EA013225B1 - Способ получения линии клеток, продуцирующей рекомбинантный поликлональный белок, способ получения поликлонального белка, линия клеток, продуцирующая рекомбинантный поликлональный белок, библиотека векторов, популяция клеток - Google Patents

Способ получения линии клеток, продуцирующей рекомбинантный поликлональный белок, способ получения поликлонального белка, линия клеток, продуцирующая рекомбинантный поликлональный белок, библиотека векторов, популяция клеток Download PDF

Info

Publication number
EA013225B1
EA013225B1 EA200501101A EA200501101A EA013225B1 EA 013225 B1 EA013225 B1 EA 013225B1 EA 200501101 A EA200501101 A EA 200501101A EA 200501101 A EA200501101 A EA 200501101A EA 013225 B1 EA013225 B1 EA 013225B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cells
nucleic acid
polyclonal
library
cell
Prior art date
Application number
EA200501101A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200501101A1 (ru
Inventor
Джон С. Хаурум
Финн К. Виберг
Винсент В. Колье
Жаклин Шарон
Чиоу-Ин Ян
Original Assignee
Симфоген А/С
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Симфоген А/С filed Critical Симфоген А/С
Publication of EA200501101A1 publication Critical patent/EA200501101A1/ru
Publication of EA013225B1 publication Critical patent/EA013225B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)

Abstract

Изобретение относится к способу производства композиции рекомбинантного поликлонального белка, в особенности композиции рекомбинантного поликлонального антитела. Способ предусматривает получение коллекции клеток, трансфицированных библиотекой вариантных последовательностей нуклеиновой кислоты, где каждая клетка в коллекции трансфицирована и способна к экспрессии одного элемента библиотеки, который кодирует определенный элемент поликлонального белка, который связывает специфический антиген и который расположен на том же отдельном сайте в геноме отдельных клеток в указанной коллекции, в котором указанная последовательность нуклеиновой кислоты в природе не связана с указанной клеткой в коллекции. Клетки культивируют при подходящих условиях для экспрессии поликлонального белка, который получают из супернатанта культуры или клеток. Последовательность нуклеиновой кислоты вводят в клетки посредством трансфекции библиотекой векторов для сайт-специфичной интеграции. Настоящий способ подходит для производства рекомбинантных поликлональных антител, что, таким образом, делает возможной описанную выше замену полученных из плазмы терапевтических продуктов иммуноглобулина.

