57kDa蛋白质，其是蜂王浆的组分。已经表明，蜂王浆主蛋白本身能够诱导雌性幼虫分化成蜂王。蜂王浆主蛋白复制了蜂王浆的作用，具有增加的生长速度和增加的寿命。也已经发现，蜂王浆主蛋白在另一种昆虫-黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)或常见的果蝇中蜂王浆主蛋白具有相同的增加生长和寿命的作用。也已经发现，蜂王浆主蛋白在非昆虫线虫-秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中蜂王浆主蛋白具有延长寿命的作用。在昆虫和蠕虫中，都已经发现蜂王浆主蛋白主要通过表皮生长因子受体(EGFR)的成员起作用。这在果蝇(Drosophila)和秀丽隐杆线虫通过使用敲除突变体得到了证明。最后，蜂王浆主蛋白也被证明对哺乳动物细胞具有促有丝分裂作用。考虑到蜜蜂中蜂王浆主蛋白的高保守度，预期蜜蜂属的蜂王浆主蛋白，或者更确切地说，蜂属的昆虫的蜂王浆主蛋白具有如本文中所述的生物活性(如对哺乳动物细胞的促有丝分裂活性和在伤口愈合中的活性)，并且可以使用如本文中所述的抗体和方法进行纯化。因此，如本文中所用的“蜂王浆主蛋白”是指蜂属的蜂王浆主蛋白。此类蜂王浆主蛋白可以在蜂属的昆虫的蜂王浆中找到。在一些实施方案中，蜂王浆主蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白质，或者由具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白质组成。在一些实施方案中，蜂王浆主蛋白由SEQ ID NO:1的核酸编码。在一些实施方案中，蜂王浆主蛋白包括蜂属的蜂王浆主蛋白。在一些实施方案中，蜂王浆主蛋白包括意大利蜂(Apis mellifera)的蜂王浆主蛋白。在一些实施方案中，蜂属的蜂王浆主蛋白还包含亲和力标签，例如his、FLAG和/或HA标签。

预期以其天然构象的蜂王浆主蛋白具有如本文中所示的生物活性，但是包含蜂王浆主蛋白的多肽序列的其他的蛋白质(例如，变性的蜂王浆主蛋白或合成的蜂王浆主蛋白多肽或片段)未必具有这些活性，或者具有不太有效的活性。因此，在一些实施方案中，提供了与蜂王浆主蛋白特异性结合的抗体。特异性针对蜂王浆主蛋白的抗体能够结合天然蜂王浆主蛋白。如本文中所用的“天然的”蜂王浆主蛋白是指未变性的蜂属的蜂王浆主蛋白蛋白质，如可以在蜂王浆找到的，例如，SEQ ID NO:2的蛋白质。抗体可被用于纯化天然蜂王浆主蛋白，以便产生如本文中所述的包含纯化的天然蜂王浆主蛋白的组合物。

抗体

抗体是免疫球蛋白分子类别的成员。全长抗体是具有约150kDa的分子量的异四聚体糖蛋白。参见Janeway等人，Immunobiology，第5版，纽约:Garland Science 2001，其在此通过引用整体并入本文中。典型的抗体包含两条轻链和两条重链，每条轻链包含可变轻链(VL)结构域和轻链恒定区，每条重链包含可变重链(VH)结构域和重链恒定区。抗体的链经由二硫键结合在一起。从N末端到C末端，每个重链可变区包含含有以下区的重链可变区：第一重链框架区(HFR1)、第一重链互补决定区(HCDR1)、第二重链框架区(HFR2)、第二重链互补决定区(HCDR2)、第三重链框架区(HFR3)、第三重链互补决定区(HCDR3)，以及第四重链框架区(HFR4)。重链可变区的下游(朝向C末端方向)是重链恒定区，其包括(从N末端到C末端)恒定重链1(CH1)结构域、恒定重链2(CH2)结构域和恒定重链3(CH3)结构域。在人抗体中，重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4类型。从N末端到C末端，每条轻链包含含有以下区的轻链可变区：第一轻链框架区(LFR1)、第一轻链互补决定区(LCDR1)、第二轻链框架区(LFR2)、第二轻链互补决定区(LCDR2)、第三轻链框架区(LCDR3)、第三轻链互补决定区(LCDR3)和第四轻链框架区(LFR4)。轻链可变区的下游(朝向C末端方向)是轻链恒定区。在人抗体中，轻链恒定区可以是κ型或λ型。CDR代表高变环，并且六个CDR或其子集参与抗体的表位识别和结合。可以根据任何本领域认可的定义对CDR编号，例如Kabat的定义(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))、Chothia的定义(参见Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))，以及AbM定义(Martin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:9268-9272(1989))，它们中的每个在此通过引用整体并入。在一些实施方案中，根据选自Kabat的定义、Chothia的定义、AbM定义、接触定义和IMGT定义的组来定义CDR。如本文中所用的，术语“抗体”涵盖全长单克隆和多克隆抗体，以及它们的功能结合片段，如Fab、Fab’F(ab’)2、Fv、双体抗体等。在一些实施方案中，针对蜂王浆主蛋白的抗体是全长抗体。如果在蛋白质、大分子或其他可能的抗体结合靶标的异源群体中，抗体的结合决定了特定抗原的存在，则抗体将被理解为“特异性地结合”(或与…“特异性结合”，或“特异性针对”，包括这些词根术语的变型)。因此，蜂王浆主蛋白特异性的抗体将被理解为以高于背景的水平结合包含蜂王浆主蛋白的物质，并将被理解为优先结合蜂王浆主蛋白，而与物质中其他的潜在抗原无显著结合。应注意，特异性针对蜂王浆主蛋白的抗体能够结合天然蜂王浆主蛋白，并且还能够结合其他形式的蜂王浆主蛋白，但对天然蜂王浆主蛋白的结合活性将用于纯化天然蜂王浆主蛋白。

可通过将宿主生物体暴露至包含蜂王浆主蛋白的抗原的一次或多次施用，来构建根据本文中的一些实施方案的单克隆抗体。包含蜂王浆主蛋白的抗原还包含载体蛋白质，如钥孔戚血蓝蛋白(KLH)。根据本文中的一些实施方案，多种宿主是合适的，例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、仓鼠、驴、山羊、马等。因此，应理解，在一些实施方案中，可以产生任何期望宿主类型的抗体。在一些实施方案中，宿主包括非人类的哺乳动物。在一些实施方案中，宿主是啮齿目动物，如小鼠或大鼠。可从宿主分离抗体产生的细胞，通常是B细胞。在一些实施方案中，在向宿主初始施用包含蜂王浆主蛋白的抗原后，随后进行一次或多次强化。在一些实施方案中，从抗体产生细胞构建杂交瘤，并筛选杂交瘤以产生具有期望的特性(如对天然蜂王浆主蛋白的亲和力)蜂王浆主蛋白的抗体。在一些实施方案中，产生了包含编码抗体或其结合片段的核酸的噬菌体展示文库(参见Clackson和Wells,Trends Biotech.12:173-184(1994))。可筛选对期望的靶标(例如天然蜂王浆主蛋白)具有亲和力的抗体或结合片段的噬菌体展示文库。因此，噬菌体展示文库可被用于具有合适的亲和力的抗体的初步筛选，并且也可以被用于筛选对天然蜂王浆主蛋白具有合适的亲和力的变体，例如被用于筛选先导单克隆抗体的更高亲和力的变体。在一些实施方案中，筛选噬菌体展示文库以鉴定编码对天然蜂王浆主蛋白具有合适的结合特性的抗体的核酸。在一些实施方案中，噬菌体展示文库被用于筛选与天然蜂王浆主蛋白结合的单克隆抗体的高亲和力变体。可针对包含溶解的天然蜂王浆主蛋白(例如天然蜂王浆主蛋白)的水性溶液筛选噬菌体展示文库。产生单克隆抗体的技术被论述于例如，Greenfield(2014),Antibodies:A Laboratory Manual,第二版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约，其在此通过引用整体并入。

