ES2381531T3 - Un procedimiento de caracterización estructural de una proteína policlonal recombinante o una línea celular policlonal - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para caracterizar una muestra que comprende un anticuerpo policlonal recombinante que comprende anticuerpos individuales que tienen diferentes regiones variables, en el que dicha muestra se deriva de un sobrenadante de cultivo celular de un cultivo celular policlonal que produce dicho anticuerpo policlonal recombinante, en el que el cultivo celular policlonal comprende clones individuales que expresan cada uno un miembro individual diferente del anticuerpo policlonal recombinante, tal información se obtiene en lo que respecta a la proporción relativa o presencia de miembros de anticupero individual de dicha muestra, comprendiendo el procedimiento analizar alícuotas de dicha muestra mediante al menos una técnica de caracterización de proteína seleccionada de análisis cromatográfico que separa proteína de acuerdo con una propiedad físico-química distinta del tamaño.

Description

Un procedimiento de caracterización estructural de una proteína policlonal recombinante o una línea celular policlonal

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la caracterización de un anticuerpo policlonal recombinante.

Antecedentes de la invención

Está admitido desde hace mucho tiempo que la administración profiláctica o terapéutica de anticuerpos (denominada como inmunización pasiva) puede potenciar la capacidad del sistema inmune del cuerpo para eliminar agentes infecciosos. Dichos anticuerpos terapéuticos se han obtenido históricamente del plasma humano (por lo cual, la composición de anticuerpos se denomina inmunoglobulina o gammaglobulina). Para obtener estos anticuerpos, se recogen combinaciones de sangre procedentes de donantes humanos inmunes y se extrae y se purifica la fracciónde inmunoglobulina. Únicamente una fracción de la inmunoglobulina será específica de un antígeno concreto. El uso terapéutico de la inmunoglobulina es complicado debido a diversas limitaciones tales como un número limitado de donantes, fabricación cara, riesgo de contaminantes infecciosos procedentes de los donantes, variaciones lote a lote inevitables así como regímenes de administración complicados.

Los anticuerpos monoclonales recombinantes han proporcionado recientemente una alternativa a los productos de inmunoglobulina. Se dirigen, sin embargo, únicamente, contra una diana única y pueden por tanto no ser eficaces contra dianas que son complejas o dinámicas, tales como los agentes infecciosos. Existen algunos ejemplos de anticuerpos monoclonales mixtos con el fin de superar este problema (por ejemplo, Nowakowski, A. y col. 2002. Proc Natl Acad Sci EE.UU. 99, 11346-11350 y documento US 5.126.130).

Recientemente, se ha desarrollado una tecnología para la producción recombinante de anticuerpos policlonales muy específicos adecuados para la administración profiláctica y terapéutica (documento WO 2004/061104). Se puede purificar el anticuerpo policlonal recombinante (rpAb) procedente de un biorreactor de producción en forma de una preparación única sin manipulación, fabricación, purificación, o caracterización separadas de los miembros individuales que constituyen la proteína policlonal recombinante. Sin embargo, dicha estrategia de producción requiere un procedimiento para verificar la identidad y demostrar la producción consistente en el tiempo de la mezcla compleja de moléculas de anticuerpo.

Además, un anticuerpo policlonal producido industrialmente usando la tecnología recombinante tendrá que caracterizarse hasta un cierto grado para obtener la aprobación de los organismos reguladores nacionales y supranacionales como fármaco de investigación o terapéutico. Debido a que el planteamiento de un anticuerpo policlonal recombinante es un concepto completamente nuevo, el problema de caracterizar una muestra que comprende múltiples proteínas diferentes pero muy homólogas con respecto a la proporción relativa de proteínas individuales en la muestra no se había abordado nunca anteriormente. De esta manera, la inmunoglobulina derivada de sangre se aprobó en general basándose en los datos de eficacia clínica y no clínica y a menudo en los datos de seguridad histórica, así como en la química bruta, la fabricación y los parámetros de control (CMC) tales como pureza, título de la unión, y ausencia de agentes adicionales. Dicha solución simplista es por supuesto no aceptable para las proteínas producidas de manera recombinante. Por tanto, para las mezclas de unos pocos anticuerpos monoclonales, las directrices reguladoras establecen que dichas mezclas deberían someterse a la caracterización individual de cada anticuerpo constituyente de la mezcla usando las técnicas de caracterización química integral de las proteínas acopladas con ensayos biológicos. Sin embargo, no existe solución técnicamente factible o apropiada para una composición genuinamente policlonal, basada en más de 10, 20 o incluso más anticuerpos diferentes.

El documento WO 2004/009618 describe la producción de mezclas de anticuerpos de un clon celular simple, donde el clon simple comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena ligera común y al menos dos cadenas pesadas diferentes, con lo que resulta la producción de una mezcla de anticuerpos de las células huésped.