Description

Настоящее изобретение образует основание технологической платформы для получения рекомбинантных поликлональных белков, таких как белки из надсемейства иммуноглобулинов, например растворимые или мембраносвязанные формы В- и Т-клеточных рецепторов, для применения в качестве нового класса лекарственных средств для лечения, облегчения состояния или профилактики различных инфекций, воспалительных заболеваний, отторжения трансплантатов, злокачественных опухолей и аллергий.
Уровень техники изобретения
Для множества инфекционных заболеваний и злокачественных опухолей отсутствует эффективная терапия. Моноклональные антитела, как правило, безуспешно использовались против этих мишеней, частично из-за вариабельности сложных мишеней и адаптивных мутаций белков-мишеней, что вызывает иммунный уход от узнавания моноклональным антителом. С другой стороны, поликлональные антитела способны нацеливаться на множество динамических мишеней, например на вирусы или раковые клетки. Кроме того, поликлональные антитела обладают самой высокой вероятностью поддержания активности в случае антигенной мутации.
Существуют различные коммерчески доступные терапевтические средства с поликлональными антителами, включая: 1) нормальный иммуноглобулин человека, выделенный из крови нормальных доноров людей; 2) гипериммунный иммуноглобулин человека, полученный из крови отдельных доноров людей, несущих антитела против специфической мишени заболевания, например, вируса, с которым они предварительно вступили в контакт либо путем заражения, либо через прививку; и 3) гипериммунный иммуноглобулин животного, полученный из крови иммунизированных животных.
Иммуноглобулин, выделенный из человеческой крови, на практике оказался эффективным против заражений вирусом гепатита В, респираторно-синцитиального вируса, цитомегаловируса и других вирусов герпеса, вируса бешенства, ботулинического токсина, и т.д., так же как в профилактике резус Ό новорожденных. Иммуноглобулин, выделенный из крови кроликов, иммунизированных человеческими Тклетками, используется для обеспечения Т-клеточной иммуносупрессии при лечении или профилактике отторжения трансплантата (например, Тимоглобулин). Нормальный иммуноглобулин человека использовали для поддержания иммунной системы иммунодефицитных пациентов, так же как в терапии различных аутоиммунных нарушений.
Однако широкое распространение использования иммуноглобулина было ограничено из-за вынужденной поставки сырого материала донорской крови, проблем с изменчивостью от партии к партии и непостоянной безопасности. В частности, иммуноглобулины, полученные из животных, встречают те же проблемы иммуногенности, которые наблюдались для полученных из животных моноклональных антител в 1980 и 1990-ых.
Наконец, как и в случае с другими продуктами крови, остается риск передачи возбудителей инфекции, таких как ВИЧ, вирусы герпеса или гепатита или прионы. Соответственно, в то время как клинические врачи признают, что поликлональные антитела являются предпочтительным терапевтическим средством в некоторых ситуациях, их использование было очень ограничено.
Новые подходы к производству иммуноглобулинов человека возникли с методиками трансгенных животных. Были получены трансгенные мыши, несущие человеческие локусы иммуноглобулина (патент США № 6111166). Эти мыши производят полностью человеческие иммуноглобулины, и антитела против определенной мишени могут быть стимулированы обычными методиками иммунизации. Однако большие выработки антитела ограничены из-за относительно небольшого размера мышей. Более крупных животных также сделали трансгенными посредством генов иммуноглобулина человека, например коров, овец, кроликов и кур (Кигопта. Υ. и др. №11игс Вю1есйио1оду; 2002; 20: 889-893). Однако получение поликлональных антител для терапии из крови таких животных не лишено трудностей. Во-первых, иммунофизиология животного и людей может демонстрировать значительные различия, что становится причиной различия в конечном иммунном репертуаре функциональной реаранжировке и многообразия гуморального ответа. Во-вторых, митотическая неустойчивость введенных локусов иммуноглобулина может повлиять на длительную продукцию антител. В-третьих, технически сложно удалить собственные локусы иммуноглобулина животного так, чтобы, например, продукция антитела животного не превысила продукцию антитела человека. В-четвертых, введение антител человека, продуцированных животными, сопровождается риском передачи возбудителей инфекции, таких как вирусы, прионы или другие патогены.
Соответственно, есть потребность в промышленных технологиях для производства рекомбинантных поликлональных белков, таких как антитела, в достаточно больших количествах и с минимальной изменчивостью от партии к партии для безопасных клинических применений. Для производства различных белков, включая моноклональные антитела, интерлейкины, интерфероны, фактор некроза опухоли, факторы свертывания крови VII, VIII и IX, были разработаны эффективные способы производства гомогенных рекомбинантных белков, использующие линии экспрессии клеток эукариот (в частности, млекопитающих). Многие из этих методик основаны на трансфекции и случайной интеграции представляющего интерес гена в геном клеточной линии экспрессии, с последующим отбором, амплификацией и харак- 1 013225 теризацией высокопроизводительного клона для экспрессии и размножения этого клона как основной клеточной линии экспрессии.
Экспрессия встроенного чужеродного гена может оказаться под влиянием эффектов положения со стороны окружения геномной ДНК. Во многих случаях ген встраивается в сайты, где эффекты положения достаточно сильны, чтобы ингибировать синтез продукта введенного гена. Кроме того, экспрессия часто нестабильна из-за механизмов сайленсинга (то есть метилирования), прикладываемых со стороны окружающей хромосомной ДНК хозяина.
Для экспрессии гомогенной рекомбинантной белковой композиции были разработаны системы, обеспечивающие интеграцию и экспрессию представляющего интерес гена в клетках млекопитающего в определенном геномном положении (патент США, №№ 4959317 и 5654182; νθ 98/41645; νθ 01/07572). В νϋ 98/41645 описывается сайт-специфичная интеграция для производства линии клеток млекопитающего, которая секретирует, например, антитело. Однако эта экспрессия является моноклональной и нет никакого указания на то, что трансфекции могли быть осуществлены библиотекой векторов. И причем никак не предлагается поддерживать первоначальное многообразие, произведенное определенной комбинацией Ун-Уь в библиотеке.
Раскрытие вклада
Настоящее изобретение относится к решениям для получения продуцирующей линий клеток для экспрессии и продукции рекомбинантного поликлонального белка, при исключении значительного отклонения среди отдельных представителей, составляющих поликлональный белок.
Сверх того, настоящее изобретение не использует животных в производстве поликлонального белка, таким образом, устраняются этические и клинические трудности, связанные с такими подходами.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к способам получения рекомбинантной поликлональной продуцирующей линии клеток для производства рекомбинантного поликлонального белка, обычно выбираемого из надсемейства иммуноглобулинов. В особенности представляет интерес производство поликлональных антител, поликлональных Т-клеточных рецепторов или их поликлональных фрагментов. Настоящее изобретение предусматривает коммерческое производство рекомбинантного поликлонального белка для использования в фармацевтических композициях. Одна важная особенность изобретения заключается в том, что в ходе производственного процесса отклонение экспрессии отдельных молекул, составляющих поликлональный белок, сохраняется на незначительном уровне, сводя к минимуму нежелательную изменчивость от партии к партии.
Один аспект настоящего изобретения относится к способу производства представляющего интерес рекомбинантного поликлонального белка, в котором указанный поликлональный белок содержит (или состоит из) определенных представителей, которые связывают специфический антиген, причем указанный способ предусматривает: а) обеспечение коллекции клеток, содержащих библиотеку вариантных последовательностей нуклеиновой кислоты, где каждая из указанных последовательностей нуклеиновой кислоты кодирует определенный элемент указанных поликлональных белков и где каждая из указанных последовательностей нуклеиновой кислоты интегрирует в один и тот же единственный сайт генома каждой отдельной клетки в указанной коллекции клеток; Ь) культивирование указанной коллекции клеток при условиях, способствующих экспрессии указанного поликлонального белка; и с) выделение указанного экспрессированного поликлонального белка из клеточной культуры, фракции клеток или культуральной среды клетки.
Дальнейший аспект настоящего изобретения относится к способу производства коллекции клеток, подходящих в качестве рекомбинантной поликлональной продуцирующей линии клеток, причем указанный способ предусматривает: а) обеспечение библиотеки векторов, содержащей популяцию вариантных последовательностей нуклеиновой кислоты, в которой каждый из указанных векторов содержит 1) одну единственную копию определенной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей определенный элемент поликлонального белка, содержащего определенные элементы, которые связывают специфический антиген и 2) одну или более последовательностей узнавания рекомбиназы; Ь) введение указанной библиотеки векторов в линию клеток-хозяев, в которой геном каждой отдельной клетки указанной линии клетки-хозяина содержит последовательности узнавания рекомбиназы, соответствующие таковым из вектора, в отдельном специфичном сайте в его геноме; обеспечение наличия в указанных клетках одной или более рекомбиназ так, чтобы вариантные последовательности нуклеиновой кислоты стадии (а) сайт, специфичным образом интегрировали в клетки линии клеток-хозяев, где указанную одну или более рекомбиназу либо ί) экспрессируют указанные клетки, в которые ввели указанную последовательность нуклеиновой кислоты; ίί) эффективно кодируют векторы стадии (а); ίίί) обеспечивают посредством экспрессии от второго вектора; или ίν) предоставляют клетке в виде белка; и б) селекцию клеток, содержащих интегрированную копию из указанной библиотеки вариантных последовательностей нуклеиновой кислоты.
В обоих способах изобретения понимается, что поликлональный белок обычно представляет собой белок, который в природе не связан с клетками, в которых совершается экспрессия.
Настоящее изобретение описывает несколько способов, с помощью которых в линию клеток-хозяев
- 2 013225 можно ввести библиотеку вариантных последовательностей нуклеиновой кислоты, с тем чтобы получить коллекцию клеток, применимую в качестве поликлональной продуцирующей линии клеток. Эти способы включают полную трансфекцию коллекции клеток библиотекой, частичную трансфекцию определенных аликвот клеток фракциями библиотеки или индивидуальную трансфекцию, где клетки-хозяев трансфицируют отдельными элементами библиотеки, с последующим объединением клонов, произведенных при селекции. Предпочтительно настоящее изобретение в качестве линии клеток-хозяев использует клетки млекопитающего (линии клеток или типы клеток).
В одном аспекте настоящего изобретения отдельные элементы поликлонального белка кодируются парами независимых сегментов гена. Поликлональные белки, где отдельные элементы состоят из двух полипептидных цепей, включают растворимые или мембраносвязанные формы Т-клеточных рецепторов и антитела. В дальнейших воплощениях настоящего изобретения пара сегментов гена кодирует тяжелую цепь антитела и вариабельную область легкой цепи, или альфа-цепь Т-клеточного рецептора и вариабельную область бета-цепи, или гамма-цепь Т-клеточного рецептора и вариабельную область дельтацепи.
Настоящее изобретение дополнительно относится к рекомбинантной поликлональной продуцирующей линии клеток, содержащей коллекцию клеток, трансфицированных библиотекой вариантных последовательностей нуклеиновой кислоты, в котором каждая клетка в коллекции трансфицирована и способна экспрессировать один элемент библиотеки, который кодирует определенный элемент поликлонального белка, который связывает специфический антиген и который расположен на том же единственном сайте в геноме отдельных клеток в указанной коллекции, в котором указанная последовательность нуклеиновой кислоты в природе не связана с указанной клеткой в коллекции. Данная линия клеток предпочтительно имеет происхождение от линии клеток млекопитающего, таких как клетки яичника китайского хомяка (СНО), клетки СО8, клетки ВНК, клетки миеломы (например, клетки 8р2/0, N80), ΥΒ2/0, ΝΙΗ 3Т3, фибробласт или иммортализованные клетки человека, такие как клетки НеЬа, клетки НЕК 293, или РЕК..С6. Однако также можно использовать эукариотические клетки, отличные от клеток млекопитающего, или прокариотические клетки, такие как растительные клетки, клетки насекомого, дрожжевые клетки, бактерии, грибы и т. д.
Также настоящее изобретение охватывает библиотеку векторов для сайт-специфичной интеграции, содержащей популяцию встречающихся в природе вариантных последовательностей нуклеиновой кислоты, в которой каждый из указанных векторов содержит 1) одну копию определенной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей определенный элемент поликлонального белка, который связывает специфический антиген, и 2) одну или более последовательностей узнавания рекомбиназы.
В другом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента рекомбинантное поликлональное антитело (или его фрагмент) или поликлональный Т-клеточный рецептор (или его фрагмент), предпочтительно полученный способами в соответствии с настоящим изобретением. Рекомбинантный поликлональный белок композиции является специфическим или реагирующим на предварительно определенную мишень заболевания. Такие фармацевтические композиции могут использоваться для лечения, облегчения состояния или профилактики заболеваний, таких как злокачекственные опухоли, инфекции, воспалительные заболевания, аллергия, астма и другие респираторные заболевания, аутоиммунные заболевания, иммунологические дисфункции, сердечнососудистые заболевания, заболевания в центральной нервной системе, метаболические и эндокринные заболевания, отторжение трансплантата или нежелательная беременность у млекопитающего, такого как человек, домашнее животное или ручное животное.
Определения
Под белком или полипептидом следует понимать любую цепь аминокислот, независимо от длины или посттрансляционной модификации. Белки могут существовать как мономеры или мультимеры, содержащие собранные вместе две или более полипептидные цепи, фрагменты белков, полипептидов, олигопептидов или пептидов.
В используемом здесь смысле термин поликлональный белок или поликлональность относится к белковой композиции, содержащей различные, но гомологичные белковые молекулы, предпочтительно выбранные из надсемейства иммуноглобулинов. Таким образом, каждая белковая молекула является гомологичной по отношению к другим молекулам композиции, но также содержит один или более участков вариабельной полипептидной последовательности, которую/которые характеризуют различиями в аминокислотной последовательности между отдельными элементами поликлонального белка. Известные примеры таких поликлональных белков включают антитело или молекулы иммуноглобулина, Тклеточный рецептор и В-клеточный рецептор. Поликлональный белок может состоять из определенной субпопуляции белковых молекул, которую определили посредством общей особенности, такой как общая активность связывания с требуемой мишенью, например, в случае с поликлональным антителом, против требуемого антигена-мишени.
Термин представляющий интерес поликлональный белок охватывает определенную поликлональную белковую субпопуляцию, которая имеет общую особенность, такую как активность связывания с требуемой мишенью, например, в случае с поликлональными антителами, которые характеризуются
- 3 013225 активностью связывания или специфичностью против антигена-мишени, причем указанный антиген, например, может быть одним или более из отдельных белков, микроорганизмов, паразитов, типов клеток, аллергенов, или углеводных молекул, или любых других структур, молекул, или веществ, которые могут быть мишенью специфичного связывания антитела, или смесей указанных антигенов.
Термины один элемент рекомбинантной поликлональной белковой композиции или один элемент рекомбинантного поликлонального белка обозначают одну белковую молекулу белковой композиции, содержащей различные, но гомологичные белковые молекулы, где каждая белковая молекула является гомологичной по отношению к другим молекулам композиции, но также содержит один или более участок вариабельной полипептидной последовательности, которую/которые характеризуют различиями в аминокислотной последовательности между отдельными элементами поликлонального белка.
Термины вариабельная полипептидная последовательность и вариабельная область используются попеременно.
Термины определенный элемент рекомбинантного поликлонального белка обозначают одну белковую молекулу белковой композиции, содержащей различные, но гомологичные белковые молекулы, где каждая белковая молекула является гомологичной по отношению к другим молекулам композиции, но также содержит один или более участок вариабельной полипептидной последовательности, которую/которые характеризуют различиями в аминокислотной последовательности между отдельными элементами поликлонального белка.
Термин антитело описывает функциональный компонент сыворотки и часто используется для обозначения либо набора молекул (антител или иммуноглобулина), либо одной молекулы (молекулы антитела или молекулы иммуноглобулина). Молекула антитела способна к связыванию или реагированию со специфической антигенной детерминантой (антигеном или антигенным эпитопом), которая в свою очередь, может привести к индукции иммунологических эффекторных механизмов. Отдельную молекулу антитела обычно считают моноспецифичной, и композиция молекул антитела может быть моноклональной (то есть состоять из идентичных молекул антитела) или поликлональной (то есть состоять из различных молекул антитела, реагирующих с одними и теми же или с различными эпитопами на одном и том же антигене или даже на определенных различных антигенах). Каждая молекула антитела имеет уникальную структуру, которая обеспечивает специфичное связывание с соответствующим ей антигеном, и все природные молекулы антител имеют одну и ту же полную основную структуру из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей. Собирательно антитела также известны как иммуноглобулины. Также подразумевается, что термины антитело или антитела в используемом здесь смысле включают в себя химерные и одноцепочечные антитела, так же как и связывающие фрагменты антител, такие как фрагменты РаЬ, Ρν или фрагменты зсРу, а также мультимерные формы, такие как димерные молекулы 1дЛ или пятивалентный 1дМ.
Термин поликлональное антитело описывает композицию различных молекул антитела, которые способны связывать или реагировать с несколькими различными специфическими антигенными детерминантами на одном и том же или на различных антигенах. Обычно считается, что вариабельность поликлонального антитела размещена в так называемых вариабельных областях поликлонального антитела. Однако в контексте настоящего изобретения поликлональность можно также понимать для описания различия между отдельными молекулами антитела, находящимися в так называемых константных областях как, например, в случае со смесями антител, содержащими два или более изотипа антител, такие как изотипы человека 1дС1, 1дС2, 1дС3, 1дС4. 1дА1 и 1дА2, или изотипы мыши 1дС1, 1дС2а. 1дС2Ь, 1дС3, и 1дА.
Представляющее интерес рекомбинантное поликлональное антитело описывает определенную рекомбинантную поликлональную субпопуляцию антител, которую характеризуют способностью связываться с требуемой мишенью или требуемым набором мишеней, причем указанные мишени, например, представляют собой отдельный белок, микроорганизм, паразита, клетку, аллерген, углеводную молекулу, или другую структуру, молекулу, или вещество, которое может быть мишенью специфичного связывания антитела, или их смесей.
Термин иммуноглобулин обычно используют как коллективное обозначение смеси антител, найденных в крови или сыворотке, но может также использоваться для обозначения смеси антител, полученных из других источников.
Термин молекула иммуноглобулина обозначает отдельную молекулу антитела, например, являющуюся частью иммуноглобулина, или частью композиции поликлонального или моноклонального антитела.
При указании, что элемент поликлонального белка связывается с антигеном, подразумевается связывание, имеющее константу связывания меньше 1 мМ, предпочтительно меньше 100 нМ, еще более предпочтительно меньше 10 нМ.
Термин библиотека представляющих интерес вариантных молекул нуклеиновой кислоты используют для описания набора молекул нуклеиновой кислоты, которые вместе кодируют представляющий интерес рекомбинантный поликлональный белок. При использовании для трансфекции библиотека представляющих интерес вариантных молекул нуклеиновой кислоты содержится в библиотеке векторов
- 4 013225 экспрессии. Такая библиотека обычно имеет по меньшей мере 3, 5, 10, 20, 50, 1000, 104, 105 или 106 определенных элементов.
В используемом здесь смысле термины одна копия представляющей интерес определенной последовательности нуклеиновой кислоты не следует понимать буквально как отдельный участок нуклеиновых кислот, соответствующих отдельному сегменту гена, а скорее, как одну копию всех сегментов гена, необходимых для получения всех субъединиц одной молекулы представляющего интерес белка и собранных в одну молекулу нуклеиновой кислоты, такую как, например, вектор. Некоторые примеры, в которых, чтобы дать начало полной молекуле представляющего интерес белка, обычно требуется более чем один сегмент гена, включают В-клеточный рецептор, антитела и фрагменты антител, такие как РаЬ и вариабельные домены, или Т-клеточный рецептор. При введении в клетку сегменты гена, которые вместе кодируют полностью собранный представляющий интерес белок, находятся в одном и том же векторе, таким образом, оказываясь связанными в одной последовательности нуклеиновой кислоты, возможно, в виде отдельных элементов транскрипции под контролем различных промоторов.
Термин представляющий интерес ген в используемом здесь смысле относится к последовательности нуклеиновой кислоты, составленной из одного или более сегментов генов (геномных или кДНК), которые кодируют один элемент представляющего интерес белка. Форма множественного числа представляющие интерес гены относится к библиотеке последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих представляющий интерес поликлональный белок. Термин СО1 используется как сокращение для представляющего (представляющих) интерес гена (генов).
В используемом здесь смысле термин вектор относится к молекуле нуклеиновой кислоты, в которую может быть встроена последовательность нуклеиновой кислоты для переноса между различными генетическими окружениями и/или для экспрессии в клетке-хозяине. Вектор, способный к интегрированию в геном клетки-хозяина в заранее определенный специфический локус в геноме, в настоящем изобретении называют вектором для сайт-специфичной интеграции. Если вектор несет регуляторные элементы для транскрипции последовательности нуклеиновой кислоты, встроенной в вектор (по меньшей мере, подходящий промотор), такой вектор в настоящем изобретении называют экспрессирующим вектором. Если экспрессирующий вектор способен к интегрированию в заранее определенный, специфический локус в геноме клетки-хозяина, экспрессирующий вектор можно назвать экспрессирующим вектором для сайт-специфичной интеграции. Если последовательность нуклеиновой кислоты, встроенная в указанные выше идентифицированные векторы, кодирует представляющий интерес белок, определенный в настоящем изобретении, используются следующие термины: представляющий интерес вектор, представляющий интерес вектор для сайт-специфичной интеграции, представляющий интерес экспрессирующий вектор и представляющий интерес экспрессирующий вектор для сайт-специфичной интеграции. Термин вектор, кодирующий изотип относится к вектору, несущему последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие изотип антитела. В настоящей спецификации фагмидный вектор и фаговый вектор используется попеременно. Термины плазмида и вектор используются попеременно. Предполагается, что изобретение включает такие другие формы векторов, которые обслуживают эквивалентные функции, например плазмиды, фагмиды и вирусные геномы или любые молекулы нуклеиновой кислоты, способные к направлению выработки требуемого белка в подходящем хозяине.
Термин каждый элемент библиотеки представляющих интерес векторов используют для описания отдельных молекул вектора с определенной последовательностью нуклеиновой кислоты, полученной из библиотеки представляющих интерес векторов, где последовательность нуклеиновой кислоты кодирует один элемент представляющего интерес рекомбинантного поликлонального белка.
Термин массовый перенос используется для описания переноса представляющих интерес последовательностей нуклеиновой кислоты от одной популяции векторов к другой популяции векторов и выполнения этого для каждой ДНК одновременно, не прибегая к выделению отдельных представляющих интерес ДНК. Такие популяции векторов могут представлять собой библиотеки, содержащие, например, вариабельные области, промоторы, лидерные последовательности или представляющие интерес энхансерные элементы. Затем эти последовательности можно перенести без предварительного выделения, например, из фагового вектора в экспрессирующий вектор млекопитающего. В особенности для последовательностей антител эта методика гарантирует, что связь между многообразием Ун и Уъ не будет потеряна, при переносе библиотеки, например, из вектора для селекции (например, вектора фагового дисплея) в экспрессирующий вектор млекопитающего. Таким образом, сохраняется первоначальное соединение Ун и Уь.
Термин трансфекция здесь используется в широком смысле введения чужеродной ДНК в клетку. Также подразумевается, что данный термин охватывает другие рабочие эквивалентные способы для введения чужеродной ДНК в клетку, такие как, например, трансформация, заражение, трансдукция или слияние донорской клетки и акцепторной клетки.
Термин селекция используют для описания способа, в котором клетки приобрели определенное свойство, делающее возможным отделение от клеток, которые не приобрели это свойство. Такие свойства могут представлять собой устойчивость к цитотоксическому агенту или продукцию необходимого питательного вещества, фермент или цвет.
- 5 013225
Термины ген селектируемого маркера, ген маркера для селекции, ген селекции и маркерный ген используют для описания гена, кодирующего селектируемый маркер (например, ген, дающий устойчивость против некоторого цитотоксического препарата, такого как определенные антибиотики, ген, способный произвести необходимое питательное вещество, которое может быть изъято из среды для выращивания, ген, кодирующий фермент, продуцирующий поддающиеся анализу метаболиты, или ген кодирующий цветной белок, который, например, может быть отсортирован с помощью РАС8), который вводят в клетки совместно с представляющим интерес геном (генами).
Термин рекомбинантный белок используют для описания белка, который экспрессируется в линии клеток, трансфицированных экспрессирующим вектором, содержащим последовательность кодирования белка.
В используемом здесь смысле термин функционально связанный относится к сегменту, связанному с другим сегментом при переводе в функциональную зависимость с другим сегментом. Например, ДНК, кодирующая сигнальную последовательность, функционально связана с ДНК, кодирующей полипептид, если она экспрессируется как лидерная последовательность, которая участвует в переносе полипептида в эндоплазматический ретикулум. Кроме того, промотор или энхансер функционально связан с последовательностью кодирования, если он стимулирует транскрипцию последовательности.
Термин большинство отдельных клеток относится к процентному отношению клеток, такому как более чем 80%, предпочтительно более чем 85%, более предпочтительно 90, 95 или даже 99% или выше.
В используемом здесь смысле термин геном не следует понимать буквально как нормальную совокупность хромосом, присутствующих в клетке, но также и внехромосомные элементы, которые могут быть введены и поддерживаться в клетке. Такие внехромосомные элементы могут включать, без ограничений, минихромосомы, УАС (искусственные хромосомы дрожжей), МАС (искусственные хромосомы мыши) или НАС (искусственные хромосомы человека).
Термин промотор относится к области ДНК, участвующей в связывании РНК-полимеразы для инициирования транскрипции.
Термин промоторы голова-к-голове относится к паре промоторов, расположенных в непосредственной близости таким образом, что транскрипция двух генных фрагментов, управляемых промоторами, происходит в противоположных направлениях. Промотор голова-к-голове может также быть сконструирован со вставкой между этими двумя промоторами, составленной из сторонних нуклеиновых кислот. Такой фрагмент вставки вполне может содержать более 500 нуклеотидов.
Ген устойчивости к антибиотику представляет собой ген, кодирующий белок, который может компенсировать подавляющий или токсический эффект, который антибиотик оказывает на клетку, что гарантирует жизнеспособность и продленную пролиферацию клеток в присутствии антибиотика.
Термин сайт внутренней посадки рибосом или ΙΚΕ8 описывает структуру, отличную от нормальной 5' кэп-структуры на мРНК. Обе структуры могут узнаваться рибосомой для инициации поиска АИС кодона, для инициации трансляции. При использовании одной промоторной последовательности и двух инициирующих АИС первая и вторая полипептидные последовательности могут транслироваться с одной мРНК. Таким образом, чтобы обеспечить совместную трансляцию первой и второй полинуклеотидных последовательностей с одной двухцистронной мРНК, первую и вторую полинуклеотидные последовательности можно транскрипционно объединить посредством линкерной последовательности, содержащей последовательность ΙΚΕ8, которая обеспечивает трансляцию полинуклеотида последовательности ниже последовательности ΙΚΕ8. В этом случае, транскрибированная двуцистронная молекула РНК будет транслироваться как с защищенных 5'-концов, так и с внутренней последовательности ΙΚΕ8 двуцистронной молекулы РНК, чтобы таким образом получить как первый, так и второй полипептид.
Термин индуцибельная экспрессия используют для описания экспрессии, которая, для того, чтобы экспрессия имела место, требует взаимодействия молекулы-индуктора или выработки молекулыкорепрессора и регуляторного белка.
Термин конститутивная экспрессия относится к экспрессии, которая обычно не является индуцибельной.
Термин рекомбиназа относится к ферменту, который катализирует рекомбинацию между двумя или более сайтами рекомбинации. Рекомбиназы, применимые в настоящем изобретении, катализируют рекомбинацию на определенных сайтах рекомбинации, которые представляют собой специфические последовательности нуклеиновой кислоты, узнаваемые определенной рекомбиназой.
Термин конкуренция описывает ситуации, в которых отдельной клеткой экспрессируются два или более определенных элемента поликлонального белка, составленного из двух различных полипептидных цепей, например из надсемейства иммуноглобулинов. Эта ситуация может возникнуть, когда отдельная клетка интегрирует в геном более чем одну пару сегментов гена, где каждая пара сегментов гена кодирует определенный элемент поликлонального белка. В таких ситуациях могут возникнуть непредусмотренные комбинации полипептидных цепей, экспрессированных из сегментов гена. Эти непредусмотренные комбинации полипептидных цепей могут не обладать терапевтическим эффектом.
Термин конкуренция цепей Ун-Уь является примером конкуренции, определенной выше. В этом примере пару сегментов гена составляют сегменты Ун и Уь. Конкуренция происходит, когда непреду
- 6 013225 смотренные комбинации полипептидов Ун и Уь производит клетка, в которой две различных пары сегмента гена, кодирующего и Ун, интегрируют в одну и ту же клетку. Такая конкурирующая молекула антитела, по всей вероятности, не сохранит первоначальную специфичность и, таким образом, не может обладать терапевтическим эффектом.
Термин рекомбинантная поликлональная продуцирующая линия клеток относится к популяции клеток экспрессирующих белок, которые трансфицированы библиотекой вариантных представляющих интерес последовательностей нуклеиновой кислоты таким образом, что отдельные клетки, которые вместе составляют рекомбинантную поликлональную продуцирующую линию клеток, несут только одну копию определенной представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует один элемент представляющего интерес рекомбинантного поликлонального белка, причем каждая копия интегрирует в один и тот же сайт генома каждой клетки. Клетки, составляющие рекомбинантную поликлональную продуцирующую линию клеток, отбирают по их способности сохранять интегрированную копию определенной представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты, например посредством селекции антибиотиком. Клетки, которые могут составить такую продуцирующую линию клеток, могут, например, представлять собой бактерии, грибы, эукариотические клетки, такие как дрожжи, клетки насекомых или клетки млекопитающих, в особенности иммортализованные линии клеток млекопитающих, такие как клетки СНО, клетки СО8, клетки ВНК, клетки миеломы (например, клетки 8р2/О, N80). ΝΙΗ 3Т3, ΥΒ2/Ο и иммортализованные клетки человека, такие как клетки НеЬа, клетки НЕК 293 или РЕК.С6.
Термин горячая точка как в выражении линия клеток горячей точки относится к предустановленному локусу генома клетки, которую отобрали или произвели и характеризовали для высокоэффективной транскрипции представляющей интерес интегрированной последовательности нуклеиновой кислоты при интеграции вектора экспрессии в тот сайт.
Термин отклонение используют для обозначения феномена в ходе выработки рекомбинантного поликлонального белка, в котором композиция поликлонального вектора, поликлональной линии клеток, или поликлонального белка изменяется в течение времени из-за случайных генетических мутаций, различий в кинетике пролиферации между отдельными клетками, различий в уровнях экспрессии между различными сконструированными последовательностями экспрессии или различий в эффективности клонирования ДНК.
Термин КЕЬР относится к полиморфизму длины фрагмента рестрикции, способу, в соответствии с которым после расщепления ферментами рестрикции анализируют подвижную структуру геля фрагментов молекулы нуклеиновой кислоты.
Термин НЭ8 относится к способу сортировки высокой плотности, в котором множество отдельных молекул проверяют параллельно на мембранах таким образом, что одновременно на данную активность исследуют большое количество испытываемых соединений.
В используемом здесь смысле Тас.|Мап РСК относится к анализу РСК., основанному на системе ТацМап, описанной у Но11апб, Р. М. и др., Ргос. №11. Асаб. 8с1. И.8.А. 88: 7276-7280 (1991).
Термин 5' иТК относится к 5' нетранслируемой области мРНК.
Термин РГи РСК относится к реакции РСК, выполненной с применением ДНК полимеразы РГи (выделенной из Ругососсик Гигюзиз), которую используют, поскольку она имеет самую высокую точность среди известных теплоустойчивых полимераз.
Сокращения: СМУ = Цитомегаловирус (человека). М8Р8У = Миелопролиферативный Вирус Саркомы. АбМЬР = Главный поздний промотор Аденовируса. 8У40 поли А = сигнальная последовательность поли А Обезьяньего вируса 40. СЕР = Зеленые Флуоресцентные Белки. РУЭЕ = поливинилиден дифтор. ТСК = Т-клеточный рецептор. ЕБ18А = Твердофазный иммуноферментный анализ. ЬТК = Длинный концевой повтор.
Описание чертежей
Фиг. 1 - схематическое представление вектора экспрессии промотора голова-к-голове, содержащего следующие элементы: Атр рго = промотор, обеспечивающий экспрессию гена устойчивости к ампициллину. Атр = ген устойчивости к ампициллину. рИС опдш = начало репликации рИС. Сайты фермента рестрикции: №11 и ЕсоК1. Промотор А/Промотор В = кассета промотора голова-к-голове, включающего лидерные последовательности (например, СМУ/МР8У). V Тяж. = Последовательность, кодирующая вариабельную тяжелую цепь СО1. С Тяжелая цепь = Последовательности, кодирующие константную тяжелую цепь (например, последовательности для константной тяжелой цепи 1дС1 или 1дО2В мыши). К-В-д1оЬш рА = Последовательность поли А β-глобина кролика. БОН полиА = Последовательность поли А бычьего гормона роста. У Каппа = Последовательность, кодирующая вариабельную каппацепь СО1. С Каппа-цепь = Последовательность, кодирующая константную каппа-цепь. ЕКТ сайт = сайт рекомбинации ЕКТ. Гигромицин = ген устойчивости к гигромицину. 8У40 полиА = сигнальная последовательность поли А.
Фиг. 2 - схематическое представление вектора экспрессии для однонаправленной экспрессии, содержащего следующие элементы: Атр рго = промотор, обеспечивающий экспрессию гена устойчивости к ампициллину. Атр = ген устойчивости к ампициллину. рИС ог1= начало репликации рИС. Промотор А
