KR20220124194A - 에스. 아우레우스 감염을 예방하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

에스. 아우레우스 감염을 예방하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 적어도 하나의 스타필로코커스 아우레우스(staphylococcus aureus) 항원을 포함하는 면역원성 조성물(여기서, 상기 항원은 서열번호 8의 SdrH-유사 폴리펩티드, 서열번호 4의 Nuc 또는 서열번호 12의 LukG와 적어도 80%의 동일성을 갖는 폴리펩티드이다), 상기 항원 중 적어도 하나에 선택적으로 결합하는 폴리클로날 항체를 포함하는 면역요법 조성물, 및 대상체에서 에스. 아우레우스에 의해 유발된 질환에 대한 보호를 부여하는 항원을 동정하는 시험관내 방법에 관한 것이다.

Description

에스. 아우레우스 감염을 예방하기 위한 조성물 및 방법
본 발명은 스타필로코커스 아우레우스 항원을 포함하는 면역원성 조성물(immunogenic composition)에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 대상체에서 에스. 아우레우스(S. aureus)에 의해 유발되는 질환에 대한 보호를 부여하는데 사용하기 위한 면역원성 조성물에 관한 것이다.
에스. 아우레우스는 인간의 주요한 감염증의 원인이고, 피부 및 연조직의 감염, 골수염(osteomyelitis), 심내막염(endocarditis) 및 패혈증(sepsis)을 포함하는 광범위한 병리를 담당한다. 특히, 에스. 아우레우스는, 이러한 재료의 표면에 생물막을 형성하는 능력이 있기 때문에, 외래 장치(예: 카테터(catheter)) 및 임플란트(예: 보철물)와 관련된 높은 비율의 감염을 담당한다. 이러한 감염은 만성 또는 전신성일 수 있고, 일부 경우에는 인공 관절 감염, 임플란트 실패 또는 심지어 사망을 유발할 수 있기 때문에 특히 문제가 된다. 예를 들면, 대규모 혈액투석 센터에서 에스. 아우레우스 감염에 대한 소급적 분석에서는 혈액투석 환자의 에스. 아우레우스 감염 비율이 거의 18%였고 사망률은 10%였으며, 대부분의 감염이 혈관 카테터와 관련되어 있는 것으로 밝혀졌다[참조: Fitzgerald et al., 2011].
에스. 아우레우스 감염은 통상 항생물질 요법으로 치료되지만, 메티실린 내성(MRSA) 및 반코마이신 내성(VRSA) 균주를 포함하는 항생물질 내성 에스. 아우레우스 세균의 출현에 의해 종래 항생물질의 사용이 복잡해졌다. 추가로, 반코마이신은 현재 MRSA 균혈증 및 심내막염 치료의 최적의 표준이지만, 이 항생물질은 불량한 조직 침투성, 바람직하지 않은 부작용 및 느린 살균 활성으로 인해 이상적이지 않다[참조: Gould, 2008]. 정형외과용 임플란트의 경우, 대부분의 경우에 재수술이 필요하다[참조: Darouiche, 2004]. 그러나, 이 전략은 비용이 들고, 침습적이며, 종종 초기 임플란트 수술보다 기술적으로 곤란하고, 보다 광범위한 수술이 필요하며, 대상체의 삶의 질의 저하와 관련이 있다.
에스. 아우레우스 감염을 예방하는 효과적 백신의 개발은 현재의 치료 방법에 대한 유망한 대안을 제시하고, 에스. 아우레우스에 대한 다양한 백신이 현재 I, II 또는 III 상의 임상 시험하에 평가되고 있지만, 성공적 III 상의 시험은 아직 완료되지 않았다. 현재까지, 백신 개발은 주로 에스. 아우레우스 분비 알파 독소(Hla) 및/또는 협막 다당류에 초점을 맞추었다. 알파 독소를 표적화하는 백신은 독소가 병원성 효과의 대부분에 관여하는 감염에 대한 보호 효과가 있는 것으로 밝혀졌지만(예: 문헌[참조: Bubeck and Schneewind, 2008]에 기재된 폐렴), 치사-이하의 감염을 예방하기에는 불충분하다[참조: Adlam et al., 1977]. 추가로, 협막 다당류의 다양성 및 다수의 메티실린 내성 에스. 아우레우스 균주가 캡슐화되지 않는다는 사실을 고려하면, 협막 다당류 단독의 사용은 제한된 관심이다. 에스. 아우레우스에 감염된 대상체에서 항체를 유도하는 것으로 밝혀진 IsdB 단백질을 포함하여 단독으로 또는 조합하여 섭취한 다양한 에스. 아우레우스 단백질도 평가 중이지만, 이는 장래의 감염에 대한 보호를 제공하기에는 불충분하다[참조: Zorman et al., 2013]. 임상 시험은 추가로, IsdB에 의한 백신접종이 위약 수용자와 비교한 경우에 효과가 없고, 일부 경우에는 심지어 유해한 것으로 밝혀졌다[참조: McNeely et al., 2014].
현재의 전략은 불충분하기 때문에, 에스. 아우레우스 항원 또는 상기 항원에 대해 생성된 폴리클로날 항체(polyclonal antibody)를 포함하는 개선된 면역원성 조성물의 필요성이 남아 있다. 특히, 에스. 아우레우스 감염을 예방 및/또는 치료할 수 있는, 예를 들면, 에스. 아우레우스 감염에 대한 보호 항체 또는 이들 항체 자체를 유도할 수 있는 항원을 포함하는, 신규한 면역원성 및 면역요법 조성물(immunotherapeutic compostion)이 필요하다. 또한, 대상체에서 에스. 아우레우스에 의해 유발되는 질환에 대한 보호를 부여하는 항원을 동정(identifying)하는 신규한 방법의 필요성이 남아 있다. 특히, 임상 시험의 높은 비용과 기간을 고려하면, 백신 반응을 평가하기 위한 보호의 상관관계로서 사용될 수 있는 개선된 검정의 필요성이 존재한다.
본 발명은 면역원성 조성물, 면역요법 조성물, 및 대상체에서 에스. 아우레우스에 의해 유발되는 질환에 대한 보호를 부여하는 항원을 동정하는 시험관내 방법을 제공함으로써 이들 및 기타 필요성을 충족시킨다.
특히, 본 발명은 적어도 하나의 스타필로코커스 아우레우스 항원을 포함하는 면역원성 조성물으로서, 상기 항원이 서열번호 8의 SdrH-유사 폴리펩티드, 서열번호 4의 Nuc 또는 서열번호 12의 LukG와 적어도 80%의 동일성(identity)을 갖는 폴리펩티드인, 면역원성 조성물을 제공한다.
특정 태양에 따르면, 면역원성 조성물은 서열번호 8의 SdrH-유사 폴리펩티드와 적어도 80%의 동일성을 갖는 항원 및 서열번호 12의 LukG와 적어도 80%의 동일성을 갖는 항원을 포함한다.
본 발명의 면역원성 조성물에 포함되는 하나 이상의 항원은 IsdB 등의 기존 항원과 비교하여 예상치 않게 개선된 면역원성 특성(예: 면역원성 반응의 수준, 품질 및/또는 범위)을 유리하게 제공한다.
바람직하게는, 면역원성 조성물은 별개의 폴리펩티드 형태 또는 하나 이상의 융합 폴리펩티드 형태 또는 별개의 폴리펩티드(들) 및 융합 폴리펩티드(들) 형태 둘 모두의 에스. 아우레우스 항원을 포함한다.
바람직하게는, 면역원성 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함한다.
바람직하게는, 면역원성 조성물은 대상체에서 에스. 아우레우스에 의해 유발된 질환에 대한 보호를 부여하는 백신으로서 사용하기 위한 것이다.
본 발명은 추가로 본 명세서에 정의된 적어도 하나의 항원에 선택적으로 결합하는 폴리클로날 항체를 포함하는 면역요법 조성물으로서, 상기 항체가 식세포에 의한 에스. 아우레우스의 흡수 및 사멸을 촉진하는, 면역요법 조성물에 관한 것이다.
바람직하게는, 면역요법 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함한다.
바람직하게는, 면역요법 조성물은 대상체에서 에스. 아우레우스에 의해 유발된 질환에 대한 보호를 부여하는 수동 면역요법으로서 사용하기 위한 것이다.
바람직하게는, 상기 에스. 아우레우스는 메티실린 내성 에스. 아우레우스(MRSA) 또는 메티실린-감수성 에스. 아우레우스(MSSA)이다.
바람직하게는, 상기 대상체는 골관절 장치(osteoarticular device), 바람직하게는 골관절 임플란트, 보다 바람직하게는 전체 관절 대체 보철물을 갖는다.
바람직하게는, 본 명세서에 제공된 상기 면역원성 또는 면역요법 조성물은 에스. 아우레우스 감염에 대해 효과적인 하나 이상의 항생물질과 함께 사용하기 위한 것이다.
본 발명은 추가로 대상체에서 에스. 아우레우스에 의해 유발된 질환에 대한 보호를 부여하는 항원을 동정하는 시험관내 방법으로서,
a) 에스. 아우레우스를 포함하는 용액을 에스. 아우레우스 항원에 대해 생성된 항체를 포함하는 용액과 함께, 바람직하게는 35℃에서 1시간 동안 인큐베이팅(incubating)하여, 혼합 현탁액을 수득하는 단계,
b) 마크로파지(macrophage)를 단계 a)의 혼합 현탁액과 접촉시키는 단계,
c) 마크로파지로부터 혼합 현탁액을 제거하고, 항생물질이 보충된 신선한 배지를 첨가하여 세포외 에스. 아우레우스 세균을 사멸시키는 단계, 및
d) 상기 마크로파지에 의한 에스. 아우레우스 세균의 내재화(internalization) 및 사멸을 평가하는 단계로서, 상기 항원이, 마크로파지의 생존력을 유지하면서, 에스. 아우레우스의 내재화의 증가 및 사멸 둘 다를 유도하는 경우에, 상기 항원은 에스. 아우레우스에 의해 유발된 질환에 대한 보호를 부여하는 것으로 간주되는, 단계
를 포함하는, 시험관내 방법에 관한 것이다.
특히 다형핵 호중구를 사용하는 이전 방법과는 대조적으로, 본 발명자들은 에스. 아우레우스의 흡수 및 사멸 둘 다를 촉진하는 항체를 생성할 수 있는 표적 백신 항원을 동정하기 위한 신규한 OPA 검정을 개발했다. 실제로, 다형핵 호중구는 매우 강력한 살균 활성("사멸")을 나타내고, 이는 특히 최종적 "촉진" 항체(즉, 세균 흡수를 촉진하지만, 사멸보다는 세포내 세균 성장을 초래한다)가 생성되는지의 여부를 평가하는 것을 불가능하게 한다. 유리하게는, 마크로파지는 반응성 산소 종 및 항균성 펩티드의 합성 수준이 낮기 때문에 다형핵 호중구보다 훨씬 낮은 살균("사멸") 활성을 갖는다. 추가로, 골관절 보철 감염의 특정 상황에서는 마크로파지 기반 검정의 개발이 특히 유리하고, 이는 감염의 생리병리학에서 순환 혈액 매개 에스. 아우레우스가 다형핵 호중구에 의한 것보다 비장 및/또는 폐에 존재하는 마크로파지에 의해 혈류로부터 제거되어야 하고, 이에 의해 세균혈증의 기간 및 보철 감염의 가능성을 감소시키기 때문이다.
바람직하게는, 상기 마크로파지는 불멸화(immortalized) 마크로파지 세포주, 바람직하게는 J774.2 세포주이다.
바람직하게는, 단계 d)에서의 에스. 아우레우스 세균의 사멸은 단계 c)의 3시간 후에 마크로파지에 내재화된 세균의 양을 단계 c)의 6시간 후에 마크로파지에 내재화된 세균의 양과 비교함으로써 평가된다.
발명의 설명
본 발명을 추가로 상세하게 설명하기 전에, 본 명세서에서 사용된 용어 "a" 및 "an"은, 문맥상 달리 지시하지 않는 한, "적어도 하나", "적어도 제1", "하나 이상" 또는 "복수"의 참조된 화합물 또는 단계를 의미하는 의미로 사용되는 것에 주목해야 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "및/또는"은 "및", "또는" 및 "상기 용어에 의해 연결된 요소들의 전부 또는 임의의 기타 조합"의 의미를 포함한다. 용어 "포함하는(comprising)", "갖는(having)", "포함하는(including)" 또는 "함유하는(containing)"(및 "함유하다(contains)" 또는 "함유한다(contain)" 등의 상기 용어의 임의의 형태)는, 제한은 없고, 추가의 인용되지 않은 요소 또는 방법 단계를 제외하는 것은 아니다. 대조적으로, 본 명세서에 사용된 용어 "~로 이루어진"은 (미량 수준을 초과하는) 임의의 기타 성분 또는 단계를 제외한다.
상기 나타낸 바와 같이, 제1 태양에 따르면, 본 발명은 적어도 하나의 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 항원을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이고, 여기서 상기 항원은 서열번호 8의 SdrH-유사 폴리펩티드, 서열번호 4의 Nuc 또는 서열번호 12의 LukG와 적어도 80%의 동일성을 갖는 폴리펩티드이다.
본 명세서에 사용된 용어 "면역원성"은 면역원성으로 적격의 성분이 도입된 대상체에서 측정 가능한 B 세포-매개 면역 반응을 유도 또는 자극하는 조성물의 능력을 지칭한다. 예를 들면, 본 발명의 조성물은 선천적 및/또는 특이적(즉, 상기 면역원성 조성물에 포함된 적어도 하나의 에스. 아우레우스 폴리펩티드에 대해), 체액성 및/또는 세포성(예를 들면, 항체 및/또는 사이토카인의 생성 및/또는 세포독성 T 세포, B, T 림프구, 항원 제시 세포, 헬퍼 T 세포, 수지상 세포, NK 세포 등의 활성화)일 수 있는 대상체에서 면역 반응을 유도 또는 자극할 수 있다는 의미에서 면역원성이다. 면역원성 조성물은 통상 투여된 대상체에서 보호 반응을 초래한다. 구체적으로, 본 발명의 조성물은 적어도 하나의 에스. 아우레우스 폴리펩티드를 인식하는 항체를 유도하고, 식세포에 의한 에스. 아우레우스의 흡수 및 사멸 둘 다를 증가시킨다는 점에서 면역원성이다. 그러나, 상기 조성물은 또한 하나 이상의 추가 면역 반응을 유도할 수 있다.
