JP2006515520A - 組換え型ポリクローナルタンパク質の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、さまざまな感染症、炎症性疾患、移植片拒絶、癌及びアレルギーの治療、改善又は予防における新規の療法として使用するべき、例えば可溶性又は膜結合形態のB又はT細胞レセプタなどの免疫グロブリンスーパーファミリー由来のタンパク質といったような、組換え型ポリクローナルタンパク質を生産するための技術的基盤の基礎を成すものである。
数多くの感染性疾患及び癌には、効率の良い療法が欠如している。モノクローナル抗体認識からの免疫学的回避をひき起こす複合標的の可変性および標的タンパク質の適応突然変異を一部の原因として、モノクローナル抗体はこれらの標的に対して一般に成功をおさめていない。一方、ポリクローナル抗体は、例えばウイルス又は癌細胞上で複数の動的標的をターゲティングすることができる。同様に、ポリクローナル抗体は、抗原突然変異の場合に活性を保持する最高の確率を有している。
ネイチャーバイオテクノロジー(Nature Biotechnology;2002;20:889−893))。しかしながら、かかる動物の血液から療法用のポリクローナル抗体を産生することには、複雑さが伴う。まず第1に、動物及びヒトの免疫生理は、著しい差異を示し、これが結果としての免疫レパートリ、機能的再配置及び抗体応答の多様性の差異をひき起こし得る。第2に、導入された免疫グロブリン遺伝子座の分裂不安定性が抗体の長期産生に影響を及ぼし得る。第3に、例えば動物抗体産生がヒト抗体の産生を上回らないように動物自身の免疫グロブリンを欠失させることは、技術的に難しいことである。第4に、ウイルス、プリオン又はその他の病原体といった感染物質の伝染の危険性が、動物の体内で産生されたヒト抗体の投与に随伴する。
「タンパク質」又は「ポリペプチド」というのは、長さ又は翻訳後の修飾の如何に関わらず、あらゆるアミノ酸鎖を意味する。タンパク質は、2つ以上の組合わされたポリペプチド鎖、タンパク質フラグメント、ポリペプチド、オリゴペプチド又はペプチドを含む単量体又は多量体として存在し得る。
本発明は、好ましくは免疫グロブリン様ドメインを伴うタンパク質ファミリーである免疫グロブリンスーパーファミリーから選択される組換え型ポリクローナルタンパク質の一貫性ある製造のための方法を提供する。成員の大部分は、細胞表面認識事象に関与する。配列相同性は、抗体、T細胞レセプタ、MHC分子、一部の細胞付着分子及びサイトカインレセプタが密な相同性を共有することを示唆する。特に、可変領域を含むこのファミリーの成員が、本発明に従った組換え型ポリクローナルタンパク質の生成に適している。かかる成員には、抗体、膜結合抗体(B細胞レセプタ)、Fabフラグメント、Fvフラグメント、一本鎖Fv(scFv)フラグメント、T細胞レセプタ(TcRs)、可溶性TcRs、TcR可変ドメインフラグメント、ポリペプチドリンカーによりリンクされたTcR可変ドメインフラグメント又はその他の抗体又はTcR由来のフラグメントが含まれる。特に、本発明は、組換え型治療用ポリクローナル抗体又はTcRsを含む新しい種類の治療薬を大規模に製造及び生産する可能性を開くことになると考えられる。
ポリクローナルタンパク質の特徴の1つは、各々のタンパク質分子が該ポリクローナルタンパク質のその他の分子と相同であるものの該ポリクローナルタンパク質の個別成員間のアミノ酸配列の差異により特徴づけされる可変性をも有している、一定数の個別のタンパク質分子によりそれが構成されているという点にある。好ましくは、差異は、ポリクローナルタンパク質の全体的構造の別個の部域に限定される。かかる部域は、例えば抗体又はTcRの可変領域であり、場合によってはさらにこれらの部域内のCDR領域に限定される。この可変性は同様に、核酸レベルならびにタンパク質の機能レベル、例えば標的に向かっての特異性及び親和力の差異の両方で同定可能な多様性としても表現できる。
適切な宿主細胞は、そのゲノムの1領域の中に、1つ以上の適切な組換え部位、すなわち1つ以上のリコンビナーゼ酵素により認識可能な核酸配列を含む。組込み体(すなわち組込み部位内に問題の核酸配列の組込まれたコピーを有する細胞)について選択する能力を有するために、組換え部位は、それに対し3’のところにある第1の選択遺伝子(例えば抗生物質耐性遺伝子)に操作可能な形でリンクされる。さらに、耐性マーカーコーディング領域の一部を成す組換え部位に対し5’のところに、弱いプロモーター(例えば切形SV40早期プロモーター)及び転写開始コドンが位置づけされ得る。かくして、転写開始コドンは、ポリクローナルタンパク質をコードする発現ベクターのライブラリーでのトランスフェクションの前に宿主細胞内の選択遺伝子の転写開始を先導する。
適切なベクターは、宿主細胞の構築のために用いられる選択遺伝子とは異なる適切な選択遺伝子にリンクされた適切な組換え部位を含む。哺乳動物細胞発現において使用するための適切な選択遺伝子には、栄養選択を可能にする遺伝子、例えばチミジンキナーゼ遺伝子(TK)、グルタミンシンセターゼ遺伝子(GS)、トリプトファンシンターゼ遺伝子(trpB)又はヒスチジノールジヒドロゲナーゼ遺伝子(hisD)が含まれるが、これらに制限されるわけではない。さらに、選択マーカーは、薬物耐性を付与する代謝拮抗剤耐性遺伝子、例えば、ヒポキサンチン及びチミジン欠損培地で選択可能でありさらにはメトトレキセートで選択可能であるジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子(dhfr)、マイコフェノール酸で選択可能であるキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、真核細胞内のG418又は原核細胞内のネオマイシン又はカナマイシンで選択可能なネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(neo)、ハイグロマイシンで選択可能であるハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ(hyg、hph、hpt)遺伝子、ピューロマイシンで選択可能であるピューロマイシンN−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子(pac)又はブラスチシジンで選択可能であるブラスチシジンSデアミナーゼ遺伝子(Bsd)である。最後に、緑色蛍光タンパク質(GFP)、神経成長因子レセプタ(NGFR)又はその他の膜タンパク質又はベータ−ガラクトシダーゼ(LacZ)といったような、例えばフローサイトメトリによる選別を可能にするタンパク質をコードする遺伝子も、選択マーカーとして使用可能である。