Los documentos US 5.789.209 y US 6.335.163 desvelan procedimientos para la creación de bibliotecas de anticuerpos policlonales, por ejemplo, bibliotecas específicas del paciente o específicas del antígeno para tratamiento o diagnóstico de trastornos neoplásticos, donde las bibliotecas o sub-bibliotecas se pueden transferir desde un vector de expresión a otro sin pérdida significativa de diversidad de biblioteca.

Chen y col. (Immunology Letters (2003) vol. 88: nº 2, páginas 135-140) describen la transferencia de masa de pares de genes de región VL-VH de una biblioteca que muestra un fago Fab de cáncer anti-colorectal para un vector de expresión de mamífero y la producción de una biblioteca prototipo de anticuerpos IgG policlonal de células Sp2/0 transfectadas con la biblioteca de vector de expresión de mamífero.

Toto y col (J. of Interferon and Cytokine Res. (2001) vol. 21, nº 11, páginas 813-920) describen un procedimiento de purificación usado para obtener un producto de interferona-a humana (IFN-a) que contiene la subtipos de IFN-a principales producidos por leucocitos humanos, y caracterización del producto por wetern blotting y RP-HPLC.

El documento 2004/061104 describe un procedimiento para la fabricación de una composición de proteína policlonal recombinante, usando integración dirigida al sitio basada en recombinasa de las secuencias que codifican proteína en el genoma de células huésped para dar una colección de células adecuadas para uso como una línea celular de fabricación de proteína policlonal recombinante.

Mhatre y col (J. Chromatography (1995) vol 707, nº 2, páginas 225-231) describen la purificación de fragmentos de anticuerpo Fab mediante cromatografía de intercambio catiónico y elución en gradiente de pH.

Divulgación de la contribución

La presente invención proporciona una plataforma de caracterización estructural para demostrar la producción consistente de una mezcla de diferentes proteínas homólogas, tal como una proteína policlonal recombinante, en particular un anticuerpo policlonal recombinante, procedente de una línea celular policlonal.

Descripción de la invención

Un prerrequisito para la producción industrial de una proteína policlonal recombinante para uso profiláctico y terapéutico es el mantenimiento de la diversidad clonal durante la expresión. Por tanto, es importante ser capaz de seguir y medir la diversidad clonal de una línea celular policlonal que produce un anticuerpo policlonal, así como la representación relativa de las proteínas individuales en la proteína policlonal en cualquier momento deseado, y en cualquier muestra relevante, permitiendo de esta manera el análisis de la estabilidad del sistema de expresión en un lote único, así como la variación lote a lote del producto final.

Las composiciones de proteínas homólogas tales como un anticuerpo policlonal recombinante o un receptor de linfocito T policlonal recombinante (TcR) están comprendidas por proteínas variables con propiedades físicoquímicas muy similares. Esto es una ventaja cuando se purifica una proteína policlonal producida de manera recombinante, debido a que la purificación se puede llevar a cabo como si se tratara de una proteína única, sin pérdida de diversidad durante el procedimiento. Esta similitud, sin embargo, representa un desafío cuando se caracteriza la distribución relativa de los miembros individuales de una proteína policlonal, debido a que la similitud en las propiedades físico-químicas hace difícil distinguir un miembro individual de otro.

Más comúnmente, cuando se produce una proteína policlonal recombinante, se conoce la composición original, debido a que las secuencias que codifican la proteína policlonal se han aislado, rastreado y secuenciado antes de la generación de una línea celular de fabricación policlonal para la producción de proteína policlonal recombinante. Para la generación de dicha línea celular, véase por favor el documento WO 2004/061104. Una rara excepción a lo anterior puede ser situaciones en las que una biblioteca no rastreada o no seleccionada, por ejemplo, de un paciente convaleciente, se usa directamente para generar un anticuerpo policlonal recombinante.

Para asegurar que la diversidad de la salida (la proteína policlonal recombinante) se asemeje a la diversidad de la entrada (la biblioteca de secuencias de codificación) tras el cultivo y la purificación, será necesario obtener información con respecto a la proporción relativa de miembros individuales de la proteína policlonal y/o sus secuencias de codificación dentro de la línea celular de fabricación policlonal. La presente invención proporciona una plataforma de caracterización estructural, basada en el análisis genético así como técnicas de caracterización de proteínas, capaces de proporcionar información con respecto a la diversidad de una línea celular policlonal y una proteína policlonal.

Definiciones

El término “anticuerpo anti-idiotipo” se refiere a un anticuerpo de longitud completa o fragmento del mismo (por ejemplo, un Fv, scFv, Fab, Fab’ o F(ab)2) que se une específicamente a la parte variable de un miembro individual de una proteína policlonal. Preferiblemente, un anticuerpo anti-idiotipo de la presente invención se une específicamente a la parte variable de un miembro individual de un anticuerpo policlonal o una TcR policlonal. La especificidad del anticuerpo anti-idiotipo se dirige preferiblemente contra la parte específica del antígeno de un miembro individual de un anticuerpo policlonal o un receptor de linfocito T policlonal, la así denominada región V. Este puede, sin embargo, mostrar también especificidad hacia una subpoblación definida de miembros individuales, por ejemplo, una familia de genes específicos de VH representada en la mezcla.

