MX2007000551A

MX2007000551A - Procedimiento para la caracterizacion estructural de una proteina policlonal recombinante o una linea celular policlonal.

Info

Publication number: MX2007000551A
Application number: MX2007000551A
Authority: MX
Inventors: Lone Kjaer Rasmussen; Torben Frandsen; Soeren Kofoed Rasmussen; Peter Sejer Andersen
Original assignee: Symphogen As
Priority date: 2004-07-20
Filing date: 2005-07-20
Publication date: 2007-03-30
Also published as: EP2053408B1; AU2005263334A1; HK1101043A1; CA2574146A1; HK1133076A1; RU2007106050A; ATE548657T1; JP2008506960A; IL180169A; KR20070032078A; DK2053408T3; PL2053408T3; ES2332524T3; US20130203063A1; NZ552264A; ES2381531T3; AU2005263334C1; BRPI0513714A; DE602005016818D1; NO20070931L

Abstract

La presente invencion proporciona una plataforma de caracterizacion estructural que puede ser utilizada para evaluar la estabilidad de una linea de celulas policlonales durante la produccion, asi como la consistencia de lote a lote de los productos policlonales finales. La plataforma de caracterizacion estructural esta basada en analisis geneticos asi como en tecnicas de caracterizacion de proteina que solas o en combinacion proporcionan la informacion necesaria para caracterizar la linea de celulas policlonales y los productos finales. La coleccion de diferentes proteinas homologas va a ser analizada con tecnicas de plataforma si es por ejemplo un anticuerpo policlonal recombinante o una mezcla de anticuerpos monoclonales.

Description

PROCEDIMIENTO PARA LA CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE UNA PROTEINA POLICLONAL RECOMBINANTE O UNA LINEA CELULAR POLICLONAL CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un procedimiento para la caracterización estructural de una proteína policlonal recombinante o una línea celular policlonal que produce tal proteína, con el fin de verificar la consistencia de lote a lote de los productos finales, así como la estabilidad composicional durante corridas de producción simples. En particular, la presente invención se refiere a un procedimiento para caracterizar un anticuerpo policlonal recombinante. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se ha reconocido por mucho tiempo que la administración profiláctica o terapéutica de anticuerpos (denominada inmunización pasiva) puede aumentar la habilidad del sistema inmune del cuerpo para eliminar agentes infecciosos . Tales anticuerpos terapéuticos han sido históricamente obtenidos a partir de plasma humano (de donde la composición del anticuerpo es denominada inmunoglobulina o gamma-globulina. Para obtener estos anticuerpos, son recolectados combinados de sangre proveniente de donadores humanos inmunes y la fracción de inmunoglobulina es extraída y purificada. Únicamente una fracción de la inmunoglobulina será específica para un antígeno particular. El uso terapéutico de REF:i77804 la inmunoglobulina es complicado a varias limitaciones tales como un número limitado de donadores, fabricación cara, riesgo de contaminantes infecciosos de donadores, variaciones inevitables de lote a lote, así como regímenes de administración complicados. Los anticuerpos monoclonales recombinantes han proporcionado recientemente una alternativa a los productos de inmunoglobulina. No obstante, éstos son únicamente dirigidos contra un objetivo simple y pueden por lo tanto no ser tan efectivos contra objetivos que son complejos o dinámicos, tales como agentes infecciosos. Existen algunos ejemplos para mezclar anticuerpos monoclonales con el fin de superar este problema (por ejemplo, Nowakows i, A. et al . 2002 Proc Nati Acad Sci USA 99, 11346-11350 y patente de los Estados Unidos No. 5,126,130). Recientemente, ha sido desarrollada una tecnología para la reproducción recombinante de anticuerpos policlonales altamente específicos, adecuados para la administración profiláctica y terapéutica (WO 2004/061104) . El anticuerpo policlonal recombinante (rpAb) puede ser purificado a partir de un biorreactor de producción como una preparación simple sin manejo, fabricación, purificación o caracterización separadas de los miembros individuales que constituyen la proteína policlonal recombinante. No obstante, tal estrategia de producción requiere un procedimiento para verificar la identidad y demostrar la producción consistente de la mezcla compleja de moléculas de anticuerpos sobre el tiempo. Además, un anticuerpo policlonal producido industrialmente utilizando tecnología recombinante tendrá que ser caracterizado a un cierto grado con el fin de obtener la aprobación como un fármaco de investigación o terapéutico a partir de las autoridades regulatorias nacionales y supranacionales . Ya que el procedimiento anticuerpo policlonal recombinante es un concepto completamente nuevo, El resultado de caracterización de una muestra que comprende múltiples proteínas diferentes pero altamente homologas con respecto a la proporción relativa de las proteínas individuales en la muestra, no ha sido nunca enfrentado anteriormente. De este modo, la inmunoglobulina derivada de sangre es en general aprobada con base en los datos de eficacia no clínica y clínica y a menudo los datos de seguridad histórica, así como la química cruda, la fabricación y los parámetros de control (CMC) , tales como la pureza, el título de enlace, y la ausencia de agentes adventicios . Tal procedimiento simplista es por supuesto no aceptable para las proteínas recombinantemente producidas. Por lo tanto, para las mezclas de unos pocos anticuerpos monoclonales, los lineamientos regulatorios establecen que tal mezcla debe ser sometida a caracterización individual de cada anticuerpo constituyente en la mezcla, utilizando técnicas integrales de caracterización química de proteínas, aunado con los ensayos biológicos. No obstante, éste no es un procedimiento técnicamente factible o apropiado para una composición genuinamente policlonal, con base en más de 10, 20 o incluso más anticuerpos diferentes. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una plataforma de caracterización estructural para demostrar la producción consistente de una mezcla de diferentes proteínas homologas, tal como una proteína policlonal recombinante, en particular un anticuerpo policlonal recombinante, a partir de una línea celular policlonal. Un pre-requisito para la producción de una proteína policlonal recombinante para el uso profiláctico y terapéutico es el mantenimiento de la diversidad clonal durante la expresión. Por lo tanto, es importante ser capaz de monitorizar y medir lo diversidad clonal de una línea celular policlonal que produce un anticuerpo policlonal, así como la representación relativa de proteínas individuales en la proteína policlonal a cualquier punto de tiempo deseado, y en cualquier muestra relevante, permitiendo de este modo el análisis de la estabilidad del sistema de expresión en una corrida simple, así como la variación de lote a lote del producto final . Las composiciones de proteína homologa, tales como un anticuerpo policlonal recombinante o un receptor de célula T policlonal, recombinante (TcR) están comprendidas de proteínas variantes con propiedades fisicoquímicas muy similares. Esto es una ventaja cuando se purifica una proteína policlonal recombinantemente producida, ya que la purificación puede ser realizada como si ésta fuera una proteína simple, sin la pérdida de diversidad durante el proceso. Esta similitud, no obstante, proporciona un reto cuando se caracteriza la distribución relativa de los miembros individuales de una proteína policlonal, debido a la similitud en las propiedades fisicoquímicas que hace distinguir a un miembro individual del otro. De manera más común, cuando se produce una proteína policlonal recombinante, la composición original es conocida, debido a que las secuencias que codifican para la proteína policlonal han sido aisladas, seleccionadas y secuenciadas antes de la generación de una vida celular de fabricación policlonal para la producción de la proteína policlonal recombinante. Para la generación de tal línea celular, por favor ver WO 2004/061104, incorporada por referencia en la presente. La rara excepción a esto pueden ser las situaciones donde una biblioteca no seleccionada o no clasificada, proveniente de un paciente convaleciente, es utilizado directamente para generar un anticuerpo policlonal recombinante . Para asegurar que la diversidad de la producción (la proteína policlonal recombinante) se asemeja a la diversidad de la entrada (la biblioteca de secuencias de codificación) después del cultivo y purificación será necesario obtener la información con respecto a la proporción relativa de los miembros individuales de la proteína policlonal y/o sus secuencias de codificación dentro de la línea celular de fabricación policlonal . La presente invención proporciona una plataforma de caracterización estructural, basada en análisis genéticos, así como las técnicas de caracterización de proteínas, capaces de proporcionar información con respecto a la diversidad de una línea celular policlonal y una proteína policlonal . DEFINICIONES El término "anticuerpo anti-idiotipo" se refiere a un anticuerpo de longitud completa, o fragmento del mismo (por ejemplo, un Fv, scFv, Fab, Fab' o F(ab)2) que se enlaza específicamente a la parte variante de un miembro individual de una proteína policlonal. Preferentemente, un anticuerpo anti-idiotipo de la presente invención se enlaza específicamente a la parte variante de un miembro individual de un anticuerpo policlonal o un TcR policlonal. La especificidad de anticuerpo anti-idiotipo está preferentemente dirigida contra la parte específica del antígeno de un miembro individual de un anticuerpo policlonal o un receptor de células T policlonal, la denominada región V. No obstante, ésta puede también mostrar especificidad hacia una sub-población definida de miembros individuales, por ejemplo, una familia de genes VH específicos representados en la mezcla. El término "péptido anti-idiotipo" se refiere a un péptido-ligando específico, que es capaz de asociarse específicamente y de este modo identificar un miembro de proteína individual dentro de una mezcla de proteínas homologas. Preferentemente, un péptido anti-idiotipo de la presente invención se enlaza específicamente a un miembro individual de un anticuerpo policlonal o un TcR policlonal. Los péptidos anti-idiotipo de la presente invención están preferentemente dirigidos contra la parte específica del antígeno de la secuencia de un anticuerpo individual o un receptor de célula T individual. Un péptido anti-idiotipo puede, no obstante, mostrar también especificidad hacia una sub-población definida de miembros individuales. El término "secuenciamiento N-terminal a "granel"" se refiere al secuenciamiento de la proteína N-terminal de una muestra que contiene un número de moléculas de proteína homologas variantes, por ejemplo, una proteína policlonal. Este secuenciamiento a granel proporciona la información de la secuencia de todas las proteínas diferentes presentes dentro de la muestra al mismo tiempo. En posiciones en donde los aminoácidos varían de entre los miembros individuales en la muestra, éstas pueden ser cuantificadas y las diferentes cantidades de aminoácidos individuales en diversas posiciones proporcionarán información con respecto a la sub-población de proteína que contiene una variación particular. Si las proteínas que van a ser secuencias N-terminalmente contienen más de una sub-unidad, esas son preferentemente separadas antes del secuenciamiento para reducir la complejidad, por ejemplo, si la muestra es un anticuerpo policlonal, las cadenas pesadas pueden ser separadas de las cadenas ligeras antes del secuenciamiento . El término "diversidad clonal" o "policlonalidad" se refiere a la variabilidad o diversidad de una proteína policlonal, las secuencias de ácido nucleico que las codifican, y la línea celular policlonal que la produce. La variabilidad está caracterizada por las diferencias en las secuencias de aminoácidos o las secuencias de ácido nucleico entre los miembros individuales de la proteína policlonal o la biblioteca de secuencias de codificación. Para las líneas celulares policlonales la diversidad clonal puede ser evaluada por la variabilidad de las secuencias de ácido nucleico representadas dentro de la línea celular, por ejemplo, como integraciones del sitio simple dentro del genoma de las células individuales. No obstante, ésta puede ser también evaluada como la variabilidad de las secuencias de aminoácidos representadas sobre las superficies de las células dentro de la línea celular. El término "epitopo" se refiere a la parte de una molécula antigénica a la cual se enlazará un receptor de célula T o un anticuerpo. Un antígeno o molécula antigénica en general representará varios o incluso muchos epitopos simultáneamente. El término "inmunoglobulina" es comúnmente utilizado como una designación colectiva de la mezcla de anticuerpos encontrados en el suero o en la sangre. Por lo tanto, un anticuerpo policlonal derivado de suero es a menudo denominado inmunoglobulina o gamma-globulina. No obstante, la inmunoglobulina puede ser también utilizada para designar una mezcla de anticuerpos derivados de otras fuentes, por ejemplo, inmunoglobulina recombinante. El término "clon individual" como se utiliza en la presente, denota una población isogénica de células que expresan una proteína particular, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal. Tales clones individuales pueden ser por ejemplo, obtenidos mediante transfección de una célula hospedera por un ácido nucleico deseado, y después de la selección para los transfectantes positivos, un clon simple puede ser expandido o un número de clones simples pueden ser combinados y expandidos . Una línea celular policlonal puede ser generada al mezclar clones individuales que expresan diferentes miembros individuales de una proteína policlonal. Los términos "un miembro individual" o "un miembro distinto" denotan una molécula de proteína de una composición de proteína que comprende moléculas de proteína diferentes pero homologas, tales como una proteína policlonal donde la molécula de proteína individual es homologa a las otras moléculas de la composición, pero también contiene uno o más tramos de la secuencia polipeptídica, que está caracterizada por diferencias en la secuencia de aminoácidos entre los miembros individuales de la proteína policlonal, también denominada una región variable. Por ejemplo, en un anticuerpo policlonal comprendido de Abl a Ab50, todas las proteínas con la secuencia de Abl serán consideradas como un miembro individual del anticuerpo policlonal, y Abl puede por ejemplo diferir de las proteínas Ab2 en la región CDR3. Una sub-población de miembros individuales puede ser por ejemplo, constituida de anticuerpos que pertenecen a Abl, Abl2 y Ab33. El término "anticuerpo policlonal" describe una composición de diferentes moléculas del anticuerpo que son capaces de enlazarse a o reaccionar con varios determinantes antigénicos, específicos, diferentes, sobre el mismo o sobre diferentes antígenos. La variabilidad de un anticuerpo policlonal está localizada en las denominadas regiones variables de los anticuerpos individuales que constituyen el anticuerpo policlonal, en particular, en las regiones de la determinación de la complementariedad (CDR)l, CDR2 y CDR3. Los términos "línea celular de fabricación policlonal", "línea celular policlonal" "banco de células maestras policlonales" (pMCB) " y "banco de células de trabajo policlonal (pWBC) " son utilizadas intercambiablemente y se refieren a una población de células que expresan proteína, que son transfectadas con una biblioteca de las secuencias variantes de ácido nucleico de interés. Preferentemente, las células individuales, las cuales conjuntamente constituyan la línea celular de fabricación policlonal recombinante, llevan únicamente una copia de una secuencia de ácido nucleico distinto de interés que codifica para un miembro de la proteína policlonal recombinante de interés, y cada copia es integrada dentro del mismo sitio del genoma de cada célula. Las células que pueden constituir tal línea celular de fabricación, pueden ser por ejemplo, bacterias, hongos, células eucarióticas, tales como levaduras, células de insecto o células de mamífero, especialmente líneas celulares de mamífero inmortales tales como las células CHO, células COS, células BHK, células de mieloma (por ejemplo, Sp2/0, NSO), NIH 3T3, YB2/0 y células humanas inmortalizadas, tales como las células HeLa, células HEK 293, o PER.C6. Como se utiliza en la presente, el término "proteína policlonal" se refiere a una composición de proteína que comprende moléculas de proteínas diferentes pero homologas, seleccionadas preferentemente de la super-familia de inmunoglobulinas. Aún más preferidas son las moléculas de proteína homologas que son anticuerpos o receptores de células T (TcR) . De este modo, cada molécula de proteína es homologa a las otras moléculas de la composición, pero también contiene uno o más tramos de secuencias polipeptídicas variables, que están caracterizadas por diferencias en la secuencia de aminoácidos entre los miembros individuales, también denominados miembros variantes distintos de la proteína policlonal. Los ejemplos conocidos de tales proteínas policlonales incluyen anticuerpos, receptores de células T, y receptores de células V. Una proteína policlonal puede consistir de un sub-grupo definido de moléculas de proteína, que ha sido definido por una característica común tal como la actividad de enlace compartida hacia un objetivo deseado, por ejemplo, en el caso de un anticuerpo policlonal contra el antígeno objetivo deseado. Una proteína policlonal recombinante está en general compuesta de tal subgrupo definido de molécula, donde la secuencia de cada miembro es conocida. Únicamente en casos raros una proteína policlonal recombinante puede asemejarse a una inmunoglobulina derivada de suero, en el sentido en que la proteína policlonal recombinante también contiene una proporción significativa de proteínas específicas no objetivo. El término "receptor de célula T policlonal (TcR) " describe una composición de diferentes moléculas de TcR que son capaces de enlazarse a o reaccionar con varios determinantes antigénicos específicos diferentes a partir del mismo o de diferentes antígenos. La variabilidad de un TcR policlonal está localizada en las denominadas regiones variables de las moléculas de TcR individuales que constituyen el TcR policlonal, en particular en las regiones CDRl, CDR2, CDR3 y CDR4. Las moléculas de TcR de la presente invención son dímeros solubles manipulados por ingeniería de las cadenas alfa-beta o las cadenas gamma-delta. Tales TcRs manipulados por ingeniería son por ejemplo, descritos en (Willcox, B.E. et al., 1999. Protein Sci 8, 2417-2423) . El término "proteína" se refiere a cualquier cadena de aminoácidos, no obstante de la longitud o modificación post-traduccional. Las proteínas pueden existir como monómeros o multímeros, que comprenden dos o más cadenas polipeptídicas ensambladas, fragmentos de proteínas, polipéptidos, oligopéptidos o péptidos. El término "proteína centinela" describe un miembro individual de una proteína policlonal, que puede ser monitorizado por su presencia durante la producción de la proteína policlonal o en diferentes lotes. La consistencia en la presencia de una proteína centinela en una serie de muestras relacionadas, reflejará la estabilidad en la expresión de una proteína policlonal entre lotes o sobre el tiempo en una producción simple. Además, éste reflejará el mantenimiento de la diversidad durante el procesamiento corriente abajo tal como la purificación de una proteína policlonal recombinantemente producida. El término "péptidos marcadores únicos" describe el número de péptidos que se originan de la región variable de los libros individuales de una proteína policlonal. Los péptidos son preferentemente generados mediante el tratamiento de proteasa u otros medios de fragmentación de proteínas y los péptidos que pueden ser no ambiguamente asignados a un miembro individual simple de la proteína policlonal son denominados péptidos marcadores únicos . BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 : Cromatogramas de intercambio de cationes del anticuerpo policlonal recombinante (rpAb anti-RhD) a partir de las alícuotas 3948 y 3949 después de 9 semanas de cultivo. El diagrama inferior corresponde a la alícuota 3949 y el superior a la alícuota 3938. El eje X del diagrama superior ha sido desplazado con el fin de separarlo del diagrama inferior. Los puntos A-J comprenden anticuerpos que difieren de la carga neta y los anticuerpos individuales que aparecen de carga heterogénea. Figura 2: Imagen en gel que muestra el análisis de RFLP de Hinfl sobre el producto de RT-PCR derivado de las alícuotas 3938+ y 3949+ de la línea celular policlonal (FCW065) que produce el rpAb anti-RhD después de 11 semanas de cultivo. Las bandas que pueden ser asignadas a los clones específicos están identificadas . Figura 3 : Patrones de T-RFLP de las cadenas ligeras del anticuerpo D anti-Rhesus proveniente de un cultivo de células policlonales que expresan el rpAb anti-RhD con ocho diferentes anticuerpos D anti-Rhesus. Los ocho diferentes clones D anti-Rhesus han sido asignados a los picos indicados por las flechas . Figura 4 : Patrones de T-RFLP de las regiones variables de cadena pesada del anticuerpo D anti-Rhesus provenientes de un cultivo de células policlonales que expresan rpAb anti-RhD con 25 diferentes anticuerpos D anti-Rhesus en un punto de tiempo dado. Los veinticinco diferentes clones D anti-Rhesus han sido asignados a los picos indicados por las flechas. Figura 5: Distribución del cDNA estimado por T-RFLP de ocho diferentes secuencias que codifican para la cadena pesada D anti-Rhesus a partir de un cultivo de células policlonales que fue cultivado por cinco semanas. Figura 6: Muestra el contenido relativo (%) de un rpAb anti-RhD, con ocho diferentes anticuerpos analizados utilizando cromatografía de intercambio catiónico. Los picos cromatográficos integrados fueron asignados a anticuerpos individuales a partir de los tiempos de retención y de los patrones pico obtenidos de los anticuerpos simples analizados individualmente utilizando cromatografía de intercambio catiónico bajo condiciones idénticas. Figura 7 : Cromatograma de intercambio catiónico de rpAb anti-RhD con veinticinco miembros individuales de una muestra obtenida después de 4 semanas de cultivo. Los picos ACl al 25 comprenden los anticuerpos que difieren en la carga neta, y los anticuerpos individuales que parecen de carga heterogénea. Figura 8: Perfil de elución a partir de un cromatograma de intercambio catiónico de un anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD con diez miembros individuales. Las letras indican los picos sometidos a RP-HPLC, en la segunda dimensión. Figura 9 : Muestra un perfil de elución a partir de RP-HPLC de la fracción B5 de la figura 8. Figura 10: Muestra un análisis composicional de 2D LC de un anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD con diez miembros individuales, visualizados por un mapa de proteínas codificado por color (representado en la escala de grises) . Figura 11: Muestra un perfil de elución a partir de una cromatografía de intercambio catiónico fuerte de una digestión con Asp-N del LC purificado proveniente de un anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD con ocho miembros individuales. La línea horizontal negrita indica fracciones sometidas al análisis MALDI-TOF para la identificación de los péptidos marcadores . Figura 12 : Muestra un traslape del cromatograma OD280IEX obtenido sobre un rpAb anti-RhD con veinticinco miembros individuales, con los datos de ELISA obtenidos a partir de tres análisis individuales de ELISA utilizando los péptidos anti-idiotipo, PEP162, PEP202 y PEP305. Los análisis de ELISA fueron realizados sobre cada fracción obtenida mediante cromatografía de intercambio iónico. Los datos de ELISA están normalizados a porcentaje del OD total, con el fin de hacer a los tres ensayos de ELISA con PEP162, PEP202 y PEP305, respectivamente, comparables uno con el otro. Figura 13 : Muestra la distribución de tres anticuerpos centinelas anti-RhDl62, 202 y 305, en diferentes tiempos de cultivo durante la fermentación. G8 corresponde al día 8 después de la inoculación del biorreactor. Figuras 14A-14C: Datos de FACS de tres líneas celulares teñidas con los tetrámeros REP202. (Fig. 14A) muestra la línea celular RHD162 negativa a PEP202. (Fig. 14B) muestra la línea celular RhD202, y (Fig. 14C) muestra una mezcla al 50% de las líneas celulares RhDl62 y RhD202 (correspondiente a la mezcla A en el experimento) . Las figuras 14A-14C muestran las líneas punteadas de FSC-SSC, donde Rl es la entrada para las células libres y saludables con base en el tamaño (FSC) y la granularidad (SSC) . El histograma en el panel intermedio describe la intensidad de fluorescencia de las células . La entrada R6 rodea las células teñidas con el tetrámero. El panel final muestra los porcentajes en R6 utilizadas en los cálculos.