在一些实施方案中，两种或更多种单克隆抗体竞争结合蜂王浆主蛋白(例如天然蜂王浆主蛋白)上的表位。如本文中所用的，当第一抗体抑制第二抗体与蜂王浆主蛋白的常见表位的结合时，两种抗体“竞争”结合蜂王浆主蛋白。可以使用多种合适的测定(例如竞争ELISA或竞争放射免疫测定)确定竞争。例如，可在未标记的(或不同标记的)特异性针对蜂王浆主蛋白的第二抗体存在或不存在下，确定标记的特异性针对蜂王浆主蛋白的第一抗体的结合，以确定在第二抗体存在下标记的第一抗体的结合是否减少。可以直接或间接标记第一抗体。一些表位可以是线性的表位，其代表了蜂王浆主蛋白上特定的残基集合，并且可以例如，通过对与蜂王浆主蛋白肽和/或缺失肽的结合的抗体绘图来进行确认。例如，根据一些实施方案的蜂王浆主蛋白的线性表位可包含SEQ ID NO:2的残基1-10、11-20、21-30、31-40、41-50、51-60、61-70、71-80、81-90、91-100、101-110、111-120、121-130、131-140、141-150、151-160、161-170、171-180、181-190、191-200、201-210、211-220、221-230、231-240、241-250、251-260、261-270、271-280、281-290、291-300、301-310、311-320、321-330、331-340、341-350、351-360、361-370、371-380、381-390、391-400、401-410、411-420或421-432中的表位。一些表位可以是构象的，并且由于天然蜂王浆主蛋白的三维结构，由此可以存在于天然蜂王浆主蛋白上，但未必在蜂王浆主蛋白的初级氨基酸序列中包含连续的残基。由此，在一些实施方案中，如本文中所述的特异性针对蜂王浆主蛋白的单克隆抗体特异性结合天然蜂王浆主蛋白上的构象表位，但以较低的亲和力与变性的蜂王浆主蛋白结合，或者不显著地与变性的蜂王浆主蛋白结合。在一些实施方案中，如本文中所述的特异性针对蜂王浆主蛋白的单克隆抗体与蜂王浆主蛋白上的线性表位特异性结合。在一些实施方案中，抗体与以下抗体中的至少一种竞争结合蜂王浆主蛋白：抗体4G6C5、抗体8C5C9、抗体8C5D3、抗体4G6E2或抗体9G6A2，或者包含任何所列抗体的六个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3)的抗体。在一些实施方案中，针对蜂王浆主蛋白的抗体与抗体4G6C5、抗体8C5C9、抗体8C5D3、抗体4G6E2或抗体9G6A2中的两种或更多种竞争结合蜂王浆主蛋白。在图6B和图6D中分别显示了抗体4G6C5的HCVR序列和LCVR序列。在图6A和图6C中分别显示了编码所示的HCVR和LCVR的核酸。应理解，在本文中无论在何处提及抗体“4G6C5”(或该词根术语变型，如“mAb 4G6C5”、“克隆4G6C5”等)，都可以明确地预期包含HCVR和LCVR的抗体，所述HCVR包含：SEQ NO:6的CDR3结构域的CDR3结构域；SEQ NO:6的CDR2结构域的CDR2结构域和SEQ NO:6的CDR1结构域的CDR1结构域，所述LCVR，其包含SEQ NO:8的CDR3结构域的CDR3结构域；SEQ NO:8的CDR2结构域的CDR2结构域和SEQ NO:8的CDR1结构域的CDR1结构域。应理解，在本文中无论在何处提及抗体“4G6C5”(或该词根术语的变型)，也可以明确地预期包含为SEQ NO:6中的HCVR的HCVR和为SEQ NO:8的LCVR的LCVR的抗体。

在一些实施方案中，分离的单克隆抗体(其可被用作如本文中所述的用于纯化天然蜂王浆主蛋白的任何方法的抗体)包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，所述重链可变区(HCVR)包含：SEQ NO:6的CDR3结构域的CDR3结构域；SEQ NO:6的CDR2结构域的CDR2结构域和SEQ NO:6的CDR1结构域的CDR1结构域，所述轻链可变区(LCVR)包含：SEQ NO:8的CDR3结构域的CDR3结构域；SEQ NO:8的CDR2结构域的CDR2结构域和SEQ NO:8的CDR1结构域的CDR1结构域。在一些实施方案中，分离的单克隆抗体(其可被用作如本文中所述的用于纯化天然蜂王浆主蛋白的任何方法的抗体)包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，所述重链可变区(HCVR)包含：SEQ NO:6的CDR3结构域的CDR3结构域；SEQ NO:6的CDR2结构域的CDR2结构域和SEQ NO:6的CDR1结构域的CDR1结构域，所述轻链可变区(LCVR)包含：SEQ NO:8的CDR3结构域的CDR3结构域；SEQ NO:8的CDR2结构域的CDR2结构域和SEQNO:8的CDR1结构域的CDR1结构域，并且所述HCVR包含与SEQ ID NO:6至少85％相同的多肽，和所述LCVR包含与SEQ ID NO:8至少85％相同的多肽。例如，所述HCVR可包含与SEQ ID NO:6至少90％相同的多肽，并且所述LCVR可包含与SEQ ID NO:8至少90％相同的多肽。例如，所述HCVR可包含与SEQ ID NO:6至少95％相同的多肽，并且所述LCVR可包含与SEQ ID NO:8至少95％相同的多肽。例如，所述HCVR可包含与SEQ ID NO:6至少97％相同的多肽，并且所述LCVR可包含与SEQ ID NO:8至少97％相同的多肽。例如，所述HCVR可包含与SEQ ID NO:6具有至少99％相同的多肽，并且所述LCVR可包含与SEQ ID NO:8至少99％相同的多肽。在一些实施方案中，分离的单克隆抗体(其可被用作如本文中所述的用于纯化天然蜂王浆主蛋白的任何方法的抗体)包含SEQ ID NO:6的HCVR的HCVR和SEQ ID NO:8的LCVR的LCVR。