구체적으로, 본 발명자들은, 본 발명에 이르러, 놀랍게도, 각각의 SdrH-유사 폴리펩티드, Nuc 및 LukG 항원이 식세포에 의한 에스. 아우레우스의 흡수 및 사멸 둘 다를 증가시키는 항체를 유도할 수 있음을 밝혀냈다. 본 발명에서 마크로파지 기반 모델에서 최초로 수행된 이러한 활성을 갖는 항체의 생성은 본 명세서에 기재된 항원이 면역원성 조성물에 존재하는 경우에 에스. 아우레우스 감염에 대한 보호를 유도한다는 것을 나타낸다. 실제로, 본 발명의 항원을 사용하여 본 발명에서 수득된 결과는 (에스. 아우레우스 감염이 유리할 수 있기 때문에) 유해한 효과를 갖는 것으로 이전에 밝혀진 IsdB로 수득된 결과와 현저하게 대조적이고, 이는 항원의 평가에서 마크로파지 기반 모델의 타당성을 확인한다. 동물 모델에서 수득된 생체내 결과는 이러한 항원이 애쥬번트 단독 및/또는 스타필로키나제 등의 대조군 항원으로 관찰된 것보다 신장에서 에스. 아우레우스 세균 성장을 대폭 감소시킬 수 있음을 추가로 나타내고, 이는 에스. 아우레우스 감염에 대한 보호를 유도하는 이들의 능력을 추가로 확인한다. 따라서, 특정 태양에 따르면, 면역원성 조성물은 세균의 식작용에 의한 에스. 아우레우스의 흡수 및 사멸 둘 다를 증가시키는 상기 항원에 대한 항체를 유도하는 적어도 하나의 스타필로코커스 아우레우스 항원을 포함하고, 여기서 상기 항원은 서열번호 8의 SdrH-유사 폴리펩티드, 서열번호 4의 Nuc 또는 서열번호 12의 LukG와 적어도 80%의 동일성을 갖는 폴리펩티드이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "에스. 아우레우스 항원"은 에스. 아우레우스 종에 존재하거나 또는 에스. 아우레우스 종으로부터 수득되는 폴리펩티드 또는 항체에 의해 결합할 수 있는 이의 단편(예를 들면, 에피토프)을 지칭하고, 여기서 상기 항원은 "SdrH-유사" 폴리펩티드, Nuc 및 LukG 및 이들의 하나 이상의 조합을 포함한다. 전형적으로, 이러한 항원은 하나 이상의 B 에피토프(들)를 함유한다. 본 발명의 문맥에서, 이 용어는 천연 에스. 아우레우스 항원(예를 들면, 전장 항원) 또는 이의 변형된 버전(예를 들면, 단편 또는 변이체)을 포함한다. "천연" 에스. 아우레우스 항원은 특히 자연계에서 에스. 아우레우스의 공급원으로부터 발견, 단리, 수득될 수 있다. 이러한 공급원에는 에스. 아우레우스, 배양된 세포, 게다가 기탁 기관(예를 들면, ATCC 또는 TB 기관), 라이브러리에서 이용가능하거나 문헌에 기재된 재조합체 재료(예를 들면, 에스. 아우레우스 단리물, 에스. 아우레우스 게놈 등)으로 감염 또는 노출된 대상체로부터 수집된 생물학적 샘플(예: 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 가래, 조직 절편, 생검 표본 등)이 포함된다.
"SdrH-유사" 항원 또는 폴리펩티드는 숙주 부착 도메인 MSCRAMM(접착성 매트릭스 분자를 인식하는 미생물 표면 성분(microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules))을 포함하는 세포벽에 고정된 세린-아스파르테이트 반복 패밀리 단백질이다. "SdrH-유사" 폴리펩티드는 서열번호 7 또는 8의 서열을 포함할 수 있고, 이는 각각 서열번호 5 또는 6의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, "SdrH-유사" 폴리펩티드는 바람직하게는 서열번호 8의 서열을 갖는다.
"Nuc" 항원(미세구균 뉴클레아제 또는 써모뉴클레아제라고도 공지됨)은 세포외 뉴클레아제이다. 세포막에서 신호 펩티다제에 의해 절단된 후, Nuc는 2개의 활성 형태: NucA 또는 NucB로 처리될 수 있다. Nuc는 특히 서열번호 1 또는 2의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있는 서열번호 3 또는 4의 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 문맥에서, Nuc는 바람직하게는 서열번호 4의 서열을 갖는다.
"LukG" 항원(LukA라고도 공지됨)은 "LukH"(LukB라고도 공지됨)와 헤테로이량체를 형성한다. 이 헤테로이량체 LukGH는 에스. 아우레우스에 의한 인간 단핵구, 마크로파지 및 다형핵 세포 등의 면역 세포의 사멸을 적어도 부분적으로 매개하는 기공-형성 류코시딘이다. LukG는 서열번호 11 또는 12의 서열을 포함할 수 있고, 이는 각각 서열번호 9 또는 10의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, LukG는 바람직하게는 서열번호 12의 서열을 갖는다.
LukG는 LukH와 헤테로이량체를 형성하지만, 바람직하게는 상기 면역원성 조성물은 LukH의 부재하에 LukG를 포함한다. 실제로, 본 발명자들은 놀랍게도, 식세포에 의한 에스. 아우레우스의 흡수 및 사멸을 증가시키는 항체가 단독으로(즉, LukH의 부재하에) 섭취된 경우, LukG에 의해 유도될 수 있음을 발견했다. 이것은 항체를 생성하기 위해 LukGH 헤테로이량체를 사용해야 한다고 시사하는 이전 연구와는 현저히 대조적이다. 특히, 문헌[참조: Badarau et al. 2016]은 LukG 또는 LukH 단독에 대해 생성된 모노클로날 항체는 LukGH 독소를 중화하는 능력이 거의 또는 전혀 없다는 것을 발견했다. 따라서, 바람직한 태양에 따르면, 면역원성 조성물은 LukG 및 LukH 둘 다를 포함할 수 있지만, 바람직하게는 LukH의 부재하에 LukG를 포함한다.
당업자는 유전자 코드의 축퇴의 결과로서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 다수의 뉴클레오티드 서열이 존재한다는 것을 이해할 것이다. 특히, 소정 뉴클레오티드 서열 내의 코돈 사용은 에스. 아우레우스 이외의 생물(예를 들면, 이. 콜라이(E. coli))에서 상응하는 폴리펩티드의 최적화된 발현에 적합시킬 수 있다.
변형된 에스. 아우레우스 항원(예를 들면, 변이체)은, 전형적으로, 예를 들면, 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 부가 및/또는 결실, 비-자연 배치 및 이들의 임의의 조합을 통해 하나 이상의 위치(들)에서 본 명세서에 구체적으로 개시된 폴리펩티드 또는 천연 폴리펩티드와는 상이하다. 아미노산 치환은 동일하거나 동일하지 않을 수 있다. 바람직하게는, 치환은 "동등한" 아미노산, 즉 원래 아미노산의 구조와 유사하기 때문에, 항원의 생물학적 활성을 변화시킬 가능성이 없는 임의의 아미노산으로 이루어진다. 이러한 치환의 예는 하기 표 1에 제시되어 있다:
동등한 아미노산에 의한 치환
원래 아미노산 치환(들)
Ala (A) Val, Gly, Pro
Arg (R) Lys, His
Asn (N) Gln
Asp (D) Glu
Cys (C) Ser
Gln (Q) Asn
Glu (G) Asp
Gly (G) Ala
His (H) Arg
Ile (I) Leu
Leu (L) Ile, Val, Met
Lys (K) Arg
Met (M) Leu
Phe (F) Tyr
Pro (P) Ala
Ser (S) Thr, Cys
Thr (T) Ser
Trp (W) Tyr
Tyr (Y) Phe, Trp
Val (V) Leu, Ala
몇몇 변형이 고려되는 경우, 이들은 연속적 및/또는 비연속적 잔기와 관련될 수 있다. 변형(들)은 부위 특이적 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, DNA 셔플링 등의 당업자에게 공지된 다양한 방법 및 합성 기술(예를 들면, 목적하는 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 합성 핵산 분자를 초래)에 의해 생성될 수 있다.
에스. 아우레우스 항원의 기원(예를 들면, 천연 또는 변형)에 관계없이, 본 발명의 면역원성 조성물에 포함된 항원은 상응하는 천연 항원의 하나 이상의 면역원성 부분, 보다 바람직하게는 B 에피토프(들)를 보유한다. 항원의 적절한 면역원성 부분을 동정하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 공유 펩티드 결합을 통해 결합된 적어도 10개 이상의 아미노산, 바람직하게는 적어도 20개 이상의 아미노산을 포함하는 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 폴리펩티드는 선형, 분지형 또는 환형일 수 있고, 자연 발생 및/또는 아미노산 유사체를 포함할 수 있다. 이는 화학적으로 변형될 수 있다(예: 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 절단, 디설파이드 브릿지에 의한 가교결합 및/또는 인산화). 이는 태그(예: his, myc, Flag 등) 및/또는 표적화 펩티드(예: 신호 펩티드, 막관통 도메인 등) 등의 추가 요소를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 면역원성 조성물에 포함된 적어도 하나의 폴리펩티드는 신호 펩티드를 포함하지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 면역원성 조성물에 포함된 적어도 하나의 폴리펩티드는 태그를 포함하지 않는다. 용어 "폴리펩티드"는 단백질(통상 50개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드에 사용됨), 올리고펩티드 및 펩티드(통상 50개 미만의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드에 사용됨)를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 각각의 폴리펩티드는 특정 아미노산을 특징으로 할 수 있고, 본 명세서에 제공된 것 등의 특정 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.
따라서, 아미노산 서열이 폴리펩티드의 최종 아미노산 서열의 일부인 경우, 폴리펩티드는 아미노산 서열을 "포함"한다. 이러한 폴리펩티드는, 일부 경우에, 최대 수백 개의 추가 아미노산 잔기(예를 들면, 태그 펩티드, 표적화 펩티드 등)를 가질 수 있다. 폴리펩티드가 기재된 아미노산 서열의 아미노산 서열 이외의 임의의 아미노산을 함유하지 않는 경우, 폴리펩티드는 아미노산 서열로 "구성"된다.
용어 "퍼센트(%) 동일성"은 2개의 폴리펩티드 또는 핵산 분자 사이의 아미노산 대 아미노산 또는 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드의 대응을 지칭한다. 2개 분자 사이의 동일성 백분율은 최적의 정렬과 각 갭의 길이를 위해 도입되어야 하는 갭의 수를 고려하여 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다. 본 발명의 문맥에서 언급된 퍼센트 동일성은 비교되는 서열의 최적 정렬 후에 결정되고, 따라서 이는 하나 이상의 삽입, 결실, 절단 및/또는 치환을 포함할 수 있다. 이 퍼센트 동일성은 당업자에게 공지된 임의의 서열 분석 방법에 의해 계산될 수 있다. 특히, 퍼센트 동일성은 이들의 전체 길이에 걸쳐 완전히 취해진 서열의 비교되는 서열의 글로벌 정렬 후에 결정될 수 있다. 수동 비교 외에도, 니들만 및 운쉬[참조: Needleman and Wunsch(1970)]의 알고리즘을 사용하여 글로벌 정렬을 결정할 수 있다.
뉴클레오티드 서열의 경우, 서열 비교는 니들 소프트웨어 등의 당업자에게 공지된 임의의 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있다. 사용된 파라미터는 특히 다음과 같다: 10.0과 동등한 "갭 개방", 0.5와 동등한 "갭 확장" 및 EDNAFULL 매트릭스(NCBI EMBOSS 버전 NUC4.4).
아미노산 서열의 경우, 서열 비교는 니들(Needle) 소프트웨어 등의 당업자에게 공지된 임의의 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있다. 사용된 파라미터는 특히 다음과 같다: 10.0과 동등한 "갭 개방", 0.5와 동등한 "갭 확장" 및 BLOSUM62 매트릭스.
바람직하게는, 본 발명의 문맥에서 정의된 바와 같은 퍼센트 동일성은 이들의 전체 길이에 걸쳐 비교되는 서열의 글로벌 정렬을 통해 결정된다.
본 발명은 본 명세서에 개시된 폴리펩티드와 실질적 서열 동일성을 갖는, 바람직하게는 상기 기재된 방법을 사용하여 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 서열과 적어도 50%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 바람직한 실시형태에 따르면, 폴리펩티드는 에스. 아우레우스 아종 아우레우스 Mu50(수탁번호 BA000017.4)의 SdrH-유사 폴리펩티드, Nuc 또는 LukG와 적어도 80%의 동일성을 갖는다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 서열번호 8의 SdrH-유사 폴리펩티드, 서열번호 4의 Nuc 또는 서열번호 12의 LukG와 적어도 80%의 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 갖는다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 서열번호 8의 SdrH-유사 폴리펩티드, 서열번호 4의 Nuc 또는 서열번호 12의 LukG와 100%의 동일성을 갖는다.
본 명세서에서 제공되는 면역원성 조성물은 본 명세서에서 제공되는 폴리펩티드의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 비제한적 예로서, 조성물은 서열번호 4의 Nuc와 적어도 80%의 동일성을 갖는 폴리펩티드 및 서열번호 12의 LukG와 적어도 80%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또는, 조성물은 서열번호 4의 Nuc와 적어도 80%의 동일성을 갖는 폴리펩티드 및 서열번호 8의 SdrH-유사 폴리펩티드와 적어도 80%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 또는, 조성물은 서열번호 8의 SdrH-유사 폴리펩티드와 적어도 80%의 동일성을 갖는 폴리펩티드 및 서열번호 12의 LukG와 적어도 80%의 동일성을 갖는 항원을 포함할 수 있다. 또는, 조성물은 서열번호 4의 Nuc와 적어도 80%의 동일성을 갖는 폴리펩티드, 서열번호 12의 LukG와 적어도 80%의 동일성을 갖는 폴리펩티드 및 서열번호 8의 SdrH-유사 폴리펩티드와 적어도 80%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 면역원성 조성물은 서열번호 8의 SdrH-유사 폴리펩티드와 적어도 80% 동일성을 갖는 항원 및 서열번호 12의 LukG와 적어도 80%의 동일성을 갖는 항원을 포함한다.
본 명세서에 제공된 항원은 식세포에 의한 에스. 아우레우스의 흡수 및 사멸 둘 다를 증가시키는 항체를 유리하게 유도한다. 따라서, 본 발명의 면역원성 조성물은 유리하게는 식세포에 의한 에스. 아우레우스의 흡수 및 사멸 둘 다를 증가시키는 항체를 유도하는 적어도 하나의 에스. 아우레우스 항원을 포함하고, 여기서 상기 항원은 서열번호 8의 SdrH-유사 폴리펩티드, 서열번호 4의 Nuc 또는 서열번호 12의 LukG와 적어도 80% 동일성을 갖는 폴리펩티드이다. 이론에 의해 제한되지 않고서, 항체는 에스. 아우레우스 세균의 식작용 또는 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC) 또는 이들 둘 다를 촉진시킬 수 있다. 하나의 경우, 옵소닌화 항체의 항원 결합 부분은 표적 항원에 결합하는 반면, 옵소닌화 항체의 Fc 부분은 식세포 상의 Fc 수용체에 결합한다. 다른 경우에, 옵소닌화 항체의 항원 결합 부분은 표적 항원에 결합하는 반면, 옵소닌화 항체의 Fc 부분은, 예를 들면, 이의 Fc 도메인을 통해 면역 이펙터 세포에 결합하고, 이에 의해 결합된 이펙터 세포(예: 단핵구, 호중구 및 자연 킬러 세포)에 의한 표적 세포 용해를 유발한다.
본 명세서에서 제공되는 면역원성 조성물은 별개의 폴리펩티드 형태 또는 하나 이상의 융합 폴리펩티드 형태, 또는 복수의 폴리펩티드가 면역원성 조성물에 존재하는 경우, 별개의 폴리펩티드(들) 및 융합 폴리펩티드(들)의 형태 둘 모두의 에스. 아우레우스 항원을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "융합 폴리펩티드"는 2개 이상의 폴리펩티드 서열을 함께 연결함으로써 생성된 폴리펩티드를 의미한다. 본 발명에 포함되는 융합 폴리펩티드는 하나 이상의 항원, 또는 이의 단편 또는 돌연변이체를 코딩하는 DNA 서열을 연결하는 키메라 유전자 작제물의 번역 산물을 포함하고, DNA 서열은 단일 개방 판독 프레임을 형성하기 위해 제2 폴리펩티드를 코딩한다. 즉, "융합 폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 또는 몇몇 펩티드를 통해 연결된 2개 이상의 단백질의 재조합 단백질이다.