Figurass 15A-15D: Perfiles de cromatografía de intercambio catiónico que muestran las muestras tomadas a diferentes etapas durante el procesamiento corriente abajo de una muestra de rpAb anti-RhD que contiene 25 miembros individuales representados por el material recolectado después de la elución de captura (Fig. 15A) , Sephadex G-25 (Fig. 15B) , DEAE-Sepharose (Fig. 15C) , y MEP Hypercel (Fig. 15D) . Figuras 16A-16C: Perfiles IEX de tres anticuerpos monoclonales representativos anti-RhD que muestran tres diferentes patrones de carga. (Fig. 16A) homogéneo, (Fig. 16B) patrón de "3 picos", (Fig. 16C) patrón complejo. Figura 17: Análisis IEX de RhDl89 y la variante mutada en Glu, RhDl89E. Figura 18: Actividad de enlace de la variante RhDl89E de Glu, y su contraparte nativa RhDl89. El enlace de los anticuerpos a los eritrocitos positivos RhD fue medido por FACS y la intensidad de fluorescencia media (MFI) es mostrada como una función a la concentración del anticuerpo. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la presente invención es para proporcionar una plataforma para la caracterización estructural, para obtener información con respecto a la producción relativa de los miembros individuales en las muestras que comprenden (i) diferentes proteínas homologas que tienen diferentes regiones variables o (ii) líneas celulares que producen tales proteínas. La plataforma de caracterización puede ser utilizada para evaluar diferentes aspectos durante un proceso de producción o de purificación, o durante el almacenamiento a largo plazo de una composición que comprende diferentes proteínas homologas. Preferentemente, la plataforma de caracterización de la presente invención es utilizada para uno de los siguientes propósitos i) determinar la representación relativa de los miembros individuales o algunos de los miembros individuales uno con relación al otro dentro de una muestra simple, ii) para evaluar la proporción relativa de uno o más miembros individuales en diferentes muestras para la determinación de la consistencia de lote a lote, y iii) para evaluar la proporción efectiva de uno o más miembros individuales. Opcionalmente, esto puede ser comparado con la biblioteca de vectores originalmente utilizados para generar la línea celular de fabricación policlonal . La plataforma de caracterización es particularmente útil en el monitoreo de la diversidad clonal de una línea celular policlonal y/o la presentación de proteínas individuales en una proteína policlonal producida por la línea celular. La estabilidad composicional durante las corridas de producción individuales y la consistencia de lote a lote puede ser monitorizada. Alternativamente, los procedimientos de plataforma pueden ser también aplicados a composiciones purificadas de diferentes mezclas de proteínas homologas, incluyendo una proteína policlonal o una mezcla de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, para elaborar la estabilidad a largo plazo de los miembros individuales en tal composición. Una modalidad de la presente invención es un procedimiento para caracterizar muestras que comprenden diferentes proteínas homologas que tienen diferentes regiones variables o las células que producen tales proteínas, tal que la información es obtenida con respecto a la proporción relativa o la presencia de los miembros individuales de dichas proteínas o sus secuencias de codificación, el procedimiento comprende el análisis de las alícuotas de las muestras por una o más técnicas de caracterización de proteínas y/o por uno o más análisis genéticos de las secuencias de codificación de proteínas . En una modalidad adicional de la presente invención, la plataforma de caracterización estructural está comprendida de un número de técnicas analíticas seleccionadas de las técnicas de caracterización de proteínas así como análisis genéticos. De este modo, la plataforma de caracterización estructural puede estar compuesta de cualquier número de las modalidades individuales descritas en las siguientes secciones . Puede ser suficiente obtener información respecto a una muestra proveniente únicamente de las técnicas analíticas descritas en las modalidades. No obstante, es preferible obtener la información de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 de estas técnicas analíticas, mediante lo cual se combinan las modalidades individuales descritas más adelante para generar la plataforma de caracterización. La combinación de varias técnicas analíticas permite la generación de un grupo de datos más descriptivo en relación a la composición relativa o absoluta de la mezcla policlonal . La información obtenida de estas técnicas puede ser de una naturaleza cuantitativa así como cualitativa, que cuando se recopilan conjuntamente, proporcionan una caracterización general de las muestras analizadas. En modalidades preferidas de la presente invención una técnica analítica es una técnica de caracterización de proteínas, y otra técnica analítica es un análisis genético. Los análisis genéticos se refieren a técnicas tales como el análisis de polimorfismo de fragmentos de restricción (RFLP, por sus siglas en inglés) , RFLP terminal (T-RELP) , análisis de microarreglo, reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) , cuantitativa, tal como la PCR en tiempo real, y el secuenciamiento de ácido nucleico. Las técnicas de caracterización de proteínas se refieren a técnicas utilizadas en general dentro del campo de los proteónicos para caracterizar las proteínas desconocidas tales como i) análisis cromatográficos que separan las proteínas de acuerdo a las propiedades fisicoquímicas, ii) el análisis de las digestiones proteolíticas de las proteínas homologas, iii) el secuenciamiento N-terminal "a granel" y iv) análisis utilizando moléculas detectoras específicas para las proteínas homologas . Un concepto adicional de la presente invención, que es aplicable en combinación con las técnicas analíticas descritas anteriormente, para la caracterización de un combinado complejo de proteínas homologas, ha sido desarrollado en conexión con la presente invención. El concepto está basado en la selección de un número de proteínas centinelas presentes en el combinado de proteínas homologas (por ejemplo, un anticuerpo policlonal o un TcR policlonal) o sobre la superficie del combinado de células que producen las proteínas homologas (por ejemplo, una línea celular de fabricación policlonal) . Las proteínas centinelas son cuantitativa y cualitativamente caracterizadas para verificar que esta sub-población de proteínas esté presente de una manera consistente, ya sea en el sobrenadante de un cultivo de células policlonales o sobre la superficie celular durante la producción. Las proteínas centinelas pueden por ejemplo ser analizadas utilizando moléculas detectoras que son específicas para miembros individuales de las proteínas homologas, por ejemplo, tales como las moléculas anti-idiotipo. El concepto de proteína centinela puede ser además aplicado para evaluar la consistencia entre diferentes lotes de cultivo celular. El concepto de proteínas centinelas puede ser extendido a péptidos únicos derivados de una proteína policlonal mediante tratamiento con proteasa, tales péptidos centinelas contienen preferentemente una parte del CDR si la proteína policlonal es un anticuerpo policlonal o TcR. Los análisis realizados al nivel genético pueden también aplicar el principio centinela, con base en la secuencia de ácido nucleico únicas provenientes de miembros individuales de la biblioteca que codifica para la proteína policlonal. En particular, las secuencias de ácido nucleico correspondientes a las regiones CDR de los anticuerpos o TcRs pueden ser seleccionadas como secuencias de ácido nucleico centinelas, la más preferida es la región CDR3. Las proteínas centinelas, los péptidos o las secuencias de ácido nucleico pueden variar para las técnicas analíticas celulares dependiendo de cuáles miembros de la proteína policlonal, o las secuencias de ácido nucleico que la codifican, pueden ser distinguidas con la técnica analítica seleccionada. Análisis genético de la diversidad clonal de una línea celular de fabricación policlonal En algunas modalidades de la presente invención, la policlonalidad en un sistema de expresión para producir una proteína policlonal, es monitorizada al evaluar la cantidad de células que codifican para un miembro particular de la proteína policlonal y/o los niveles de mRNA que codifican para miembros individuales de la proteína policlonal. Esto puede ser monitorizado al nivel del mRNA o a nivel genómico utilizando por ejemplo, el análisis RFLP o T-RFLP, el análisis de microarreglo de oligonucleótidos, la PCR cuantitativa tal como la PCR en tiempo real, y el secuenciamiento de ácidos nucleicos de las regiones variables de las secuencias génicas obtenidas de la línea celular de fabricación. Alternativamente, pueden ser utilizadas las mismas técnicas cualitativamente para demostrar la diversidad de la línea celular policlonal. Las secuencias de ácido nucleico que codifican para la proteína policlonal pueden ser monitorizadas sobre mezclas obtenidas de un cultivo de células policlonales simples en diferentes puntos de tiempo durante el cultivo con lo cual se monitorizan las proporciones relativas de las secuencias de codificación individuales a todo lo largo de la corrida de producción, para evaluar su estabilidad composicional. Alternativamente, las secuencias de ácido nucleico que codifican para la proteína policlonal pueden ser monitorizadas sobre muestras obtenidas de diferentes cultivos celulares policlonales, en un punto de tiempo particular, con lo cual se monitorizan las proporciones relativas de las secuencias de codificación individual en diferentes lotes, para evaluar la variación de lote a lote. Preferentemente, la muestra utilizada en los análisis genéticos es una fracción de cultivo celular enriquecida para las células del cultivo, por ejemplo, mediante precipitación. La muestra es en general obtenida mediante la cosecha de una fracción del cultivo celular en un punto de tiempo deseado, seguido por el retiro del medio, por ejemplo, centrifugación. Las muestras para comparación de la consistencia de lote a lote, son preferentemente obtenidas de las células en el límite para la edad celular in vitro para la producción.

RFLP/T-RFLP El análisis de RFLP y T-RFLP puede ser realizado al nivel genómico o al nivel de mRNA. Cuando una línea celular de fabricación policlonal es generada tal que cada célula únicamente contiene una copia de la secuencia de interés, el análisis al nivel genómico proporcionará información con respecto a la proporción relativa de las células dentro de la línea celular de fabricación que producen un miembro individual de la proteína policlonal. Por una parte, el análisis a nivel del mRNA proporcionará la información respecto a los niveles de expresión potenciales de los miembros individuales de la proteína policlonal. El análisis al nivel del mRNA es en general realizado mediante transcripción inversa del mRNA en cDNA antes del análisis de restricción. No obstante, es también posible realizar el análisis directamente sobre el mRNA. En el análisis RFLP terminal, el o los cebadores delantero y/o inverso utilizados para la PCR o la RT-PCR, son marcados dando como resultado la marcación terminal de los fragmentos de PCR. Después de la digestión con las enzimas de restricción apropiadas, fragmentos de diferentes tamaños son generados y pueden ser separados mediante electroforesis, preferentemente electroforesis capilar, y los fragmentos pueden ser detectados a través del amplicón marcador (Liu et al. 1997, Applied and Environmental Microbiology 63, 4516-4522). Los marcadores adecuados pueden proporcionar señales detectables por fluorescencia, radioactividad, colorimetría, difracción de rayos X o absorción, magnetismo o actividad enzimática e incluyen, por ejemplo, fluoróforos, cromóforos, isótopos radiactivos (particularmente, 32P, 33P, 35S y 125I), reactivos electrónicamente densos, enzimas, y ligandos que tienen patrones de enlace específicos. Preferentemente, es utilizado un fluoróforo como el marcador. En una línea celular de fabricación policlonal con una gran diversidad, puede ser también posible obtener un fragmento de restricción único para cada secuencia de codificación individual. Si tal situación surge, las secuencias de ácido nucleico centinelas pueden ser seleccionadas para monitorizar la diversidad clonal de la línea celular de fabricación policlonal. Alternativamente, los fragmentos que no pueden ser separados de acuerdo al tamaño pueden ser secuenciados con el fin de evaluar la distribución de todas las secuencias de codificación individuales. Análisis de microarreglo de oligonucleótido Los microarreglos de oligonucleótido, tales como los chips de DNA, pueden ser utilizados para medir los niveles de ADN genómicos o los niveles de mRNA en una línea celular policlonal, mediante la medición de la hibridación del ADN marcado, generado a partir de la línea celular, a una sonda acoplada a una superficie sólida (Guo, Z. et al . 1994, Nucleic Acids Res. 22, 5456-5465).