一些实施方案包括编码与蜂王浆主蛋白特异性结合的分离的单克隆抗体的核酸。在一些实施方案中，核酸可编码包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)的抗体，所述重链可变区(HCVR)包含：SEQ NO:6的CDR3结构域的CDR3结构域；SEQ NO:6的CDR2结构域的CDR2结构域和SEQ NO:6的CDR1结构域的CDR1结构域，所述轻链可变区(LCVR)包含：SEQ NO:8的CDR3结构域的CDR3结构域；SEQ NO:8的CDR2结构域的CDR2结构域和SEQ NO:8的CDR1结构域的CDR1结构域。在一些实施方案中，核酸包含SEQ ID NO:5的核酸序列和SEQ ID NO:7的核酸序列，基本上由SEQ ID NO:5的核酸序列和SEQ ID NO:7的核酸序列组成，或由SEQID NO:5的核酸序列和SEQ ID NO:7的核酸序列组成。SEQ ID NO:5的核酸能够编码与蜂王浆主蛋白特异性结合的抗体的HCVR，并且SEQ ID NO:7的核酸能够编码与蜂王浆主蛋白特异性结合的抗体的LCVR。在一些实施方案中，SEQ ID NO:5的核酸和SEQ ID NO:7的核酸是同一多核苷酸的一部分(例如，位于同一载体或同一染色体上)。在一些实施方案中，SEQ IDNO:5的核酸和SEQ ID NO:7的核酸是不同多核苷酸的一部分(例如，在不同的载体或不同的染色体上)。

在一些实施方案中，提供了天然蜂王浆主蛋白的多克隆抗体。多克隆抗体未必与天然蜂王浆主蛋白上的同一表位结合，并因此，未必彼此竞争结合。可以通过用包含如本文中所述的蜂王浆主蛋白的抗原免疫宿主获得多克隆抗体(其也可被称为“抗血清”)。可以获得来自宿主的免疫血清，并可通过亲和纯化(例如亲和层析或免疫沉淀)获得对蜂王浆主蛋白具有亲和力的多克隆抗体。例如，可以将蜂王浆主蛋白(天然构象的蜂王浆主蛋白)如固定在固相上，并与多克隆血清接触，使得特异性针对蜂王浆主蛋白的多克隆抗体与固相上固定的天然蜂王浆主蛋白结合。然后可以洗涤固相以去除非特异性针对蜂王浆主蛋白的抗体以及任何非期望的物质。然后，可以从固相去除特异性针对蜂王浆主蛋白的抗体，例如通过洗脱。

纯化蜂王浆主蛋白的方法

一些实施方案包括纯化蜂王浆主蛋白的方法。应注意，如本文中所用的“纯化”期望的物质(如天然蜂王浆主蛋白)是指将该物质与异源组合物中的其他的物质分离，例如通过从异源组合物中去除并保留期望的物质，和/或通过从异源组合物中大量地去除其他的物质。由此，“纯化的”蜂王浆主蛋白(包含该词根术语的变型)不必完全由蜂王浆主蛋白组成，但也包括其中相比起始异源组合物蜂王浆主蛋白被大量富集的组合物。因此，如根据本文中的一些实施方案所论述的纯化蜂王浆主蛋白的方法将被理解为产生富含蜂王浆主蛋白的组合物，例如其包含蜂王浆主蛋白(如天然蜂王浆主蛋白)、基本上由蜂王浆主蛋白(如天然蜂王浆主蛋白)组成，或由蜂王浆主蛋白(如天然蜂王浆主蛋白)组成。其中蜂王浆主蛋白被大量富集的此类组合物的产品也应被理解为包含纯化的蜂王浆主蛋白。出于相似的原因，粗制生物提取物(包含蜂王浆主蛋白和其他的物质)应被理解为不包含如本文中所用的“纯化的”蜂王浆主蛋白。该方法可包括使包含天然蜂王浆主蛋白的生物物质溶解在水性溶液中。该方法可包括使包含溶解的生物物质的水性溶液与被固定在基质上的抗体接触，其中单克隆抗体与蜂王浆主蛋白特异性结合。抗体可与天然蜂王浆主蛋白结合。该方法可包括从水性溶液分离与抗体结合的天然蜂王浆主蛋白(例如，通过去除水性溶液、通过洗涤抗体和基质，和/或通过从水性溶液去除基质)。然后可以从基质去除结合的天然蜂王浆主蛋白，例如通过洗脱。由此获得的天然蜂王浆主蛋白代表了包含纯化的天然蜂王浆主蛋白的组合物。在一些实施方案中，包含纯化的蜂王浆主蛋白的组合物包含至少1％(w/w)的天然蜂王浆主蛋白，例如，至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％13％、14％、15％、16,％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％或90％的天然蜂王浆主蛋白，包括所列值的任意两个之间的范围，例如1％-90％、1％-50％、1％-30％、1％-20％、1％-10％、5％-90％、5％-50％、5％-30％、5％-20％、5％-10％、10％-90％、10％-50％、10％-30％、10％-20％、20％-90％、20％-50％或20％-30％。在一些实施方案中，纯化的蜂王浆主蛋白经历进一步的纯化，例如过滤、离心、尺寸排阻层析，或者一轮或多轮另外的使用特异性针对蜂王浆主蛋白的抗体的亲和纯化。在一些实施方案中，纯化的天然蜂王浆主蛋白被用于产生包含如本文中所述的天然蜂王浆主蛋白的美容产品。在一些实施方案中，纯化的天然蜂王浆主蛋白被包含在试剂盒中，以用于产生如本文中所述的美容产品。此外，应理解，在本文中无论在何处公开了纯化蜂王浆主蛋白的方法并且该方法包括抗体，也可以明确地预期用于纯化蜂王浆主蛋白的抗体。

在一些实施方案中，针对蜂王浆主蛋白的抗体可被用于通过以下步骤富集或纯化天然蜂王浆主蛋白：将抗体固定在基质上，将水性溶液中的天然蜂王浆主蛋白与抗体结合，从残留的水性溶液分离结合的蜂王浆主蛋白(例如，通过洗涤和/或从水性溶液物理分离基质)，以及洗脱(或者否则去除)结合的天然蜂王浆主蛋白。在一些实施方案中，抗体包括以下抗体、基本上由以下抗体组成，或由以下抗体组成：包含SEQ NO:6的CDR3结构域的CDR3结构域；SEQ NO:6的CDR2结构域的CDR2结构域和SEQ NO:6的CDR1结构域的CDR1结构域；和轻链可变区(LCVR)的抗体，所述轻链可变区(LCVR)包含SEQ NO:8的CDR3结构域的CDR3结构域；SEQ NO:8的CDR2结构域的CDR2结构域和SEQ NO:8的CDR1结构域的CDR1结构域。在一些实施方案中，抗体包括以下抗体、基本上由以下抗体组成，或由以下抗体组成：包含SEQ IDNO:6的HCVR的HCVR和SEQ ID NO:8的LCVR的LCVR的抗体。在一些实施方案中，抗体包括抗体4G6C5、抗体8C5C9、抗体8C5D3、抗体4G6E2或抗体9G6A2中的一种或多种。在一些实施方案中，抗体与抗体4G6C5、抗体8C5C9、抗体8C5D3、抗体4G6E2或抗体9G6A2中的一种或多种竞争结合蜂王浆主蛋白。根据本文中的一些实施方案，多种合适的技术可被用于将抗体固定在基质上。例如，可通过与活化的珠(实例包括Affi-gel 10,Biorad Laboratories,Richmond,CA)共价偶联或通过使抗体与已偶联至对IgG具有高亲和力的蛋白质如蛋白A(实例包括Pierce蛋白A加琼脂糖(Pierce Protein A Plus Agarose),ThermoFisherScientific,沃尔瑟姆,MA)的珠接触，来将抗体固定在基质上。在一些实施方案中，特异性针对蜂王浆主蛋白的抗体被用于经由免疫沉淀纯化天然蜂王浆主蛋白。在一些实施方案中，特异性针对蜂王浆主蛋白的抗体被用于经由亲和层析纯化天然蜂王浆主蛋白。在一些实施方案中，在天然蜂王浆主蛋白与基质上的抗体结合后，进行一次或多次洗涤，以便在洗脱或否则去除结合的天然蜂王浆主蛋白之前，从已包含蜂王浆主蛋白的初始溶液分离基质和抗体。