본 명세서에서 제공되는 면역원성 조성물은, 2개 이상의 폴리펩티드가 면역원성 조성물에 포함되는 경우, 동일하거나 상이한 양의 각 성분을 추가로 포함할 수 있다. 비제한적 예로서, 1회 용량당 총 50㎍의 항원을 투여할 수 있다. 상기 하나 이상의 에스. 아우레우스 항원의 최적량은 당업자에 의해 결정될 수 있음이 이해된다.
본 발명의 추가 태양은 대상체에서 에스. 아우레우스에 의해 유발된 질환에 대한 보호를 부여하는 백신으로서 사용하기 위한 본 명세서에 제공된 면역원성 조성물이다. 조성물은 치료학적으로 유효하도록 충분한 양의 상기 하나 이상의 항원을 포함한다. 바람직하게는, 상기 백신은 기존의 에스. 아우레우스 감염을 갖지 않는 대상체에게 투여되어, 상기 대상체에서 에스. 아우레우스-보호 체액성 또는 세포성 면역 반응을 유도한다. 또는, 상기 백신은 에스. 아우레우스 감염이 이미 발생했지만, 백신에 대해 생성된 면역 반응이 에스. 아우레우스 감염의 추가 확산을 효과적으로 억제할 만큼 충분히 초기 단계인 대상체에게 투여할 수 있다. 이것은 특히 에스. 아우레우스 세균혈증(SAB)이 발생한 경우일 수 있지만, 아직 혈류 감염이나 패혈증 등의 보다 심각한 감염을 일으키지 않은 경우일 수 있다.
상기 면역원성 조성물 또는 백신은 단일 용량으로 투여될 수 있다. 또는, 상기 면역원성 조성물 또는 백신은 일정 기간에 걸쳐 복수 용량으로 투여될 수 있다. 특히, 보호 효과를 유지하기 위해 백신의 투여를 적절하게 반복할 수 있다.
상기 면역원성 조성물 또는 백신은 면역 반응의 크기, 품질 및/또는 지속 기간을 증강시키는 역할을 하는 하나 이상의 애쥬번트를 추가로 포함할 수 있다. 면역원성 조성물 및 백신을 위한 애쥬번트는 당해 기술분야에 공지되어 있다. 비제한적 예로서, 상기 애쥬번트는 불완전 또는 완전 프로인트 애쥬번트, 모노글리세라이드 및 지방산(예: 모노-올레인, 올레산 및 대두유의 혼합물), 알루미늄 염(예: 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산알루미늄) 또는 인산칼슘 겔 등의 미네랄 염, 오일 에멀젼 및 계면활성제 기반 제형(예: MF59(미세 유동화 세제 안정화 수중유 에멀젼), QS21(정제 사포닌), AS02 [SBAS2](수중유 에멀젼 + MPL + QS-21), MPL-SE, 몬타나이드(Montanide) ISA-51 및 ISA-720(안정화된 유중수 에멀젼)), 미립자 애쥬번트(예: 바이로솜(인플루엔자 혈구응집소를 포함하는 단층 리포솜 비히클), AS04([SBAS4] MPL과의 Al 염), ISCOMS(사포닌과 지질의 구조화 복합체), 폴리락티드 공-글리콜리드(PLG)), 천연 및 합성 미생물 유도체(예: 모노포스포릴 지질 A(MPL), 데톡스(MPL + M. Phlei 세포벽 골격), AGP[RC-529](합성 아실화 단당류), 데톡스-PC, DC Chol(리포솜으로 자가 조직화할 수 있는 지질 면역자극제), OM-174(지질 A 유도체), CpG 모티프(면역자극성 CpG 모티프를 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드), 무독성 보조 효과를 제공하기 위해 유전자 변형된 세균 독소, 예컨대, 변형된 LT 및 CT), 내인성 인간 면역조절제(예: hGM-CSF 또는 hIL-12(단백질 또는 플라스미드 코딩된 것으로 투여될 수 있는 사이토카인), 이뮤탑틴(Immutaptin)(C3d 탠덤 어레이), MoGM-CSF, TiterMax-G, CRL-1005, GERBU, TERamide, PSC97B, Adjumer, PG-026, GSK-I, GcMAF, B-알레틴(alethine), MPC-026, Adjuvax, CpG ODN, 베타펙틴(Betafectin), 알룸(Alum) 및 MF59) 및 금 입자 등의 불활성 비히클을 포함한다. 바람직하게는, 애쥬번트는 무기염이고, 바람직하게는 상기 열거된 것들 중에서, 더욱 바람직하게는 수산화알루미늄 및/또는 인산알루미늄이다. 바람직하게는, 인비보겐(InvivoGen)에 의해 상업화된 알하이드로겔(Alhydrogel®) 및 Adju-Phos® 애주번트의 경우와 같이 애쥬번트는 습윤 겔 현탁액으로 제형화된다. 바람직하게는, 항원(Ag) 대 애쥬번트의 비율은 0.4 내지 3mg Ag:mg 알루미늄(Al)이다.
추가 태양에서, 본 발명은 본 명세서에 제공된 하나 이상의 에스. 아우레우스 항원에 선택적으로 결합하는 항체(예를 들면, SdrH-유사 폴리펩티드, Nuc 또는 LukG와 적어도 80%의 동일성을 갖는 폴리펩티드)를 포함하는 면역요법 조성물에 관한 것이고, 여기서 상기 항체는 식세포에 의한 에스. 아우레우스의 흡수 및 사멸을 촉진한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 표현 "면역요법 조성물"은 면역 분자(예를 들면, 항체 및 임의로 추가의 면역 분자)를 포함하고 수동 면역을 제공하는 조성물을 지칭한다. "수동 면역"은 보다 구체적으로 항원의 투여 없이 대상체에게 부여된 임의의 면역을 지칭한다. 이는 일반적으로 일시적 및 단기적이다(예: 수 주간 또는 수 개월 동안 면역을 제공).
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 적어도 항원 결합 단편 또는 항원 결합 도메인을 포함하고 표적 항원에 선택적으로 결합하는 임의의 폴리펩티드를 지칭한다. 따라서, 면역요법 조성물은 특히 하나 이상의 에스. 아우레우스 항원에 결합하는 항체 CDR 도메인을 포함하는 항체 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 특정 경우에, 어느 정도의 교차 반응성에도 불구하고, 표적 항원에 대한 항체 결합은 여전히 선택적인 것으로 이해된다. 통상, 항체와 항원 사이의 결합은 회합 상수 KA가 10-6 M보다 높은 경우에 특이적인 것으로 간주된다. 본 명세서에 제공된 면역요법 조성물에 포함된 항체는 폴리클로날, 모노클로날, 단일특이적, 다중특이적, 인간, 인간화, 일본쇄, 키메라, 합성, 재조합, 또는 선택적 항원 결합을 유지하는 이러한 항체의 임의의 단편일 수 있고, 이들은 Fab, F(ab')2, Fv 및 scFv 단편을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 항체는 임의의 유형(예: IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스의 전체 면역글로불린일 수 있다. 바람직하게는, 본 명세서에 제공된 항체는 폴리클로날이다. 따라서, 바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명의 면역요법 조성물은 본 명세서에 제공된 하나 이상의 항원에 선택적으로 결합하는 폴리클로날 항체를 포함하고, 여기서 상기 항체는 식세포에 의한 에스. 아우레우스의 흡수 및 사멸을 촉진한다.
본 명세서에 사용된 용어 "폴리클로날 항체"는 보다 구체적으로 동일하거나 상이한 항원 상의 몇몇 상이한 특정 항원 결정기에 결합 또는 반응할 수 있는 항체 분자의 혼합물을 지칭한다. 따라서, 폴리클로날 항체는 상이한 B 세포 계통으로부터 유래한다. 폴리클로날 항체의 항원 특이성의 변동성은 폴리클로날 항체를 구성하는 개별 항체의 가변 영역, 특히 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3에 위치한다. 폴리클로날 항체는 디스플레이(예를 들면, 파지, 효모 또는 리보솜 디스플레이) 또는 하이브리도마 기술에 의해 표적 항원 또는 이의 일부로 말, 소, 새, 래빗, 마우스 또는 랫트 등의 동물을 면역화시킴으로써 제조할 수 있다. 폴리클로날 항체 제제는 면역된 동물의 혈액, 밀크, 초유 또는 난으로부터 단리될 수 있고, 통상 표적 항원에 특이적인 항체 외에 표적 항원에 특이적이지 않은 항체를 포함한다. 표적 항원에 특이적인 항체는 폴리클로날 항체 제제로부터 정제될 수 있거나, 또는 폴리클로날 항체 제제는 추가 정제 없이 사용될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리클로날 항체"는 표적 항원에 특이적인 항체가 농후화된 항체 제제 및 정제되지 않은 제제 둘 다를 지칭한다. 폴리클로날 항체는 단리된 형태로, 용액(예: 동물 항혈청) 또는 숙주 세포(예: 하이브리도마)로 제공될 수 있다. 특정 태양에 따르면, 면역요법 조성물은 폴리클로날 항혈청일 수 있다. 특정 항원에 대한 항체를 위한 폴리클로날 항체를 농후화하기 위한 다수의 기술이 당업자에게 공지되어 있다. 특정 태양에서, 항체 또는 항체들은 본 명세서에 제공된 항원(들)으로 챌린지된 동물 또는 제2 대상체로부터 친화성 정제될 수 있다. 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된 WO 제2004/061104호에 제공된 바와 같이 예방적 및 치료적 투여에 적합한 고도로 특이적인 폴리클로날 항체의 재조합 생산이 또한 사용될 수 있다. 재조합 폴리클로날 항체(rpAb)는 재조합 폴리클로날 단백질을 구성하는 개별 구성원의 개별적 처리, 제조, 정제 또는 특성화 없이 단일 제제로서 생산 생물반응기로부터 정제될 수 있다. 또는, 경우에 따라, 폴리클로날 항체는 복수의 모노클로날 항체를 혼합함으로써 제조하는 것으로 상정될 수 있다.
본 발명의 면역요법 조성물은 치료 목적, 예를 들면, 에스. 아우레우스에 노출된 후에 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 면역요법 조성물은 또한 에스. 아우레우스에 대한 예상된 또는 가능한 노출 전에(예를 들면, 정형외과 수술, 신장 투석 전에) 예방적으로 사용될 수 있다. 상기 면역요법 조성물은 상응하는 항원(들)(예를 들면, "SdrH-유사" 폴리펩티드 Nuc 및/또는 LukG)을 보유하는 에스. 아우레우스 균주에 의한 감염의 예방 또는 치료에 유리하게 사용될 수 있다. 투여는 소정 기간에 걸쳐 또는 특정 이벤트의 전에(예: 수술 전에) 수동 면역을 제공하기 위해 필요에 따라 반복할 수 있다.
바람직하게는, 감염의 예방 또는 치료는 수동 면역화에 의해 발생한다. 따라서, 바람직한 실시형태에 따르면, 본 명세서에서 제공되는 면역요법 조성물은 대상체에서 에스. 아우레우스에 의해 유발되는 질환에 대한 보호를 부여하는 수동 면역요법으로서 사용하기 위한 것이다. 이와 관련하여, 면역요법 조성물은 폴리클로날 조성물일 수 있다. 특정 실시형태에서, 면역요법 조성물은 "SdrH-유사" 폴리펩티드, Nuc 및/또는 LukG 항원(들)으로 챌린지된 동물로부터의, 바람직하게는 친화성 정제된 폴리클로날 항혈청이다.
바람직하게는, 적어도 하나의 에스. 아우레우스 항원을 포함하는 본 발명의 면역원성 조성물 또는 상기 적어도 하나의 에스. 아우레우스 항원에 대해 생성된 항체, 바람직하게는 폴리클로날 항체를 포함하는 면역요법 조성물은 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함한다. 용어 "약제학적으로 허용되는 부형제"는 본 명세서에서 약제학적 조성물과 적합성이 있고, 환자에게 원치 않는 부작용을 일으키지 않으며, 일반적으로 무독성인 것으로 간주되는 성분 또는 성분들의 조합으로 정의된다. 약제학적으로 허용되는 부형제는 가장 일반적으로는 조성물의 투여를 용이하게 하거나, 제품의 저장 수명 또는 효능을 증가시키거나, 또는 조성물의 용해도 또는 안정성을 개선하는 것과 관계된다. 일부 경우에, 부형제 자체도 치료 효과를 가질 수 있다. 상기 하나 이상의 부형제의 선택은 또한 원하는 투여 경로에 의존할 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 약제학적으로 허용되는 부형제는 특히 하나 이상의 희석제, 애쥬번트, 항산화제, 방부제, 완충제 및 가용화제를 포함할 수 있다. 비제한적 예로서, 약제학적으로 허용되는 부형제는 물, 생리식염수, 인산염 완충 생리식염수, 수크로오스 또는 덱스트로오스 등의 당, 글리세롤, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 폴리소르베이트 80, 폴리(에틸렌)글리콜 300 및 400(PEG 300 및 400), PEG화 피마자유(예: Cremophor EL), 폴록사머 407 및 188, 지방 에멀젼, 지질, PEG화 인지질, 중합체 매트릭스, 생체적합성 중합체, 리포구, 소포, 리포솜, 옥수수 전분, 젤라틴, 락토오스, 수크로오스, 미정질 셀룰로오스, 카올린, 만니톨, 인산이칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 알긴산, 크로스카멜로스 나트륨, 나트륨 전분 글리콜레이트 및 이들의 조합을 포함한다.