Las sondas pueden ser ya sea secuencias de cDNA de doble hebra representativas de las secuencias que se espera estén presentes en la línea celular policlonal (ya sea derivadas de las línea celular policlonal misma o de la biblioteca de ADN utilizada para transfectar las células hospederas que comprenden la línea celular policlonal) o los oligonucleótidos en sentido (de 20-90 nucleótidos de longitud) . Las sondas son acopladas a una superficie sólida tal como vidrio, plástico o una matriz de gel, y si es utilizada una sonda de doble hebra, ésta es desnaturalizada antes de realizar el ensayo. Cuando se analiza una línea celular policlonal que expresa proteínas homologas, por ejemplo, un anticuerpo policlonal o TcR policlonal, se prefiere utilizar sondas oligonucleotídicas cuidadosamente diseñadas para prevenir la hibridación cruzada no deseada entre la sonda y el cDNA marcado, derivado de la línea celular policlonal. Tales sondas son diseñadas con base en el alineamiento de las regiones que codifican para la región variable que fueron utilizadas para generar la línea celular de fabricación policlonal, con el fin de diseñar las sondas específicas para cada miembro individual del producto policlonal. Para los anticuerpos que codifican para los anticuerpos, las secuencias de codificación diferirán principalmente en las regiones CDR con el más alto grado de variabilidad en la región CDR3. Las regiones con la mayor variabilidad son preferentemente utilizadas para el diseño de las sondas oligonucleotídicas en sentido. Las sondas son preferentemente complementarias en secuencia a los miembros individuales comprendidos en la línea celular policlonal, y tienen un alto grado de similitud a otros miembros, tanto como sea posible. Una o más sondas específicas para cada región variable pueden ser utilizadas. Para fines de estandarización, las sondas que se hibridan con las secuencias en la región constante pueden ser utilizadas. Las sondas son ya sea directamente transferidas por puntos sobre la superficie utilizada para la hibridación, o sintetizadas in situ sobre la superficie (Pease et al. 1994, PNAS 91: 5022-5026, Singh-Gasson et al. 1999. Nature Biotech. 17:974-978). El ADN marcado que va a ser analizado, es generado mediante la cosecha de la población de células policlonales y la preparación de ADN genómico, RNA total o mRNA a partir de las células. Cuando se utiliza el ADN genómico las marcación es obtenida ya sea mediante el uso de cebadores adecuadamente marcados o nucleótidos marcados en una amplificación de PCR de las secuencias de codificación relevantes. Cuando se utiliza el RNA total o el mRNA es posible obtener el cDNA marcado mediante transcripción inversa ya sea solo o combinado con un paso de PCR utilizando cebadores o nucleótidos marcados. Los marcadores adecuados pueden proporcionar señales detectables por fluorescencia, radioactividad, colorimetría, difracción de rayos X o absorción, magnetismo o actividad enzimática e incluyen, por ejemplo, fluoróforos, cromóforos, isótopos radiactivos (particularmente 32P, 33P, 35S y 125I) , reactivos electrónicamente densos, enzimas y ligandos que tienen socios de enlace específicos. Preferentemente, un fluoróforo es utilizado como marcador. Donde las secuencias de codificación que van a ser analizadas son cadenas pesada y ligera del anticuerpo, el cDNA de primera hebra es preparado mediante la transcripción inversa mediante cebadura con cebadores antisentido situados en la región constante 3' a la región variable. Si no se realiza la PCR adicional, la síntesis es preferentemente realizada con nucleótidos marcados. Si la transcripción inversa es seguida por PCR, son aplicados una serie de cebadores en sentido, los cuales aseguran que todas las familias de la región variable sean amplificadas. Alternativamente, los cebadores en sentido que se hibridan a las regiones que son idénticas en todos los mRNAs (por ejemplo, región 5' no traducida o la secuencia que codifica para el péptido de señal) pueden ser utilizadas. Los cebadores en sentido y/o antisentido pueden ser fluorescentemente marcados o los nucleótidos marcados pueden ser utilizados en este procedimiento . Cuando las sondas y el ADN marcado han sido preparados, el ensayo de microarreglos es realizado mediante la hibridación de ADN marcado, desnaturalizado, a los oligonucleótidos inmovilizados, bajo condiciones optimizadas para bajo ruido y alta señal específica. Después del lavado, cada una de las sondas hibridadas es medida, y se calcula la cantidad del mensaje específico. PCR cuanti tativa Los métodos de PCR han sido previamente adaptados para proporcionar detección y cuantificación de la secuencia de ácido nucleico en una muestra, ver por ejemplo Higuchi, R. et al. 1993. Kinetic Biotechnology 11, 1026-1030; Holland P.M. et al. 1991. PNAS 88, 7276-7280; Livak, K. J. et al. 1995 PCR Methods Appl. 4, 357-362. Estos métodos emplean cebadores delanteros e inversos como la PCR estándar, más una o más secuencias de ácido nucleico adicionales que se hibridan al ácido nucleico que será amplificado. La secuencia de ácido nucleico adicional, denominada una "sonda", se hibrida a una porción del ácido nucleico que va a ser amplificado entre las porciones que se hibridan a los dos cebadores, y está marcada de una manera tal que cada ciclo de PCR sucesivo provoca un cambio en la sonda o en su marcador. Este cambio en la sonda o su marcador provoca activación o acentuación del marcador a un grado que está relacionado al número de copias adicionales del ácido nucleico amplificado, durante cada ciclo de PCR. Tales métodos son en general denominados como PCR "en tiempo real" y proporcionan una detección ciclo por ciclo del producto de PCR cada vez mayor al combinar el ciclo térmico con la detección del marcador. En una versión particular de la PCR en tiempo real, el cambio en la sonda o su marcador es provocado por la actividad exonucleasa de la polimerasa, por ejemplo, la polimerasa Taq, por lo tanto esta técnica es en general denominada como PCR en tiempo real Taq o TaqMan (por ejemplo, Holland, P.M. et al., 1991, PNAS 88, 7276-7280). Los marcadores adecuados pueden proporcionar señales detectables mediante fluorescencia, radioactividad, colorimetría, difracción de rayos X u absorción, magnetismo o actividad enzimática e incluye, por ejemplo, fluoróforos, cromóforos, isótopos radioactivos (particularmente 32P, 33P, 35S y 125I) , reactivos electrónicamente densos, enzimas y ligandos que tienen socios de enlace específicos. De manera más común, el marcador para la sonda es un marcador fluorescente que proporciona una señal de salida fluorescente. Esto puede ser logrado mediante la provisión de una sonda que está doblemente marcada con un colorante reportero fluorescente en un extremo, típicamente el extremo 5', y un colorante apagador en el otro, el extremo 3' (por ejemplo Livak, J.J. et al., 1995 PCR Methods Appl. 4, 357-362). Cuando la sonda está intacta, la proximidad del colorante apagador al colorante reportero suprime la fluorescencia del colorante reportero. Los colorantes adecuados son revisados en Wilheim, J y Pingould, A., 2003. Chembiochem. 4, 1120-1128. Durante cada ciclo de PCR, la actividad de exonucleasa 5' —> 3 ' de una DNA-polimerasa rompe la sonda, lo cual separa el colorante reportero del colorante apagador. Esta separación da como resultado fluorescencia incrementada del colorante reportero. Durante la PCR, si el objetivo de interés está presente en una muestra, la sonda se recocerá específicamente entre los sitios de cebadores de PCR delantero e inverso. La actividad de exonucleasa de la DNA-polimerasa rompe la sonda entre el reportero y los colorantes apagadores, únicamente si la sonda se hibrida a la molécula objetivo. Estas son a menudo denominadas sondas TaqMan. El incremento en la fluorescencia es decretada únicamente si la secuencia objetivo es complementaria a la sonda, y es amplificada durante la PCR. Debido a estos requerimientos, la amplificación no específica no es detectada. Únicamente los productos amplificados que contienen la secuencia complementaria a la sonda son reconocidos por la presencia de la señal fluorescente, mediante lo cual se eliminan ciertos elementos relacionados al análisis de los falsos positivos. Adicionalmente, una o más de otras enzimas pueden ser utilizadas para ayudar a limitar la amplificación de los productos de transcripción de transporte. Este tipo de PCR cuantitativa permite la normalización de errores de pipeteo y cambios de volumen que pueden ser realizados al dividir la fluorescencia del reportero entre una referencia pasiva, contenida dentro de cada reacción, para determinar la señal normalizada del reportero para cada reacción individual. El software (dotación lógica informática) puede ser utilizado para analizar el incremento de ciclo a ciclo en la intensidad de fluorescencia y comparar estos datos a los estándares con el fin de determinar el número de copias iniciales para la cuantificación absoluta o para comparar contra otras muestras desconocidas para una comparación de la cantidad relativa. En particular, la PCR en tiempo real TaqMan en la presente invención se ha encontrado que es adecuada para la caracterización de una línea celular policlonal. De este modo, cuando se aplica a una línea celular que expresa un anticuerpo policlonal, la técnica sirve para cuantificar las proporciones relativas de las secuencias que codifican para el anticuerpo individual ya que una sonda TaqMan única puede ser diseñada para la cadena pesada y/o la cadena ligera, para cada miembro representado en la línea celular policlonal. Preferentemente, una de las regiones de CDR, CDRl, CDR2 ó CDR3 , es seleccionada para diseñar la sonda TaqMan. Más preferentemente, la región CDR3 es seleccionada para diseñar la sonda TaqMan. Los ejemplos de tales sondas TaqMan de CDR3 de cadena pesada variable, pueden ser encontrados en Rasmussen, T. et al. 2000, Exp. Hematol . 28, 1039-1405, incorporada por referencia en la presente . Secuenciamiento del ácido nucleico El secuenciamiento del ácido nucleico es una técnica bien conocida, la cual puede ser utilizada con la presente invención para proporcionar información cualitativa con respecto a la diversidad de una línea celular de fabricación policlonal. El secuenciamiento puede ser ya sea realizado sobre células simples derivadas de la línea celular policlonal, mediante clonación de células simples o sobre una muestra no procesada de células variantes obtenidas de una línea celular de fabricación policlonal. El secuenciamiento al nivel de las células simples proporcionará información con respecto a la proporción relativa de las células dentro de la línea celular de fabricación que produce un miembro individual de la proteína policlonal . En este procedimiento, una muestra proveniente de la línea celular de fabricación policlonal es obtenida en un punto de tiempo deseado, y las células que codifican para la proteína policlonal que va a ser caracterizada, son clonadas por células simples, por ejemplo mediante el uso de dilución limitada, o por un plastificador de células tal como un FACS Aria. El número de células simples que deben ser obtenidas de la muestra de la línea celular policlonal, depende de la variedad de secuencias que se espera que sean representadas dentro de la línea celular. Preferentemente al menos 3 veces el número de secuencias de calificación individuales que forman la entrada durante la generación de la línea celular, deben ser clasificadas por célula simple para dar una pluralidad de 95% de re-encontrar a todas ellas en la muestra de prueba. De este modo, si una biblioteca de 25 diferentes secuencias de codificación fuera utilizada para generar la línea celular, al menos 75 clones de células simples deben se obtenidos de la muestra para el secuenciamiento, dado que las 25 diferentes secuencias son representadas en cantidades iguales. Esto debe asegurar que la mayor parte de las secuencias de codificación individuales representadas en la línea celular policlonal sean representadas entre los clones de células simples, si éstas no se han perdido durante el proceso de fabricación. Las células simples son desarrolladas hasta la confluencia en pozos separados y se utilizan alícuotas de cada pozo como una plantilla en las reacciones de ácido nucleico. El secuenciamiento puede ser realizado al nivel del mRNA o al nivel genómico, utilizando una RT-PCR o un paso de amplificación por PCR, respectivamente, antes del secuenciamiento. La información de la secuencia, obtenida ya sea al nivel de mRNA o al nivel genómico, puede determinar el porcentaje de células que codifican para cada uno de los componentes de anticuerpo individuales. Además, la información de secuencia obtenida al nivel del mRNA puede ser utilizada para elaborar el nivel de expresión de cada uno de los anticuerpos individuales en la composición policlonal . Además del secuenciamiento es posible realizar una PCR en tiempo real TaqMan al nivel del mRNA para obtener información con respecto al nivel de información potencial del clon de células simples . Los análisis de RELP o T-RELP previamente descritos pueden ser de igual modo realizados al nivel de células simples. El secuenciamiento sobre una muestra no procesada de células variantes obtenidas de una línea celular de fabricación policlonal puede también proporcionar información con respecto al nivel de expresión potencial de un miembro individual de la proteína policlonal producida a partir de la línea celular, con base en el nivel relativo de mRNA de las secuencias de codificación de los miembros individuales de la proteína - policlonal. En este procedimiento, una muestra proveniente de una línea celular de fabricación policlonal es obtenida a un punto de tiempo deseado. La RT-PCR es realizada directamente sobre las células lisadas dentro de la muestra. El grupo de cebadores aplicado para la reacción de RT-PCR está diseñado de una manera tal que se esperará que amplifique todas las secuencias de codificación con la misma eficiencia si los cebadores en sentido y antisentido se hibridan a regiones que son idénticas en todos los mRNAs (por ejemplo, un cebador en sentido en la región 5' no traducida o en la secuencia que codifica para el péptido de señal o un cebador antisentido en la secuencia de la región constante, puede ser utilizado) . Los fragmentos de PCR amplificados son clonados dentro de un vector de secuenciamiento y transfectados dentro de una célula hospedera, preferentemente, E. coli. El ADN plásmido proveniente de las colonias simples que representan una secuencia de codificación individual proveniente de la línea celular de codificación policlonal, es secuenciado, la proporción de las secuencias de codificación individuales obtenidas, reflejará el nivel del mRNA de cada secuencia de codificación individual en la línea celular policlonal, así como el nivel de expresión potencial de los miembros de proteínas individuales . En una modalidad adicional de la presente invención, los análisis genéticos descritos anteriormente, son aplicados como análisis separados. Preferentemente, uno o más de los análisis son realizados sobre alícuotas de la misma muestra, con el fin de obtener tanta información sobre la diversidad clonal de la línea celular como sea posible. Los análisis genéticos pueden ser combinados alternativamente de una manera multidimensional, por ejemplo, análisis de microarreglo pueden ser realizados sobre los fragmentos de RFLP o T-RFLP después de este análisis, o los fragmentos de RFLP pueden ser secuenciados subsecuentemente al análisis de RFLP. En particular, es una ventaja realizar el secuenciamiento sobre fragmentos de RFLP que representan más de un componente individual, y que no pueden ser separados debido a su tamaño idéntico de fragmentos de restricción. Técnicas de caracterización de proteínas para evaluar la ol iclonalidad En modalidades de la presente invención, la policlonalidad de un combinado de proteínas homologas o el sistema de expresión para producir las proteínas homologas, es monitorizado mediante una o más técnicas de caracterización de proteínas. Las técnicas de caracterización de proteínas se refieren a cualquier técnica que sola o en combinación con nuevas técnicas sea capaz de proporcionar información con respecto a la presencia y proporción relativa de los miembros individuales de una mezcla de proteínas monoclonales o una proteína policlonal recombinante en solución o sobre la superficie de una célula presente en una línea celular policlonal. Dependiendo de la complejidad de la proteína policlonal recombinante, pueden ser utilizadas una o más de las siguientes técnicas: i) técnicas de separación cromatográficas, ii) análisis de digestiones proteolíticas de la proteína policlonal para la modificación del péptido marcador único que representa los miembros individuales de la proteína policlonal, iii) secuenciamiento N-terminal "a granel", y iv) análisis utilizando moléculas detectoras específicas, por ejemplo, para la caracterización de los miembros de proteínas centinelas de la proteína policlonal. La muestra que contiene las diferentes proteínas homologas puede, ser una mezcla de proteínas monoclonales purificadas o una proteína policlonal. La proteína policlonal puede ser por ejemplo derivada de un sobrenadante de cultivo celular obtenido a partir de un cultivo de células policlonales, por ejemplo, en la forma de un sobrenadante "bruto" el cual únicamente ha sido separado de las células por ejemplo, mediante centrifugación, o los sobrenadantes que han sido purificados, por ejemplo, mediante purificación de afinidad de proteína A, inmunoprecipitación o filtración en gel. Estos pasos de pre-purificación son, no obstante, no una parte de la caracterización de la proteína policlonal recombinante, ya que éstos no proporcionan ninguna separación de las proteínas homologas diferentes en la composición. Preferentemente, la muestra sometida al proceso de caracterización de la presente invención ha sido sometida al menos a un paso de purificación. Son más preferidas las muestras que comprenden proteínas homologas 90%, 95%, ó 99% puras . Las diferentes proteínas homologas que constituyen la proteína policlonal pueden ser monitorizadas sobre las muestras obtenidas de un cultivo de células policlonales simples, a diferentes puntos de tiempo durante el cultivo, con lo cual se monitorizan las proporciones relativas de los miembros individuales de las proteínas policlonales a todo lo largo de la corrida de producción, para evaluar su estabilidad composicional. Alternativamente, diferentes proteínas homologas que constituyen la proteína policlonal pueden ser monitorizadas sobre muestras obtenidas de diferentes cultivos de células policlonales a un punto de tiempo particular, con lo cual se monitorizan las composiciones relativas de las secuencias de codificación individuales en diferentes notas, para evaluar la consistencia lote a lote. Técnicas de separación cromatográfica La separación cromatográfica de los miembros individuales de la proteína policlonal pueden estar basados en diferencias en las propiedades fisicoquímicas tales como i) carga neta (ejemplificada por la cromatografía de intercambio iónico (IEX) ) ; ii) hidrofobicidad (ejemplificada por la cromatografía de fase inversa (RP-HPLC) ) y la cromatografía de integración hidrofóbica basada en la concentración de sal (HIC)), iii) los puntos isoeléctricos (valores pl) (ejemplificados por el cromatoenfoque) o iv) afinidad (ejemplificada por la cromatografía de afinidad utilizando péptidos/anticuerpos anti-idiotipo; o la cromatografía de proteína L para la separación de las cadenas ligeras de anticuerpo kappa y lambda) . La quinta técnica cromatográfica bien conocida está basada en la siguiente propiedad fisicoquímica: tamaño. Es decir, aunque no una técnica particularmente adecuada para la caracterización de las proteínas homologas tales como un anticuerpo policlonal o TcR policlonal, ya que todos los miembros son esencialmente del mismo tamaño. La separación por tamaño puede ser omitida completamente de la plataforma de caracterización. Algunas de las técnicas cromatográficas anteriormente mencionadas han sido empleadas en la separación de clases de inmunoglobulina tales como IgA, IgG e IgM (Gallo, P. et al. 1987. J. Chromatogr. 416, 53-62) o las subclases tales como IgGl, IgG2, IgG3 (Scharf, O et al., 2001. J. Virol. 75, 6558-6565) provenientes de suero humano. No obstante, la separación con respecto a la diversidad de los anticuerpos individuales en una inmunoglobulina derivada de suero o un anticuerpo policlonal recombinante, no ha sido previamente realizada. a) Cromatografía de intercambio iónico En modalidades de la presente invención la cromatografía de intercambio iónico es utilizada para separar miembros individuales de una proteína policlonal recombinante o una sub-población de miembros individuales de una proteína policlonal . La separación mediante cromatografía de intercambio iónico está basada en la carga neta de las proteínas individuales en la composición que va a ser separada. Dependiendo de los valores de pl de la proteína policlonal recombinante, los valores de pH y las concentraciones salinas del amortiguador de columna elegido, los miembros individuales de la proteína policlonal recombinante pueden ser separados, al menos en cierto grado, utilizando cromatografía de intercambio aniónico o catiónico. Por ejemplo, todos los miembros individuales de una proteína policlonal recombinante normalmente se enlazarán a un medio de intercambio catiónico, negativamente cargado, siempre y cuando el pH esté muy por debajo del valor de pl más bajo de los miembros individuales de la composición de la proteína policlonal recombinante. Los miembros individuales de la proteína policlonal recombinante enlazada pueden ser subsecuentemente eluidos de la columna dependiente de la carga neta de las proteínas individuales, utilizando típicamente un gradiente cada vez mayor de una sal (por ejemplo, cloruro de sodio) o un valor de pH cada vez mayor. Varias fracciones serán obtenidas mediante la elución. Una fracción simple contiene preferentemente un miembro individual de la proteína policlonal, pero puede contener también 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ó más miembros distintos de la proteína policlonal. Los principios generales de intercambio catiónico y aniónico son bien conocidos en la técnica, y las columnas para la cromatografí de intercambio iónico son comercialmente disponibles . b) Cromatoenfoque En modalidades adicionales de la presente invención el cromatoenfoque es utilizado para separar los miembros individuales de una proteína policlonal recombinante o una sub-población de miembros individuales de una proteína policlonal . La separación mediante cromatoenfoque está basada en diferencias en los valores de pl de las proteínas individuales, y se realiza utilizando un amortiguador de columna con un valor de pH por arriba del valor de pl en la proteína policlonal recombinante. Una proteína policlonal recombinante donde los miembros individuales tienen valores de pl relativamente bajos, se enlazará a un medio de intercambio aniónico débil, positivamente cargado. Los miembros individuales de la proteína policlonal recombinante enlazada, pueden ser susbsecuentemente eluidos de la columna dependiente, sobre los valores de pl de los miembros individuales mediante la generación de un gradiente de pH cada vez menor dentro de la columna, utilizando un poliamortiguador diseñado para cubrir el intervalo de pH de los valores de pl de los miembros individuales. Varias fracciones serán obtenidas durante la elución. Una fracción simple contiene preferentemente un miembro individual de la proteína policlonal, pero puede también contener 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ó más miembros distintos de la proteína policlonal. Los principios generales del cromatoenfoque utilizando intercambiadores de aniones son bien conocidos en la técnica, y las columnas de aniones son comercialmente disponibles . El cromatoenfoque con intercambiadores de cationes es también conocido en la técnica (Kang, X, y Frey, D.D., 2003. J. Chromatogr. 991, 117-128, incorporada por referencia en la presente) . c) Cromatografía de interacción hidrofóbica En modalidades adicionales de la presente invención, la cromatografía de interacción hidrofóbica es utilizada para separar los miembros individuales de una proteína policlonal recombinante o una sub-población de miembros individuales de una proteína policlonal. La separación mediante cromatografía de interacción hidrofóbica está basada en las diferencias en la hidrofobicidad de las proteínas individuales en la composición que va a ser separada. La proteína policlonal recombinantemente producida, es enlazada a un medio de cromatografía modificado con un ligando hidrofóbico en un amortiguador que favorece las interacciones hidrofóbicas. Esto es típicamente logrado en un amortiguador que contiene un bajo porcentaje de solvente orgánico (RP-HPLC) o en un amortiguador que contiene una concentración claramente alta de una sal elegida (HIC) . Los miembros individuales de la proteína policlonal recombinante enlazada serán eluidos subsecuentemente a la columna dependiente de la hidrofobicidad de los miembros individuales, utilizando típicamente un gradiente cada vez mayor de solvente orgánico (RP-HPLC) o gradiente cada vez menor de una sal elegida (HIC) . Serán obtenidas varias fracciones durante la elución. Una fracción simple contiene preferentemente un miembro individual de la proteína policlonal, pero puede también contener 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o más miembros distintos de la proteína policlonal. Los principios generales de cromatografía de interacción hidrofóbica son bien conocidos en la técnica, y las columnas de RP-HPLC así como HIC son comercialmente disponibles . d) Cromatografía de afinidad En modalidades adicionales de la presente invención se utiliza la cromatografía de afinidad para separar los miembros individuales de una proteína policlonal o una sub-población de miembros individuales de una proteína policlonal. La separación mediante cromatografía de afinidad está basada en las diferencias en la afinidad hacia una molécula detectora, ligando o proteína específica. La molécula detectora, el ligando o la proteína o una pluralidad de éstas (estas opciones diferentes son solo denominadas ligando en lo subsiguiente) son inmovilizadas sobre un medio cromatográfico y la proteína policlonal recombinante es aplicada a la columna de afinidad bajo condiciones que favorecen la interacción entre los miembros individuales y el ligando inmovilizado. Las proteínas que no muestran afinidad hacia el ligando inmovilizado son recolectadas en el flujo de columna de lado a lado, y las proteínas que muestran afinidad hacia el ligando inmovilizado, son subsecuentemente eluidas de la columna bajo condiciones que desfavorecen el enlace (por ejemplo, bajo pH, alta concentración de sal o una alta concentración del ligando) . Pueden ser obtenidas varias fracciones durante la elución. Una fracción simple contiene preferentemente un miembro individual de la proteína policlonal, pero puede también contener 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ó más miembros distintos de la proteína policlonal. Los ligandos que pueden ser utilizados para caracterizar una proteína policlonal recombinante son por ejemplo, antígenos-objetivo, moléculas anti-idiotipo o proteína L para la separación de anticuerpos con las cadenas ligeras kappa o lambda. La cromatografía de afinidad con antígenos-objetivo será particularmente relevante donde una proteína policlonal recombinante comprenda afinidades hacia más de un epitopo. El objetivo por ejemplo, puede ser una célula cancerosa o un virus o una combinación de objetivos, que contienen muchos epitopos. Estos epitopos pueden ser sintetizados sintéticamente e inmovilizados sobre un medio cromatográfico. El ensayo puede ser diseñado con un epitopo por columna o varios diferentes epitopos por columna, con lo cual se permite la caracterización de la mezcla de proteína policlonal recombinante con respecto a la distribución de los miembros individuales hacia los epitopos particulares. Alternativamente, los antígenos completos o moléculas objetivo pueden ser inmovilizados sobre un medio cromatográfico . La cromatografía de afinidad con moléculas anti-idiotipo (por ejemplo, péptidos anti-idiotipos o anticuerpos anti-idiotipo, que se enlazan específicamente a los miembros individuales de una proteína policlonal o una sub-población de tales miembros individuales, puede ser realizada para obtener la información con respecto a la proporción relativa de los miembros seleccionados de la proteína policlonal recombinante (también denominadas proteínas centinela) o una sub-población de miembros individuales. Idealmente, cada molécula anti-idiotipo individual únicamente se enlaza específicamente a un miembro individual, pero no a otros miembros de la proteína policlonal recombinante, aunque una molécula anti-idiotipo que se enlaza a un subgrupo definido de miembros, también es aplicable en la presente invención. Preferentemente, las moléculas anti-idiotipo son generadas hacia todos los miembros individuales, tal que la composición policlonal completa puede ser caracterizada. Donde la proteína policlonal recombinante es un anticuerpo policlonal o TcR, las moléculas anti-idiotipos que son dirigidas contra la parte específica del antígeno, de la secuencia de un anticuerpo o un receptor de célula T. Las moléculas anti-idiotipo pueden ser inmovilizadas al medio cromatográfico individualmente, tal que una columna contiene una molécula anti-idiotipo, con lo cual es obtenida la información respecto a un miembro de proteína particular o sub-población de proteínas. El flujo de lado a lado puede ser luego aplicado a una segunda columna con una segunda molécula inmovilizada anti-idiotipo, y así sucesivamente. Alternativamente, son inmovilizadas varias moléculas anti-idiotipo diferentes sobre el mismo medio cromatográfico aplicado a la misma columna. La elución es luego realizada bajo condiciones que permiten que las proteínas individuales sean eluidas en diferentes fracciones, por ejemplo, mediante la adición de cantidades cada vez mayores de moléculas de idiotipo libre a la columna, o utilizando un gradiente de pH o salino.

Con este procedimiento, será posible obtener información sobre las proporciones de varios miembros de la proteína policlonal con un análisis unidimensional. Donde la proteína policlonal recombinante es un anticuerpo policlonal, éste puede estar compuesto de miembros individuales los cuales contienen ya sea una cadena ligera kappa o una cadena ligera lambda. En tal anticuerpo policlonal, los anticuerpos con una cadena ligera lambda pueden ser separados de los anticuerpos con una cadena ligera kappa mediante el uso de la falta de afinidad hacia la proteína L para los anticuerpos de cadena ligera lambda. De este modo, un subgrupo de miembros de anticuerpo que contienen la cadena ligera lambda pueden ser separados de un subgrupo de miembros de anticuerpos que contienen la cadena ligera kappa utilizando la cromatografía de afinidad de proteína L. Los subgrupos de anticuerpos kappa y lambda pueden ser subsecuentemente caracterizados utilizando además técnicas cromatográficas alternativas para la cuantificación de los anticuerpos individuales, por ejemplo, como se describe anteriormente. Croma tografía mul tidimensional Dependiendo de la complejidad de las proteínas homologas variantes en la muestra que va a ser analizada, por ejemplo, una proteína policlonal recombinante puede ser deseable recombinar dos o más de las técnicas cromatográficas descritas anteriormente en a) a d) en un formato bidimensional, tridimensional o multidimensional. Se prefiere utilizar cromatografía líquida en todas las dimensiones en vez de la electroforesis en gel bidimensional. No obstante, esto no excluye el uso de las técnicas de electroforesis en gel o de precipitación en una o más dimensiones, para la caracterización de una proteína policlonal recombinante. La cromatografía bidimensional líquida ha sido descrita por ejemplo en Lubman, D.M. et al. 2002 J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 782, 183-196; WO 01/58925 y WO 01/58926. El método ha sido utilizado para comparar la expresión de proteínas de células saludables y de células cancerosas, generando por ende una visualización diferencial al nivel de proteínas. Además, la cromatografía tridimensional, donde la tercera dimensión es la separación por tamaño, ha sido descrita en WO 03/102539 para la separación de proteínas, por ejemplo en extractos celulares, con lo cual se genera de igual modo una visualización diferencial. En modalidades adicionales de la presente invención se utiliza la cromatografía multidimensional para la caracterización de diferentes proteínas homologas dentro de una muestra. En particular, las muestras de proteínas homologas que tienen diferentes regiones variables tales como anticuerpos y receptores de células T son caracterizadas con cromatografía multidimensional. Preferentemente, la dimensión adicional es realizada sobre fracciones obtenidas durante la elución en la dimensión precedente. No obstante, el flujo de lado a lado puede ser también utilizado para el análisis dimensional adicional. Esto puede en particular volverse relevante cuando la dimensión precedente es la cromatografía de afinidad. En una modalidad de la presente invención, se utiliza la cromatografía multidimensional en la separación de moléculas de anticuerpo individuales con respecto a su diversidad, ya sea a partir de un anticuerpo policlonal (inmunoglobulina derivada de suero o recombinante) o una mezcla de anticuerpos monoclonales. Preferentemente, la cromatografía multidimensional es cromatografía líquida. En otra modalidad más de la presente invención, se utiliza cromatografía multidimensional en la separación de las moléculas receptoras de células T individuales, con respecto a su diversidad, ya sea a partir de un receptor de célula T policlonal o una mezcla de receptores de células T monoclonales. Preferentemente, la cromatografía multidimensional es cromatografía líquida. En general, se intenta utilizar técnicas cromatográficas con base en diferentes propiedades fisicoquímicas en las diferentes dimensiones en una cromatografía multidimensional, por ejemplo, la separación por carga en la primera dimensión, y separación por hidrofobicidad en la segunda dimensión y afinidad en la tercera dimensión. No obstante, algunas técnicas cromatográficas pueden proporcionar separación adicional cuando se utilizan en una dimensión subsecuente, incluso si éstas explotan propiedades fisicoquímicas similares de la proteína. Por ejemplo, la separación adicional puede ser obtenida cuando el cromatoenfoque es seguido por cromatografía de intercambio iónico o cromatografía de afinidad, con diferentes ligandos que se suceden uno al otro. La tabla 1 lista las cinco dimensiones, en las cuales pueden ser empleadas técnicas cromatográficas como una parte de la plataforma de caracterización de la presente invención. No obstante, esto no debería ser considerado un número indispensable de dimensiones. Si una separación suficiente, para caracterizar la proteína policlonal recombinante, ha sido obtenida después de una, dos, tres o cuatro dimensiones, las dimensiones restantes pueden ser omitidas. Por lo tanto, si es obtenida una separación suficiente con la cromatografía de intercambio iónico (IEX) , no es necesario realizar el cromatoenfoque, RP-HPLC, y similares. Por otra parte, si cinco dimensiones prueban ser insuficientes, pueden ser agregadas dimensiones adicionales. Además, la tabla 1 no debe ser considerada como una lista exhaustiva de las posibles combinaciones de técnicas cromatográficas o como una lista exhaustiva de las técnicas mismas .