El término “péptido anti-idiotipo” se refiere a un péptido-ligando específico, que es capaz de asociarse específicamente e identificar de esta manera un miembro de la proteína individual dentro de una mezcla de proteínas homólogas. Preferiblemente, un péptido anti-idiotipo de la presente invención se une específicamente a un miembro individual de un anticuerpo policlonal o una TcR policlonal. Los péptidos anti-idiotipo de la presente invención están dirigidos preferiblemente contra la parte específica del antígeno de la secuencia de un anticuerpo individual o un receptor de linfocito T individual. Un péptido anti-idiotipo puede, sin embargo, mostrar también especificidad hacia una subpoblación definida de miembros individuales.

El término “secuenciación N terminal ”en masa”” se refiere a la secuenciación de la proteína N terminal de una muestra que comprende numerosas moléculas de proteínas homólogas variables, por ejemplo, una proteína policlonal. Esta secuenciación en masa proporciona al mismo tiempo información acerca de la secuencia de todas

las diferentes proteínas presentes dentro de la muestra. En las posiciones en las que los aminoácidos varían entre los miembros individuales en la muestra, éstas se pueden cuantificar, y las diferentes cantidades de aminoácidos individuales en posiciones variables proporcionarán información con respecto a la subpoblación de proteínas que contiene una variación concreta. Si las proteínas que se van a secuenciar N terminalmente contienen más de una subunidad, éstas se separan preferiblemente antes de la secuenciación para reducir la complejidad, por ejemplo, si la muestra son cadenas pesadas de un anticuerpo policlonal, se pueden separar de las cadenas ligeras antes de la secuenciación.

El término “diversidad clonal” o “policlonalidad” se refiere a la variabilidad o diversidad de una proteína policlonal, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican ésta, o la línea celular policlonal que produce ésta. La variabilidad se caracteriza por las diferencias en las secuencias de aminoácidos o las secuencias de ácidos nucleicos entre los miembros individuales de la proteína policlonal o la biblioteca de secuencias de codificación. Para las líneas celulares policlonales se puede evaluar la diversidad clonal por la variabilidad de las secuencias de ácidos nucleicos representada dentro de la línea celular, por ejemplo, como integraciones de sitio único en el genoma de las células individuales. Esto puede, sin embargo, evaluarse también como la variabilidad de las secuencias de aminoácidos representada en la superficie de las células dentro de la línea celular. El término “epitopo” se refiere a la parte de una molécula antigénica a la cual se unirá un receptor de linfocito T o un anticuerpo. Un antígeno o molécula antigénica presentará algunos o muchos epitopos simultáneamente.

El término “inmunoglobulina” se usa comúnmente como una designación colectiva de la mezcla de anticuerpos que se encuentran en la sangre o el suero. Por tanto un anticuerpo policlonal derivado de suero se denomina a menudo inmunoglobulina o gammaglobulina. Sin embargo, se puede usar también la inmunoglobulina para diseñar una mezcla de anticuerpos derivada de otras fuentes, por ejemplo, inmunoglobulina recombinante.

El término “clon individual”, tal como se usa en el presente documento, denota una población isogénica de células que expresan una proteína concreta, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal. Dichos clones individuales pueden por ejemplo obtenerse mediante la transfección de una célula huésped con un ácido nucleico deseado, y tras la selección de los transfectantes positivos, se puede expandir un clon único o se pueden combinar y expandir numerosos clones únicos. Se puede generar una línea celular policlonal mezclando clones individuales que expresan diferentes miembros individuales de una proteína policlonal.

Los términos “un miembro individual” o “un miembro distinto” denotan una molécula de proteína de una composición de proteínas que comprende diferentes moléculas de proteínas, pero homólogas, tales como una proteína policlonal, en la que la molécula de proteína individual es homóloga con las otras moléculas de la composición, pero contiene también uno o más tramos de la secuencia del polipéptido, que se caracteriza por diferencias en la secuencia de aminoácidos entre los miembros individuales de la proteína policlonal, denominada también una región variable. Por ejemplo, en un anticuerpo policlonal constituido por Ab1 a Ab50, todas las proteínas con la secuencia de Ab1 se considerarán como un miembro individual del anticuerpo policlonal y Ab1 puede por ejemplo diferir de las proteínas Ab2 en la región CDR3. Una subpoblación de miembros individuales puede por ejemplo estar constituida por los anticuerpos que pertenecen a Ab1, Ab12 y Ab33.

El término “anticuerpo policlonal” describe una composición de diferentes moléculas de anticuerpo que es capaz de unirse a o reaccionar con diversos determinantes antigénicos específicos diferentes en el mismo o en diferentes antígenos. La variabilidad de un anticuerpo policlonal se localiza en las regiones variables así denominadas de los anticuerpos individuales que constituyen el anticuerpo policlonal, en concreto, en las regiones determinantes de la complementariedad, las regiones (CDR)1, CDR2 y CDR3.