항원(즉, 폴리펩티드)을 함유하는 면역원성 조성물 또는 활성 성분으로서 항체를 포함하는 면역요법 조성물을 제조하는 방법은 또한 당해 기술분야에 공지되어 있다. 제형은 비강, 국소, 경구(구강내 및 설하 포함) 및/또는 비경구 투여에 적합한 것을 포함할 수 있다. 제형은 단위 투여 형태로 편리하게 제공될 수 있다. 단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 대상체 및/또는 특정 투여 방식에 따라 달라질 수 있다. 단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 생성하는 화합물의 양일 것이다. 전형적으로, 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사제로 제조되지만, 주사 전에 액체에 용해 또는 현탁액에 적합한 고체 형태도 제조될 수 있다. 제제는 또한 유화될 수 있다. 활성 성분은 종종 상기 나열된 것 중 하나 이상 등의 부형제와 혼합된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "에스. 아우레우스"는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 종의 임의의 균주를 지칭한다. 이 용어는 실험실 균주 및 임상 분리주를 포함한다. 바람직한 실시형태에 따르면, 에스. 아우레우스는 하나 이상의 항생물질, 바람직하게는 메티실린 내성 에스. 아우레우스(MRSA)에 내성이다. 용어 "메티실린 내성"은 메티실린의 살균 효과에 대한 세균 균주의 감수성의 결여를 나타낸다. 메티실린에 대한 내성은 포도상구균 염색체 카세트(SCC) 내에 일반적으로 위치하는 mecA 또는 mecC 유전자에 의해 특히 부여된다. MRSA 균주는 또한 소위 "5세대 세팔로스포린"을 제외하고 베타-락탐 계열의 모든 약제에 대해 자연적으로 내성이 있고, 세프타롤린과 세프토비프롤이 최초로 이용 가능한 약제이다. MRSA 균주는 추가 항생물질(예: 글리코펩티드, 리포펩티드, 뮤피로신, 퀴놀론, 아미노글리코시드, 마크롤라이드, 리팜핀 등)에 대한 내성을 추가로 포함할 수 있다. 또는, 에스. 아우레우스는 메티실린-감수성 에스. 아우레우스(MSSA)일 수 있다. 메티실린-감수성 균주는 에스. 아우레우스에서 일반적으로 관찰되는 클래스 A 베타-락타마제(특히 옥사실린, 클록사실린, 나프실린, 세팔로스포린, 카바페넴, 페니실린/베타-락탐 억제제 조합)에 의해 가수분해되지 않는 메티실린 및 기타 베타-락탐의 살균 효과에 영향을 받기 쉽지만, 기타 항생물질에 대한 내성을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 표현 "에스. 아우레우스에 의해 유발된 질환에 대한 보호를 부여하는"은 에스. 아우레우스 관련 질환 또는 감염의 발증 및/또는 확립의 예방 또는 지연을 지칭한다. 비제한적 예로서, 상기 에스. 아우레우스 질환 또는 감염은 피부 또는 연조직 감염(SSTI), 창상 감염, 세균혈증(bacteremia), 심내막염(endocarditis), 폐렴(pneumonia), 골수염(osteomyelitis), 독성 쇼크 증후군(toxic shock syndrome), 감염성 심내막염(infective endocarditis), 모낭염(folliculitis), 종기(furuncle), 큰종기(carbuncle), 농가진(impetigo), 수포성 농가진(bullous impetigo), 봉와직염(cellulitis), 보트리균증(botryomyosis), 화상 피부 증후군(scalded skin syndrome), 중추 신경계 감염(central nervous system infection), 감염성 및 염증성 안 질환(infective and inflammatory eye disease), 골수염(osteomyelitis) 또는 관절 또는 뼈의 기타 감염, 기도 감염(respiratory tract infection), 요로 감염(urinary tract infection), 패혈성 관절염(septic arthritis), 패혈증(septicemia) 또는 괴저(gangrene)일 수 있다. 특히, 상기 에스. 아우레우스 관련 질환 또는 감염은 본 명세서에 기재된 바와 같이 대상체의 외래 장치 또는 임플란트의 존재와 관련될 수 있다.
"환자" 또는 "대상체"는 연령에 관계없이 임의의 모든 인간 개인일 수 있다. 구체적으로, 대상체는 성인 또는 어린이일 수 있다. 용어 "성인"은 본 명세서에서 적어도 16세의 개인을 지칭한다. 용어 "어린이"는 0 내지 1세의 유아와 1 내지 8세, 8 내지 12세 및 12 내지 16세의 어린이를 포함한다. 용어 "어린이"는 출생부터 28일까지의 신생아 및 28일에서 364일까지의 신생아 이후의 영아를 추가로 포함한다. 조성물은 성인 또는 신생아를 포함하는 어린이에게 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은, 임의의 이유로, 보다 바람직하게는 심장 또는 정형외과 수술을 위해 또는 투석 치료(예: 신장 투석)을 위해 입원하는 대상체 또는 이미 입원한 대상체에서 에스. 아우레우스 연관 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위해 특히 유리하다. 바람직한 실시형태에서, 대상체는 외래 장치 또는 임플란트를 갖는다. 비제한적 예로서, 상기 대상체는 정맥내 카테터(intravenous catheter), 혈관 보철물(vascular prosthesis), 혈관내 스텐트(intravascular stent), 뇌척수액 션트(shunt), 인공 심장 판막(prosthetic heart valve), 요로(urinary) 카테터, 관절 보철물, 정형 외과용 고정 장치, 심장 박동기(cardiac pacemaker) 또는 제세동기(defibrillator), 복막 투석 카테터, 자궁내 장치, 담도 스텐트, 인슐린 투여용 카테터, 의치(denture), 유방 임플란트, 콘택트 렌즈 또는 임의의 기타 외래 장치 또는 임플란트 중 하나 이상의 장치 또는 임플란트를 보유할 수 있다. 바람직하게는, 상기 대상체는 골관절 장치, 바람직하게는 골관절 임플란트, 보다 바람직하게는 전체적 또는 부분적 관절 보철물, 보다 더 바람직하게는 전체적 또는 부분적 엉덩이, 무릎, 어깨, 팔꿈치, 손목 또는 발목 대체물을 갖는다.
본 발명의 추가 태양에서, 본 명세서에 제공된 임의의 실시형태에 따른 면역원성 또는 면역요법 조성물은 대상체에서 에스. 아우레우스 감염의 치료에 사용하기 위한 것이다. 용어 "치료"는 에스. 아우레우스 감염의 증상이 개선 또는 완전히 제거되는 프로세스를 지칭한다. 치료는 바람직하게는 본 명세서에 기재된 면역원성 또는 면역요법 조성물을, 에스. 아우레우스 감염의 치료 또는 예방에 사용되는 항생물질 요법 등의 하나 이상의 종래의 요법과 조합하여, 또는 에스. 아우레우스 감염에 기인하여 임플란트 실패의 경우에 임플란트 치환과 동시에 대상체에게 내부 투여함으로써 수행된다. 따라서, 특정 실시형태에 따르면, 상기 면역원성 또는 면역요법 조성물은 에스. 아우레우스 감염에 대해 효과적인 하나 이상의 항생물질과 함께 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 추가 태양은 에스. 아우레우스 감염을 예방 또는 치료하는 목적으로 본 명세서에 기재된 면역원성 조성물을 제공 또는 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 에스. 아우레우스 관련 질환 또는 감염을 예방 및/또는 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태에 따른 면역원성 또는 면역요법 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에 따르면, 이를 필요로 하는 대상체에게 수동 면역을 부여하는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 상기 방법은 (1) 적어도 하나의 에스. 아우레우스 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 사용하여 항체 제제를 생성하는 단계로서, 상기 항원은 서열번호 8의 SdrH-유사 폴리펩티드, 서열번호 4의 Nuc 및/또는 서열번호 12의 LukG와 적어도 80%의 동일성을 갖는 폴리펩티드인, 단계; 및 (2) 면역요법 제제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 상기 에스. 아우레우스는 항생물질 내성 에스. 아우레우스, 보다 바람직하게는 MRSA이다. 바람직하게는, 상기 대상체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 외래 장치 또는 임플란트를 갖고 있고, 보다 바람직하게는 상기 대상체는 골관절 장치, 바람직하게는 골관절 임플란트, 보다 바람직하게는 전체 관절 대체 보철물을 갖는다.
본 발명은 또한 대상체에서 면역 반응을 증가시키기 위한, 바람직하게는 에스. 아우레우스 관련 질환 또는 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 면역원성 또는 면역요법 조성물의 용도를 포함한다.
본 발명은 또한 에스. 아우레우스 관련 질환 또는 감염의 예방 및/또는 치료에서 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태에 따른 면역원성 또는 면역요법 조성물의 용도를 포함한다.
추가 태양에 따르면, 본 발명은 본 명세서에 제공된 면역원성 또는 면역요법 조성물 및 본 명세서에 기재된 면역원성 또는 면역요법 조성물을 대상체에게 제공 또는 투여하기 위한 설명서를 포함하는 키트에 관한 것이다.
상기에서 언급한 바와 같이, 임상 시험의 높은 비용과 기간을 고려하여, 시험관내 옵소닌 식작용(OPA) 검정은 백신 반응을 평가하기 위한[참조: Romero-Steiner et al., 2006], 게다가 항체 기능성, 특히 전문 식세포에 의한 에스. 아우레우스의 흡수를 촉진하는 항체의 능력을 평가하기 위한[참조: Nanra et al., 2013; Fowler et al, 2013] 보호의 상관물로서 일반적으로 사용된다. 특히, 다형핵 호중구를 사용하는 이전의 방법과는 대조적으로, 본 발명자들은 에스. 아우레우스의 흡수 및 사멸 둘 다를 촉진하는 항체가 가능한 표적 백신 항원을 동정하기 위해 본 명세서에 제공된 신규한 OPA 검정을 개발했다.
따라서, 추가 태양에 따르면, 본 발명은 대상체에서 에스. 아우레우스에 의해 유발된 질환에 대한 보호를 부여하는 항원을 동정하는 시험관내 방법으로서,
a) 에스. 아우레우스를 포함하는 용액을 에스. 아우레우스 항원에 대해 생성된 항체를 포함하는 용액과 함께, 바람직하게는 35℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하여, 혼합 현탁액을 수득하는 단계,
b) 마크로파지를 단계 a)의 혼합 현탁액과 접촉시키는 단계,
c) 마크로파지로부터 혼합 현탁액을 제거하고, 및
d) 상기 마크로파지에 의한 에스. 아우레우스 세균의 내재화 및 사멸을 평가하는 단계로서, 상기 항원이 에스. 아우레우스의 내재화의 증가 및 사멸 둘 다를 유도하는 경우에, 상기 항원은 에스. 아우레우스에 의해 유발된 질환에 대한 보호를 부여하는 것으로 간주되는, 단계
를 포함하는, 시험관내 방법에 관한 것이다.
상기 방법의 단계 a), b), c) 및 d)는 반드시 상기 지시된 순서로 수행된다. 세균이 특정 밀도(예: 광학 밀도 1)로 제공되도록 에스. 아우레우스를 포함하는 용액을 배양 또는 희석하는 것, 항체를 포함하는 용액을 농축 또는 희석하는 것, 및/또는 혼합 용액을 희석(예를 들면, 마크로파지가 특정 감염 다중도(MOI)을 갖는 세균과 접촉될 수 있도록)하는 것, 세균 및/또는 마크로파지를 세척하는 것, 마크로파지를 인큐베이팅하는 것 등의 추가 단계가 상기 방법에 추가로 포함될 수 있다.
단계 a)는 바람직하게는 35℃에서 1시간 동안 수행되지만, 인큐베이팅은 2℃ 내지 40℃ 범위의 온도에서 1분 내지 48시간 동안 발생할 수 있다. 유사하게는, 단계 b)는 바람직하게는 35℃에서 1시간 동안 수행되지만, 마크로파지는 2℃ 내지 38℃ 범위의 온도에서 1분 내지 48시간 동안 혼합 현탁액과 접촉시킬 수 있다. 바람직하게는, 마크로파지는 5% CO2 분위기에서 35℃에서 저장된다. 바람직하게는, 혼합 현탁액은 10:1 내지 25:1로 구성된 MOI(즉, 마크로파지당 10 내지 25개 세균)를 갖는다. 에스. 아우레우스와 마크로파지 층과의 접촉은, 에스. 아우레우스와 마크로파지 사이의 접촉이 촉진되도록 원심분리에 의해 증강시킬 수 있다. 따라서, 원심분리는 유리하게는 단계 b)의 기간을 단축시킬 수 있다. 상기 접촉 단계는 에스. 아우레우스 세균의 일부가 내재화하는 것을 가능하게 하고, 이는 단계 a)에서 제공된 항체를 포함하는 용액의 조성에 따라 추가로 달라질 수 있다. 단계 c)에서 혼합 현탁액의 제거는 특히 하나 이상의 세척 단계(예: 마크로파지를 신선한 배양 배지 또는 인산염 완충 생리식염수(PBS)로 세척하는 것)를 포함할 수 있다. 실제로, 이는 외부 에스. 아우레우스 세균의 제거를 유리하게 개선한다. 단계 c)는 바람직하게는 혼합 현탁액의 제거 후에 항생물질을 포함하는 용액의 첨가를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 용액의 첨가는 잔류하는 세포외 에스. 아우레우스 세균을 확실히 사멸시키는데 유리하다. 따라서, 에스. 아우레우스는 사용된 항생물질에 감수성이 있어야 하지만, 마크로파지는 영향을 받지 않는 것이 바람직하다. 비제한적 예로서, 상기 항생물질은 젠타마이신이다. 젠타마이신은 특히 50μg/mL 내지 100μg/mL 범위의 농도 또는 100μg/mL 이상의 농도로 존재할 수 있다. 비제한적 예로서, 항생물질을 포함하는 상기 용액은 DMEM 등의 세포 배양 배지이다. 상기 배양 배지는 바람직하게는 이전에 사용된 적이 없다(즉, "신선한" 것).
따라서, 바람직한 실시형태에 따르면, 단계 c)는 마크로파지로부터 혼합 현탁액을 제거하고, 항생물질이 보충된 용액을 첨가하는 것을 포함한다. 보다 바람직하게는, 단계 c)는 마크로파지로부터 혼합 현탁액을 제거하고, 항생물질이 보충된 신선한 배지를 첨가하는 것을 포함하고, 따라서 세포외 에스. 아우레우스 세균을 확실하게 사멸시킨다.
마크로파지에서 에스. 아우레우스 세균의 내재화 및 사멸은 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 결정할 수 있다.
일례로서, 내재화는 당해 기술분야에 공지된 방법(예: 이미지 분석 등)에 따라 관찰되는 형광 수준에 따라 세균을 정량화함으로써 결정될 수 있다(예를 들면, 직접적으로, 형광 단백질을 발현하는 재조합 에스. 아우레우스 세균의 형광을 측정함으로써, 또는 간접적으로, 고정된, 투과성 마크로파지, 예를 들면, BODIPY® FL 반코마이신(VMB), 그람 양성 세균의 세포벽에 결합하는 형광 당펩티드 항생물질에 하나 이상의 염색제를 첨가하고 수득된 형광을 측정함으로써). 내재화는, 이미지 인식 및 분석을 사용하여, 특히 목적 항원에 대해 생성된 항체를 포함하는 혼합 현탁액으로 처리된 마크로파지에서 단계 c)의 3시간 후에 존재하는 형광 수준을 대조군 혈청(예를 들면, 에스. 아우레우스가 부재하는 항원에 대해 생성, 예컨대, GFP 단백질)과 비교함으로써 결정할 수 있다. 특정 예로서, 이미지 분석을 사용하여, 예를 들면, 각 조건에서 마크로파지당 VMB 형광에 대해 양성인 픽셀의 수를 결정할 수 있다. 추가의 예로서, 단계 d)에서의 에스. 아우레우스 세균의 사멸은 단계 c)의 3시간 후에 마크로파지에 내재화된 세균의 양을 단계 c)의 6시간 후에 마크로파지에 내재화된 세균의 양과 비교함으로써 평가된다. 구체적으로, 사멸은 본 명세서에 기재된 방법에 따라 3시간 대 6시간에서 관찰되는 VMB 형광의 수준에 따라 결정할 수 있다. 세균의 성장은 3시간과 비교하여 6시간에서 형광의 증가가 측정된 경우에 발생하는 것으로 간주될 수 있다. 세균 용해(즉, 사멸)는 3시간과 비교하여 6시간에서 형광의 감소가 측정될 때에 발생하는 것으로 간주된다. 이러한 형광성 변화는 세균 성장/용해와 관련된 세포내 펩티도글리칸 양의 변화를 반영한다.
상기 방법에 사용되는 마크로파지는 임의의 마크로파지 세포주 또는 단리된 마크로파지일 수 있다. 바람직하게는, 상기 마크로파지는 고전적 배양 조건(즉, DMEM에서)에서 단층으로 배양된다. 바람직하게는, 상기 마크로파지는 불멸화된 마크로파지 세포주, 보다 바람직하게는 J774.2 세포주이다.