- 7 013225 = промотор млекопитающего, включющего лидерные последовательности (например, АбМЬР). V Тяж. = Последовательность, кодирующая вариабельную тяжелую цепь ΟΘΙ. С Тяжелая цепь = Последовательности, кодирующие константную тяжелую цепь (например, последовательности для константной тяжелой цепи Ц01 мыши). Й0Н поли А = Последовательность поли А гормона роста человека. ЙОН полиА = Последовательность поли А бычьего гормона роста. V Каппа = Последовательность, кодирующая вариабельную каппа-цепь 00Ι. С Каппа = Последовательность, кодирующая константную каппа-цепь. ТЯТ = сайт рекомбинации ТЯТ. Гигромицин = ген устойчивости к гигромицину. §ν40 поли А = сигнальная последовательность поли А. Последовательности ЙОН поли А и промотора А можно заменить структурой 1ЯЕ8.
Фиг. 3 - схема последовательности выполнения операций, подчеркивающая получение рекомбинантной поликлональной продуцирующей линии клеток и производство рекомбинантного поликлонального белка. 1) Иллюстрирует методику полной трансфекции; 2) иллюстрирует методику частичной трансфекции и 3) иллюстрирует методику индивидуальной трансфекции. А) Иллюстрирует библиотеку векторов (горизонтальные линии), стрелки иллюстрируют группировку векторов. В методике 1 векторы сгруппированы в полном объеме, в методике 2 они сгруппированы в меньших фракциях (в частичном объеме), тогда как в методике 3 они остаются отдельными друг от друга (индивидуальными). В) Иллюстрирует трансфекцию, в которой число пробирок зависит от группы векторов, составляющих библиотеку. С) Иллюстрирует селекцию клеток, которые сайт-специфичным образом интегрировали 00Ι в геном клетки-хозяина, И) Иллюстрирует получение поликлонального запаса библиотеки 00Ι, где селектированные клетки, составляющие интегрированную библиотеку, сохраняют в морозильнике. Хранение отдельных клонов или объединение клонов не является обязательным. Е) Иллюстрирует начало фазы, в котором клоны из запаса размораживают (как по отдельности, так и из меньших фракций или из резерва) и адаптируют к росту в суспензии. Адаптацию к сывороточным свободным средам можно выполнять после стадии селекции или на этой стадии. Т) Иллюстрирует стадию в выработке, в которой поликлональную линию клеток выращивают для высевания в биореактор большего размера (промежуточные стадии отбора выступают в качестве опции, несмотря на то что не проиллюстрированы). В методике 2 и 3 представлена стадия, в которой запас клонов поликлональной клетки больше не сохраняют в виде отдельных клонов или частичных фракций, а объединяют в коллекцию клеток, образуя рекомбинантную поликлональную продуцирующую линию клеток. О) Иллюстрирует конечную выработку, полученную от производства биореактором. После фазы выработки поликлональную белковую композицию собирают для очистки и исследования продукта.
Фиг. 4 - схема последовательности выполнения операций, иллюстрирующая получение вектора экспрессии млекопитающего.
(А). Схематическое представление фагмидного вектора р8ушус10, который несет последовательность, кодирующую элемент 00Ι. Р 1ас и Р 1ас2 = бактериальная кассета промотора голова-к-голове. V каппа = последовательность, кодирующая вариабельную легкую каппа-цепь 00Ι. С Каппа-цепь = Последовательность, кодирующая легкую константную каппа-цепь мыши. V тяж. = Последовательность, кодирующая вариабельную тяжелую цепь 00Ι. С Тяжелая Цепь = Последовательность, кодирующая 0Н1 домен константной тяжелой цепи. Сайты ферментов рестрикции: ЕсоШ, ΝοΐΙ, 8ас! и ХйоТ срШ = фаговый белок ΙΙΙ. Атр рго = промотор, обеспечивающий экспрессию гена устойчивости к ампициллину. Атр = ген устойчивости к ампициллину. рИС 0τί= начало репликации рИС.
Стадия 1. Путем расщепления рестрикции посредством ЗаО и ΧΙιοΙ бактериальную кассету промотора можно вырезать из р8утус10 и путем лигирования, заменить на кассету промотора млекопитающего (В), которую также приготовили путем расщепления рестрикции посредством 8;·κΙ и ХйоТ (С) Схематическое представление фагмидного вектора, р8утус12, несущего последовательности из 00Ι, после обмена промоторами с кассетой промотора голова-к-голове млекопитающего. Промотор А/Промотор В = выбранная кассета промотора голова-к-голове (например, СМ^МРЗ^. V каппа = последовательность, кодирующая вариабельную легкую каппа-цепь 00Ι. С Каппа-цепь = Последовательность, кодирующая константную каппа-цепь мыши. V тяж. = последовательность, кодирующая вариабельную тяжелую цепь 00Ι. С тяжелая цепь = последовательность, кодирующая домен СН1 константной тяжелой цепи. Сайты ферментов рестрикции: №П, ЗасЕ ΧΙκιΙ и ЕсоЯЙ срШ = фаговый белок ΙΙΙ. Атр рго = промотор, обеспечивающий экспрессию гена устойчивости к ампициллину. Атр = ген устойчивости к ампициллину. рИС 0τί= начало репликации рИС.
Стадия 2. Путем расщепления рестрикции р8утус12 посредством ЕсοЯI и фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий все из: каппа, кассеты промотора и V тяж., можно вырезать из р8утус12 и лигировать в вектор, кодирующий изотип, например, р8утус20, который был также приготовлен путем расщепления рестрикции посредством ЕсοЯI и №П, получая, таким образом, экспрессирующий вектор млекопитающего р8утус21 (Е).
(Е) Схематическое представление вектора экспрессии млекопитающего, р8утус21, с вариабельными тяжелой и каппа- областями из 00Ι, для экспрессии антитела. Этот экспрессирующий вектор млекопитающего содержит следующие элементы: Атр рго = промотор, обеспечивающий экспрессию гена устойчивости к ампициллину. Атр = ген устойчивости к ампициллину. рИС 0τί= начало репликации рИС.
- 8 013225
Сайты ферментов рестрикции: ΝοΐΙ и ЕсоВЕ Промотор А/Промотор В = выбранная кассета промотора голова-к-голове (например, СМУ/МР8У). V каппа = V каппа-последовательность, кодирующая переменную легкую каппа-цепь ΟΘΙ. С Каппа-цепь = последовательность, кодирующая константную легкую каппа-цепь млекопитающего (например, константную каппа-цепь мыши). V тяж. = V тяжелая последовательность, кодирующая вариабельную тяжелую цепь ΟΘΙ. С Тяжелая цепь = Последовательности, кодирующие константную тяжелую цепь (например, последовательности для константной тяжелой цепи 1дС1 мыши). В-В-д1оЬш рА = Последовательность поли А β-глобина кролика. ЬСН полиА = Последовательность поли А бычьего гормона роста. сайт РВТ = сайт рекомбинации РВТ. Гигромицин = ген для устойчивости к гигромицину. 8У40 поли А = поли А последовательность 8У40.
Закономерно, порядок стадий 1 и 2 может быть полностью изменен таким образом, что фрагмент от р8ушус10, содержащий все из каппа, бактериальной кассеты промотора и V тяж. можно вырезать из р8ущус10, с применением расщепления рестрикции ЕсоВ1 и ΝοίΙ, который можно затем лигировать в вектор, кодирующий изотип, например р8ущус20. Затем на р8ущус20 можно провести обмен промоторами путем расщепления рестрикции с применением 8аб и ΧΙιοΙ и лигирование с расщепленным 8ас1+Х1ю1 фрагментом кассеты промотора млекопитающего, например, таким как фиг. 4В.
Фиг. 5 - гистограмма, показывающая распределение генотипа в клетках ТС1, трансформированных Препаратом Плазмиды 1. Ет 223-228 относятся к векторам с бактериальными промоторами, кодирующим анти-в2 микроглобулин (анти-В2М), антищелочной фосфат (анти-АР), антиовальбумин (анти-ΟVА), анти-Фактор VIII (анти-РУШ), антилизоцим (анти-ЬУ8), антигаптоглобин (анти-НАР), соответственно. Ет223-228 представляют векторы типа р8утус10. Количество отдельных генотипов, совпавших со структурой фрагментов, определенной ВРЬР, соответствует количеству отдельных колоний среди общего количества выбранных колоний.
Фиг. 6 - гистограмма, показывающая распределение генотипа в клетках ТС1, трансформированных Препаратом Плазмиды 2. Ет 229-234 относятся к векторам с промоторами млекопитающего (СМV/МР8V), кодирующим анти-в2-микроглобулин (анти-В2М), антищелочной фосфат (анти-АР), антиовальбумин (анти-ΟVА), анти-Фактор VIII (анти-ЕУШ), антилизоцим (анти-ЬУ8), антигаптоглобин (анти-НАР), соответственно. Ет 229-234 представляют векторы типа р8утус12. Количество клонов представляет количество наблюдаемых клонов, которые совпадают со структурой последовательности, определенной ВЕЬР этого типа Ет (полный анализ последовательности не был выполнен).
Фиг. 7 - гистограмма, показывающая распределение генотипа в клетках ТС1, трансформированных Препаратом Плазмиды 3. Ет 235-240 относятся к мышиному вектору экспрессии ЦС1 млекопитающего (включающему сигнал поли А β-глобина кролика) и кодирующему анти-в2-микроглобулин (анти-В2М), анти-щелочной фосфат (анти-АР), антиовальбумин (анти-ΟVА), анти-Фактор VIII (анти-РУШ), антилизоцим (анти-ЬУ8), антигаптоглобин (анти-НАР), соответственно. Ет235-240 представляют векторы типа р8утус21. Количество клонов представляет количество наблюдаемых клонов, которые совпадают со структурой последовательности, определенной ВРЬР этого типа Ет (полный анализ последовательности не был выполнен).
Фиг. 8 - гистограмма, показывающая распределение генотипа в клетках Т01, трансформированных Препаратом Плазмиды двойного расщепления/лигирования (массовый перенос в экспрессирующий вектор млекопитающего без амплификации ДНК в Е. сой после Приготовления Плазмиды стадии 1).
Фиг. 9 - гистограммы, показывающие распределение генотипа в клетках СНО-РфПп, трансфицированных смесью векторов экспрессии млекопитающих, кодирующих шесть представляющих интерес генов на А) день 16 и В) день 34 после трансфекции.
Фиг. 10 - антиген-специфичный ЕЫ8А супернатантов, полученных из клеток СНО-Р1р4п спустя 34 дня после полной трансфекции смесью векторов экспрессии, кодирующих шесть представляющих интерес генов.
Фиг. 11 - анти-каппа ЕЫ8А оболочки супернатантов, полученных резервов клеток СНО-Р1рПп спустя 34 дня после трансфекции либо отдельным экспрессирующим вектором, кодирующим один представляющий интерес ген, либо смесью векторов экспрессии, кодирующих шесть представляющих интерес генов.
Фиг. 12 - количественный антиген-специфичный ЕЫ8А супернатантов, полученных из СНО Р1рПп клона 019 на день 17, 31, 45, 59 и 73 после полной трансфекции смесью векторов экспрессии, кодирующих шесть представляющих интерес генов. А, В и С представляют три различных эксперимента трансфекции.
Фиг. 13 - антиген-специфичный ЕЫ8А супернатантов, полученных из клеточной культуры СНО Р1рПп на день 8, 17, 30, 45, 57, 72 и 85 после смешивания СНО Р1рПп линий клеток, экспрессирующих отдельные элементы библиотеки ιηίπί-δίχ. Результаты показанны в виде среднего значения ± 8Ό трех независимых экспериментов.
Подробное описание изобретения
Рекомбинантная поликлональная белковая система экспрессии
Настоящее изобретение относится к способам для последовательного производства рекомбинант
- 9 013225 ных поликлональных белков, которые предпочтительно выбирают из надсемейства иммуноглобулинов, семейства белков с доменами, подобными иммуноглобулину. Большинство из этих элементов участвует в событиях узнавания поверхности клетки. Гомология последовательностей говорит о том, что антитела, Т-клеточный рецептор, молекулы МНС, некоторые молекулы клеточной адгезии и рецепторы цитокинов разделяют близкую гомологию. В особенности, для получения рекомбинантных поликлональных белков, в соответствии с настоящим изобретением, подходят элементы этого семейства, содержащие вариабельные области. Такие элементы включают антитела, мембраносвязанные антитела (В-клеточный рецептор), фрагменты ЕаЬ, фрагменты Εν, фрагменты одноцепочечных Εν (кеЕу), Т-клеточный рецептор (ТСК), растворимые ТСК, фрагменты вариабельных доменов ТСК, фрагменты вариабельных доменов ТСК, фрагменты вариабельных доменов ТСК, связанные полипептидным линкером, или другие фрагменты, производные антител и ТСК. В частности предполагается, что настоящее изобретение открывает возможность для крупномасштабного производства и получения нового класса терапевтических средств, содержащего рекомбинантные терапевтические поликлональные антитела или ТСК.
Одно из главных преимуществ способа производства в соответствии с настоящим изобретением заключается в том, что все элементы, составляющие рекомбинантный поликлональный белок, можно получить в приблизительно 1-10 биореакторах или их эквивалентах. В дальнейшем в ходе процесса рекомбинантную поликлональную белковую композицию можно очистить из реактора в виде отдельного препарата без необходимости разделения отдельных элементов, составляющих рекомбинантный поликлональный белок. Напротив, если есть необходимость имитировать композицию рекомбинантного поликлонального антитела путем смешения очищенных моноклональных антител (как, например, предложено в АО 91/16074), то потребовалось бы, чтобы в композицию включили раздельное производство каждого антитела в биореакторе, и наиболее вероятно, чтобы антитела также очищали раздельно. Такое получение моноклональной смеси было бы очень дорогостоящим и требующим большего времени и места по сравнению с способом получения рекомбинантного поликлонального антитела или других поликлональных белков, как описано в настоящем изобретении. Таким образом, способ, как описано в АО 91/16074, по всей видимости, привел бы к практическому пределу до количества моноклональных антител, которые можно включить в такую смесь, наиболее вероятно, ниже 10, тогда как технология, в соответствии с описанием в настоящем изобретении, в общем, может производить поликлональное антитело с требуемым количеством отдельных элементов.
Чтобы получить прогнозируемую экспрессию рекомбинантного поликлонального белка из рекомбинантной поликлональной продуцирующей линии клеток, требуется достаточно хорошо понять регуляторные свойства геномного сайта интеграции.
Для получения рекомбинантного поликлонального белка нежелательна обычная трансфекция и методики экспрессии рекомбинантных белков с применением случайной интеграции, так как случайный характер процесса приведет к варьированию от клетки к клетке количества и положения интегрированных последовательностей нуклеиновой кислоты. Таким образом, если рекомбинантный поликлональный белок произведен в соответствии с такими традиционными протоколами, то это, вероятно, приведет к гетерогенной клеточной культуре с переменными скоростями экспрессии отдельных элементов поликлонального белка и генетической неустойчивости из-за позиционных эффектов интегрированной ДНК. Это, по всей вероятности, приведет к отклонению экспрессии элементов, составляющих поликлональный белок.
Поэтому желательно введение в заранее определенный геномный сайт, это, в принципе, может быть достигнуто посредством гомологичной рекомбинации. Однако вследствие доминирования событий запрещенной рекомбинации гомологичная рекомбинация очень неэффективна.
Кроме того, в тех сучаях, где поликлональный белок представляет собой антитело или Т-клеточный рецептор (ТСК), возникает другая проблема с применением обычных протоколов трансфекции, приводящих к случайной интеграции. Антитела и ТСК кодируются парами независимых сегментов гена, последовательностями, кодирующими легкую и тяжелую цепь, для антител и последовательностями, кодирующими альфа- и бета-цепь или дельта- и гамма-цепь для ТСК. Полипептидные продукты от этих сегментов гена становятся ковалентно связанными в ходе внутриклеточного процессинга молекулы антитела или ТСК. Обычная технология трансфекции, приводящая к случайной интеграции, приводит к введению нескольких копий различных тяжелых и легких цепей или альфа- и бета-цепей в одной и той же клетке, что приводит к случайным комбинациям тяжелых и легких цепей, так называемая конкуренция Ун-Уь цепей или конкуренция альфа-бета цепей. Следовательно, это ухудшает работу экспрессированных антител или ТСК, что становится причиной потери сродства и/или специфичности, возможному возникновению новых специфичностей и/или уменьшенной удельной активности.
Чтобы обойти эти проблемы, система экспрессии в соответствии с настоящим изобретением использует сайт-специфичную интеграцию в геном отдельных клеток-хозяев. Система в соответствии с настоящим изобретением гарантирует, что библиотеку представляющих интерес векторов содержащую, представляющие интерес вариантные последовательности нуклеиновой кислоты, можно вставить в предварительно охарактеризованное положение в хромосоме в соответствии с опосредованной рекомбиназой процедурой обмена кассеты, таким образом, получая линию клеток, в которой отдельные клетки экс
- 10 013225 дрессируют отдельный определенный элемент представляющего интерес рекомбинантного поликлонального белка. Как описано ниже, множественные интеграции могут встречаться в некоторых из клеток, составляющих рекомбинантную поликлональную продуцирующую линию клеток. Однако как полагается, это не создает проблему, в то время как большинство отдельных клеток экспрессирует отдельный определенный элемент рекомбинантного поликлонального белка.
Могут использоваться такие рекомбиназы, как Сге, Ир, бета-рекомбиназа, Οίη, Ρίη, ΡίηΒ, Ρίηϋ, Р/Р8, лямбда интеграза, или фаговая интеграза ФС31. Подходящие рекомбиназы для интеграции в данное положение в хромосоме можно обеспечить либо (ί) путем экспрессии из собственного генома клетки, в который ввели указанную последовательность нуклеиновой кислоты, (и) путем активного кодирования последовательностью нуклеиновой кислоты, внесенной в клетку, (ш) путем экспрессии из второй молекулы нуклеиновой кислоты, либо (ίν) в виде белка. В предпочтительном варианте выполнения вариантную последовательность нуклеиновой кислоты, содержавшуюся в представляющем интерес векторе интегрируют в локус, который служит посредником в высокоуровневой транскрипции и экспрессии представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты, так называемую горячую точку.
Используемая линия клетки-хозяина предпочтительно представляет собой линию клетки млекопитающего, содержащую клетки, обычно используемые для биофармацевтической белковой экспрессии, например клетки СНО, клетки СО8, клетки ВНК, клетки миеломы (например, клетки 8р2/О, N80). ΥΒ2/0, ΝΙΗ 3Т3 и иммортализованные клетки человека, такие как клетки НеЬа, клетки НЕК 293 или РЕР,С6. В настоящем изобретении использовали клетки СНО. Однако специалист в данной области техники легко может заменить клетки СНО другими клетками млекопитающего? как описано, или даже использовать другие типы клеток, включая растительные клетки, дрожжевые клетки, клетки насекомых, грибы и бактерии. Таким образом, выбор типа клеток не подразумевает ограничения изобретением. В предпочтительном варианте выполнения для продуцирования используют клетки млекопитающего, содержащие предварительно охарактеризованную горячую точку, являющуюся посредником в высоких уровнях экспрессии представляющего интерес рекомбинантного поликлонального белка.
В дальнейшем варианте выполнения настоящего изобретения представляющие интерес вариантные последовательности нуклеиновой кислоты сайт-специфичным образом интегрируют с использованием того же хромосомного сайта интеграции в клетках-хозяевах. Такая инкорпорация в отдельный специфичный сайт сводит к минимуму позиционные эффекты, обнаруживаемые, в противном случае, случайной интеграцией или интеграцией в многократные сайты в геноме. Особенно, при экспрессии поликлональных белков, составленных из более чем одной полипептидной цепи, более того важно иметь в своем распоряжении отдельный сайт, в котором встречается сайт-специфичная интеграция в геном. Это связано с тем, что, если отдельная клетка экспрессирует более чем одну интегрированную молекулу, то, вероятно, будет встречаться конкуренция между субъединицами.
В сайт-специфичной системе интеграции отдельные клетки-хозяева экспрессируют идентичную полную белковую структуру, не считая различий, наблюдаемых в вариабельной области представляющего интерес рекомбинантного поликлонального белка, например, в области антител или ТСР, связывающей антиген. Вследствие этого большинство клеток в таком резерве клеток должно демонстрировать сходные свойства в отношении производительности и генетической стабильности, и, следовательно, эта технология предлагает возможность конролируемого получения, рекомбинантного поликлонального белка, например рекомбинантного поликлонального антитела или ТСК.
Подразумевается, что рекомбинантный поликлональный белок в соответствии с настоящим изобретением охватывает белковую композицию, содержащую различные, но гомологичные белковые молекулы, которые по своей природе являются вариабельными, это означает, что, в предпочтительных вариантах выполнения, библиотека вариантных нуклеиновых кислот содержит встречающееся в природе многообразие. Таким образом, каждая белковая молекула является гомологичной по отношению к другим молекулам композиции, но также содержит один или более участков вариабельной полипептидной последовательности, который/которые характеризуют различиями в аминокислотной последовательности между отдельными элементами поликлонального белка. Различия в аминокислотной последовательности (аминокислотных последовательностях), которые составляют вариабельную полипептидную последовательность, могут быть даже в одной аминокислоте. Предпочтительно различия в аминокислотной последовательности составляют более чем одну аминокислоту.
Обычно считается, что естественная вариабельность поликлонального антитела или ТСК расположена в так называемых вариабельных областях или У-областях полипептидных цепей.
В одном аспекте настоящего изобретения отдельные элементы в поликлональном белке содержат вариабельные области, которые составляют в длину приблизительно от 80 до 120 аминокислот. Вариабельные области могут содержать гипервариабельные домены, например области, определяющие комплементарность (СИР).
Во встречающихся в природе ТСР в каждой вариабельной области есть четыре СИР. Во встречающихся в природе антителах есть три СИР в тяжелой цепи и три СИР в легкой цепи.
В дополнительном аспекте настоящего изобретения вариабельные области отдельных элементов поликлонального белка содержат по меньшей мере один гипервариабельный домен, который составляет
- 11 013225 в длину от 1 до 26 аминокислот, предпочтительно от 4 до 16 аминокислот. Этот гипервариабельный домен может соответствовать области СЭКЗ. Для антител каждая вариабельная область предпочтительно формирует три гипервариабельных домена. Они могут соответствовать СЭК1, СЭК2 и СЭКЗ. Для ТСК каждая вариабельная область предпочтительно формирует четыре гипервариабельных домена. Они могут соответствовать СЭК1, СЭК2, СЭК3 и СЭК4. Сами гипервариабельные домены могут формировать вариабельные последовательности в пределах вариабельной области рекомбинантного поликлонального белка в соответствии с настоящим изобретением.
В контексте настоящего изобретения вариабельность полипептидной последовательности (поликлональность) можно также понимать для описания различия между отдельными молекулами антител, находящимися в так называемых константных областях или С областях полипептидных цепей антител, например, как в случае смесей антител, содержащих два или более различных изотипа антител, такие как изотипы человека 1дО1, 1дО2, 1дС3. 1дС4. 1дА1, и 1дА2, или изотипы мыши 1дО1, 1дО2а, 1дС2Ь. 1дС3. и 1дА. Таким образом, рекомбинантное поликлональное антитело может содержать молекулы антител, которые характеризуют различиями в последовательности между отдельными молекулами антитела в вариабельной области (V области) или в константной области (С области) или в обеих.
С тем чтобы обеспечить вариантные последовательности нуклеиновой кислоты, которые кодируют белки, которые связывают специфический антиген, можно применять множество способов, известных в данной области техники. Как правило, в настоящем изобретении оказывается полезным применение процедуры скрининга, которая обеспечивает идентификацию и/или выделение нуклеиновых кислот, которые кодируют белок, которые связывают специфический антиген. Несколько из этих способов включают так называемую стадию биопэннинга, известную из таких технологий, как фаговый дисплей (Капд, А.8. и др. 1991. Ргос №111 Асаб 8е1 И8А 88, 4363-4366), рибосомный дисплей (8сЬай11ге1, С. и др. 1999. 1. 1ттипо1. МеЛобк 231, 119-135), ДНК дисплей (Си11, М.О. и др. 1992. Ргос №а11 Асаб 8с1 И8А 89, 18651869), РНК-пептидный дисплей (КоЬейк, К.^., 8/о51ак, 1.^., 1997. Ргос №а11 Асаб δα И8А 94, 1229712302), ковалентный дисплей (\УО 98/37186), бактериальный поверхностный дисплей (Еисйк, Р. и др. 1991. Вю1ес11по1оду 9, 1369-1372), поверхностный дисплей дрожжей (Вобег, Е.Т., ХУЩгир, Κ.Ό., 1997. №11 Вю1ес1шо1 15, 553-557) и дисплей эукариотических вирусов (ОгаЬйетг, К., Етп51, ^., 2001. СотЬ. Сйет. НщЕ ТЕгоидЕрШ. 8стееп. 4, 185-192), способов, которые известны в уровне техники и представляют собой интересные вспомогательные средства в практике настоящего изобретения. ЕАС8 и магнитная сортировка частиц также применимы с целью обогащения (пэннинга) с применением меченого антигена. Также можно использовать иммунологические анализы, такие как ЕЫ8А (Этейет, М.Ь. и др. 1991. 1. 1ттипо1. Способы 139, 197-205) и ЕЫ8РОТ (С/егкшкку, С.С. и др. 1983. 1 1ттипо1 Ме1йоб5. 65, 109-21), либо после стадии биопэннинга, либо в чистом виде.
Композиция представляющего интерес рекомбинантного поликлонального белка содержит определенную субпопуляцию белков, которые определяли посредством общей особенности, такой как общая активность связывания с требуемой мишенью, например, в случае с поликлональными антителами, против требуемого антигена-мишени. Обычно поликлональная белковая композиция включает по меньшей мере 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 1000, 104, 105 или 106 определенных вариантных элементов. Количество определенных элементов, необходимых в поликлональной белковой композиции, будет зависеть от сложности мишени. В случае с антителом сложность антигена-мишени (антигенов-мишеней) будет влиять на количество определенных вариантных элементов, необходимых в поликлональной композиции антитела. При малых или не очень сложных мишенях, например малом белке, достаточно поликлональной композиции антител, которая содержит 3-100 определенных вариантных элементов, и предпочтительно, чтобы количество вариантов не превышало 90, или даже 80, или 70. Во многих примерах количество определенных вариантов не превышает 60 или 50 и предпочтительно, чтобы количество вариантов находилось в диапазоне между 5 и 40, например, между 5 и 30. Тогда как для более сложных мишеней, например вирусов со сложными или взаимозаменяемыми поверхностными белками, или охватывающими несколько вирусных подтипов, будет достаточно поликлональной композиции антител, которая содержит 20-500 определенных вариантных элементов. Для очень сложных мишеней, в которых антиген содержит много различных молекул, может потребоваться поликлональная композиция антител, содержащая 50-10000 определенных вариантных элементов.
У млекопитающих есть несколько известных примеров встречающихся в природе поликлональных белков как свободно циркулирующих в крови, как антитела или молекулы иммуноглобулина, так и присутствующих на поверхности клеток, как Т-клеточный рецептор и В-клеточный рецептор. У некоторых млекопитающих многообразие этих встречающихся в природе поликлональных белков достигается посредством генетической рекомбинации генов, кодирующих вариабельные области этих белков. Также известно, что антитела увеличивают свое многообразие посредством соматической мутации. Настоящее изобретение может использовать это природное многообразие путем выделения последовательностей, ответственных за многообразие (например, вариабельных доменов или областей СЭК молекул иммуноглобулина или ТСК) и получения из них библиотеки. Для белков, кодируемых из двух независимых сегментов гена, например вариабельной тяжелой цепи антитела и вариабельной легкой цепи, цепи ТСКа и
- 12 013225 цепи β или цепи ТСК.5 и цепи γ, каждый вектор в библиотеке составляет пару этих последовательностей, кодирующих вариабельные области. Получение библиотек пар последовательностей, кодирующих вариабельную область, известно в данной области техники.
Библиотеки, содержащие встречающееся в природе многообразие, например, представляют собой комбинаторные библиотеки (случайное объединение последовательностей, кодирующих вариабельную область) или библиотеки когнатных пар (пар последовательностей, кодирующих вариабельную область, полученных из одной и той же клетки). Также в настоящем изобретении применимы библиотеки, полученные из изолированных фрагментов генов СОК., которые включены в подходящую структуру (например, 8ойет11пй, Е. и др., 2000. №11. Вю1ее11по1. 18, 852-856), такую как антитело или вариабельная область ТСК. Библиотеки предпочтительно исследуют для получения подбиблиотек (представляющих интерес библиотек) с требуемой специфичностью.
Многообразие белков может также быть создано искусственным способом, например синтетическим или посредством мутации. Мутации могут представлять собой либо случайные, либо точечные мутации последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей отдельный белок, таким образом, производя поликлональную популяцию одного белка. Другой пример получения искусственных библиотек антител описан в ЕР 0859841, способ, который основан на производстве библиотеки структур вариабельной области, которая может быть объединена с другой библиотекой СОК.
В предпочтительном варианте выполнения изобретения рекомбинантный поликлональный белок представляет собой рекомбинантное поликлональное антитело или фрагмент антитела.
В другом предпочтительном варианте выполнения изобретения рекомбинантный поликлональный белок представляет собой рекомбинантный поликлональный фрагмент ТСК или ТСК.
В дополнение к многообразию, достигнутому путем генетической и соматической рекомбинации в так называемых вариабельных областях, есть различные изотипы иммуноглобулинов, которые определяют тяжелой цепью. Главные изотипы представлены 1дМ, 1§С. 1дЛ, 1дО и 1дЕ.
В связи этим рекомбинантный поликлональный белок соответствии с настоящим изобретением может также быть составлен из различных изотипов или более предпочтительно из различных подклассов. Поликлональность иммуноглобулинов может встречаться в константной части или в вариабельном домене молекулы иммуноглобулина или как в константной части, так и в вариабельном домене.
Поликлональность в так называемой константной области, особенно, тяжелой цепи антител, представляет интерес в отношении терапевтического применения антител. Различные изотипы иммуноглобулина имеют различные биологические функции (сведенные в табл. 1), которые может потребоваться объединить, при применении антител для лечения, поскольку различные изотипы иммуноглобулина могут быть вовлечены в различные аспекты естественных иммунных реакций (Сапйе1й апй Мотлзоп 1991. ЕЕхр.Мей. 173, 1483-91; Китре1 и др. 2002. Тгап81и8.С1т.Вю1. 9, 45.-53; 8йтайе1 и др. 2000. Ер1йетю1. !п£ее1.124, 153-162).
Таблица 1. Биологические функции изотипов иммуноглобулина человека
Иммуноглобулин человека
1дС1 1дСг 1дсэ 1дС4 1дАх 1дА2 1дМ 1дб 1дЕ
Классический путь акивации комлемента +++ ++ ++++ 4- - - ++++ - -
Альтернативный путь акивации комлемента + 4* + 4* + + + - - + -
Плацентарный перенос + ++ 4-4- - - - - -
Лизис бактерий + + + + +++ +++ + 2 о
Связывание макрофага/ других фагоцитов - + + 4- + - -
Связывание тучной клетки/ базофилов - - - - - - - - -
Реактивность белка Стафилококка А + + - + - - - - -
Дальнейший вариант выполнения настоящего изобретения основан на рекомбинантной поликлональной продуцирующей линии клеток, содержащей коллекцию клеток, трансфицированную библиотекой вариантных последовательностей нуклеиновой кислоты, в которой каждая клетка в коллекции трансфицирована и способна к экспрессии одного элемента библиотеки, который кодирует определенный элемент поликлонального белка, который связывает специфический антиген и который расположен
- 13 013225 на том же отдельном сайте в геноме отдельных клеток в указанной коллекции, в котором указанная последовательность нуклеиновой кислоты в природе не связана с указанной клеткой в коллекции.
В дополнительном варианте выполнения описанного выше варианта выполнения, все вариантные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие поликлональный белок (предпочтительно из надсемейства иммуноглобулина), получают из встречающихся в природе последовательностей, например, берут у донора.
Композиции клеток, которые содержат вариантные нуклеиновые кислоты, расположенные в отдельном специфичом сайте в геноме в каждой клетке, описаны в \УО 02/44361. Этот документ раскрывает применение клеток для идентификации молекул, имеющих требуемые свойства, но данная ссылка не обсуждает обеспечение системы для получения или обеспечения поликлонального белка, характеризующегося специфичным связыванием с антигеном.
Клональное многообразие
Одно из свойств поликлонального белка заключается в том, что он составлен из множества отдельных белковых молекул, где каждая белковая молекула является гомологичной по отношению к другим молекулам поликлонального белка, но также обладает вариабельностью, которую характеризуют различиями в аминокислотной последовательности между отдельными элементами поликлонального белка. Предпочтительно эти различия ограничиваются определенными зонами полной структуры поликлонального белка. Такие области, например, представляют собой вариабельную область антитела или ТСЯ и, возможно, дополнительно ограничены областями СЭЯ в этих зонах. Эту вариабельность можно также описать как многообразие, которое можно идентифицировать как на уровне нуклеиновой кислоты, так и на белковом функциональном уровне, например специфичности и различиях в сродстве к мишени.
Клональное многообразие линии клеток можно проанализировать с помощью КЕЬР (или секвенирования продуктов (ЯТ)-РСЯ) на изолированных клонах от резерва клеток, экспрессирующих рекомбинантный поликлональный белок.
Многообразие также можно проанализировать с помощью функциональных тестов (например, ЕЬ18А) на рекомбинантном поликлональном белке, произведенном линией клеток.
Клональное отклонение (то есть постепенное изменение в композиции отдельных антител, составляющих поликлональное антитело), если оно существует, можно оценить путем сравнения клонального многообразия исходной библиотеки, используемой для трансфекции, с многообразием, обнаруженным в резерве клеток (линии клеток), экспрессирующих рекомбинантный поликлональный белок.
Клональное многообразие поликлонального белка, экспрессированного из линии клеток, может быть оценено как способнось связывания мишени поликлональным белком. В этом случае считают, что достигается достаточное многообразие, когда приблизительно 25-100% требуемых молекул связывается поликлональным белком. Например, в случае поликлонального антитела достаточное многообразие в композиции обеспечивает связывание антитела по меньшей мере с 25% неидентичных эпитопов на поверхности антигена-мишени. Предпочтительно клональное многообразие по способности связывания мишени составляет по меньшей мере 50% и еще более предпочтительно по меньшей мере 75%. Для антител такую способность связывания мишени можно, например, оцененить путем картирования эпитопов.
В качестве альтернативы, клональное многообразие можно оценить как распределение отдельных элементов поликлональной композиции. Это распределение можно оценить как общее количество различных отдельных элементов в конечной поликлональной белковой композиции по сравнению с количеством различных последовательностей кодирования, первоначально введенных в линию клеток в ходе трансфекции. В этом случае считают, что достигается достаточное многообразие, когда по меньшей мере 50% последовательностей кодирования, первоначально используемых в трансфекции, может быть идентифицировано как различные отдельные элементы конечных поликлональных белков и предпочтительно по меньшей мере 75%.
Распределение отдельных элементов поликлональной композиции можно также оценить относительно взаимного распределения среди отдельных элементов. В этом случае считают, что достигается достаточное клональное многообразие, если ни один отдельный элемент композиции не составляет более чем 75% общего количества отдельных элементов в конечной поликлональной белковой композиции. Предпочтительно ни один отдельный элемент не превышает 50%, еще более предпочтительно 25% и наиболее предпочтительно 10% общего количества отдельных элементов в конечной поликлональной композиции. Определение клонального разнообразия, основанное на распределении отдельных элементов в поликлональной композиции, можно выполнить с помощью анализа КЕЬР, секвенирования и белкового анализа, такого как подходы, описанные ниже для исследования поликлональной композиции.
Клональное многообразие может уменьшиться в результате клонального отклонения, которое может возникнуть а) в ходе процесса клонирования, Ь) в результате изменений в клеточной пролиферации, или с) из-за конкуренции интегрированных молекул. Если такие отклонения возникают, каждую из этих причин потери клонального многообразия легко исправить, прибегая к незначительным модификациям способов, описанных в настоящем изобретении.
С тем, чтобы ограничить отклонение, внесенное клонированием вариабельных доменов в подходя
- 14 013225 щих векторах, перенос представляющих интерес генов от одного вектора к другому можно разработать таким образом, чтобы ограничить отклонение клонирования. Методики массового переноса и тщательная селекция штамма Е. сой, используемого для амплификации, могут уменьшить отклонение клонирования. Другая возможность заключается в том, чтобы выполнить отдельно перенос между векторами в соответствии с настоящим изобретением каждого полинуклеотида, кодирующего отдельный элемент поликлонального белка.