Los términos “línea celular de fabricación policlonal”, “línea celular policlonal”, “banco maestro de células policlonales (pMCB)” y “banco de trabajo de células policlonales (pWBC)” se usan de manera intercambiable y se refieren a una población de células que expresan proteínas que se transfectan con una biblioteca de secuencias variables de ácidos nucleicos de interés. Preferiblemente, las células individuales, que constituyen conjuntamente la línea celular de fabricación policlonal recombinante, transportan sólo una copia de una secuencia distinta de ácido nucleico de interés que codifica un miembro de la proteína policlonal recombinante de interés, y cada copia se integra en el mismo sitio del genoma de cada célula. Las células que pueden constituir dicha línea celular de fabricación pueden ser por ejemplo bacterias, hongos, células eucariotas, tales como levaduras, células de insectos o células de mamíferos, especialmente líneas celulares inmortales de mamíferos tales como células CHO, células COS, células BHK, células de mieloma (por ejemplo, células Sp2/0, NS0), NIH 3T3, YB2/0 y células humanas inmortalizadas, tales como células HeLa, células HEK 293, o PER.C6.

Tal como se usa en el presente documento, el término “proteína policlonal” se refiere a una composición de proteínas que comprende moléculas de proteínas diferentes pero homólogas, seleccionadas preferiblemente entre la superfamilia de la inmunoglobulina. Más preferidas incluso son las moléculas de proteínas homólogas que son anticuerpos o receptores de linfocitos T (TcR). De esta manera, cada molécula de proteína es homóloga con las otras moléculas de la composición, pero contiene también uno o más tramos de la secuencia de polipéptido variable que se caracteriza(n) por diferencias en la secuencia de aminoácidos entre los miembros individuales denominados también miembros variables distintos de la proteína policlonal. Los ejemplos conocidos de dichas proteínas policlonales incluyen los anticuerpos, los receptores de los linfocitos T y los receptores de los linfocitos B. Una

proteína policlonal puede estar constituida por un subconjunto definido de moléculas de proteínas, que se ha definido por una característica común tal como la actividad de unión compartida hacia una diana deseada, por ejemplo, en el caso de un anticuerpo policlonal contra el antígeno diana deseado. Una proteína policlonal recombinante está compuesta generalmente de dicho subconjunto definido de moléculas, en el que la secuencia de cada miembro es conocida. Sólo en casos raros puede una proteína policlonal recombinante parecerse a una inmunoglobulina derivada de suero en el sentido que la proteína policlonal recombinante contiene también un proporción significativa de proteínas no específicas de la diana.

El término “receptor de linfocito T policlonal (TcR)” describe una composición de diferentes moléculas TcR que es capaz de unirse a o reaccionar con diversos determinantes antigénicos específicos diferentes del mismo o de diferentes antígenos. La variabilidad de un TcR policlonal se localiza en las regiones variables así denominadas de las moléculas de TCR individuales que constituyen el TcR policlonal, en concreto, en las regiones CDR1, CDR2, CDR3 y CDR4. La moléculas de TcR de la presente invención son dímeros solubles diseñados mediante ingeniería genética de las cadenas alfa-beta o las cadenas gamma-delta. Dichos TcR diseñados mediante ingeniería genética se describen por ejemplo en (Willcox, B.E. y col. 1999. Protein Sci 8, 2418-2423).

El término “proteína” se refiere a cualquier cadena de aminoácidos, sin tener en cuenta la longitud o la modificación post-traduccional. Las proteínas pueden existir en forma de monómeros o multímeros, comprendiendo dos o más cadenas de polipéptidos ensamblados, fragmentos de proteínas, polipéptidos, oligopéptidos, o péptidos.

El término “proteína centinela” describe un miembro individual de una proteína policlonal cuya presencia se puede vigilar durante la producción de la proteína policlonal o en diferentes lotes. La consistencia en la presencia de una proteína centinela en una serie de muestras relacionadas reflejará la estabilidad en la expresión de una proteína policlonal entre lotes o durante el tiempo en una producción única. Además, reflejará el mantenimiento de la diversidad durante el procesamiento tal como la purificación de una proteína policlonal producida de manera recombinante.

El término “péptidos marcadores únicos” describe numerosos péptidos que se originan a partir de la región variable de los miembros individuales de una proteína policlonal. Los péptidos se originan preferiblemente mediante tratamiento con proteasa u otros medios de fragmentación de proteínas, y los péptidos que se pueden asignar sin ambigüedad a un miembro individual único de la proteína policlonal se denominan péptidos marcadores únicos.

Descripción de los dibujos

Fig. 1: Cromatogramas de intercambio catiónico de la composición de anticuerpo policlonal recombinante anti-RhD (anti-RhD rpAb) procedente de las alícuotas 3948 y 3949 tras 9 semanas de cultivo. El diagrama inferior corresponde a la alícuota 3949 y el superior a la alícuota 3948. El eje Y del diagrama superior se ha desplazado con el fin de separar éste del diagrama inferior. Los picos A – J comprenden los anticuerpos que difieren en la carga neta y los anticuerpos individuales que aparecen con carga heterogénea.