도 1. 면역 혈청에 의해 매개되는 에스 . 아우레우스의 흡수
1/1000(상부 패널) 및 1/2000(하부 패널)으로 희석된 면역 혈청을 사용하여 10:1(좌측 패널) 및 25:1(우측 패널)의 감염 다중도(MOI)에서 에스. 아우레우스 흡수(감염 후 3시간). 평균 형광 면적 값(488nm 여기, 515nm 방출)이 보고되고, 항-GFP 항체(값 1)에 의해 정규화된다. 표준 편차는 항-GFP 항체의 형광에 대한 정규화 전에 세포당 형광 면적의 값으로부터 계산되었다. 통계적 유의성은 생 데이터에 대해 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism)을 사용하여 평가되었다. *P-값 <0.05. **P-값 <0.01. 시험된 단백질: Pbp2a("A"), SspA("B"), Sak("C"), IsaA("D"), GlpQ("E"), 오토리신-유사 단백질("F"), Nuc("G"), Hla("H"), LukG("I"), LukH("J"), IsdA("K"), IsdB("M"), SdrD(2개의 부분 폴리펩티드로서: "N" 및 "Nb"), ClfA(2개 부분 폴리펩티드: "O" 및 "Ob"), MntC("1"), SdrH-유사 폴리펩티드("2"), Lip2("3"), 추정 단백질("4"), Atl("5") 및 가상 단백질("6"). 회색: Nuc("G"), LukG("I") 및 SdrH-유사 폴리펩티드("2").
도시된 바와 같이, 5개의 폴리펩티드만이 적어도 2개의 상이한 조건에서 흡수의 유의한 증가와 연관되어 있다: Nuc("G"), Hla("H"), LukG("I"), IsdA("K"), 및 SdrH-유사 폴리펩티드("2"); 1/1000 및 1/2000의 희석으로 관찰된 값이 유사하고, 이는 역치 효과가 없는 것을 나타냄에 주의한다.
도 2. 에스 . 아우레우스 사멸
1/1000(상부 패널) 및 1/2000(하부 패널)으로 희석된 면역 혈청을 사용하여, 10:1(좌측 패널) 및 25:1(우측 패널)의 MOI에서 에스. 아우레우스(감염 후 6시간) 사멸. 6시간의 시점에서 보고된 단백질의 평균 형광 면적(여기 488nm, 방출 515nm)은 여기에서 3시간의 시점에서 동일한 단백질에 대해 측정된 값(참조 값 1)으로 정규화된다. 시험된 단백질은 상기에 수록된 것과 동일하다(도 1의 범례 참조). 회색: Nuc("G"), LukG("I") 및 SdrH-유사 폴리펩티드("2").
도시된 바와 같이, 에스. 아우레우스 흡수의 유의한 증가와 관련된 5개 항원 중 3개만이 모든 검정 조건에서 세균의 사멸과 관련이 있다: Nuc("G"), LukG("I") 및 SdrH -유사 폴리펩티드("2").
도 3. 감염 후 6시간에 항- IsdB 단백질 및 항- SdrH -유사 단백질 항혈청으로 처리된 에스 . 아우레우스에 감염된 마크로파지의 사진( MOI 1:10, 혈청 희석 1/1000)
항-IsdB("M") 단백질 항혈청(패널 A)을 사용하면, 무수한 세균(백색 원)이 세포질 공간을 충전하는 것을 볼 수 있고; 세포외 세균의 방출을 수반하는 세포 용해 면적도 관찰할 수 있다. 이것은 항-SdrH-유사 폴리펩티드("2") 항혈청(패널 B)으로 수득된 사진과 대조적이고; 개별 세균(백색 원)을 열거할 수 있고; 세포골격 구조가 보존되고, 핵 영역이 보존된다. 유사한 관찰은, 항-Nuc("G") 단백질 및 항-LukG("I") 단백질 항혈청에서 이루어졌다(데이터는 도시되지 않음).
실시예
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태를 입증하기 위해 포함된다. 하기 실시예 및 첨부 도면에 기재 또는 도시된 모든 주제는 한정적인 의미가 아니라, 예시로서 해석되어야 한다. 하기 실시예는 당업자에 의해 결정될 수 있는 임의의 대체물, 균등물 및 수정을 포함한다.
실시예 1: 에스 . 아우레우스 및 대조군 항원의 작제 , 생산 및 정제
재료 및 방법
본 발명의 에스 . 아우레우스 항원 및 에스 . 아우레우스 조절 항원을 코딩하는 유전자의 발현 벡터로의 클로닝
서열분석된 에스. 아우레우스 균주 Mu50을 게놈 DNA의 공급원으로 사용했다. DNA 추출은 시판 키트(DNeasy Blood and Tissue, Qiagen Hilden, Germany)를 사용하여 수행되었다. 목적 에스. 아우레우스 유전자는 AmplifX로 설계된 적절한 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시켰다.
에스. 아우레우스 유전자의 뉴클레오티드 서열은 특히 서열번호 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73 및 79에 제공된 바와 같다. 클로닝된 DNA 서열은 서열번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 75, 80 및 81에 제공된 바와 같다. 특히, 2개의 상이한 폴리펩티드가 sdrD 및 clfA 유전자에 대해 클로닝되었다(sdrD에 대해서는 서열번호 74 및 75 및 clfA에 대해서는 서열번호 80 및 81). DNA는 폴리-히스티딘 태그를 함유하는 발현 벡터 pET-6xHN-N(Clontech, Otsu, Japan)과 마찬가지로 SalI 및 StuI(Thermo Scientific, Waltham, USA)을 사용하여 효소적 제한 전에 정제했다. 이어서, 제한된 PCR 산물을 벡터에 결찰했다. 수득된 각 유전자의 발현 벡터는 화학 적격의 DH10β1 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)(Thermo Scientific)으로 형질전환되기 전에 전기영동 이동에 의해 조절되었다. 형질전환된 세균을 루리아-베르타니(Luria-Bertani; LB) 브로쓰에서 35℃에서 1시간 인큐베이팅한 후, 암피실린(100mg/L)을 함유하는 LB 아가에 플레이팅하고, 35℃에서 밤새 인큐베이팅했다. 단리된 콜로니를 수집하고, LB 브로쓰에서 밤새 성장시켜 클론을 증폭시켰다. 이어서, 시판 키트(QIAprep Spin Miniprep, Qiagen)를 사용하여 벡터 DNA를 정제했다. 삽입된 각 유전자 서열을 검증하기 위해 서열분석을 수행했다. pET-6xHN-GFPuv 벡터(Clontech)를 사용하여, 녹색 형광 단백질을 발현시켰다(GFP, 클로닝된 DNA 및 아미노산 서열에 대해 각각 서열번호 85 및 86).
항원 생산 및 정제
검증된 벡터를 사용하여, DH10β1 세포에 사용된 것과 동일한 프로토콜에 따라 화학적격 BL21(DE3) 이. 콜라이 세포(Thermo Scientific)를 형질전환하고, 유사하게 증폭된 콜로니를 단리했다. 밤새 배양물의 1/100 희석액을 배양물이 0.5의 광학 밀도(OD)에 도달할 때까지 35℃에서 인큐베이팅했다. 이어서, IPTG 용액(최종 1mM)을 세균에 첨가하여, OD가 1.2에 도달할 때까지 35℃에서 항원 생산을 유도했다. 원심분리에 의해 수득된 세균 펠릿을 용해하고, 히스티딘 태그된 단백질을 시판 키트(Proteus Metal Chelate, Generon, Slough, UK)를 사용하여 정제하고, 재조합 His 태그 단백질은 10mM 이미다졸 용액을 사용하여 용출시켰다. 이어서, 아미콘 울트라-15 컬럼(Merck, Darmstadt, Germany)을 사용하여 용출된 항원을 농축했다. 상기 항원의 폴리펩티드 서열은 서열번호 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 76 및 82에 제공된 바와 같다. 클로닝된 폴리펩티드 서열은 모두 N-말단 His 태그를 추가로 포함하고, 서열번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 10, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 77, 78, 83 및 84에 제공된 바와 같다.
항원 특성화
정제된 항원의 특성화는 재조합 항원의 크기, 완전성 및 순도를 평가하기 위해 쿠마시에 용액으로 착색된 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 수행되었다. 정제된 항원 용액의 농도는 브래드포드(Bradford)의 방법을 사용하여 결정되었다.
결과
22개의 상이한 폴리펩티드로서 평가된 합계 20개의 에스. 아우레우스 항원이 클로닝, 발현 및 정제되었고(>95% 순도), 정제된 단백질의 총량은 각 재조합 단백질에 대해 1mg 내지 6mg 범위이다.
이들 단백질 중 4개는 약제학적 개발 중의 에스. 아우레우스 백신에 포함되어 있고, 대조군 백신 항원으로 사용되었다: IsdB(문헌[참조: Harro et al., 2010, Moustafa et al., 2012, Fowler et al., 2013]에 기재됨), MntC(문헌[참조: Salazar et al., 2014, Begier et al., 2017, Inoue et al., 2018]에 기재됨), ClfA(문헌[참조: Salazar et al., 2014, Begier et al., 2017, Inoue et al., 2018]에 기재됨) 및 Hla 알파-독소(문헌[참조: Landrum et al., 2016]에 기재됨).
실시예 2: 에스 . 아우레우스 항원에 대한 항체 생산
재료 및 방법
에스. 아우레우스 폴리펩티드 및 대조군 항원을 표적화하는 항체는 특정 병원체 비함유 BALB/cJRj 마우스의 면역화에 의해 수득되었고, 에스. 아우레우스 비함유 환경에서 유래한 것으로 구체적으로 보고되었다. 마우스는 9주령이었을 때에 제공받았고, 면역화 1주일 전에 순응시켰다. 항원당 6마리의 마우스 그룹에, 프로인트 완전 애쥬번트를 포함하는 20μg의 정제된 항원의 제1 용량을 주입하고, 이어서 21일차와 42일차에 프로인트 불완전 애쥬번트를 포함하는 20μg의 항원을 추가로 2회 주사했다. 마우스를 희생시키고, 제1 주사의 50일 후에 혈청을 수집했다. 제1 대조군(n=6)에는 GFP(비관련 비-에스. 아우레우스 항원)를 주사했다. 제2 대조군(n=6)에는 애쥬번트 면역원성을 조절하기 위해 인산염 완충액(PBS)을 주사했다.
각 면역 혈청의 역가 및 특이성은 정제된 단백질을 사용한 웨스턴 블롯으로 검증했다.
결과
각 혈청은 역가 60,000까지 연속 희석으로 평가했다. 시험된 모든 혈청 샘플은 이 농도에서 양성 특이적 밴드를 나타냈고, 이는 모든 동물의 효과적 면역화를 나타낸다. 동일한 항원으로 면역화시킨 6마리의 마우스로부터의 혈청을 풀링하여, 22개의 에스. 아우레우스 폴리펩티드 각각 및 GFP에 대한 단일 면역 혈청 스톡을 수득했다.
실시예 3: 마크로파지 기반 OPA 검정에서 면역 혈청의 시험관내 평가
재료 및 방법
에스 . 아우레우스 균주
실험은 USA300과 이의 spA-유도체(Frederic Laurent, Lyon)을 사용하여 수행했다.
마크로파지 배양
세포 검정은 뮤린(murine)의 BALB/c 불멸화 마크로파지 세포주 J774.2(European Collection of Authenticated Cell Lines, Porton Down, UK)에서 실시되었다. 마크로파지는 5% CO2 분위기하에 35℃에서 10% 소 태아 혈청이 보완된 둘베코 변형된 이글 배지(DMEM)에서 배양했다. 세포를 보완된 DMEM에 현탁시키고, 적정하고, 검정 24시간 전에 배양 플레이트에 시딩했다.
마크로파지-기반 검정
뇌-심장 주입(BHI) 브로쓰에서 18시간의 에스. 아우레우스 배양물을 신선한 배지에서 1/100으로 희석하고, 배양물이 OD 1에 도달할 때까지 37℃에서 인큐베이팅했다. 1/1000 또는 1/2000으로 희석된 면역 혈청을 첨가하고, 35℃에서 1시간 동안 세균 표면에 결합시켰다. 이어서, 혈청-처리된 세균을 10:1(세포당 10개 세균) 및 25:1(세포당 25개 세균)의 감염 다중도(MOI)로 적정된 J774.2 세포 단층에 첨가했다. 5% CO2 분위기하에 35℃에서 1시간 동안 인큐베이팅한 후, 웰로부터 배지를 비우고, 젠타마이신을 포함한 신선한 DMEM을 첨가하기 전에 PBS로 온화하게 세척했다. 적절한 시간에(이하 참조: 세균 흡수, 감염 후 3시간; 세균 사멸, 감염 후 6시간), J774.2 세포를 PBS로 세척하고, PFA 4%로 5분간 고정한 후, 0.1% 트리톤 X100으로 5분 동안 투과처리했다. 고정 세포를 훽스트(Hoechst) 33342(Thermo Scientific), 팔로이딘(Phalloidin)-ATTO 655(Sigma-Aldrich, Saint-Louis, USA) 및 BODIPY® FL 반코마이신(VMB)(Invitrogen, Carlsbad, USA)으로 30분간 염색하고, 유리 커버슬립을 사용하여 밀봉했다. 라이카(Leica) SP8 공초점 현미경을 사용하여 이미지를 취득하고, ImageJ 소프트웨어(National Institute of Health, Bethesda, USA)를 사용하여 분석했다.
세균 흡수 및 사멸의 평가
혈청 처리된 세균의 흡수는, 감염 후 3시간에서, 각 항원 특이적 혈청에 대한 J774.2 세포당 VMB 형광(세균 세포벽의 정량화)의 픽셀 수를 관련 없는 대조군 혈청(항-GFP)에 대한 J774.2 세포당 VMB 형광의 픽셀 수와 비교함으로써 평가했다.
내재화된 세균의 결과를 평가하기 위해, 감염후 3시간과 감염후 6시간의 VMB 면적을 비교했다. 세균의 성장은, 세포내 펩티도글리칸 양의 증가를 반영하여, 형광의 증가가 측정될 때 호출되었다. 세포내 펩티도글리칸 양의 감소를 반영하여, 세포내 펩티도글리칸 양의 감소가 측정될 때에 세균 용해("사멸")가 호출되었다.
결과
2개의 항체 희석액(1:1000, 1:2000)과의 에스. 아우레우스 인큐베이팅 후에 10:1 및 25:1의 MOI에서의 감염 3시간 후에 평가된 세균 흡수 평가는, 정규화를 위한 각 실험에서 항-GFP 대조군 혈청을 특성화하여 본 명세서에 제시되어 있다. 5개의 항원은 단백질 SdrH-유사 폴리펩티드("2"), Nuc("G") 및 LukG("I"), 및 Hla("H") 및 IsdA("K")의 적어도 2개 조건에서 에스. 아우레우스의 내재화가 대폭 증가한 현저히 상이한 거동을 나타낸다(도 1).
세포내 세균 제거 및 성장은 감염 6시간 후 VMB 형광 면적과 감염 3시간 후 관찰된 형광 면적을 비교함으로써 평가했다. 유의한 세균 흡수와 관련이 있는 것으로 이전에 밝혀진 5개 항원 중에서, 3개는 모든 실험 조건에서 세균 사멸과 관련이 있었다: SdrH-유사 폴리펩티드("2"), Nuc("G") 및 LukG("I")(도 2).
주목할 것으로, 흡수에 유의한 효과가 없는 다수의 단백질은 세균 성장 증강(면역 혈청의 "촉진" 효과)과 관련이 있었다(예를 들면, 도 2의 단백질 Pbp2a("A") 및 Sak("C"), 25:1의 MOI 및 1/1000의 혈청 희석에서). 세균 성장은 항-IsdB 단백질 혈청에서 특히 강력했고, 마크로파지 단층의 파괴를 초래했고(도 3), 이는 세포내 세균의 부하의 과소평가를 유도했다(도 1 및 2를 도 3과 비교).