Возможно, что изменение в скоростях клеточной пролиферации отдельных клеток в линии клеток в течение длительного промежутка времени может внести отклонение в экспрессию рекомбинантного поликлонального белка, путем увеличения или уменьшения присутствия некоторых элементов рекомбинантного поликлонального белка, экспрессированного линией клеток. Одна причина для таких изменений в скоростях пролиферации может заключаться в том, что популяция клеток, составляющих исходную линию клеток, используемую для начальной трансфекции, является гетерогенной. Известно, что отдельные клетки в линии клеток развиваются по-разному в течение длительного промежутка времени. С тем, чтобы гарантировать более гомогенный исходный материал, субклонирование линии клеток до трансфекции представляющей интерес библиотекой может быть выполнено с применением серийных разведений линии клеток до уровня отдельных клеток и выращивании каждой отдельной клетки в новую популяцию клеток (так называемое субклонирование клеток путем серийных разведений). Затем одну или более из этих популяций клеток отбирают как исходный материал, основанный на их свойствах пролиферации и экспрессии.
Кроме того, давление отбора, который используют для того, чтобы гарантировать, что выживут только клетки, которые получили сайт-специфичные интегрированные молекулы, может повлиять на скорости пролиферации отдельных клеток в пределах поликлональной линии клеток. Это может произойти из-за поддержания клеток, которые претерпевают определенные генетические изменения с тем, чтобы адаптироваться к давлению отбора. Таким образом, выбор маркерного гена селекции может также повлиять на отклонение, вызванное скоростью пролиферации.
Если оно встречается, необходимо проверить различные маркерные гены селекции. В случаях, где селекция основана на токсичном для клеток веществе, необходимо тщательно проверить оптимальную концентрацию, так же как необходимость селекции в течение всего периода выработки или только в начальной фазе.
Дополнительный подход для того, чтобы обеспечить четкоопределенную популяцию клетки заключается в том, чтобы использовать сортировку клеток с возбуждением флуоресценции (ЕАС8) после процедур селекции и трансфекции. Флюоресцентно меченые антитела можно использовать для увеличения количества очень производительных клеток, полученных из резерва клеток, трансфицированных конструкциями 1дО (Вгсхиъку и др. 1. 2003. 1ттипо1 Ме1йоЙ5 277, 141-155). Этот способ можно также использовать для сортировки клеток, экспрессирующих сходные уровни иммуноглобулина, таким образом, создавая гомогенную относительно производительности популяцию клеток. Аналогично, путем применения мечения с помощью флуоресцентного красителя сукцинимидилового эфира 5,6-карбоксилфлуоресцеин диацетата (СЕ8Е) клетки, демонстрирующие сходные скорости пролиферации, можно отобрать с применением способов ЕАС8.
Даже если отклонение, вызванное скоростью пролиферации, проявляется, потеря или сверхпредставление отдельных элементов может не обязательно быть критическим, в зависимости от потребностей в многообразии конечного рекомбинантного поликлонального белкового продукта и устойчивости многообразия с течением времени.
В сайт-специфичных отдельных интегрированных молекулах между клетками будут различия только в последовательности вариабельных областей антител, которые должны быть экспрессированы. Поэтому различные клеточные эффекты, установленные вариацией в сайте интеграции и регуляторных элементах гена, устраняются и оказывают минимальные эффекты на скорость пролиферации клетки. По всей видимости, конкуренция и многократная интеграция не должны вызвать проблемы в скорости пролиферации продуцирующей линии клеток, так как они являются редкими событиями. Как правило, случайная интеграция встречается с эффективностью приблизительно 10-5, тогда как сайт-специфичная интеграция встречается с эффективностью приблизительно 10-3. Если многократная интеграция неожиданно представит проблему, альтернативой будет повтор трансфекции библиотекой представляющих интерес векторов, поскольку вероятность, что данный случай возникнет повторно, очень мала, как описано выше. Дополнительные альтернативы описаны в примере 3 ниже.
Другой метод борьбы с нежелательным клональным отклонением заключается в выполнении трансфекции всей библиотекой представляющих интерес векторов в нескольких подрезервах или разделении резерва клеток на ранней стадии после трансфекции на подрезервы. На этой стадии отклонение не должно стать значительным, и статистически должна быть возможность получения подрезервов, в которых отсутствуют клоны с нежелательным преимуществом в пролиферации. Получающееся исключение нежелательных клонов должно быть в согласии с требованиями многообразия в конечном рекомбинантном поликлональном белковом продукте. При рассмотрении статистики полная трансфекция большого количества клеток также предоставляет способ обхождения нежелательного клонального отклонения. В
- 15 013225 этом подходе линию клетки-хозяина трансфицируют в полном объеме библиотекой вариантных последовательностей нуклеиновой кислоты. Такая библиотека образует множество копий каждого определенного элемента библиотеки. Эти копии предпочтительно должны быть интегрированы в большое количество клеток-хозяев.
Предпочтительно по меньшей мере 100, 1000, 10000 или 100000 отдельных клеток должны быть трансфицированы копиями определенных элементов библиотеки вариантных последовательностей нуклеиновой кислоты. Таким образом, если библиотека определенных вариантных последовательностей нуклеиновой кислоты составлена из 1000 определенных элементов, каждый из которых интегрирован в 1000 отдельных клеток, в результате трансфекции должно появиться 106 клонов, содержащих сайтспецифичным образом интегрированный СО1. Таким образом, гауссовская кривая скоростей удвоения отдельных клеток должна влиять на общую популяцию только в очень малой степени. Это увеличивает вероятность поддержания композиции клонов постоянной в течение долгого времени, даже если аберрантный рост и/или свойства экспрессии показывает низкий процент от прозводящих клеток.
В качестве альтернативы, библиотеку представляющих интерес векторов можно разбить на фракции, содержащие приблизительно 5-50 отдельных векторов библиотеки. Предпочтительно фракция библиотеки составляет 10-15 отдельных векторов. Каждую фракцию затем трансфицируют в аликвоту клеток. Отдельные аликвоты клеток можно затем ослеживать в течение некоторого времени с тем, чтобы наблюдать, развивается ли клональное отклонение в любой из них. Если это случается, такие аликвоты клеток можно исключить до восстановления коллекции клеток путем объединения оставшихся аликвот клеток. В качестве опции, аликвоты клеток оставляют раздельными на протяжении всей выработки и поликлональную композицию антитела собирают путем объединения продуктов каждой аликвоты, а не аликвот клеток перед выработкой. Предполагается, что количество резервов, с которыми можно иметь дело, составит пять-десять (см. предыдущее описание моноклональных антител).
В качестве альтернативы можно осуществить способ с высокой производительностью, в котором клетки трансфицируют, отдельно с применением векторов и клеток, основанных на отдельных клонах из начальной библиотеки представляющих интерес векторов. Это может исключить любое возможное отклонение последовательности в ходе трансфекции и интеграции. В качестве опции можно генотипировать отдельные трансфектанты и собрать абсолютно разнообразный резерв клеток непосредственно перед получением или раньше, если это подходит. В качестве альтернативы отдельная трансфекция большого количества клеток, продуцирующих множество клонов с одним и тем же определенным элементом библиотеки вариантных последовательностей нуклеиновой кислоты, может служить причиной таких же статистических преимуществ, какие описаны для полной трансфекции, когда индивидуально трансфицированные клетки объединяют до производства поликлонального белка.
Клетка-хозяин
Подходящая клетка-хозяин содержит в области генома один или более подходящий сайт рекомбинации, то есть последовательность нуклеиновой кислоты, распознаваемую одним или более ферментомрекомбиназой. С тем чтобы была возможность отбирать на интегрированные молекулы (то есть клетки, имеющие интегрированную копию представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты в сайте интеграции), сайт рекомбинации функционально связывают с первым геном селекции (например, геном устойчивости к антибиотику), расположенным с З'-конца от сайта рекомбинации. Кроме того, с 5'конца от сайта рекомбинации может быть расположен слабый промотор (например, усеченный ранний промотор 8У40) и кодон начала транскрипции, которые составляют неотъемлемую часть области кодирования маркера устойчивости. Таким образом, кодон начала транскрипции инициирует начало транскрипции гена селекции в клетке-хозяине перед трансфекцией библиотекой векторов экспрессии, кодирующих поликлональный белок.
Клетки-хозяев для сайт-специфичной интеграции, как описано выше, можно получить из любой клетки, которая может интегрировать ДНК в свои хромосомы или сохранить внехромосомные элементы, такие как минихромосомы, УАС (искусственные хромосомы дрожжей), МАС (искусственные хромосомы мыши), или НАС (искусственные хромосомы человека). МАС и НАС описаны подробно в №0 97/40183, таким образом, приведены в качестве ссылочного материала. Предпочтительно используют клетки млекопитающего, такие как клетки СНО, клетки СО8, клетки ВНК, клетки миеломы (например, 8р2/О или клетки N80), фибробласты, такие как ΝΙΗ 3Т3, и иммортализованные клетки человека, такие как клетки НеЬа, клетки НЕК 293 или РЕК.С6. Однако можно также использовать эукариотические клетки не млекопитающего или прокариотические клетки, такие как растительные клетки, клетки насекомых, дрожжевые клетки, грибы, Е. сой и т.д.
В одном варианте выполнения настоящего изобретения линию клеток для использования в качестве исходного материала субклонируют, выполняя так называемые серийные разведения линии клеток до уровня отдельных клеток, с последующим выращиванием каждой отдельной клетки в новую популяцию клеток до трансфекции библиотекой представляющих интерес векторов. Такое субклонирование можно также выполнить позднее в процессе отбора подходящей линии клеток, если это требуется.
Клетки-хозяев для сайт-специфичной интеграции можно получить путем трансфекции произвольно интегрирующей плазмидой, содержащей слабый промотор (например, усеченный ранний промотор
- 16 013225
8У40), кодон начала транскрипции, сайт рекомбинации, расположенный с З'-конца от стартового кодона. Предпочтительно плазмида интегрирования также содержит маркерный ген, присоединенный к первому гену селекции. Один пример такой плазмиды интегрирования представляет рЕВТ/Ьас2ео2 от бкбгодеп (СагкЬаб, СА). Маркерный ген можно использовать для оценки относительной интенсивности экспрессии в положении в геноме, используемом для того, чтобы встраивать представляющую интерес последовательность нуклеиновой кислоты. Маркерный ген (например, бета-галактозидаза (Ьас2), зеленый флуоресцентный белок (СЕР) или маркер клеточной поверхности) может быть связан с первым геном селекции в слиянии генов или транскрипционно связан ΙΚΕ8 (сайт внутреннего присоединения рибосомы) таким образом, что происходит совместная экспрессия первого гена селекции и маркерного гена. Применение гена селекции, который устанавливает на клетки давление за счет выживания (например, устойчивость к препарату или истощение питательных веществ), объединенный с маркером, позволяющим сделать оценку относительных уровней экспрессии от линии клеток к линии клеток, представляет собой эффективный способ, чтобы обеспечить клетки с высоким уровнем выработки, которые поддерживают интегрированную плазмиду в геноме. Клетки с последовательностью рекомбинации, встроенной в области с особенно активной транскрипцией, приведут к высокой экспрессии маркерного гена, например СЕР или Ьас2. Клетки с высоким уровнем экспрессии можно отбирать с помощью сортировки клеток с возбуждением флюоресценции (ЕАС8) и клонировать. На этой стадии также должно быть проанализировано, является ли интегрированная молекула отдельной интегрированной молекулой. Это может быть выполнено с помощью РСК в реальном времени и Саузерн-блоттинга.
Другой способ оценки относительных уровней экспрессии клеток, трансфицированных плазмидой интегрирования, заключается в проведении дополнительной стадии интеграции-вырезания на клетках, полученных, как описано выше. Этот резерв отобранных клеток трансфицируют снова плазмидой, кодирующей рекомбиназу, соответствующую сайту рекомбинации плазмиды интегрирования и второй плазмиды, содержащей второй маркер селекции без стартового кодона, область кодирования которого предшествует последовательности рекомбинации, аналогично соответствующей первой плазмиде интегрирования. Эта вторая плазмида также содержит последовательность кодирования для флуоресцентного маркерного белка (например, СЕР (или эквивалентных флуоресцентных белков), управляемую промотором млекопитающего. Рекомбиназа обеспечивает интеграцию этой плазмиды в геном клетки-хозяина, где подобную последовательность рекомбинации предварительно вставили с помощью интегрирующей плазмиды. Клетки с последовательностью рекомбинации, встроенной в области с особенно активной транскрипцией, приведут к высокой экспрессии флуоресцентного белка. Клетки с высоким уровнем экспрессии можно отбирать с помощью сортировки клеток с возбуждением флюоресценции (ЕАС8) и клонировать. Клоны с одинаково высоким уровнем экспрессии и содержащие одну копию встроенной плазмиды трансфицируют с помощью рекомбиназы и отбирают с помощью первого маркерного гена селекции, идентифицируя клетки, из которых вторая последовательность плазмиды была удалена рекомбиназой, что заставляет первый маркерный ген селекции снова работать. Эти клетки все еще содержат первую последовательность рекомбинации, встроенную в горячей точке транскрипции, и их можно теперь использовать для экспрессии представляющих интерес генов.
Линии клеток, которые достигают высокой экспрессии маркерного гена при интеграции отдельной копии плазмиды, используют для трансфекции представляющим интерес геном. Сайт рекомбинации в клетке-хозяине предпочтительно располагается в гене или области, особенно активной экспрессии, то есть в так называемой горячей точке.
Вектор для сайт-специфичной интеграции
Подходящий вектор содержит подходящий сайт рекомбинации, связанный с подходящим геном селекции, отличным от гена селекции, используемого для конструирования клетки-хозяина. Подходящие гены селекции для применения в экспрессии клетки млекопитающего включают, без ограничений, гены, обеспечивающие селекцию питательными веществами, такие как ген тимидин киназы (ТК), ген глютамин синтетазы (С8), ген триптофан синтазы (1грВ) или ген гистидинол дегидрогеназы (ЫзЭ). Кроме того, маркерные гены селекции представляют собой гены устойчивости к антиметаболитам, придающие устойчивость к препаратам, такие как ген дигидрофолат редуктазы (бЫг), который можно селектировать средой с дефицитом гипоксантина и тимидина и дополнительно селектировать метотрексатом, ген ксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (др!), который можно селектировать микофеноловой кислотой, ген неомицин фосфотрансферазы (пео), который можно селектировать С418 в эукариотической клетке и неомицином или канамицином в прокариотических клетках, ген гигромицин В фосфотрансферазы (Нуд, НрН, Нр1), который можно селектировать гигромицином, ген пуромицин Ν-ацетил-трансферазы (рас), который можно селектировать пуромицином, или ген бластицидин С деаминазы (Взб), который можно селектировать бластицидином. Наконец, в качестве маркерных генов селекции также можно использовать гены, кодирующие белки, которые обеспечивают сортировку, например, посредством проточной цитометрии, такие как зеленый флуоресцентный белок (СЕР), рецептор фактора роста нерва ^СЕВ) или другие мембранные белки, или бета-галактозидаза (Ьас2).
В одном аспекте настоящего изобретения селектируемый ген не снабжен ни предшествующим промотором, ни кодоном, инициирующим трансляцию. Промотор и кодон АТС обеспечивают на вы
- 17 013225 бранном сайте сайт-специфической рекомбинации. Если этот вектор интегрирует в область, отличную от выбранного сайта рекомбинации в геноме клетки-хозяина, экспрессия этого второго гена селекции не может совершаться из-за отсутствия промотора и инициирующего кодона. Если интеграция происходит на выбранном сайте рекомбинации в геноме клетки-хозяина, второй ген селекции экспрессируется, и экспрессия первого гена селекции утрачивается.
Интеграцию, например, можно выполнить с применением так называемого сайта ΡΚΤ (51даадйсс1айссдаадйсс1айс1с1адааад1а1аддаасйс-3' (8ЕЦ ΙΌ N0 1) и его вариантов) в геноме и на векторе для сайт-специфичной интеграции вместе с рекомбиназой Р1р или ее мутантами от Зассйаготусек ссгс^збас. Однако можно одинаково успешно использовать другие системы рекомбиназы, включая таковые для рекомбиназы Сгс и различные сайты 1ох, такие как 1охР из бактериофага Р1 или его варианты или мутанты, например 1ох66, 1ох71, 1ох76, 1ох75, 1ох43, 1ох44 и 1ох511 1ох511 (С. Согтап апб С. Ви11оск, Сигг. Ορίηίοη ίη Вю1сс11по1оду 2000, 11: 455-4 60) или путем применения фаговой интегразы ФС31 или интегразы лямбда, которая выполняет рекомбинацию между сайтом айР и сайтом айВ (А.С. Сго£й и др. ΡΝΑ8 2000, 97: 5995-6000). Дальнейшие системы рекомбиназы, которые можно использовать в настоящем изобретении, представлены, без ограничений, системой β-рекомбиназы-шесть из бактериальной плазмиды р8М19035, системой Сю-щх из бактериофага Мю или системой К-К8 из Худокассйаготусск гоихн.
Дополнительный вариант системы сайт-специфической рекомбинации заключается в использовании сайтов негомологичной рекомбинации. В такой системе в геном хозяина вводят два неидентичных сайта рекомбинации для образования определенных сайтов-мишеней. Сайты рекомбинации, соответствующие фланкирующим сайт-мишень, также фланкируют конструкцию, содержащую представляющий интерес ген. Такая система описана в АО 99/25854, таким образом, приведеной полностью в качестве ссылочного материала. Показано, что применение сайтов негомологичной рекомбинации подавляет вырезание СО1 из хромосомы. Неидентичные сайты рекомбинации можно составить из любого сайта рекомбинации, описанного выше, если обеспечены соответствующие рекомбиназы. Например, неидентичные сайты рекомбинации могут состоять из сайта ΡΚΤ и мутантного сайта ΡΡΤ с применением рекомбиназы Ρ1ρ для интеграции или сайта ΡΡΤ и сайта 1охР с применением Ρ1ρ и рекомбиназы Сгс для интеграции.
Кроме того, у Усбюсусп и др., Нит. Сспс Тйсг. 2001 12, 933-44 была описана система с применением двух различных сайтов ΡΚΤ. В этом подходе интегрирующую плазмиду переносят в клетки-хозяев посредством заражения ретровирусом. Плазмида состоит из комбинации гена репортера и первого гена маркера для селекции, а также ретровирусных элементов, требуемых для заражения. Ретровирусный 3'ЬТК. содержит два различных сайта ΡΡΤ. Не функционирующий второй ген маркера для селекции, в котором отсутствует промотор и кодон, инициирующий трансляцию, расположен с 3'-конца от тезисных сайтов. В ходе процесса заражения ретровирусом 3ΈΤΚ. последовательность копируется в 5ΈΤΒ. Это приводит к фланкированию гена репортера и первого гена маркера для селекции двумя различными сайтами ΡΚΤ с каждой стороны. Последовательность между внешними сайтами ΡΡΤ можно заменить на СО1 под контролем сильного промотора. Кассета, содержащая СО1, фланкирована тем же набором сайтов ΡΚΤ. Реакция катализируется рекомбиназой Ρ1ρ. В трансфицированной обменной плазмиде элемент ΙΚΕ8 и кодон, инициирующий трансляцию, расположены еще ниже СО1. После замены интегрированной кассеты не функционирующий ген маркера для селекции, расположенный в 3' ΕΤΚ. последовательности снаружи от сайтов ΡΚΤ, активизируется кодоном, инициирующим трансляцию, который обеспечивает кассета, образующая СО1. Состояние замены можно дополнительно улучшить, если в векторе интегрирования присутствует маркер отрицательной селекции (например, тимидин киназа).
Вектор интегрирования можно также перенести в клетки-хозяев путем стандартной трансфекции. В этом случае кассета интегрирования фланкирована ΡΚΤ на 5' конце и другим ΡΚΤ' сайтом на 3' конце. ΑΤС-дефицитный второй маркерный ген устойчивости дополнительно устанавливают ниже 3' ΡΚΤ' сайта.
Замена на СО1 переходит, как описано для ретровирусной системы.
Другой системой, которая предотвращает вырезание СО1 после его сайт-специфичной интеграции в хромосому, является интеграза ФС31, также упомянутая выше. Эта система была описана полностью в АО 01/07572 и АО 02/08409, таким образом, приведенных здесь полностью в качестве ссылочного материала.
В дальнейшем аспекте изобретения вектор для сайт-специфичной интеграции представляющего интерес гена дополнительно содержит ДНК, кодирующую один элемент представляющего интерес рекомбинантного поликлонального белка, которому, в качестве опции, предшествует его собственный промотор млекопитающего, управляющий экспрессией белка. Если элемент представляющего интерес рекомбинантного поликлонального белка содержит более чем одну белковую цепь, например, если этот элемент представляет собой антитело или Т-клеточный рецептор, ДНК, кодирующим цепи белка может предшествовать их собственный промотор млекопитающего, управляющий высокими уровнями экспрессии (двунаправленной или однонаправленной, см. фиг. 1 и 2, соответственно) каждой из цепей. При двунаправленный экспрессии можно использовать конфигурацию промотора голова-к-голове в векторе экспрессии и для однонаправленной экспрессии можно использовать два промотора или один промотор,
- 18 013225 объединенные, например, с последовательностью ГКЕ8. Подходящие конфигурации промотора голова-кголове представлены, например, без ограничений промотором ЛёМЬР вместе с промотором металлотионеина-1 мыши в обеих ориентациях, промотором ЛёМЬР вместе с промотором фактора элонгации 1 в обеих ориентациях или промотором СМУ вместе с промотором ΜΡδν в обеих ориентациях.
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую функциональную лидерную последовательность, можно включить в экспрессирующий вектор с тем, чтобы направить продукт гена в эндоплазматический ретикулум или в определенное местоположение в клетке, такое как органелла. Сильный сигнал полиаденилирования может быть расположен на 3'-конце последовательности ДНК, кодирующей белок. Сигнал полиаденилирования обеспечивает терминирование и полиаденилирование образующегося транскрипта РНК и коррелирует со стабильностью сигнала. ДНК, кодирующая элемент представляющего интерес рекомбинантного поликлонального белка, может, например, кодировать как тяжелые, так и легкие цепи антитела или фрагменты антитела, каждая последовательность гена, которой, в качестве опции, предшествует ее собственный промоторный элемент млекопитающего и/или которую сопровождают сильные сигналы поли А, управляющие экспрессией высокого уровня каждой из этих двух цепей.
Экспрессирующий вектор для сайт-специфичной интеграции может нести дополнительные транскрипционные регуляторные элементы, такие как энхансеры или ИСОЕ (повсеместные открывающие хроматин элементы), для усиления экспрессии на сайте интеграции. Энхансеры представляют собой последовательности нуклеиновой кислоты, которые специфичным образом взаимодействуют с клеточными белками, участвующими в транскрипции. ИСОЕ открывают хроматин или поддерживает хроматин в открытом состоянии и способствуют воспроизводимой экспрессии функционально связанного гена (более подробно описанного в \УО 00/05393, таким образом, приведенной полностью в качестве ссылочного материала). Когда один или более регуляторный элемент, описанные выше, интегрируют в хромосому клетки-хозяина, их называют гетерологичными регуляторными элементами.
Установление системы экспрессии для интенсивной экспрессии белков
Способы введения последовательности нуклеиновой кислоты в клетку известны в данной области техники. Эти способы обычно включают применение вектора ДНК для введения представляющей интерес последовательности в клетку, геном или внехромосомный элемент. Трансфекцию клеток можно проводить множеством способов, известных специалисту в данной области техники, включая осаждение фосфорнокислым кальцием, электропорацию, микроинъекцию, слияние липосом, слияние теней КВС, слияние протопластов и т. п.
Для трансфекции линии клеток-хозяев используют библиотеку представляющих интерес векторов, в которой каждый вектор содержит только одну копию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей один элемент рекомбинантного представляющего интерес поликлонального белка. Эта библиотека представляющих интерес векторов экспрессии вместе кодирует рекомбинантный поликлональный представляющий интерес белок. Подходящие векторы для сайт-специфичной интеграции были описаны в предыдущей секции. Отдельные векторы, составляющие библиотеку представляющих интерес вариантных последовательностей нуклеиновой кислоты, можно либо смешать вместе в отдельную композицию, либо можно хранить в отдельных композициях или в смесях отдельных векторов, кодирующих каждый элемент библиотеки, приблизительно 5-50 отдельных векторов библиотеки в композиции.
Производство рекомбинантной поликлональной продуцирующей линии клеток и получение рекомбинантного поликлонального белка от такой линии клеток можно провести с помощью нескольких различных методик трансфекции и производства. Эти методики обозначены на фиг. 3.
Один путь заключается в применении библиотеки векторов, смешанных вместе в отдельную композицию для трансфицирования линии клеток-хозяев. Этот способ называют полной трансфекцией или трансфекцией в полном объеме. В целом, предварительно описанное конструирование вектора и клеткихозяина гарантирует, что поликлональная линия клеток получается при подходящей селекции. В такой линии клеток большинство отдельных клеток интегрирует в геном одну копию молекулы нуклеиновой кислоты, кодируя определенный элемент рекомбинантного поликлонального белка из библиотеки представляющих интерес последовательностей нуклеиновой кислоты. Отдельная копия последовательности нуклеиновой кислоты интегрирует в отдельный специфичный сайт генома каждой клетки в коллекции клеток, таким образом, производя поликлональную линию клеток, составленную из отдельных клеток, экспрессирующих отдельные элементы представляющего интерес поликлонального белка. Замороженный запас поликлональной линии клеток делают перед началом производства рекомбинантного поликлонального белка.
Другой путь заключается в применении библиотеки векторов, разбитой на фракции, содержащие для трансфекции приблизительно 5-50 отдельных векторов библиотеки в композиции.
Предпочтительно фракция библиотеки составляет 10-20 отдельных векторов. Затем каждую композицию трансфицируют в аликвоту клеток-хозяев. Этот способ называют частичной трансфекцией. Количество трансфицированных аликвот зависит от размера библиотеки и от количества отдельных векторов в каждой фракции. Например, если библиотека составляет 100 определенных вариантных элементов, которые разбиты на фракции, содержащие 20 определенных вариантных элементов в композиции, 5 аликвот клеток-хозяев должны быть трансфицированы композицией библиотеки, образующей отдельную
- 19 013225 фракцию исходной библиотеки. Аликвоты клеток-хозяев селектируют для сайт-специфичной интеграции. Предпочтительно определенные аликвоты селектируют отдельно. Однако их можно также объединить перед селекцией. Аликвоты можно проанализировать на клональное многообразие, и только те, у которых многообразие достаточно, будут использовать для производства запаса библиотеки поликлонального СО1. Чтобы получить требуемую поликлональную линию клеток для производства, аликвоты можно смешать перед производством замороженного запаса, сразу после того, как они были восстановлены из запаса или после пролиферации и адаптации в течение недолгого времени. В качестве опции, аликвоты клеток хранят отдельно в ходе всей выработки и поликлональную белковую композицию собирают путем объединения продуктов от каждой аликвоты, а не аликвот клеток перед получением.
Третий путь представляет собой способ высокой производительности, в котором клетки-хозяев индивидуально трансфицируют с использованием отдельных векторов, составляющих представляющую интерес библиотеку. Этот способ называют индивидуальной трансфекцией. Индивидуально трансфицированные клетки-хозяев предпочтительно отдельно селектируют для сайт-специфичной интеграции. Однако их также можно объединить перед селекцией. Отдельных клонов клеток, произведенных в ходе селекции, можно проанализировать на предмет времени пролиферации и интегрирующей структуры и предпочтительно, чтобы для производства запаса библиотеки поликлонального СО1 использовали клонов с одинаковыми темпами роста и отдельной сайт-специфичной интеграцией. Отдельных клонов клеток можно смешать, чтобы получить требуемую поликлональную линию клеток перед производством запаса, сразу после того, как они были восстановлены от запаса, или после пролиферации и адаптации в течение недолгого времени.
Этот подход может исключить любое возможное остаточное отклонение последовательности в ходе трансфекции, интеграции и селекции. В качестве альтернативы индивидуально трансфицированные клетки-хозяева смешивают до выполнения селекции, обеспечивают контроль отклонения последовательности из-за трансфекции.
Общая особенность методик производства, обозначенных выше, заключается в том, что все отдельные элементы, составляющие рекомбинантный поликлональный белок, можно получить в одном, или ограниченном количестве биореакторов, приблизительно в 10 как максимум. Единственное различие заключается в стадии, в которой выбирают производство коллекции клеток, которая составляет рекомбинантную поликлональную продуцирующую линию клеток.
Линия клетки-хозяина, которую используют для экспрессии и получения представляющего интерес рекомбинантного поликлонального белка, содержит одну или более молекулу (молекулы) нуклеиновой кислоты, распознаваемых ферментом (ферментами) рекомбиназы (например, клетки, подготовленные заранее, содержащие сайт РКТ в заранее определенной области в геноме, как описано, например, в И8 5677177).
Вектор для сайт-специфичной интеграции предпочтительно интегрируют в заранее определенный геномный локус, который участвует в интенсивной экспрессии, так называемую горячую точку.
Если уровни экспрессии необходимо увеличить, амплификацию гена можно выполнить с применением селекции на ген ΌΗΡΚ или ген глютамин синтетазы (С8). Для этого требуется использовать векторы, содержащие такой маркер селекции.
Для производства поликлонального белка, где каждый белковый элемент состоит из более чем двух полипептидных цепей, комбинация цепей может быть важной для сродства, специфичности и активности белка, который они формируют. Это, например, наблюдали для антител и ТСК. Например, известно, что комбинация вариабельной тяжелой цепи антитела и переменной легкой цепи влияет на сродство и специфичность антитела, формирующегося из цепей. Таким образом, когда библиотеку последовательностей кодирующих антитела селектируют на их способность производить антитела со сродством к определенной мишени, требуется гарантия того, что комбинация вариабельной тяжелой цепи и вариабельной легкой цепи в конечном продукте соответствовала этому. По этой причине полипептидные цепи, составляющие отдельный элемент поликлонального белка, помещают в один и тот же вектор, используемый для интеграции, таким образом, гарантируя, что они будут держаться вместе в ходе всего процесса.
Следующее описание представляет собой один пример получения рекомбинантной поликлональной линии клеток экспрессии антитела, где конкуренция цепей является минимальной, если вообще присутствует.
Была создана универсальная промоторная кассета для конститутивной экспрессии, содержащая два промотора, расположенных в противоположных направлениях транскрипции, как конструкция голова-кголове, окруженная вариабельной тяжелой цепью и полной легкой цепью каппа, что обеспечивает перенос целой конструкции в вектор для сайт-специфичной интеграции, причем указанный вектор содержит сайт РКТ и ген устойчивости к гигромицину и константную область тяжелой цепи. Предполагается, что можно также использовать промоторную кассету для индуцибельной экспрессии. Кроме того, промоторы можно расположить хвост-к-хвосту, что приведет к транскрипции в противоположном направлении, или хвост-к-голове для однонаправленной транскрипции. Для эксперимента использовали клетки СнОР1р-1п (1иуйгодеи, СагкЬаб, СА), которые устойчиво экспрессируют ген слияния ΙαοΖ-Ζοοοίη. делая клетки устойчивыми к антибиотику Ζеοс^η. Клетки поддерживали в питательной среде, содержащей Ζеοс^η.
- 20 013225
Клетки трансфицировали в полном объеме библиотекой векторов для сайт-специфичной интеграции, кодирующей поликлональное антитело и другой маркер селекции (гигромицин фосфотрансфераза) вместе с плазмидой, экспрессирующей рекомбиназу Е1р. Индуцибельный промотор можно также использовать для контроля экспрессии. После трансфекции клетки выращивали в присутствии гигромицина. Клетки, которые проявляли устойчивость к гигромицину, впоследствии выращивали в различных культуральных системах, таких как обычные малые культуральные колбы, многоуровневые клеточные фабрики Νιιηο. малые биореакторы с высоким выходом (М1шРетт, ГИТЕОКА-СЕББше) и центрифужные пробирки для реакторов с системой полых волокон и биореакторов. Клетки проверяли на выработку антитела с применением ЕББ5А. Поликлональные линии клеток селектировали на жизнеспособность при росте в суспензии в сывороточной свободной питательной среде без давления отбора в течение продолжительных периодов. Запасы линий клеток выращивали в присутствии гигромицина.
Оценка сохранения поликлональности в системе экспрессии
В соответствии с настоящим изобретением часто важно гарантировать, что поликлональность в системе экспрессии существенно не меняется в ходе выработки так, чтобы было возможно остановить выработку, когда поликлональность действительно изменится. В соответствии с настоящим изобретением это осуществляется путем контролирования относительных уровней экспрессии вариантных последовательностей нуклеиновой кислоты. Уровни экспрессии можно, например, проверять на уровне мРНК, например, с применением анализа КЕБР, РСК в реальном времени либо массивов, либо на уровне белка, например, с применением двумерного электрофореза в полнакриломидном геле, масс-спектрометрии или различных хроматографических методик. С помощью этих методик можно установить основное значение для количества всех отдельных уровней экспрессии и затем взять образцы из культуры во время выработки, чтобы измерить, изменились ли уровни экспрессии (как полные, так и относительные). В нормальной практике настоящего изобретения, можно установить диапазон значений, находящихся вблизи основного значения, и если обнаруживают, что относительные уровни экспрессии, оказываются вне диапазонов, то выработку прекращают.
Чтобы было возможно оценить стабильность и воспроизводимость системы экспрессии, приготовили векторы, кодирующие шесть определенных фрагментов ЕаЬ (библиотека ιηίηί-δίχ) с реактивностью против овальбумина курицы (ОУА), бычей щелочной фосфатазы (АР), в2-микроглобулина человека (в2т), гаптоглобина человека (НАР), фактора УШ человека (ЕУШ) и лизозима яичного белка курицы (БУ8). Различные последовательности, кодирующие фрагмент ЕаЬ, не идентичны и поэтому демонстрируют различные структуры КЕБР, в связи с этим, КЕБР можно использовать для анализа композиции генотипа.
Библиотеку ιηίπί-δίχ ввели в клетки СНО-Е1р-1п посредством трансфекции с применением вектора экспрессии с кассетой промотора голова-к-голове. Клетки СНО-Е1р-1п либо трансфицировали в полном объеме смесью представляющих интерес векторов экспрессии, кодирующих шесть определенных антител, что привело к образованию поликлональной линии клеток, экспрессирующей данные шесть антител в известной комбинации, либо клетки трансфицировали индивидуально одним элементом представляющей интерес библиотеки экспрессии с последующим смешиванием трансфицированных клеток, что привело к образованию экспрессирующей рекомбинантные поликлональные антитела линии клеток, экспрессирующих данные шесть антител в известной комбинации. Таким способом, было возможно проверить, происходит ли трансфекция клеток млекопитающего без отклонения к одному или нескольким отдельным клонам линии клеток, экспрессирующей рекомбинантные поликлональные антитела. Кроме того, было возможно проверить наличие отклонения пролиферации и отклонения, вызванного очисткой поликлональной композиции антител.
Создание линии клеток, продуцирующей рекомбинантные поликлональные антитела антиовальбумина
Фаговые клоны, связывающие овальбумин, селектировали с применением фагового дисплея и ЕББ5А, чтобы идентифицировать подходящие клоны. Для того чтобы идентифицировать антитела из связывающих овальбумин клонов, использовали две установки, то есть чашки ЕББ5А, покрытые овальбумином, или способ скрининга высокой плотности (НБ8), основанный на иммобилизации овальбумина на мембранах РУБЕ. Таким способом получили группу антител, из которых некоторые узнают овальбумин, иммобилизированный на чашке ЕББ5А, а другие узнают овальбумин, иммобилизированный на мембране РУБЕ.
Селектированные фаговые клоны, связывающие овальбумин, могут содержать последовательности ДНК вариабельной тяжелой и каппа-цепей, связанные с промоторами млекопитающего и перенесенные в вектор типа р8утνс20 (фиг. 4Б) для экспрессии антитела, продуцирующей колекцию клонов типа ρ3νιηνο21 (фиг. 4Е). Клетки СНО-Е1р-1п либо трансфицируют в полном объеме смесью клонов р8утνс21, либо клетки трансфицируют индивидуально одной плазмидой р8утνс21 экспрессии антитела, с последующим смешиванием трансфицированных клеток, экспрессирующих другие антитела, связывающие овальбумин. Процедуру создания линии клеток, вырабатывающей поликлональные антитела антиовальбумина, можно проверить с помощью секвенирования ДНК, ТадМап РСК и анализа КЕБР от