Fig. 2: Imagen de gel que muestra el análisis RFLP de Hinfl en el producto de la RT-PCR derivado de las alícuotas 3948+ y 3949+ de la línea celular policlonal (FCW065) que producen anti-RhD rpAb tras 11 semanas de cultivo. Las bandas que se pueden asignar a los clones específicos están identificadas.

Fig. 3: modelos T-RFLP de las cadenas ligeras del anticuerpo anti-Rhesus D procedentes de un cultivo celular policlonal que expresa anti-RhD rpAb con ocho anticuerpos diferentes anti-Rhesus D. Los ocho clones diferentes de anti-Rhesus D se han asignado a los picos indicados por las flechas.

Fig. 4: Modelos T-RFLP de las regiones variables de la cadena pesada del anticuerpo anti-Rhesus D procedentes de un cultivo celular policlonal que expresa anti-RhD rpAb con veinticinco anticuerpos diferentes anti-Rhesus D en un momento dado. Los veinticinco clones diferentes de anti-Rhesus D se han asignado a los picos indicados por las flechas.

Fig. 5: Distribución de ADNc estimada mediante T-RFLP de ocho secuencias diferentes que codifican la cadena pesada de anti-Rhesus D procedentes de un cultivo celular policlonal que se cultivó durante cinco semanas.

Fig. 6: Muestra el contenido relativo (%) de un anti-RhD rpAb con ocho anticuerpos diferentes analizados usando cromatografía de intercambio catiónico. Se asignaron los picos cromatográficos integrados a los tiempos de retención de los anticuerpos individuales y los modelos de picos obtenidos de los anticuerpos únicos analizados individualmente usando cromatografía de intercambio catiónico en condiciones idénticas.

Fig. 7: Cromatograma de intercambio catiónico de un anti-RhD rpAb con veinticinco miembros individuales procedentes de una muestra obtenida tras 4 semanas de cultivo. Los picos AC1 a 25 comprenden los anticuerpos que difieren en la carga neta y los anticuerpos individuales que aparecen con carga heterogénea.

Fig. 8: Perfil de elución procedente de una cromatografía de intercambio catiónico de un anticuerpo anti-RhD policlonal recombinante con diez miembros individuales. Las letras indican los picos sometidos a RP-HPLC, en la segunda dimensión.

Fig. 9: Muestra un perfil de elución de RP-HPLC de la fracción B5 de la Fig. 8.

Fig. 10: Muestra un análisis composicional de LC en 2D de un anticuerpo anti-RhD policlonal recombinante con diez miembros individuales, visualizado mediante un mapa de proteínas codificado en color (representado en la escala de grises).

Fig. 11: Muestra un perfil de elución procedente de una cromatografía de intercambio catiónico fuerte de una Asp-N digerida de LC purificada de un anticuerpo anti-RhD policlonal recombinante con ocho miembros individuales. La línea horizontal en negrita indica las fracciones sometidas al análisis MALDI-TOF para la identificación de los péptidos marcadores.

Fig. 12: Muestra una superposición de la DO280 del cromatograma IEX obtenido en un anti-RhD rpAb con veinticinco miembros individuales, con datos de ELISA obtenidos de tres análisis ELISA individuales usando los péptidos antiidiotipo PEP162, PEP202 y PEP305. Los análisis ELISA se llevaron a cabo sobre cada fracción obtenida mediante la cromatografía de intercambio iónico. Los datos de ELISA se normalizaron hasta un 0 % de la DO total con el fin de hacer los tres ensayos ELISA con PEP162, PEP202 y PEP305, respectivamente, comparables entre sí.

Fig. 13: muestra la distribución de los tres anticuerpos centinela anti-RhD162, 202 y 305, en diferentes momentos de cultivo durante la fermentación. G8 corresponde al día 8 tras la inoculación del biorreactor.

Fig. 14: Datos FACS de tres líneas celulares teñidas con tetrámeros PEP202. (A) Muestra los PEP202 negativos de la línea celular RhD162. (B) muestra la línea celular RhD202, y (C) muestra una mezcla al 50 % de las líneas celulares RhD162 y RhD202 (que corresponden a la mezcla en el experimento). El primer panel en A, B y C muestra las representaciones gráficas punteadas de FSC-SSC, en las que R1 es el selector de las células vivas y sanas en tamaño (FSC) y granularidad (SSC). El histograma en el panel del medio representa gráficamente la intensidad de la fluorescencia de las células. El selector R6 rodea las células teñidas con tetrámeros. El panel final muestra los porcentajes de células en R6 usados en los cálculos.

Fig. 15: Perfiles de la cromatografía de intercambio catiónico que muestran las muestras tomadas en diferentes etapas durante el procesamiento en la dirección corriente abajo de una muestra de anti-RhD rpAb que contiene 25 miembros individuales representados por el material recogido tras la elución de captura (A), Sephadex G-25 (B), DEAE-Sepharose (C), y MEP Hypercel (D).