Tabla 1 En modalidades preferidas de la presente invención, la cromatografía líquida multidimensional (LC) es una técnica de LC bidimensional seleccionada de las dos primeras dimensiones mostradas en la Tabla 1. En modalidades preferidas de la presente invención, la LC multidimensional es una técnica LC tridimensional seleccionada de las primeras tres dimensiones mostradas en la Tabla 1. Como una alternativa, las técnicas LC multidimensionales, la inmunoprecipitación combinada con una técnica de electroforesis adecuada, tal como la electroforesis en gel o la electroforesis capilar, y la cuantificación subsecuente de los antígenos puede ser utilizada para caracterizar una proteína policlonal recombinante . Esta técnica será particularmente útil para caracterizar un anticuerpo policlonal recombinante dirigido contra antígenos complejos. Un anticuerpo policlonal recombinante dirigido contra, por ejemplo, un antígeno viral complejo, puede ser inmunoprecipitado utilizando una mezcla de antígenos marcados y esferas de proteínas A. Los antígenos podrían ser subsecuentemente separados utilizando enfoque isoeléctrico o PAGE bidireccional (2D PAGE) seguido por cuantificación de los antígenos individuales, reflejando las cantidades de anticuerpos en un anticuerpo policlonal recombinante dirigido contra los antígenos específicos. Eliminación de la heterogeneidad de carga N-terminal en proteínas recombinantes Las técnicas de caracterización en la proteína descritas anteriormente, la heterogeneidad de la proteína individual en un combinado de proteínas homologas puede complicar la caracterización todavía más, ya que una proteína simple puede dar como resultado varios picos por ejemplo en un perfil de IEX. La heterogeneidad es un fenómeno común en anticuerpos y otras proteínas recombinantes, y es debida a las modificaciones post-traduccionales enzimáticas o no enzimáticas. Estas modificaciones pueden provocar heterogeneidad de tamaño o de carga. Las modificaciones post-traduccionales comunes incluyen N-glucosilación, oxidación de metionina, fragmentación proteolítica, y desamidación. La heterogeneidad puede también originarse de las modificaciones al nivel genético, tales como mutaciones introducidas durante la transfección (Harris, J.R., et al. 1993 Biotechnology 11, 1293-7) y eventos cruzados entre genes variables de las cadenas pesada y ligera durante la transcripción (Wan, M. et al. 1999. Biotechnol Bioeng. 62, 485-8). Estas modificaciones son epigenéticas y de este modo predecibles a partir de la estructura genética de la construcción sola. Algunas de estas modificaciones . post-traduccionales las cuales pueden dar resultado en heterogeneidad pueda ser tratada antes de la caracterización. La variación de carga que surge de la eliminación enzimática de la lisina C-terminal puede ser resuelta mediante el uso de inhibidores específicos de carboxipeptidasa o el tratamiento del anticuerpo con carboxipeptidasa para simplificar el patrón general (Perkins, M. et al. 2000. Pharm Res. 17, 1110-7). La variación de tamaño que surge de las diferencias en los patrones de glucosilación, puede también ser tratada por desglucosilación enzimática utilizando por ejemplo, PNGasa F, Endo H, O-glucosidasa o neuraminidasa. La degradación química de las proteínas, tales como la desamidación ha mostrado que es problema significativo durante la producción y almacenamiento y da como resultado heterogeneidad de carga. La desamidación de Asna a Asp y la formación de IsoAsp (enlaces péptido isoaspartilo) tiene lugar bajo condiciones leves (Aswad, D.W. et al . 2000. J Pharm Biomed Anal. 21, 1129-36). Estos re-arreglos ocurren más fácilmente en las secuencias Asn-Gly, Asn-Ser y Asp-Gly donde la flexibilidad de la cadena polipeptídica local es alta. Otra causa más de la heterogeneidad de carga puede resultar del bloqueo N-terminal por el ácido piroglutámico (PyroGlu) que resulta de la ciclización de los residuos de glutamina N-terminales (desamidación) . Tales modificaciones post-traduccionales han sido descritas para IgG así como para otras proteínas. La ciclización parcialmente del extremo N-terminal de un anticuerpo, especialmente si están involucrados HC y LC, dará como resultado heterogeneidad de carga que da un patrón IEX complejo. Los patrones IEX potenciales debido a la formación de un PyroGlu N-terminal sobre una o más de las cadenas VH y VL de un anticuerpo, se muestran en la figura 16. Si una muestra que comprende diferentes proteínas homologas que tienen diferentes regiones variables, tal como un anticuerpo policlonal recombinante, va a ser caracterizado por técnicas basadas en la carga neta, es obvio que tal análisis será complicado incluso si solo unos pocos componentes de la muestra tienen patrones de IEX como se muestra en la figura 16B y C, ya que esto enmascarará la diversidad clonal en un perfil de IEX por ejemplo, una composición de anticuerpo policlonal. Este problema puede ser resuelto mediante el uso de la enzima específica, la piroglutamato-aminopeptidasa, primero que todo debido al desbloqueo que tiene que ser realizado sobre anticuerpos reducidos y alquilados, con el fin de obtener altos rendimientos de los anticuerpos desbloqueados (Mozdzanowski, J. et al. 1998 Anal Biochem. 260, 183-7) no compatibles con un análisis de IEX subsiguiente, y en segundo lugar debido a que no será posible tener una escisión del 100% para todos los anticuerpos . Un aspecto adicional de la presente invención se refiere por lo tanto a la eliminación de la heterogeneidad de carga provocada por la ciclización de los residuos de glutamina N-terminales. Este aspecto de la invención es particularmente útil si se combina con cualquiera de las herramientas de caracterización previamente descritas, las cuales están basadas en la propiedad fisicoquímica de carga neta, por ejemplo, la cromatografía IEX y el cromatoenfoque. La formación de residuos PyroGlu N-terminales es eliminada de que ninguna cadena polipeptídica contenga una glutamina N-terminal, por ejemplo, por cambio del residuo de glutamina N-terminal a otro aminoácido. Si la proteína es una proteína heteromérica compuesta de diferentes sub-unidades, preferentemente todos los residuos Gln N-terminales son intercambiados por otros residuos. Para los anticuerpos, los residuos Gln en el extremo N de la cadena pesada y/o la cadena ligera, son intercambiados. Esto es realizado mediante la mutagénesis dirigida al sitio de las secuencias de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos con una glutamina N-terminal. Preferentemente, los residuos de glutamina N-terminales son reemplazados por residuos de ácido glutámico, ya que éste es el derivado no cargado de la glutamina. En una proteína policlonal recombinante, las secuencias individuales que codifican para los miembros deben ser cambiadas y re-insertadas dentro de un vector de expresión para generar una nueva línea celular que expresa la proteína cambiada. Esta línea celular puede ser luego incluida dentro de la colección de células que produce la proteína policlonal. Análisis de protecciones proteolíticas de la región variable de las proteínas homologas Una muestra de proteína que comprende diferentes proteínas homologas que tienen diferentes regiones variables puede, como se describe en lo anterior, ser caracterizada con base en las propiedades fisicoquímicas de las proteínas intactas; utilizando una gama de técnicas cromatográficas. La información obtenida de estos análisis previamente descritos puede ser adicionalmente suplementada con información obtenida del análisis de digestiones proteolíticas de las proteínas homologas. Preferentemente, la digestión proteolítica es realizada sobre una alícuota de la misma muestra sobre la que fueron realizados los análisis cromatográficos de las proteínas intactas . En modalidades adicionales de la presente invención, la identificación de péptidos marcadores únicos que se originan de la región variable de los miembros individuales de una composición de proteínas homologas, es utilizada para caracterizar la composición de proteínas para la presencia de los miembros individuales, de una manera cualitativa. Estos péptidos marcadores son generados mediante digestión proteolítica de la composición de proteína (muestra) que comprende las diferentes proteínas homologas. Con el fin de realizar el mapeo de los péptidos de las regiones variables de una mezcla de proteínas homologas, es importante que la parte o partes de las regiones variables que diferencian los miembros individuales dentro de la mezcla de los otros miembros, sean mantenidas intactas después de la digestión proteolítica. Por lo tanto, una o más proteasas deben ser seleccionadas tal que al menos una secuencia única también denominada un péptido marcador, pueda ser obtenida para cada miembro individual de una proteína policlonal recombinante. Donde la mezcla de proteínas homologas es un anticuerpo policlonal recombinante o TcR policlonal recombinante, las secuencias que diferencian los miembros individuales uno del otro son normalmente caracterizados por las regiones de CDR. La elección de la proteasa, las proteasas o los compuestos químicos utilizados para generar los péptidos marcadores únicos está basada en un análisis de las secuencias de proteínas que constituyen la muestra de proteína homologa. En general, las proteasas o los compuestos químicos deben escindir en sitios definidos en la proteína con alta especificidad. Tales proteasas específicas de escisión son bien conocidas en la técnica y pueden ser por ejemplo, tripsina, endo Glu-C, lysyl-endopeptidasa, endo Arg-C, endo Asp-N o endo Asn-C. Estos son meramente ejemplos y no deben ser considerados como limitantes para esta modalidad. Cuando una muestra de proteína policlonal es digerida con una o más proteasas seleccionadas, un combinado de péptidos que se originan de las regiones constante y variable provenientes de todos los miembros individuales, serán generados . Una proporción de los péptidos marcadores únicos marcarán diferencias en sus propiedades fisicoquímicas en comparación a la población principal de péptidos que se originan de las regiones constantes . Los péptidos marcadores únicos pueden por lo tanto ser aislados utilizando una de las técnicas cromatográficas descritas anteriormente. Preferentemente, la cromatografía de intercambio iónico o la RP-HPLC específicamente diseñada para la separación de péptidos, se utiliza para separar los péptidos únicos de la fracción mayor de los péptidos de la región constante. Las técnicas cromatográficas muítidimensionales como se describieron previamente, pueden de igual modo ser aplicadas para separar los péptidos marcadores únicos . Después de la separación en una o más dimensiones, puede ser utilizada la espectroscopia de masa (MS) para la identificación de los diferentes péptidos. Las técnicas MS conocidas por la persona experta dentro del campo de los proteónicos, pueden ser utilizadas para la identificación de los péptidos. Las técnicas MS preferidas son la espectroscopia de masa de tiempo de vuelo (TOF, por sus siglas en inglés) de deserción/ionización de láser de UV asistido por matriz (MALDI, por sus siglas en inglés) , y la espectrometría de masa de tiempo de vuelo de ionización de electrorrocío (ESI-TOF, por sus siglas en inglés) . Alternativamente, la digestión proteolítica puede ser realizada sobre proteínas intactas separadas por cromatografía unidimensional o multidimensional como se describe en a) a d) y en la sección de "Cromatografía líquida multidimensional", anteriormente descrita, seguida por la escisión proteolítica de las fracciones de proteína separadas . Estas digestiones pueden ser luego analizadas mediante MS (Kackman, M.T. et al. 2002. Anal. Chem. 74, 1779-1791). Este procedimiento puede ser una ventaja para la caracterización de proteínas policlonales muy complejas, ya que puede ser aplicada selectivamente a una proporción de las fracciones obtenidas por un análisis unidimensional o multidimensional de las proteínas intactas, con el fin de caracterizar estas adicionalmente. La digestión proteolítica puede además ser realizada con el fin de aislar los péptidos marcadores N-terminales, si esos contienen regiones variables únicas . Los péptidos N-terminales pueden ser aislados como se describe esencialmente en Gevaert, K. et al., 2003. Nat. Biotechnol, 21, 566-569, incorporada por referencia en la presente. En resumen, los grupos amino libres en la proteína policlonal recombinante son bloqueados, por ejemplo, mediante acetilación, y la mezcla de proteínas es subscuentemente digerida por una proteasa adecuada. La digestión genera un grupo amino N-terminal libre sobre los péptidos internos que son subsecuentemente bloqueados con un compuesto que permite la separación de los péptidos internos a partir de péptidos N-terminales. Tales compuestos pueden ser i) ácido 2 , 4, 6-trinitrobencensulfónico (TNBS) como se describe por Gevaert que permiten el aislamiento por interacciones hidrofóbicas, ii) biotina, seguido por eliminación subsecuente después del enlace a la estreptavidina inmovilizada, o iii) matrices pre-activadas (por ejemplo, material de ECH-Sepharose activado con NHS, activado por CNBr, o el soporte de bis-acrilamida UltraLink con grupos Azolactona) seguido por la centrifugación, con lo cual los péptidos internos enlazados son separados de los péptidos L-terminales acetilados, que están presentes en el sobrenadante. Los péptidos N-terminales acetilados, aislados, pueden ser subsecuentemente analizados mediante cromatografía líquida unidimensional o multidimensional, combinada con el análisis MS como se describe anteriormente. Alternativamente, los extremos N de las proteínas intactas son bloqueadas con un compuesto que permite su separación específica y los péptidos internos generados después de la escisión son acetilados o bloqueados con un segundo compuesto. Adicionalmente, la identificación de péptidos marcadores únicos después de la digestión proteolítica puede ser realizada utilizando la funcionalidad de cadena lateral de aminoácido, característica. Una o una combinación de técnicas de afinidad diferentes que capturan los péptidos que contienen residuos específicos de aminoácidos con y sin modificación de cadena lateral de aminoácido, relevante, pueden ser utilizadas. Los péptidos que contienen, por ejemplo, cisteína, metionina, triptofano, histidina, y tirosina pueden ser purificados utilizando material de columna o esfera inmovilizadas con marcadores de afinidad específicos que capturan péptidos que contienen estos residuos de aminoácidos (Bernhard, O.K. et al. 2003. Proteomics 3, 139-146; Chelius, D. y Shaler, T.A. , 2003, Bioconjug. Chem. 14, 205-211; Gevaert, K. et al. 2002. Mol. Cell Proteomics 1, 896-903; Gygi, S.P. Et al., 1999. Nat Biotechnol 17, 994-999) . Los péptidos de la región variable únicos que contienen una cisteína y una tirosina pueden ser por ejemplo capturados sobre una columna de estreptavidina después de la biotinilación del residuo de cisteína, y subsecuentemente después de la elución de los péptidos que contienen cisteína, éstos pueden ser aplicados ya sea a una columna o a esferas que se enlazan específicamente a los residuos de tirosina. Esta captura de péptidos basada en la afinidad a residuos de aminoácidos específicos, puede ser realizada como una dimensión adicional a las técnicas cromatográficas previamente descritas como RP-HPLC y cromatografía de intercambio iónico. Primeramente, las técnicas cromatográficas son aplicadas a una digestión proteolítica .de la proteína policlonal recombinante en una o más dimensiones, luego la captura específica de aminoácido es realizada sobre una o más fracciones en una dimensión final, seguida por el análisis mediante MS . El aislamiento de los péptidos con base en la funcionalidad de cadena lateral puede ser luego realizado en combinación con la técnica de aislamiento de péptido N-terminal. Donde la proteína policlonal recombinante puede ser analizada por digestión proteolítica seguida por aislamiento de péptidos es una proteína multimérica, la separación de las subunidades es preferentemente realizada antes de la proteólisis con el fin de simplificar la "determinación de la huella digital" de la digestión proteolítica. Esto puede ser realizado por ejemplo, mediante la reducción y alquilación de los residuos de cisteína libres, seguido por la filtración en gel para separar las subunidades, por ejemplo, la separación de las cadenas pesadas de las cadenas ligeras, o las cadenas alfa de las cadenas beta, si la proteína policlonal es un anticuerpo o TcR, respectivamente. Alternativamente, la digestión proteolítica puede ser realizada bajo condiciones nativas. Particularmente para anticuerpos esto puede ser una alternativa adecuada, ya que la estructura cuaternaria de un anticuerpo conduce a una alta resistencia a la escisión proteolítica dentro de las regiones constantes. De este modo, la escisión proteolítica de un anticuerpo policlonal no es reducido, intacto, es probable que genere péptidos generalmente a partir de las regiones variables . Las técnicas de digestión proteolítica descritas anteriormente pueden ser también aplicadas de acuerdo al concepto de centinela, mediante la selección de péptidos centinela que pueden ser caracterizados dentro de una digestión proteolítica . Secuenciamiento N-terminal "a granel " Como se describe, las secuencias N-terminales pueden ser aisladas y utilizadas para la determinación de la huella digital de una digestión proteolítica, de una proteína policlonal. Alternativamente, la secuencia N-terminal puede ser secuenciada directamente a partir de la proteína intacta, con lo cual se omite el paso proteolítico. El análisis de secuencia N-terminal "a granel" de una muestra de proteína que comprende diferentes proteínas homologas que tienen diferentes regiones variables, puede ser utilizado para comparar los productos de lotes purificados, por ejemplo, de una proteína policlonal recombinante. Donde la proteína policlonal es un anticuerpo policlonal recombinante o TcR, el secuenciamiento N-terminal "a granel" es preferentemente, realizado sobre combinados de cadenas pesadas y ligeras separadas o cadenas alfa y beta separadas, respectivamente. En un combinado por ejemplo de las cadenas pesadas homologas, algunas posiciones de aminoácidos pueden ser completamente conservadas, mientras que otras posiciones pueden variar, esto puede ser evaluado por el alineamiento de las secuencias de aminoácidos. De este modo, varios aminoácidos diferentes pueden ser obtenidos mediante rondas particulares de secuenciamiento. Por ejemplo, la posición 4 puede ser representada por cinco diferentes aminoácidos en una muestra policlonal, como es determinado por alineamiento de las secuencias homologas. Durante el análisis de secuencia N-terminal "a granel" estos aminoácidos variantes pueden ser cuantificados y las diferentes cantidades de aminoácidos individuales que representan, por ejemplo, la posición cuatro en un anticuerpo policlonal recombinante, pueden ser utilizadas para comparar la composición relativa de diferentes muestras. Caracterización de las mezclas de proteína homologa complejas, con moléculas detectoras específicas La plataforma de caracterización de la presente invención emplea además moléculas detectoras específicas, donde cada molécula detectora específica es capaz de identificar un miembro de proteína individual dentro de una mezcla compleja de proteínas homologas, con lo cual se ayuda en el monitoreo de la presencia del miembro particular en una muestra. Las moléculas detectoras específicas pueden ser por ejemplo, ligandos específicos tales como moléculas orgánicas pequeñas, péptidos o proteínas con especificidad para un miembro individual de una proteína policlonal. En particular, los ligandos-péptidos o proteínas tales como los péptidos anti-idiotipo o los anticuerpos anti-idiotipo, son modalidades preferidas de la presente invención. Una molécula detectora que se enlaza a un subgrupo definido de la mezcla compleja de proteínas homologas, es también aplicable en la presente invención. Las moléculas detectoras específicas pueden ser utilizadas para caracterizar mezclas complejas de proteínas homologas, i) al permitir la determinación de concentraciones o la proporción relativa de una o más proteínas individuales en una muestra que comprende una muestra compleja de proteínas homologas, ii) actuando como una dimensión adicional en los análisis cromatográficos, iii) permitiendo la determinación de concentraciones de proteínas individuales en muestras obtenidas durante la fermentación de una mezcla compleja de proteínas homologas y iv) permitiendo la determinación de células productoras de proteína, individuales, en una línea celular policlonal, tal como un banco de células de trabajo, o una muestra de células de biorreactor, que expresan una mezcla de proteínas homologas. El paso iv puede ser ya sea realizado sobre una línea celular policlonal o sobre células simples distribuidas en tubos simples a partir de una línea celular policlonal, seguido por el periodo de cultivo subsiguiente. Para la generación de péptidos-ligandos específicos, capaces de identificar miembros proteicos individuales dentro de una mezcla compleja de proteínas homologas, pueden ser seleccionadas mediante afinidad bibliotecas grandes de vectores de expresión fagos, filamentosos, que muestran péptidos oligoméricos extraños sobre la superficie del virión, seguido por purificación de los fagos que muestran un péptido extraño que se enlaza a un anticuerpo TcR u otro miembro proteico individual deseado (Scott y Smith 1990. Science 249, 386-90). La patente Europea EP 1 106 625 describe en particular la generación de péptidos capaces de enlazarse a los anticuerpos anti-RhD para fines de inmunización. Bibliotecas de péptidos visualizados están aproximadamente entre 5 y 50 aminoácidos de longitud, y preferentemente entre 7 y 20 aminoácidos de longitud, aún más preferentemente 8 y 15 aminoácidos de longitud y lo más preferentemente entre 9 y 12 aminoácidos. Cuando los péptidos relevantes han sido identificados, éstos pueden ser sintetizados. La generación de los anticuerpos anti-idiotipo es en general conocida en la técnica. En resumen, los ratones son inmunizados con el anticuerpo hacia el cual se desean los anticuerpos anti-idiotipo. Los anticuerpos monoclonales son generados a partir de ratones inmunizados, los cuales son seleccionados para la producción de un anticuerpo anti-idiotipo con la especificidad deseada, utilizando por ejemplo, la tecnología de hibridomas o la visualización de fago. Los péptidos anti-idiotipo o los anticuerpos anti-idiotipo deben ser caracterizados con respecto a la especificidad y a la reactividad cruzada potencial. Este análisis verificará si un péptido anti-idiotipo o anticuerpo anti-idiotipo reconocen o no un miembro específico alternativamente reconocen o no un subgrupo de miembros estrechamente relacionados dentro de una proteína policlonal (para los anticuerpos, los miembros relacionados pueden ser por ejemplo una familia específica de genes de VH) . Los péptidos-anticuerpos anti-idiotipo pueden ser aplicados en ensayos de inmunodetección tales como ensayos de ELISA, FLISA, o RÍA para una cuantificación directa de las proteínas de los miembros individuales (por ejemplo, un anticuerpo específico o TcR específico) . Alternativamente, los péptidos/anticuerpos anti-idiotipo pueden ser aplicados en cromatografía de afinidad, ya sea solos o como una primera o dimensión adicional después de otras separaciones cromatográficas como se describen previamente. La inmunoprecipitación es un proceso adicional donde las moléculas detectoras pueden ser utilizadas para separar y caracterizar los miembros individuales de una proteína policlonal. Además, el péptido anti-idiotipo o el anticuerpo anti-idiotipo pueden ser utilizados para el aislamiento y/o determinación de las células individuales productoras de proteína en una línea de células policlonales. Las técnicas descritas por Borth, N. et al. 2000-2001. Biotechnol Bioeng. 71, 266-273 y Brezinsky, S.C. et al. 2003. J. Immunol . Methods 277, 141-155, son ambas aplicables para el aislamiento de las células productoras de proteínas individuales, a partir de un cultivo celular. Potencialmente es posible generar moléculas detectoras específicas para todos y cada uno de los miembros individuales en una proteína policlonal para obtener una caracterización completa. No obstante, con el fin de monitorizar la estabilidad de la expresión o la consistencia de lote a lote, es de acuerdo con la presente invención lo suficiente para identificar un número de miembros individuales denominadas proteínas centinelas , dentro de una proteína policlonal recombinante para la caracterización de manera cuantitativa y/o cualitativa, para asegurar que esta colección de miembros de proteínas individuales sea consistentemente expresada y purificada en diferentes lotes de la proteína policlonal recombinantemente producida. Este procedimiento puede ser utilizado en particular para simplificar la caracterización de un combinado complejo de moléculas de proteínas . El concepto de proteínas centinelas como representantes de una proteína policlonal recombinante, no solamente aplica la molécula detectora específicamente, virtualmente cualquiera de las técnicas de caracterización previamente descritas o combinaciones de éstas pueden aplicar el concepto de proteínas o péptidos centinelas. Además, las proteínas centinela pueden variar de técnica a técnica. Algunos miembros específicos de la proteína policlonal pueden separarse particularmente bien con base en la diferencia en sus propiedades fisicoquímicas, mientras que los péptidos anti-idiotipo con alta afinidad son particularmente útiles para la preparación de proteínas con propiedades fisicoquímicas idénticas . En modalidades de la presente invención, una o más moléculas detectoras específicas son utilizadas para monitorizar la proporción relativa de una o más proteínas centinelas en muestras que comprenden diferentes proteínas homologas que tienen diferentes regiones variables. La consistencia en la proporción de una o más proteínas centinelas en una serie de muestras relacionadas, reflejará la estabilidad composicional en la expresión de una proteína policlonal entre lotes, así como el tiempo en una corrida de producción simple. Además, ésta puede evaluar la estabilidad composicional durante el almacenamiento a largo plazo de la proteína policlonal recombinante o una mezcla de proteínas monoclonales . En modalidades preferidas de la presente invención, las proteínas centinelas o una proteína policlonal recombinante son caracterizadas por una o más de las siguientes técnicas, i) la cromatografía de afinidad del péptido/anticuerpo anti-idiotipo, ii) inmunodetección con péptidos/anti-anticuerpos anti-idiotipo, iii) aislamiento cromatográfico multidimensional de los miembros intactos con respecto a sus propiedades fisicoquímicas características, y iv) mapeo peptídico proteolítico utilizando cromatografía y MS . Complejidad de una mezcla de proteínas homologas diferentes que van a ser caracterizadas Una muestra que va a ser caracterizada por la plataforma de la presente invención comprende un subgrupo definido de diferentes proteínas homologas que tienen diferentes proteínas de las regiones variables, por ejemplo, una proteína policlonal o anticuerpos con diferentes regiones CDR (por ejemplo, un anticuerpo policlonal o una mezcla de anticuerpos monoclonales) o células T receptoras con diferentes regiones CDR (por ejemplo, una TcR policlonal o una mezcla de TcRs monoclonales) . Es de preferencia que las proteínas homologas diferentes que tengan regiones variables diferentes, sean proteínas recombinantes. Además, se prefiere que los miembros individuales de una proteína policlonal o mezcla de proteínas monoclonales, hayan sido definidas por una característica común tal como la actividad de enlace compartida hacia un objetivo deseado, por ejemplo, en el caso de los anticuerpos o TcRs contra el antígeno objetivo deseado. Típicamente, una composición de proteína policlonal que va a ser analizada por la plataforma de caracterización de la presente invención comprende al menos 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 1000, 104, 105 ó 106 miembros variantes distintos. Usualmente, ningún miembro variante simple constituye más del 75% del número total de los miembros individuales en la composición de proteína policlonal. Preferentemente, ningún miembro individual excede más de 50%, aún más preferentemente 25% y lo más preferentemente 10% del número total de miembros individuales en la composición policlonal final. En el caso de anticuerpos, la complejidad del o de los antígenos objetivo influirá el número de miembros variantes distintos en la composición de proteína policlonal que va a ser caracterizado, utilizando la plataforma de la presente invención. Con objetivos pequeños o no muy complejos, por ejemplo, una proteína objetivo pequeña, una composición de proteína policlonal que comprende entre 3 a 100 miembros variantes distintos, será establecida para la caracterización, y se prefiere que el número de variantes no exceda 90, o incluso 80 ó 70. En muchos casos, el número de variantes distinto no excederá 60 ó 50, y se prefiere que el número de variantes esté en el intervalo de entre 5 y 40, tal como entre 5 y 30. Mientras que para objetivos más complejos, por ejemplo, virus con proteínas superficiales complejas o intercambiables, o que abarcan varios subtipos de virus, una composición de proteína policlonal que comprende entre 20 a 500 distintos miembros variantes será establecida para la caracterización. Para objetivos muy complejos donde el antígeno comprende muchas diferentes moléculas, una composición de proteína policlonal que comprende entre 50 a 10,000 distintos miembros variantes pueden necesitar ser caracterizados de acuerdo a la presente invención. En una modalidad de la presente invención, la muestra que comprende las diferentes proteínas homologas que tienen diferentes regiones variables, es un anticuerpo policlonal. El anticuerpo policlonal puede estar comprendido de uno o más isotipos de anticuerpos diferentes, tales como los isotipos humanos igGl, lgG2, IgG3 , IgG4, igAl e IgA2 , o los isotipos murinos IgGl , IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgA. En una modalidad de la presente invención, la muestra que comprende las diferentes proteínas homologas que tienen diferentes regiones variables, es una TcR policlonal. EJEMPLOS En los siguientes ejemplos, varias composiciones de anticuerpo policlonal recombinantes (rpAb anti-RhD) comprendidas de diferentes miembros de anticuerpo anti-RhD individuales, o las líneas celulares que producen rpAb anti-RhD han sido utilizadas para ilustrar la plataforma de caracterización estructural de la presente invención. Los anticuerpos individuales específicos de anti-RhD y las líneas celulares que los producen, corresponden a aquellas descritas en la solicitud de patente Danesa del presente cesionario, PA 2004 01133 presentada el 20 de Julio del 2004. En resumen, una biblioteca de visualización de fagos combinatorios de regiones variables de cadena pesada y regiones ligeras kappa/lambda, fue generada a partir de donadores D-negativos Rhesus inmunizados con eritrocitos positivos a RhD. La biblioteca fue visualizada panorámicamente para los clones productores de anticuerpos específicos anti-RhD. Los pares de genes de las cadenas pesada y ligera variables provenientes de los fagos específicos del antígeno fueron transferidos a un vector de expresión de mamífero. Los vectores de mamífero fueron transfectados individualmente dentro de la línea celular CHO Flp-In (Invitrogen, CA) , de una manera específica del sitio utilizando el sistema de recombinación Flp-FRT. El ácido nucleico (nuc.) así como las secuencias de proteínas (a. a.) para las cadenas ligeras completas (LC) así como la región variable de las cadenas pesadas (VH) son identificados por los números de identidad secuencial (seq id) mostrados en la Tabla 2. Estos números corresponden a la SEQ ID Nos . en la solicitud de patente Internacional del presente cesionario PCT/DK2005/00501 titulado "ANTICUERPO POLICLONAL RECOMBINANTE ANTI-RHESUS Y MÉTODOS DE FABRICACIÓN" y presentada el 18 de Julio del 2005. Las seq id's de la Tabla 2 deben ser distinguidas de las SEQ ID Nos. de la presente solicitud, ya que éstas no son idénticas. La región constante de las cadenas pesadas corresponden a la IgGl humana.