在一些实施方案中，例如通过共价连接(如交联)将特异性针对蜂王浆主蛋白的抗体直接固定在基质上。在一些实施方案中，例如通过使特异性针对蜂王浆主蛋白的抗体与被固定在基质上的第二抗体接触而将特异性针对蜂王浆主蛋白的抗体间接固定在基质上，其中所述第二抗体对于特异性针对蜂王浆主蛋白的抗体的宿主是特异性的。

在一些实施方案中，对包含亲和标签(例如his或FLAG)或者血球凝集素(HA)标签的蜂王浆主蛋白进行亲和纯化。可以在细胞培养物(例如包含编码亲和标记的蜂王浆主蛋白的核酸的昆虫或细菌细胞)中产生此类亲和标记的蜂王浆主蛋白蛋白质。可以使蜂王浆主蛋白与对亲和标签具有亲和力的固相接触。例如，固相中的重金属离子(如Ni或Co)可能对his标签具有亲和力。例如，固相上固定的抗体可能对FLAG或HA标签具有亲和力。举例来说，在SEQ ID NO:4中显示了包含his和FLAG标签的蜂王浆主蛋白蛋白质。如实施例1中所示的，对该亲和标记的蜂王浆主蛋白蛋白质进行亲和纯化，且显示其具有生物活性。

在一些实施方案中，基质包含顺磁性的珠，以有助于富集或纯化过程(实例包括Dynabeads蛋白A磁珠(Dynabeads Protein A Magnetic Beads),ThermoFisherScientific,沃尔瑟姆,MA)。过程类似于上文所示的批量纯化方法，除了使用磁体而非离心收集珠外。在一些实施方案中，基质包含琼脂糖，例如琼脂糖珠或琼脂糖树脂。

在一些实施方案中，使包含蜂王浆主蛋白的生物物质(例如，蜂王浆、细胞培养物或细胞培养物提取物)的粗制溶液与特异性针对蜂王浆主蛋白的抗体接触。在一些实施方案中，溶液是水性溶液。在一些实施方案中，包含蜂王浆主蛋白的生物物质包含蜂王浆、由蜂王浆组成，或者基本上由蜂王浆组成。在一些实施方案中，包含蜂王浆主蛋白的生物物质包含细胞培养物或其提取物(例如表达蜂王浆主蛋白的转基因细胞的培养物)、由细胞培养物或其提取物(例如表达蜂王浆主蛋白的转基因细胞的培养物)组成，或基本上由细胞培养物或其提取物(例如表达蜂王浆主蛋白的转基因细胞的培养物)组成。在一些实施方案中，细胞包括细菌细胞或昆虫细胞。在一些实施方案中，包含天然蜂王浆主蛋白的生物物质的溶液在与蜂王浆主蛋白特异性的抗体接触之前，经历一个或多个初始纯化步骤。例如，在一些实施方案中，包含蜂王浆主蛋白的生物物质的溶液可经历初始轮的过滤、离心、尺寸排阻层析等，以对其富集蜂王浆主蛋白和/或去除非期望的物质。然后可对经历初始纯化的溶液进一步进行如本文中所述的使用针对蜂王浆主蛋白的抗体纯化蜂王浆主蛋白的方法。

在一些实施方案中，将在基质(例如，珠)上固定的特异性针对蜂王浆主蛋白的抗体放入柱中，并使包含含有天然蜂王浆主蛋白的生物物质的溶液通过柱。几次洗涤之后，使用使抗原和抗体分离的特异性的缓冲液洗脱天然蜂王浆主蛋白，并在来自柱的溢流物(flowthrough)中收集。因此可以获得纯化的天然蜂王浆主蛋白，产生包含纯化的天然蜂王浆主蛋白的组合物。在一些实施方案中，可以在批量方法中进行纯化。代替使用柱，将珠添加到粗制溶液中。可使用离心使珠成团，并使用相同的方法对其进行洗涤。最终的洗脱也可以与用柱的洗脱相同，除了最终的洗脱在将珠离心下来后吸走它们外。因此可以获得纯化的天然蜂王浆主蛋白，产生包含纯化的天然蜂王浆主蛋白的组合物。

包含纯化的天然蜂王浆主蛋白的组合物

在一些实施方案中，如本文中所述的纯化蜂王浆主蛋白的方法产生富含纯化的天然蜂王浆主蛋白、由纯化的天然蜂王浆主蛋白组成，或者基本上由纯化的天然蜂王浆主蛋白组成的组合物。在一些实施方案中，组合物包含在溶剂(如水性溶液)中的天然蜂王浆主蛋白。在一些实施方案中，组合物包含干燥形式(如冻干的或喷雾干燥的)的纯化的天然蜂王浆主蛋白。预期包含纯化的天然蜂王浆主蛋白的组合物可用于“美容产品”(其在本文中也可被称为“美容性组合物”，包括任一词根术语的变型)。在一些实施方案中，美容产品包含外用美容产品，如外用洗剂、乳膏、糊剂、剂胶、喷雾剂、粉剂、眉笔等。因此，在一些实施方案中，美容产品包含如本文中所述的纯化的天然蜂王浆主蛋白。在一些实施方案中，将包含纯化的天然蜂王浆主蛋白的组合物被用于制备包含天然蜂王浆主蛋白的美容产品。在一些实施方案中，使用如本文中所述的纯化方法产生包含纯化的天然蜂王浆主蛋白的组合物，然后被用于制备包含天然蜂王浆主蛋白的美容产品，而没有中间步骤。在一些实施方案中，例如通过冻干或喷雾干燥来干燥包含纯化的天然蜂王浆主蛋白的组合物，并且可以随后被用于制备包含天然蜂王浆主蛋白的美容产品。在一些实施方案中，包含纯化的天然蜂王浆主蛋白的组合物包括在试剂盒中，以用于制备包含天然蜂王浆主蛋白的美容产品。在一些实施方案中，试剂盒还包括指导使用者如何可以将包含纯化的天然蜂王浆主蛋白的组合物掺入到美容产品中的说明书。在一些实施方案中，试剂盒还包括指导使用者如何重构包含纯化的天然蜂王浆主蛋白的组合物的说明书。在一些实施方案中，包含纯化的天然蜂王浆主蛋白的组合物包含至少1％(w/w)的天然蜂王浆主蛋白，例如，至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16,％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％或90％的天然蜂王浆主蛋白，包括所列值的任意两个之间的范围，例如1％-90％、1％-50％、1％-30％、1％-20％、1％-10％、5％-90％、5％-50％、5％-30％、5％-20％、5％-10％、10％-90％、10％-50％、10％-30％、10％-20％、20％-90％、20％-50％或20％-30％。