- 21 013225 дельных клеток, экспрессирующих антитело, а также ЕЫ8А, 2-мерной (2Ό) жидкостной хроматографии (ЕС) и масс-спектрометрии (М§) полученной смеси антител.
Культивирование клеток и получение рекомбинантного поликлонального антитела
Поликлональную линию клеток, полученную, как описано выше, выращивают в подходящих питательных средах при подходящих условиях для экспрессии представляющего интерес поликлонального белка, кодируемого вариантными последователностями нуклеиновой кислоты, встроенными в геном клеток. Культивирование клеток можно выполнить в несколько стадий. Первая стадия заключается в том, что поликлональную линию клеток селектируют на сайт-специфичные интегрированные молекулы. При использовании клеток млекопитающего селектированные клетки предпочтительно адаптируют к росту в суспензии, а также к условиям свободного состояния в сыворотке. Это можно выполнить в одну или две стадии и с давлением отбора или без него. Наращивание можно начать, когда поликлональная линия клеток адаптируется к подходящим условиям. На этой стадии запас рабочих клеток можно заморозить. Предпочтительно используют биореакторы объемом от 30 до 100 л, но можно использовать меньшие или большие биореакторы. Подходящее время получения и выбор размера биореактора зависят от требуемой выработки белка от загрузки и уровней экспрессии линии клеток. Время может варьироваться от нескольких дней до трех месяцев. Экспрессированный рекомбинантный поликлональный белок выделяют из клеток или супернатанта. Рекомбинантный белок очищают и характеризуют согласно процедурам, известным специалисту в данной области техники. Примеры процедур очистки и характеризации упомянуты ниже.
Очистка рекомбинантного поликлонального белка от супернатанта культуры
Выделение определенных белков из супернатантов культуры возможно с применением различных хроматографических методик, которые используют различия в физико-химических свойствах белков, например различия в молекулярной массе, полном заряде, гидрофобности или сродстве к определенному лиганду или белку. Белки можно таким образом разделить по молекулярной массе с применением гельфильтрационной хроматографии или по полному заряду используя ионообменную (катион/анионную) хроматографию или в качестве альтернативы, используя хроматофокусирование. Точно так же белки можно разделить по гидрофобности с применением хроматографии гидрофобного взаимодействия или афинной хроматографии, использующей различия в сродстве к определенному иммобилизированному лиганду или белку. Таким образом, можно выполнить разделение сложных смесей белков путем последовательной комбинации различных хроматографических принципов. Таким образом, смесь белков сначала можно разделить, например, в соответствии с полным зарядом с применением ионообменной хроматографии и белки с близкими полными зарядами можно впоследствии разделить в соответствии с молекулярной массой с применением гель-фильтрационной хроматографии, или по гидрофобности с применением хроматографии гидрофобных взаимодействий в присутствии высокой концентрации выбранной соли.
Афинную хроматографию, в комбинации с последующими стадиями очистки, такими как ионообменная хроматография, гидрофобные взаимодействия и гель-фильтрация, часто использовали для очистки 1§С (как поликлонального, так и моноклонального) и ТСЕ из различных источников, например, асцитической жидкости, супернатантов клеточной культуры и сыворотки. Аффинная очистка, в которой разделение основано на обратимом взаимодействии между белком (белками) и определенным лигандом, соединенным с хроматографической матрицей, представляет собой легкий и быстрый способ, который предоставляет высокую селективность, обычно, большую емкость и концентрацию в меньшем объеме. Белок А и белок С, два белка поверхности бактериальной клетки, имеют высокое сродство к области Рс и, в иммобилизированной форме, использовались для многих обычных приложений, включая очистку поликлонального 1дС и его подклассов от различных видов и абсорбцию и очистку иммунных комплексов.
После афинной хроматографии с тем, чтобы удалить белки клетки-хозяина, пропущенный Белок А и ДНК, можно выполнить последующие стадии хроматографии, например ионообменную и/или хроматографию гидрофобного взаимодействия.
Гель-фильтрацию, как конечную стадию очистки, можно использовать для удаления загрязняющих молекул, таких как димеры и другие скопления, и поместить образец в буфер хранения. В зависимости от источника и условий экспрессии может быть необходимым включение дополнительной стадии очистки для достижения необходимого уровня чистоты антител. Таким образом, с тем, чтобы очистить антитела для терапевтического применения, часто используют хроматографию гидрофобного взаимодействия или ионообменную хроматографию в сочетании с Белком А и гель-фильтрационной хроматографией.
Для того чтобы очистить другие классы антител, следует использовать альтернативные среды для афинной хроматографии, поскольку белки А и С не связывают 1дА и 1дМ. Можно использовать иммуноафинную очистку (моноклональные антитела анти-1дА или анти-1дМ, соединенные с твердой фазой) или, в качестве альтернативы, можно использовать многостадийные методики очистки, включая ионообменное и гидрофобное взаимодействие.
Структурная характеризация
Структурная характеризация поликлональных белков, таких как антитела и ТСК.8, требует высокого
- 22 013225 разрешения из-за сложности смеси (клональное многообразие и гликозилирование).
Традиционные подходы, такие как гель-фильтрация, ионообменная хроматография или электрофорез, возможно, не обладают достаточной разрешающей способностью, чтобы дифференцировать отдельные антитела. Двумерный электрофорез в полиакриломидном геле (2Ό-ΡΆΟΕ) использовали для того, чтобы профилировать сложные белковые смеси, с последующей масс-спектрометрией (МБ) или жидкостной хроматографией (ЬС)-М8 (например, протеомикой). 2Ό-ΡΆ6Ε, который объединяет разделение, основанное на заряде белка и массе, оказался полезным для дифференцирования поликлонального, олигоклонального и моноклонального иммуноглобулина в образцах сыворотки. Однако этот способ имеет некоторые ограничения. Хроматографические методики, в отдельном капилляре и ЬС, объединенная с М8 с ионизацией электраспылением, все чаще используются для анализа сложных смесей пептида. ЬСМ8 использовали для исследования моноклональных антител и с недавнего времени также для профилирования легких цепей поликлональных антител. Анализ очень сложных образцов требует большей разрешающей способности хроматографической системы, которой можно достичь путем разделения на два измерения (или больше). Такой подход может быть основан на ионном обмене в первом измерении и обратнофазной хроматографии (или гидрофобном взаимодействии) во втором измерении, в качестве опции, объединенной с М8.
Функциональная характеризация
Поликлональный белок можно, например, функционально охарактеризовать путем сравнительных исследований с поликлональными белками со специфичностью к той же самой мишени или со сходной активностью. Такие исследования можно выполнять как ίη νίίτο, так и ίη νίνο.
Функциональная характеризация поликлонального антитела ίη νίίτο может, например, представлять собой иммунопреципитацию, которая является очень специфичной методикой для аналитического отделения антигенов-мишеней от грубых лизатов клетки. При объединении иммунопреципитации с другими методиками, такими как 8Ό8-ΡΆΟΕ, с последующим окрашиванием белка (Синий Кумасси, окрашивание серебром или мечение биотином) и/или иммуноблоттинг, можно обнаружить и провести количественный анализ антигенов, например, и, таким образом оценивать некоторые из функциональных свойств антител. Хотя этот способ не дает оценку количества молекул антител, их сродства связывания, он обеспечивает визуализацию целевых белков и, таким образом, специфичность. Этот способ можно аналогично использовать для контроля разности потенциалов антител по отношению к антигенам (целостность клонального многообразия) в ходе процесса экспрессии.
Функциональная характеризация поликлонального антитела ίη νίνο может, например, представлять собой исследование заражения. Подопытное животное, такое как мышь, можно, например, заразить определенным вирусом, к которому разрабатывалось поликлональное антитело. Степень, с которой можно ингибировать заражение, указывает функциональность поликлонального антитела.
Терапевтические композиции
В одном варианте выполнения настоящего изобретения фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный поликлональный белок, выбранный из надсемейства иммуноглобулинов в качестве активного ингредиента, предназначена для лечения или профилактики заболевания у млекопитающего, такого как заболевание, выбранное из: злокачественных опухолей, инфекций, воспалительных заболеваний, аллергии, астмы и других респираторных заболеваний, аутоиммунных заболеваний, иммунологических дисфункций, сердечно-сосудистых заболеваний, заболеваний в центральной нервной системе, метаболических и эндокринных заболеваний, отторжений трансплантации и нежелательной беременности. Млекопитающее предпочтительно представлено человеком, домашним животным или ручным животным.
В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит рекомбинантное поликлональное антитело или фрагмент антитела в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый инертный наполнитель.
В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит рекомбинантный поликлональный Т-клеточный рецептор или фрагмент Т-клеточного рецептора в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый инертный наполнитель.
Для лечения или профилактики инфекций фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит представляющий интерес рекомбинантный поликлональный белок, способный связывать или реагировать с инфекционным микроорганизмом, таким как микроорганизм, выбранный из: бактерий, микобактерий, вируса, микоплазм, риккетсий, спирохет, простейших, грибов, гельминтов и эктопаразитов.
Рекомбинантные поликлональные белки человека можно вводить в фармацевтически приемлемом разбавителе, носителе, или инертном наполнителе, в монолитной лекарственной форме. Для обеспечения подходящих композиций или композиций для введения соединений пациентам, страдающим от заболевания, например, вызванного чрезмерной пролиферацией клеток, можно применять обычную фармацевтическую практику. Введение можно начать прежде, чем пациент проявит симптомы. Можно использовать любой подходящий путь введения, например введение может представлять собой парентеральное, внутривенное, внутриартериальное, подкожное, внутримышечное, внутричерепное, внутриглазначное,
- 23 013225 глазное, внутрижелудочковое, внутрисуставное, внутрипозвоночное, интрацистернальное, внутрибрюшное, внутриносовое, аэрозоль, свечу или пероральное введение. Например, терапевтические композиции могут быть в форме жидких растворов или суспензий; для перорального приема композиции могут быть в форме таблеток или капсул, жевательной резинки, пасты, композиции, подходящие для нанесения на кожу, могут быть в форме кремов, мазей, лосьонов, гелей, прокладок или других, композиции, подходящие для применения на влагалищную или мочеполовую слизистую оболочку, могут быть в форме вагиториев, гелей или других, и внутриносовые композиции - в форме порошков, носовых капель или аэрозолей.
Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением готовят способом, известным по существу, например, посредством процессов обычного растворения, лиофилизирования, смешивания, гранулирования или изготовления сладких препаратов. Для фармацевтических композиций можно разработать рецептуру в соответствии с обычной фармацевтической практикой (см., например, в Кет1пд1оп: ТНе 8с1епсе апб РгасПсе оГ РБагтасу (201Б еб.), еб. А.К. Сеппаго, 2000, Ырршсой ^1Шат§ & ^11к1И8, РЫ1абе1рЫа, РА апб Епсус1ореб1а оГ РБагтасеи11са1 ТесЬпо1оду, ебк. 1. 8\уагЬпск апб 1. С. Воу1ап, 1988-1999, Магсе1 Эеккег, №\ν Уогк, ΝΥ).
Предпочтительно используют растворы активного ингредиента, а также суспензии, и особенно изотонические водные растворы или суспензии, что возможно для тех растворов или суспензий, которые получают до применения, например, в случае лиофилизированных композиций, которые содержат активный ингредиент отдельно или вместе с носителем, например маннитом. Фармацевтические композиции можно стерилизовать, и/или они могут содержать инертные наполнители, например консерванты, стабилизаторы, увлажняющие и/или эмульгирующие агенты, солюбилизаторы, соли для регулирования осмотического давления и/или буфер, и их можно приготовить способом, известным по существу, например, посредством обычного растворения или процессов лиофилизации. Упомянутые растворы или суспензии могут содержать вещества, увеличивающие вязкость, такие как натрий карбоксиметилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливинилпирролидон или желатин.
Композиции для инъекций готовят общепринятым способом в стерильных условиях; это относится и к введению композиций в ампулы или пробирки и запечатыванию емкостей.
Фармацевтические композиции для перорального приема можно получать путем объединения активного ингредиента с твердыми носителями, если требуется, гранулирования получающейся смеси, и переработки смеси, если это требуется или необходимо, после добавления подходящих инертных наполнителей в таблетки, сердцевины драже или капсулы. Их также можно включить в пластиковые носители, которые позволяют активным ингредиентам рассеиваться или высвобождаться в измеренных количествах.
Фармацевтические композиции содержат от приблизительно 1 до приблизительно 95%, предпочтительно от приблизительно 20 до приблизительно 90% активного ингредиента. Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением могут быть, например, в форме унифицированной дозы, например в форме ампул, пробирок, свеч, драже, таблеток или капсул.
Композиции можно вводить людям - пациентам в терапевтически эффективных количествах (например, в количествах, которые предотвращают, устраняют или уменьшают патологическое состояние) с тем, чтобы обеспечить терапию заболевания или состояния. Предпочтительная дозировка терапевтического агента, который нужно вводить, по всей видимости, зависит от таких переменных факторов, как тип и степень нарушения, общее состояние здоровья конкретного пациента, рецептуры наполнителей композиции и пути его введения.
Если требуется, лечение рекомбинантными человеческими поликлональными антителами можно объединить с более традиционными терапиями. Например, при лечении злокачественных опухолей такие сочетательные терапии могут быть в форме хирургии или введения химиотерапевтических средств или других агентов против злокачественных опухолей.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит рекомбинантный поликлональный представляющий интерес белок, способный связывать или реагировать с инфекционным микроорганизмом, таким как микроорганизм, выбранный из бактерий, микобактерий, вируса, микоплазм, риккетсий, спирохет, простейших, грибов, гельмитов и эктопаразитов.
Терапевтические применения композиций в соответствии с настоящим изобретением
Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением можно использовать для лечения, улучшения состояния или профилактики заболевания у млекопитающего. Заболевания, которые можно лечить с помощью настоящих фармацевтических композиций, включают злокачественные опухоли, инфекционные заболевания, воспалительные заболевания, аллергию, астму и другие респираторные заболевания, аутоиммунные заболевания, сердечно-сосудистые заболевания, заболевания в центральной нервной системе, метаболические и эндокринные заболевания, отторжения трансплантации и нежелательная беременность.
Один аспект настоящего изобретения представляет собой способ для лечения заболевания, улучшения состояния или профилактики у животного, в котором используют эффективное количество рекомби
- 24 013225 нантного поликлонального антитела или фрагмента антитела. В дальнейшем аспекте используют эффективное количество рекомбинантного поликлонального Т-клеточного рецептора или фрагмента Тклеточного рецептора.
Дополнительный аспект настоящего изобретения представляет собой применение рекомбинантного поликлонального антитела или рекомбинантного поликлонального Т-клеточного рецептора или фрагментов антител или Т-клеточных рецепторов для приготовления композиции состава для лечения заболеваний, выбранных из группы, состоящей из: злокачественных опухолей, инфекции, воспалительного заболевания, аллергии, астмы или другого респираторного заболевания, иммунологических дисфункций, аутоиммунного заболевания, сердечно-сосудистого заболевания, заболевания в центральной нервной системе, нарушения обмена веществ, эндокринных заболеваний, отторжений трансплантата и нежелательной беременности.
Диагностическое применение и применение для детекции в оружающей среде
Другой вариант выполнения настоящего изобретения направлен на диагностические наборы и наборы для детекции в оружающей среде, а также на способы для применения этих наборов. Наборы в соответствии с настоящим изобретением содержат рекомбинантный поликлональный белок, приготовленный в соответствии с настоящим изобретением, который, можно пометить детектируемой меткой или не метить для детекции без использования метки. В случае если настоящий рекомбинантный поликлональный белок пометили, его можно добавить к образцу, в котором предполагают содержание молекулымишени, и наличие или отсутствие метки указывает на наличие или отсутствие молекулы-мишени. Тестируемый образец может представлять собой образец жидкости тела, такой как кровь, сыворотка, плазма, спинномозговая жидкость, лимфа или моча, или образец не из млекопитающего, такой как образец из окружающей среды, в котором предполагают накопление загрязняющего вещества. Образцы не из млекопитающего могут представлять собой воду, воздух или загрязненную землю. Детекция без использования метки охватывает измерение изменения преломления в В1Асоге при связывании, в котором для того, чтобы захватить молекулу-мишень, используют рекомбинантный поликлональный белок.
Примеры
Следующие примеры описывают, как экспрессируют и получают рекомбинантные поликлональные антитела в высокопроизводительной линии клеток, в которые посредством сайт-специфичной интеграции в предварительно охарактеризованный сайт горячей точки в хромосоме вставили представляющий интерес ген (гены)/вектор (векторы).
В примерах в качестве клетки-хозяина использовали клетки СНО. Их преимущества включают наличие подходящей среды для выращивания, их способность к эффективному росту до высокой плотности в культуре и их способность экспрессировать белки млекопитающего, такие как антитела, в биологически активной форме.
В целом, трансформацию Е. сой и трансфекцию клеток млекопитающего в соответствии с данным изобретением выполняют в соответствии с обычными способами. Для лучшего понимания изобретения в примерах ниже описаны примеры конструирования векторов и их использование при получении рекомбинантной поликлональной продуцирующей линии клеток для экспрессии рекомбинантных поликлональных белков.
Следующие примеры иллюстрируют изобретение, но их не следует рассматривать как ограничение охвата изобретения.
Пример 1. Сайт-специфичная интеграция против случайной интеграции.
Для следующего эксперимента трансфекции использовали клетки СНО Р1р-1п (1иуйгодеи, СагкЬай, СА). Эффективность системы проверяли путем использования в качестве гена репортера, секретированной щелочной фосфатазы человека (8ЕАР). Приготовили две конструкции плазмиды:
1. 8ЕАР, встроенный в ркДНК3.1йудго + Диуйгодеи, СагкЬай, СА) (для случайной интеграции);
2. 8ЕАР, встроенный в ркДНК5/РКТ Диуйгодеи, СагИЬай, СА) (для сайт-специфичной интеграции).
Две конструкции плазмиды очень сходны в отношении регуляторных элементов, то есть промотора, полиаденилирования и т.д., что позволяло использовать плазмиды для сравнения случайной интеграции с сайт-специфичной интеграцией.
Клетки СНО Р1р-1и трансфицировали конструкцией плазмиды 1 отдельно, или конструкцией плазмиды 2 вместе с плазмидой, кодирующей рекомбиназу рОС44 в соответствии с процедурой, описанной 1иуйгодеи. Трансфектанты селектировали с применением гигромицина и измеряли выработку 8ЕАР из резервов трансфектантов.
Клетки, трансфицированные путем сайт-специфичной интеграции, вырабатывали приблизительно в 6 раз больше 8ЕАР, чем клетки, трансфицированные путем случайной интеграции, что доказывает эффективность данной системы и данной линии клеток.
Пример 2. Конструирование и приготовление вектора экспрессии для сайт-специфичной интеграции в клетку-хозяина.
Можно собрать экспрессирующий вектор, подходящий для сайт-специфичной интеграции в область горячей точки в хромосоме клетки-хозяина, содержащий следующие элементы ДНК:
а) сайт рекомбинации РКТ, связанный с геном устойчивости к гигромицину,
- 25 013225
Й) начало репликации рИС,
с) ген устойчивости к ампициллину (Й1а),
б) Й1а-промотор, обеспечивающий экспрессию гена устойчивости к ампициллину (Й1а),
е) ген (гены), кодирующий представляющий интерес белок (00Ι8),
ί) промотор (промоторы), обеспечивающий экспрессию 00Ι, и
д) в качестве опции, дополнительные регуляторные элементы транскрипции или трансляции, такие как энхансеры или иС0Е'§, для увеличения экспрессии на сайте интеграции или ГЯЕ8.
Для лучшего понимания конструирования вектора экспрессии каждый из элементов описывают более детально.
а) Использовали сайт рекомбинации ТЯТ, связанный с геном устойчивости к гигромицину для интеграции, опосредованной рекомбиназой Т1р, и селекции линии клеток с большей частью отдельных интегрированных молекул. Ген гигромицина не обеспечили ни предшествующим промотором, ни кодоном, инициирующим транскрипцию, но с З'-конца гена добавили сигнал полиаденилирования. Используемый сайт ТЯТ представлял собой 5'-даадйсс1айссдаадйсс1айс1с1адааад1а1аддаасйс-3' (ГЕЦ ΙΌ N0 1).
Й) Начало репликации рИС включили с тем, чтобы обеспечить репликацию большого числа копий в клетке-хозяине Е. сой.
с) Включили ген устойчивости к ампициллину (Й1а) (β-лактамаза), обеспечивающий селекцию трансформантов Е. сой.
б) В1а-промотор обеспечивал экспрессию гена устойчивости к ампициллину (Ыа) в Е. сой.
е) Включили 00Ι, кодирующий представляющий интерес белок, например рекомбинантный поликлональный белок, антитело, тяжелую и легкую цепи антитела, а также нуклеотидные последовательности, которые кодируют всю или часть константной области или вариабельной области молекулы антитела, и в качестве опции всю или часть регуляторной нуклеотидной последовательности, которая управляет экспрессией молекулы антитела.
Локусы иммуноглобулина для тяжелых цепей могут включать без ограничений всю или часть областей V, Ό, 1 и области переключения (включая промежуточные последовательности, также известные как интроны) и фланкирующие последовательности, связанные или примыкающие к определенному гену константной области тяжелой цепи, и он может включать области, расположенные внутри или ниже константной области (включая интроны).
Локусы иммуноглобулина для легких цепей могут включать без ограничений области V и 1, фланкирующие их сверху последовательности, и промежуточные последовательности (интроны), связанные или примыкающие к гену константной области легкой цепи, и он может включать области, расположенные внутри или ниже константной области (включая интроны).
Для модификации всей или части константной области антитела модифицирующие последовательности в соответствии с настоящим изобретением могут включать без ограничений константный участок антитела, имеющий специфическую эффекторную функцию, класс и/или происхождение (например, константные области иммуноглобулинов Ι§0, ΙβΛ. Ι§Μ, Ι§Ό или ЦЕ человека или любого другого вида) или часть константной области, которая изменяет активность или свойства константной области антитела; а также гены, которые кодируют другие молекулы, которые придают некоторую новую функцию молекуле модифицированного антитела, например фермент, токсин и т. п.
Ген (гены), кодирующий представляющий интерес белок, может быть эффективно связан с последовательностями нуклеотида, кодирующими функциональные лидерные последовательности, направляющие продукт гена на секреторный путь.
Дополнительно, с 3'-конца от 00Ι, кодирующего представляющий интерес белок, например, такой как поликлональное антитело, содержащее тяжелую и легкую цепи, могут быть расположены сильные сигналы полиаденилирования. Использование изотипа мыши Ц01 в следующих примерах приведено в иллюстративных целях и не предназначается для ограничения охвата изобретения.
ί) Предоставлены промоторы, обеспечивающие экспрессию 00Ι. В сзязи с этим, описывают кассету, содержащую элементы промотора и энхансера для экспрессии. В векторе экспрессии, каждому из генов антитела могут предшествовать их собственные элементы промотора млекопитающего, управляющие экспрессией высокого уровня каждой из этих двух цепей, используется однонаправленная, двунаправленная и ориентация хвост-к-хвосту кассет транскрипции.
В двунаправленной ориентации экспрессии можно использовать конфигурацию промотора головак-голове (конструкция такой системы детально описана в патенте США № 5789208, который приведен полностью в качестве ссылочного материала). В однонаправленной системе экспрессии можно также использовать для экспрессии два промотора или один промотор, объединенный, например, с последовательностью ГЯЕ8.
Для конструирования промоторов голова-к-голове Р£и РСЯ амплификацию промоторов выполняют по отдельности. 5'-праймер инициирует на наиболее близком к 5'-концу основании промотора, 3'концевой праймер включает уникальный сайт рестрикции, такой как сайт ХЬа1. После амплификации РСЯ, фрагменты можно разделить на агарозном геле и выделить из геля, используя колонки Ц|аОшск (Ц|адеп). После этого осуществляют расщепление рестрикции ХЬа1, тепловую инактивацию при 65°С в
- 26 013225 течение 20 мин и очистку фрагментов в колонке, используя ΟίαΟιιίοΚ. Фрагменты затем смешивают и лигируют вместе с применением лигазы Е. сой (№\ν Епд1апб Вю1аЬз (ΝΕΒ)), фермент, который избирательно лигирует липкие концы. Смесь лигирования амплифицируют с помощью РСЯ с 5'-праймерами каждого промотора с тем, чтобы выработать фрагмент полного промотора голова-к-голове (промотор А/ промотор В). Этот фрагмент вступает во взаимодействие с Т4 полинуклеотид киназой (Р№<) (ΝΕΒ), фермент инактивируют теплом при 65°С в течение 20 мин и фрагмент лигируют (тупыми концами) в представляющий интерес вектор (амплифицированный РСЯ фрагмент р§утус10 (см. фиг. 4), в котором праймеры, используемые для амплификации, отжигаются на каждой стороне промоторной области, амплифицируя все кроме промотора), с применением Т4 лигазы (ΝΕΒ).
Фиг. 1 и 2 показывают экспрессирующий вектор, содержащий промоторы для двунаправленного и однонаправленного, соответственно. Предполагается, что эти промоторы иллюстрируют, но не ограничивают, выбор промотора в настоящем изобретении.
д) Экспрессирующий вектор может нести дополнительные регуляторные элементы транскрипции и/или трансляции, такие как энхансеры и/или ИСОЕ'з, для усиления экспрессии на сайте интеграции и/или 1ЯЕ8.
Пример 3. Оценка сохранения поликлональности в развитой продуцирующей системе.
С тем чтобы иметь возможность оценить стабильность и воспроизводимость продуцирующей системы, приготовили линию клеток, экспрессирующую, поликлональную композицию определенных антител в известной комбинации. Такую поликлональную композицию антител назвали композицией ιηίπί81х. Библиотеку последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих композицию тЬш-зЬх, называли библиотекой тЬш-зЬх.
(a) Происхождение клона.
В этом примере использовали следующие последовательности, кодирующие фрагменты БаЬ (представляющие интерес гены) с реактивностью против антигенов 1-6:
1. Овальбумин (ОУА). Фрагменты, кодирующие БаЬ, отобрали из мышиной библиотеки фагового дисплея анти-ОУА.
2. Щелочная фосфатаза (АР). Фрагменты, кодирующие БаЬ отобрали из мышиной библиотеки фагового дисплея анти-АР.
3. в2-микроглобулин (в2т). Фрагменты, кодирующие БаЬ, клонировали от гибридомы ВВМ.1 (подарок от д-ра Ь. 0. Ребегзеп, Дания), которые получили против β2ιη.
4. Гаптоглобин человека (НАР). Фрагменты, кодирующие БаЬ, отобрали из мышиной библиотеки фагового дисплея анти-гаптоглобина человека.
5. Фактор УШ (БУШ). Парентеральное моноклональное антитело этого фрагмента БаЬ представляло собой моноклональное антитело БУШ Б25 (подарок от Νονο ΝοΓάίδΚ. Дания). ДНК, кодирующую Ун и полные каппа-цепи этого фрагмента БаЬ субклонировали в фагмиде, с последующей вставкой прокариотической промоторной кассеты в данную конструкцию.
6. Куриный яичный лизозим (ЬУ8). Эта конструкцию получили из клона Ό1.3 зсБν (Вои1о1, С. и др., 1. Мо1. Βίο1., 213 (4) (1990) 617-619), посредством РСЯ амплификации Ун и Ук фрагментов и клонирования в фагмиде.
Фагмидные клоны существуют как в глицериновых запасах трансформированного штамма ЕзсйепсЫа сой ТС1 (хранившегося при -80°С) или в виде препаратов фагмидных ДНК.
(b) Анализ ЯГЬР и секвенирование ДНК библиотек тЬш-зЬх. Нуклеотидные последовательности, кодирующие тяжелые цепи фрагментов БаЬ, проанализировали с помощью ЯГЬР следующим образом: исследовали структуры полос, полученные после расщепления фрагментов, произведенных РСЯ ферментами ШаШ и Нш£ I. Различные последовательности, кодирующие фрагмент БаЬ, показали весьма разные и легко различимые структуры. Нуклеотидные последовательности, кодирующие фрагменты Ун и Уь, секвенировали и нашли последовательности, соответствующие структуре ЯГЬР. Кроме того, нуклеотидные последовательности кодировали открытые рамки считывания и транслировались в четко определенные полипептиды.
(c) Анализ ЕЫ8А композиции тЬш-зЬх.
Фрагменты БаЬ, экспрессированные от клонов, проанализировали с применением ЕЫ8А, в котором все фрагменты БаЬ проанализировали на реактивность со всеми антигенами. Экспрессию БаЬ проверили с применением анти-каппа ЕЫ8А. Все фрагменты БаЬ дважды проверили в ЕЫ8А. Все клоны экспрессировали фрагменты БаЬ, и фрагменты БаЬ специфичным образом реагировали с подходящим антигеном. Никаких фоновых проблем в анализах ЕБ18Л не обнаружили.
Шесть фагмидных клонов существуют в индивидуально трансформированных глицериновых запасах трансформированного штамма ЕзсйетЬсйЬа сой ТС1, которые использовали в модельной системе для инокуляции, как описано ниже.
(б) Разработка поликлональной модельной системы с шестью определенными антителами в известной комбинации.
Шесть селектированных клонов, экспрессирующих БаЬ экспрессии (клонов, экспрессирующих
- 27 013225 фрагменты РаЬ анти-ОУА, анти-АР, анти-в2т, анти-НАР, анти-РУШ и анти-ЬУЗ), охарактеризовали, проверяя реактивность экспрессированных фрагментов РаЬ против подходящих антигенов. Эти клоны формировали часть поликлональной модельной системы для тестирования экспрессии и получения шести определенных антител в известной комбинации (композиция т1ш-81х). Все нуклеотидные последовательности, кодирующие фрагменты РаЬ (библиотека ιηίπί-δίχ). перенесли в фагмидный вектор (проиллюстрированный р8утус10, фиг. 4А).
(й.1) Отдельный перенос ΟΟΙ'δ из фагмидного вектора в вектор для экспрессии млекопитающего.
Перенос представляющих интерес генов (библиотеки т1ш-81х) из фагмидного вектора в вектор для экспрессии млекопитающего в этом примере выполнили посредством двустадийной процедуры. Первая стадия заключалась в замещении прокариотических промоторов промоторной кассетой млекопитающего в ориентации голова-к-голове. После этой стадии следует перенос вариабельной области ΟΟΙ'δ, промоторной кассеты и константной каппа в экспрессирующий вектор, как подробно описано ниже и проиллюстрировано на фиг. 4.
Кассету промотора голова-к-голове (промотор А/промотор В) вставили в фагмидный вектор для каждого клона путем использования расщепления 8ас1/Хйо1, с последующим лигированием, что приводит к замене бактериального промотора на промотор млекопитающего. Затем использовали расщепление ЕсоК1 и ЫоЙ с тем, чтобы переместить вариабельную тяжелую цепь, кассету промотора голова-к-голове (промотор А/промотор В) и полную каппа-цепь (ЕсоК1/ЫоБ I фрагмент) из фагмидного вектора в экспрессирующий вектор.
Пример отдельного переноса каждого клона дается со схемой последовательности выполнения операций на фиг. 4. Эта фигура демонстрирует плазмиду р8утус10, в которой представляющие интерес тяжелая и каппа-кодирующие последовательности (например, дсО32 ОУА) присутствуют в фагмидном векторе, в которую лигировали конструкцию кассеты промотора голова-к-голове млекопитающего с тем, чтобы заменить бактериальные промоторы с помощью переноса фрагмента 8ас1/Хйо1 с образованием р8утус12.
Из этой конструкции, последовательность, кодирующую вариабельную тяжелую цепь, включающую промоторную кассету и всю последовательность, кодирующую каппа-цепь, перенесли в вектор, кодирующий изотип млекопитающего (р8утус20) посредством переноса ЫоП/ЕсоК!. Получающийся вектор (р8утус21) экспрессировал представляющее интерес антитело мыши (например, анти-ОУА антитело Ι§01).
Последовательность, кодирующую вариабельную тяжелую цепь, промоторную кассету млекопитающего и всю последовательность, кодирующую каппа-цепь, от каждого из шести клонов перенесли отдельно посредством переноса ИоП/ЕсоК!, результатом чего стал экспрессирующий вектор млекопитающего р8утус21, который экспрессирует каждую из кодируемых ОО1 последовательностей антитела, как антитела 1дО1 мыши.
Шесть отдельных клонов р8утус21, содержащих шесть ОО1з, хранили в виде запасов Т01 в глицерине.
Для трансфекции в клетки СНО Р1р-1п запасы Т01 выращивали отдельно и после нормировки ОО600 на количество клеток Е сой эти шесть культур смешали и использовали для приготовления плазмиды. Этот препарат плазмиды, содержащей шесть ОО1з (библиотеку тш1-81х), использовали для полной трансфекции клеток млекопитающего для экспрессии рекомбинантного поликлонального белка.
(й.2) Массовый перенос ООГз из фагмидных векторов в векторы для экспрессии млекопитающего ОО1з (библиотека т1П1-81х) (в данном случае, фрагменты ЕсоШ/ЫоБГ), расположенные в фагмидных векторах и кодирующие шесть определенных фрагментов РаЬ (анти-ОУА, анти-АР, анти-в2т, анти-НАР, анти-РУШ, и анти-ЬУ8), перенесли массой в виде шести конструкций вектора в векторы для экспрессии млекопитающего, что привело к смеси шести определенных векторов экспрессии.
Экспериментальная процедура, относящаяся к массовому переносу, следует за процедурой, описанной в (й.1), за исключением того, что ее выполнили массой, то есть все шесть ОО1з (кодирующие вариабельные тяжелые цепи, включая кассету промотора голова-к-голове и полные каппа-цепи) перенесли одновременно в виде смеси шести фагмидных векторов.
Препараты плазмид библиотеки тш1-81х
Препарат Плазмиды 1 относится к препарату плазмиды смеси шести фагмидных векторов (с последовательностями, кодирующими антитело, содержащимися в векторе р8утус10).
Препарат Плазмиды 2 относится к препарату плазмиды шести фагмидных векторов с кодирующими последовательностями, содержащимися в векторе р8утус12 после стадии 1 массового переноса (см. фиг. 4С), что приводит к замене прокариотических промоторов конструкциями промоторных кассет млекопитающего.
Препарат Плазмиды 3 относится к препарату плазмиды после стадии массового переноса 2 (см. фиг. 4Ό), который предоставляет замену вариабельной тяжелой цепи, кассеты промотора голова-к-голове и полной каппа-цепи из р8утус12 на экспрессирующий вектор млекопитающего (р8утус21), таким образом, обеспечивая экспрессию шести выбранных антител как полные антитела 1дО1 мыши.
- 28 013225
Генотипирование клеток Т01, трансформированных препаратами плаэмиды, используемыми в массовом переносе
Клетки Т01 трансформировали библиотекой ιηίηί-δίχ в полном объеме с помощью электропорации и после инкубации в течение ночи на плашках 2χΥΤ (81дша Υ 2627) отбирали отдельные колонии. В каждом эксперименте отбирали 180 колоний и культивировали в 96 луночных форматах в жидкой среде 2χΥΤ в течение 4 ч. Аликвоты культур разбавляли водой, денатурировали и использовали в качестве матрицы в РСК. Во всех экспериментах амплифицировали вариабельную тяжелую цепь. Последовательности праймеров для фагмидных векторов (тип р8ушус10) были представлены:
5'-6СЛТТ6ЛСЛ66Л66ТТ6Л66С-3' (8 ЕС) II) N0 2) и 5'-6СТ6СС6ЛСС6СТ6СТ6СТ66ТС-3' (8Е() ГО N0 3)
Праймеры для векторов с промоторной кассетой млекопитающего были представлены (тип р8ушус12):
5'-6СЛТТ6ЛСЛ66Л66ТТ6Л66С-3' (8ЕС) II) N0 4) и
5'-6Т6ТССЛСТСТ6Л66ТТСЛ6-3' (8ЕС) II) N0 5).
Праймеры для конструкций р8ушус21 были представлены:
5'-СЛЛЛТЛ6СССТТ6ЛССЛ66С-3' (8ЕС) II) N0 6) и 5'-6Т6ТССЛСТСТ6Л66ТТСЛ6-3' (8ЕС) II) N0 7).
Все продукты РСК расщепляли как №аШ, так и ΗίηΠ с тем, чтобы гарантировать однозначное генотипирование. Фрагменты расщепления анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле и полосы визуализировали окрашиванием Е1Вг. Количество отдельных генотипов, схожих со структурой фрагмента, определенной посредством НЕГР, соответствует количеству отдельных колоний, представляющих каждое из этих шести антител среди общего количества выбранных колоний.
(ё.2а) Массовый перенос из фагмидного вектора в вектора млекопитающего после амплификации ДНК в клетках Е. сой (двустадийный способ амплификации).