Fig. 16: Perfiles IEX de los tres anticuerpos anti-RhD monoclonales representativos que muestran tres modelos diferentes de carga. (A) homogéneo, (B) modelo de “3 picos”, (C) modelo complejo.

Fig. 17: Análisis IEX de RhD189 y la variante RhD189E de Glu mutada.

Fig. 18: Actividad de unión de la variante RhD189E de Glu, y su contraparte RhD189 natural. Se midió la unión de los anticuerpos a los eritrocitos RhD-positivos mediante FACS y la intensidad de fluorescencia promedio (MFI) se muestra como una función de la concentración de anticuerpos.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento de caracterización de un anticuerpo policlonal recombinante como se define en las reivindicaciones adjuntas. Se puede usar el procedimiento de caracterización para evaluar diferentes aspectos durante un procedimiento de producción o purificación o durante el almacenamiento a largo plazo de una composición que comprende un anticuerpo policlonal recombinante. Preferiblemente, se usa el procedimiento de caracterización de la presente invención para uno de los siguientes objetivos i) determinar la representación relativa de los miembros individuales o alguno de los miembros individuales en relación entre sí dentro de una muestra única, ii) evaluar la proporción relativa de uno o más miembros individuales en diferentes muestras para la determinación de la consistencia lote a lote, y iii) evaluar la proporción real de uno o más miembros individuales. El procedimiento de caracterización es particularmente útil en la vigilancia de la representación de anticuerpos individuales en un anticuerpo policlonal recombinante. Se puede controlar tanto la estabilidad de composición durante la producción individual como la consistencia lote a lote.

Una realización de la presente invención es un procedimiento para caracterizar una muestra que comprende un anticuerpo policlonal recombinante que comprende anticuerpos individuales que tienen diferentes regiones variables, en la que dicha muestra se deriva de un sobrenadante de cultivo celular de un cultivo celular policlonal que produce dicho anticuerpo policlonal recombinante, en el que el cultivo celular policlonal comprende clones individuales que expresan cada uno un miembro individual diferente del anticuerpo policlonal recombinante, tal que se obtiene esa información respecto a la proporción relativa o presencia de miembros de anticuerpo individual de dicha muestra, comprendiendo el procedimiento el análisis de alícuotas de dicha muestra en al menos una técnica de caracterización de proteína seleccionada de análisis cromatográfico que separa proteínas de acuerdo con una propiedad físico-química distinta del tamaño. La plataforma de caracterización estructural puede, además de una o más técnicas de caracterización de proteína, comprender también uno o más análisis genéticos. Esto puede ser suficiente para obtener información acerca de una muestra procedente únicamente de las técnicas de caracterización de proteína. Es, sin embargo, preferible, obtener información de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10

técnicas de caracterización combinando por tanto las formas de realización individuales que se muestran a continuación para generar la plataforma de caracterización, La combinación de diversas técnicas analíticas permite la generación de un conjunto de datos más descriptivo relacionados con la composición relativa o absoluta de la mezcla policlonal. La información obtenida de estas técnicas puede ser de naturaleza cuantitativa así como cualitativa, que cuando se compila conjuntamente proporciona una caracterización global de las muestras analizadas.

En una realización preferida, la presente invención incluye una técnica de caracterización de proteínas además de un análisis genético.

El análisis genético se refiere a técnicas tales como el análisis del polimorfismo de longitud del fragmento de restricción (RFLP), el RFLP terminal (T-RFLP), análisis en micromatriz, PCR cuantitativa tal como la PCR en tiempo real, y la secuenciación de ácidos nucleicos.

Las técnicas de caracterización de proteínas se refieren a las técnicas generalmente usadas dentro del campo de la proteómica para caracterizar proteínas desconocidas tales como i) análisis cromatográficos que separan las proteínas de acuerdo con las propiedades fisicoquímicas, ii) análisis de digestiones proteolíticas de las proteínas homólogas, iii) secuenciación N-terminal “en masa”, y iv) análisis usando moléculas detectoras específicas de las proteínas homólogas.

Un concepto adicional de la presente invención, que es aplicable en combinación con las técnicas analíticas descritas anteriormente, para la caracterización de un combinado complejo de proteínas homólogas, se ha desarrollado en conexión con la presente invención. El concepto se basa en la selección de numerosas proteínas centinela presentes en el combinado de proteínas homólogas (por ejemplo, un anticuerpo policlonal o un TcR policlonal) o en la superficie del combinado de células que producen las proteínas homólogas (por ejemplo una línea celular de fabricación policlonal). Las proteínas centinela se caracterizan cuantitativa y cualitativamente para verificar que esta subpoblación de proteínas está presente de una manera consistente, tanto en el sobrenadante de un cultivo celular policlonal como en la superficie celular durante la producción. Se pueden analizar por ejemplo las proteínas centinela usando moléculas detectoras que son específicas de los miembros individuales de las proteínas homólogas, por ejemplo, tales como moléculas anti-idiotipo. Se puede aplicar además el concepto de proteína centinela para evaluar la consistencia entre lotes de cultivo celular diferentes. Se puede extender el concepto de proteínas centinela a péptidos únicos derivados de una proteína policlonal mediante tratamiento con proteasa, dichos péptidos centinela contienen preferiblemente una parte de la CDR si la proteína policlonal es un anticuerpo policlonal o TcR. Los análisis llevados a cabo al nivel genético se pueden aplicar también al principio centinela, basado en las secuencias únicas de ácidos nucleicos de los miembros individuales de la biblioteca que codifica la proteína policlonal. En concreto, se pueden seleccionar las secuencias de ácidos nucleicos que corresponden a las regiones CDR de los anticuerpos o los TcR como secuencias de ácidos nucleicos centinela, la más preferida es la región CDR3. Las proteínas, péptidos o secuencias de ácidos nucleicos centinela pueden variar para las técnicas analíticas individuales, dependiendo de que miembros de la proteína policlonal, o de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican éstos, se pueden distinguir con la técnica analítica seleccionada.