在一些实施方案中，包含天然蜂王浆主蛋白的美容产品包含至少1％(w/w)的天然蜂王浆主蛋白，例如，至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％13％、14％、15％、16,％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％或80％的蜂王浆主蛋白，包括所列值的任意两个之间的范围，例如1％-80％、1％-50％、1％-30％、1％-20％、1％-10％、5％-80％、5％-50％、5％-30％、5％-20％、5％-10％、10％-80％、10％-50％、10％-30％、10％-20％、20％-80％、20％-50％或20％-30％的天然蜂王浆主蛋白。如本文中所述的包含纯化的蜂王浆主蛋白的此类美容产品可以是如本文中所述的外用美容产品。如本文中所述的，预期根据本文中的一些实施方案的包含纯化的天然蜂王浆主蛋白的此类美容产品可以具有生物活性，如刺激集落形成和/或刺激伤口愈合。

实施例

实施例1：具有伤口愈合活性的His标记的蜂王浆主蛋白蛋白质的产生

过去，已经报道(蜂属的)蜜蜂的蜂王浆可增强一些哺乳动物细胞的增殖并促进伤口愈合。蜂王浆主蛋白是主要的蜂王浆蛋白质中较丰富的蛋白质之一，并且发明人推测其可能是主要成分。蜂王浆主蛋白蛋白的序列是已知的，并且制备了具有组氨酸标签的包括全长蜂王浆主蛋白蛋白质的细菌融合蛋白(SEQ ID NO:4)。通过将粗制裂解物施加到连接了重金属离子以进行纯化的柱来纯化该蛋白质，然后被用于处理培养物中的细胞。

对U937(人骨髓谱系)细胞系和HEK293(人胚肾)细胞系进行了观察集落形成单位的体外实验，且证明了在纯化蛋白的存在下的集落形成增加。该结果也被扩展到胚胎干细胞，并且观察到相似的结果。最后，将纯化的蛋白用于延迟伤口愈合的动物模型-糖尿病(db/db)小鼠上。这显示蛋白质的应用引起伤口愈合的大约50％的提高。因此，His标记的蜂王浆主蛋白蛋白质(SEQ ID NO:2)在多种人类细胞类型和延迟伤口愈合的小鼠模型中具有刺激集落形成的生物活性。

实施例2：针对蜂王浆主蛋白的抗体的产生

在细菌中产生并纯化了含有具有组氨酸标签的全长蜂王浆主蛋白(SEQ ID NO:2)的融合蛋白，其被证实具有实施例1中的生物活性。通过注射至小鼠中将该蛋白质用于产生单克隆抗体，随后收获脾脏用于产生多个杂交瘤，而。分离单独的杂交瘤，并使用斑点免疫印迹测定筛选产生的抗体。将各种浓度的蜂王浆主蛋白点在印迹上，用牛血清白蛋白(BSA)作为对照。使用斑点免疫印迹测定测试总共30个单独的杂交瘤(图3A和图3B)，并选择对蜂王浆主蛋白具有最高亲和力的5个用于进一步分析(杂交瘤#19、20、21、22和23)。

下表1中概括了蛋白质斑点印迹(Western dot blot)的结果：

表1

实施例3：通过抗体免疫沉淀蛋白质

使用免疫沉淀实验进一步测试通过了初始筛选的上述抗体结合蜂王浆主蛋白的能力。在不同量的被测试单克隆抗体中，孵育500ng的纯化的蜂王浆主蛋白。结合后，添加蛋白A连接的琼脂糖珠以免疫沉淀抗体和结合的蛋白质。将沉淀物在SDS-PAGE凝胶上进行电泳，以证明所鉴定的蛋白质具有适当的大小，并部分定量所结合的蛋白质的量。虽然发现所有抗体均能适当地结合蛋白质，但抗体#19和20具有略微更好的蛋白质沉淀。结果，选择了单克隆抗体#19进一步用于从蜂王浆中制备富集的提取物。

实施例4：缀合的抗体结合蜂王浆主蛋白的能力

首先，证明了单克隆抗体能够使用纯化的蛋白质富集蜂王浆主蛋白的能力。测试了5种单克隆抗体-抗体19(4G6C5)、20(8C5C9)、21(8C5D3)、22(4G6E2)和23(9G6A2)。将不同量的单克隆抗体缀合到珠支持物上。缀合后，将少量的纯化的蜂王浆主蛋白与珠一起孵育，以允许结合。然后分离并洗涤珠，并通过考马斯染色分析结合的蛋白。图4A和图4B中显示了考马斯-染色凝胶。NB是IP的溢流物。洗脱的是IP后的级分(回收的样本)。箭头所指的是蜂王浆主蛋白的条带(图4A中的白色箭头；图4B中的黑色箭头)。

如通过在洗涤中没有可检测的条带而在洗脱中存在强的条带所证明的，本实验证明了缀合的抗体能够结合几乎所有的蜂王浆主蛋白蛋白。

实施例5

蜂王浆主蛋白的样品富集方案。进行了小规模实验以证明从蜂王浆中富集蜂王浆主蛋白的方案。将1g的蜂王浆溶解在34ml Tris pH7缓冲液中。混合物的蛋白质测定(BCA)证明了总蛋白质的蛋白质浓度为3.22mg/ml。将单克隆抗体#19(4G6C5)缀合至Dynabead^TM支持物。缀合后，将1mg的总蜂王浆蛋白添加到缀合的抗体中并允许结合。然后分离并洗涤珠，并在SDS-PAGE上分离结合的蛋白质。然后用特异性针对蜂王浆主蛋白的抗体对该滤膜进行免疫印迹，以证明单克隆抗体显著富集适当大小的条带的能力。结果显示在图5A(考马斯染色SGS-PAGE)和图5B(使用针对RA的多克隆抗体的抗RA蛋白质印迹)中，并证实富集了对应于蜂王浆主蛋白的大小条带中的蛋白质。

实施例6

对根据一些实施方案的编码单克隆抗体#19(4G6C5)的HCVR和LCVR的核酸进行了测序。在图6A中显示了编码HCVR(SEQ ID NO:5)的核酸，并且在图6B中显示了对应的翻译的HCVR多肽(SEQ ID NO:6)。在图6C中显示了编码LCVR(SEQ ID NO:7)的核酸，并且在图6D中显示对应的翻译的LCVR多肽(SEQ ID NO:8)。

尽管本文中已经公开了不同的方面和实施方案，但是其他的方面和实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。本文中公开的不同的方面和实施方案是出于说明的目的，并且并非旨在为限制的，真实的范围和精神通过以下权利要求指出。本领域的技术人员将理解，对于本文中公开的该过程和方法以及其他的过程和方法，可以以不同顺序来实施在过程和方法中进行的功能。此外，所概述的步骤和操作仅作为实例提供，并且一些步骤和操作可以是任选的、组合至较少的步骤和操作中，或者扩展至另外的步骤和操作中，而不背离所公开的实施方案的实质。