1つの細胞内に核酸配列を導入するための方法は、当該技術分野において既知である。これらの方法は、標準的に、細胞、ゲノム又は外部染色体要素内に問題の配列を導入するためのDNAベクターの使用を含んでいる。細胞のトランスフェクションは、リン酸カルシウム沈降、電気穿孔法、マイクロインジェクション、リポゾーム融合、RBCゴースト融合、原形質融合などを含めた、当業者にとって既知の一定数の方法によって達成され得る。
本発明に従うと、ポリクローナル性が実際に改変された時点で産生を停止させることが可能であるような形で、産生中に発現系内のポリクローン性が重大な改変を受けないように保証することが往々にして重要である。これは、変異体核酸配列の相対的発現レベルを監視することによって本発明に従って行なわれる。発現レベルは例えば、RFLP分析、アレイ又はリアルタイムPCRなどを用いてmRNAレベルで、又は2次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動、質量分析法又はさまざまなクロマトグラフィ技術を用いてタンパク質レベルで、監視可能である。これらの技術を用いて、一定数の個別発現レベル全てについて基準値を確立し、その後、発現レベルが(合計して及び相対的にの両方で)変化したか否かを評価するべく産生中培養から試料を取り出すことが可能となる。発明の通常の実践においては、基準値をとり囲む値の範囲を確立することができ、相対的発現レベルがその範囲外にあることがわかった場合には、産生は終結される。
関連するクローンを同定するため、ファージ提示及びELISAを用いてオボアルブミン結合ファージクローンを選択した。オボアルブミン結合クローンから抗体を同定するために、2つの構成すなわち、オボアルブミンでコーティングされたELISAプレート又はPVDF膜上のオボアルブミンの固定化に基づく高密度スクリーニング方法(HDS)を使用した。この要領で、一群の抗体が得られ、その一部分は、ELISAプレート上で固定化されたオボアルブミンを認識し、その他はPVDF膜上に固定化されたオボアルブミンを認識する。
上述の通りに産生されたポリクローナル細胞系統は、細胞のゲノム内に挿入された変異体核酸配列によりコードされた問題のポリクローナルタンパク質を発現するのに適した条件下で適切な培地内で成長させられる。細胞培養は、複数のステップで実施可能である。第1のステップは、部位特異的の組込み体についてポリクローナル細胞系統が選択されるステップである。哺乳動物細胞を使用する場合、選択された細胞は次に好ましくは懸濁状態での成長ならびに無血清条件に適合される。これは、1ステップ又は2ステップで、選択圧を用いて又は用いずに実施可能である。ポリクローナル細胞系統が適切な条件に適合された時点で、スケールアップを開始することができる。この時点で、作業用細胞ストックを凍結させることができる。好ましくは30〜100リットルの間の生物反応器が用いられるが、それより小さい又は大きい生物反応器を利用してもよい。適切な生産時間及び生物反応器サイズの選択は、バッチからのタンパク質の所望の収率及び細胞系統からの発現レベルによって左右される。時間は、数日から3ヵ月まで変動し得る。発現された組換え型ポリクローナルタンパク質は、細胞又は上清から単離される。組換え型タンパク質は、当業者により既知の手順に従って特徴づけされる。精製及び特徴づけ手順の例が以下で列挙されている。
培養上清からの特定のタンパク質の単離は、タンパク質の物理化学特性の差、例えば分子量、正味電荷、疎水性又は特定のリガンド又はタンパク質に向かう親和力の差を利用するさまざまなクロマトグラフィ技術を用いて可能である。かくして、ゲルろ過クロマトグラフィを用いて分子量に従って、又は、イオン交換(カチオン/アニオン)クロマトグラフィを用いて又代替的にはクロマトフォーカシングを用いて正味電荷に従ってタンパク質を分離することができる。同様にして、特定の固定化されたリガンド又はタンパク質に向かう親和力の差を利用するアフィニティクロマトグラフィ又は疎水性相互作用クロマトグラフィを用いて、疎水性に従ってタンパク質を分離することもできる。タンパク質の複合混合物の分離は、かくして、さまざまなクロマトグラフィ原理の逐次的組合せによって達成可能である。かくして、イオン交換クロマトグラフィを用いて例えば正味電荷に従ってタンパク質の混合物を最初に分離し、これに続いて、ゲルろ過クロマトグラフィを用いて分子量に従って又は、選択された高濃度の塩の存在下で疎水性相互反応クロマトグラフィを用いて疎水性に従って、類似の正味電荷のタンパク質を分離することができる。
抗体及びTcRといったポリクローナルタンパク質の構造的特徴づけには、混合物の複雑性に起因して高い分解能が必要となる(クローン多様性及びグリコシル化)。ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィ又は電気泳動といったような従来のアプローチは、個別抗体の間で弁別するのに充分な分解能を有していない可能性がある。複合タンパク質混合物のプロファイリングのためには2次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(2D−PAGE)が使用されてきており、その後に、質量分析法(MS)又は液体クロマトグラフィ(LC)−MS(例えばプロテオミクス)が行なわれた。タンパク質の電荷及び質量に基づく分離を組合せた2D−PAGEが、血清試料中のポリクローナル、オリゴクローナル及びモノクローナル免疫グロブリンの間での弁別のために有用であることが立証された。しかしながら、この方法には、いくつかの制限がある。クロマトグラフィ技術、特にエレクトロスプレーイオン化MSにカップリングされた毛管及びLCクロマトグラフィは、複合ペプチド混合物の分析のために応用されることが増々多くなってきている。LC−MSはモノクローナル抗体の特徴づけのために使用されてきており、最近はポリクローナル抗体軽鎖のプロファイリングにも使用されている。非常に複雑な試料の分析は、2次元(又はそれ以上)での分離により得ることのできるクロマトグラフィシステムのより高い分解能を必要とする。かかるアプローチは、第1の次元ではイオン交換に基づき、任意にはMSにカップリングされた第2の次元では逆相クロマトグラフィ(又は疎水性相互作用)に基づくものである可能性がある。