Análisis genético de la diversidad clonal de una línea celular de fabricación policlonal

La policlonalidad en un sistema de expresión para producir una proteína policlonal se vigila evaluando la cantidad de células que codifican un miembro concreto de la proteína policlonal y/o los niveles del ARNm que codifican los miembros individuales de la proteína policlonal. Esto se puede vigilar al nivel del ARNm o genómico usando por ejemplo el análisis RFLP o T-RFLP, el análisis en micromatriz de oligonucleótidos, la PCR cuantitativa tal como la PCR en tiempo real, y la secuenciación de ácidos nucleicos de las regiones variables de las secuencias génicas obtenidas de la línea celular de fabricación. Alternativamente, se pueden usar las mismas técnicas cualitativamente para demostrar la diversidad de la línea celular policlonal. Se pueden vigilar las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la proteína policlonal en las muestras obtenidas de un cultivo celular policlonal único en diferentes momentos durante el cultivo vigilando por tanto las proporciones relativas de las secuencias de codificación individuales a lo largo del transcurso de la producción para evaluar su estabilidad composicional. Alternativamente, se pueden vigilar las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la proteína policlonal en las muestras obtenidas de diferentes cultivos celulares policlonales en un momento concreto vigilando por tanto las proporciones relativas de las secuencias de codificación individuales en diferentes lotes para evaluar la variación lote a lote. Preferiblemente, la muestra usada en los análisis genéticos es una fracción de cultivo celular enriquecida para las células del cultivo, por ejemplo, mediante precipitación. La muestra se obtiene generalmente cosechando una fracción del cultivo celular en un momento deseado, seguido por la eliminación del medio, por ejemplo mediante centrifugación. Las muestras para la comparación lote a lote se obtienen preferiblemente de células en el límite de la edad celular in vitro para la producción.

RFLP/T-RFLP

Se llevó a cabo el análisis RFLP y el T-RFLP al nivel genómico o al nivel del ARNm. Cuando se genera una línea celular de fabricación policlonal de tal manera que cada célula contiene únicamente una copia de la secuencia de interés, el análisis al nivel genómico proporcionará información con respecto a la proporción relativa de células

dentro de la línea celular de fabricación que produce un miembro individual de la proteína policlonal. Por otra parte, el análisis al nivel del ARNm proporcionará información con respecto a los niveles potenciales de expresión de los miembros individuales de la proteína policlonal. El análisis al nivel del ARNm se llevó a cabo generalmente mediante transcripción inversa del ARNm en el ADNc antes del análisis de restricción. Es, sin embargo, también posible, llevar a cabo el análisis directamente sobre el ARNm.

En el análisis RFLP terminal el(los) cebadores directo y/o inverso usado(s) para la PCR o la RT-PCR se marcan dando como resultado una marca terminal de los fragmentos de la PCR. Tras la digestión con los enzimas de restricción apropiados, se generan fragmentos de diferentes tamaños y se pueden separar mediante electroforesis, preferiblemente electroforesis capilar, y los fragmentos se pueden detectar mediante el amplicón de la marca (Liu y col. 1997, Applied and Environmental Microbiology 63, 4516-4522). Las marcas adecuadas pueden proporcionar señales detectables mediante fluorescencia, radioactividad, colorimetría, difracción o absorción de rayos X, magnetismo o actividad enzimática e incluir, por ejemplo, fluoróforos, cromóforos, isótopos radioactivos (particularmente 32P, 33P, 35S y 125I, reactivos densos a electrones, enzimas, y ligandos que tienen compañeros de unión específicos. Preferiblemente, se usa un fluoróforo como marca.

En una línea celular de fabricación policlonal con una gran diversidad, puede no ser posible obtener un único fragmento de restricción para cada secuencia de codificación individual. Si surge dicha situación, se pueden seleccionar las secuencias de ácidos nucleicos centinela para vigilar la diversidad clonal de la línea celular de fabricación policlonal. Alternativamente, los fragmentos que no se pueden separar de acuerdo con el tamaño se pueden secuenciar con el fin de evaluar la distribución de todas las secuencias de codificación individuales.