Tabla 2. Lista los anticuerpos anti-RhD/clones celulares, individuales utilizados en los siguientes ejemplos. EJEMPLO 1 El presente ejemplo ilustra la generación de una línea celular de fabricación policlonal, y la caracterización de la variación de lote a lote, sobre el nivel de proteína utilizando una técnica cromatográfica en una dimensión, y al nivel genético utilizando análisis RFLP. Establecimiento de una línea celular de fabricación para la producción de anticuerpo policlonal recombinante anti-Rhesus D Diez líneas celulares, que expresan cada una distinto anticuerpo recombinante anti-Rhesus D provenientes de un sitio específico sobre su genoma (RhDl57.119D11 , RhDl58.119B06, RhDl59.119B09, RhDldl .119E09 , RhDl63.119A02 , RhDl90.119F05 , RhDl91.119E08, RhDl92.119G06 , RhDl97.127A08 y RhD204.128A03 ) fueron seleccionadas y mezcladas para constituir la. línea celular de fabricación policlonal recombinante. RhDl97 y RhD204 fueron clones Lambda mientras que los restantes fueron clones kappa . Posteriormente, los cultivos celulares que expresan los antígenos individuales anti-Rhesus fueron completamente adaptados al cultivo en suspensión libre de suero en matraces agitadores, y fueron mezclados en número de células iguales, con lo cual se genera una línea celular policlonal CHO-Flp-In (019) . El cultivo de células mixtas fue centrifugado y congelado en alícuotas de 10 x 106 células/tubo. Dos tubos (3948 FCW065 y 3949 FCW065) fueron descongelados y cultivados individualmente por 11 semanas en frascos de agitadores de 1000 ml que contenían 100 ml de medio Excell 302 libre de suero, con neomicina. El sobrenadante fue cosechado y filtrado antes de la purificación rpAb anti-RhD. Diversidad clonal La diversidad clonal fue evaluada al nivel de las proteínas así como al nivel del mRNA. La muestra de sobrenadante utilizada para analizar la composición anticuerpo fue tomada después de 9 semanas de cultivo, mientras que la muestra celular utilizada para analizar la composición de RNA fue tomada en la cosecha después de 11 semanas de cultivo. Composición del anticuerpo : El rpAb anti-RhD expresado a partir de la línea celular policlonal CHO-Flp-In (019) está en el anticuerpo isotipo IgGl . El rpAb anti-RhD fue purificado a partir de ambas alícuotas (3948 y 3949) utilizando una columna inmovilizada con proteína A. Los anticuerpos individuales interactuaron con la proteína A inmovilizada a pH de 7.4, mientras que las proteínas contaminantes fueron lavadas de la columna. Los anticuerpos enlazados fueron subsecuentemente eluidos de la columna a un bajo valor de pH (pH 2.7). Las fracciones que contenían anticuerpos, determinadas por mediciones de absorbancia a 280 nm, fueron combinados y dializadas contra acetato de sodio 5 mM, pH 5.

Las composiciones del rpAb anti-RhD obtenidas de la alícuota 3948 y 3949 (FCW065) después de 9 semanas de cultivo, fueron analizadas utilizando cromatografía de intercambio catiónico. El rpAb anti-RhD purificado por vitamina A, fue aplicado sobre una columna PolyCatA (4.6 x 100 mm) en acetato de sodio 25 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 5.0 a una velocidad de flujo de 60 ml/h, operada a temperatura ambiente. Los componentes de anticuerpo fueron subsecuentemente eluidos utilizando un gradiente lineal de cloruro de sodio y 150-350 mM en acetato de sodio 25 mM, pH 5.0, a una velocidad de flujo de 60 ml/hora. Los componentes de anticuerpo fueron detectados espectrofotometricamente a 280 nm. El cromatograma (Figura 1) fue subsecuentemente integrado y las áreas de los picos individuales A-J fueron utilizadas para cuantificar los componentes de anticuerpo (Tabla 3) . El área total de los picos fue ajustada a 100%. Los cromatogramas provenientes de las dos alícuotas mostraron una distribución pico idéntica, así como concentraciones similares de los componentes en cada pico. A partir de estos resultados, se puede concluir que las alícuotas de la misma línea celular policlonal desarrollada bajo condiciones idénticas, producirán el rpAb anti-RhD con una distribución similar de los miembros de anticuerpo individuales . Los miembros individuales de los rpAb anti-RhD fueron asignados a uno o más picos particulares (resumidos en la Tabla 3). Esta asignación está basada en los cromatogramas obtenidos para anticuerpos individuales, analizados bajo condiciones idénticas . Un cromatograma individual no fue obtenido para el Ab RhDl58, de este modo este clon no fue asignado a ninguno de los picos. No obstante, se considera probable que el pico D constituye RhDl58, este anticuerpo debe ser también representado en algunos de los otros picos debido a la heterogeneidad. En particular, el producto de anticuerpo proveniente del clon RhDl97 muestran un alto grado de heterogeneidad en el perfil IEX. El anticuerpo RhDl90 Ab debe haber sido visible a un tiempo de retención de 15.3 minutos. No obstante, éste no fue detectable, indicando que este clon se perdió o alternativamente fue producido en cantidades por debajo del límite de detección en la línea celular de fabricación policlonal recombinante. La pérdida del clon RhDl90 corresponde a una reducción del 10% de la diversidad, que se considera aceptable con respecto a la diversidad de la composición final del rpAb anti-RhD.

Tabla 3 Composición del mRNA : La diversidad clonal dentro de la línea celular policlonal CHO-Flp-In (019) después de 11 semanas de cultivo fue estimada mediante análisis de RT-PCR-RFLP. En resumen, las suspensiones celulares correspondientes a 200 células fueron sometidas a un procedimiento de congelamiento-descongelamiento y estos lisados fueron utilizados como plantilla en un RT-PCR utilizando el equipo RT-PCR de un solo paso (Qiagen) con cebadores que amplifican la cadena ligera. Las secuencias cebadoras fueron: Cebador delantero : 5 ' -TCTCTTCCGCATCGCTGTCT (SEQ ID NO 1) Cebador inverso: 5 ' -AGGAAAGGACAGTGGGAGTGGCAC (SEQ ID NO 2) Los productos de RT-PCR fueron digeridos con Hinfl y analizados mediante electroforesis en gel de agarosa, visualizando el producto de restricción con tinción con bromuro de etidio (Figura 2) . El tamaño esperado de los fragmentos de restricción obtenidos mediante la digestión con Hinfl de las cadenas ligeras amplificadas por RT-PCR, se muestran para cada clon individual en la Tabla 4. Seis tamaños de fragmento únicos sobre el gel, los cuales pudieron ser asignados a miembros individuales de los genes que codifican para el anticuerpo policlonal anti-Rhesus D, son indicados en negritas. No todos los fragmentos únicos pudieron ser identificados por el gel, éstos son indicados en cursivas. De este modo, no obstante, esto no necesariamente excluye que estos clones sean efectivamente representados en el cultivo, ya que los fragmentos pueden no haber sido ya sea separados suficientemente desde otros fragmentos para ser identificables, o alternativamente que la concentración haya sido demasiado débil en comparación a bandas que aparecen más fuertes. Esto puede ser más pronunciado para fragmentos más cortos, ya que éstos se enlazan a un número más pequeño de moléculas de bromuro de etidio y por lo tanto son menos visibles. Tabla 4 Las dos alícuotas (3948 y 3949) de la misma línea de células policlonales, mostraron un patrón de expresión similar en el gel, aunque la intensidad de las bandas no fue completamente idéntica. Esto indica que las alícuotas de la misma línea de células policlonales desarrolladas bajo condiciones idénticas producirá rpAb anti-RhD con una diversidad clonal similar.

Sumar i o Diez líneas celulares que expresan cada una un anticuerpo monoclonal anti-RhD fueron mezcladas con el fin de generar una línea celular de fabricación del rpAb anti-RhD, que después de 9 semanas de cultivo todavía mantuvo 90% de la diversidad inicial. Después de 11 semanas de cultivo el mRNA proveniente de seis diferentes clones pudo ser no ambiguamente identificado y es probable que otros varios clones sean representados en la banda aproximadamente a 500 pares de bases (bp) . El hecho de que las dos alícuotas de las líneas celulares policlonales CHO-Flp-In (019) mostraron resultados similares con respecto a la diversidad clonal, ilustra que los resultados reproducibles pueden ser obtenidos entre diferentes lotes. EJEMPLO 2 El presente ejemplo ilustra la caracterización de un cultivo de células policlonales con ocho miembros sobre el tiempo. La diversidad clonal del cultivo fue evaluada al nivel genético utilizando el análisis de RFLP y al nivel de las proteínas utilizando una técnica cromatográfica en una dimensión. Análisis de RFLP para estimar la diversidad clonal en cul tivos de células policlonales La distribución de los clones individuales en un cultivo celular policlonal que expresa ocho diferentes anticuerpos anti-Rhesus D, fue estimada mediante el análisis de RFLP terminal (T-RFLP) de los productos de RT-PCR derivados de la línea celular policlonal. En el procedimiento de T-RFLP el o los cebadores delanteros y/o inverso son fluoescentemente marcados y por lo tanto una proporción de los fragmentos de restricción generados a partir de los amplicones contendrán el marcador . Los fragmentos marcados pueden ser subsecuentemente separados mediante electroforesis capilar y detectados mediante fluorescencia. El análisis puede ser realizado sobre la cadena ligera y la región variable de las secuencias que codifican para la cadena pesada, dependiendo de los cebadores aplicados. En resumen, una suspensión celular fue correspondiente a 200 células fue lavada una vez en PBS y sometida a un procedimiento de congelamiento/descongelamiento que genera lisados utilizados como plantilla en una amplificación de RT-PCR utilizando un equipo One-Step RT-PCR (Qiagen) y cebadores adecuados. La RT-PCR fue llevada a cabo sobre un ciclador térmico estándar con las siguientes condiciones: Transcripción inversa 559C por 30 minutos Desnaturalización 952C por 15 minutos Ciclo de inicio (35 ciclos) Desnaturalización 95SC por 30 segundos Recocido 60aC por 30 segundos Alargamiento 72 SC por 5 minutos Ciclo final Alargado 722C por 15 minutos Finalización 82C para siempre Para el análisis de la cadena ligera fueron utilizados los siguientes cebadores para la amplificación por RT-PCR. El cebador inverso fue 6-carboxifluoresceína (FAM) marcada, y las secuencias cebadoras fueron como sigue: VL cebador delantero: 5 ' -TCTCTTCCGCATCGCTGTCT (SEQ ID NO 1) CL cebador inverso: 5 ' -FAM-AGGAAAGGACAGTGGGAGTGGCAC (SEQ ID NO 2) Veinte microlitros del producto de RT-PCR fueron digeridos con una U de Nhel, 1 U de PstI y 1 U de Hinfl (todos de New England Biolabs) en NEBÍ por 2 horas. Los fragmentos marcados fueron detectados mediante electroforesis capilar de fluorescencia sobre un aparato AB13700 (Applied Biosystems) en el Statens Serum Institute, Copenhagen, Dinamarca. Los fragmentos esperados para cada uno de los clones celulares productores del anticuerpo anti-RhD son mostrados en la Tabla 5 y los fragmentos marcados con FAM son indicados en negritas .