Препарат Плазмиды 1 приготовили из каждого из шести запасов в глицерине Е. со11 Т01, содержащего один из шести фагмидных векторов, составляющих библиотеку ιηίηί-δίχ. Запасы выращивали отдельно и после нормировки 0Ό600 на количество Е со11 эти шесть культур смешали в равных количествах и использовали для приготовления плазмиды, результатом чего стал Препарат Плазмиды 1. Распределение генотипа шести фагмидных векторов в Препарате Плазмиды 1 тестировали с помощью трансформации в электрокомпетентные клетки Т01 и последующего анализа КЕЬР. Распределение различных генотипов в клетках Т01 показано на фиг. 5.
Препарат Плазмиды 1, содержащий поликлональный фагмидный вектор, экспрессирующий равную смесь шести отобранных генотипов фрагмента ЕаЬ, расщепляли ЗасЕХйоЕ Затем кассету промотора голова-к-голове (СМУ промотор/МР8У промотор) вставили посредством лигирования. Распределение генотипа векторов после обмена промоторами в векторе протестировали в клетках Т01 после трансформации ДНК из стадии лигирования (фиг. 6).
Клетки высеяли и выращивали на больших агаровых плашках (245 мм х 245 мм) 2х ΥΤ и Препарат Плазмиды 2 приготовили для получения фагмидного вектора, теперь содержащего кассету промотора голова-к-голове (р8ушус12).
Из Препарата Плазмиды 2, последовательность, кодирующую вариабельную тяжелую цепь, включая промоторную кассету, и полную последовательность каппа-цепи вызерали из фагмидного вектора путем расщепления №П/ЕсоК1 и переносили в вектор (р8ушус20), который уже содержит домены константной области ^01 мыши. Результатом этого стал набор векторов р8ушус21, который экспрессирует вариабельную область шести выбранных клонов антитела, такого как полные антитела ^01 мыши.
Перенос промоторов можно в качестве альтернативы выполнить в векторе млекопитающего, кодирующем изотип, изменяя порядок расщепления рестрикции, начиная с №П/ЕсоК1 для переноса представляющей интерес ДНК в вектор млекопитающего и затем фрагмент расщепления рестрикции ЗасЕХМ для вставки области промотора.
Распределение генотипов после переноса последовательности, кодирующей вариабельную тяжелую цепь, промоторной кассеты и полной последовательности, кодирующей каппа-цепь, в экспрессирующий вектор, протестировали посредством трансформации клеток Т01 ДНК из второй стадии лигирования (фиг. 7). Клетки высеяли на больших агаровых плашках (245 мм х 245 мм) 2х ΥΤ и приготовили Препарат Плазмиды 3 (р8ушус21), в котором вариабельную область шести клонов экспрессировали в контексте конструкции антитела !цС1 мыши.
Препарат Плазмиды 3 можно использовать для полной трансфекции клеток млекопитающего с тем, чтобы получить рекомбинантную поликлональную продуцирующую линию клеток для экспрессии рекомбинантного поликлонального антитела.
Результаты массового переноса из фагмидного вектора в вектор млекопитающего, кодирующий изотип, после амплификации ДНК в клетках Е. сой показали, что можно получить сбалансированное распределение шести конструкций вектора после их отдельного выращивания и смешения (Препарат Плазмиды 1, фиг. 5). Шесть конструкций, после обмена промоторной кассетой (Препарат Плазмиды 2,
- 29 013225 фиг. 6) так же как после вставки в вектор, кодирующий изотип ^01 мыши (Препарат Плазмиды 3, фиг. 7), были в сравнимой степени детектируемыми.
(б.2Ь) Массовый перенос из фагмидного вектора в вектор для экспрессии млекопитающего без амплификации ДНК в Е. со11 после стадии Препарата Плазмиды 1 (одностадийный способ амплификации).
ДНК из Препарата Плазмиды 1 (в данном случае использовали 25 мкг), содержащей поликлональный фагмидный вектор (р8утус10), экспрессирующий равную смесь шести селектированных генотипов фрагмента РаЬ, расщепили 8асI/X1юI для обмена промоторами. Фрагмент вектора 8асI/X1юI очистили и лигировали с кассетой промотора голова-к-голове (промотор СМ^промотор МР8У). После обмена промоторами, без проведения амплификации, вектор с промоторной кассетой СМV/МР8V расщепили NοΐI/ЕсοВI с тем, чтобы вырезать целую область с последовательностью, кодирующей вариабельную тяжелую цепь, включая промоторную кассету и всю последовательность, кодирующую каппа-цепь из фагмидного вектора для массового переноса в вектор для экспрессии млекопитающего.
После лигирования фрагмента ШП/ЕсоК! кодирующего вариабельную тяжелую цепь, промоторную кассету и каппа-цепь в вектор, кодирующий ^01 мыши (р8утус20), получили экспрессирующий вектор, который экспрессирует вариабельную область шести отобранных клонов в контексте полных антител ^01 мыши. Композиция этого вектора экспрессии проиллюстрировали на фиг. 1.
После массового переноса, приводящего к обмену промоторами в векторе и переносу нуклеотидных последовательностей, кодирующих вариабельную тяжелую цепь, промоторной кассеты и полной каппа-цепи в вектор для экспрессии млекопитающего распределение генотипов проверили с помощью трансформации клеток Т01 плазмидой из второй стадии лигирования. Клетки высеяли на больших агаровых плашках (245 мм х 245 мм) 2х УТ и приготовили препарат плазмиды этого Препарата Плазмиды двойного расщепления/лигирования (вектор р8утус21, в котором вариабельную область шести клонов экспрессировали в контексте антитела ^01 мыши в соответствии с Препаратом Плазмиды 3 из 6.2а). Распределение генотипа в клетках Т01 после трансформации препаратом плазмиды из одностадийного способа амплификации показано на фиг. 8.
Одностадийный способ амплификации может внести некоторую конкуренцию среди тяжелых и легких цепей от шести последовательностей, кодирующих РаЬ, получающуюся из-за образования нежелательных продуктов лигирования, которые в обычных условиях исключаются в ходе амплификации в Е.со11. Однако если такая конкуренция возникает, можно ввести стадию скрининга с тем, чтобы гарантировать поддержание достаточного клонального многообразия.
(6.2с) Прямая трансфекция клеток млекопитающего после обмена промоторами.
С тем чтобы трансфицировать клетки млекопитающего в полном объеме, для экспрессии рекомбинантного поликлонального антитела можно использовать непосредственно продукт из препаратов плазмиды библиотеки ιηίπί-δίχ либо из двухстадийного способа амплификации, либо из одностадийного способа амплификации.
(6.3) Тестирование трансфицированных клеток млекопитающего. С тем чтобы проверить и гарантировать, что массовый перенос и трансфекция в клетки млекопитающего протекают путем, поддерживающим клональное многообразие, и не вводят отклонение в композицию генотипов вариабельных последовательностей антител в ходе трансфекции и последующего культивирования, можно использовать известную комбинацию антител модели поликлональной системы т1ш-81х. Способы, посредством которых композицию генотипа отслеживают в ходе всего процесса массового переноса, полной трансфекции и экспрессии млекопитающего, могут содержать следующее:
- секвенирование ДНК изолированных клонов,
- анализ ВЕЬР отдельных клонов,
- ЕЫ8А полученной смеси антител,
- масс-спектрометрия полученной смеси антител,
- Тас.|тап РСВ относительной композиции геномных последовательностей и мРНК, экспрессирующих различные тяжелые и легкие цепи.
Отклонения в композиции генотипа, введенной в ходе процесса трансфекции, в случае, если они произойдут, могут быть вызваны случайной интеграцией или множественными интегрированными молекулами. Как описано в подробном описании, это вряд ли вызовет проблемы, если использовать линию клеток-хозяев, заранее спроектированную для сайт-специфичной интеграции. Однако ей можно управлять различными способами. Можно провести селекцию против интеграции в случайную область генома (область, отличную от сайт-специфичной области) с применением очень низких количеств ДНК, например 1 мкг/107 клеток, трансфекции с применением липофектамина или 0,2 мкг/107 клеток, при выполнении трансфекции с применением электропорации. Кроме того, ДНК для интеграции можно обеспечить в суперскрученной форме; форме, которая, как известно, не подходит для случайной интеграции.
Единичную или многократную интеграцию вне предварительно разработанного сайта-мишени исключают за счет отрицательной селекции, потому что селектируемый маркер присутствует в геноме без промотора или стартового кодона. Таким образом, реципиенты этих случайных событий интеграции не выживают в процессе селекции.
Трансформанты, продуцирующие многократную интеграцию, в которой одно из событий рекомби
- 30 013225 нации происходит на сайте-мишени, выживают в процессе селекции; однако вероятность этого типа многократной интеграции чрезвычайно низка. Поэтому это событие приводит к минимальной конкуренции поликлонального белка. Также, если встречается многократная интеграция, поскольку имеется от 100 до 1000 других клонов, кодирующих тот же рекомбинантный поликлональный белок, даже если уровень эктопической экспрессия высок, эффект конкуренции составил бы меньше чем приблизительно 1%. Как предварительно упомянуто, вероятность эктопической интеграции можно уменьшить путем уменьшения количества ДНК, используемой в данном способе.
Наименее вероятным событием является многократная тандемная интеграция на сайте-мишени. С применением системы рекомбиназы Р1р, описанной в настоящем изобретении, этот тип события происходит редко, поскольку активность вырезания из хромосомы является значительно более высокой, чем активность интеграции. Однако в случае, если тандемная интеграция происходит с неприемлемо высокой частотой, систему Р1р можно заменить на систему, в которой возможна вставка только единичной копии (см., например, \¥О 99/25854; приведенной полностью в качестве ссылочного материала).
(е) Экспрессия шести определенных антител в известной комбинации в клетках млекопитающего.
В общей сложности для того чтобы свести к минимуму переменные скорости пролиферации, предпочтительно интегрировать каждый определенный ОО1 (в этом случае каждый отдельный элемент библиотеки ιηίηί-δίχ) по меньшей мере в 100, предпочтительно в 1000 и наиболее предпочтительно в 10000 клеток. Предполагается, что поликлональная линия клеток, содержащая большое количество отдельных клеток, экспрессирующих один и тот же ОО1 (для всех ООГк), со статистической точки зрения меньше подвержена влиянию различий в скоростях пролиферации отдельных клеток и у нее меньше вероятность отклонения в конечной композиции поликлонального белка.
Также может быть полезным обеспечение гомогенной линии клетки-хозяина для экспрессии. Этого можно достичь путем субклонирования линии клетки-хозяина до трансфекции. Этот процесс описан в параграфе, относящемся к клональному многообразию.
Для поликлональных библиотек, в которых требуется дополнительный контроль отклонения, конечную композицию поликлонального белкового продукта можно контролировать путем введения индуцибельного элемента транскрипционного контроля в платформу вектора экспрессии. Подходящие индуцибельные элементы контроля включают, например, ΒΌ Те! оп/оГГ (ΒΌ Вюкаепсе, Ргапкйп Ьакек, N1) и Сепе8\\йс11 (1пуйгодеп, СагкЬай, СА). Эти транскрипционные переключатели можно индуцировать в подходящий момент времени (например, когда резерв клеток полностью расширен), чтобы свести к минимуму любое отклонение пролиферации из-за изменения в экспрессии гена или белковом продукте. Настоящий эксперимент выполняют без таких элементов контроля.
После переноса шести выбранных ОО1 из фагмидного вектора в векторы экспрессии млекопитающего либо отдельно, как описано в (й.1), либо путем массового переноса, как описано в (й.2), векторы экспрессии млекопитающего использовали для трансфекции в горячую точку линии клеток СНО-Р1р-1п путем применения сайт-специфичной интеграции для экспрессии шести определенных антител, как описано ниже.
Для отдельно перенесенного ОО1 (й.1) плазмидные ДНК размножали по отдельности и использовали для индивидуальной трансфекции в клетки СНО Р1р-1п, или размножали по отдельности запасы ТО1 и после нормировки ОЭ600 на количества клеток Е. сой данные шесть культур смешали и использовали для препарата плазмиды. Этот препарат плазмиды, содержащий данные шесть представляющих интерес генов, использовали для полной трансфекции клеток млекопитающего для экспрессии рекомбинантного поликлонального антитела.
Для перенесенного массой ОО1 (й.2а или й.2Ь) плазмидные ДНК либо трансфицировали в клетки СНО-Р1р-1п, либо амплифицировали и очищали (Препарат Плазмиды 3) согласно процедуре, описанной в (й.2а или й2.Ь,) и затем использовали для полной трансфекции.
(е. 1) Клеточная культура.
Линию клеток-хозяев СНО Р1р-1п (1пуйгодеп, СагНЬай, СА) содержали в среде Нат'к Р-12, с добавлением глютамина (2 мМ) и РС8 (1%) и 100 мкг/мл 2еост (1пуйгодеп, СагНЬай, СА). Для субкультивирования клетки отделили с помощью трипсина и разделили в соответствии с инструкциями изготовителя. Клетки выращивали при 5% СО2, 37°С. Среда и добавки к среде были от 01Ьсо.
Эта линия клеток устойчиво экспрессирует ген слияния 1ас2-2еост, делая клетки устойчивыми к антибиотику 2еос1п, устойчивость, которая утрачивается при сайт-специфичной интеграции чужеродного гена. Клетки содержат отдельную копию сайта-Мишени Рекомбинации И1р (РКТ) и, таким образом, готовы к использованию в качестве линии клеток-хозяев для сайт-направленной интеграции при помощи системы И1р-1п (1пуйгодеп, СагНЬай, С А).
(е.2) Трансфекция клеток СНО.
6-луночные плашки с культурой ткани инокулировали 4,0х105 клеток СНО-Р1р-1п на лунку и культивировали в течение ночи при 37°С/5% СО2. Трансфекцию этих клеток выполняли, тестируя различные способы трансфекции с применением ΡιιΟΕΝΕ™6 (Коисйе), ЫроГесйпе™, Ь1роГес!Атте™ или ЫроГесίΛΜΕΝΕ 2000™ (01Ьсо) в соответствии с инструкциями изготовителя. В этом примере ЕзроГесАМШЕ
- 31 013225
2000™ использовали в качестве реагента трансфекции. Вкратце, в день перед трансфекцией экспоненциально растущие клетки СНО-Р1р-1п высеивали, как описано выше, и культивировали в течение ночи при 37°С/5% СО2. Лунки с 85-95% слиянием клеток использовали для совместной трансфекции.
Приготовили две пробирки со следующим содержанием.
Пробирка 1. 0,5 мкг отдельного вектора экспрессии с СО1, описанным в (6.1) (например, р8утус21 с ОУА), + 4,5 мкг тр040 (максипрепарат рОС44) (плазмиды, экспрессирующей рекомбиназу Р1р) добавили к 250 мкл Орйтет (1,5 мл пробирки ЕррепбогГ).
Пробирка 2. 7,5 мкл ЫроГеСАМЕНЕ 2000™ добавили к 250 мкл Орйтет (1,5 мл пробирки ЕррепбогГ) и культивировали при комнатной температуре (КТ, КТ) в течение 5 мин.
Содержимое пробирки 2 перенесли в пробирку 1 с последующей инкубацией при КТ в течение 20 мин.
Комплексы ДНК-Е1роГес1атше перенесли в лунки с клетками, в соответствии с инструкциями изготовителя.
После 24 ч клетки отделяли с помощью трипсина, разделяли (1:3) и распределяли между колбой Т25 и 100 мм чашками Петри и выращивали в свежей Питательной Смеси Р-12 Нат + 10% РС8 + 2 мМ Ьглютаминовой среды с 900 мкг Гигромицина В/мл в качестве давления отбора.
(е.3) Селекция сайт-специфичных интегрированных молекул и субкультивирование трансфицированных клеток.
Клетки выращивали под давлением отбора Гигромицина В в течение двух-трех недель, в течение этого периода клетки снабжали каждые 2-4 дня новой питательной средой, содержащей ту же самую концентрацию селектирующего агента. Резерв выживших клеток в колбе Т-25 и в чашках Петри отделили с помощью трипсина, разделили (1:6) и распределили по Т-колбам для дальнейшего размножения при указанном выше давлении отбора. Некоторые отдельные клоны брали (используя так называемые цилиндры клонирования) из чашек Петри, содержащих трансфектанты, произведенные в соответствии со способом, описанным в (б.1), и переносили в новые лунки для размножения и применения в исследованиях уровня экспрессии.
Каждый резерв клеток или отдельных клонов, которые проявляли устойчивость к пороговой концентрации Гигромицина В, впоследствии выращивали для слияния в 6-луночных плашках, пересеивали в чашки Петри, колбы Т-25, Т-80 и Т-175 в соответствующей питательной среде с Гигромицином В. Когда экспоненциально растущие клетки достигают 80%-ного слияния в колбах Т80 с культурой ткани, пробирки каждой линии клеток замораживали и хранили в Ν2 (Ь)-морозильнике с жидким азотом.
Для трансфекции смесью плазмид, содержащих данные шесть представляющих интерес генов (библиотеку т1ш-51х), шесть отдельных культур нормировали при ОБ600 на количества Е. со11, смешали и использовали для поликлонального препарата плазмиды, содержащего данные шесть представляющих интерес генов. Выполнили процедуру трансфекции, использующую в 7,5 раз больше реактивов и клеток, описанных выше, получая рекомбинантную поликлональную линию клеток, экспрессирующих смесь шести определенных антител.
Шесть линий клеток, экспрессирующих отдельные элементы отобранных антител, и линия клеток, экспрессирующих смесь шести определенных антител в ходе культивирования и размножения тестировали на выработку антитела антиген-специфичным ЕБ18А.
(Г) Контроль композиции поликлональной линии клеток, экспрессирующих шесть определенных антител в известной комбинации.
Получили поликлональную линию клеток, экспрессирующую шесть определенных антител путем получения смеси шести отобранных представляющих интерес генов, расположенных в векторах экспрессии, с последующей полной трансфекцией и сайт-специфичной интеграцией в клетки СНО-Р1р-1п.
За линией клеток наблюдали в течение 34 дней, за которые отслеживали распределение генотипов, экспрессию антитела и скорости пролиферации. Результаты описаны ниже.
(Г.1) Распределение генотипов шести отобранных представляющих интерес генов в клетках СНОР1р-1п, трансфицированных препаратом плазмиды из нормированной ОБ600 смеси клеток.
Поликлональную линию клеток СНО-Р1р-1п трипсинизировали и суспензию клеток разбавили до 10 клеток/мл. После этого 200 мкл перенесли в каждую лунку десяти 96-луночных плашек. Приблизительно по прошествии 10 дней лунку с отдельными колониями идентифицировали посредством микроскопии. Лунки с отдельными колониями промыли, 1х в РВ8 и добавили 50 мкл воды. Чашки культивировали при 80°С в течение 10 мин и лизаты перенесли в другую 96-луночную плашку. Десять мкл лизатов использовали в 25 мкл Опе81ер КТ-РСК (01адеп) со следующими праймерами:
5'-САААТАССССТТСАССАССС-3' (8ЕО ΙΌ ΝΘ 6) и
5'-СТСТССАСТСТСАССТТСАС-3' (8ЕО ΙΌ ΝΘ 7)
КРЬР выполнили с применением ШпП и Ν1αΙΙΙ на 10 мкл смесей КТ-РСК в 15 мкл реакциях, которые культивировали при 37°С в течение 2 ч. Фрагменты расщепления визуализировали с применением электрофореза в агарозном геле, с последующим окрашиванием геля Е!Вг. Распределение генотипов клеток, получающих анти-ОУА, анти-АР, анти-в2т, анти-НАР, анти-РУШ и анти-БУ8, наблюдали в течение
- 32 013225 некоторого времени (дни 16 и 34 после трансфекции), см. фиг. 9.
(£. 2) ЕЫ8А образцов, полученных из клеток СНО-Е1р-1п, трансфицированных препаратом плазмиды из нормированной ОЭ6оо смеси Е. со11 (б. 1).
Поликлональную линию клеток СНО-Е1р-1п (е. 3) трипсинизировали и 3х106 клеток высеяли в колбы Т-75 в Е-12 НАМ + 10% ЕС8 + 2 мМ Ь-глютамин и 900 мкг гигромицина. Среду замененяли каждый день, и на день 3 супернатанты селектировали на ЕЬ18А. Антигены, ф2-микроглобулин (подарок от Ишνе^8^ίу о£ СорепНадеп), щелочная фосфатаза (81дта), овальбумин (81дта), фактор VIII (подарок от Νονο Νοι^ίδΕ Эептагк), лизоцим яичного белка курицы (81дта) и гаптоглобин (81дта)) разбавили в 50 мМ карбонатном буфере до 10 мкг/мл. Плашки ЕЬ18А покрыли антигеном (50 мкл в каждую лунку) и культивировали в течение ночи при 4°С. Лунки промыли 4 раза с промывающим буфером (1х РВ8/0,05% Тетееп 20) и блокировали в течение 1 ч 2%-ным обезжиренным молочным порошком в промывающем буфере (100 мкл в каждую лунку). 50 мкл образцов добавили в лунки и плашки культивировали в течение 1 ч при КТ. Чашки промыли 4х и вторичные антитела (козий анти-мышиный 1дС/НКР, коньюгат (81дта) ) добавляли в течение 1 ч с последующим 4х промыванием. ЕЫ8А проводили с субстратом ТМВ (50 мкл в каждую лунку, ЭЛКО 81600) в течение 5 мин и реакции останавливали путем добавления 50 мкл 1М Н28О4. Плашки сразу считывали при 450 нм. Данные, демонстрирующие экспрессию всех шести представляющих интерес антител в лизатах, полученных на день 34 после трансфекции смесью векторов экспрессии, кодирующих шесть представляющих интерес генов, показаны на фиг. 10. Следует отметить, что поскольку данные, представленные на фиг. 10, получены из шести различных антиген-специфичных анализов ЕЫ8А, считывания ОЭ450 не являются непосредственно сопоставимыми в пересчете на количество антител.
Уровни экспрессии антитела дополнительно проанализировали посредством анти-каппа ЕЬ18А оболочки в резервах клеток СНО-Е1р-1п, трансфицированных каждым отдельным СО1 или смесью шести СО1. Результат показан на фиг. 11. Это указывает на то, что уровни экспрессии антител являются сопоставимыми среди индивидуально трансфицированных линий клеток (например, линия клеток, трансфицированная вектором, кодирующим анти-в2т, экспрессирует сопоставимое количество антитела по сравнению с линией клеток, трансфицированной вектором, кодирующим антитело анти-АР). Здесь используют термин резервы клеток СНО-Е1р-1п, трансфицированных отдельным СО1, поскольку отдельные линии клеток получают не из отдельных клонов, а резервов клонов, как описано в е. 3.
(д) Выводы из эксперимента.
Во-первых, данные оценки (тесты) сохранения поликлональности в продуцирующей системе показали, что массовый перенос шести отобранных представляющих интерес генов из библиотеки ιηίπί-δίχ (кодирующей анти-ОVА, анти-АР, анти-в2т, анти-НАР, анти-ΕνΐΙΙ, и анти-ЬУ8) из фагмидных векторов в векторы экспрессии млекопитающего был возможен без внесения отклонения селекции или пролиферации (фиг. 7), таким образом, заканчиваясь с сопоставимыми частотами шести отобранных представляющих интерес генов.
Во-вторых, полная трансфекция клеток СНО-Е1р-1п смесью конструкций, содержащих шесть отобранных представляющих интерес генов, также привела к сопоставимому распределению конструкций в изолированных клетках млекопитающего. Распределения генотипов шести отобранных представляющих интерес генов в течение некоторого времени (день 16 и 34 после трансфекции) также были сходны (фиг. 9), что указывает на то, что система экспрессии вплоть до дня 34 сохраняла первоначальное, равное распределение этих шести генотипов без внесения отклонения пролиферации.
В-третьих, клетки, трансфицированные в полном объеме смесью этих шести представляющих интерес генов, демонстрировали экспрессию всех шести антител, как показало исследование антигенспецифичного ЕЬ18А на супернатантах от клеток спустя 34 дня после трансфекции (фиг. 10). Результаты ЕЫ8А для различных антигенов не являются непосредственно сопоставимыми в переводе на количества антител, из-за разницы в сродстве связывания. Однако ЕЫ8А захвата, основанный на покрытии козьим анти-мышиным антителом каппа-цепи, выполненным на супернатантах от: а) шести индивидуально трансфицированных линий клеток СНО-Е1р-1п, произведенных с применением препарата вектора, как описано в (б.1) и Ь) на супернатантах поликлональной линии клеток, экспрессирующей смесь шести отобранных представляющих интерес генов, показал сопоставимые уровни экспрессии антитела от данных шести генотипов.
Суммируя вышесказанное, было продемонстрировано, что существует возможность переноса поликлонального СО1 в массе из фагмидного вектора в экспрессирующий вектор млекопитающего. Это было предварительно описано 8Нагоп (И8 57 89208). Кроме того, смесь конструкций экспрессии млекопитающего можно трансфицировать в клетки млекопитающего в полном объеме и поддерживать при сопоставимой частоте по меньшей мере до дня 34 после трансфекции.
Пример 3А.
Оценка сохранения поликлональности в клеточных культурах, произведенных посредством полной трансфекции субклона от линии клеток СНО-Е1р-1п библиотекой ιηίπί-δίχ.
(а) Субклонирование исходной линии клеток СНО Е1р-1п.
- 33 013225
Исходную линию клеток СНО Р1р-1п (1пуйтодеп) культивировали, как описано (Пример 3 секция е.1). После трипсинизации клетки подсчитывали и высевали 1 клетку в лунку в 96-луночной культуральной плашки. Приблизительно 14 дней спустя 20 лунок с отдельными колониями идентифицировали и клетки трипсинизировали и переносили в 24-луночные плашки. Один из субклонов, клон 019 СНО-Р1р1п, селектировали для будущих исследований после характеризации режима роста, а также уровней экспрессии.
(b) Полная трансфекция и селекция клеток клона 019 СНО-Р1р-1п.
Трансфекцию выполнили трехкратно и селекцию клеток клона 019 СНО-Р1р-1п существенным образом выполнили, как описано (пример 3, секция е.2 и е.3), за исключением того, что маркер селекции Неомицина замещает маркер Гигромицина в р§утус21 (фиг. 4.е). Следовательно, в ходе селекции и культивирования клеток вместо Гигромицина В использовали Генитицин (450 мкг/мл).
(c) ЕЬ18А образцов, полученных от клеток клона 019 СНО Р1р-1п, трансфицированных в полном объеме библиотекой ιηίπί-δίχ.
Клетки культивировали в течение 73 дней после трансфекции и образцы для ЕЬ18А брали на день 17, 31, 45, 59 и 73. Выполняли количественный ЕЬ18А (с применением отдельно очищенных антител пйш-бх в качестве стандартов), как описано (пример 3, секция, £.2). Результаты трех независимых трансфекции показаны на фиг. 12. Наблюдали различные профили экспрессии между различными трансфекциями. Однако все шесть антител были детектируемыми во всех экспериментах вплоть до дня 59.
(б) Вывод из эксперимента.
Эксперименты с системой селекции Неомицина на клетках клона 019 СНО Р1р-1п показывали относительно слабо меняющиеся профили экспрессии отдельных групп, в течение двух месяцев после полной трансфекции (фиг. 12). Такой период стабильности достаточен для целей производства. С наблюдаемой изменчивостью от партии к партии можно столкнуться при выработке и хранении большого замороженного запаса отдельной группы до получения.
Пример 3В.
Оценка сохранения поликлональности в клеточных культурах, полученных путем смешения индивидуально трансфицированных клеток СНО Р1р-1п после селекции.
(a) Индивидуальная трансфекция и селекция клеток СНО-Р1р-1п.
Экспериментальные процедуры для получения данных шести линий клеток, экспрессирующих отдельные элементы библиотеки шни-бх. были описаны предварительно (пример 3, секция е.3). Данные шесть линий клеток, экспрессирующих отдельные элементы библиотеки т1ш-81х, смешали сразу после селекции в равных количествах (5х105 каждой линии клеток) и смешанную популяцию клеток культивировали в течение 85 дней. Из отдельных линий клеток сделали три отдельные смеси.
(b) ЕЬ18А образцов, полученных от поликлональных клеточных культур, полученных в (а).
Образцы брали каждые две недели и композицию антител, экспрессированных из библиотеки тш1δίχ, определяли с помощью ЕЫ8А, как описано (пример 3, секция £.2). ЕЬ18А выполняли на день 8, 17, 30, 45, 57, 72 и 85 после смешивания. Результаты (среднее ± 8Ό троекратного эксперимента) показаны на фиг. 13. Все шесть антител были детектируемыми в течение 85 дней после смешивания. Как предварительно указано (пример 3, секция £.2), считывания для различных антител не были непосредственно сопоставимыми, но данные представленные на фиг. 13, показывают относительно устойчивые профили экспрессии, по меньшей мере, вплоть до дня 45 после смешивания, после которого наблюдали основной спад производительности. Кроме того, сравнение результатов, полученных от трех независимых смесей, показало сходные профили экспрессии антител пнш-бх в течение долгого времени, что указывает на то, что результаты были воспроизводимыми.
(c) Вывод из экспериментов.
Поликлональные клеточные культуры, составленные из смесей клеток, индивидуально трансфицированных определенными элементами библиотеки тш1-81х, демонстрировали сохранение композиции, по меньшей мере, вплоть до дня 45 после смешивания. Сохранение композиции в течение 45 дней в большинстве случаев является достаточным временем для целей производства. Кроме того, трехкратные эксперименты дали схожие результаты, что таким образом указывает на то, что смешивание клеток, индивидуально трансфицированных различными конструкциями, приводит к смешанным клеточным культурам с низкой изменчивостью от партии к партии.
Пример 4.
Создание рекомбинантной поликлональной линии клеток, продуцирующей антитело антиовальбумина.
(а) Экспрессия поликлональной композиции антитела антиовальбумина.
Коллекцию полностью охарактеризованных овальбумин-связывающих фаговых клонов идентифицировали следующим образом. Четыре восьминедельных самки мышей ВАЬВ/с иммунизировали 1.р. и
з.с. 50 мкг ОУА в полном Адъюванте Фрейнда и стимулировали ОУА в неполном адъюванте Фрейнда на день 21 и 42 после дня иммунизации 0 и установили, что у всех животных сыворотка была преобразована против ОУА, в соответствии с измерением антиген-специфичным ЕЬ18А. Из мышей с лучшим ответом
- 34 013225 собрали селезенки на день 31 и 52. Фагмидные библиотеки с ЕаЬ-дисплеем получали из РНК селезенки с применением фагмидного вектора (8утус10), как предварительно описано. Получающиеся библиотеки содержали приблизительно 106 независимых клонов. Селекцию этих библиотек выполняли с помощью реакции 5/1011 фагмид с ЕаЬ-дисплеем с ОVА, нанесенными на ΝυΝΕ 1ттипо1иЬе5, с последующей промывкой и кислотной элюцией связывающих фагов. В то время как элюаты от первого цикла пэннинга содержали значительную пропорцию молекул, связывающих ОVА, элюаты от первого и второго циклов пэннинга исследовали на наличие ОVА-связывающих фаговых клонов.
Вначале ОVА-реактивные фаговые клоны идентифицировали с помощью ЕЬ18А. Вкратце, плашки ЕЫ8А покрывали ОVА, и они реагировали с ЕаЬ§ фагового дисплея, сопровождаемые вторичным антителом, конъюгированным с НКР. Для отрицательных контролей использовали несоответствующие антигены (В8А) или несоответствующие ЕаЬ§ фагового дисплея (анти-АР).
Кроме того, создали способ ΗΌ8, основанный на иммобилизации ОVА на мембранах ΓνΌΕ. Результатом этих двух способов стала идентификация отдельных субпопуляций клонов, то есть некоторых клонов, которые узнавали ОVА в одной установке, но не в другой и наоборот. Для фаговых клонов с ЕаЬдисплеем, которые реагировали с ОVА посредством либо ЕЬ18А, либо ΗΌ8, определяли нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельный домен νΗ путем секвенирования ДНК, и генетическое многообразие оценивали с помощью филогенетического анализа, с применением программного пакета Vесΐо^ ΝΊΊ. Получающаяся группа включает 127 ОVА-связывающих клонов, для всех из которых установили нуклеотидные последовательности вариабельной части νΗ.
Фрагменты ЕаЬ, экспрессированные 127 ОVА-связывающими клонами, могут связывать овальбумин как в нативной, так и в денатурированной форме. Из этого набора идентифицировали приблизительно 30 различных клонов, содержавшихся в фагмидном векторе, например р8утус10, для использования в массовом переносе и экспрессии млекопитающего. Эти антитела экспрессируются в форме как 1дА, 1дС2А, так и 1§С2В антитела мыши. Поскольку последовательности ДНК этих клонов, продуцирующих антитела, полностью охарактеризовали, можно контролировать распределение генотипов на протяжении всего массового переноса и процедуры экспрессии млекопитающего с применением тех же способов, которые используют для модельной системы с шестью определенными антителами, описанными в примере 3.
(b) Массовый перенос ОVА-специфичных последовательностей антител в вектор для экспрессии млекопитающего.
Перенос представляющих интерес генов из фагмидного вектора в экспрессирующий вектор представляет собой двустадийную процедуру (проиллюстрированную на фиг. 4), в которой первая стадия представляет собой обмен промоторами с промоторной кассетой с ориентацией отобранных промоторов млекопитающего голова-к-голове, за этим следует перенос вариабельной области представляющих интерес генов и промоторной кассеты в экспрессирующий вектор. Кассету промотора голова-к-голове (промотор А/промотор В) можно вставить в фагмидный вектор каждого клона с использованием расщепления 8ас1/ХМ, с последующим лигированием, приводящим к замещению бактериального промотора промотором млекопитающего (р8утус12).
Затем расщепление ЕсоК! и №11 переносит последовательности, кодирующие вариабельную тяжелую цепь, кассету промотора голова-к-голове (промотор А/промотор В) и полную каппа-цепь из фагмидного вектора (р8утус12) в вектор, кодирующий изотип, р8утус20. Вектор р8утус20 может принять любой фрагмент №11/ЕсоК1 от фагмидного вектора. Этот фрагмент переносит последовательность, кодирующую вариабельную тяжелую цепь, для присоединения к последовательностям константной тяжелой цепи в р8утус20, а также для присоединения всей последовательности, кодирующей каппа-цепь, к последовательности ЬСН Поли А. Результатом этого массового переноса становятся векторы экспрессии, как показано на фиг. 1, которые экспрессируют вариабельные тяжелые области и полные каппа-цепи, как антитела 1§С2В мыши после массового переноса.
Вектор, р8утус20, может содержать константные области тяжелой цепи генов 1дА, 1дС2А, 1дС2В, 1дЕ или !дС1 мыши, и таким образом, может экспрессировать любой из выбранных подходящих изотипов иммуноглобулина мыши.
(c) Экспрессия рекомбинантного поликлонального антитела анти-овальбумина.
Посредством массового переноса последовательности, кодирующие вариабельную область тяжелой цепи, промоторы и всю каппа-цепь, переносят из фаговой библиотеки векторов в векторы, кодирующие изотип, результатом чего становится поликлональная композиция вектора экспрессии млекопитающего. За этим следует трансфекция и сайт-специфичная интеграция в линию клеток СНО-Е1р-1п, создающая продуцирующую линию клеток рекомбинантного поликлонального антитела. Эту последнюю линию клеток производят путем направления представляющего интерес гена, кодирующего каждый элемент рекомбинантного поликлонального белка в ту же специфичную область в геноме каждой трансфицированной клетки, и в то же время интегрирования только одной копии конструкции экспрессии, содержащей указанную последовательность нуклеиновой кислоты в каждой трансфицированной клетке.
Клеточные культуры и процедура трансфекции и селекции являются теми же, что описаны в примере 3 (е.1-е.3).
- 35 013225 (б) Контроль стабильности композиции.
С тем чтобы гарантировать, что массовый перенос и трансфекция в клетки млекопитающего встречаются без внесения значительного отклонения в отношении клонирования, экспрессии и многообразия среди отдельных клонов, процесс массового переноса и экспрессию млекопитающего можно проверить следующими способами:
1) анализ времени образования резервов клеток от каждой трансфицированной конструкции,
2) анализ уровня экспрессии резервов клеток от каждой трансфицированной конструкции,
3) анализ РЕБ-Ρ на отдельных клетках,
4) ЕБ18Л полученной смеси антител,
5) масс-спектрометрия полученной смеси антител,
6) анализ Тадшии ΡСР (ГСР в реальном времени) на определенном объеме серии с использованием определенных V область-специфичных праймеров с тем, чтобы установить долю каждого несходного клона, или
7) анализ группы, культивируемой в течение некоторого времени с давлением отбора и без него (гигромицин), можно выполнить для следующих параметров:
a) клональное распределение,
b) белковые уровни экспрессии (количество и распределение),
c) геномная стабильность,
б) эффекты адаптации к питательным средам без сыворотки, (е) получение композиции рекомбинантного поликлонального антитела анти-овальбумина.
Линию клеток СНО-Ир-Ιη, продуцирующую рекомбинантное поликлональное антитело, выращивают в различных культуральных системах, включая обычные малые культуральные колбы, многоуровневые фабрики клеток Шпс и малые биореакторы с высоким выходом (М^п^Ρе^т, ШТЕСРЛ-СЕББте). Дополнительно, линии клеток адаптируют к свободной сывороточной суспензии для последующего культивирования в центрифужных пробирках, полых волокнах и биореакторах.
Среды, используемые для роста селектированных линий клеток, представляют собой среды, не содержащие сыворотку, не содержащие белки или химически определенные среды, рекомендованные изготовителем (ΙηνίΐΓο^η, Β&Ό, НусЮю).
Собирают супернатанты от прикрепленных клеток или клеток в суспензии, которые культивируют без селекции (гигромицин). Собранные супернатанты анализируют и характеризуют, как описано (3ί). Выход получения, функциональность и качество полученных антител проверяют в течение и после роста клеток в условиях с подпиткой или в условиях перфузии. Клетки в суспензии используют для инокуляции больших центрифужных пробирок или биореакторов.
Поликлональное антитело из собранных супернатантов очищают для дальнейшего применения в исследовании на животных.
Другие варианты выполнения изобретения очевидны для специалистов в данной области техники после рассмотрения описания и при выполнении на практике раскрытого здесь изобретения. Предполагается, что описание и примеры должны рассматриваться только в качестве примеров, а истинные объем и сущность изобретения указаны в следующей формуле изобретения.
- 36 013225
Список последовательностей <110> ЗупрЬодвп А/3 <120> СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ БЕЛКОВ <130 15в85РСТ00 <1805· 7 <170> Ρβϊβηϊΐη νβΐίΐοη 3.2 <210> 1 <211>48 <212> ДНК <213> ЗассЬагоиусвв свгеУ1»1ав <4001 даадЬЬссЬа еъссдаадЕЕ ссЕаМсЕсЪ адмадЪа!» ддаасЬЬс48 <210 2 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная <2ΖΟ <223> Синтетический ПЦР—праймер <400> 2 дсаСЬдасад дадд!Ьдадд с 21 <210 3 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная <220 <223> Синтетический ПЦР-праймер <400 3 дсСдссдасс дсбдсТдсЕд дЬс 23 <210> 4 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетический ПЦР-праймер <4004 дсаССдасад даддЕЕдадд с21 <2105 <211> 20 <212> днк <213> Искусственная <220>
<223> Синтетический ПЦР-праймер <400> 5 дЬдЪссасЪс Сдаддььсад 20 <210 6 <211> 20 <212> дик <213> Искусственная <220 <223> Синтетический ПЦР-праймер <40О> в свааТадссс СЬдаесаддс 20 <210 7 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная <220 <223> Синтетический ПЦР-праймер <400 7 дЕдТссасйс ЪдаддЕЪсад 20
- 37 013225