실시예 4: 마우스에서 전신성 에스. 아우레우스 감염의 생체내 모델의 확립
이전 연구에서는, BALB/c 마우스는 이 마우스 계통이 신장에서 세균 성장을 제한할 수 없기 때문에 혈액 유래 에스. 아우레우스 감염에 매우 감수성인 것으로 밝혀졌다[참조: von Kockritz-Blickwede et al., 2008]. 그러나, 감염 경과는 병원성 레퍼토리에 따라 에스. 아우레우스 균주 사이에서 상이할 수 있기 때문에, 먼저 에스. 아우레우스의 어느 용량이 비치사성 신장 감염을 유발하는지를 결정했다.
재료 및 방법
에스 . 아우레우스 균주
실험은 에스. 아우레우스 균주 USA300으로 수행했다.
마우스
암컷 BALB/c 마우스는 잔비에르 랩스(Janvier Labs)(Le Genest Saint Isle, France)에서 구입했다. 마우스는 6주령일 때에 제공받았고, 면역화 1주일 전에 순응시켰다. 동물 실험은 제도적 및 국가적 윤리 가이드라인(Agreement APAFIS #26827)에 따라 실시되었다.
전신성 에스. 아우레우스 감염의 마우스 모델
케타민/자일라진(50/10mg/kg)을 복강내 투여하여 마우스를 마취시키고, 100μL의 용적으로 안와후동 주사에 의해 109, 107 또는 105 CFU의 USA300을 접종했다. 감염 3시간 후 및 24시간 후에 마우스를 안락사시켰다. 비장과 신장을 채취하고, 균질화하고, 연속 희석액을 뮈엘러 힌톤(Mueller Hinton) 2 한천 플레이트에 플레이팅했다. CFU는 37℃에서 24시간 배양 후에 계수되었다(최소 검출 한계: 기관당 2.69 log10 CFU).
결과
109 CFU의 용량은 챌린지 후 24시간의 시점 이전에, 100%의 동물의 사망을 유발한 반면, 105 CFU는 신장에서의 감염을 허용하지 않았다(챌린지 후 3시간 및 24시간에 세균은 검출되지 않음)(표 2).
따라서, 107 CFU는 치사성이고, 신장 감염과 관련된 유일한 용량이었다. 예상된 바와 같이, 세균의 부하는 비장에서의 챌린지 후 3시간 및 24시간에서 유사했고, 이는 감염 통제를 시사한 반면, 신장에서는 세균 성장이 극적으로 증가했다(챌린지 후 3시간 및 24시간 사이의 CFU 차이는 약 4 log10)(표 2).
비-면역화된 동물에서 챌린지 후 3시간 및 24시간에서의 CFU 계수.
USA300 용량 기관당 CFU의 평균 수(log10 a)
비장 신장
3h 24h 3h 24h
109 CFU 6.70 †b 6.68 †b
107 CFU 5.71 5.58 2.69 6.08
105 CFU 3.66 ND ND ND
a 기관당 및 각 시점에서의 4마리 동물의 그룹.
b 모든 동물은 챌린지 후 24시간 시점 이전에 사망했다.
c 검출 불능(최소 검출 한계, 2.69 log10 CFU).
실시예 5: 전신성 에스. 아우레우스 감염의 마우스 모델에서 SdrH-유사 폴리펩티드 대 음성 대조군의 보호 효과의 평가
BALB/c 마우스는 강력한 Th2 반응을 발생시킴으로써 에스. 아우레우스 감염을 제어할 수 있는 것으로 밝혀졌다[참조: Nippe et al., 2011]. 우리는 이전에 OPA 검정에서 SdrH-유사 폴리펩티드, Nuc 또는 LukG에 대해 지시된 혈청이 식세포에 의한 에스. 아우레우스의 사멸을 증강시켰다는 것을 밝혀냈다(실시예 3 참조). 따라서, 이러한 3개 항원 중 하나인 SdrH-유사 폴리펩티드("SdrH-유사")를 BALB/c 마우스에 백신접종하는 것으로 이 전신 감염 모델에서 신장 감염의 제어를 개선할 수 있는지의 여부를 연구했다.
재료 및 방법
SdrH 유사, 애쥬번트의 생산 및 정제
SdrH-유사는 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성하고 정제했다. 애쥬번트(수산화알루미늄 겔(Alhydrogel®) 및 인산알루미늄 겔(Adju-Phos®); InVivoGen, CA, USA)는 제조원의 권장에 따라 사용되었다.
백신접종 프로토콜 및 종점 분석
마우스를 1주에 1회 3주간 근육내에 10μg의 정제된 SdrH-유사(수산화알루미늄 겔(우측 대퇴, 용적: 50μL)로 5μg 및 인산알루미늄 겔(좌측 대퇴, 용적: 50μL)로 5μg)로 면역화시키고; 마우스는 음성 대조군과 동일한 양의 애쥬번트만을 제공받았다.
마우스(시점당 6마리의 마우스 그룹)에 3회차 면역화의 2주 후에 USA300의 107 CFU의 용량을 접종하고; 그 이외의 프로토콜은 실시예 4에 기재된 바와 같았다.
결과
표 3에 제시된 바와 같이, 챌린지 후 24시간의 세균 부하는 SdrH 유사 백신을 접종한 마우스 대 대조군 마우스에서 0.53 log10 CFU 감소했다. 백신접종된 마우스에서는 신장 감염이 조절되지 않았지만, 세균 성장은 대폭 감소했다(챌린지 후 3시간 내지 24시간 사이에 +1.53 log10 CFU 대 대조군 마우스에서는 +2.06 log10 CFU).
예상된 바와 같이, 백신접종은 비장 감염에 최소한의 영향을 미쳤다.
SdrH 유사 대 음성 대조군으로 면역화된 동물의 챌린지 후 3시간 및 24시간에서의 CFU 계수.
챌린지 후 시간 기관당 평균 CFU 수(log10 a)
음성 대조군b SdrH-유사
비장 신장 비장 신장
3h 5.31 3.20 5.25 3.15
24h 4.05 5.26 4.33 4.68
3h-24hΔ -1.26 +2.06 -0.92 +1.53
a 기관당 및 각 시점에서 6마리 동물의 그룹.
b 애쥬번트 단독.
실시예 6: 전신성 에스 . 아우레우스 감염의 마우스 모델에서 SdrH -유사 대 스타필로키나제 및 MntC의 보호 효과의 평가
이어서, SdrH-유사를 스타필로키나제 및 MntC와 비교했다. 제1 비교물질인 스타필로키나제는 이 단백질에 대해 지시된 혈청이 OPA 검정에서 에스. 아우레우스의 세포내 성장에 유리한 것으로 역설적으로 나타났기 때문에 선택되었다(도 1 및 2에서 Sak, "C" 참조). 제2 비교물질인 MntC는 다양한 동물 모델에서 유망한 백신 후보인 것으로 나타났기 때문에 선택되었지만[참조: Anderson et al., 2012], OPA 검정에서는 SdrH 유사보다 열등한 것으로 나타났다(도 1 및 2에서 MntC , "1" 참조).
3개의 감염 용량이 시험되었다: 107, 3×106 및 106 CFU.
재료 및 방법
SdrH-유사, 스타필로키나제 및 MntC는 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성 및 정제되었다. 백신접종 프로토콜 및 종점 분석은 보호 효과가 3개 용량: 107, 3×106 및 106 CFU의 USA300을 사용하여 평가된 것을 제외하고는 실시예 5에 기재된 바와 같았다.
결과
신장에서 감염 경과는 스타필로키나제로 백신접종한 마우스와 비교하여 SdrH 유사로 백신접종한 마우스에서 명백하게 상이했고(표 4); USA300의 용량에 관계없이, SdrH-유사는 스타필로키나제와 비교하여 신장의 세균 부하를 약 0.80 log10 CFU 감소시켰다(표 5).
유사한 CFU의 감소(0.95 log10 CFU)가 최저 용량, 즉 106 CFU의 스타필로키나제와 비교하여 MntC에서 관찰되었고(표 5); 그러나, 차이는 107 및 3×106 CFU에서 훨씬 적었다(단지 0.30 내지 0.39 log10 CFU의 감소, 표 5).
상기의 결과와 일치하여, SdrH-유사는 2개의 최고 용량, 즉 107 및 3×106 CFU(각각 0.45 및 0.47 log10 CFU의 감소; 표 5)에서 신장 감염에 대해 MntC보다 더 강력한 영향을 미치는 것으로 나타났지만, 유사한 결과가 106 CFU에서 발견되었다.
따라서, SdrH-유사, 스타필로키나제 및 MntC로 백신접종한 후에 신장에서 관찰된 세균 동태는 OPA 검정에서 이들 3개 항원으로 관찰된 세균 동태와 유사했다.
예상된 바와 같이, 이 3개 항원 각각에 대한 백신접종은 비장 감염에 최소한의 영향을 미쳤다.
SdrH 유사 대 스타필로키나제 및 MntC로 면역화된 동물에서 챌린지 후 3시간 및 24시간에서의 CFU 계수.
USA300 용량 챌린지 후 시간 기관당 평균 CFU 수(log10 a)
스타필로키나제 MntC SdrH-유사
비장 신장 비장 신장 비장 신장
107 CFU 3h 5.28 3.00 5.09 3.20 5.24 3.55
24h 4.41 4.77 4.55 4.58 4.27 4.48
3-24 b -0.87 +1.77 -0.54 +1.38 -0.97 +0.93
3×106 CFU 3h 4.97 2.69 4.91 2.85 4.93 2.85
24h 3.79 4.46 3.90 4.32 4.08 3.85
3-24 -1.18 +1.77 -1.01 +1.47 -0.85 +1.00
106 CFU 3h 4.43 2.69 4.23 2.85 4.52 2.69
24h 3.77 3.90 3.76 3.11 3.61 3.09
3-24 -0.66 +1.21 -0.47 +0.26 -0.91 +0.40
a 기관당 및 각 시점에서 6마리 동물의 그룹.
b 3시간 내지 24시간 사이의 세균 성장은 "+"로 표시되고, 세균 사멸은 "-"로 표시된다.
신장에서 3시간 내지 24시간의 CFU 차이의 쌍 비교.
USA300 용량 3h-24h CFU 차이(log10 (차이)a)
SdrH-유사 대 스타필로키나제 SdrH-유사 대 MntC MntC 대 스타필로키나제
107 CFU +0.93 대 +1.77
(-0.84) 		+0.93 대 +1.38
(-0.45)		 +1.38 대 1.77
(-0.39)
3×106 CFU +1.0 대 +1.77
(-0.77) 		+1.0 대 +1.47
(-0.47)		 +1.47 대 1.77
(-0.30)
106 CFU +0.40 대 +1.21
(-0.81) 		+0.40 대 +0.26
(+0.14)		 +0.26 대 1.21
(-0.95)
a 볼드체의 경우, 차이는 ≥ 0.5 log10 CFU이다.
결론
에스. 아우레우스에 대한 특이적 항체의 결합은, 세포외 항원의 생리학적 기능을 억제하고, 면역 세포에 의한 흡수를 증가시키고, 식작용을 촉진하고, 및/또는 식세포 구획에 대한 세균의 표적화를 개선할 수 있기 때문에, 숙주에 유익할 수 있다. 보다 구체적으로, 에스. 아우레우스 항원에 대한 항체는 세균을 양호한 세포내 미세환경으로 표적화하는 세균 방어 메커니즘을 억제하고, 항원 제시를 위한 세균의 프로세싱을 증가시킴으로써 면역 반응을 증강시키고, 세균 클리어런스를 촉진할 수 있다. 그러나, 특정 항체에는 유해한 효과가 있고, 이는 면역계에 의해 적절하게 인식되고 숙주에 의한 감염의 조절에 관여하는 결정인자의 기능을 억제함으로써 세균의 병원성을 증강시킨다. 백신 후보에 의해 생성된 체액성 반응은 바람직하게는 최적 항원 제시를 위해 세균 흡수를 증가시키고, 세포내 세균 용해를 증강시켜야 한다.
SdrH-유사 폴리펩티드, Nuc 또는 LukG에 대한 혈청은 놀랍게도 마크로파지에 의한 에스. 아우레우스의 내재화를 촉진하고, 식작용 후의 에스. 아우레우스의 세포내 클리어런스를 증강시키는 것으로 밝혀졌다.
후보 백신 단백질 Hla, MntC 및 ClfA에 대해 생성된 항혈청 중 어느 것도 본 명세서에 보고된 2개의 특성을 조합한 임상 시험에서 이전에 개발되고 효과가 없는 것으로 밝혀진 것에 주목할 가치가 있다. 더욱이, IsdB 백신 후보는 백신접종을 받은 환자의 결과를 악화시키는 것으로 나타났고, 여기에 보고된 마크로파지 검정에서는 내재화의 증강에 따른 마크로파지 층의 급성 파괴와 함께 유해한 것으로 입증되었다. 이들 결과는 대상체에서 에스. 아우레우스에 의해 유발된 질환에 대한 보호를 부여하는 항원을 동정할 때에 본 명세서에 제공된 신규한 마크로파지 기반 시험관내 검정의 타당성을 추가로 확인시켜 준다.
또한, 마크로파지 기반 시험관내 검정의 결과는 신장에서의 세균 성장을 제한할 수 없기 때문에 에스. 아우레우스에 매우 감수성이 높은 BALB/c 마우스를 사용한 에스. 아우레우스 감염의 전신 모델에서 생체내에서 확인되었다. 실제로, 이 모델에서 평가된 3개의 항원 중, SdrH-유사 폴리펩티드는, 마크로파지 검정에서 관찰된 동태와 일치하여, 신장 전체에서 에스. 아우레우스의 세균 성장에 대해 가장 강력한 억제 효과를 나타냈고, 이어서 MntC가 뒤를 따랐다.