Tabla 5 El patrón de T-RFLP es mostrado en la Figura 3 y los ochos clones productores del anticuerpo anti-Rhesus D han sido asignados a los picos específicos. Bajo el presunto de que no existió competencia de plantilla-cebador durante la RT-PCR, el área pico relativo responderá a la cantidad relativa del mRNA transcrito a partir de cada gen de cadena ligera del anticuerpo representado en la línea celular policlonal. Para el análisis de la región variable de cadena pesada, dentro de la misma línea de células policlonales, la amplificación por RT-PCR fue llevada a cabo con cebadores específicos de VH. Las secuencias cebadores fueron como sigue: VH cebador delantero: 5' -FAM CGTAGCTTTTAAGAGGTG (SEQ ID NO 3) VH cebador inverso: 5 ' -HEX-ACCGATGGGCCCTTGGTGGA SEQ ID NO 4) Veinte µl del producto de RT-PCR fueron digeridos con 1 U de Rsal y 1 U de Ndel (todos de New England Biolabs) en NEB2 por 2 horas . Los fragmentos marcados fueron detectados mediante electroforesis capilar de fluorescencia sobre un ABI3700. El análisis fue realizado por el Satenes Serum Institute, Copenhagen, Dinamarc . Los patrones esperados de T-RFLP son mostrados en la Tabla 6, donde los fragmentos mostrados con FAM son mostrados en negritas y los fragmentos marcados con HEX (éster succinimidilo de la 6-carboxi-2 ' , 4, 4 ' , 5, 7 , 7 ' -hexaclorofluoresceína) , están subrayados. Tabla 6 La línea celular policlonal fue cultivada por más de 5 semanas y una vez a la semana fueron tomadas muestras para los análisis de T-RFLP. El análisis fue realizado sobre la cadena pesada variable, pero pudo haber sido realizado sobre la cadena ligera también, si se desea. Después de la electroforesis capilar de los fragmentos de restricción, las sales pico relativas fueron integradas y utilizadas para estimar la intensidad clonal del cultivo celular policlonal. Las cantidades relativas sobre el tiempo fueron mostradas en la Figura 5. Con base en estos resultados, parece que RhDl96 se incrementa mientras que RhD203 parece disminuir sobre el tiempo. Las cantidades de los otros clones son muy estables durante el periodo de cultivo y los cDNA pudieron ser detectados después de cinco semanas de cultivo. Al realizar T-RFLP sobre la cadena ligera y la cadena pesada, así como sobre el mRNA y el DNA, debería ser posible obtener una huella digital precisa de la diversidad clonal dentro del cultivo de células policlonales, por ejemplo, en las células al límite de la edad de células in vitro o a cualquier punto de tiempo dado, durante el cultivo. La técnica puede ser por lo tanto utilizada para monitorizar la estabilidad de la diversidad clonal en un cultivo celular sobre el tiempo, durante la producción del anticuerpo. La técnica puede ser también aplicada para monitorizar la consistencia de lote a lote por ejemplo de diferentes ampolletas congeladas a partir del mismo banco de células de trabajo policlonales (pWCB) o en células cosechadas después de dos o más corridas de fabricación. Análisis cromatográfico de intercambio catiónico para estimar la diversidad clonal en un cul tivo de células policlonales El rpAb anti-RhD producido a partir del mismo cultivo de células policlonales como se utilizó en el análisis T-RFLP descrito anteriormente, fue analizado utilizando cromatografía de intercambio catiónico. El anticuerpo policlonal producido recombinantemente purificado por proteína A, fue aplicado sobre una columna polyCatA (4.6 x 100 mm) en acetato de sodio 25 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 5.0 a una velocidad de flujo de 60 ml/hora operada a temperatura ambiente. Los componentes del anticuerpo fueron subsecuentemente eluidos utilizando un gradiente lineal de 150-350 mM de cloruro de sodio en acetato de sodio 25 mM, pH 5.0 a una velocidad de flujo de 60 ml/hora. Los componentes del anticuerpo fueron detectados espectrofotométricamente a 280 nm y el cromatograma fue subsecuentemente integrado y el área de los picos individuales fue luego utilizada para cuantificar los componentes del anticuerpo. Las cantidades relativas sobre el tiempo son mostradas en la Figura 6. Sumario Los resultados obtenidos a nivel genético por el análisis de RFLP y al nivel de las proteínas mediante cromatografía de intercambio catiónico, son comparables. Las Figuras 5 y 6 ilustran claramente que la mayoría de los clones individuales en la línea celular policlonal así como los anticuerpos individuales del anticuerpo policlonal expresados a partir de la línea celular, siguen las mismas tendencias durante las cinco semanas de cultivo. De este modo, los análisis al nivel genético, así como a nivel de las proteínas son buenos equivalentes para evaluar la diversidad computacional de una línea celular al nivel genético y la proteína policlonal recombinante producida a partir de la línea celular.

EJEMPLO 3 El presente ejemplo ilustra la caracterización de un cultivo de células policlonales con veinticinco miembros, sobre el tiempo. La diversidad clonal del cultivo fue evaluada al nivel genético utilizado en el análisis T-RFLP y al nivel de las proteínas utilizando una técnica cromatográfica en una dimensión. Análisis de T-RFLP de la parte variable de los genes de cadena pesada derivado de un cul tivo de células policlonales que expresan veinticinco diferentes anticuerpos anti-Rhesus D sobre un periodo de 5 semanas de cul tivo . El cultivo de células policlonales examinadas en el presente ejemplo estuvo compuesto de una mezcla de cultivos celulares que expresan veinticinco diferentes anticuerpos anti-Rhesus D (generados como se describe en el Ejemplo 1) . El cultivo de células policlonales fue cultivado en 5 semanas y una vez a la semana fueron tomadas muestras para los análisis de T-RFLP. El RT-PCR fue llevado a cabo con cebadores específicos de VH descritos en el Ejemplo 2 y en el fragmento de restricción fue llevado a cabo de igual modo. T-RFLP de las veinticinco diferentes secuencias que codifican para anti-Rhesus D, si todos los genotipos están presentes, dan como resultado diecisiete diferentes fragmentos marcados con FAM. Algunos fragmentos representarán hasta tres diferentes genotipos, mientras que otros representarán un genotipo único. Los tamaños esperados de los fragmentos marcados con FAM se muestran en la Tabla 7, junto con las cantidades relativas de los diferentes fragmentos marcados con FAM, sobre el tiempo. Además, un ejemplo de un perfil de T-RFLP es mostrado en la figura 4 Tabla 7 Fue posible separar los fragmentos de restricción a un grado que permitió que la información fuera obtenida para doce clones individuales de los veinticinco clones que constituyen la línea celular. Las fracciones restantes pudieron ser potencialmente sometidas a secuenciamiento con el fin de obtener más información sobre los clones remanentes . Análisis cromatográfico de intercambio catiónico para estimar la diversidad clonal en un cul tivo de células policlonales que expresan los veinticinco diferentes anticuerpos anti -Rhesus D El rpAb anti-RhD del mismo cultivo de células policlonales que se utilizó en el análisis de T-RFLP descrito anteriormente, se analizó utilizando cromatografía de intercambio catiónico. El anticuerpo policlonal producido recombinantemente, purificado por proteína A fue aplicado sobre una columna PolyCatA (4.6 x 100 mm) en acetato de sodio 25 mM, pH 5.0 a una velocidad de flujo de 60 ml/hora operada a temperatura ambiente. Los componentes del anticuerpo fueron subsecuentemente eluidos utilizando un gradiente lineal de cloruro de sodio 150-350 mM en acetato de sodio 25 mM, pH 5.0 a una velocidad de flujo de 60 ml/hora. Los componentes del anticuerpo fueron detectados espectrofotométricamente a 280 nm y el cromatograma fue subsecuentemente integrado y el área de picos individuales se utilizó para cuantificar los diferentes componentes del anticuerpo. La Figura 7 muestra el cromatograma producido a partir de la muestra obtenida en la semana 4, los picos que contienen anticuerpo que están numerados del 1 al 25. Es concurrencia pura que el cromatograma contenga un número idéntico de picos que el número de anticuerpos individuales en el anticuerpo policlonal analizado. La Tabla 8 muestra el contenido relativo en porcentaje de los componentes de anticuerpo totales (ACl a 25) así como la representación de los anticuerpos individuales en cada componente de anticuerpo (pico) . La asignación de los anticuerpos individuales a los picos cromatográficos integrados estuvo basado en los tiempos de retención y los patrones pico obtenidos a partir de los anticuerpos monoclonales analizados utilizando cromatografía de intercambio catiónico bajo condiciones idénticas.

Tabla 8 La cromatografía de intercambio catiónico separa los miembros de anticuerpos individuales a partir de un anticuerpo policlonal, con bases en la diferencia en la carga neta entre los miembros individuales, y además separa las formas de los anticuerpos individuales que aparecen con carga heterogénea. Varios anticuerpo fueron por lo tanto representados en un pico simple, por ejemplo, AC 1 que contiene RhD293 y RhD319 (ver Tabla 8) y algunos anticuerpos individuales fueron además representados en varios picos cromatográficos, por ejemplo, RhD319 que está presente en ACl y 5 (ver Tabla 8) . Los picos que contienen más de un anticuerpo individual pudieron ser sometidos a técnicas adicionales de caracterización química de proteínas, tales como análisis cuantitativo con los péptidos anti-idiotipo, mapeo peptídico proteolítico, secuenciamiento N-terminal o una cromatografía de segunda dimensión. Sumario El presente ejemplo ilustra el uso combinado de los análisis de T-RFLP y la cromatografía de intercambio catiónico para evaluar la distribución de los transcritos primarios y de los componentes de anticuerpo, respectivamente, en un periodo de cultivo. El análisis de T-RFLP permite la identificación únicamente de 12 clones individuales de los 25 clones expresados en la línea celular policlonal y en el presente ejemplo se ilustra que estos 12 clones pudieron ser detectados durante 4 semanas de cultivo con el análisis de T-RFLP. Potencialmente, más clones pudieron ser identificados mediante análisis secuencial de los fragmentos que representan más de un clon. La distribución de componentes de anticuerpo fue analizado utilizando cromatografía de intercambio catiónico y en el presente ejemplo se observa que la distribución de los 25 componentes analizados es relativamente estable durante el cultivo. Aunque la identificación única de todos anticuerpos individuales es difícil debido a la naturaleza heterogénea en carga, inherente de los anticuerpos expresados, se demostró en el presente ejemplo que el componente 8 del anticuerpo que representa el anticuerpo RhDl60, mostró el más alto nivel de anticuerpo durante el periodo de cultivo, de acuerdo con los altos valores de R-RFLP obtenidos para el grupo 13 que representan los clones RhDl60, 293 y 196. Además, el componente RhD 207, el cual pudo ser identificado de manera única por T-RFLP así como cromatografía de intercambio catiónico, mostró valores de T-RFLP de 10-11% y niveles ligeramente menores de 5.5-10% obtenidos al nivel del anticuerpo. En general, las dos técnicas conjuntamente demuestra una producción relativamente estable a nivel del mRNA y del anticuerpo durante el cultivo; no obstante, discrepancias potenciales entre las dos técnicas pudieron también ser observadas, ilustradas por la pérdida aparente de la transcripción de algunos clones en las semanas 5 de cultivo contrastando los resultados obtenidos al nivel del anticuerpo. De este modo, el presente ejemplo justifica el uso complementario de ambas técnicas para definir los intervalos de cultivo dentro de los cuales puede ser producida la producción estable de proteína policlonal compleja. EJEMPLO 4 El presente ejemplo ilustra un análisis composicional de un anticuerpo anti-RhD policlonal, con los diez miembros individuales derivados de un cultivo de células policlonales. La diversidad de la muestra de anticuerpo policlonal fue evaluada utilizando cromatografía líquida bidimensional que separó los anticuerpos con base en las diferencias en su carga neta e hidrofobicidad, utilizando intercambio catiónico en la primera división y HPLC de fase inversa (RP)-HPLC en la segunda dimensión, respectivamente. Una muestra de anticuerpo policlonal anti-RhD con diez miembros individuales fue derivado de un cultivo de células policlonales. El rpAb anti-RhD fue purificado a partir del sobrenadante utilizando una columna de proteína A (columna HiTrap" proteína A, Amersham Biosciences GE Healthcare, Inglaterra) . La primera dimensión fue ejecutada mediante la aplicación del anticuerpo policlonal purificado sobre una columna ProPac WCE10 (4 x 250 mm) en acetato de sodio 25 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 5.0 a una velocidad de flujo de 60 ml/hora, operado a temperatura ambiente sobre un sistema Ettan LC (Amersham Biosystems, GE Healthcare, Inglaterra) . Los componentes del anticuerpo fueron subsecuentemente eluidos utilizando un gradiente lineal de 150 a 350 mM de cloruro de sodio en acetato de sodio en 25 mM, pH 5.0 a una velocidad de flujo de 60 ml/hora. Los componentes del anticuerpo fueron detectados espectrofotométricamente a 280 nm y las fracciones correspondientes a los picos particulares fueron recolectadas y además concentradas antes del análisis mediante RP-HPLC. Las fracciones indicadas en la Figura 8 fueron además separadas en una segunda dimensión utilizando RP-HPLC. La segunda dimensión fue realizada sobre un sistema de HPLC Summit (Dionex, CA) utilizando una columna Zorbax Poroshell 330SB-C8 (2.1 x 75 mm (5 µm) , y el sistema de HPLC fue configurado como fue recomendado en las instrucciones para la columna Poroshell (Agilent Technologies, CA) . Los componentes anticuerpo recolectados de la cromatografía de intercambio catiónico fueron reemplazados sobre la columna (5 µl) en 10% de CH3CN, 0.1% de TFA, 0.3% de PEG a una velocidad de flujo de 120 ml/hora y eluidos mediante un gradiente lineal de 90% de CH3CN, 0.8% de TFA, 0.3% de PEG. La columna fue operada a 702C. Todas las muestras componentes del anticuerpo dieron como resultado cromatogramas con uno o dos picos angostos . El perfil de RP-HPLC de un componente de anticuerpo B5 es mostrado en la figura 9. Sumar i o Ya que la cromatografía de intercambio catiónico en la primera dimensión separa los anticuerpos individuales que difieren en carga neta, así como los anticuerpos individuales que aparecen heterogéneos en carga, varios anticuerpos pueden ser representados en un pico simple. Varios componentes de anticuerpo fueron separados dando como resultado un perfil más bien complejo como se muestra en la Figura 8. Como se ilustra en los ejemplos 2 y 3, es posible identificar los componentes individuales en cada pico por un análisis comparativo con los anticuerpos monoclonales analizados bajo condiciones idénticas. No obstante, no fue realizado en el presente experimento, ya que el propósito fue proporcionar una huella digital para la comparación de las muestras una entre la otra sin tener que asignar a cada anticuerpo monoclonal en el rpAb. De este modo, la combinación de intercambio catiónico seguida por RP-HPLC genera datos a partir de dos dimensiones, y los mapas de proteínas codificados por color, detallados (ProteoVue software, Eprogen, EUA) como se ilustra en la Figura 10, pueden ser construidos para la evaluación de la consistencia de lote a lote, sin la necesidad de analizar anticuerpos monoclonales para caracterizar los miembros individuales del rpAb complejo. EJEMPLO 5 El presente ejemplo ilustra la caracterización de un anticuerpo policlonal anti-RhD con ocho miembros individuales derivados de un cultivo de células policlonales. La diversidad del anticuerpo policlonal fue evaluada utilizando análisis de secuencia N-terminal "a granel".

La secuencia N-terminal de los miembros individuales presentes en la muestra de anticuerpo anti-RhD policlonal que fueron analizadas en el presente ejemplo, se muestran en seguida en la Tabla 9. Las secuencias de cadena ligera lambda se muestran en cursivas. Tabla 9 El rpAb anti-RhD purificado por proteína A fue analizado mediante SDS-PAGE reductor (NuPAGE 4-12%) . Los polipéptidos fueron electrotransferidos sobre una membrana de PVDF y subsecuentemente teñidos con azul de comassie de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Una banda de aproximadamente 53 kDa correspondiente a la cadena pesada (HC) y dos bandas de aproximadamente 25 y 30 kDa correspondientes a las cadenas ligeras kappa y lambda + kappa, respectivamente, fueron claramente visibles sobre la membrana de PVDF teñida con azul de comassie. Estas bandas fueron cortadas y sometidas al análisis de la secuencia N-terminal, utilizando un secuenciador de proteínas ABI Procise (Applied Biosytems, CA) y programas estándares. Los resultados de secuenciamiento son resumidos en la Tabla 10 siguiente. Tabla 10 ND = No determinado Las secuencias para los HCs son idénticas, excepto para el primer residuo, mientras que las LCs kappa son conservadas para los residuos dos, cinco, seis y siete y las LCs lambda son conservadas para los residuo uno, cinco y seis (ver Tabla 9) . El resultado obtenido a partir del secuenciamiento de la HC está en concordancia con las secuencias esperadas como se presentan en la Tabla 10. Los datos de secuencia a partir de la banda LC kappa de ~ 25 kDa indicó la presencia de anticuerpos con la secuencia N-terminal EIVLTQS (SEQ ID No.: 7), correspondiente a RhD191, 324, 201 y 306, y los anticuerpos con la secuencia N-terminal DIQMTQS (SEQ ID No. : 8) correspondiente a RhD244 y 196. Con la presente técnica no obstante, no fue posible evaluar si todos los miembros individuales estaban presentes en la muestra de anticuerpo policlonal. El secuenciamiento de la banda de LC de ~ 30 kDa indicó la presencia del anticuerpo RhD319 juzgada por la presencia de una Val en el ciclo tres y cuatro. No se obtuvo evidencia para la presencia del anticuerpo RhD203 (ni S y A en el ciclo dos y tres, respectivamente) . No obstante, la cromatografía de intercambio iónico y el análisis de la secuencia N-terminal de este anticuerpo monoclonal recombinante, sugiere fuertemente que el LC de RhD203 tiene un extremo N parcial bloqueado. De este modo, se puede determinar de manera concluyente por el análisis de la secuencia N-terminal si este anticuerpo está o no presente en la mezcla analizada. Además, parece que la banda de 30 kDa contiene alguna LC kappa, ya que existen residuos E y D presentes en el ciclo uno y un residuo M presente en el ciclo 4. En resumen, el análisis de la secuencia N-terminal a granel puede ser utilizado para identificar la presencia de los anticuerpos individuales si éstos difieren en sus secuencias ya sea en la HC o en la LC y no están bloqueados en el extremo N. Este método es cuantitativo siempre y cuando los extremos N de los polipéptidos individuales no estén parcialmente bloqueados. EJEMPLO 6 El presente ejemplo ilustra la caracterización de un anticuerpo policlonal anti-RhD con ocho miembros individuales derivados de un cultivo de células policlonales . La diversidad del anticuerpo fue analizada mediante el aislamiento de péptidos marcadores únicos que se originan de la región variable utilizando ya sea RP-HPLC o cromatografía de intercambio iónico (IEX) para la separación péptidos. Generación de péptidos mediante digestión de las cadenas pesadas y cadenas ligeras aisladas Un anticuerpo policlonal anti-RhD con ocho miembros individuales fue purificado a partir del sobrenadante de un cultivo de células policlonales mediante cromatografía de afinidad utilizando las columnas HiTrap rProtein A. El material liofilizado fue disuelto en clorhidrato de guanidinio 6 M, EDTA 0.5 M, Tris HCl 0.2 M, pH 8.4, (DTT) reducido y carboximetilado (ácido yodoacético) . Las cadenas pesadas y las cadenas ligeras fueron separadas mediante filtración en gel sobre una columna Superóse 12 (10/300 de Amersham Biosciences, GE Healthcare) en clorhidrato de guanidinio 6 M, fosfato de sodio 50 mM, pH 8.4 sobre un sistema Ettan LC (Amersham Biosciences, GE Healthcare, Inglaterra). La HC (~ 3.5 mg/ml) y la LC (6.5 mg/ml) separadas, fueron digeridas con la endoproteinasa Asp-N (Roche, 1 054 589) a una concentración de enzima a sustrato de 1:500 en fosfato de sodio, pH 8. Aislamiento de péptidos únicos por RP-HPLC Alícuotas de digestiones de Asp-N individuales de HC y LC aisladas obtenidas de la muestra de anticuerpo policlonal fueron aplicadas a un sistema Agilent 1100 LC/MSD SL equipado con una columna Zorbax 300SB-C8 (2.1 x 150 mm) de 5 µm) conectada a una proteína de protección (Zorbax 300SB-C8, 2.1 x 12.5 mm, de 5 µm) equilibrado en TFA a 0.1% utilizando una velocidad de flujo de 0.2 ml/minuto. Los péptidos fueron eluidos utilizando un gradiente lineal de 0.08% de TFA, 70% de acetonitrilo. Los péptidos fueron detectados espectrofotométricamente a 220 nm y analizados mediante MS en línea (electrorrocío de ionización a presión atmosférica (API) ) . Una mezcla de 75% de ácido propiónico/25% de isopropanol fue agregada post-columna a fase móvil para incrementar la señal . Los espectros de masa obtenidos fueron analizados utilizando el software Chermestation (Agilent Technologies, CA) y el software BioLynx (Micromass, Waters Corporation, MA) . Los resultados del análisis de MS de las digestiones con Asp-N de HC y LC se resumen en la Tabla 11 y 12, respectivamente. Ambas Tablas indican las masas teóricas y detectada que son dadas como masas promedio .