Claims (43)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ получения линии клеток, продуцирующей рекомбинантный поликлональный белок, предусматривающий:
    a) получение библиотеки векторов, содержащей совокупность вариантных последовательностей нуклеиновых кислот, где каждый из указанных векторов включает 1) одну-единственную копию определенной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей определенный элемент поликлонального белка, содержащего элементы, которые связывают специфический антиген, и 2) одну или несколько последовательностей узнавания рекомбиназы;
    b) введение указанной библиотеки векторов в линию клеток-хозяев, где геном каждой отдельной клетки указанной линии клеток-хозяев в единственном специфичном сайте содержит последовательности узнавания рекомбиназы, соответствующие последовательностям узнавания рекомбиназы вектора;
    c) обеспечение присутствия в указанных клетках одной или нескольких различных рекомбиназ с тем, чтобы вариантные последовательности нуклеиновых кислот стадии (а) были сайт-специфически интегрированы в клетки линии клеток-хозяев, где указанная одна или несколько рекомбиназ либо 1) экспрессируются указанными клетками, в которые была введена указанная последовательность нуклеиновой кислоты; либо ίί) оперативно кодируется векторами стадии (а); либо ΐΐΐ) обусловлена экспрессией дополнительного вектора, кодирующего рекомбиназу; либо ίν) вводится в клетку; и
    й) селекцию клеток, содержащих интегрированную копию указанной библиотеки вариантных последовательностей нуклеиновых кислот, для получения линии клеток, продуцирующей рекомбинантный поликлональный белок.
  2. 2. Способ по п.1, где поликлональный белок является гетерологичным по отношению к указанной линии клеток.
  3. 3. Способ по п.1 или 2, где указанный поликлональный белок представляет собой поликлональное антитело или фрагмент антитела.
  4. 4. Способ по п.1 или 2, где указанный поликлональный белок представляет собой поликлональный рецептор Т-клетки или фрагмент рецептора Т-клетки.
  5. 5. Способ по любому из пп.1-4, где указанную библиотеку векторов вводят в указанную линию клеток-хозяев посредством частичной трансфекции аликвот указанных клеток-хозяев фракциями, содержащими от 5 до 50 отдельных векторов указанной библиотеки векторов, и указанные клетки объединяют до или после селекции на стадии (й) с получением линии клеток, продуцирующей рекомбинантный поликлональный белок.
  6. 6. Способ по любому из пп.1-4, где указанную библиотеку векторов для сайт-специфичного интегрирования вводят в указанную линию клеток-хозяев посредством отдельной трансфекции указанных клеток-хозяев индивидуальными представителями указанной библиотеки векторов и указанные клетки объединяют с получением линии клеток, продуцирующей рекомбинантный поликлональный белок, до или после селекции на стадии (й).
  7. 7. Способ по любому из предшествующих пунктов, где популяцию вариантных нуклеиновых кислот стадии (а) выделяют или идентифицируют с помощью процедуры скрининга, которая позволяет идентифицировать и/или выделить нуклеиновые кислоты, кодирующие белок, который связывает указанный специфический антиген.
  8. 8. Способ по п.7, где процедура скрининга включает стадию биопэннинга и/или иммунологического анализа.
  9. 9. Способ по п.7 или 8, где указанная процедура скрининга выбрана из группы, состоящей из фагового дисплея, рибосомного дисплея, ДНК дисплея, РНК-пептидного дисплея, ковалентного дисплея, дисплея бактериальной поверхности, дисплея дрожжевой поверхности, дисплея эукариотического вируса, ЕЫ8А и ЕЫ8РОТ.
  10. 10. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанная библиотека вариантных последовательностей нуклеиновых кислот включает по меньшей мере 3 вариантные последовательности нуклеиновых кислот.
  11. 11. Способ по любому из предшествующих пунктов, где стадия й) п.1 включает отбор клеток, в которых отдельные представители указанной библиотеки вариантных последовательностей нуклеиновых кислот интегрированы в единственный специфичный сайт, который способен опосредовать высокоэффективную экспрессию каждого элемента указанного рекомбинантного поликлонального белка.
  12. 12. Способ по любому из предшествующих пунктов, где каждая отдельная последовательность нуклеиновой кислоты содержит пару сегментов гена, которые кодируют элемент поликлонального белка, состоящего из двух различных полипептидных цепей.
  13. 13. Способ по п.12, где указанная пара сегментов гена содержит последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела, и последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела.
  14. 14. Способ по п.12, где указанная пара сегментов гена содержит последовательность, кодирующую вариабельную область альфа-цепи рецептора Т-клетки, и последовательность, кодирующую вариабель
    - 38 013225 ную область бета-цепи рецептора Т-клетки.
  15. 15. Способ по п.12, где указанная пара сегментов гена содержит последовательность, кодирующую вариабельную область гамма-цепи рецептора Т-клетки, и последовательность, кодирующую вариабельную область дельта-цепи рецептора Т-клетки.
  16. 16. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанная библиотека вариантных последовательностей нуклеиновых кислот содержит вариантные последовательности нуклеиновых кислот с природным многообразием.
  17. 17. Способ по п.16, где природное многообразие локализовано в областях, кодирующих СОК, присутствующих в указанных вариантных последовательностях нуклеиновых кислот.
  18. 18. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанная линия клеток представляет собой линию клеток млекопитающего.
  19. 19. Способ по п.18, где указанная линия клеток млекопитающего выбрана из группы, состоящей из клеток яичника китайского хомячка (СНО), клеток СО8, клеток ΒΗΚ, УВ2/О, ΝΙΗ 3Т3, клеток миеломы, фибробластов, ^Ьа, ΗЕΚ 293, РЕК.С6 и линий клеток, полученных на их основе.
  20. 20. Способ получения поликлонального белка, где указанный поликлональный белок содержит определенные элементы, которые связывают специфический антиген, предусматривающий:
    a) получение линии клеток в соответствии со способом по любому из пп.1-19, содержащей популяцию вариантных последовательностей нуклеиновых кислот, где каждая из указанных последовательностей нуклеиновых кислот кодирует определенный элемент указанного поликлонального белка и где каждая из указанных последовательностей нуклеиновых кислот интегрирована в один и тот же единственный сайт генома каждой отдельной клетки указанной линии клеток;
    b) культивирование указанной линии клеток в условиях, способствующих экспрессии указанного поликлонального белка; и
    c) выделение указанного экспрессированного поликлонального белка из клеток или супернатанта клеточной культуры.
  21. 21. Способ по п.20, где поликлональный белок является гетерологичным по отношению к указанной линии клеток.
  22. 22. Способ по любому из пп.20-21, где популяцию вариантных нуклеиновых кислот стадии (а) выделяют или идентифицируют на более ранней стадии с помощью процедуры скрининга, которая позволяет идентифицировать и/или выделить нуклеиновые кислоты, кодирующие белок, который связывает указанный специфический антиген.
  23. 23. Способ по п.22, где процедура скрининга включает стадию биопэннинга и/или иммунологического анализа.
  24. 24. Способ по п.22 или 23, где указанная процедура скрининга выбрана из группы, состоящей из фагового дисплея, рибосомного дисплея, ДНК дисплея, РНК-пептидного дисплея, ковалентного дисплея, дисплея бактериальной поверхности, дисплея дрожжевой поверхности, дисплея эукариотического вируса, ЕЫ8А и ЕЫ8РОТ.
  25. 25. Способ по любому из пп.20-24, где указанный поликлональный белок представляет собой поликлональное антитело или фрагмент антитела.
  26. 26. Способ по любому из пп.20-24, где указанный поликлональный белок представляет собой поликлональный рецептор Т-клетки или фрагмент рецептора Т-клетки.
  27. 27. Способ по любому из пп.20-26, где во время культивирования указанной линии клеток измеряют относительные уровни экспрессии вариантных последовательностей нуклеиновых кислот.
  28. 28. Способ по п.27, где указанные уровни экспрессии измеряют по уровню мРНК и/или уровню белка.
  29. 29. Способ по п.27 или 28, где культивирование на стадии (Ь) завершают не позднее момента, когда относительные уровни экспрессии окажутся вне заранее определенного диапазона.
  30. 30. Линия клеток, продуцирующая рекомбинантный поликлональный белок, состоящая, по существу, из клеток, трансфицированных библиотекой векторов, включающей совокупность вариантных последовательностей нуклеиновых кислот, где каждая клетка указанной линии трансфицирована одним представителем библиотеки векторов и способна экспрессировать одну определенную последовательность нуклеиновой кислоты, где указанная последовательность нуклеиновой кислоты а) кодирует определенный элемент поликлонального белка, который связывает специфический антиген, Ь) расположена на одном и том же единственном сайте в геноме отдельных клеток указанной линии, и с) не ассоциирована в природе с указанными клетками, составляющими линию.
  31. 31. Линия клеток, продуцирующая рекомбинантный поликлональный белок, по п.30, где указанная библиотека вариантных последовательностей нуклеиновых кислот кодирует поликлональное антитело или фрагмент антитела с природным разнообразием отдельных элементов указанного поликлонального антитела или фрагментов антитела.
  32. 32. Линия клеток, продуцирующая рекомбинантный поликлональный белок, по п.30, где указанная библиотека вариантных последовательностей нуклеиновых кислот кодирует поликлональный рецептор Т-клетки или фрагмент рецептора Т-клетки с природным разнообразием отдельных элементов указанно
    - 39 013225 го поликлонального рецептора Т-клетки или фрагмента рецептора Т-клетки.
  33. 33. Линия клеток, продуцирующая рекомбинантный поликлональный белок, по любому из пп.3032, где указанная линия клеток представляет собой линию клеток млекопитающего.
  34. 34. Линия клеток, продуцирующая рекомбинантный поликлональный белок, по п.33, где указанная линия клеток млекопитающего выбрана из группы, состоящей из клеток яичника китайского хомячка (СНО), клеток С0З, клеток ВНК, ΥΒ2/0, ΝΙ4 3Т3, клеток миеломы, фибробластов, НеЬа, НЕК 293, РЕЯ.С6 и линий клеток, полученных на их основе.
  35. 35. Библиотека векторов для сайт-специфичной интеграции, содержащая совокупность природных вариантных последовательностей нуклеиновых кислот, где каждый из указанных векторов включает 1) одну-единственную копию определенной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей определенный элемент поликлонального белка, содержащего элементы, которые связывают специфический антиген, и 2) одну или несколько последовательностей узнавания рекомбиназы.
  36. 36. Библиотека по п.35, где указанная совокупность природных вариантных последовательностей нуклеиновых кислот кодирует поликлональное антитело или фрагмент антитела.
  37. 37. Библиотека по п.35, где указанная совокупность природных вариантных последовательностей нуклеиновых кислот кодирует поликлональный рецептор Т-клетки или фрагмент рецептора Т-клетки.
  38. 38. Библиотека по любому из пп.35-37, где каждый представитель указанной библиотеки векторов дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую рекомбиназу.
  39. 39. Популяция клеток, содержащая совокупность вариантных последовательностей нуклеиновых кислот, где каждая из указанных последовательностей нуклеиновых кислот кодирует определенный элемент поликлонального белка, содержащего элементы, которые связывают специфический антиген, и где каждая из указанных последовательностей нуклеиновых кислот интегрирована в один и тот же единственный сайт генома каждой отдельной клетки указанной популяции.
  40. 40. Популяция клеток по п.39, где совокупность вариантных последовательностей нуклеиновых кислот входит в состав библиотеки по любому из пп.35-38.
  41. 41. Популяция клеток по п.40, где по меньшей мере 50% кодирующих последовательностей, изначально присутствующих в библиотеке по любому из пп.35-38, могут быть идентифицированы как различные отдельные элементы поликлонального белка, экспрессированного указанной популяцией клеток.
  42. 42. Линия клеток по п.31, экспрессирующая поликлональное антитело, трансфицированная библиотекой пар сегментов генов VII и V., где каждая клетка линии клеток трансфицирована и способна экспрессировать одну пару генов и VI, библиотеки, кодирующую определенный элемент поликлонального антитела, связывающий специфический антиген, и расположенную в одном том же единственном сайте в геноме отдельных клеток указанной линии клеток, где указанная последовательность нуклеиновой кислоты не ассоциирована в природе с указанными клетками.
  43. 43. Линия клеток по п.42, где библиотека пар сегментов генов и VI, представляет собой библиотеку по п.36.
EA200501101A 2003-01-07 2004-01-07 Способ получения линии клеток, продуцирующей рекомбинантный поликлональный белок, способ получения поликлонального белка, линия клеток, продуцирующая рекомбинантный поликлональный белок, библиотека векторов, популяция клеток EA013225B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US43840303P 2003-01-07 2003-01-07
DKPA200300008 2003-01-07
US47601803P 2003-06-05 2003-06-05
PCT/DK2004/000001 WO2004061104A2 (en) 2003-01-07 2004-01-07 Method for manufacturing recombinant polyclonal proteins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200501101A1 EA200501101A1 (ru) 2006-02-24
EA013225B1 true EA013225B1 (ru) 2010-04-30