尽管本文中已经公开了不同的方面和实施方案，但是其他的方面和实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。本文中公开的不同的方面和实施方案是出于说明的目的，并且并非旨在为限制的，真实的范围和精神通过以下权利要求指出。

关于本文中基本上任何复数的和/或单数的术语的使用，本领域技术人员可以从复数转化为单数，和/或从单数转化为复数，只要适合于上下文和/或应用。为了清楚起见，在本文中可以明确地阐述各种单数/复数置换。

本领域技术人员将理解，通常，在本文中且尤其是在所附权利要求(例如，所附权利要求的主体)中使用的术语通常旨在为“开放性”术语(例如，术语“包括(including)”应该被解释为“包括但不限于”，术语“具有”应被解释为“具有至少”，术语“包括(includes)”应被解释为“包括但不限于”等等)。本领域技术人员还将理解，如果旨在特定数量的引入的权利要求陈述，则在权利要求中将明确地陈述这样的意图，并且在没有这样的陈述的情况下，不存在这样的意图。例如，为帮助理解，以下所附的权利要求可能含有引入性短语“至少一个/种”和“一个/种或多个/种”的使用，以引入权利要求陈述。然而，使用这样的短语不应解释为暗示通过不定冠词“一个/种(a/an)”引入的权利要求陈述将含有此类引入的权利要求陈述的任何特定权利要求限制于仅含有一个此类陈述的实施方案，即使当同一权利要求包括引入性短语“一个/种或多个/种”或“至少一个/种”以及不定冠词如“一个/种(a/an)”时(例如“一个/种(a/an)”应解释为意指“至少一个/种”或“一个/种或多个/种”)；对于用于引入权利要求陈述的定冠词的使用同样如此。另外，即使明确陈述了特定数量的引入的权利要求陈述，本领域技术人员将认可此类陈述不应解释为意指至少所述的数量(例如，仅陈述“两种陈述”而无其他的修饰，意指至少两种陈述，或者两种或更多种陈述)。此外，在使用类似于“A、B和C中的至少一个/种等”的惯例的那些情况下，通常，此类结构旨在具有本领域技术人员将理解所述惯例的含义(例如，“具有A、B和C中的至少一种的抗体”将包括但不限于具有仅A、仅B、仅C、A和B一起、A和C一起、B和C一起，和/或A、B和C一起等等的抗体)。在使用类似于“A、B或C中的至少一个/种等”的惯例的那些情况下，通常，此类结构旨在具有本领域技术人员将理解所述惯例的含义(例如，“具有A、B或C中的至少一种的抗体”将包括但不限于具有仅A、仅B、仅C、A和B一起、A和C一起、B和C一起，和/或A、B和C一起等等的系统)。本领域技术人员还将理解，无论是在说明书、权利要求书或附图中，事实上显示两个或更多个可替代性术语的任何分隔的词语和/或短语均应理解为考虑了包括术语中的一个、术语中的任一个或术语中的两个的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。

另外，在根据马库什组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到本公开也因此根据马库什组的任何单个成员或成员的子组来描述。

如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，如就提供书面描述而言，本文中公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何所列的范围都可以容易地被认为是充分描述，并且使得能够将相同的范围分解为至少等半、三等分、四等分、五等分、十等分等。作为非限制性的实例，可以容易地将本文中论述的每个范围分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，诸如“多达”、“至少”等的所有语言均包括所陈述的数字，并且指随后可以按上文所论述的分解为子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1个、2个或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个细胞的组，依此类推。

从前述内容将理解，出于说明的目的，已经在本文中描述了本公开的不同的实施方案，并且可以在不脱离本公开的范围和精神的情况下进行各种修改。因此，本文中公开的不同的实施方案并不旨在为限制的，真实的范围和精神通过以下权利要求书指出。

序列表

<110> 威尔科学公司(WYL Sciences Inc.)

Yang, George P.

Wang, Kevin C.

Wan, Derrick C.

<120> 蜂王浆主蛋白的抗体及其用途

<130> WYLS.001WO

<150> 62/485263

<151> 2017-04-13

<160> 8

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 1299

<212> DNA

<213> 意大利蜂(Apis melifera)

<220>

<221> misc_feature

<222> 1089

<223> n = A、T、C或G

<400> 1

atgacaagat tgtttatgct ggtatgcctt ggcatagttt gtcaaggtac gacaggcaac 60

attcttcgag gagagtcttt aaacaaatca ttacccatcc ttcacgaatg gaaattcttt 120

gattatgatt tcggtagcga tgaaagaaga caagatgcaa ttctatctgg cgaatacgac 180

tacaagaata attatccatc cgacattgac caatggcatg ataagatttt tgtcaccatg 240

ctgagataca atggcgtacc ttcctctttg aacgtgatat ctaaaaaggt cggtgatggt 300

ggtcctcttc tacaacctta tcccgattgg tcgtttgcta aatatgacga ttgctctgga 360

atcgtgagcg cctcaaaact tgcgatcgac aaatgcgaca gattgtgggt tctggactca 420

ggtcttgtca ataatactca acccatgtgt tctccaaaac tgctcacctt tgatctgact 480

acctcgcaat tgctcaagca agttgaaata ccacatgatg ttgccgtaaa tgccactaca 540

ggaaagggaa gattatcatc tctagctgtt caatctttag attgcaatac aaatagcgat 600

actatggtgt acatagcaga cgagaaaggt gaaggtttaa tcgtgtatca taattctgat 660

gattccttcc atcgattgac ttccaacact ttcgattacg atcctaaatt taccaaaatg 720

acgatcgatg gagaaagtta cacagcccaa gatggaattt ctggaatggc tcttagtccc 780

atgactaaca atctctatta cagtcctgta gcttccacca gtttgtatta tgttaacacg 840

gaacaattca gaacatccga ttatcaacag aatgacatac attacgaagg agtccaaaat 900

attttggata cccaatcgtc cgctaaagta gtatcaaaga gtggcgttct cttcttcgga 960

ttggtgggcg attcagctct tggctgctgg aacgaacatc gaacacttga aagacacaat 1020

atccgtaccg tcgctcaaag tgatgagact cttcaaatga tcgctagcat gaagattaag 1080

gaagctctnc cacacgtgcc tatattcgat aggtatataa accgtgaata catattggtt 1140

ttaagtaaca aaatgcaaaa aatggtgaat aatgacttca acttcgacga tgttaacttc 1200

agaattatga acgcgaatgt aaacgaattg atattgaaca ctcgttgcga aaatcccgat 1260

aatgatcgaa cacctttcaa aatttcaatc catttgtaa 1299

<210> 2

<211> 432

<212> PRT

<213> 意大利蜂(Apis melifera)