Tabla 11: Resultados para la cadena pesada Péptidos diferentes con la misma masa. Péptidos (cuatro idénticos y uno diferente) casi con la misma masa. * Indica una Gln ciclizada N-terminal (PyroGlu) Tabla 12. Resultados para la cadena ligera Como se observa en la Tabla 11, trece péptidos provenientes de HC variable y dieciséis péptidos provenientes de la LC variable pueden ser identificados como péptidos marcadores únicos y algunos péptidos provenientes de la región variable de HC (por ejemplo, Di de RhDl96, RhD244 y RhD306 indicados por a) tienen la misma masa, y de este modo estas masas no pueden ser asignadas de manera no ambigua. No obstante, ya que otras masas pueden ser no ambiguamente asignadas a los péptidos únicos en todos los casos, ha sido obtenida la identificación positiva de los ocho anticuerpos. Para la LC, han sido asignados los péptidos únicos para siete de los ocho anticuerpos (Tabla 12) . El anticuerpo a partir del cual falta la información para la LC fue RhD324. De este modo, los datos de MS combinados a partir de HC y LC demuestran que los ochos anticuerpos pudieron ser identificados en la muestra de rpAb anti-RhD con base en la detección de los péptidos únicos provenientes de cada uno de los anticuerpos. Aislamiento de los péptidos únicos mediante cromatografía de intercambio catiónico Las digestiones con Asp-N de HC y LC fueron separados mediante cromatografía de intercambio catiónico fuerte como sigue: alícuotas de digestiones individuales de Asp-N de HC y LC, obtenidos de el anticuerpo policlonal, como se describe anteriormente fueron aplicados sobre una columna polisulfoetil A (2.1 x 100 mm) equilibrada en fosfato de potasio 10 mM, 20% (v/v) de acetonitrilo, pH 3.0 utilizando una velocidad de flujo de 0.2 ml/minuto a temperatura ambiente sobre un sistema Ettan LC (Amersham Biosciences, GE Healthcare, Inglaterra) . Los péptidos fueron subsecuentemente eluidos utilizando un gradiente lineal desde 0 hasta 500 mM de cloruro de potasio en fosfato de potasio 10 mM, 20% o 30% (v/v) de acetonitrilo, pH 3.0. Los péptidos eluidos fueron detectados espectrofotométricamente a 215 nm y las fracciones fueron recolectadas con base en el fraccionamiento por tiempo. Alícuotas (1 µl) de las fracciones, fueron filtradas con 1 µl de una solución de ácido -ciano-4-hidroxicinámico (20 mg/ml) en 70% de acetonitrilo/30% de TFA al 0.1%, y se aplicaron sobre el objetivo de MS, y se lavaron con 0.1% de TFA. Las muestras fueron analizadas mediante MALDI-TOF sobre un Autoflex TOF (Bruker Daltronics, Bremen, Alemania) , y la calibración de masa externa fue realizada utilizando mezclas de calibración de Bruker Daltronics (Bremen, Alemania) . Los espectros de MALDI fueron analizados (búsqueda de masa y calibración interna) utilizando el software GPMAW 6.1 (Lighthouse data, Odense, Dinamarca) . Un cromatograma representativo que contiene varios picos provenientes de la digestión con Asp-N de LC se muestra en la Figura 11. Los resultados del análisis MALDI-TOF de las fracciones de las digestiones de Asp-N de LC y HC se muestran en la Tabla 13 y 14, respectivamente. Las masas teórica y encontrada son dadas como masas monoisotópicas para las masas < 3500 Da y como masas promedio para masas > 3500 Da.

Tabla 3. Resultados provenientes de la cadena ligera a Los mismos péptidos . b Los mismos péptidos Los mismos péptidos Tabla 14: Resultados de la cadena pesada a Los mismos péptidos. b Verificado por identificación del mismo péptido con una Met oxidada. Como se observa en las Tablas 13 y 14, quince péptidos de la LC variable y nueve péptidos de la HC variable pueden ser identificados como péptidos marcadores únicos y algunos péptidos provenientes de la región variable de HC así como de la LC tienen la misma masa, y no pueden ser asignados de manera no ambigua. De este modo, no ha sido posible asignar péptidos únicos para HC RhD201, 203 y 324 y para la LC RhD201 y 319, utilizando cromatografía de intercambio catiónico fuerte.

Sumar i o Los resultados obtenidos de los dos diferentes análisis con péptidos marcadores son suficientes para apoyar que los datos combinados obtenidos de los análisis de MS de HC y LC hacen posible la identificación de los péptidos únicos a partir de la región variable a partir de los ochos anticuerpos que constituyen el rpAb anti-RhD utilizando RP-HPLC. Mediante el uso de cromatografía de intercambio catiónico fuerte, seis de los ocho miembros individuales de la composición de rpAb anti-RhD pudieron ser identificados. Los resultados provenientes de los análisis de MS no han sido hasta ahora analizados a detalle completo, sino únicamente al grado mostrados en las Tablas 11 a la 14. EJEMPLO 6A El presente ejemplo ilustra la caracterización de un anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD con 25 miembros individuales derivados de un cultivo de células policlonales (corrida de biorreactor) . La diversidad del anticuerpo fue analizada mediante aislamiento de los péptidos marcadores únicos que se originan de las regiones variables de LC o HC utilizando RP-HPLC combinada con espectrometría de masa para la identificación de los péptidos. Generación de péptidos mediante digestión de cadenas pesadas y cadenas ligeras aisladas Una muestra de anticuerpo policlonal anti-RhD con 25 miembros individuales fue purificada del sobrenadante de un cultivo de células policlonales provenientes de una corrida del biorreactor. La purificación fue realizada mediante cromatografía de afinidad utilizando una columna MabSelect (Amersham Biosciences, GE Healthcare) y desalada sobre una columna G25 (Amersham Biosciences, GE Healthcare) . El material liofilizado fue disuelto en clorhidrato de guanidinio 6M, Tris HCl 0.2 M, pH 8.4, (DTT) reducido y ácido yodoacético carboximetilado. Las cadenas pesadas y las cadenas ligeras fueron separadas mediante filtración en gel sobre una columna Superóse 12 (10/300 GL de Amersham Biosciences, GE Healthcare) en clorhidrato de guanidinio 6 M, fosfato de sodio 50 mM, pH 8.4. La HC y LC separadas fueron digeridas con la endoproteinasa Asp-N (Roche, 1 054 589) a una concentración de enzima a sustrato de 1:200 en urea 1 M, fosfato de sodio 50 mM, pH 8 toda la noche a 372C. Aislamiento de los péptidos únicos mediante LC-MS Alícuotas de digestiones separadas con Asp-N de la HC y LC aisladas obtenidas de la muestra de anticuerpo policlonal, fueron aplicadas a un sistema Agilent 1100 LC/MSD SL equipado con una columna Zorbax 300SB-C18 (2.1 x 150 mm) conectada a una columna de protección 5 µm (Zorbax 300SB-C8, 2.1 x 12.5 mm, 5 µm) equilibrada en 0.1% de TFA, 14% de ACN utilizando una velocidad de flujo de 0.2 ml/minutos. Los péptidos fueron eluidos utilizando un gradiente lineal al 0.08%, 70% de acetonitrilo. Los péptidos fueron detectados espectrofotométricamente a 220 nm y analizados mediante MS en línea (electrorrocío de ionización a presión atmosférica (API) . Una mezcla de 75% de ácido propiónico/25% de isopropanol fue agregada post-columna a la fase móvil para incrementar la afinidad. Los espectros de masa obtenidos fueron analizados utilizando un software Chemstation (Agilent Technologies, CA) y el software GPMAW 6.2 (Lighthouse, Odense, Dinamarca). Los resultados del análisis de MS de las digestiones con HC y LC se resumen en la Tabla 14A, donde las masas teóricas detectadas se dan como masas promedio.

Tabla 14A. Identificación de los péptidos hidrofóbicos únicos a partir de 25 anticuerpos en un rpAb anti-RhD que emplea la escisión con Asp-N y el análisis de LC-MS. aD y d denotan los péptidos de HC y LC generados por Asp- N, respectivamente, y los péptidos son numerados desde el extremo N hasta el extremo C de la secuencia predicha. Por lo tanto, d4 denota un péptido producido por la escisión en el 3ero y 4to. sitio Asp-N el polipéptido LC. bEste péptido contiene un sitio de escisión faltante. * Indica una Gln ciclizada N-terminal (pyroGlu) . Como se observa en la Tabla 14A, 22 péptidos provenientes de la parte variable de una LC, y 3 péptidos provenientes de la parte variable de una HC, pueden ser identificados como péptidos marcadores únicos. De este modo, los datos de MS provenientes de HC y LC demuestran de manera no ambigua que los 25 anticuerpos podrían ser identificados en la muestra rpAb anti-RhD con base en la detección de los péptidos únicos provenientes de cada uno de los anticuerpos. EJEMPLO 7 El presente ejemplo ilustra la generación de los péptidos anti-idiotipo con especificidad hacia los miembros individuales de un anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD, así como la evaluación de la concentración de un miembro individual en un anticuerpo policlonal recombinante. Generación de los ligandos peptídicos específicos del anticuerpo anti -RhD Una biblioteca de fago que visualiza siete aminoácidos en orden de secuencia aleatoria en el extremo N-terminal de pIII (New England Biolab) se utilizó para la selección por afinidad de los enlazadores peptídicos a anticuerpos individuales anti-RhD. Una versión lineal y una constreñida de la biblioteca peptídica se utilizaron para la selección. Placas de microtitulación (Maxisorb, NUNC) fueron recubiertas a 42C por 12-16 horas con el anticuerpo monoclonal purificado anti-RhD a 10 µg/ml utilizando 100 µl por pozo. Los 25 anticuerpos individuales contenidos en el anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD fueron utilizados para seleccionar los péptidos anti-idiotipo. No obstante, en situaciones donde el anticuerpo policlonal recombinante contiene un gran número de miembros individuales (por ejemplo, por arriba de 50) , pueden ser seleccionados los anticuerpos centinelas para la clasificación. Preferentemente, un número de anticuerpos centinelas correspondientes al menos a 4% del número total de anticuerpos que constituyen la proteína policlonal recombinante, son seleccionados, aún más preferentemente los anticuerpos centinelas constituyen al menos 8%, 12%, 16%, 20%, 30%, ó 50% del número total de anticuerpos que constituyen la proteína policlonal recombinante. Las placas recubiertas fueron subsecuentemente lavadas en PBS, 0.05% de Tween-20 y luego bloqueados con leche descremada al 2%/PBS. Los bacteriófagos a - 1011 pfu/100 µl fueron utilizados para cada ronda de visualización panorámica. Las bibliotecas constreñida y lineal fueron mezcladas y visualizadas panorámicamente conjuntamente como una mezcla en leche descremada al 2%/PBS. Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, los fagos enlazados fueron eluidos con glicina/HCl, pH = 2.2 por 10 minutos, seguidos por la neutralización con Tris HCl, pH = 9.0. Después de tres a cuatro rondas de visualización panorámica, los clones simples fueron aislados, el ADN extraído y secuenciado en la región correspondiente a la región peptídica aleatoria. La Tabla 15 siguiente muestra los alineamientos de las secuencias de aminoácidos deducidas, a partir de los clones simples . Tabla 15 Tres péptidos sintéticos con afinidad específica ya sea hacia anti-RhDl62, 202 ó 305, respectivamente, fueron sintetizados de acuerdo a la secuencia de aminoácido de consenso deducida, de los grupos de secuencias relacionas. Cada péptido sintetizado fue acoplado a biotina en el extremo C. La especificidad de cada péptido fue probada por ELISA. En resumen, las placas de ELISA fueron recubiertas con estreptavidina a 4aC por 12-16 horas con estreptavidina a 5 µg/ml utilizando 100 µl por pozo. Luego, se agregó el péptido diluido a ~ 10 µg/ml en PBS, seguido por la incubación a 1 hora y eliminación del péptido en exceso mediante lavado. Las placas fueron subsecuentemente bloqueadas en leche descremada al 2%/PBS y lavadas tres veces en PBS. Cada uno de los anticuerpos individuales anti-RhD fue agregado separadamente a cada diluciones comenzando a 10 µg/ml. El anticuerpo enlazado fue detectado utilizando un conjugado de igG anti-humano (Catálogo Caltag # H10307) . Las placas fueron lavadas cinco veces y la detección fue llevada a cabo mediante la adición de 25 µl de cromógeno (TMB, Kem-En-Tech) . Las reacciones fueron terminadas 15-25 minutos después por la adición de 25 µl de ácido sulfúrico 1M. Los valores de absorbancia fueron medidos a 450 nm. La prueba de cada péptido contra el panel de anticuerpos monoclonales anti-RhD mostró que la reactividad es específica para la proteína del miembro individual apropiado . Por lo tanto, PEP162 únicamente se enlazó al anticuerpo anti-RhDl62, PEP202 únicamente se enlazó a anti-RhD202 y PRP305 únicamente se enlazó a anti-RhD305 con una proporción de señal a ruido por arriba de 10. Determinación de la cantidad del anticuerpo anti -RhD305 en un anticuerpo policlonal recombinante anti -RhD Utilizando diluciones apropiadas del anticuerpo monoclonal anti-RhD305 purificado, como un estándar de referencia fue posible determinar la cantidad del anticuerpo anti-RhD305 con relación a la cantidad total de los anticuerpos en una mezcla de anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD. En resumen, las placas de ELISA fueron recubiertas son estreptavidina e incubadas con PEP305 diluido a ~ 10 µg/ml en PBS por 1 hora. Después de la incubación, el péptido en exceso fue retirado mediante lavado. Las placas fueron subsecuentemente bloqueadas en leche descremada al 2%/PBS y lavadas tres veces. Un anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD compuesto de 25 anticuerpos anti-RhD individuales (la muestra) fue agregado a diluciones en el intervalo de 1 a 16384 veces. La muestra fue analizada por cuadruplicado. En pozos separados sobre la misma placa, diluciones en serie (por triplicado) del anticuerpo monoclonal anti-RhD305 comenzado a 10 µg/ml, fueron agregadas como muestra de referencia con el fin de generar una curva estándar. El anticuerpo enlazado fue detectado utilizando un conjugado de IgG anti-humana (Catálogo Caltag # H10307) . Las placas fueron lavadas cinco veces y la detección fue llevada a cabo mediante la adición de 25 µl de cromógeno (TMB, Kem-En-Tech) . Las reacciones fueron terminadas 15-25 minutos más tarde por la adición de 25 µl de ácido sulfúrico 1 M. Los valores de absorbancia fueron medidos a 450 nm. La curva estándar fue linealmente proporcionada a la concentración dentro del siguiente intervalo: Estos datos dieron como resultado una curva estándar con la ecuación y = 0.116 x -0.0256 y R2 = 0.9812. La ecuación determinada para la curva estándar, así como el factor de dilución de la muestra se utilizó para calcular la concentración del anticuerpo anti-RhD305 en la muestra de anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD. A una dilución de 32 veces, el promedio OD450 medido para la muestra fue de 1.24 ± 0.14, correspondiente a una concentración de anticuerpo anti-RhD305 de 3.8 ± 0.5 µg/ml en el anticuerpo policlonal anti-RhD. La concentración del anticuerpo total en la muestra de anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD, fue de 100 µg/ml. De este modo, el anticuerpo anti-RhD305 representa 3.8% de la muestra de anticuerpo policlonal. EJEMPLO 8 El presente ejemplo ilustra el uso de los péptidos anti-idiotipo para identificar los anticuerpos centinela en las fracciones/pico específicos después de la separación en una dimensión mediante el análisis cromatográfico de intercambio iónico líquido de un anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD. Un anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD compuesto de 25 anticuerpos individuales anti-RhD fue separado mediante cromatografía de intercambio catiónico y las fracciones fueron recolectadas. Cada fracción fue examinada por ELISA utilizando los tres péptidos anti-idiotipo (como se describe en el Ejemplo 7) con el fin de detectar la presencia de un anticuerpo particular anti-RhD en cada fracción. Una superposición del cromatograma con los datos de ELISA realizados sobre cada fracción, mostró que este método puede ser utilizado para identificar anticuerpos individuales en una fracción particular (Figura 12) . De este modo, al comparar la absorbancia en un pico particular con los datos de ELISA, es posible realizar una evaluación semi-cuantitativa de la composición de mezclas complejas de proteínas homologas. EJEMPLO 9 El aseguramiento de la estabilidad composicional es un programa clave cuando se fabrican proteínas policlonales para el uso médico. Los péptidos-ligandos específicos capaces de identificar miembros de proteínas individuales dentro de una mezcla compleja de proteínas homologas, pueden ser utilizados para monitorizar la estabilidad composicional de una proteína policlonal durante la fabricación, mediante al extraer las muestras del medio durante la fermentación a diferentes puntos de tiempo de generación y aplicando el método de detección cuantitativa tales como los métodos de ELISA descritos en el Ejemplo 7. En el presente ejemplo, la cantidad efectiva de las tres proteínas centinelas, los anticuerpos anti-RhDl62, 202 y 305 fueron estimadas en un proceso de fermentación por perfusión de un pWCB que produce un anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD compuesto de 25 anticuerpos anti-RhD únicos. La Figura 3 ilustra la distribución de los tres anticuerpos centinelas (anti-RhDl62 , 202 y 305) a diferentes tiempos de cultivo durante la fermentación, con G8 correspondiente al día 8 después de la inoculación del biorreactor. EJEMPLO 10 El presente ejemplo ilustra un método para la identificación de las células que producen un anticuerpo anti-RhD particular en una mezcla de cultivo celular. En el ejemplo, una mezcla que consiste de dos diferentes líneas celulares productoras de anticuerpo fue analizada utilizando un péptido anti-idiotipo y citometría de flujo para la detección. Dos líneas celulares productoras de anticuerpo anti-RhD individuales, RhDl62 y RhD202, fueron mezcladas a proporciones definidas. Los porcentajes del clon RhD202 son indicados en la Tabla 16. El péptido biotinilado 202 (PEP202 preparado en el Ejemplo 7) fue incubado con estreptavidina conjugada a la ficoeritrina (SA-PE) para formar los tetrámeros peptídicos. Los tetrámeros fueron incubados con las mezclas de la línea celular por 20 minutos a temperatura ambiente y las células fueron corridas a través de un citómetro de flujo FACS CAlibur (Becton Dickinson) . Las células positivas para los tetrámeros fueron introducidas como se describe por Rl en la Figura 14. Las líneas celulares no mezcladas individuales fueron también medidas (Figura 14 A y B) . Una característica observada para las líneas celulares productoras del anticuerpo anti-RhD, es la presencia de las células que expresan el anticuerpo y las que no expresan el anticuerpo, dentro de la línea celular. Para averiguar la porción de células positivas a PEP202 en una mezcla, necesita ser determinado el número total de las células expresadoras . En este ejemplo, se asume que la porción de las células que expresan en la mezcla de RhDl62 y RhD202, fue la misma que el RhD202 sola. Esto pudo haber sido averiguado por la doble tinción de la célula con Pep202 y el anticuerpo anti-IgG (no realizado) . No obstante, los resultados indicaron la veracidad de la asunción. El porcentaje de células RhD202 enlazadas por el tetrámero PEP202 en las mezclas fue calculada a partir del porcentaje en las células en la entrada 6 (R6), como se muestra en la Figura 14. El porcentaje de la línea celular RhD202 en la mezcla a) fue calculada de acuerdo a la siguiente ecuación, ejemplificada con las mediciones para la mezcla a. % de la mezcla (x) de entrada R6 14.12 % de células RhD202— —— x 100 = 45% % de 1 entrada R6 RhD202 31.42 Tabla 16 EJEMPLO 11 El presente ejemplo ilustra el uso de la PCR en tiempo real para evaluar la distribución de los clones individuales o una selección centinela de tales clones dentro de un cultivo de células policlonales. La técnica está basada en las diferencias de secuencia entre las secuencias de ácido nucleico que codifican para anticuerpos individuales . Debido a la variedad de las secuencias que codifican para anticuerpos individuales, una sonda TaqMan única puede ser diseñada para la cadena pesada y/o la cadena ligera para cada miembro representado en la línea celular policlonal. Preferentemente, una de las regiones de CDR, CDRl, CDR2 ó CDR3 , se selecciona para diseñar la sonda TaqMan. Más preferentemente, la región CDR3 es seleccionada para diseñar la zona TaqMan.

Diseño del oligonucleótido Los cebadores son preferentemente diseñados tal que los amplicones de 70-150 nucleótidos son obtenidos. Algunos diseños de cebadores posibles son: un cebador delantero de consenso que se recoce en la región FR3 de la región variable de cadena ligera o de cadena pesada, y el cebador inverso se recoce en la región constante. Una sonda TaqMan específica para una parte de la región CDR que difiere entre los miembros inhibidores de la muestra, preferentemente, la región CDR3 está diseñada para cada clon de interés . Un grupo potencial de cebadores y sondas para el análisis de la línea celular policlonal que expresan los siguientes ocho anticuerpos anti-RhD, puede ser diseñada como se indica en seguida. Cebador delantero e inverso para todos los clones . Cebador delantero: CAC GGC TGA GTA TTA CTG TGC (SEQ ID No 24) Cebador inverso: TTG GTG GAG CCA CTC GA (SEQ ID NO 25) Las sondas TaqMan para todos los clones individuales se muestran en la Tabla 17.

Un diseño de cebador alternativo para las secuencias que codifican para la cadena pesada, constituye un cebador delantero que se recoce en la unión VH-DH y un cebador inverso en la región constante, y la sonda TaqMan en la unión JH-C como se describe en Rasmussen, T. et al., 2000. Exp. Hematol . 28, 1039-1045.