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AUREUS INFECTION <130> D39006 <150> EP19306797.2 <151> 2019-12-31 <160> 86 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 687 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 1 atgacagaat acttattaag tgctggcata tgtatggcaa ttgtttcaat attacttata 60 gggatggcta tcagtaatgt ttcgaaaggg caatacgcaa agaggttttt ctttttcgct 120 actagttgct tagtgttaac tttagttgta gtttcaagtc taagtagctc agcaaatgca 180 tcacaaacag ataacggcgt aaatagaagt ggttctgaag atccaacagt atatagtgca 240 acttcaacta aaaaattaca taaagaacct gcgacattaa ttaaagcgat tgatggtgat 300 acggttaaat taatgtacaa aggtcaacca atgacattca gactattatt agttgataca 360 cctgaaacaa agcatcctaa aaaaggtgta gagaaatatg gccctgaagc aagtgcattt 420 acgaaaaaaa tggtagaaaa tgcaaataaa attgaagtcg agtttgacaa aggtcaaaga 480 actgataaat atggacgtgg cttagcgtat atttatgctg atggaaaaat ggtaaacgaa 540 gctttagttc gtcaaggctt ggctaaagtt gcttatgttt ataaacctaa caatacacat 600 gaacaacttt taagaaaaag tgaagcacaa gcgaaaaaag agaaattaaa tatttggagc 660 gaagacaacg ctgattcagg tcaataa 687 <210> 2 <211> 612 <212> DNA 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Gly Asn Asp Phe 195 200 205 Val Ser Gln Arg Phe Leu Ala Leu Ala Asn Gly Ala Tyr Lys Tyr Asn 210 215 220 Pro Tyr Ile Leu Asn Gln Ile Asn Lys Leu Gly Lys Asp Tyr Gly Glu 225 230 235 240 Val Thr Asp Glu Asp Ile Tyr Asn Ile Ile Arg Lys Gln Asn Phe Ser 245 250 255 Gly Asn Ala Tyr Leu Asn Gly Leu Gln Gln Gln Ser Asn Tyr Phe Arg 260 265 270 Phe Gln Tyr Phe Asn Pro Leu Lys Ser Glu Arg Tyr Tyr Arg Asn Leu 275 280 285 Asp Glu Gln Val Leu Ala Leu Ile Thr Gly Glu Ile Gly Ser Met Pro 290 295 300 Asp Leu Lys Lys Pro Glu Asp Lys Pro Asp Ser Lys Gln Arg Ser Phe 305 310 315 320 Glu Pro His Glu Lys Asp Asp Phe Thr Val Val Lys Lys Gln Glu Asp 325 330 335 Asn Lys Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Ser Lys Ser Trp Leu Ala Ile 340 345 350 Val Cys Ser Met Met Val Val Phe Ser Ile Met Leu Phe Leu Phe Val 355 360 365 Lys Arg Asn Lys Lys Lys Asn Lys Asn Glu Ser Gln Arg Arg 370 375 380 <210> 9 <211> 1056 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 9 atgaaaaata aaaaacgtgt tttaatagcg tcatcattat catgtgcaat tttattgtta 60 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ttattctata gaaatacgag aattgctact 660 gtagaaaacc ctgaactaag ctttgcttca aaatatagat acccagcatt agtaagaagt 720 ggctttaatc cagaattttt aacttattta tctaatgaaa agtcaaatga gaaaacgcaa 780 tttgaagtaa catacacacg aaatcaagat attttgaaaa acagacctgg aatacattat 840 gcaccttcaa ttttagaaaa aaataaagat ggtcaaaggt taattgtcac ttatgaagtt 900 gattggaaaa ataaaacagt taaagtcgtt gataaatatt ctgatgacaa taaaccttat 960 aaagaaggat aa 972 <210> 11 <211> 351 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 11 Met Lys Asn Lys Lys Arg Val Leu Ile Ala Ser Ser Leu Ser Cys Ala 1 5 10 15 Ile Leu Leu Leu Ser Ala Ala Thr Thr Gln Ala Asn Ser Ala His Lys 20 25 30 Asp Ser Gln Asp Gln Asn Lys Lys Glu His Val Asp Lys Ser Gln Gln 35 40 45 Lys Asp Lys Arg Asn Val Thr Asn Lys Asp Lys Asn Ser Thr Val Pro 50 55 60 Asp Asp Ile Gly Lys Asn Gly Lys Ile Thr Lys Arg Thr Glu Thr Val 65 70 75 80 Tyr Asp Glu Lys Thr Asn Ile Leu Gln Asn Leu Gln Phe Asp Phe Ile 85 90 95 Asp Asp Pro Thr Tyr Asp Lys Asn Val Leu Leu Val Lys Lys Gln Gly 100 105 110 Ser Ile His 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gcatggttaa gtttagataa tggtattaaa tacgtaaaaa caattcaaca aacatttatc 480 gataacgaca aaaaacataa agcagattat gaaaagcaag gtaacaaata cattgctcaa 540 ttggaaaaat taaataatga cagtaaagac aaatttaatg acattccaaa agaacaacgt 600 gccatgatta caagtgaagg tgccttcaag tacttctcaa aacaatacgg tattacacca 660 ggttatattt gggaaattaa cactgaaaaa caaggtacac ctgaacaaat gagacaagct 720 attgagtttg ttaaaaagca caaattaaaa cacttattag tagaaacaag tgttgataag 780 aaagcaatgg aaagtttatc tgaagaaacg aagaaagata tctttggtga agtgtacaca 840 gattcaatcg gtaaagaagg cactaaaggt gactcttact acaaaatgat gaaatcaaat 900 attgaaactg tacacggaag catgaaataa 930 <210> 18 <211> 831 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> MntC - Cloned DNA Sequence <400> 18 aaagtagtaa cgacgaattc aattttatat gatatggcta aaaatgttgg tggagacaac 60 gtcgatattc atagtattgt acctgttggt caagatcctc atgaatatga agttaaacct 120 aaagatatta aaaagttaac tgacgctgac gttattttat acaacggatt aaatttagag 180 actggtaacg gttggtttga aaaagcctta gaacaggctg gtaaatcatt aaaagataaa 240 aaagttatcg cagtatcaaa 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240 ggtaacattg atcgcaacgt tcaatttaat tttgttaaag aagatggtat gtggaagtta 300 gattgggatc atagcgtcat tattccagga atgcagaaag accaaagcat acatattgaa 360 aatttaaaat cagaacgtgg taaaatttta gaccgaaaca atgtggaatt ggccaataca 420 ggaacagcat atgagatagg catcgttcca aagaatgtat ctaaaaaaga ttataaagca 480 atcgctaaag aactaagtat ttctgaagac tatatcaaac aacaaatgga tcaaaattgg 540 gtacaagatg ataccttcgt tccacttaaa accgttaaaa aaatggatga atatttaagt 600 gatttcgcaa aaaaatttca tcttacaact aatgaaacag aaagtcgtaa ctatcctcta 660 ggaaaagcga cttcacatct attaggttat gttggtccca ttaactctga agaattaaaa 720 caaaaagaat ataaaggcta taaagatgat gcagttattg gtaaaaaggg actcgaaaaa 780 ctttacgata aaaagctcca acatgaagat ggctatcgtg tcacaatcgt tgacgataat 840 agcaatacaa tcgcacatac attaatagag aaaaagaaaa aagatggcaa agatattcaa 900 ctaactattg atgctaaagt tcaaaagagt atttataaca acatgaaaaa tgattatggc 960 tcaggtactg ctatccaccc tcaaacaggt gaattattag cacttgtaag cacaccttca 1020 tatgacgtct atccatttat gtatggcatg agtaacgaag aatataataa attaaccgaa 1080 gataaaaaag 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ctaatgccgc agattctgat attaatatta aaaccggtac tacagatatt 120 ggaagcaata ctacagtaaa aacaggtgat ttagtcactt atgataaaga aaatggcatg 180 cacaaaaaag tattttatag ttttatcgat gataaaaatc acaataaaaa actgctagtt 240 attagaacga aaggtaccat tgctggtcaa tatagagttt atagcgaaga aggtgctaac 300 aaaagtggtt tagcctggcc ttcagccttt aaggtacagt tgcaactacc tgataatgaa 360 gtagctcaaa tatctgatta ctatccaaga aattcgattg atacaaaaga gtatatgagt 420 actttaactt atggattcaa cggtaatgtt actggtgatg atacaggaaa aattggcggc 480 cttattggtg caaatgtttc gattggtcat acactgaaat atgttcaacc tgatttcaaa 540 acaattttag agagcccaac tgataaaaaa gtaggctgga aagtgatatt taacaatatg 600 gtgaatcaaa attggggacc atatgataga gattcttgga acccggtata tggcaatcaa 660 cttttcatga aaactagaaa tggttctatg aaagcagcag agaacttcct tgatcctaac 720 aaagcaagtt ctctattatc ttcagggttt tcaccagact tcgctacagt tattactatg 780 gatagaaaag catccaaaca acaaacaaat atagatgtaa tatacgaacg agttcgtgat 840 gactaccaat tgcattggac ttcaacaaat tggaaaggta ccaatactaa agataaatgg 900 acagatcgtt cttcagaaag atataaaatc gattgggaaa aagaagaaat gacaaattaa 960 <210> 62 <211> 882 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Hla - Cloned DNA Sequence <400> 62 gcagattctg atattaatat taaaaccggt actacagata ttggaagcaa tactacagta 60 aaaacaggtg atttagtcac ttatgataaa gaaaatggca tgcacaaaaa agtattttat 120 agttttatcg atgataaaaa tcacaataaa aaactgctag ttattagaac gaaaggtacc 180 attgctggtc aatatagagt ttatagcgaa gaaggtgcta acaaaagtgg tttagcctgg 240 ccttcagcct ttaaggtaca gttgcaacta cctgataatg aagtagctca aatatctgat 300 tactatccaa gaaattcgat tgatacaaaa gagtatatga gtactttaac ttatggattc 360 aacggtaatg ttactggtga tgatacagga aaaattggcg gccttattgg tgcaaatgtt 420 tcgattggtc atacactgaa atatgttcaa cctgatttca aaacaatttt agagagccca 480 actgataaaa aagtaggctg gaaagtgata tttaacaata tggtgaatca aaattgggga 540 ccatatgata gagattcttg gaacccggta tatggcaatc aacttttcat gaaaactaga 600 aatggttcta tgaaagcagc agagaacttc cttgatccta acaaagcaag ttctctatta 660 tcttcagggt tttcaccaga cttcgctaca gttattacta tggatagaaa agcatccaaa 720 caacaaacaa atatagatgt aatatacgaa cgagttcgtg atgactacca attgcattgg 780 acttcaacaa attggaaagg taccaatact aaagataaat ggacagatcg ttcttcagaa 840 agatataaaa tcgattggga aaaagaagaa atgacaaatt aa 882 <210> 63 <211> 319 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 63 Met Lys Thr Arg Ile Val Ser Ser Val Thr Thr Thr Leu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Ser Ile Leu Met Asn Pro Val Ala Asn Ala Ala Asp Ser Asp Ile Asn 20 25 30 Ile Lys Thr Gly Thr Thr Asp Ile Gly Ser Asn Thr Thr Val Lys Thr 35 40 45 Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu Asn Gly Met His Lys Lys Val 50 55 60 Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp Lys Asn His Asn Lys Lys Leu Leu Val 65 70 75 80 Ile Arg Thr Lys Gly Thr Ile Ala Gly Gln Tyr Arg Val Tyr Ser Glu 85 90 95 Glu Gly Ala Asn Lys Ser Gly Leu Ala Trp Pro Ser Ala Phe Lys Val 100 105 110 Gln Leu Gln Leu Pro Asp Asn Glu Val Ala Gln Ile Ser Asp Tyr Tyr 115 120 125 Pro Arg Asn Ser Ile Asp Thr Lys Glu Tyr Met Ser Thr Leu Thr Tyr 130 135 140 Gly Phe Asn Gly Asn Val Thr Gly Asp Asp Thr Gly Lys Ile Gly Gly 145 150 155 160 Leu 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gttgcaaaac caacaactgc ttcatcaaaa 1680 acaacaaaag atgttgttca aacttcagca ggttctagcg aagcaaaaga tagtgctcca 1740 ttacaaaaag caaacattaa aaacacaaat gatggacaca ctcaaagcca aaacaataaa 1800 aatacacaag aaaataaagc aaaatcatta ccacaaactg gtgaagaatc aaataaagat 1860 atgacattac cattaatggc attactagct ttaagtagca tcgttgcatt cgtattacct 1920 agaaaacgta aaaactaa 1938 <210> 70 <211> 1818 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> IsdB - Cloned DNA Sequence <400> 70 gcagctgaag aaacaggtgg tacaaataca gaagcacaac caaaaactga agcagttgca 60 agtccaacaa caacatctga aaaagctcca gaaactaaac cagtagctaa tgctgtctca 120 gtatctaata aagaagttga ggcccctact tctgaaacaa aagaagctaa agaagttaaa 180 gaagttaaag cccctaagga aacaaaagca gttaaaccag cagcaaaagc cactaacaat 240 acatatccta ttttgaatca ggaacttaga gaagcgatta aaaaccctgc aataaaagat 300 aaagatcata gcgcaccaaa ctctcgtcca attgattttg aaatgaaaaa agaaaatggt 360 gagcaacaat tttatcatta tgccagctct gttaaacctg ctagagttat tttcactgat 420 tcaaaaccag aaattgaatt aggattacaa tcaggtcaat tttggagaaa atttgaagtt 480 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caacaccatc acctgttgaa aaagaatcac aaaaacaaga cagccaaaaa 1380 gatgacaata aacaattacc aagtgttgaa aaagaaaatg acgcatctag tgagtcaggt 1440 aaagacaaaa cgcctgctac aaaaccaact aaaggtgaag tagaatcaag tagtacaact 1500 ccaactaagg tagtatctac gactcaaaat gttgcaaaac caacaactgc ttcatcaaaa 1560 acaacaaaag atgttgttca aacttcagca ggttctagcg aagcaaaaga tagtgctcca 1620 ttacaaaaag caaacattaa aaacacaaat gatggacaca ctcaaagcca aaacaataaa 1680 aatacacaag aaaataaagc aaaatcatta ccacaaactg gtgaagaatc aaataaagat 1740 atgacattac cattaatggc attactagct ttaagtagca tcgttgcatt cgtattacct 1800 agaaaacgta aaaactaa 1818 <210> 71 <211> 645 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 71 Met Asn Lys Gln Gln Lys Glu Phe Lys Ser Phe Tyr Ser Ile Arg Lys 1 5 10 15 Ser Ser Leu Gly Val Ala Ser Val Ala Ile Ser Thr Leu Leu Leu Leu 20 25 30 Met Ser Asn Gly Glu Ala Gln Ala Ala Ala Glu Glu Thr Gly Gly Thr 35 40 45 Asn Thr Glu Ala Gln Pro Lys Thr Glu Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr 50 55 60 Thr Ser Glu Lys Ala Pro Glu Thr Lys Pro Val Ala Asn Ala Val 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ctatgtatgg gaagatacaa ataaaaacgg tgttcaagat 2760 aaagatgaaa agggtatttc aggtgtaaca gttacgttaa aagatgaaaa cgacaaagtt 2820 ttaaaaacag ttacaacaga tgaaaatggt aaatatcaat tcactgattt aaacaatgga 2880 acttataaag ttgaattcga gacaccatca ggttatacac caacttcagt aacttctgga 2940 aatgatactg aaaaagattc taatggttta acaacaacag gtgtcattaa agatgcagat 3000 aacatgacat tagacagtgg tttctataaa acaccaaaat atagtttagg tgattatgtt 3060 tggtacgaca gtaataaaga cggcaaacaa gattcaactg aaaaaggtat caaagatgtt 3120 aaagttattt tattaaatga aaaaggcgaa gtaattggaa caactaaaac agatgaaaat 3180 ggtaaatacc gctttgataa tttagatagc ggtaaataca aagttatttt tgaaaagcct 3240 actggcttaa cacaaacagg tacaaataca actgaagatg ataaagatgc cgatggtggc 3300 gaagttgatg taacaattac ggatcatgat gatttcacac ttgataatgg ctactacgaa 3360 gaagaaacat cagatagcga ctcagattcg gacagcgatt cagactcaga cagcgattca 3420 gactcagata gtgattcaga ttcagatagt gattcagatt cagatagtga ttcagattca 3480 gacagcgact cagactcaga tagtgactca gactcagata gcgattcaga ttcagatagc 3540 gattcagact cagacagcga 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ttcctgaaca acctgatgag cctggtgaaa ttgaaccaat tccagaggat 1560 tcagattctg acccaggttc agattctggc agcgattcta attcagatag cggttcagat 1620 tctggcagtg attcttaa 1638 <210> 81 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> ClfA - Partial Cloned DNA Sequence <400> 81 ccgtatattg tagttgttaa tggccatatt gatcctgcta gtacaggtga tttagcacta 60 cgttcgacat tttatggtta tgattctaat tttatatgga gatctatgtc atgggacaac 120 gaagtagcat ttaataacgg atcaggttct ggtgacggta tcgataaacc agttgttcct 180 gaacaacctg atgagcctgg tgaaattgaa ccaattccag aggattcaga ttctgaccca 240 ggttcagatt ctggcagcga ttctaattca gatagcggtt cagattctgg cagtgattct 300 acatcagata gtggttcaga ttcagcgagt