<220>

<221> VARIANT

<222> 363

<223> Xaa = 任何氨基酸

<400> 2

Met Thr Arg Leu Phe Met Leu Val Cys Leu Gly Ile Val Cys Gln Gly

1 5 10 15

Thr Thr Gly Asn Ile Leu Arg Gly Glu Ser Leu Asn Lys Ser Leu Pro

20 25 30

Ile Leu His Glu Trp Lys Phe Phe Asp Tyr Asp Phe Gly Ser Asp Glu

35 40 45

Arg Arg Gln Asp Ala Ile Leu Ser Gly Glu Tyr Asp Tyr Lys Asn Asn

50 55 60

Tyr Pro Ser Asp Ile Asp Gln Trp His Asp Lys Ile Phe Val Thr Met

65 70 75 80

Leu Arg Tyr Asn Gly Val Pro Ser Ser Leu Asn Val Ile Ser Lys Lys

85 90 95

Val Gly Asp Gly Gly Pro Leu Leu Gln Pro Tyr Pro Asp Trp Ser Phe

100 105 110

Ala Lys Tyr Asp Asp Cys Ser Gly Ile Val Ser Ala Ser Lys Leu Ala

115 120 125

Ile Asp Lys Cys Asp Arg Leu Trp Val Leu Asp Ser Gly Leu Val Asn

130 135 140

Asn Thr Gln Pro Met Cys Ser Pro Lys Leu Leu Thr Phe Asp Leu Thr

145 150 155 160

Thr Ser Gln Leu Leu Lys Gln Val Glu Ile Pro His Asp Val Ala Val

165 170 175

Asn Ala Thr Thr Gly Lys Gly Arg Leu Ser Ser Leu Ala Val Gln Ser

180 185 190

Leu Asp Cys Asn Thr Asn Ser Asp Thr Met Val Tyr Ile Ala Asp Glu

195 200 205

Lys Gly Glu Gly Leu Ile Val Tyr His Asn Ser Asp Asp Ser Phe His

210 215 220

Arg Leu Thr Ser Asn Thr Phe Asp Tyr Asp Pro Lys Phe Thr Lys Met

225 230 235 240

Thr Ile Asp Gly Glu Ser Tyr Thr Ala Gln Asp Gly Ile Ser Gly Met

245 250 255

Ala Leu Ser Pro Met Thr Asn Asn Leu Tyr Tyr Ser Pro Val Ala Ser

260 265 270

Thr Ser Leu Tyr Tyr Val Asn Thr Glu Gln Phe Arg Thr Ser Asp Tyr

275 280 285

Gln Gln Asn Asp Ile His Tyr Glu Gly Val Gln Asn Ile Leu Asp Thr

290 295 300

Gln Ser Ser Ala Lys Val Val Ser Lys Ser Gly Val Leu Phe Phe Gly

305 310 315 320

Leu Val Gly Asp Ser Ala Leu Gly Cys Trp Asn Glu His Arg Thr Leu

325 330 335

Glu Arg His Asn Ile Arg Thr Val Ala Gln Ser Asp Glu Thr Leu Gln

340 345 350

Met Ile Ala Ser Met Lys Ile Lys Glu Ala Xaa Pro His Val Pro Ile

355 360 365

Phe Asp Arg Tyr Ile Asn Arg Glu Tyr Ile Leu Val Leu Ser Asn Lys

370 375 380

Met Gln Lys Met Val Asn Asn Asp Phe Asn Phe Asp Asp Val Asn Phe

385 390 395 400

Arg Ile Met Asn Ala Asn Val Asn Glu Leu Ile Leu Asn Thr Arg Cys

405 410 415

Glu Asn Pro Asp Asn Asp Arg Thr Pro Phe Lys Ile Ser Ile His Leu

420 425 430

<210> 3

<211> 1353

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Flag-蜂王浆主蛋白-His融合蛋白的编码序列

<400> 3

atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccgat 60

tacaaggacg acgatgacaa gaacattctg cgtggggaat ccctgaacaa gtcattgcct 120

atccttcatg aatggaaatt ctttgattat gattttggtt ccgacgaacg acggcaggac 180

gccatcctct ctggagaata tgattacaaa aacaactacc cttctgatat cgaccagtgg 240

cacgataaga tttttgtcac catgctgcgg tacaatggag ttccctcttc actgaacgtc 300

atcagtaaga aggtgggcga cggaggaccc ctgctccagc catatcctga ttggtctttc 360

gctaagtacg acgactgttc tggaatcgtc tccgcttcta agctggccat tgacaagtgt 420

gatcggttgt gggtcctgga ttcagggttg gtgaacaata cccagcccat gtgctctcct 480

aagctgctga ccttcgacct caccaccagc cagttgctca agcaggtgga gattccccac 540

gacgtcgctg tgaacgctac cacaggcaag ggccgcttga gcagccttgc tgtgcaaagc 600

ctggactgca acaccaattc agatactatg gtgtacatcg cagacgaaaa gggtgaaggt 660

ctgattgtct accataactc agacgatagt tttcatagac tgacctccaa cacattcgat 720

tatgacccca agttcactaa gatgactatt gacggtgagt catacactgc ccaggacggg 780

atttccggta tggcactgtc acctatgaca aataacctgt attattctcc cgttgcaagc 840

acttctctgt actacgtgaa cactgagcaa ttcaggacca gcgactatca acagaatgat 900

atccattacg agggagtcca gaacatcctt gacactcagt cctctgccaa ggtagttagc 960

aagagtggag tattgttttt cggcctggtt ggcgacagtg ctttgggatg ttggaatgaa 1020

catcggaccc tggaacgtca taacattcgc actgtggccc aatctgacga gactcttcag 1080

atgatcgcct ctatgaagat aaaggaggcc ttgccccacg tccctatctt cgacaggtat 1140

atcaaccgtg aatatatact ggtgctctca aataagatgc agaaaatggt taataatgat 1200

ttcaattttg acgatgtgaa ttttaggatc atgaacgcaa acgttaatga actgatcttg 1260

aatacccgtt gtgagaatcc cgacaacgat aggacaccct ttaagatttc tattcacctg 1320

caccaccatc atcaccatca ccaccatcac tag 1353

<210> 4

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Flag-蜂王浆主蛋白-His融合蛋白

<400> 4

Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asn Ile Leu Arg Gly

20 25 30

Glu Ser Leu Asn Lys Ser Leu Pro Ile Leu His Glu Trp Lys Phe Phe

35 40 45

Asp Tyr Asp Phe Gly Ser Asp Glu Arg Arg Gln Asp Ala Ile Leu Ser

50 55 60

Gly Glu Tyr Asp Tyr Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Asp Ile Asp Gln Trp