PCR cuanti tativa en tiempo real El mRNA o el ADN genómico es extraído de las células concentradas. Si el mRNA es utilizado como plantilla, éste es transcrito inversamente para generar el cDNA antes de la PCR en tiempo real. Es establecido un número de reacciones de PCR en tiempo real correspondientes al número de clones que van a ser analizados . Los ensayos en tiempo real son optimizados con respecto a las concentraciones del cebador y a las concentraciones de la zona TaqMan. Las reacciones son realizadas por triplicado en placas de 96 pozos y selladas con cubiertas adhesivas ópticas. Las reacciones de PCR son realizadas en mezcla maestra de PCR y realizadas en ABI prism 7000 (Applied Biosystems) con análisis subsiguiente utilizando software ABI prism 7000 SDS. Análisis de la diversidad Los valores de Ct de los diferentes clones son comparados uno con el otro, y la distribución de cada clon en la línea celular policlonal, es calculada. El método puede ser aplicado para evaluar la variación de lote a lote así como la estabilidad clonal sobre el tiempo durante una corrida de producción particular. EJEMPLO 12 El presente ejemplo ilustra un método para evaluar y demostrar la naturaleza policlonal de la línea de células policlonales (por ejemplo, un pWCB) capaz de producir un anticuerpo policlonal recombinante por medio del secuenciamiento del ADN de la región variable de los genes de anticuerpo de cadena pesada y/o ligera a partir de clones de células simples derivados de la línea de células policlonales. Clonación de células simples Una ampolleta del pWCB es descongelada y cultivada por unos pocos días en medio completo para reconstituir una buena viabilidad celular. Subsecuentemente, son obtenidos los clones de células simples mediante la dilución limitante donde las células son sembradas en placas de cultivo de células de 96 pozos a una densidad de 1 célula/pozo, en medio de cultivo completo. Las células son incubadas a 37 aC, 5% de C02 por 10-20 días, y las placas son luego calificadas visualmente para los pozos con colonias simples bajo un microscopio. Alternativamente, los clones de células simples provenientes de pWCB son obtenidos utilizando el clasificador de células FACS . Las células de pWCB viables son introducidas y clasificadas en placas de 96 pozos pre-llenadas con 100 µl de medio completo condicionado a 1 célula/pozo. Las células son incubadas y calificadas para las colonias simples, como se describe anteriormente. Secuenciamiento del ácido nucleico Cuando las colonias de células simples en los pozos se han desarrollado hasta la confluencia, las alícuotas (10-20 µl) de cada uno de un número deseado de pozos (por ejemplo, 100) son transferidas a nuevas placas de 96 pozos para ser utilizadas como plantilla en las reacciones de secuenciamiento del DNA. El secuenciamiento es ya sea realizado al nivel del mRNA o a nivel genómico utilizando entre 1 y 100 ó 1 y 1000 células, respectivamente. En el primer caso, un fragmento de PCR que cubre suficiente de la región variable para distinguir los diferentes genes de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, presentes en pWCB (típicamente al menos la región CDR3) es generada por tecnología de RT-PCR estándar, por ejemplo, utilizando el equipo de RT-PCR de un solo paso Qiagen, comercialmente disponible, siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células son lisadas antes de la reacción del PCR. El fragmento de PCR resultante es purificado en gel utilizando por ejemplo el equipo de Extracción en Gel Qiagen Qiaquick, y utilizado como plantilla en una reacción de secuenciamiento de ADN estándar, seguido por el análisis sobre una máquina de secuenciamiento de ADN automatizada tal como el analizador genético ABI Prim" 3100 (Applied Biosystems) . Alternativamente, el secuenciamiento del ADN es realizado sobre el ADN genómico como se describe anteriormente, excepto que el paso de transcripción inversa es saltado. Para la caracterización del anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD se utilizan los siguientes cebadores: Cebadores de PCR para la amplificación de VH: RhD#001: 5 'TCTCTTCCGCATCGCTGTCT (SEQ ID No . : 34) RhD#007: 5 'AGGAAAGGACAGTGGGAGTGGCAC (SEQ ID No.: 35) Cebadores de PCR para la amplificación de VL: RhD#005: 5 ' CGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTG (SEQ ID No . : 36) RhD#008: 5 'AAGACCGATGGGCCCTTGGTGGA (SEQ ID No . : 37) Los cebadores de secuenciamiento son: VH: 5 'AACGGGTTTGCCGCCAGAACA (SEQ ID No.: 38) VL: 5 ' CCGAGGGACCTGAGCGAGT (SEQ ID No . : 39) ELISA sobre células simples utilizando péptidos anti-idiotipo Como un suplemento al secuenciamiento de ácido nucleico, la composición clonal de una mezcla de células productoras de anticuerpo tal como el banco de células de trabajo policlonales, puede ser evaluada utilizando ELISA de péptido anti-idiotipo. Células simples clasificadas son cultivadas por aproximadamente 15 días, con los cual se generan cultivos de células isogénicas a partir de los clones simples . El sobrenadante de estos cultivos puede ser analizado para la presencia de los anticuerpos anti-RhD específicos utilizando péptidos anti-idiotipo en un ensayo de ELISA como se describe en el Ejemplo 7. Esto proporcionará información con respecto al número de clones que producen un miembro individual particular. Si la cantidad de un miembro individual es comparada a la cantidad total de las células productoras de anticuerpo (por ejemplo, al medir la IgG sobre todos los cultivos de células isogénicas) , una medida cuantitativa para la fracción de células que producen anticuerpos anti-RhD individuales en el cultivo de células policlonales, puede ser obtenida. EJEMPLO 13 El presente ejemplo demuestra el uso del análisis cromatográfico de intercambio catiónico para estimar la diversidad clonal durante el proceso corriente abajo (DSP) de un anticuerpo policlonal recombinante.

Procesamiento corriente abajo (3 ' ) Una muestra de rpAB anti-RhD que contiene 25 miembros individuales, a partir de una corrida del biorreactor en desarrollo se purificó utilizando los siguientes pasos de DSP: 1. captura de los anticuerpos utilizando una columna MAbSelect 2. inactivación del virus a pH 3 3. intercambio de amortiguador utilizando una columna sephadex G-25 4. cromatografía de intercambio aniónico utilizando una columna de DEAE-sepharose 5. filtración del virus utilizando un filtro Planova 15N, y 6. cromatografía de inducción de carga hidrofóbica utilizando una columna hypercel MEP 7. ultrafiltración/diafiltración utilizando un filtro biomax millipore Análisie de diversidad clonal después de los pasos individuales de DSP La cromatografía de intercambio catiónico fue utilizada para analizar la diversidad clonal durante DSP de una composición de anticuerpo policlonal recombinante. Las muestras tomadas después del paso 1, 3, 4 y 6 durante el DSP de un rpAb anti-RhD fueron aplicadas sobre una columna PolyCatA (4.6 x 100 mm) en acetato de sodio 25 mM, cloruro de sodio 15 mM, pH 5.0 a una velocidad de flujo de 60 ml/hora, operado a temperatura ambiente. Los componentes del anticuerpo fueron subsecuentemente eluidos utilizando un gradiente lineal de 150-500 mM de cloruro de sodio en acetato de sodio 25 mM, pH 5.0 a una velocidad de flujo de 60 ml/hora. Los componentes de anticuerpo fueron detectados espectrofotométricamente a 280 nm y los cromatogramas fueron comparados (Figura 15) para detectar la pérdida potencial de diversidad clonal durante DSP. En el presente ejemplo se demostró utilizando cromatografía de intercambio catiónico que la diversidad clonal permanece esencialmente sin cambio durante DSP de un anticuerpo policlonal recombinante. EJEMPLO 14 El análisis IEX de más de 40 anticuerpos contra RhD ha revelado que un número sustancial de los anticuerpos individuales muestran un "patrón de tres picos" como se muestra en la Figura 16B. El tratamiento con carboxipeptidasa B, así como el análisis de carbohidratos han indicado que esta heterogeneidad de carga no es provocada por el atrapamiento de lisina C-terminal o la presencia de ácido siálico (datos no mostrados) . El presente ejemplo muestra que la heterogeneidad de carga es debida a formación de PyroGlu, y cómo puede ser utilizada la mutagénesis dirigida al sitio para obtener los patrones de IEX homogéneos . Expresión y purificación de anticuerpos Líneas celulares estables (obtenidas como se describe en la solicitud de patente Danesa PA 2004 01133 presentada el 20 de Julio del 2004) cada una expresa un anticuerpo monoclonal anti-Rhesus D recombinante, distinto proveniente de un ciclo específico sobre su genoma, fueron adaptados para el cultivo en suspensión en el medio Excell 302 libre de suero (JRH Biosciences, Andover, Reino Unido) suplementado con L-glutamina 4 mM (Invitrogen) y agente anti-aglomeración (Invitrogen) diluido 1:250, expandido y agrupado a -150aC utilizando procedimientos de congelamiento convencionales. Los sobrenadantes fueron cosechados de los cultivos celulares antes del agrupamiento y el sobrenadante fue filtrado antes de la filtración de los anticuerpos monoclonales anti-RhD, utilizando cromatografía de afinidad (Proteína A) esencial como se describe en el Ejemplo 1.

Cromatografía de intercambio catiónico fuerte Los anticuerpos monoclonales purificados en el paso previo fueron sometidos a cromatografía IEX fuerte esencialmente como se describe en el Ejemplo 1. La columna IEX en la Tabla 18 resume el número de picos presentes en los perfiles de IEX de los anticuerpos seleccionados, tales perfiles IEX son también presentados en la Figura 16. Análisis de la secuencia N-terminal El análisis de la secuencia N-terminal de los picos separados provenientes del análisis IEX de dos anticuerpos seleccionados (RhDl98 y RhD307) se realizó en solución, mediante secuenciamiento de Edman utilizando un secuenciador Procise 494 (Applied Biosystems, CA) operado como es descrito por el fabricante. El análisis de la secuencia demostró que la heterogeneidad de carga fue debida a la ciclización parcial del Gln N-terminal del HC (ver Tabla 18) . De este modo, el primer pico contenía anticuerpos con el extremo N totalmente bloqueado del HC (los extremos N de la HC que tienen carga 0) ; el segundo pico correspondió a los anticuerpos donde uno de los extremos N de la HC estaban bloqueados (los extremos N de la HC tienen carga +1) , y el tercer pico lo más probablemente representó los anticuerpos donde la Gln N-terminal de la HC estaban no modificada (los extremos N del HC tienen carga +2) . La ciclización del residuo de glutamina N-terminal a PyroGlu la hace refractaria al secuenciamiento de Edman.

Un número de otros anticuerpos anti-RhD que muestran de igual modo tal "patrón de 3 picos" o un "patrón de 1 pico" fueron analizados mediante el análisis de la secuencia N-terminal al someter el anticuerpo SDS-page que fue electro-transferido sobre membranas de PVDF. La banda de HC y LC sobre éstas transferencias fueron sometidas a secuenciamiento de Edman. Unos pocos anticuerpos que albergan una Gln N-terminal en la HC (RhDl62, RhD240) se mostró que son totalmente bloqueados de acuerdo con sus perfiles de IEX ("un patrón pico"), mientras que los anticuerpos (RhDl96, RhD305 y RhD306) con el "patrón de 3 picos" se encontró que son parcialmente bloqueados como se esperaba (ver Tabla 18) . Las interpretaciones están basadas en los rendimientos de secuencia así como el porcentaje relativo de las diferentes variantes de carga (0, +1 y +2) en el perfil IEX.

Tabla 1 a Secuencias N-terminales esperadas y obtenidas son indicadas en estilo de fuente regular y negritas, respectivamente . Los datos obtenidos del manchado o transferencia. c Datos obtenidos de las fracciones aisladas (pico 1 y 2) del análisis IEX (analizados en solución) . d Ciclización del residuo de glutamina N- terminal a PyroGlu lo hace refractario al secuenciamiento de Edman, n-d; no determinado. Mutagénesis dirigido al si tio La mutagénesis dirigida al sitio fue utilizada para eliminar la heterogeneidad de carga de un anticuerpo seleccionado al cambiar la Gln N-terminal a una Glu. El plásmido de expresión de RhDl89 que codifica para un anticuerpo de longitud completa con una Gln N-terminal en la cadena pesada y un residuo de Glu N-terminal en la cadena LC, fue utilizado. La región VH en este plásmido es flanqueado por un sitio AscI en el extremo 3' de la región que codifica para el péptido de señal, y un sitio Xhol silencioso en la región J. La mutagénesis fue realizada con los siguientes cebadores : RhDl89 delantero: TGGGCGCGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG (SEQ ID NO 44) RhDl89 inverso: GGAGGCGCTCGAGACGGTGACCGTGGTCCC (SEQ ID NO 45) El sitio AscI en el cebador delantero y el sitio Xhol en el cebador inverso están subrayados, mientras que el codón de Glu (GAG) en el extremo N de la región VH es mostrado en negritas. El plásmido RhDl89 fue utilizado como plantilla en las reacciones de PCR con los cebadores anteriormente mencionados, las regiones de PCR fueron realizadas con la DNA-polimerasa Phusion (Finnzymes, Finlandia) por 25 ciclos de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La banda de VH de aproximadamente 400 pares de bases fue purificada sobre un gel de agarosa al 1%, incubada con la DNA-polimerasa BioTaq, repurificada sobre un gel de agarosa y clonada dentro del vector pCR2.lTOPO (Invitrogen, CA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los clones que contienen el inserto de VH fueron verificados mediante secuenciamiento. El fragmento de VH original fue extirpado del plásmido RhDl89 con AscI y Xhol y el fragmento mutado a partir de plásmido pCR2.1TOPO fue insertado. El plásmido libre de endotoxina midiprep (Macherey-Nagel, Alemania) fue preparado a partir de una colonia positiva a partir de la clonación y secuenciado para verificar la presencia del fragmento correcto. El anticuerpo fue sometido a análisis de SDS-PAGE, electrotransferido seguido por el secuenciamiento N-terminal de la banda HC para verificar el reemplazo de Gln a Glu (datos no mostrados) . El intercambio del gel Gln N-terminal a Glu de la HC del anticuerpo RhDl89, que muestra un perfil IEX de "3 picos" dio como resultado un perfil significativamente diferente únicamente con 1 pico (Figura 17) . De este modo, la heterogeneidad de carga había sido eliminada sucesivamente al cambiar el residuo de Gln N-terminal a un residuo de Glu.

Ensayo de enlace Para evaluar si la mutación N-terminal afectó la funcionalidad del anticuerpo, el anticuerpo nativo, RhDl89, así como la contraparte Glu mutada, RhDl89E, fue evaluada para el enlace a los eritrocitos positivos a RhD. Los eritrocitos fueron preparados a partir de sangre completa obtenida de donadores saludables después del consentimiento informado en el banco de sangre, Hospital Aalborg, Dinamarca, mediante lavado de la sangre tres veces en PBS (Gibco, Invitrogen, Reino Unido) que contenía 1% de albúmina sérica bovina (BSA, Sigma-Aldrich, Alemania) . Los eritrocitos fueron resuspendidos y almacenados a 4°C como una solución al 10% en ID-Cellstab (DiaMed, Suiza) . La capacidad de enlace a los anticuerpos fue medida utilizando los eritrocitos positivos a RhD al 5 x 104 células/µl en PBS, 1% de BSA. Las diluciones de los anticuerpos fueron realizadas en PBS, 1% de BSA por triplicado en placas de 96 pozos (Becton Dickinson Labware, NJ, Estados Unidos) . Cincuenta µl de la solución de anticuerpo se mezclaron con 50 µl de eritrocitos y se incubaron a 37°C por 40 minutos. Las células fueron lavadas dos veces (300 g, 2 minutos) en PBS, 1% de BSA. Ochenta µl de IgF de cabra anti-humano, conjugado a ficoeritrina (Beckman Coulter, CA, Estados Unidos) diluida a 1:20 en PBS, se agregó 1% de BSA a cada muestra y se dejó a 4°C por 30 minutos. Las muestras fueron lavadas en PBS, 1% de BSA y en FacsFlow (Becton Dickinson, Bélgica) (300 g, 2 minutos), y se resuspendieron en 200 µl de FACSFlow. Las muestras fueron corridas sobre un FACSCalibur (Becton Dickinson, CA, Estados Unidos) y el análisis de datos se realizó utilizando CellQuest Pro y Excel . Como se muestra en la Figura 18, no se observó diferencia significativa en la capacidad de enlace a los eritrocitos positivos a RhD entre la variante de Glu y su contraparte nativa. Sumario La heterogeneidad observada en los perfiles de IEX de muchos anticuerpos anti-RhD fue debida a la ciclización parcial de los residuos de Gln N-terminales en estos anticuerpos. El intercambio de Gln N-terminal por los residuos de Glu de la HC en los anticuerpos anti-RhD, elimina la heterogeneidad de carga N-terminal, inherente, presumiblemente sin afectar la potencia de enlace a los eritrocitos positivos a RhD. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un procedimiento para caracterizar una muestra que se espera comprenda diferentes proteínas homologas conocidas que tienen diferentes regiones variables o una muestra que comprende las células que producen tales proteínas, tal que la información es obtenida con respecto a la proporción relativa o presencia de los miembros individuales de proteínas homologas de dicha muestra o sus secuencias de codificación, el procedimiento está caracterizado porque comprende el análisis de alícuotas de la muestra mediante una o más técnicas de caracterización de proteínas y/o mediante uno ó más análisis genéticos de las secuencias que codifican para las proteínas. 2. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los análisis genéticos son seleccionados de RFLP, T-RFLP, análisis de microarreglo, PCR cuantitativa y secuenciamiento de ácido nucleico.
3. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la muestra es una fracción de cultivo celular que comprende las células del cultivo .
4. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las técnicas de caracterización de proteínas son seleccionadas de i) análisis cromatográficos que separan las proteínas de acuerdo a propiedades fisicoquímicas, ii) el análisis de digestiones proteolíticas de las proteínas homologas, iii) el secuenciamiento N-terminal a granel y iv) el análisis utilizando moléculas detectoras específicas para las proteínas homologas .
5. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque los análisis cromatográficos están basados en otra propiedad fisicoquímica diferente al tamaño.
6. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el análisis cromatográfico individual está basado en las propiedades fisicoquímicas seleccionadas de i) carga neta, ii) hidrofobicidad, iii) puntos isoeléctricos y iv) afinidad.
7. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque los análisis cromatográficos son realizados como una cromatografía multidimensional .
8. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el análisis de las digestiones proteolíticas de las proteínas homologas se realiza con el fin de aislar los péptidos marcadores N-terminales o los péptidos con funcionalidad característica de la cadena lateral de aminoácidos .
9. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque las moléculas detectoras específicas son péptidos anti-idiotipo o anticuerpos anti-idiotipo .
10. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el péptido anti-idiotipo o el anticuerpo anti-idiotipo es utilizado en la determinación de las células individuales productoras de proteínas, en una línea de células policlonales.
11. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 4 a 9, caracterizado porque la muestra es derivada de un sobrenadante de cultivo celular.
12. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la caracterización está basada en el análisis de una o más proteínas centinelas o secuencias de ácidos nucleicos centinelas, presentes en dicha muestra.
13. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque al menos dos técnicas analíticas son aplicadas para analizar las muestras .
14. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque una técnica analítica es una técnica de caracterización de proteínas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, y otra técnica analítica es un análisis genético de conformidad con la reivindicación 2.
15. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las muestras son obtenidas a partir de un cultivo de células policlonales simples a diferentes puntos de tiempo durante el cultivo, y las proporciones relativas de las proteínas homologas individuales y/o las secuencias de codificación, son comparadas .
16. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque las muestras son obtenidas de diferentes cultivos de células policlonales en un punto de tiempo particular, y las proporciones relativas de las proteínas homologas individuales y/o las secuencias de codificación, son comparadas.
17. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las proteínas homologas diferentes que tienen diferentes regiones variables, son proteínas recombinantes.
18. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque las proteínas recombinantes constituyen una proteína policlonal recombinante.
19. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las diferentes proteínas homologas que tienen diferentes regiones variables son anticuerpos con diferentes regiones CDR.
20. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque las proteínas homologas diferentes que tienen diferentes regiones variables, son receptores de células T con diferentes regiones CDR.
21. El uso de un péptido anti-idiotipo o anticuerpo anti-idiotipo, para el aislamiento y/o determinación de las células individuales productoras de proteína, en una línea de células policlonales.
22. El uso de la cromatografía multidimensional en la separación de moléculas de anticuerpo individuales, con respecto a su diversidad a partir de un anticuerpo policlonal, o una mezcla de anticuerpos policlonales.
23. El uso de la cromatografía multidimensional en la separación de moléculas individuales de receptores de células T con respecto a su diversidad a partir de un receptor de células T policlonal o una mezcla de receptores de células T monoclonales .
24. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-21, caracterizado porque aplica un análisis cromatográfico basado en la carga neta, en donde las proteínas que muestran heterogeneidad de carga provocada por la ciclización de los residuos de glutamina N-terminales, son sometidas a un método para la eliminación de la heterogeneidad de carga N-terminal provocada por la ciclización de residuos de glutamina N-terminales en las proteínas recombinantes, que comprende el cambio del residuo glutamina N-terminal por otro aminoácido .
25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el cambio es realizado mediante mutagénesis dirigida al sitio de la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína.
26. El método de conformidad con la reivindicación 24 ó 25, caracterizado porque el cambio es realizado sobre uno o más miembros individuales de una proteína policlonal.
27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, caracterizado porque la proteína es un anticuerpo o un receptor de célula T.