ポリクローナルタンパク質は、例えば、同じ標的に向かっての特異性又は類似の活性をもつポリクローナルタンパク質との比較可能性研究を通して機能的に特徴づけすることができる。かかる研究は、インビトロでもインビボでも実施可能である。
本発明の一実施形態においては、その活性成分として免疫グロブリンスーパーファミリーから選択された組換え型ポリクローナルタンパク質を含む医薬組成物は、癌、感染症、炎症性疾患、アレルギー、喘息及びその他の呼吸器疾患、自己免疫疾患、免疫機能不全、心臓血管疾患、中枢神経系疾患、代謝及び内分泌疾患、移植片拒絶及び望まれない妊娠といったような哺乳動物の疾病の治療及び予防用に意図されている。該哺乳動物は、好ましくは、ヒト、家畜又はペットである。
本発明に従った医薬組成物は、哺乳動物における疾病の治療、改善又は予防用に使用可能である。当該医薬組成物で治療できる疾病としては、癌、感染性疾患、炎症性疾患、アレルギー、喘息及びその他の呼吸器疾患、自己免疫疾患、心臓血管疾患、中枢神経系疾患、代謝及び内分泌疾患、移植片拒絶及び望まれない妊娠が含まれる。
発明のもう1つの実施形態は、診断用キット及び環境検出用途向けキットならびにこれらのキットの使用方法に向けられている。本発明に従ったキットは、検出可能な標識で標識されているか又は非標識検出用に標識されていない本発明に従って調製された組換え型ポリクローナルタンパク質を含んでいる。標識されている場合、当該組換え型ポリクローナルタンパク質は、標的分子を含有している疑いのある試料に対し添加され得、該標識の有無が標的分子の有無を表わす。テストされるべき試料は、血液、血清、血漿、髄液、リンパ又は尿といったような体液の試料又は汚染物質が隠れている疑いのある環境供給源からの試料といった哺乳動物以外の試料であり得る。哺乳動物以外の試料は、水、空気又は汚染土であり得る。非標識検出は、標的分子を捕捉するために組換え型ポリクローナルタンパク質が使用される、結合時点でのBIA coreの屈折変化の測定を包含する。
部位特異的組込み対無作為組込み
以下のトランスフェクション実験のためには、CHOFlp−In−細胞(インビトロジェン(Invitrogen)、カリフォルニア州、カールスバッド)が使用された。リポータ遺伝子としてヒト分泌アルカリホスファターゼ(SEAP)を用いて、系の効率をテストした。次の2つのプラスミド構築物を調製した:
1.pcDNA3.1 hygro+(インビトロジェン(Invitrogen)、カリフォルニア州、カールスバッド)内に挿入されたSEAP(無作為組込み用)。
2.pcDNA5/FRT(インビトロジェン(Invitrogen)、カリフォルニア州、カールスバッド)内に挿入されたSEAP(部位特異的組込み用)。
宿主細胞内の部位特異的組込みのための発現ベクターの設計と調製
宿主細胞のホットスポット染色体領域内への部位特異的組込みに適した、以下のDNA要素を含む発現ベクターを、組立てることができる:
b)pUC複製開始点、
c)アンピシリン耐性遺伝子(bla)
d)アンピシリン(bla)耐性遺伝子の発現を可能にするbla−プロモーター、
e)問題のタンパク質をコードする遺伝子(単複)(GOI)、
f)GOIの発現を可能にするプロモーター(単複);及び
g)任意には、組込み部位又はIRESにおける発現を増大するための、エンハンサ又はUCOEといった付加的な転写又は翻訳調節要素。
開発された製造系内でのポリクローナル性保存の評価
製造系の安定性及び再現性を評価できるようにするため、既知の組合せでの別個の抗体のポリクローナル組成物を発現する細胞系統を調製した。該ポリクローナル抗体組成物は、ミニシックス組成物と呼ばれた。ミニシックス組成物をコードする核酸配列ライブラリーは、ミニシックスライブラリーと呼ばれた。
この実施例では、抗原1〜6に対する反応性をもつFabフラグメント(問題の遺伝子)をコードする以下の配列を使用した:
1.オボアルブミン(OVA)。Fabコーディングフラグメントは、マウス抗−OVAファージ提示ライブラリーから選択された。
2.アルカリホスファターゼ(AP)。Fabコーディングフラグメントは、マウス抗APファージ提示ライブラリーから選択された。
3.β2−ミクログロブリン(β2m)。Fabコーディングフラグメントは、β2mに対して生成されたハイブリドーマBBM.1(デンマークのL.φ、ペデルセン(Pedersen)博士から寄贈されたもの)からクローニングされた。
4.ヒトハプトグロブリン(HAP)、Fabコーディングフラグメントは、マウス抗ヒトハプトグロビンファージ提示ライブラリーから選択された。
5.第VIII因子(FVIII)。このFabフラグメントの親モノクローナル抗体は、FVIIIF25モノクローナル抗体(デンマーク、ノボノルディスク(Novo Nordiskから寄贈されたもの)であった。このFabフラグメントのVH及び完全カッパ鎖をコードするDNAは、ファージミドへとサブクローニングされ、その後、原核性プロモーターカセットが構築物内に挿入された。
6.ニワトリ卵白リゾチーム(LYS)。この構築物は、VH及びVKフラグメントのPCR増幅及びファージミドへのクローニングによって、D1.3scFvクローン(ブロット(Boulot)G.ら、J.Mol.Bio.,213(4)(1990)617−619)から生成された。
Fabフラグメントの重鎖をコードするヌクレオチド配列を以下のようにRFLPによって分析した;NlaIII及びHinfI酵素でのPCRで生成されたフラグメントの消化の後に得られたバンドパターンを検討した。異なるFabフラグメントコーディング配列は非常に異なる容易に区別可能なパターンを示した。VH及びVLフラグメントをコードするヌクレオチド配列を配列決定し、RFLPパターンに対応する配列を発見した。さらに、ヌクレオチド配列は、読取り枠をコードし、明確なポリペプチドに翻訳した。
クローンから発現されたFabフラグメントを、ELISAを用いて分析し、この中で、全てのFabフラグメントを全ての抗原との反応性について分析した。抗カッパELISAを用いてFab発現を監視した。ELISA内では、全てのFabフラグメントを、デュプリケートでテストした。全てのクローンはFabフラグメントを発現し、Fabフラグメントはその関連する抗原と特異的に反応した。ELISA分析においては、いかなるバックグラウンド問題も見られなかった。
関連する抗原に対する発現されたFabフラグメントの反応性をテストすることにより、6つの選択されたFab発現クローン(抗−OVA、抗−AP、抗−β2m、抗−HAP、抗−FVIII、及び抗−LYS)を特徴づけした。これらのクローンは、既知の組合せでの6つの別個の抗体(ミニシックス組成物)の発現及び産生をテストするためのポリクローナルモデル系の一部を成していた。ヌクレオチド配列をコードする全てのFabフラグメント(ミニシックスライブラリー)をファージミドベクター(pSymvc10により例示されているもの、図4A)内に移送した。
ファージミドベクターから哺乳動物発現用ベクターへの問題の遺伝子(ミニシックスライブラリー)の移送は、この例では、2ステップ手順によって実施された。第1のステップは、頭−頭方向性で哺乳動物プロモーターカセットで原核性プロモーターを置換することにあった。このステップの後、以下で詳述された図4に例示されているように、GOIの可変領域、プロモーターカセット及び定常のカッパが発現ベクターに移送された。
ファージミドベクター内に位置設定され6つの別個のFabフラグメント(抗OVA、抗AP、抗−β2m、抗HAP、抗−FVIII及び抗−LYS)についてコードするGOI(ミニシックスライブラリー)(ここではEcoRI/NotIフラグメント)を、6つのベクター構築物の混合物として哺乳動物発現用ベクター内にまとめて移送し、結果として6つの別個の発現ベクターをもたらした。
プラスミド調製物1は、(抗体コーディング配列がベクターpSymvc10内に含まれている状態で)6つのファージミドベクターの混合物のプラスミド調製物を意味する。
TG1細胞を、まとめて電気穿孔によってミニシックスライブラリーで形質転換させ、2xYT(SigmaY2627)プレート上での一晩のインキュベーションの後、個別コロニーを採集した。各々の実験において、180のコロニーを採集し、2xYT液体培地内で4時間、96ウェルのフォーマットでインキュベートした。培養のアリコートを水で希釈し、変性させ、PCR内で鋳型として使用した。全ての実験において、可変重鎖を増幅した。ファージミドベクター(pSymvc10−型)のプライマ配列は、以下のとおりであった:
5’−GCATTGACAGGAGGTTGAGGC−3’(配列番号2)及び5’−GCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTC−3’(配列番号3)
5’−GCATTGACAGGAGGTTGAGGC−3’(配列番号4)及び5’−GTGTCCACTCTGAGGTTCAG−3’(配列番号5)
5’−CAAATAGCCCTTGACCAGGC−3’(配列番号6)及び5’−GTGTCCACTCTGAGGTTCAG−3’(配列番号7)。
プラスミド調製物1を、ミニシックスライブラリーを構成する6つのファージミドベクターのうちの1つを含む6つのE.coliTG1グリセロールストックの各々から調製した。ストックを個別に調製し、E.coliの数についてのOD600正規化の後、6つの培養を等量で混合し、プラスミド調製のために使用して結果としてプラスミド調製物1を得た。エレクトロコンピテントTG1細胞への形質転換及びその後のRFLP分析によって、プラスミド調製物1内の6つのファージミドベクターの遺伝子型分布をテストした。TG1細胞内の異なる遺伝子型の分布は図5に示されている。
6つの選択されたFabフラグメント遺伝子型の等しい混合物を発現するポリクローナルファージミドベクター(pSymvc10)を含むプラスミド調製物1からのDNA(ここでは25μgを使用)を、プロモーターの交換のためSacI/XhoIで消化させた。SacI/XhoIベクターフラグメントを精製し、頭−頭プロモーターカセット(CMVプロモーター/MPSVプロモーター)と連結させた。いかなる増幅も実施せずにプロモーターを交換した後、CMV/MPSVプロモーターカセットを伴うベクターを、大量移送用ファージミドベクターから哺乳動物発現用ベクターへと、プロモーターカセット及び全カッパ鎖コーディング配列を含めた可変重鎖コーディング配列で全領域を切取るためにNotI/EcoRIで消化させた。可変重鎖、プロモーターカセット及びカッパ鎖をコードするNotI/EcoRIフラグメントをマウスIgG1−コーディングベクター(pSymvc20)内に連結させた後、マウスIgG1全長抗体という状況下で6つの選択されたクローンの可変領域を発現する発現ベクターを獲得した。この発現ベクターの組成は、図1に例示されている。
2ステップ増幅方法又は1ステップ増幅方法のいずれかからのミニシックスライブラリーのプラスミド調製物からの産物を、組換え型ポリクローナル抗体発現のために哺乳動物細胞をまとめてトランスフェクションすることに直接使用することができる。
ミニシックスポリクローナルモデル系の既知の抗体組合せを使用してテストを行ない、哺乳動物細胞内への大量移送及びトランスフェクションを、クローン多様性を維持するような形でかつトランスフェクション及びその後の培養中の抗体可変配列遺伝子型の組成に偏向を導入することなく確実に発生させることができる。大量移送、バルクトランスフェクション及び哺乳動物発現のプロセス全体を通して遺伝子型組成を監視する方法には、以下のものが含まれ得る:
−単離されたクローンのDNA配列決定、
−個別クローンのRFLP分析、
−産生された抗体混合物のELISA、
−産生された抗体混合物の質量分析、
−異なる重鎖及び軽鎖を発現するmRNA及びゲノム配列の相対的組成物のTaqmanPCR。
一般に可変増殖速度を最小限におさえるためには、各々の特異的GOI(この場合は、ミニシックスライブラリーの各々の個別成員)を少なくとも100、好ましくは1000そして最も好ましくは10000個の細胞内に組込むことが好ましい。全てのGOIについて同じGOIを発現する多数の個別細胞を含むポリクローナル細胞系統が、個別細胞の増殖速度差により受ける影響がより少なく、最終的ポリクローナルタンパク質組成の偏向の可能性が低いということが、統計的に予想されている。
グルタミン(2mM)及びFCS(10%)及び100μg/mlのゼオシン(インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド)を添加しながら、ハムのF−12培地内にCHO−Flp−In 宿主細胞系統(インビトロジェン、カリフォルニア州、カールスバッド)を維持した。サブクローニングのためには、細胞をトリプシンで離脱させ、メーカーの指示に従って分割させた。細胞を37℃、5%CO2で成長させた。培地及び培地添加剤は、ギブコ(Gibco)製のものであった。
6つのウェルを伴う組織培養プレートに、4.0×105個のCHO−Flp−In細胞/ウェルを接種し、これらのプレートを37℃/5%CO2でO/Nインキュベートした。メーカーの指示に従い、FuGENETM6(ロッシュ(Roche))、LipofectineTM、LipofectAminTM、又はLipofect AMINE2000TM(ジブコ(Gibco))を用いて異なるTFN方法をテストして、これらの細胞のトランスフェクションを実施した。この例では、トランスフェクション試薬としてLipofectAMINE2000TMを使用した。簡単に言うと、トランスフェクションの前日に、上述のとおりに、指数増殖するCHO−Flp−In細胞を播種し、37℃/5%CO2でO/Nインキュベートした。同時トランスフェクションのために、85〜95%の細胞集密度をもつウェルを使用した。
チューブ1: (d.1)で記載されているGOIを伴う個別の発現ベクター0.5μg(例えばOVAを伴うpSymvc21)+4.5μgのmp040(pOG44のマキシプレップ)(リコンビナーゼFlpを発現するプラスミド)を、250μlのOptimem(1.5mlのエッペンドルフ管)に添加した。
2〜3週間ハイグロマイシンB選択圧下で細胞を培養し、この期間中、2−4日毎に同じ濃度の選択用作用物質を含有する新しい培地で細胞をリフレッシュした。T−25フラスコ及びペトリ皿内の生き延びた細胞プールをトリプシンにより離脱させ、(1:6)で分割させ、上述の選択圧下でのさらなる増殖のためT−フラスコに分配した。(d.1)に記載された方法に従って生成された形質転換体を含有するペトリ皿から(いわゆるクローニングシリンダを用いて)いくつかの単一クローンを採集し、増殖及び発現レベル研究用に新しいウェルに移送した。
発現ベクター内にある6つの選択された問題の遺伝子の混合物を生成しその後バルクトランスフェクション及びCHO−Flp−In細胞内への部位特異的組込みを行なうことにより、6つの別個の抗体を発現するポリクローナル細胞系統を生成した。
ポリクローナルCHO−Flp−In細胞系統をトリプシン処理し、細胞懸濁液を10個の細胞/mlまで希釈させた。その後、合計10枚の96ウェルプレートの各ウェルに200μlを移送した。約10日後、単一コロニーをもつウェルを顕微鏡検査により同定した。単一コロニーを伴うウェルをPBS中で1回洗浄し、50μlの水を添加した。プレートを10分間80℃でインキュベートし、溶解物をもう1つの96ウェルプレートに移した。10μlの溶解物を、以下のプライマと共に25μlのOneStep RT−PCR(キアゲン(Qiagen))中で使用した。
5’−CAAATAGCCCTTGACCAGGC−3’(配列番号6)及び
5’−GTGTCCACTCTGAGGTTCAG−3’(配列番号7)
ポリクローナルCHO−Flp−In細胞系統(e.3)をトリプシン処理し、T−75フラスコ内でF−12HAM+10%FCS+2mMのL−グルタミン及び900μgのハイグロマイシン中で、3×106個の細胞をプレート固定した。培地を毎日変え、3日目にELISAのために上清を選択した。50mMの炭酸塩緩衝液中で10μg/mlに至るまで、抗原(β−ミクログロブリン)(コペンハーゲン大学から寄贈されたもの)、アルカリホスファターゼ(シグマ(Sigma))、オボアルブミン(シグマ)、第VIII因子(デンマークのノボノルディスク(Novo Nordisk)より寄贈されたもの)、ニワトリ卵白リゾチーム(シグマ)及びハプトグロピン(シグマ))を希釈させた。ELISAプレートに抗原(各ウェルに50μl)をコーティングし、4℃でO/Nインキュベートした。洗浄用緩衝液(1×PBS/0.05%のツィーン(Tween)20)で4回ウェルを洗浄し、洗浄用緩衝液(各ウェルに対し100μl)中2%のスキムミルク粉末で1時間遮断した。ウェルに50μlの試料を添加し、プレートをRTで1時間インキュベートした。プレートを4回洗浄し、1時間二次抗体(ヤギ抗マウスIgG/HRP接合体(シグマ))を添加し、ひき続き4回洗浄した。ELISAをTMB基質(各ウェル中50μl、DAKO S1600)で5分間展開させ、1MのH2SO450μlを添加することにより、反応を停止させた。プレートを450nmで直ちに読みとった。問題の6つの遺伝子をコードする発現ベクターの混合物でのトランスフェクション後34日目に誘導された溶解物中での6つの問題の抗体全ての発現を実証するデータが、図10に示されている。図10に提示されているデータは6つの異なる抗原特異的ELISA検定から誘導されていることから、OD450の読取り値は抗体の数量に関し直接比較可能ではないということを指摘すべきである。
まず第1に、製造系におけるポリクローン性の保存についてのこれらの評価(試験)は、ファージミドベクターから哺乳動物発現ベクターへの(抗OVA、抗AP、抗β2m、抗HAP、抗−FVIII、及び抗LYSをコーディングする)ミニシックスライブラリーからの6つの選択された問題の遺伝子の大量移送が、選択又は増殖偏向の導入なく可能であり(図7)、かくして、6つの選択された問題の遺伝子に関して匹敵する頻度で終了するということを示した。
ミニシックスライブラリーでのCHO−Flp−In細胞系統からのサブクローンのバルクトランスフェクションにより生成された細胞培地内のポリクローン性保存の評価。
記載された通りに(実施例3、第e.1項)、オリジナルのCHO Flp−in細胞系統(インビトロジェン)を培養した。トリプシン処理細胞を計数し、96ウェルの培養プレート内でウェルあたり1個の細胞でプレート固定した。約14日後、単一のコロニーをもつ20のウェルを同定し、細胞をトリプシン処理し、24ウェルプレートに移送した。成長挙動ならびに発現レベルの特徴づけの後、今後の研究のために、サブクローン、CHO−Flp−Inクローン019の1つを選択した。
トランスフェクションをトリプリケートで実施し、CHO−Flp−Inクローン019細胞の選択は基本的に、pSymvc21中でネオマイシン選択マーカーがハイグロマイシンマーカーで置換されたという点を除いて(図4.e)、記載されている通りに(実施例3、第e.2項及び第e.3項)で実施した。その結果、細胞の選択及び培養中、ハイグロマイシンBの代りにゲニチシン(450μg/ml)が使用された。
トランスフェクション後73日間細胞を培養し、17、31、45、59及び73日目にELISA用試料を採取した。記載された通りに(実施例3、第f、2項)、(個別に精製されたミニシックス抗体を標準として用いて)定量的ELISAを実施した。3つの独立したトランスフェクションからの結果は図12に示されている。異なるトランスフェクションの間で異なる発現プロフィールが観察された。しかしながら、6つの抗体は全て、59日目まで全ての実験において検出可能であった。
CHO Flp−Inクローン019細胞についてのネオマイシン選択系での実験は、バルクトランスフェクションの後2ヵ月間、個別バッチの比較的保存された発現プロフィールを示した(図12)。かかる安定性期間は、製造目的で充分なものである。観察されたバッチ間の変動は、生産に先立ち個別バッチの大きな凍結ストックを生成し貯蔵することによって処理できる。
選択後の個別にトランスフェクションを受けたCHO Flp−In細胞を混合することによる細胞培地内のポリクローン性保存の評価
(a)CHO Flp−In細胞の個別トランスフェクション及び選択
ミニシックスライブラリーの個別成員を発現する6つの細胞系統の生成のための実験的手順については、先に記載した(実施例3、第e.3項)。等数(各細胞系統5×105個)での選択後直ちに、ミニシックスライブラリーの個別成員を発現する6つの細胞系統を混合し、混合細胞集団を85日間培養した。個別細胞系統から3つの個別混合物を作った。
試料を2週間後毎に採取し、ミニシックスライブラリーから発現された抗体の組成を、記載された通り(実施例3、第f.2項)ELISAにより決定した。ELISAを、混合後8、17、30、45、57、72及び85日目に実施した。結果(トリプリケートでの実験の平均±SD)は、図13に示されている。6つの抗体はすべて、混合物から85日後に検出可能であった。先に記載した通り(実施例3、第f.2項)、異なる抗体についての読取り値は直接比較可能ではなく、図13で提示されているデータは、少なくとも混合後45日目まで比較的安定した発現プロフィールを示し、その後、生産性の全体的降下が見られる。さらに、3つの独立した混合物から得られた結果の比較は、ミニシックス抗体の経時的に類似した発現プロフィールを示し、これは結果が再現可能であることを表していた。
ミニシックスライブラリーの別個の成員でのトランスフェクションを個別に受けた細胞の混合物から成るポリクローナル細胞培養は、少なくとも混合から45日目までは、組成の保存を示した。45日間の組成保存は、大部分の場合、製造目的で充分な時間となる。その上、トリプリケートでの実験は類似の結果を示しており、かくして、異なる構築物での個別のトランスフェクションを受けた細胞の混合が低いバッチ間変動をもつ混合された細胞培養を結果としてもたらすことを示唆した。
抗オボアルブミン組換え型ポリクローナル抗体製造細胞系統の確立
(a)抗オボアルブミンポリクローナル抗体組成物の発現
完全に特徴づけされたオボアルブミン結合ファージクローンの収集物を以下の通りに同定した。生後8週の雌のBALB/Cマウス4匹を完全フロイドアジュバント中の50μgのOVAで、腹腔内及び皮下で免疫化させ、免疫化0日から21日目及び42日目に不完全フロインドアジュバント中のOVAでブーストし、全ての動物が、抗原特異的ELISAにより測定される通りOVAに対抗して変換された血清を有していることが確認された。31日目及び52日目に、最も良く応答したマウスから脾臓を収獲した。前述したように、ファージミドベクター(Symvc10)を用いて、脾臓RNAからFab提示ファージミドライブラリーを生成した。結果として得たライブラリーは、およそ106個の独立したクローンを含んでいて、これらのライブラリーの選択は、NUNCイムノチューブ上にコーティングされたOVAと5×1011個のFab提示ファージミドを反応させることによって実施された。第1ラウンドのパニングからの溶出液は、OVA結合剤を高い割合で含んでいたことから、第1及び第2ラウンドのパニングからの溶出液がOVA結合ファージクローンについてスクリーニングされた。
ファージミドベクターから発現ベクターへの問題の遺伝子の移送は、2ステップ手順(図4に例示)であり、ここで第1ステップは、選択された哺乳動物プロモーターの頭−頭方向性をもつプロモーターカセットとのプロモーター交換であり、この後に、問題の遺伝子の可変領域及びプロモーターカセットを発現ベクターまで移送する。頭−頭プロモーターカセット(プロモーターA/プロモーターB)は、SacI/XhoI消化物を用いることによって各クローンのファージミドベクター内に挿入でき、その後連結されてその結果、細菌から哺乳動物プロモーター(pSymvc12)へのプロモーター交換がもたらされる。
大量移送により、重鎖の可変領域、プロモーター及びカッパ鎖全体をコードする配列が、ファージベクタライブラリーからイソタイプコーディングベクターまで移動させられ、ポリクローナル哺乳動物発現ベクター組成物を結果としてもたらす。この後には、トランスフェクションとCHO−Flp−In細胞系統への部位特異的組込みが続き、組換え型ポリクローナル製造細胞系統が生成される。この後者の細胞系統は、トランスフェクションを受けた各々の細胞のゲノム内の同じ特定の場所に組換え型ポリクローナルタンパク質の各々の成員をコードする問題の遺伝子をターゲティングすると同時に、トランスフェクションを受けた各々の細胞内の前記核酸配列を含む発現構築物の1つのコピーのみを組込むことによって、生成される。
大量移送及び哺乳動物細胞内へのトランスフェクションがクローニング、発現及び個別クローン間の多様性に関する多大な偏向を導入すること無く確実に行なわれるようにするため、以下の方法を用いて、大量移送及び哺乳動物発現のプロセスを監視することができる。
2) トランスフェクションを受けた各々の構築物からの細胞プールの発現レベルの分析、
3) 単細胞上のRFLPによる分析、
4) 産生された抗体混合物のELISA、
5) 産生された抗体混合物の質量分析法、
6) 各々の異なるクローンの比率を同定するための、V領域特異的プライマを用いた明確なバッチサイズについてのTaqman PCR(リアルタイムPCR)による分析、又は
7) 選択圧(ハイグロマイシン)を伴って及び伴わずに経時的培養されたパッチの分析は、以下のパラメータについて実施可能である:
a) クローナル分布
b) タンパク質発現レベル(数量及び分布)
c) ゲノム安定性
d) 無血清培地に対する適合の効果
従来の小型培養フラスコ、Nunc多層セルファクトリ及び小型高収量生物反応器(MiniPerm, INTEGRA−CELLine)を含めた、異なる培養系の中で、組換え型ポリクローナル抗体産生CHO−Flp−In細胞系統を産生させる。さらに、細胞系統は、スピナーフラスコ、中空ファイバ及び生物反応器内のその後の培養のため無血清懸濁液に適合されている。
Claims (47)
- 組換え型ポリクローナル製造細胞系統として適切な細胞の収集物を生成するための方法であって、
a)変異体核酸配列の集合を含むベクターライブラリーを提供する段階であって、前記ベクターの各々が1)特定の抗原を結合させる別個の成員を含むポリクローナルタンパク質の別個の成員をコードする別個の核酸配列の1つの単一コピー、及び2)1つ以上のリコンビナーゼ認識配列を含んでいる、段階、
b)宿主細胞系統内に前記ベクターライブラリーを導入する段階であって、前記宿主細胞系統の各々の個別細胞の前記ゲノムが、そのゲノム内の単一の特異的部位で前記ベクターものと整合するリコンビナーゼ認識配列を含んでいる、段階;
c)段階(a)の前記変異体核酸配列が前記宿主細胞系統の前記細胞内で部位特異的に組込まれるような形で1つ以上のリコンビナーゼの前記細胞内での存在を保証する段階であって、ここで、前記1つ以上のリコンビナーゼは、i)前記核酸配列が中に導入される前記細胞により発現されるか;(ii)段階aの前記ベクターにより操作可能な形でコードされるか;iii)第2のベクターから発現を通して提供されるか;又はiv)1つのタンパク質として前記細胞に提供されるかのいずれかである、段階;及び
d)変異体核酸配列の前記ライブラリーから、組込まれたコピーを含む細胞を選択する段階、
を含む方法。 - 前記ポリクローナルタンパク質が前記細胞収集物と天然に会合されていない、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリクローナルタンパク質がポリクローナル抗体又は抗体フラグメントである、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記ポリクローナルタンパク質がポリクローナルT細胞レセプタ又はT細胞レセプタフラグメントである、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記ベクターライブラリーが、このベクターライブラリーを用いた前記宿主細胞の収集物のバルクトランスフェクションにより前記宿主細胞系統内に導入される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ベクターライブラリーが、前記ベクターライブラリーのうちの5〜50個のベクターを含む画分での前記宿主細胞のアリコートの半バルクトランスフェクションにより前記宿主細胞系統内に導入され、前記細胞が、段階(d)の選択に先立ち又はそれに後続して組換え型ポリクローナル製造細胞系統として適切な細胞収集物を形成するべくプールされている、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 部位特異的組込みのための前記ベクターライブラリーが、前記ベクターライブラリーの個別成員で別々に前記宿主細胞をトランスフェクションすることによって前記宿主細胞系統内に導入され、前記細胞が、段階(d)の選択に先立ち又はそれに後続して組換え型ポリクローナル製造細胞系統として適切な細胞収集物を形成するべくプールされる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 段階(a)中の変異体核酸の集合が、前記特定の抗原を結合させるタンパク質をコードする核酸の同定及び/又は単離を可能にするスクリーニング手順を用いて単離又は同定される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- スクリーニング手順がバイオパニング段階及び/又は免疫検出検定を内含している、請求項8に記載の方法。
- 前記スクリーニング手順が、ファージ提示法、リボソーム提示法、DNA提示法、RNAペプチド提示法、共有結合提示法、細菌表面提示法、酵母表面提示法、真核生物ウイルス提示法、ELISA及びELISPOTから成る群から選択される、請求項8又は9に記載の方法。
- 前記変異体核酸配列が少なくとも3つの変異体核酸配列を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 変異体核酸配列の前記ライブラリーの個別成員が、前記細胞収集物内の個別細胞の単一の予め定義されたゲノム遺伝子座内に組込まれており、前記遺伝子座が前記組換え型ポリクローナルタンパク質の各成員の高レベル発現を媒介する能力をもつ、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 各々の別個の核酸配列が、2つの異なるポリペプチド鎖から成るポリクローナルタンパク質の一成員をコードする一対の遺伝子セグメントを含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記遺伝子セグメント対が、抗体重鎖可変領域コーディング配列及び抗体軽鎖可変領域コーディング配列を含む、請求項13に記載の方法。
- 前記遺伝子セグメント対が、T細胞レセプタアルファ鎖可変領域コーディング配列及びT細胞レセプタベータ鎖可変領域コーディング配列を含む、請求項13に記載の方法。
- 前記遺伝子セグメント対が、T細胞レセプタガンマ鎖可変領域コーディング配列及びT細胞レセプタデルタ鎖可変領域コーディング配列を含む、請求項13に記載の方法。
- 前記変異体核酸配列ライブラリーが、前記変異体核酸配列内部にある天然に発生する多様性を含んでいる、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 天然に発生する多様性が、前記変異体核酸配列内に存在するCDR領域内に位置している、請求項17に記載の方法。
- 前記細胞収集物が、哺乳動物細胞系統又は細胞型から誘導されている、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞系統が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、COS細胞、BHK細胞、YB2/0、NIH3T3、骨髄腫細胞、線維芽細胞、HeLa、HEK293、PER.C6及びそれらから誘導された細胞系統から成る群から選択される、請求項19に記載の方法。
- ポリクローナルタンパク質の製造方法であって、前記ポリクローナルタンパク質が、特定の抗原を結合させる別個の成員を含んでおり、
a)変異体核酸配列のライブラリーを含む細胞収集物を提供する段階であって、前記核酸配列の各々が前記ポリクローナルタンパク質の別個の成員をコードし、前記核酸配列の各々が前記細胞収集物内の各々個別の細胞のゲノムの同じ単一の部位にて組込まれている、段階、
b)前記ポリクローナルタンパク質の発現を容易にする条件の下で、前記細胞収集物を培養する段階;及び
c)細胞培養細胞又は細胞培養上清から前記発現されたポリクローナルタンパク質を回収する段階、
を含む方法。 - 段階(a)内の前記細胞収集物が、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法に従って生成される、請求項21に記載の方法。
- 前記ポリクローナルタンパク質が前記細胞収集物と天然に会合されていない、請求項21又は22に記載の方法。
- 段階(a)中の前記変異体核酸ライブラリーが、前記特定の抗原を結合させるタンパク質をコードする核酸の同定及び/又は単離を可能にするスクリーニング手順を用いて、より早期の段階で単離又は同定される、請求項21〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記スクリーニング手順がバイオパニング段階及び/又は免疫検出検定を内含している、請求項24に記載の方法。
- 前記スクリーニング手順が、ファージ提示法、リボソーム提示法、DNA提示法、RNAペプチド提示法、共有結合提示法、細菌表面提示法、酵母表面提示法、真核生物ウイルス提示法、ELISA及びELISPOTから成る群から選択される、請求項24又は25に記載の方法。
- 前記ポリクローナルタンパク質がポリクローナル抗体又は抗体フラグメントである、請求項21〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリクローナルタンパク質がポリクローナルT細胞レセプタ又はT細胞レセプタフラグメントである、請求項21〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記変異体核酸配列の前記相対的発現レベルが監視される、請求項21〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記発現レベルがmRNAレベル及び/又はタンパク質レベルで監視される、請求項29に記載の方法。
- 段階(b)での前記培養は、遅くとも前記相対的発現レベルが予め定められた範囲外となった時点で終結される、請求項29又は30に記載の方法。
- 変異体核酸配列ライブラリーでトランスフェクションされた細胞収集物を含む組換え型ポリクローナル製造細胞系統であって、前記収集物中の各々の細胞が、特定の抗原を結合させるポリクローナルタンパク質の別個の成員をコードし、かつ前記収集物内の個別の細胞のゲノム内で同じ単一の部位にある前記ライブラリーの1成員でトランスフェクションされこの成員を発現する能力を有しており、前記核酸配列が前記収集物中の前記細胞と天然に会合されていない組換え型ポリクローナル製造細胞系統。
- 前記変異体核酸配列ライブラリーが、ポリクローナル抗体又は抗体フラグメントの個別成員の間で天然に発生する多様性を有する前記ポリクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする、請求項32に記載の組換え型ポリクローナル製造細胞系統。
- 前記変異体核酸配列ライブラリーが、ポリクローナルT細胞レセプタ又はT細胞レセプタフラグメントの個別成員の間で天然に発生する多様性を有する前記ポリクローナルT細胞レセプタ又はT細胞レセプタフラグメントをコードする、請求項32に記載の組換え型ポリクローナル製造細胞系統。
- 前記細胞収集物が、哺乳動物細胞系統又は細胞型から誘導される、請求項32〜34のいずれか1項に記載の組換え型ポリクローナル製造細胞系統。
- 前記哺乳動物細胞系統が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、COS細胞、BHK細胞、YB2/0、NIH3T3、骨髄腫細胞、線維芽細胞、HeLa、HEK293、PER.C6及びそれらから誘導された細胞系統から成る群から選択される、請求項35に記載の組換え型ポリクローナル製造細胞系統。
- 天然に発生する変異体核酸配列の集合を含む部位特異的組込み用ベクターライブラリーであって、前記ベクターの各々が、1)特定の抗原を結合させるポリクローナルタンパク質の別個の成員をコードする別個の核酸配列の1つのコピー、及び2)1つ以上のリコンビナーゼ認識配列を含んでいる、ベクターライブラリー。
- 天然に発生する変異体核酸配列の前記集合がポリクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする、請求項37に記載のライブラリー。
- 天然に発生する変異体核酸配列の前記集合が、ポリクローナルT細胞レセプタT細胞レセプタフラグメントをコードする請求項37に記載のライブラリー。
- 前記ベクターライブラリーの各成員がさらに、リコンビナーゼコーディング核酸配列を含む、請求項37〜39のいずれか1項に記載のライブラリー。
- 請求項27に記載の方法によって得られる組換え型ポリクローナル抗体又は抗体フラグメント。
- 請求項28に記載の方法によって得られる組換え型ポリクローナルT細胞レセプタ又はそのポリクローナルフラグメント。
- 動物における疾病の治療、改善又は予防方法において、請求項41に記載の組換え型ポリクローナル抗体又は抗体フラグメントが有効量投与される方法。
- 動物における疾病の治療、改善又は予防方法において、請求項42に記載の組換え型ポリクローナルT細胞レセプタ又はT細胞レセプタフラグメントが有効量投与される方法。
- 癌、感染症、炎症性疾患、アレルギー、喘息又はその他の呼吸器疾患、免疫機能不良、自己免疫疾患、心臓血管疾患、中枢神経系疾患、代謝疾患、内分泌疾患、移植片拒絶反応、及び望まれない妊娠から成る群から選択された疾病の治療のための組成物の調製を目的とした、組換え型ポリクローナル抗体又は組換え型ポリクローナルT細胞レセプタ又は抗体又はT細胞レセプタのフラグメントの使用。
- 活性成分として請求項27に記載の方法によって得られた組換え型ポリクローナル抗体又は抗体フラグメント、及び薬学的に受容可能な賦形剤を含む医薬組成物。
- 活性成分として請求項28に記載の方法によって得られた組換え型ポリクローナルT細胞レセプタ又はT細胞レセプタフラグメント、及び薬学的に受容可能な賦形剤を含む医薬組成物。
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