gattcagatt cagcaagtga ttcagactca 360 gcgagtgatt cagattcagc aagtgattca gattcagcaa gtgattcaga ttcagcaagt 420 gattcagact cagcaagtga ttcagattca gcaagtgatt cagattcagc aagcgattca 480 gattcagcga gcgattcaga ttcagcgagc gattcagatt cagcgagtga ttccgactca 540 gcgagcgatt cagactcaga tagtgactca gattccgata gcgattccga ctcagatagc 600 gactcagatt cagacagcga ttctgactca 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Val Ala Ser Val Leu Val Gly Thr Leu Ile Gly Phe Gly Leu Leu 20 25 30 Ser Ser Lys Glu Ala Asp Ala Ser Glu Asn Ser Val Thr Gln Ser Asp 35 40 45 Ser Ala Ser Asn Glu Ser Lys Ser Asn Asp Ser Ser Ser Val Ser Ala 50 55 60 Ala Pro Lys Thr Asp Asp Thr Asn Val Ser Asp Thr Lys Thr Ser Ser 65 70 75 80 Asn Thr Asn Asn Gly Glu Thr Ser Val Ala Gln Asn Pro Ala Gln Gln 85 90 95 Glu Thr Thr Gln Ser Ser Ser Thr Asn Ala Thr Thr Glu Glu Thr Pro 100 105 110 Val Thr Gly Glu Ala Thr Thr Thr Thr Thr Asn Gln Ala Asn Thr Pro 115 120 125 Ala Thr Thr Gln Ser Ser Asn Thr Asn Ala Glu Glu Leu Val Asn Gln 130 135 140 Thr Ser Asn Glu Thr Thr Ser Asn Asp Thr Asn Thr Val Ser Ser Val 145 150 155 160 Asn Ser Pro Gln Asn Ser Thr Asn Ala Glu Asn Val Ser Thr Thr Gln 165 170 175 Asp Thr Ser Thr Glu Ala Thr Pro Ser Asn Asn Glu Ser Ala Pro Gln 180 185 190 Asn Thr Asp Ala Ser Asn Lys Asp Val Val Ser Gln Ala Val Asn Pro 195 200 205 Ser Thr Pro Arg Met Arg Ala Phe Ser Leu Ala Ala Val Ala Ala Asp 210 215 220 Ala Pro Ala Ala Gly Thr 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Asp Asn Ala Asn Asp Leu Ser Glu Ser Tyr 435 440 445 Tyr Val Asn Pro Ser Asp Phe Glu Asp Val Thr Asn Gln Val Arg Ile 450 455 460 Ser Phe Pro Asn Ala Asn Gln Tyr Lys Val Glu Phe Pro Thr Asp Asp 465 470 475 480 Asp Gln Ile Thr Thr Pro Tyr Ile Val Val Val Asn Gly His Ile Asp 485 490 495 Pro Ala Ser Thr Gly Asp Leu Ala Leu Arg Ser Thr Phe Tyr Gly Tyr 500 505 510 Asp Ser Asn Phe Ile Trp Arg Ser Met Ser Trp Asp Asn Glu Val Ala 515 520 525 Phe Asn Asn Gly Ser Gly Ser Gly Asp Gly Ile Asp Lys Pro Val Val 530 535 540 Pro Glu Gln Pro Asp Glu Pro Gly Glu Ile Glu Pro Ile Pro Glu Asp 545 550 555 560 Ser Asp Ser Asp Pro Gly Ser Asp Ser Gly Ser Asp Ser Asn Ser Asp 565 570 575 Ser Gly Ser Asp Ser Gly Ser Asp Ser Thr Ser Asp Ser Gly Ser Asp 580 585 590 Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Ala Ser Asp 595 600 605 Ser Asp Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Ala 610 615 620 Ser Asp Ser Asp Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Ala Ser Asp Ser Asp 625 630 635 640 Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Ala Ser Asp 645 650 655 Ser Asp Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Asp 660 665 670 Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp 675 680 685 Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp 690 695 700 Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp 705 710 715 720 Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp 725 730 735 Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp 740 745 750 Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Ala 755 760 765 Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Glu Ser Asp Ser Asp Ser Asp 770 775 780 Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp 785 790 795 800 Ser Glu Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Glu Ser Asp 805 810 815 Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Ala Ser Asp Ser Asp 820 825 830 Ser Gly Ser Asp Ser Asp Ser Ser Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Thr 835 840 845 Ser Asp Thr Gly Ser Asp Asn Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asn Ser Asp 850 855 860 Ser Glu Ser Gly Ser Asn Asn Asn Val Val Pro Pro Asn Ser Pro Lys 865 870 875 880 Asn Gly Thr Asn Ala Ser Asn Lys Asn Glu Ala Lys Asp Ser Lys Glu 885 890 895 Pro Leu Pro Asp Thr Gly Ser Glu Asp Glu Ala Asn Thr Ser Leu Ile 900 905 910 Trp Gly Leu Leu Ala Ser Leu Gly Ser Leu Leu Leu Phe Arg Arg Lys 915 920 925 Lys Glu Asn Lys Asp Lys Lys 930 935 <210> 83 <211> 545 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> ClfA -Partial cloned peptide sequence <400> 83 Glu Asn Ser Val Thr Gln Ser Asp Ser Ala Ser Asn Glu Ser Lys Ser 1 5 10 15 Asn Asp Ser Ser Ser Val Ser Ala Ala Pro Lys Thr Asp Asp Thr Asn 20 25 30 Val Ser Asp Thr Lys Thr Ser Ser Asn Thr Asn Asn Gly Glu Thr Ser 35 40 45 Val Ala Gln Asn Pro Ala Gln Gln Glu Thr Thr Gln Ser Ser Ser Thr 50 55 60 Asn Ala Thr Thr Glu Glu Thr Pro Val Thr Gly Glu Ala Thr Thr Thr 65 70 75 80 Thr Thr Asn Gln Ala Asn Thr Pro Ala Thr Thr Gln Ser Ser Asn Thr 85 90 95 Asn Ala Glu Glu Leu Val Asn Gln Thr Ser Asn Glu Thr Thr Ser Asn 100 105 110 Asp Thr Asn Thr Val Ser Ser Val Asn Ser Pro Gln Asn Ser Thr Asn 115 120 125 Ala Glu Asn Val Ser Thr Thr Gln Asp Thr Ser Thr Glu Ala Thr Pro 130 135 140 Ser Asn Asn Glu Ser Ala Pro Gln Asn Thr Asp Ala Ser Asn Lys Asp 145 150 155 160 Val Val Ser Gln Ala Val Asn Pro Ser Thr Pro Arg Met Arg Ala Phe 165 170 175 Ser Leu Ala Ala Val Ala Ala Asp Ala Pro Ala Ala Gly Thr Asp Ile 180 185 190 Thr Asn Gln Leu Thr Asp Val Lys Val Thr Ile Asp Ser Gly Thr Thr 195 200 205 Val Tyr Pro His Gln Ala Gly Tyr Val Lys Leu Asn Tyr Gly Phe Ser 210 215 220 Val Pro Asn Ser Ala Val Lys Gly Asp Thr Phe Lys Ile Thr Val Pro 225 230 235 240 Lys Glu Leu Asn Leu Asn Gly Val Thr Ser Thr Ala Lys Val Pro Pro 245 250 255 Ile Met Ala Gly Asp Gln Val Leu Ala Asn Gly Val Ile Asp Ser Asp 260 265 270 Gly Asn Val Ile Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Val Asp Asn Lys Glu Asn 275 280 285 Val Thr Ala Asn Ile Thr Met Pro Ala Tyr Ile Asp Pro Glu Asn Val 290 295 300 Thr Lys Thr Gly Asn Val Thr Leu Thr Thr Gly Ile Gly Thr Asn Thr 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515 520 525 Ser Gly Ser Asp Ser Asn Ser Asp Ser Gly Ser Asp Ser Gly Ser Asp 530 535 540 Ser 545 <210> 84 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> ClfA -Partial cloned peptide sequence <400> 84 Pro Tyr Ile Val Val Val Asn Gly His Ile Asp Pro Ala Ser Thr Gly 1 5 10 15 Asp Leu Ala Leu Arg Ser Thr Phe Tyr Gly Tyr Asp Ser Asn Phe Ile 20 25 30 Trp Arg Ser Met Ser Trp Asp Asn Glu Val Ala Phe Asn Asn Gly Ser 35 40 45 Gly Ser Gly Asp Gly Ile Asp Lys Pro Val Val Pro Glu Gln Pro Asp 50 55 60 Glu Pro Gly Glu Ile Glu Pro Ile Pro Glu Asp Ser Asp Ser Asp Pro 65 70 75 80 Gly Ser Asp Ser Gly Ser Asp Ser Asn Ser Asp Ser Gly Ser Asp Ser 85 90 95 Gly Ser Asp Ser Thr Ser Asp Ser Gly Ser Asp Ser Ala Ser Asp Ser 100 105 110 Asp Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Ala Ser 115 120 125 Asp Ser Asp Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser 130 135 140 Ala Ser Asp Ser Asp Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Ala Ser Asp Ser 145 150 155 160 Asp Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Ala Ser 165 170 175 Asp Ser Asp Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser 180 185 190 Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser 195 200 205 Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser 210 215 220 Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser 225 230 235 240 Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser 245 250 255 Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser 260 265 270 Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser 275 280 285 Asp Ser Asp Ser Glu Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser 290 295 300 Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Glu Ser Asp Ser 305 310 315 320 Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Glu Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser 325 330 335 Asp Ser Asp Ser Asp Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Gly Ser Asp Ser 340 345 350 Asp Ser Ser Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Thr Ser Asp Thr Gly Ser 355 360 365 Asp Asn Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asn Ser Asp Ser Glu Ser Gly Ser 370 375 380 Asn Asn Asn Val Val Pro Pro Asn Ser Pro Lys Asn Gly Thr Asn Ala 385 390 395 400 Ser Asn Lys Asn Glu Ala Lys Asp Ser Lys Glu Pro Leu Pro Asp Thr 405 410 415 Gly Ser Glu Asp Glu Ala Asn Thr Ser Leu Ile Trp Gly Leu Leu Ala 420 425 430 Ser Leu Gly Ser Leu Leu Leu Phe Arg Arg Lys Lys Glu Asn Lys Asp 435 440 445 Lys Lys 450 <210> 85 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GFP - Cloned DNA sequence <400> 85 atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60 gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120 aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 180 gtcactactt tctcttatgg tgttcaatgc ttttcccgtt atccggatca tatgaaacgg 240 catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaacgcac tatatctttc 300 aaagatgacg ggaactacaa gacgcgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360 aatcgtatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct cggacacaaa 420 ctcgagtaca actataactc acacaatgta tacatcacgg cagacaaaca aaagaatgga 480 atcaaagcta acttcaaaat tcgccacaac attgaagatg gatccgttca actagcagac 540 cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600 ctgtcgacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agcgtgacca catggtcctt 660 cttgagtttg taactgctgc tgggattaca catggcatgg atgagctcta caaataa 717 <210> 86 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> GFP - Cloned peptide sequence <400> 86 Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val 1 5 10 15 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu 20 25 30 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys 35 40 45 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe 50 55 60 Ser Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg 65 70 75 80 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 85 90 95 Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val 100 105 110 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile 115 120 125 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn 130 135 140 Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly 145 150 155 160 Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val 165 170 175 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 180 185 190 Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser 195 200 205 Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val 210 215 220 Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235

Claims (14)

  1. 적어도 하나의 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 항원을 포함하는 면역원성 조성물(immunogenic composition)으로서,
    상기 항원은 서열번호 8의 SdrH-유사 폴리펩티드, 서열번호 4의 Nuc, 또는 서열번호 12의 LukG와 적어도 80%의 동일성(identity)을 갖는 폴리펩티드인, 면역원성 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 8의 SdrH-유사 폴리펩티드와 적어도 80%의 동일성을 갖는 항원 및 서열번호 12의 LukG와 적어도 80%의 동일성을 갖는 항원을 포함하는, 면역원성 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물이 2개 이상의 상기 에스. 아우레우스 항원을 별개의 폴리펩티드의 형태 또는 하나 이상의 융합 폴리펩티드의 형태, 또는 별개의 폴리펩티드(들)와 융합 폴리펩티드(들) 둘 다의 형태로 포함하는, 면역원성 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 에스. 아우레우스(S. aureus)에 의해 유발되는 질환에 대한 보호를 부여하는 백신으로서 사용하기 위한, 면역원성 조성물.
  6. 제1항에 정의된 적어도 하나의 항원에 선택적으로 결합하는 폴리클로날 항체(polyclonal antibody)를 포함하는 면역요법 조성물(immunotherapeutic compostion)로서,
    상기 항체가 식세포에 의한 에스. 아우레우스의 흡수 및 사멸을 촉진하는, 면역요법 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는, 면역요법 조성물.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 대상체에서 에스. 아우레우스에 의해 유발된 질환에 대한 보호를 부여하는 수동 면역요법으로서 사용하기 위한, 면역요법 조성물.
  9. 제5항 또는 제8항에 있어서, 상기 에스. 아우레우스가 메티실린 내성 에스. 아우레우스(MRSA) 또는 메티실린-감수성 에스. 아우레우스(MSSA)인, 면역원성 또는 면역요법 조성물.
  10. 제5항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 골관절 장치(osteoarticular device), 바람직하게는 골관절 임플란트, 보다 바람직하게는 전체 관절 대체 보철물을 갖는, 면역원성 또는 면역요법 조성물.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 에스. 아우레우스 감염에 대해 효과적인 하나 이상의 항생물질과 조합하여 사용하기 위한, 면역원성 또는 면역요법 조성물.
  12. 대상체에서 에스. 아우레우스에 의해 유발된 질환에 대한 보호를 부여하는 항원을 동정(identifying)하는 시험관내 방법으로서,
    a) 에스. 아우레우스를 포함하는 용액을 에스. 아우레우스 항원에 대해 생성된 항체를 포함하는 용액과 함께, 바람직하게는 35℃에서 1시간 동안 인큐베이팅(incubating)하여, 혼합 현탁액을 수득하는 단계,
    b) 마크로파지(macrophage)를 단계 a)의 혼합 현탁액과 접촉시키는 단계,
    c) 마크로파지로부터 혼합 현탁액을 제거하고, 항생물질이 보충된 신선한 배지를 첨가하여 세포외 에스. 아우레우스 세균을 사멸시키는 단계, 및
    d) 상기 마크로파지에 의한 에스. 아우레우스 세균의 내재화(internalization) 및 사멸을 평가하는 단계로서, 상기 항원이 에스. 아우레우스의 내재화의 증가 및 사멸 둘 다를 유도하는 경우에, 상기 항원은 에스. 아우레우스에 의해 유발된 질환에 대한 보호를 부여하는 것으로 간주되는, 단계
    를 포함하는, 시험관내 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 마크로파지가 불멸화(immortalized) 마크로파지 세포주, 바람직하게는 J774.2 세포주인, 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 단계 d)에서 에스. 아우레우스 세균의 사멸이, 단계 c)의 3시간 후에 마크로파지에 내재화된 세균의 양을 단계 c)의 6시간 후에 마크로파지에 내재화된 세균의 양과 비교함으로써 평가되는, 방법.
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