Family

ID=32718469

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200501101A EA013225B1 (ru) 2003-01-07 2004-01-07 Способ получения линии клеток, продуцирующей рекомбинантный поликлональный белок, способ получения поликлонального белка, линия клеток, продуцирующая рекомбинантный поликлональный белок, библиотека векторов, популяция клеток

Country Status (19)

Country Link
US (1) US9163232B2 (ru)
EP (2) EP1583830B1 (ru)
JP (2) JP4589914B2 (ru)
KR (1) KR101024443B1 (ru)
AT (1) ATE338816T1 (ru)
AU (1) AU2004203727C1 (ru)
BR (1) BRPI0406678A (ru)
CA (1) CA2512647C (ru)
DE (1) DE602004002275T2 (ru)
DK (1) DK1583830T3 (ru)
EA (1) EA013225B1 (ru)
ES (1) ES2273202T3 (ru)
HK (1) HK1078896A1 (ru)
IL (1) IL169101A (ru)
MX (1) MXPA05006724A (ru)
NZ (1) NZ541458A (ru)
PT (1) PT1583830E (ru)
SI (1) SI1583830T1 (ru)
WO (1) WO2004061104A2 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11795579B2 (en) 2017-12-11 2023-10-24 Abalone Bio, Inc. Yeast display of proteins in the periplasmic space

Families Citing this family (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE47770E1 (en) 2002-07-18 2019-12-17 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
PT1523496E (pt) 2002-07-18 2011-09-29 Merus B V Produção de misturas de anticorpos de forma recombinante
WO2004061104A2 (en) 2003-01-07 2004-07-22 Symphogen A/S Method for manufacturing recombinant polyclonal proteins
TWI333977B (en) 2003-09-18 2010-12-01 Symphogen As Method for linking sequences of interest
CA2574062A1 (en) * 2004-07-20 2006-01-26 Symphogen A/S Anti-rhesus d recombinant polyclonal antibody and methods of manufacture
RU2426795C2 (ru) 2004-07-20 2011-08-20 Симфоген А/С Способ структурной характеристики рекомбинантного поликлонального белка или поликлональной клеточной линии
EP1907561B1 (en) * 2005-06-24 2013-08-28 Unigene Laboratories, Inc. Cell lines for expressing enzyme useful in the preparation of amidated products
WO2007065433A2 (en) 2005-12-05 2007-06-14 Symphogen A/S Anti-orthopoxvirus recombinant polyclonal antibody
JP2009528828A (ja) * 2006-03-06 2009-08-13 シムフォゲン・アクティーゼルスカブ 消化器多核体ウイルス感染症の治療のための組み換えポリクローナル抗体
US7504106B2 (en) 2006-03-14 2009-03-17 Boris Skurkovich Method and composition for treatment of renal failure with antibodies and their equivalents as partial or complete replacement for dialysis
FR2910490B1 (fr) * 2006-12-20 2012-10-26 Lab Francais Du Fractionnement Lignee cellulaire a forte activite transcriptionnelle pour la production de proteines, notamment therapeutiques
US9249423B2 (en) 2007-02-02 2016-02-02 Yale University Method of de-differentiating and re-differentiating somatic cells using RNA
US10155038B2 (en) 2007-02-02 2018-12-18 Yale University Cells prepared by transient transfection and methods of use thereof
US8859229B2 (en) * 2007-02-02 2014-10-14 Yale University Transient transfection with RNA
TW200846362A (en) * 2007-02-09 2008-12-01 Symphogen As A polyclonal antibody product
ES2369946T3 (es) 2007-03-01 2011-12-09 Symphogen A/S Procedimiento para clonación de anticuerpos análogos.
NZ578943A (en) 2007-03-01 2012-09-28 Symphogen As Recombinant anti-epidermal growth factor receptor antibody compositions
CA2678628A1 (en) * 2007-03-06 2008-09-12 Symphogen A/S Recombinant antibodies for treatment of respiratory syncytial virus infections
AU2008255383B2 (en) * 2007-05-25 2012-11-01 Symphogen A/S Method for manufacturing a recombinant polyclonal protein
TWI443109B (zh) 2007-08-30 2014-07-01 Daiichi Sankyo Co Ltd 抗ｅｐｈａ２抗體
WO2009046168A1 (en) 2007-10-02 2009-04-09 Avaxia Biologics, Inc. Antibody therapy for use in the digestive tract
SI2206727T1 (sl) 2007-10-11 2015-06-30 Daiichi Sankyo Company, Limited Protitelo, ki cilja osteoklast - soroden protein Siglec-15
US20110117605A1 (en) * 2008-04-23 2011-05-19 Symphogen A/S Methods for Manufacturing a Polyclonal Protein
US8663640B2 (en) 2008-08-29 2014-03-04 Symphogen A/S Methods using recombinant anti-epidermal growth factor receptor antibody compositions
CA2735020A1 (en) * 2008-08-29 2010-03-04 Symphogen A/S Method for cloning avian-derived antibodies
CN106317224B (zh) 2009-04-09 2020-05-12 第一三共株式会社 抗-Siglec-15抗体
ES2547872T3 (es) 2009-10-15 2015-10-09 Avaxia Biologics, Inc. Agentes terapéuticos de anticuerpos con actividad local en el tracto digestivo
ES2675847T3 (es) 2010-10-29 2018-07-13 Daiichi Sankyo Company, Limited Nuevo anticuerpo anti-DR5
DK2635604T3 (en) 2010-11-01 2017-02-27 Symphogen As PAN-HER-ANTIBODY COMPOSITION
JP6092782B2 (ja) * 2010-11-16 2017-03-08 エクセリミューン， インコーポレイテッド 組換えタンパク質の製造方法
PT2703486T (pt) 2011-04-25 2018-05-18 Daiichi Sankyo Co Ltd Anticorpo anti-b7-h3
KR102280111B1 (ko) 2011-12-22 2021-07-21 에프. 호프만-라 로슈 아게 발현 벡터 구성, 신규한 생산 세포 생성 방법 및 폴리펩티드의 재조합 생산을 위한 그의 용도
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
MX2014011826A (es) 2012-03-30 2014-11-21 Daiichi Sankyo Co Ltd Anticuerpo anti-siglec-15 novedoso.
SG11201405966PA (en) 2012-03-30 2014-11-27 Daiichi Sankyo Co Ltd Cdr-modified anti-siglec-15 antibody
JP6188681B2 (ja) 2012-04-09 2017-08-30 第一三共株式会社 抗ｆｇｆｒ２抗体
NZ630568A (en) 2012-04-20 2017-06-30 Merus Nv Methods and means for the production of ch3 domain-comprising molecules
TWI606065B (zh) 2012-04-27 2017-11-21 第一三共股份有限公司 抗ｒｏｂｏ４抗體
MX358728B (es) 2012-05-02 2018-09-03 Symphogen As Composiciones de anticuerpos pan-receptor del factor de crecimiento epidermico humano (pan-her) humanizados.
JP2015163047A (ja) * 2012-06-20 2015-09-10 国立大学法人 東京大学 タンパク質の迅速改良法
CN104736174B (zh) 2012-07-06 2019-06-14 根马布私人有限公司 具有三重突变的二聚体蛋白质
LT2900694T (lt) 2012-09-27 2018-11-12 Merus N.V. Bispecifiniai igg antikūnai kaip t ląstelių aktyvatoriai
JP2016514091A (ja) 2013-02-08 2016-05-19 ミスフォールディング ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド トランスサイレチン抗体およびその使用
CN105849262A (zh) 2013-09-30 2016-08-10 第三共株式会社 抗lps o11抗体
EP3056215B1 (en) 2013-10-08 2019-11-20 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of anti-fgfr2 antibody and other agent
WO2015093925A1 (es) * 2013-12-19 2015-06-25 CASTRO ALDRETE, Jorge Isaac Método de producción de anticuerpos específicos
CA2941030A1 (en) 2014-02-28 2015-09-03 Merus N.V. Antibodies that bind egfr and erbb3
WO2015130173A1 (en) 2014-02-28 2015-09-03 Merus B.V. Antibody that binds erbb-2 and erbb-3
CN107001471B (zh) 2014-09-16 2022-01-18 西福根有限公司 抗met抗体和组合物
EP3273994B1 (en) 2015-03-27 2021-12-01 University of Southern California Car t-cell therapy directed to lhr for the treatment of solid tumors
US10711064B2 (en) 2015-06-04 2020-07-14 University Of Southern California Lym-1 and Lym-2 targeted CAR cell immunotherapy
MX2018000344A (es) 2015-07-10 2018-03-14 Merus Nv Anticuerpo que se une a grupo de diferenciacion 3 (cd3) humano.
EP3352784A4 (en) 2015-09-23 2019-06-26 Cytoimmune Therapeutics, LLC FLT3-FACED CAR CELLS FOR IMMUNOTHERAPY
RU2022108079A (ru) 2015-09-24 2022-04-08 Дайити Санкио Компани, Лимитед Антитело против garp
JP7296728B2 (ja) 2015-10-23 2023-06-23 メルス ナムローゼ フェンノートシャップ 癌の成長を抑制する結合分子
AU2017269115B2 (en) * 2016-05-26 2024-06-20 Qilu Puget Sound Biotherapeutics Corporation Mixtures of antibodies
IL267567B2 (en) 2016-12-22 2024-08-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-CD3 antibody - for use in treating or preventing cancer and molecules containing the antibody
SG11201907321TA (en) 2017-02-07 2019-09-27 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-gprc5d antibody and molecule comprising the antibody
TWI782000B (zh) 2017-03-30 2022-11-01 日商第一三共股份有限公司 抗ｇｐｒ２０抗體、其製造方法及其應用
CN110650752A (zh) 2017-03-31 2020-01-03 美勒斯公司 用于治疗具有NRG1融合基因的细胞的ErbB-2和ErbB3结合双特异性抗体
EP4116328A1 (en) 2017-04-05 2023-01-11 Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co., Ltd. Combination therapies targeting pd-1, tim-3, and lag-3
EP3646885A4 (en) 2017-06-30 2021-04-28 National University Corporation Hokkaido University MEDICINAL PRODUCTS AGAINST OSTEOPOROSIS IN CHILDREN WITHOUT CAUSING GROWTH DISORDERS
EP3660155A4 (en) 2017-07-27 2021-04-07 Daiichi Sankyo Company, Limited ANTI-CD147 ANTIBODY
US11773170B2 (en) 2017-08-09 2023-10-03 Merus N.V. Antibodies that bind EGFR and cMET
BR112020006860A2 (pt) 2017-10-05 2020-10-20 Daiichi Sankyo Company, Limited composição para depleção de células t citotóxicas
CA3093205A1 (en) 2018-03-05 2019-09-12 Saitama Medical University Pharmaceutical composition for treating or preventing heterotopic ossification
CA3099900A1 (en) 2018-05-31 2019-12-05 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-human tlr7 antibody
CA3104390A1 (en) 2018-06-22 2019-12-26 Genmab A/S Method for producing a controlled mixture of two or more different antibodies
WO2020013170A1 (ja) 2018-07-10 2020-01-16 国立大学法人神戸大学 抗ＳＩＲＰα抗体
JP7406488B2 (ja) 2018-07-27 2023-12-27 第一三共株式会社 抗体－薬物コンジュゲートの薬物部位を認識する蛋白質
JPWO2021020282A1 (ru) 2019-07-26 2021-02-04
US20240190961A1 (en) 2019-10-25 2024-06-13 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of anti-garp antibody and immunomodulator
WO2021136835A1 (en) 2019-12-31 2021-07-08 Antagonis Compositions and methods for the prevention of s. aureus infection
CA3177152A1 (en) 2020-06-12 2021-12-16 David Scott Johnson Recombinant polyclonal proteins targeting covid-19 and methods of use thereof
WO2022031834A1 (en) * 2020-08-05 2022-02-10 Gigagen, Inc. Recombinant polyclonal proteins targeting zika and methods of use thereof
US11975066B2 (en) 2020-08-31 2024-05-07 SAB Biotherapeutics, Inc. Ungulate-derived polyclonal immunoglobulin specific for coronavirus protein and uses thereof

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5677177A (en) * 1991-03-08 1997-10-14 The Salk Institute For Biological Studies FLP-mediated gene modification in mammalian cells, and compositions and cells useful therefor
US5789208A (en) * 1994-01-31 1998-08-04 The Trustees Of Boston University Polyclonal antibody libraries
WO1998041645A1 (en) * 1997-03-14 1998-09-24 Idec Pharmaceuticals Corporation Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same
WO2000011155A1 (en) * 1998-08-19 2000-03-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for genomic modification
WO2001089563A1 (en) * 2000-05-26 2001-11-29 Symphogen A/S Recombinant or purified polyclonal antibodies for treating allergy
WO2002044361A2 (en) * 2000-11-28 2002-06-06 Applied Molecular Evolution, Inc. Eukaryotic expression libraries based on double lox recombination and methods of use
WO2002055718A2 (en) * 2000-10-31 2002-07-18 Genetastix Corp Assembly and screening of highly complex and fully human antibody repertoire in yeast

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US155114A (en) * 1874-09-15 Improvement in methods of laying and forming cast-iron pipes
CA1293460C (en) * 1985-10-07 1991-12-24 Brian Lee Sauer Site-specific recombination of dna in yeast
EP0530216A4 (en) 1990-04-19 1993-06-30 Medimmune, Inc. Administration of monoclonal antibodies against respiratory viruses
GB9022543D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Antibody production
US6111166A (en) 1994-09-19 2000-08-29 Medarex, Incorporated Transgenic mice expressing human Fcα and β receptors
GB9703369D0 (en) 1997-02-18 1997-04-09 Lindqvist Bjorn H Process
US6368821B1 (en) 1997-04-14 2002-04-09 Stratagene Process for infecting eukaryotic cells with a bacterial virus
US20020155114A1 (en) 1998-08-31 2002-10-24 James D. Marks Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins
WO2001005961A1 (en) 1999-07-14 2001-01-25 Clontech Laboratories, Inc. Recombinase-based methods for producing expression vectors and compositions for use in practicing the same
CA2379115C (en) 1999-07-23 2011-04-26 The Regents Of The University Of California Dna recombination in eukaryotic cells by the bacteriophage phic31 recombination system
US20040038392A1 (en) 2000-06-08 2004-02-26 Tatsurou Shibui Expression vector enabling screening of cells with high expression of recombinant protein, transformant with high expression of recombinant protein and utilization thereof
US6849259B2 (en) 2000-06-16 2005-02-01 Symphogen A/S Polyclonal antibody composition for treating allergy
US20030044398A1 (en) 2001-03-20 2003-03-06 Robl James M. Methods for producing antibodies in mammals
PT1523496E (pt) 2002-07-18 2011-09-29 Merus B V Produção de misturas de anticorpos de forma recombinante
US20040115814A1 (en) 2002-09-30 2004-06-17 Protein Design Labs, Inc. Efficient generation of stable expression cell lines through the use of scorable homeostatic reporter genes
WO2004061104A2 (en) 2003-01-07 2004-07-22 Symphogen A/S Method for manufacturing recombinant polyclonal proteins
US20060275766A1 (en) 2003-01-07 2006-12-07 Haurum John S Method for manufacturing recombinant polyclonal proteins
TWI333977B (en) 2003-09-18 2010-12-01 Symphogen As Method for linking sequences of interest
CA2553731A1 (en) 2004-01-21 2005-08-04 Novozymes A/S Production of a monoclonal antibody in a heterokaryon fungus or in a fungal host cell
RU2426795C2 (ru) 2004-07-20 2011-08-20 Симфоген А/С Способ структурной характеристики рекомбинантного поликлонального белка или поликлональной клеточной линии
CA2574062A1 (en) 2004-07-20 2006-01-26 Symphogen A/S Anti-rhesus d recombinant polyclonal antibody and methods of manufacture
WO2007065433A2 (en) 2005-12-05 2007-06-14 Symphogen A/S Anti-orthopoxvirus recombinant polyclonal antibody
JP2009528828A (ja) 2006-03-06 2009-08-13 シムフォゲン・アクティーゼルスカブ 消化器多核体ウイルス感染症の治療のための組み換えポリクローナル抗体
TW200846362A (en) 2007-02-09 2008-12-01 Symphogen As A polyclonal antibody product
AU2008255383B2 (en) 2007-05-25 2012-11-01 Symphogen A/S Method for manufacturing a recombinant polyclonal protein

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5677177A (en) * 1991-03-08 1997-10-14 The Salk Institute For Biological Studies FLP-mediated gene modification in mammalian cells, and compositions and cells useful therefor
US5789208A (en) * 1994-01-31 1998-08-04 The Trustees Of Boston University Polyclonal antibody libraries
WO1998041645A1 (en) * 1997-03-14 1998-09-24 Idec Pharmaceuticals Corporation Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same
WO2000011155A1 (en) * 1998-08-19 2000-03-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for genomic modification
WO2001089563A1 (en) * 2000-05-26 2001-11-29 Symphogen A/S Recombinant or purified polyclonal antibodies for treating allergy
WO2002055718A2 (en) * 2000-10-31 2002-07-18 Genetastix Corp Assembly and screening of highly complex and fully human antibody repertoire in yeast
WO2002044361A2 (en) * 2000-11-28 2002-06-06 Applied Molecular Evolution, Inc. Eukaryotic expression libraries based on double lox recombination and methods of use

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SODERLIND E. ET AL.: "Recombining germline-derived CDR sequences for creating diverse single-framework antibody libraries", NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 18, no. 8, August 2000 (2000-08), pages 852-856, XP002242392, ISSN: 1087-0156, cited in the application, the whole document *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11795579B2 (en) 2017-12-11 2023-10-24 Abalone Bio, Inc. Yeast display of proteins in the periplasmic space

Also Published As

Publication number Publication date
US9163232B2 (en) 2015-10-20
DE602004002275D1 (de) 2006-10-19
EA200501101A1 (ru) 2006-02-24
US20090136498A1 (en) 2009-05-28
PT1583830E (pt) 2006-11-30
AU2004203727C1 (en) 2008-08-21
KR20050101538A (ko) 2005-10-24
MXPA05006724A (es) 2005-09-08
KR101024443B1 (ko) 2011-03-23
CA2512647A1 (en) 2004-07-22
DE602004002275T2 (de) 2007-09-06
WO2004061104A2 (en) 2004-07-22
SI1583830T1 (sl) 2006-12-31
AU2004203727B2 (en) 2008-01-31
EP1762617A1 (en) 2007-03-14
HK1078896A1 (en) 2006-03-24
BRPI0406678A (pt) 2005-12-20
WO2004061104A3 (en) 2004-11-04
ES2273202T3 (es) 2007-05-01
IL169101A (en) 2009-02-11
AU2004203727A1 (en) 2004-07-22
NZ541458A (en) 2006-04-28
JP2006515520A (ja) 2006-06-01
ATE338816T1 (de) 2006-09-15
JP4589914B2 (ja) 2010-12-01
EP1583830A2 (en) 2005-10-12
EP1583830B1 (en) 2006-09-06
DK1583830T3 (da) 2007-01-15
JP2010268806A (ja) 2010-12-02
CA2512647C (en) 2013-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA013225B1 (ru) Способ получения линии клеток, продуцирующей рекомбинантный поликлональный белок, способ получения поликлонального белка, линия клеток, продуцирующая рекомбинантный поликлональный белок, библиотека векторов, популяция клеток
EP2152872B1 (en) Method for manufacturing a recombinant polyclonal protein
US8198415B2 (en) Anti-rhesus D recombinant polyclonal antibody
US20110117605A1 (en) Methods for Manufacturing a Polyclonal Protein
US20060275766A1 (en) Method for manufacturing recombinant polyclonal proteins
RU2801178C1 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА IGA2m1-ИЗОТИПА В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
AU2008201796A1 (en) Method for manufacturing recombinant polyclonal proteins

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU