JP2008506960A - 組換えポリクローナルタンパク質またはポリクローナル細胞株を構造上特徴付ける方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、最終生産物のバッチとバッチとの間の一貫性、ならびに1回の生産工程における組成物の安定性を証明するために、組換えポリクローナルタンパク質またはかかるタンパク質を産生するポリクローナル細胞株を構造上特徴付ける方法に関するものである。特に、本発明は、組換えポリクローナル抗体を特徴付ける方法に関するものである。
抗体の予防上または治療上の投与(いわゆる受動免疫)は、生体の免疫系の能力を増強して、感染性因子を排除し得ると長い間考えられてきた。歴史的に、かかる治療用抗体は、ヒト血漿から得られてきた(そのため、抗体組成物は免疫グロブリンまたはγ−グロブリンと称される)。これらの抗体を得るために、免疫ヒトドナーから血液プールが集められ、そして免疫グロブリンフラクションが抽出され、精製される。免疫グロブリンのフラクションのみが、特定の抗原に特異的となる。ドナーの数が限られていること、製造に費用がかかること、ドナー由来の感染性汚染物質のリスクがあること、バッチとバッチとの間の変動が不可避であること、ならびに投与計画が複雑であることといったいくつかの制限が原因で、免疫グロブリンの治療上の使用は複雑である。
本発明は、ポリクローナル細胞株からの組換えポリクローナルタンパク質、特に、組換えポリクローナル抗体のような異なる相同タンパク質の混合物の一貫した生産を示すための構造上の特徴決定基盤を提供する。
予防上および治療上使用する組換えポリクローナルタンパク質の産業上の生産に前もって必要なものは、発現中のクローンの多様性の維持である。それゆえ、ポリクローナル抗体を産生するポリクローナル細胞株のクローンの多様性、ならびに任意の所望の時間ポイントでのポリクローナルタンパク質、および任意の関連試料における個々のタンパク質の相対的提示をモニターし、測定できることが重要であり、これにより1回の実施における発現系の安定性、ならびに最終生産物のバッチとバッチとの間の変動の分析が可能になる。
用語「抗イディオタイプ抗体」は、ポリクローナルタンパク質の個々のメンバーの変異体部分に特異的に結合する全長抗体またはそのフラグメント(例えば、Fv、scFv、Fab、Fab’、またはF(ab)2)を意味する。好ましくは、本発明の抗イディオタイプ抗体は、ポリクローナル抗体またはポリクローナルTcRの個々のメンバーの変異体部分に特異的に結合する。好ましくは、抗イディオタイプ抗体の特異性は、ポリクローナル抗体またはポリクローナルT細胞受容体の個々のメンバーの抗原特異的部分、いわゆるV領域に対して方向付けられる。しかしながら、それは、個々のメンバーの所定のサブ集団、例えば、混合物において表された特異的VH遺伝子ファミリーに対する特異性も示し得る。
本発明の態様は、(i)異なる可変領域を有する異なる相同タンパク質、または(ii)かかるタンパク質を産生する細胞株を含む試料における個々のメンバーの相対的比率に関する情報を得るための構造上の特徴決定用基盤を提供することである。特徴決定基盤を用いて、異なる相同タンパク質を含む組成物の産生または精製過程、あるいは長期保存中に異なる態様が評価され得る。好ましくは、本発明の特徴決定基盤は、次の目的:i)1つの試料内で互いに関連する個々のメンバーまたは個々のメンバーのいくつかの相対的出現量を決定すること、ii)バッチとバッチとの間の一貫性の決定のため、異なる試料における1個以上の個々のメンバーの相対的比率を評価すること、およびiii)1個以上の個々のメンバーの実際の比率を評価すること、のうちの1つのために用いられる。必要に応じて、これは、ポリクローナル製造細胞株を生成するためにもともと用いられたベクターライブラリーと比較されてもよい。特徴決定基盤は、ポリクローナル細胞株のクローンの多様性および/または細胞株により産生されたポリクローナルタンパク質における個々のタンパク質の出現量をモニタリングするのに特に有用である。個々の生産工程における組成物の安定性およびバッチとバッチとの間の一貫性の両方がモニターされ得る。別法として、基盤手段はまた、ポリクローナルタンパク質またはモノクローナル抗体の混合物を含む異なる相同タンパク質の混合物の精製組成物に適用され、例えば、かかる組成物における個々のメンバーの長期安定性が評価され得る。
本発明のある実施態様において、ポリクローナルタンパク質を産生するための発現系におけるポリクローナル性は、ポリクローナルタンパク質の特定のメンバーをコードする細胞の量および/またはポリクローナルタンパク質の個々のメンバーをコードするmRNAレベルを評価することによりモニターされる。これは、例えば、RFLPまたはT−RFLP分析、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ分析、リアルタイムPCRのような定量的PCR、および製造細胞株から得られた遺伝子配列の可変領域の核酸配列決定を用いて、mRNAレベルまたはゲノムレベルでモニターされ得る。別法として、同じ技術を定性的に用いて、ポリクローナル細胞株の多様性が示され得る。ポリクローナルタンパク質をコードする核酸配列は、培養中の異なる時間ポイントで単一のポリクローナル細胞培養物から得られた試料においてモニターされ、それにより、生産工程を通じて個々のコード配列の相対的比率をモニターし、その組成物の安定性が評価され得る。別法として、ポリクローナルタンパク質をコードする核酸配列は、特定の時間ポイントで異なるポリクローナル細胞培養物から得られる試料においてモニターされ、それにより、異なるバッチにおける個々のコード配列の相対的比率をモニターし、バッチとバッチとの間の変動が評価され得る。好ましくは、遺伝子分析において用いられる試料は、例えば、沈殿により、培養物の細胞について濃縮された細胞培養物フラクションである。一般に、試料は、所望の時間ポイントで細胞培養物のフラクションを回収し、次に、例えば、遠心分離により培地を除去して得られる。バッチとバッチとの間の一貫性の比較のための試料は、好ましくは、産生についてのインビトロの細胞継代数(age)の限界で、細胞から得られる。
RFLPおよびT−RFLP分析は、ゲノムレベルまたはmRNAレベルで行われ得る。各細胞が目的の配列を1コピーのみ含有するように、ポリクローナル製造細胞株が生成される場合、ゲノムレベルでの分析は、ポリクローナルタンパク質の個々のメンバーを産生する製造細胞株における細胞の相対的比率に関する情報をもたらすだろう。一方、mRNAレベルでの分析は、ポリクローナルタンパク質の個々のメンバーの可能性のある発現レベルに関する情報をもたらすだろう。一般に、mRNAレベルでの分析は、mRNAをcDNAに逆転写し、次に制限酵素分析することにより、行われる。しかしながら、mRNAにおいて分析を直接行うことも可能である。
DNAチップのようなオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて、細胞株から生成された標識DNAのハイブリダイゼーションを測定することにより、ポリクローナル細胞株におけるゲノムDNAレベルまたはmRNAレベルが測定され得る(Guo, Z. et al 1994. Nucleic Acids Res. 22, 5456-5465)。
PCR法は、試料中の核酸配列の検出および定量の両方をもたらすよう既に適合されている。例えば、Higuchi, R. et al. 1993. Kinetic Biotechnology 11, 1026-1030;Holland, P.M. et al. 1991. PNAS 88, 7276-7280;Livak, K.J. et al. 1995 PCR Methods Appl. 4, 357-362を参照されたい。これらの方法は、標準的PCRなどでのフォワードおよびリバースプライマー、および増幅される核酸とハイブリダイズする1個以上のさらなる核酸配列を利用する。このさらなる核酸配列は、「プローブ」と称され、2つのプライマーにハイブリダイズする部分の間で増幅されるべき核酸の一部にハイブリダイズし、各連続的PCRサイクルがプローブまたはその標識の変化を生じるような方法で標識される。プローブまたはその標識のこの変化により、各PCRサイクルにおいて増幅された核酸の追加コピー数に関連する程度まで、標識は活性化されるか、あるいは強調される。一般に、かかる方法は、「リアルタイム」PCRと称され、熱サイクルを標識の検出と組み合わせることにより、PCR産物の増大をサイクル毎に検出する。リアルタイムPCRの特定のバージョンにおいて、プローブまたはその標識の変化は、ポリメラーゼ、例えば、Taqポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により引き起こされ、それゆえ、この技術は、一般にTaqまたはTaqManリアルタイムPCRと称される(例えば、Holland, P.M. et al. 1991. PNAS 88, 7276-7280)。
核酸の配列決定はよく知られた技術であり、本発明と共に利用され、ポリクローナル製造細胞株の多様性に関する定性的情報をもたらし得る。配列決定は、単一細胞クローニングによりポリクローナル細胞株からもたらされる単一細胞、またはポリクローナル製造細胞株から得られる変異体細胞の未処理試料のいずれかにおいて行われ得る。
本発明の実施態様において、相同タンパク質のプールまたは相同タンパク質を産生するための発現系のポリクローナル性は、1種類以上のタンパク質の特徴決定技術によりモニターされる。タンパク質の特徴決定技術は、単独または他の技術と組み合わされて、溶液中またはポリクローナル細胞株に存在する細胞の表面上のモノクローナルタンパク質の混合物または組換えポリクローナルタンパク質の個々のメンバーの存在および相対的比率に関する情報をもたらす能力のある任意の技術を意味する。組換えポリクローナルタンパク質の複雑性に依存して、次の技術のうちの1種類以上が用いられ得る:i)クロマトグラフ分離技術、ii)ポリクローナルタンパク質の個々のメンバーを表す固有のマーカーペプチドの同定のためのポリクローナルタンパク質のタンパク分解消化産物の分析、iii)「大量」N−末端配列決定、およびiv)例えば、ポリクローナルタンパク質のセンチネルタンパク質メンバーの特徴決定のための特異的検出分子を用いた分析。
ポリクローナルタンパク質の個々のメンバーのクロマトグラフ分離は、i)正味電荷(例えば、イオン交換クロマトグラフィー(IEX))、ii)疎水性(例えば、逆相クロマトグラフィー(RP−HPLC)、および塩濃度による疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC))、iii)等電点(pI値)(例えば、クロマトフォーカシング)、またはiv)アフィニティー(例えば、抗イディオタイプペプチド/抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィー、またはκおよびλ抗体軽鎖の分離のためのタンパク質Lクロマトグラフィー)のような物理化学的特性の相違に基づくものであり得る。5種類のよく知られたクロマトグラフ技術は、次の物理化学的特性:大きさに基づくものである。しかしながら、全てのメンバーは本質的に同じ大きさのものであるので、これは、ポリクローナル抗体またはポリクローナルTcRのような相同タンパク質の特徴決定に特に適した技術ではない。大きさによる分離は、特徴決定基盤から完全に省かれる。上述のこれらのクロマトグラフ技術のいくつかは、IgA、IgG、およびIgMのような免疫グロブリンのクラス(Gallo, P. et al. 1987. J. Chromatogr. 416, 53-62)、またはIgG1、IgG2、IgG3のようなサブクラス(Scharf, O et al. 2001. J. Virol. 75, 6558-6565)をヒト血清から分離する際に利用されてきた。しかしながら、血清由来の免疫グロブリンまたは組換えポリクローナル抗体における個々の抗体の多様性に関連する分離は、これまで行われていない。
本発明の実施態様において、イオン交換クロマトグラフィーを用いて、組換えポリクローナルタンパク質の個々のメンバー、またはポリクローナルタンパク質の個々のメンバーのサブ集団が分離される。イオン交換クロマトグラフィーによる分離は、分離されるべき組成物中の個々のタンパク質の正味電荷に基づくものである。組換えポリクローナルタンパク質のpI値、選択されたカラムバッファーのpH値および塩濃度に依存し、組換えポリクローナルタンパク質の個々のメンバーは、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィーのいずれかを用いて、少なくともある程度まで分離され得る。例えば、pHが、組換えポリクローナルタンパク質組成物の個々のメンバーの最も低いpI値より十分に低いものである限り、通常、組換えポリクローナルタンパク質の個々のメンバーの全てが、負に荷電した陽イオン交換媒体に結合するだろう。続いて、結合した組換えポリクローナルタンパク質の個々のメンバーは、典型的には漸増勾配の塩(例えば、塩化ナトリウム)または漸増pH値を用いて、個々のタンパク質の正味電荷に依存して、カラムから溶出され得る。いくつかのフラクションが溶出中に得られるだろう。好ましくは、単一のフラクションは、ポリクローナルタンパク質の個々のメンバーを含有するが、ポリクローナルタンパク質の2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、またはそれ以上の別のメンバーも含有し得る。陽イオンおよび陰イオン交換の一般的な原理は、当該技術分野においてよく知られており、イオン交換クロマトグラフィー用のカラムは市販されている。
b)クロマトフォーカシング
本発明のさらなる実施態様において、クロマトフォーカシングを用いて、組換えポリクローナルタンパク質の個々のメンバー、またはポリクローナルタンパク質の個々のメンバーのサブ集団が分離される。クロマトフォーカシングによる分離は、個々のタンパク質のpI値の相違に基づくものであり、組換えポリクローナルタンパク質のpI値より上のpH値を有するカラムバッファーを用いて行われる。個々のメンバーが比較的低いpI値を有する組換えポリクローナルタンパク質は、正に荷電した弱陽イオン交換媒体に結合するだろう。続いて、結合した組換えポリクローナルタンパク質の個々のメンバーは、個々のメンバーのpI値のpH範囲をカバーするよう設計されたポリバッファーを用いてカラム内の漸減pH勾配を創出することにより、個々のメンバーのpI値に依存して、カラムから溶出され得る。いくつかのフラクションが溶出中に得られるだろう。好ましくは、単一のフラクションは、ポリクローナルタンパク質の個々のメンバーを含有するが、ポリクローナルタンパク質の2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、またはそれ以上の別のメンバーも含有し得る。陽イオン交換体を用いたクロマトフォーカシングの一般的な原理は、当該技術分野においてよく知られており、陽イオンカラムは市販されている。陽イオン交換体を用いたクロマトフォーカシングも当該技術分野において知られている(Kang, X. and Frey, D.D., 2003. J. Chromatogr. 991, 117-128(引用により、本明細書に取り込まれる))。
本発明のさらなる実施態様において、疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて、組換えポリクローナルタンパク質の個々のメンバー、またはポリクローナルタンパク質の個々のメンバーのサブ集団が分離される。疎水性相互作用クロマトグラフィーによる分離は、分離されるべき組成物における個々のタンパク質の疎水性の相違に基づくものである。組換え産生されたポリクローナルタンパク質は、疎水性相互作用に有利に働くバッファー中の疎水性リガンドで修飾されたクロマトグラフィー媒体に結合する。一般に、これは、有機溶媒を低い割合で含有するバッファー(RP−HPLC)、または選択された塩を非常に高濃度含有するバッファー(HIC)において達成される。続いて、結合した組換えポリクローナルタンパク質の個々のメンバーが、典型的には、漸増勾配の有機溶媒(RP−HPLC)または漸減勾配の選択された塩(HIC)を用いて、個々のメンバーの疎水性に依存して、カラムから溶出されるだろう。いくつかのフラクションが溶出中に得られるだろう。好ましくは、単一のフラクションは、ポリクローナルタンパク質の個々のメンバーを含有するが、ポリクローナルタンパク質の2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、またはそれ以上のメンバーも含有し得る。疎水性相互作用クロマトグラフィーの一般的な原理は、当該技術分野においてよく知られており、RP−HPLCならびにHIC用カラムは市販されている。
本発明のさらなる実施態様において、アフィニティークロマトグラフィーを用いて、ポリクローナルタンパク質の個々のメンバー、またはポリクローナルタンパク質の個々のメンバーのサブ集団が分離される。アフィニティークロマトグラフィーによる分離は、特異的検出分子、リガンド、またはタンパク質に対するアフィニティーの相違に基づくものである。検出分子、リガンド、またはタンパク質、またはこれらのうちの複数のもの(これらの異なるオプションを、以下、ただリガンドと称する)は、クロマトグラフィー媒体に固定され、組換えポリクローナルタンパク質は、個々のメンバーと固定されたリガンドとの間の相互作用に有利に働く条件下でアフィニティーカラムにアプライされる。固定されたリガンドに対するアフィニティーを示さないタンパク質は、カラムフロースロー(flow-through)に集められ、次に、固定されたリガンドに対するアフィニティーを示すタンパク質は、結合に不都合に働く条件(例えば、低pH、高塩濃度、または高いリガンド濃度)下でカラムから溶出される。いくつかのフラクションが溶出中に得られ得る。好ましくは、単一のフラクションは、ポリクローナルタンパク質の個々のメンバーを含有するが、ポリクローナルタンパク質の2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、またはそれ以上の別メンバーも含有し得る。組換えポリクローナルタンパク質を特徴付けるために用いられ得るリガンドは、例えば、標的抗原、抗イディオタイプ分子、またはκまたはλ軽鎖を有する抗体の分離のためのタンパク質Lである。
分析されるべき試料中の変異体相同タンパク質、例えば、組換えポリクローナルタンパク質の複雑性に依存して、上記のa)からd)のクロマトラフ技術のうちの2種類以上を2次元、3次元、または多次元フォーマットで組み合わせることが所望され得る。好ましくは、2次元ゲル電気泳動の代わりに全次元において液体クロマトグラフィーが用いられる。しかしながら、これは、組換えポリクローナルタンパク質を特徴付けるための1以上の次元でのゲル電気泳動または沈殿技術の使用を排除するものではない。
上述のタンパク質の特徴決定技術において、単一のタンパク質は、例えば、IEXプロファイルにおいていくつかのピークを生じうるので、相同タンパク質プールにおける個々のタンパク質の不均一性は、特徴決定をなおさら複雑にし得る。不均一性は、抗体および他の組換えタンパク質において共通する現象であり、酵素性または非酵素性翻訳後修飾によるものである。共通する翻訳後修飾は、N−グリコシル化、メチオニン酸化、タンパク分解性断片化、およびアミド分解を含む。不均一性は、トランスフェクションにおいて誘発される変異(Harris, J.R, et al. 1993. Biotechnology 11,1293-7)、および転写中の重鎖と軽鎖の可変遺伝子間でのクロスオーバー現象(Wan, M. et al. 1999. Biotechnol Bioeng. 62,485-8)のような、遺伝子レベルでの修飾からも生じ得る。これらの修飾は、エピジェネティックであり、従って、構築物の遺伝子構造単独から予測することはできない。
異なる可変領域を有する異なる相同タンパク質を含むタンパク質試料は、上述の通り、広範なクロマトグラフ技術を用いて、インタクトなタンパク質の物理化学的特性に基づき特徴付けられ得る。上述のこれらの分析から得られた情報は、相同タンパク質のタンパク分解性消化産物の分析から得られた情報でさらに補足され得る。好ましくは、タンパク分解性消化は、インタクトなタンパク質のクロマトグラフ分析が行われるのと同じ試料のアリコート上で行われる。
上述のN−末端配列は、単離され、ポリクローナルタンパク質のタンパク分解性消化産物をフィンガープリンティングするために用いられ得る。別法として、N−末端配列が、インタクトなタンパク質から直接配列決定され、それにより、タンパク分解工程が省かれ得る。異なる可変領域を有する異なる相同タンパク質を含むタンパク質試料の「大量」N−末端配列分析を用いて、例えば、組換えポリクローナルタンパク質の精製バッチ産物が比較され得る。ポリクローナルタンパク質が組換えポリクローナル抗体またはTcRである場合、好ましくは、「大量」N−末端配列決定は、それぞれ、分離された重鎖および軽鎖、または分離されたα鎖およびβ鎖のプールにおいて行われる。例えば、相同な重鎖のプールにおいて、アミノ酸位置のいくつかは完全に保存され得るのに対し、他の位置は変動し得、これはアミノ酸配列のアライメントにより評価され得る。従って、いくつかの異なるアミノ酸が、特定ラウンドの配列決定において得られ得る。例えば、4位が、相同配列のアライメントにより予め決定された、ポリクローナル試料中の5種類の異なるアミノ酸により表され得る。「大量」N−末端配列分析において、アミノ酸が変動するこれらのものが定量され、例えば、組換えポリクローナル抗体の4位を表す個々のアミノ酸の異なる量を用いて、関連する組成物である異なる試料が比較され得る。
本発明の特徴決定基盤はさらに、特異的検出分子を利用し、それぞれの特異的検出分子は、相同タンパク質の複雑な混合物内の個々のタンパク質メンバーを同定する能力を有し、それにより、試料中の特定のメンバーの存在のモニタリングを助ける。特異的な検出分子は、例えば、ポリクローナルタンパク質の個々のメンバーに対する特異性を有する小有機分子、ペプチド、またはタンパク質のような特異的リガンドであり得る。特に、抗イディオタイプペプチドのようなリガンドペプチドまたはタンパク質、あるいは抗イディオタイプ抗体が、本発明の好ましい実施態様である。相同タンパク質の複雑な混合物の所定のサブセットに結合する検出分子も、本発明において適用可能である。
本発明の基盤により特徴付けられるべき試料は、異なる可変領域タンパク質を有する異なる相同タンパク質の所定のサブセット、例えば、異なるCDR領域を有するポリクローナルタンパク質または抗体(例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の混合物)、または異なるCDR領域を有するT細胞受容体(例えば、ポリクローナルTcRまたはモノクローナルTcRの混合物)を含む。好ましくは、異なる可変領域を有する異なる相同タンパク質は組換えタンパク質である。加えて、好ましくは、ポリクローナルタンパク質またはモノクローナルタンパク質の混合物の個々のメンバーは、例えば、所望の標的抗原に対する抗体またはTcRの場合、所望の標的に対する共有結合活性のような共通する特徴により定義されてきた。典型的には、本発明の特徴決定基盤により分析されるべきポリクローナルタンパク質組成物は、少なくとも3、4、5、10、20、50、100、1000、104、105、または106の別の変異体メンバーを含む。通常、ポリクローナルタンパク質組成物中の個々のメンバーの総数の75%より多くを構成する単一の変異体メンバーは存在しない。好ましくは、最終ポリクローナル組成物中の個々のメンバーの総数の50%、より好ましくは、25%、最も好ましくは、10%を超える個々のメンバーは存在しない。
以下の実施例において、異なる個々の抗RhD抗体メンバー、または抗RhD rpAbを産生する細胞株からなる種々の抗RhD組換えポリクローナル抗体(抗RhD rpAb)組成物を用いて、本発明の構造上の特徴決定基盤を説明する。個々の抗RhD特異的抗体およびそれらを産生する細胞株は、2004年7月20日に出願した譲受人のデンマーク特許出願PA 2004 01133に記載に対応するものであった。簡単にいうと、重鎖可変領域およびκ/λ軽鎖のコンビナトリアルファージディスプレイライブラリーを、RhD陽性赤血球で免疫したrhesus D陰性ドナーから調製した。ライブラリーを、抗RhD特異的抗体産生クローンについてピックアップした。抗原特異的ファージ由来の可変重鎖および軽鎖遺伝子対を哺乳類発現ベクターに導入した。哺乳類ベクターを、Flp−FRT組換え系を用いた部位特異的方法でCHO Flp−In細胞株(Invitrogen, CA)に個々にトランスフェクションした。完全な軽鎖(LC)ならびに重鎖(VH)の可変領域の核酸(nuc.)ならびにタンパク質(a.a.)配列を、表2に示す配列同一性ナンバー(配列番号)により同定する。これらのナンバーは、2005年7月18日に出願した譲受人の国際特許出願PCT/DK2005/000501(発明の名称「抗RHESUS D組換えポリクローナル抗体、および製造方法」)における配列番号に対応する。表2の配列番号を本発明の出願の配列番号と区別しなければならない。これらは同一でないからである。重鎖の定常領域は、ヒトIgG1に対応する。
本実施例は、ポリクローナル製造細胞株の生成、および1次元のクロマトグラフ技術を用いたタンパク質レベル、およびRFLP分析を用いた遺伝子レベルでバッチとバッチとの間のバリエーションの特徴決定を説明するものである。
ゲノム上の特定の部位と異なる組換え抗Rhesus D抗体をそれぞれ発現する10種類の細胞株(RhD157.119D11、RhD158.119B06、RhD159.119B09、RhD161.119E09、RhD163.119A02、RhD190.119F05、RhD191.119E08、RhD192.119G06、RhD197.127A08、およびRhD204.128A03)を選択し、混合して、組換えポリクローナル製造細胞株を構築した。RhD197およびRhD204はλクローンであり、残りはκクローンであった。
上清を回収し、ろ過後、抗RhD rpAbを精製した。
タンパク質レベルならびにmRNAレベルの両方でクローン多様性をアッセイした。9週間培養後に抗体組成物の分析のために用いる上清試料を採取し、11週間培養後にmRNA組成物を分析するために用いる細胞試料を採取した。
ポリクローナルCHO−Flp−In(019)細胞株から発現した抗RhD rpAbは、IgG1アイソタイプ抗体である。タンパク質Aを固定化したカラムを用いて、両方のアリコート(3948および3949)から抗RhD rpAbを精製した。個々の抗体は、固定化したタンパク質AとpH7.4で相互作用した。一方、コンタミしているタンパク質をカラムから洗い流した。次に、結合抗体を低pH値(pH2.7)にてカラムから溶出した。280nmでの吸光度測定により決定した抗体含有フラクションをプールし、5mM 酢酸ナトリウム(pH5)に対して透析した。
11週間培養後のポリクローナルCHO−Flp−In(019)細胞株内のクローン多様性をRT−PCR−RFLP分析により評価した。簡単にいうと、200個の細胞に対応する細胞懸濁液を凍結融解の対象とし、これらの溶解物を、軽鎖を増幅するプライマーを含むOne−STEP RT−PCRキット(Qiagen)を用いたRT−PCRにおける鋳型として用いた。プライマー配列は次の通りであった:
フォワードプライマー:5’−TCTCTTCCGCATCGCTGTCT(配列番号1)
リバースプライマー:5’−AGGAAAGGACAGTGGGAGTGGCAC(配列番号2)。
それぞれモノクローナル抗RhD抗体を発現する10種類の細胞株を混合して、抗RhD rpAb製造細胞株を生成した。9週間培養後、それはなお、最初の多様性の90%を維持していた。11週間培養後、6種類の異なるクローン由来のmRNAを明確に同定することができ、そして他のいくつかのクローンは、約500bpのバンド中に現われているようであった。
本実施例は、8種類のメンバーを有するポリクローナル細胞培養物の長期にわたる特徴決定を説明するものである。RFLP分析を用いて遺伝子レベルで、および1次元クロマトグラフ技術を用いてタンパク質レベルで培養物のクローン多様性を評価した。
8種の異なる抗Rhesus D抗体を発現するポリクローナル細胞培養物における個々のクローンの分布を、ポリクローナル細胞株由来のRT−PCR産物の末端RFLP(T−RFLP)により評価した。T−RFLP方法において、フォワードおよび/またはリバースプライマーを蛍光標識した。それゆえ、単位複製配列から生じた制限酵素消化フラグメントの部分は標識を含有するだろう。次に、標識フラグメントを、キャピラリー電気泳動により分離させ、蛍光により検出することができる。適用したプライマーに依存して、軽鎖および重鎖の可変領域をコードする配列両方において分析を行うことができる。
VLフォワードプライマー:5’−TCTCTTCCGCATCGCTGTCT(配列番号1)
CLリバースプライマー:5’−FAM−AGGAAAGGACAGTGGGAGTGGCAC(配列番号2)。
VHフォワードプライマー:5’−FAM CGTAGCTCTTTTAAGAGGTG(配列番号3)
VHリバースプライマー:5’−HEX−ACCGATGGGCCCTTGGTGGA(配列番号4)。
上述のT−RFLP分析において用いたのと同じポリクローナル細胞培養物から産生された抗RhD rpAbを、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて分析した。タンパク質Aにより精製した組換え産生ポリクローナル抗体を、25mM 酢酸ナトリウム、150mM 塩化ナトリウム,pH5.0中、流速60ml/時間、室温にてPolyCatAカラム(4.6×100mm)にアプライした。次に、25mM 酢酸ナトリウム、pH5.0中の150〜350mMの直線的勾配の塩化ナトリウムを用いて、流速60ml/時間にて抗体成分を溶出した。抗体成分を分光光度法により280nmにて検出し、次に、クロマトグラムを統合し、個々のピーク面積を用いて、抗体成分を定量した。経時的な相対量を図6に示す。
RFLP分析により遺伝子レベルで得られた結果と陽イオン交換クロマトグラフィーによりタンパク質レベルで得られた結果は比較可能である。図5および6は、ポリクローナル細胞株における個々のクローンの大部分、ならびに細胞株から発現されたポリクローナル抗体の個々の抗体が、5週間培養中、同じ傾向をたどることを明瞭に説明する。従って、遺伝子レベルならびにタンパク質レベルでの分析は、遺伝子レベルでの細胞株の組成の多様性、および細胞株から産生された組換えポリクローナルタンパク質の組成の多様性の評価について十分に同等なものである。
本実施例は、25種類のメンバーを有するポリクローナル細胞培養物の長期にわたる特徴決定を説明するものである。T−RFLP分析を用いて遺伝子レベルで、および1次元クロマトグラフ技術を用いてタンパク質レベルで、培養物のクローン多様性を評価した。
本実施例において調べたポリクローナル細胞培養物は、25種類の異なる抗Rhesus D抗体発現細胞培養物の混合物(実施例1に記載のとおり生成したもの)から構成されるものであった。ポリクローナル細胞培養物を5週間培養し、1週間に1回、T−RFLP分析のために試料を採取した。
上述のT−RFLP分析において用いたのと同じポリクローナル細胞培養物から産生された抗RhD rpAbを、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて分析した。タンパク質Aにより精製した組換え産生ポリクローナル抗体を、25mM 酢酸ナトリウム、150mM 塩化ナトリウム、pH5.0中、流速60ml/時間、室温にてPolyCatAカラム(4.6×100mm)にアプライした。次に、25mM 酢酸ナトリウム、pH5.0中の150〜350mMの直線的勾配の塩化ナトリウムを用いて、流速60ml/時間にて抗体成分を溶出した。280nmにて分光光度法により抗体成分を検出し、次に、クロマトグラムを統合して、個々のピーク面積を用いて、異なる抗体成分を定量した。図7は、4週目に得られた試料から生じたクロマトグラムを示し、抗体含有ピークに1から25までの番号を付けている。クロマトグラムが、分析したポリクローナル抗体における個々の抗体の数と同一数のピークを含有することは、正真正銘一致する。表8は、トータルの抗体成分(AC1から25)のパーセントにおける相対含有量、ならびに各抗体成分(ピーク)における個々の抗体の出現量を示す。合計したクロマトグラムのピークへの個々の抗体の割り当ては、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて同一条件下で分析したモノクローナル抗体から得られた保持時間およびピークパターンに基づくものであった。
本実施例は、培養期間にわたる1次転写物の分布および抗体成分の分布をそれぞれ評価するためのT−RFLP分析と陽イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせて使用することを説明するものである。T−RFLP分析により、ポリクローナル細胞株において発現した25種類のクローンのうち12種類の個々のクローンを固有に同定することが可能となり、そして本実施例において、4週間の培養中T−RFLP分析を用いて、これらの12種類のクローンを検出できることを説明する。可能性としては、1種類より多くのクローンを表すフラグメントの配列分析により、より多くのクローンを同定できる。陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、抗体成分の分布を分析し、そして本実施例において、25種類の分析した成分の分布が培養中比較的安定していることを見出した。個々の抗体全てを固有に同定することは、発現抗体の本来の電荷の不均一性質に起因して困難であるが、本実施例において、RhD160抗体を表す抗体成分8が培養中最も高い抗体レベルを示し、そしてこれはRhD160、293、および196クローンを表す群13について得られた高いT−RFLP値とも一致することを示した。さらに、T−RFLP、ならびに陽イオン交換クロマトグラフィーにより固有に同定することのできるRhD 207成分は、T−RFLPレベル10〜11%を示し、抗体レベルで得られたものは若干低い5.5〜10%を示した。とりわけ、2つの技術は一体となって、培養中のmRNAおよび抗体レベルでの比較的安定な産生を示す;しかしながら、2つの技術の間の可能性のある矛盾も見出され、これは、抗体レベルで得られた結果と対照的な、培養5週間でのいくつかのクローンの転写の明らかな喪失により説明される。従って、本実施例は、両方の技術を相補的に用いて、複雑なポリクローナルタンパク質の安定的産生を得られる培養間隔を定義することを十分に示すものである。
本実施例は、ポリクローナル細胞培養物からもたらされた10種類の個々のメンバーを有するポリクローナル抗RhD抗体の組成の分析を説明するものである。1次元陽イオン交換および2次元逆相(RP)−HPLCをそれぞれ用いて、正味電荷および疎水性における相違に基づき抗体を分離する2次元液体クロマトグラフィーを用いて、ポリクローナル抗体試料の多様性を評価した。
1次元の陽イオン交換クロマトグラフィーにより、正味電荷の異なる個々の抗体、ならびに電荷不均一性を示す個々の抗体が分離されるので、いくつかの抗体は単一ピークに表され得る。
本実施例は、ポリクローナル細胞培養物からもたらされた8種類の個々のメンバーを有するポリクローナル抗RhD抗体の特徴決定を説明するものである。「大量」N−末端配列分析を用いて、ポリクローナル抗体の多様性を評価した。
本実施例は、ポリクローナル細胞培養物からもたらされた8種類の個々のメンバーを有するポリクローナル抗RhD抗体の特徴決定を説明するものである。ペプチドを分離するためRP−HPLCまたはイオン交換クロマトグラフィー(IEX)のいずれかを用いて、可変領域を起源とする固有マーカーペプチドを単離することにより、抗体の多様性を分析した。
8種類の個々のメンバーを有するポリクローナル抗RhD抗体試料を、HiTraprタンパク質Aカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによりポリクローナル細胞培養物の上清から精製した。凍結乾燥した材料を6M 塩酸グアニジウム、0.5M EDTA、0.2M Tris HCl、pH8.4に溶解し、還元(DTT)し、カルボキシメチル化(ヨード酢酸)した。Ettan LCシステム(Amersham Biosciences, GE Healthcare, England)において、6M グアニジウムHCl、50mM リン酸ナトリウム、pH8.4中、Superose 12カラム(10/300 Amersham Biosciences, GE Healthcare)上でのゲルろ過により、重鎖および軽鎖を分離した。分離したHC(〜3.5mg/ml)およびLC(6.5mg/ml)を、リン酸ナトリウム、pH8中の酵素対基質濃度1:500にて、Endoproteinase Asp−N(Roche, 1 054 589)で消化した。
ポリクローナル抗体試料から得られた単離HCおよびLCの個々のAsp−N消化物のアリコートを、流速0.2ml/分を用いて0.1% TFAにて平衡化したガードカラム(Zorbax 300SB−C8、2.1×12.5mm、5μm)と結合したZorbax 300SB−C18(2.1×150mm)5μmカラムを装備したAgilent 1100 LC/MSD SLシステムに適用した。直線的勾配の0.08% TFA、70% アセトニトリルを用いてペプチドを溶出した。ペプチドを220nmにおいて分光光度法により検出し、オンラインのMS(大気圧イオン化(API)エレクトロスプレー)により分析した。75% プロピオン酸/25% イソプロパノールの混合物を移動相にポストカラム添加し、シグナルを増大させた。得られた質量スペクトルをChemstationソフトウェア(Agilent Technologies, CA)およびBioLynxソフトウェア(Micromass, Waters Corporation, MA)を用いて分析した。
HCおよびLCのAsp−N消化物を強陽イオン交換クロマトグラフィーにより次の通り分離した:上述のポリクローナル抗体から得られた単離HCおよびLCの個々のAsp−N消化物のアリコートを、Ettan LCシステム(Amersham Biosciences, GE Healthcare, England)において、10mM リン酸カリウム、20%(v/v) アセトニトリル、pH3.0にて平衡化したPolySulfoethyl Aカラム(2.1×100mm)に、流速0.2ml/分、室温にてアプライした。次に、10mM リン酸カリウム、20%または30%(v/v) アセトニトリル、pH3.0中の0〜500mMの直線的勾配の塩化カリウムを用いて、ペプチドを溶出した。溶出したペプチドを215nmにて分光光度法により検出し、時間フラクションに基づきフラクションを収集した。フラクションのアリコート(1μl)を、70% アセトニトリル/30%、0.1% TFA中のα−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸(20mg/mL)溶液1μlと混合し、MS標的上にアプライし、次に、0.1% TFAで洗浄した。試料を、Autoflex TOF(Bruker Daltronics, Bremen, Germany)上のMALDI−TOFにより分析し、Bruker Daltronics(Bremen, Germany)の校正用混合物を用いて、質量の外部校正を行った。GPMAW 6.1ソフトウェア(Lighthouse data, Odense, Denmark)を用いて、MALDIスペクトルを分析した(質量検索および内部校正)。
2種類の異なるマーカーペプチド分析から得られた結果は、HCおよびLCのMS分析から得られた統合データにより、RP−HPLCを用いて抗RhD rpABを構成する8種類の抗体全てから可変領域由来の固有ペプチドの同定を可能とすることを実証するのに十分である。強陽イオン交換クロマトグラフィーを用いることにより、抗RhD rpAb組成物中の8種類の個々のメンバーの中から6種類を同定することができた。完全に詳細までではないが、表11から14に示す程度まで、MS分析の結果を分析した。
本実施例は、ポリクローナル細胞培養物(バイオリアクターラン)からもたらされた25種類の個々のメンバーを有する組換えポリクローナル抗RhD抗体の特徴決定を説明するものである。ペプチドの同定のための質量分析と組み合わされたRP−HPLCを用いてLCまたはHC由来の可変領域を起源とする固有マーカーペプチドを単離することにより、抗体の多様性を分析した。
25種類の個々のメンバーを有するポリクローナル抗RhD抗体試料を、バイオリアクターラン由来のポリクローナル細胞培養物の上清から精製した。MabSelect(Amersham Biosciences, GE Healthcare)カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、精製を行い、G25カラム(Amersham Biosciences, GE Healthcare)上で脱塩した。凍結乾燥した材料を6M 塩酸グアニジウム、0.2M Tris HCl、pH8.4に溶解し、還元(DTT)し、次に、カルボキシメチル化(ヨード酢酸)した。6M グアニジウムHCl、50mM リン酸ナトリウム、pH8.4中Superose 12カラム(10/300 GL Amersham Biosciences, GE Healthcare)上でのゲルろ過により、重鎖および軽鎖を分離した。分離したHCおよびLCを、1M 尿素、50mM リン酸ナトリウム、pH8中酵素対基質濃度1:200、37℃にて一晩Endoproteinase Asp−N(Roche, 1 054 589)で消化した。
ポリクローナル抗体試料から得られた単離HCおよびLCの個々のAsp−N消化物のアリコートを、0.1% TFA、14% ACN中、流速0.2ml/分を用いて平衡化したガードカラム(Zorbax 300SB−C8、2.1×12.5mm、5μm)と結合したZorbax 300SB−C18(2.1×150mm)5μmカラムを装備したAgilent 1100 LC/MSD SLシステムに適用した。直線的勾配の0.08% TFA、70% アセトニトリルを用いて、ペプチドを溶出した。ペプチドを220nmにて分光光度法により検出し、オンラインのMS(大気圧イオン化(API)エレクトロスプレー)により分析した。75% プロピオン酸/25% イソプロパノールの混合物を、移動相にポストカラム添加し、シグナルを増大させた。得られた質量スペクトルをChemstationソフトウェア(Agilent Technologies, CA)およびGPMAW 6.2ソフトウェア(Lighthouse data, Odense, Denmark)を用いて分析した。
本実施例は、組換えポリクローナル抗RhD抗体の個々のメンバーに対する特異性を有する抗イディオタイプペプチドの生成、ならびに組換えポリクローナル抗体における1種類の個々のメンバーの濃度の評価を説明するものである。
PIII(New England Biolab)のN−末端でランダムな配列順序で7種類のアミノ酸を提示するファージライブラリーを、個々の抗RhD抗体に対するペプチド結合体のアフィニティー選択のために用いた。ペプチドライブラリーの線形および制約バージョンの両方を選択のために用いた。4℃にて12〜16時間、10μg/ml(1ウェル当たり100μlを用いる)精製モノクローナル抗RhD抗体でマイクロタイタープレート(Maxisorb, NUNC)をコートした。組換えポリクローナル抗RhD抗体に含有される25種類の個々の抗体全てを用いて、抗イディオタイプペプチドについてスクリーニングした。しかしながら、組換えポリクローナル抗体が多数の個々のメンバー(例えば、50より多い)を含有する状況下では、センチネル抗体をスクリーニングのために選択してもよい。好ましくは、組換えポリクローナルタンパク質を構成する抗体の総数の少なくとも4%に該当する多数のセンチネル抗体を選択し、なおより好ましくは、組換えポリクローナルタンパク質を構成する抗体の総数の少なくとも8%、12%、16%、20%、30%、または50%で構成されるセンチネル抗体が選択される。次に、コートしたプレートをPBS、0.05% Tween−20で洗浄し、2% スキムミルク/PBSを用いてブロックした。〜1011pfu/100μlのバクテリオファージを、各パニングラウンドに用いた。制約ライブラリーおよび線形ライブラリーを混合し、2% スキムミルク/PBS中の混合物として一緒にパニングした。室温にて1時間インキュベーションした後、結合ファージを、グリシン/HCl、pH=2.2で10分間溶出し、次に、Tris−HCl、pH=9.0を用いて中和した。パニング3から4ラウンド後、単一クローンを単離し、DNAを抽出し、次に、ランダムなペプチド領域に対応する領域において配列決定した。以下の表15は、単一クローン由来の推定アミノ酸配列のアラインメントを示す。
適切な希釈の精製抗RhD305モノクローナル抗体を参照標準として用いて、組換えポリクローナル抗RhD抗体混合物中の抗体総量に対する抗RhD305抗体量を決定することが可能であった。簡単にいうと、ELISAプレートをストレプトアビジンでコートし、PBS中〜10μg/mlまで希釈したPEP305と1時間インキュベーションした。インキュベーション後、過剰なペプチドを洗浄して除去した。次に、プレートを2% スキムミルク/PBSにおいてブロッキングし、3回洗浄した。25種類の個々の抗RhD抗体(試料)からなる組換えポリクローナル抗RhD抗体を、1から16384倍の範囲の希釈率で添加した。試料を4重に分析した。同じプレート上の別々のウェルにおいて、標準曲線を作成するために、参照試料としてモノクローナル抗RhD305抗体の連続希釈液(3重)(10μg/mlにて開始)を添加した。抗ヒトIgG結合体(カタログ番号H10307)を用いて、結合抗体を検出した。プレートを5回洗浄し、色素原(TMB, Kem-En-Tech)25μlを添加することにより、検出を行った。1M H2SO425μlを添加することにより、15〜25分後に反応を終結させた。吸光度を450nmにて測定した。
本実施例は、組換えポリクローナル抗RhD抗体の液体イオン交換クロマトグラフィー分析による1次元の分離後、特定のフラクション/ピークにおけるセンチネル抗体を同定するための抗イディオタイプペプチドの使用を説明するものである。
医薬上使用するためにポリクローナルタンパク質を製造する場合、組成物の安定性の確保は重要な問題である。相同タンパク質の複雑な混合物中の個々のタンパク質メンバーを同定する能力のある特異的なペプチド−リガンドを用いて、発酵中、異なる生成時間ポイントで培地試料を抽出し、実施例7に記載のELISA法のような定量的検出法を適用することにより、製造中のポリクローナルタンパク質の組成物の安定性をモニターすることができる。
本実施例は、細胞培養混合物中の特定の抗RhD抗体産生細胞の同定方法を説明するものである。実施例において、抗イディオタイプペプチドおよび検出用フローサイトメトリーを用いて、2種類の異なる抗体産生細胞株を分析した。
本実施例は、個々のクローンの分布、またはポリクローナル細胞培養物中のかかるクローンのセンチネルセレクションを評価するためのリアルタイムPCRの使用を説明するものである。
好ましくは、70〜150ヌクレオチドの単位複製配列を得るように、プライマーを設計する。いくつかの可能性のあるプライマーの設計は、重鎖または軽鎖可変領域のFR3領域においてアニーリングする一致フォワードプライマー、および定常領域においてアニーリングするリバースプライマーである。試料の個々のメンバー間で異なるCDR領域の一部、好ましくは、CDR3領域に特異的なTaqManプローブを、目的の各クローンについて設計する。
Fwプライマー:CAC GGC TGA GTA TTA CTG TGC(配列番号24)
Rwプライマー:TTG GTG GAG CCA CTC GA(配列番号25)
mRNAまたはゲノムDNAをペレット化細胞から抽出する。mRNAを鋳型として用いる場合、リアルタイムPCRに先立ち、逆転写してcDNAを生成する。分析すべきクローン数に対応する数のリアルタイムPCR反応をセットアップする。
異なるクローンのCT値を互いに比較し、ポリクローナル細胞株における各クローンの分布を計算する。方法を応用して、バッチとバッチとの間の変動ならびに個々の生産工程における経時的なクローン安定性を評価し得る。
本実施例は、ポリクローナル細胞株からもたらされた単一細胞クローン由来の重鎖および/または軽鎖抗体遺伝子の可変領域のDNA配列決定により、組換えポリクローナル抗体を産生する能力のあるポリクローナル細胞株(例えば、pWCB)のポリクローナル性質を評価し、明らかにする方法を説明するものである。
pWCBのアンプルを解凍し、完全培地にて2、3日間培養し、良好な細胞バイアビリティーを再構築した。続いて、96ウェル細胞培養プレート中、完全培地中1細胞/ウェルの密度にて細胞を播種する限界希釈により、シングルセルクローンを得る。37℃、5% CO2にて、10〜20日間細胞を培養し、次に、顕微鏡下でシングルコロニーを有するウェルについて、プレートを視覚的にスコア化する。別法として、FACS細胞ソーターを用いて、pWCB由来のシングルセルクローンを得る。生存可能なpWCB細胞にゲートをかけ、予め条件完全培地100μlで満たした96ウェルプレートに、1細胞/ウェルにて播種する。細胞をインキュベーションし、上述の通り、シングルコロニーについてスコア化する。
ウェル中のシングルセルコロニーをコンフレントまで成長させるとき、所望数(例えば、100)のウェルのそれぞれからのアリコート(10〜20μl)を新しい96ウェルプレートに移し、DNA配列決定反応の鋳型として用いる。1から100、または1から1000個の細胞をそれぞれ用いてmRNAレベルまたはゲノムレベルのいずれかで、配列決定を行う。前者の場合、pWCBに存在する異なる抗体重鎖および軽鎖遺伝子を区別するのに十分な可変領域(典型的には、少なくともCDR3領域)をカバーするPCRフラグメントを、例えば、市販のQiagen one−step RT−PCRキットを用いて、製造元の指示に従い、標準的RT−PCR技術により生成する。PCR反応に先立ち、細胞を溶解させる。得られたPCRフラグメントを、例えば、Qiagen Qiaquick Gel Extractionキットを用いてゲル精製し、標準的配列決定反応における鋳型として用い、次に、ABI Prism[登録商標]3100 Genetic Analyzer(Applied Biosystems)のような自動DNA配列決定マシーンにおいて分析する。別法として、DNA配列決定を、逆転写工程を省略する以外上述の通り、ゲノムDNAにおいて行う。
VH増幅用PCRプライマー:
RhD番号001:5’TCTCTTCCGCATCGCTGTCT(配列番号34)
RhD番号007:5’AGGAAAGGACAGTGGGAGTGGCAC(配列番号35)
VL増幅用PCRプライマー:
RhD番号005:5’CGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTG(配列番号36)
RhD番号008:5’AAGACCGATGGGCCCTTGGTGGA(配列番号37)
配列決定プライマー:
VH:5’AACGGGTTTGCCGCCAGAACA(配列番号38)
VL:5’CCGAGGGACCTGAGCGAGT(配列番号39)。
核酸配列決定に対する手助けとして、ポリクローナルワーキングセルバンクのような抗体産生細胞の混合物のクローナルな組成物を、抗イディオタイプペプチドELISAを用いて評価することができる。
本実施例は、組換えポリクローナル抗体の下流プロセッシング(DSP)中のクローン多様性を評価するための陽イオンクロマトグラフィー分析の使用を説明するものである。
25種類の個々のメンバーを含有する抗RhD rpAb試料を、発展的バイオリアクターランから、次のDSP工程を用いて精製した:
1.MAbSelectカラムを用いた抗体の捕獲
2.pH3でのウイルスの不活化
3.sephadex G−25カラムを用いたバッファー交換
4.DEAE−セファロースカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィー
5.Planova 15Nフィルターを用いたウイルスフィルトレーション、および
6.MEP hypercelカラムを用いた疎水性電荷導入クロマトグラフィー
7.milipore biomaxフィルターを用いた限外ろ過/ダイアフィルトレーション。
陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、組換えポリクローナル抗体組成物のDSP中のクローン多様性を分析した。抗RhD rpAbのDSP中、工程1、3、4、および6の後に採取した試料を、25mM 酢酸ナトリウム、150mM 塩化ナトリウム、pH5.0中、流速60ml/時間、室温にてPolyCatAカラム(4.6×100mm)にアプライした。次に、25mM 酢酸ナトリウム、pH5.0中150〜500mMの直線的勾配の塩化ナトリウムを用いて、流速60ml/時間にて抗体成分を溶出した。抗体成分を280nmにて分光光度法により検出し、クロマトグラム(図15)を比較して、DSP中のクローン多様性の可能性のある損失を検出した。本実施例において、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、クローン多様性が組換えポリクローナル抗体のDSP中に本質的に変化しないことを明らかにした。
RhDに対する40種類より多くの抗体のIEX分析により、相当数の個々の抗体が図16Bに示す通り「3ピークパターン」を表すことを明らかにした。カルボキシペプチダーゼB処理、ならびに炭水化物分析は、この電荷不均一性が、C−末端リジンクリッピングまたはシアル酸の存在により引き起こされることを示した(データは示していない)。
ゲノム上の特定の部位と異なる組換え抗Rhesus Dモノクローナル抗体をそれぞれ発現する安定な細胞株(2004年7月20日に出願されたデンマーク特許出願PA 2004 01133に記載の通り、得たもの)を、4mM L−グルタミン(Invitrogen)および1:250希釈した抗凝集剤(Invitrogen)を添加した無血清Excell 302培地(JRH Biosciences, Andover, UK)における懸濁培養に適用し、拡大させ、次に、通常の凍結手段を用いて−150℃にて保存した。
上述の工程において精製したモノクローナル抗体を、本質的に実施例1に記載の強IEXクロマトグラフィーの対象とした。表18のIEX列は、選択した抗体のIEXプロファイルに存在するピーク数を概説するものである。かかるIEXプロファイルを図16においても示す。
2種類の選択した抗体(RhD198およびRhD307)のIEX分析から分離したピークのN−末端配列分析を、Procise 494 Sequencer(Applied Biosystems, CA)(製造元によより記載された通り操作)を用いて、Edman配列決定により、溶液中で行った。配列分析により、電荷不均一性が、HCのN−末端Glnの部分的環化に起因するものであることが明らかになった(表18参照)。従って、第1のピークは、HCの全体的にブロックされたN−末端(HCのN−末端が0の電荷を有する)を有する抗体を含有し;第2のピークは、HCのN−末端の1つがブロックされている(HCのN−末端が+1の電荷を有する)抗体に対応し、そして第3のピークは、HCのN−末端Glnが非修飾されている(HCのN−末端が+2の電荷を有する)抗体を表す可能性が最も高かった。N−末端グルタミン残基のPyroGluへの環化は、それをEdman配列決定に不応性にする。
部位指定変異誘発を用いて、N−末端GlnをGluに変えることにより、選択した抗体から電荷不均一性を除いた。重鎖中にN−末端Gln、および軽鎖中にN−末端Gluを有する全長抗体をコードする発現プラスミドRhD189を用いた。このプラスミドのVH領域には、シグナルペプチドコード領域の3’末端のAscI部位、およびJ領域のサイレントXhoI部位がフランクする。
N−末端の変異が抗体の機能に影響するかどうかを評価するために、天然の抗体であるRhD189、ならびにその変異誘発Glu対応物であるRhD189Eを、RhD陽性赤血球に対する結合についてアッセイした。
多くの抗RhD抗体のIEXプロファイルにおいて観察される不均一性は、これらの抗体におけるN−末端Gln残基の部分的環化に起因するものであった。抗RhD抗体におけるHCのN−末端GlnをGlu残基に置換することにより、おそらくRhD陽性赤血球に対する結合力に影響することなく、生来のN−末端の電荷不均一性を排除する。
Claims (28)
- 異なる可変領域を有する異なる相同タンパク質またはかかるタンパク質を産生する細胞を含む試料を、該タンパク質の個々のメンバーまたはそれらのコード配列の相対的比率または存在に関する情報が得られるように特徴付ける方法であって、1種類以上のタンパク質特徴決定技術により、および/またはタンパク質コード配列の1種類以上の遺伝子分析により該試料のアリコートを分析することを含む、方法。
- 該遺伝子分析が、RFLP、T−RFLP、マイクロアレイ分析、定量的PCR、および核酸配列決定から選択されるものである、請求項1記載の方法。
- 試料が該培養物の細胞を含む細胞培養物フラクションである、請求項1または2記載の方法。
- 該タンパク質特徴決定技術が、i)物理化学的特性によりタンパク質を分離するクロマトグラフ分析、ii)相同タンパク質のタンパク分解消化産物の分析、iii)「大量」N−末端配列決定、およびiv)相同タンパク質に特異的な検出分子を用いた分析から選択されるものである、請求項1記載の方法。
- 該クロマトグラフ分析がサイズよりむしろ別の物理化学的特性に基づくものである、請求項4記載の方法。
- 個々のクロマトグラフ分析が、i)正味電荷、ii)疎水性、iii)等電点、およびiv)アフィニティーから選択される物理化学的特性に基づくものである、請求項4記載の方法。
- クロマトグラフ分析が多次元クロマトグラフィーとして行われる、請求項4から6のいずれか1項記載の方法。
- 相同タンパク質のタンパク分解性消化産物の分析が、特徴的なアミノ酸側鎖官能基を有するN−末端マーカーペプチドまたはペプチドを単離するために行われる、請求項4記載の方法。
- 該特異的検出分子が、抗イディオタイプペプチドまたは抗イディオタイプ抗体である、請求項4記載の方法。
- 該抗イディオタイプペプチドまたは抗イディオタイプ抗体が、ポリクローナル細胞株における個々のタンパク質産生細胞の決定において利用される、請求項9記載の方法。
- 該試料が細胞培養上清からもたらされるものである、請求項1または4から9のいずれか1項記載の方法。
- 該特徴決定が該試料に存在する1種類以上のセンチネルタンパク質またはセンチネル核酸配列の分析に基づくものである、請求項1から11のいずれか1項記載の方法。
- 少なくとも2種類の分析技術が該試料を分析すのに適用される、請求項1から12のいずれか1項記載の方法。
- 一方の分析技術が請求項4から9のいずれか1項記載のタンパク質特徴決定技術であり、そしてもう一方の分析技術が請求項2記載の遺伝子分析である、請求項13記載の方法。
- 該試料が培養中の異なる時間ポイントで単一のポリクローナル細胞培養物から得られものであり、そして該個々の相同タンパク質および/またはコード配列の相対的比率が比較される、請求項1から14のいずれか1項記載の方法。
- 該試料が特定の時間ポイントで異なるポリクローナル細胞培養物から得られものであり、そして該個々の相同タンパク質および/またはコード配列の相対的比率が比較される、請求項1から14のいずれか1項記載の方法。
- 異なる可変領域を有する異なる相同タンパク質が組換えタンパク質である、請求項1から16のいずれか1項記載の方法。
- 組換えタンパク質が組換えポリクローナルタンパク質を構成するものである、請求項17記載の方法。
- 異なる可変領域を有する異なる相同タンパク質が異なるCDR領域を有する抗体である、請求項1から18のいずれか1項記載の方法。
- 異なる可変領域を有する異なる相同タンパク質が異なるCDR領域を有するT細胞受容体である、請求項1から18のいずれか1項記載の方法。
- ポリクローナル細胞株における個々のタンパク質産生細胞の単離および/または決定のための、抗イディオタイプペプチドまたは抗イディオタイプ抗体の使用。
- ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の混合物からの多様性に関する個々の抗体分子の分離における、多次元クロマトグラフィーの使用。
- ポリクローナルT細胞受容体またはモノクローナルT細胞受容体の混合物からの多様性に関する個々のT細胞受容体分子の分離における、多次元クロマトグラフィーの使用。
- 組換えタンパク質中のN−末端グルタミン残基の環化により引き起こされるN−末端の電荷不均一性を解消する方法であって、該N−末端グルタミン残基を別のアミノ酸に置換することを含む、方法。
- 該置換が該タンパク質をコードする核酸配列の部位指定変異誘発により行われる、請求項24記載の方法。
- 該置換がポリクローナルタンパク質の1種類以上の個々のメンバーにおいて行われる、請求項24または25記載の方法。
- 該タンパク質が抗体またはT細胞受容体である、請求項24から26のいずれか1項記載の方法。
- 正味電荷に基づくクロマトグラフ分析を適用する方法であって、N−末端グルタミン残基の環化により引き起こされる電荷不均一性を示すタンパク質が請求項24から27記載の方法の対象とされる、請求項1またはその従属請求項に記載の方法。
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Cited By (2)
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---|---|---|---|---|
JP2013523182A (ja) * | 2010-04-15 | 2013-06-17 | アボット・ラボラトリーズ | アミロイドベータ結合タンパク質 |
JP2021528435A (ja) * | 2018-06-22 | 2021-10-21 | ゲンマブ エー/エス | 2つ以上の異なる抗体の制御された混合物を産生するための方法 |
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---|---|---|---|---|
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CA2676049C (en) * | 2007-03-01 | 2018-04-10 | Symphogen A/S | Recombinant anti-epidermal growth factor receptor antibody compositions |
SI2121920T1 (sl) * | 2007-03-01 | 2011-12-30 | Symphogen As | Postopek za kloniranje sorodnih protiteles |
CA2678628A1 (en) * | 2007-03-06 | 2008-09-12 | Symphogen A/S | Recombinant antibodies for treatment of respiratory syncytial virus infections |
EP2139509A2 (en) * | 2007-03-15 | 2010-01-06 | Biogen Idec MA, Inc. | Treatment of autoimmune disorders |
CN101688204B (zh) | 2007-05-25 | 2013-07-03 | 西福根有限公司 | 用于制造重组多克隆蛋白质的方法 |
JP2008289483A (ja) * | 2007-05-25 | 2008-12-04 | Symphogen As | 真核生物系において発現可能な形質転換体のスクリーニング |
RU2010113510A (ru) * | 2007-09-07 | 2011-10-20 | Симфоген А/С (Dk) | Способы рекомбинантной продукции антител против респираторно-цинцитиального вируса (rsv) |
NZ584684A (en) | 2007-11-22 | 2012-10-26 | Symphogen As | A method for characterization of a recombinant polyclonal protein |
SG189793A1 (en) * | 2008-04-23 | 2013-05-31 | Symphogen As | Methods for manufacturing a polyclonal protein |
AU2009287163B2 (en) | 2008-08-29 | 2014-11-13 | Les Laboratoires Servier | Recombinant anti-Epidermal Growth Factor Receptor antibody compositions |
KR20110058861A (ko) * | 2008-08-29 | 2011-06-01 | 심포젠 에이/에스 | 조류 유래 항체의 클로닝 방법 |
WO2011028961A2 (en) | 2009-09-04 | 2011-03-10 | Xoma Technology Ltd. | Anti-botulism antibody coformulations |
CA2776508A1 (en) * | 2009-10-09 | 2011-04-14 | Symphogen A/S | Multiplex quantitation of individual recombinant proteins in a mixture by signature peptides and mass spectrometry |
ES2616961T3 (es) | 2010-11-01 | 2017-06-14 | Symphogen A/S | Composición de anticuerpos pan-HER |
US9790269B2 (en) | 2013-02-08 | 2017-10-17 | Misfolding Diagnostics, Inc. | Transthyretin antibodies and uses thereof |
UY35517A (es) | 2013-04-04 | 2014-10-31 | Mabxience S A | Un procedimiento para aumentar la formación de ácido piroglutamico de una proteína |
WO2015093925A1 (es) * | 2013-12-19 | 2015-06-25 | CASTRO ALDRETE, Jorge Isaac | Método de producción de anticuerpos específicos |
TW201623331A (zh) * | 2014-03-12 | 2016-07-01 | 普羅帝納生物科學公司 | 抗黑色素瘤細胞黏著分子(mcam)抗體類及使用彼等之相關方法 |
EP3497444A4 (en) * | 2016-08-12 | 2020-11-11 | Abreos Biosciences, Inc. | DETECTION AND QUANTIFICATION OF NATALIZUMAB |
CN112816595A (zh) * | 2021-01-06 | 2021-05-18 | 海默斯(重庆)医学生物技术有限公司 | 一种重组角蛋白液体制剂及其纯度检测方法 |
Citations (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH07505469A (ja) * | 1992-03-24 | 1995-06-15 | アバント・イムノセラピューティクス・インコーポレイテッド | 蛋白質精製 |
JPH07213290A (ja) * | 1985-05-15 | 1995-08-15 | Biotechnol Australia Pty Ltd | ポリヌクレオチド配列、組換えdna分子および形質転換体宿主 |
JPH11174038A (ja) * | 1997-12-10 | 1999-07-02 | Tosoh Corp | 蛋白質の分離精製法 |
JP2001502887A (ja) * | 1996-08-09 | 2001-03-06 | ユニバーシティ オブ サスカッチェワン | GnRH―ロイコトキシンキメラ |
US6335163B1 (en) * | 1994-01-31 | 2002-01-01 | The Trustees Of Boston University | Polyclonal antibody libraries |
WO2002052259A1 (en) * | 2000-12-26 | 2002-07-04 | The Institute For Systems Biology | Rapid and quantitative proteome analysis and related methods |
US20020155114A1 (en) * | 1998-08-31 | 2002-10-24 | James D. Marks | Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins |
JP2003504638A (ja) * | 1999-07-16 | 2003-02-04 | ヒューマン ジノーム サイエンシーズ, インコーポレイテッド | 赤外分光法に応じたリアルタイムのインサイチュバイオマニュファクチャリングプロセスのモニタリングおよび制御 |
WO2004009618A2 (en) * | 2002-07-18 | 2004-01-29 | Crucell Holland B.V. | Recombinant production of mixtures of antibodies |
JP2004101477A (ja) * | 2002-09-12 | 2004-04-02 | Yoshio Yamauchi | 2次元高速液体クロマトグラフ装置及びそれを用いた蛋白質分析装置 |
JP2004514444A (ja) * | 2000-11-28 | 2004-05-20 | アプライド モレキュラー エボリューション, インコーポレイテッド | 二重lox組換えに基づく真核生物発現ライブラリーおよび使用方法 |
JP2005513481A (ja) * | 2001-12-08 | 2005-05-12 | マイクロマス ユーケー リミテッド | マススペクトル測定方法 |
JP2005520163A (ja) * | 2001-07-17 | 2005-07-07 | シファーゲン バイオシステムズ, インコーポレイテッド | ラテックスベース吸着チップ |
JP2006515520A (ja) * | 2003-01-07 | 2006-06-01 | シムフォゲン・アクティーゼルスカブ | 組換え型ポリクローナルタンパク質の製造方法 |
Family Cites Families (35)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1985002413A1 (en) | 1983-11-28 | 1985-06-06 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. U | HUMAN MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST Rh(D) ANTIGEN AND ITS USES |
CA1293460C (en) | 1985-10-07 | 1991-12-24 | Brian Lee Sauer | Site-specific recombination of dna in yeast |
US5126130A (en) | 1986-11-24 | 1992-06-30 | The Childrens Hospital Incorporated | Monoclonal antibodies reactive with specific antigenic sites on human cytomegalovirus glycoprotein a |
GB8722019D0 (en) | 1987-09-18 | 1987-10-28 | Central Blood Lab Authority | Human anti-rh(d)monoclonal antibodies |
GB8722020D0 (en) | 1987-09-18 | 1987-10-28 | Central Blood Lab Authority | Human anti-rh(d)monoclonal antibodies |
GB8722018D0 (en) | 1987-09-18 | 1987-10-28 | Central Blood Lab Authority | Human anti-rh(d)monoclonal antibodies |
DE68913658T3 (de) | 1988-11-11 | 2005-07-21 | Stratagene, La Jolla | Klonierung von Immunglobulin Sequenzen aus den variablen Domänen |
GB8906129D0 (en) | 1989-03-17 | 1989-05-04 | Central Blood Lab Authority | Pharmaceutical preparations |
GB8919761D0 (en) | 1989-09-01 | 1989-10-18 | Central Blood Lab Authority | Chemical compounds |
WO1992015694A1 (en) | 1991-03-08 | 1992-09-17 | The Salk Institute For Biological Studies | Flp-mediated gene modification in mammalian cells, and compositions and cells useful therefor |
CA2116246A1 (en) | 1992-06-26 | 1994-01-06 | Roland Beliard | Human monoclonal anti-rhesus (d) antibodies and cell lines producing same |
US5538848A (en) | 1994-11-16 | 1996-07-23 | Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. | Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe |
FR2724182B1 (fr) | 1994-09-02 | 1996-12-13 | Pasteur Institut | Obtention d'un anticorps monoclonal recombinant a partir d'un anticorps monoclonal humain anti-rhesus d, sa production en cellules d'insecte, et ses utilisations |
US6111166A (en) | 1994-09-19 | 2000-08-29 | Medarex, Incorporated | Transgenic mice expressing human Fcα and β receptors |
PL186019B1 (pl) | 1996-06-24 | 2003-09-30 | Zlb Bioplasma Ag | Polipeptydy zdolne do tworzenia struktur wiążących antygen o swoistości względem antygenów Rh D, sekwencje DNA kodujące te polipeptydy oraz sposób ich wytwarzania i stosowania |
US6255455B1 (en) | 1996-10-11 | 2001-07-03 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Rh(D)-binding proteins and magnetically activated cell sorting method for production thereof |
US5876925A (en) | 1996-10-11 | 1999-03-02 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Magnetically activated cell sorting for production of proteins |
JP4128227B2 (ja) | 1997-03-14 | 2008-07-30 | バイオジェン・アイデック・インコーポレイテッド | 哺乳類細胞内の特定部位に相同組換えによって遺伝子を組み込む方法とそれを実施するためのベクター |
WO2000011155A1 (en) | 1998-08-19 | 2000-03-02 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and compositions for genomic modification |
DK1234022T3 (da) | 1999-07-23 | 2010-07-19 | Univ California | DNA-rekombination i eukaryote celler med bakteriofag PHIC31-rekombinationssystemet |
EP1106625A1 (en) | 1999-11-17 | 2001-06-13 | ZLB Bioplasma AG | Rhesus D specific peptide sequences |
CA2401663C (en) | 2000-02-08 | 2008-11-25 | The Regents Of The University Of Michigan | Protein mapping |
MXPA02007664A (es) | 2000-02-08 | 2004-08-23 | Univ Michigan | Separacion y representacion de proteinas. |
EP1256001A2 (en) | 2000-02-08 | 2002-11-13 | The Regents Of The University Of Michigan | Mapping of differential display of proteins |
AU6206701A (en) | 2000-05-26 | 2001-12-03 | Symphogen As | Recombinant or purified polyclonal antibodies for treating allergy |
US6610472B1 (en) | 2000-10-31 | 2003-08-26 | Genetastix Corporation | Assembly and screening of highly complex and fully human antibody repertoire in yeast |
AU2003237282A1 (en) | 2002-05-31 | 2003-12-19 | The Regents Of The University Of Michigan | Automated protein analysis system comprising capillary electrophoresis-tandem mass spectrometry |
US20040137526A1 (en) | 2002-10-15 | 2004-07-15 | The Regents Of The University Of Michigan | Multidimensional protein separation system |
US20060275766A1 (en) * | 2003-01-07 | 2006-12-07 | Haurum John S | Method for manufacturing recombinant polyclonal proteins |
TWI333977B (en) | 2003-09-18 | 2010-12-01 | Symphogen As | Method for linking sequences of interest |
NZ552264A (en) | 2004-07-20 | 2010-03-26 | Symphogen As | A procedure for structural characterization of a recombinant polyclonal protein or a polyclonal cell line |
CA2574062A1 (en) | 2004-07-20 | 2006-01-26 | Symphogen A/S | Anti-rhesus d recombinant polyclonal antibody and methods of manufacture |
US7850965B2 (en) | 2005-12-05 | 2010-12-14 | Symphogen A/S | Anti-orthopoxvirus recombinant polyclonal antibody |
MX2008011280A (es) | 2006-03-06 | 2008-09-12 | Symphogen As | Anticuerpor policlonal recombinante para el tratamiento de infecciones por el virus sincitial respiratorio. |
NZ584684A (en) | 2007-11-22 | 2012-10-26 | Symphogen As | A method for characterization of a recombinant polyclonal protein |
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- 2009-12-29 IL IL203017A patent/IL203017A/en not_active IP Right Cessation
-
2012
- 2012-10-16 US US13/653,316 patent/US9029091B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH07213290A (ja) * | 1985-05-15 | 1995-08-15 | Biotechnol Australia Pty Ltd | ポリヌクレオチド配列、組換えdna分子および形質転換体宿主 |
JPH07505469A (ja) * | 1992-03-24 | 1995-06-15 | アバント・イムノセラピューティクス・インコーポレイテッド | 蛋白質精製 |
US6335163B1 (en) * | 1994-01-31 | 2002-01-01 | The Trustees Of Boston University | Polyclonal antibody libraries |
JP2001502887A (ja) * | 1996-08-09 | 2001-03-06 | ユニバーシティ オブ サスカッチェワン | GnRH―ロイコトキシンキメラ |
JPH11174038A (ja) * | 1997-12-10 | 1999-07-02 | Tosoh Corp | 蛋白質の分離精製法 |
US20020155114A1 (en) * | 1998-08-31 | 2002-10-24 | James D. Marks | Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins |
JP2003504638A (ja) * | 1999-07-16 | 2003-02-04 | ヒューマン ジノーム サイエンシーズ, インコーポレイテッド | 赤外分光法に応じたリアルタイムのインサイチュバイオマニュファクチャリングプロセスのモニタリングおよび制御 |
JP2004514444A (ja) * | 2000-11-28 | 2004-05-20 | アプライド モレキュラー エボリューション, インコーポレイテッド | 二重lox組換えに基づく真核生物発現ライブラリーおよび使用方法 |
JP2004528533A (ja) * | 2000-12-26 | 2004-09-16 | ザ インスティチュート フォー システムズ バイオロジー | 迅速かつ定量的なプロテオーム解析および関連した方法 |
WO2002052259A1 (en) * | 2000-12-26 | 2002-07-04 | The Institute For Systems Biology | Rapid and quantitative proteome analysis and related methods |
JP2005520163A (ja) * | 2001-07-17 | 2005-07-07 | シファーゲン バイオシステムズ, インコーポレイテッド | ラテックスベース吸着チップ |
JP2005513481A (ja) * | 2001-12-08 | 2005-05-12 | マイクロマス ユーケー リミテッド | マススペクトル測定方法 |
WO2004009618A2 (en) * | 2002-07-18 | 2004-01-29 | Crucell Holland B.V. | Recombinant production of mixtures of antibodies |
JP2006515503A (ja) * | 2002-07-18 | 2006-06-01 | クルセル ホランド ベー ヴェー | 抗体混合物の組換え生産 |
JP2004101477A (ja) * | 2002-09-12 | 2004-04-02 | Yoshio Yamauchi | 2次元高速液体クロマトグラフ装置及びそれを用いた蛋白質分析装置 |
JP2006515520A (ja) * | 2003-01-07 | 2006-06-01 | シムフォゲン・アクティーゼルスカブ | 組換え型ポリクローナルタンパク質の製造方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
TOLO H. ET AL.: "Development of a highly purified multicomponent leukocyte IFN-alpha product.", J.INTERFERON CYTOKINE RES., vol. Vol.21(11), JPN6010072579, 2001, pages 913 - 20, ISSN: 0002050112 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013523182A (ja) * | 2010-04-15 | 2013-06-17 | アボット・ラボラトリーズ | アミロイドベータ結合タンパク質 |
JP2016028030A (ja) * | 2010-04-15 | 2016-02-25 | アッヴィ・インコーポレイテッド | アミロイドベータ結合タンパク質 |
JP2018058837A (ja) * | 2010-04-15 | 2018-04-12 | アッヴィ・インコーポレイテッド | アミロイドベータ結合タンパク質 |
JP2020103288A (ja) * | 2010-04-15 | 2020-07-09 | アッヴィ・インコーポレイテッド | アミロイドベータ結合タンパク質 |
JP2021528435A (ja) * | 2018-06-22 | 2021-10-21 | ゲンマブ エー/エス | 2つ以上の異なる抗体の制御された混合物を産生するための方法 |
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