65 70 75 80

His Asp Lys Ile Phe Val Thr Met Leu Arg Tyr Asn Gly Val Pro Ser

85 90 95

Ser Leu Asn Val Ile Ser Lys Lys Val Gly Asp Gly Gly Pro Leu Leu

100 105 110

Gln Pro Tyr Pro Asp Trp Ser Phe Ala Lys Tyr Asp Asp Cys Ser Gly

115 120 125

Ile Val Ser Ala Ser Lys Leu Ala Ile Asp Lys Cys Asp Arg Leu Trp

130 135 140

Val Leu Asp Ser Gly Leu Val Asn Asn Thr Gln Pro Met Cys Ser Pro

145 150 155 160

Lys Leu Leu Thr Phe Asp Leu Thr Thr Ser Gln Leu Leu Lys Gln Val

165 170 175

Glu Ile Pro His Asp Val Ala Val Asn Ala Thr Thr Gly Lys Gly Arg

180 185 190

Leu Ser Ser Leu Ala Val Gln Ser Leu Asp Cys Asn Thr Asn Ser Asp

195 200 205

Thr Met Val Tyr Ile Ala Asp Glu Lys Gly Glu Gly Leu Ile Val Tyr

210 215 220

His Asn Ser Asp Asp Ser Phe His Arg Leu Thr Ser Asn Thr Phe Asp

225 230 235 240

Tyr Asp Pro Lys Phe Thr Lys Met Thr Ile Asp Gly Glu Ser Tyr Thr

245 250 255

Ala Gln Asp Gly Ile Ser Gly Met Ala Leu Ser Pro Met Thr Asn Asn

260 265 270

Leu Tyr Tyr Ser Pro Val Ala Ser Thr Ser Leu Tyr Tyr Val Asn Thr

275 280 285

Glu Gln Phe Arg Thr Ser Asp Tyr Gln Gln Asn Asp Ile His Tyr Glu

290 295 300

Gly Val Gln Asn Ile Leu Asp Thr Gln Ser Ser Ala Lys Val Val Ser

305 310 315 320

Lys Ser Gly Val Leu Phe Phe Gly Leu Val Gly Asp Ser Ala Leu Gly

325 330 335

Cys Trp Asn Glu His Arg Thr Leu Glu Arg His Asn Ile Arg Thr Val

340 345 350

Ala Gln Ser Asp Glu Thr Leu Gln Met Ile Ala Ser Met Lys Ile Lys

355 360 365

Glu Ala Leu Pro His Val Pro Ile Phe Asp Arg Tyr Ile Asn Arg Glu

370 375 380

Tyr Ile Leu Val Leu Ser Asn Lys Met Gln Lys Met Val Asn Asn Asp

385 390 395 400

Phe Asn Phe Asp Asp Val Asn Phe Arg Ile Met Asn Ala Asn Val Asn

405 410 415

Glu Leu Ile Leu Asn Thr Arg Cys Glu Asn Pro Asp Asn Asp Arg Thr

420 425 430

Pro Phe Lys Ile Ser Ile His Leu His His His His His His His His

435 440 445

His His

450

<210> 5

<211> 339

<212> DNA

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 5

gtgatgctgg tggaatctgg gggaggctta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc 60

tgtgcagcct ctggattcac tttcagtagg tatgccatgt cttggaatcg ccagactccg 120

gagaagaggc tggagtgggt cgcaacaatt agtcctggtg gtggttacat atactattca 180

gacagtgtga aggggcgatt caccatctcc agagacaatg ccaggaacac cctgtatctg 240

caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccatgtatt actgtgcagg ggactatgtt 300

gactattggg gccaaggcac cactctcaca gtctcctca 339

<210> 6

<211> 113

<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 6

Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Ala

20 25 30

Met Ser Trp Asn Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala

35 40 45

Thr Ile Ser Pro Gly Gly Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Gly Asp Tyr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 7

<211> 339

<212> DNA

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 7

gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccactggaca accagcctcc 60

atctcttgca agtcaagtca gagcctctta aatagtgatg gaaagacatt tttgaattgg 120

ttgttacaga ggccagggca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180

tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttcca 300

tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgg 339

<210> 8

<211> 113

<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 8

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Phe Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

Claims (10)

1.纯化天然蜂王浆主蛋白的方法，所述方法包括：

使包含天然蜂王浆主蛋白的生物物质溶解在水性溶液中，

使包含溶解的生物物质的水性溶液与被固定在基质上的单克隆抗体接触，其中所述单克隆抗体与包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的所述天然蜂王浆主蛋白特异性结合，从而使所述单克隆抗体与所述天然蜂王浆主蛋白结合；

从所述水性溶液分离与天然蜂王浆主蛋白结合的单克隆抗体；以及

从所述单克隆抗体去除结合的天然蜂王浆主蛋白，从而纯化天然蜂王浆主蛋白，

其中所述单克隆抗体包含：

重链可变区(HCVR)，其包含：

SEQ ID NO:6的CDR3结构域的CDR3结构域；

SEQ ID NO:6的CDR2结构域的CDR2结构域；和

SEQ ID NO:6的CDR1结构域的CDR1结构域；以及

轻链可变区(LCVR)，其包含：

SEQ ID NO:8的CDR3结构域的CDR3结构域；

SEQ ID NO:8的CDR2结构域的CDR2结构域；和

SEQ ID NO:8的CDR1结构域的CDR1结构域。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述单克隆抗体与以下抗体竞争结合：

包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)的其他的单克隆抗体，所述重链可变区(HCVR)具有SEQ ID NO:6的CDR3结构域的CDR3结构域、SEQ ID NO:6的CDR2结构域的CDR2结构域和SEQ ID NO:6的CDR1结构域的CDR1结构域，所述轻链可变区(LCVR)具有SEQ ID NO:8的CDR3结构域的CDR3结构域、SEQ ID NO:8的CDR2结构域的CDR2结构域和SEQ ID NO:8的CDR1结构域的CDR1结构域。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述单克隆抗体是包含SEQ ID NO:6的重链可变区(HCVR)和SEQ ID NO:8的轻链可变区(LCVR)的抗体。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其还包括制备包含纯化的天然蜂王浆主蛋白的组合物，其中所述组合物包含冻干的天然蜂王浆主蛋白，或者其中所述组合物包含在含有所述纯化的天然蜂王浆主蛋白的外用美容产品中。

5.分离的单克隆抗体，其能与蜂王浆主蛋白特异性结合，所述单克隆抗体包含：

重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，所述重链可变区(HCVR)包含SEQ ID NO:6的CDR3结构域的CDR3结构域、SEQ ID NO:6的CDR2结构域的CDR2结构域和SEQ ID NO:6的CDR1结构域的CDR1结构域，所述轻链可变区(LCVR)包含SEQ ID NO:8的CDR3结构域的CDR3结构域、SEQ ID NO:8的CDR2结构域的CDR2结构域和SEQ ID NO:8的CDR1结构域的CDR1结构域。

6.如权利要求5所述的分离的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包括SEQ ID NO:6的重链可变区(HCVR)和SEQ ID NO:8的轻链可变区(LCVR)。

7.分离的核酸，其编码与蜂王浆主蛋白特异性结合的分离的单克隆抗体，其中所述抗体包含：

重链可变区(HCVR)，其包含：SEQ ID NO:6的CDR3结构域的CDR3结构域；SEQ ID NO:6的CDR2结构域的CDR2结构域和SEQ ID NO:6的CDR1结构域的CDR1结构域；以及

轻链可变区(LCVR)，其包含：SEQ ID NO:8的CDR3结构域的CDR3结构域；SEQ ID NO:8的CDR2结构域的CDR2结构域和SEQ ID NO:8的CDR1结构域的CDR1结构域。

8.如权利要求7所述的分离的核酸，其中所述HCVR包含SEQ ID NO:6的HCVR，并且其中所述LCVR包含SEQ ID NO:8的LCVR。

9.如权利要求7或8所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸包含SEQ ID NO:7和SEQID NO:5，其中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:5包含在同一多核苷酸中，或者包含在不同的多核苷酸中。

10.如权利要求1所述的方法，其中通过洗脱从所述单克隆抗体去除结合的天然蜂王浆主蛋白。

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