Análisis en micromatriz de oligonucleótidos

Se pueden usar micromatrices de oligonucleótidos, tales como chips de ADN, para medir los niveles de ADN genómico o los niveles de ARNm en una línea celular policlonal midiendo la hibridación del ADN marcado generado procedente de la línea celular, a una sonda unida a una superficie sólida (Guo, Z. y col 1994. Nucleic Acids Res. 22, 5456-5465).

Las sondas pueden ser tanto secuencias de ADNc de doble cadena representativas de las cadenas esperadas que están presentes en la línea celular policlonal (tanto derivadas de la línea celular policlonal por sí misma como de la biblioteca de ADN usada para transfectar las células huésped que comprenden la línea celular policlonal) como oligonucleótidos de sentido directo (20-90 nt de longitud). Las sondas se unen a una superficie sólida, tal como vidrio, plástico o una matriz de gel, y si se usa una sonda de doble cadena, se desnaturaliza ésta antes de llevar a cabo el ensayo. Cuando se analiza una línea celular policlonal que expresa proteínas homólogas, por ejemplo, un anticuerpo policlonal o un TcR policlonal, se prefiere usar con cuidado las sondas de oligonucleótidos diseñadas para evitar la hibridación cruzada indeseada entre la sonda y el ADN marcado derivado de la línea celular policlonal. Dichas sondas se diseñan en función de la alineación de las secuencias que codifican la región variable que se usaron para fabricar la línea celular de fabricación policlonal con el fin de diseñar sondas específicas para cada miembro individual del producto policlonal. Para los anticuerpos, las secuencias de codificación diferirán principalmente en las regiones CDR con el grado más elevado de variabilidad en la región CDR3. Se usan preferiblemente regiones con la mayor variabilidad para el diseño de sondas de oligonucleótidos de sentido directo. Las sondas son preferiblemente complementarias en la secuencia con los miembros individuales comprendidos en la línea celular policlonal, y tienen un grado tan alto de desemejanza con los otros miembros como sea posible. Se pueden usar una o más sondas específicas para cada región variable. Para los objetivos de estandarización se pueden usar sondas que hibridan con las secuencias en la región constante. Las sondas son tanto manchadas directamente en la superficie usada para la hibridación como sintetizadas in situ en la superficie (Pease y col. 1994. PNAS 91: 5022-5026, Singh-Gasson y col. 1999. Nature Biotech. 17: 974-978).

El ADN marcado que se va a analizar se genera cosechando la población celular policlonal y preparando el ADN genómico, el ARN total o el ARNm de las células. Cuando se usa ADN genómico, la marca se obtiene usando tanto cebadores marcados adecuadamente como nucleótidos marcados en una amplificación de la PCR de las secuencias de codificación relevantes. Cuando se usa ARN total o ARNm es posible obtener ADNc marcado mediante transcripción inversa tanto en solitario como en combinación con una etapa de la PCR que use cebadores

o nucleótidos marcados. Las marcas adecuadas pueden proporcionar señales detectables mediante fluorescencia, radioactividad, colorimetría, difracción o absorción por rayos X, magnetismo o actividad enzimática e incluir, por ejemplo, fluoróforos, cromóforos, isótopos radioactivos (particularmente 32P, 33P, 35S y 125I), reactivos densos a electrones, enzimas, y ligandos que tienen compañeros de unión específicos. Preferiblemente, se usa un fluoróforo como marca. Cuando las secuencias de codificación que se van a analizar son cadenas ligera y pesada de anticuerpos se prepara el ADNC de primera cadena mediante transcripción inversa cebando con cebadores de sentido contrario situados en la región 3’ constante de la región variable. Si no se lleva a cabo la PCR adicional, se lleva a cabo preferiblemente la síntesis con nucleótidos marcados. Si la transcripción inversa se sigue por la PCR, se aplican una serie de cebadores de sentido directo que aseguran que todas las familias de las regiones variables se amplifican. Alternativamente, se pueden usar cebadores de sentido directo que hibridan las regiones que son idénticas en todos los ARNm (por ejemplo, la región 5’ no traducida de la secuencia que codifica el péptido señal). Se pueden usar en esta solución cebadores de sentido directo, y/o sentido contrario que pueden estar marcados fluorescentemente o nucleótidos marcados.

Cuando se han preparado las sondas y el ADN marcado, se lleva a cabo el ensayo en micromatriz hibridando el ADN marcado desnaturalizado con los oligonucleótidos inmovilizados en condiciones optimizadas para una señal de ruido bajo y muy específica. Tras el lavado, se miden cada una de las sondas hibridadas y la cantidad calculada de mensaje específico.

PCR cuantitativa

Se han adaptado anteriormente los procedimientos de la PCR para proporcionar la detección y la cuantificación de las secuencias de ácidos nucleicos en una muestra, véanse por ejemplo Higuchi, R. y col. 1993. Kinetic Biotechnology 11, 1026-1030; Holland, P.M. y col. 1991. PNAS 88, 7276-7280; Livak, K.J. y col. 1995 PCR Methods Appl. 4, 357-362. Estos procedimientos emplean cebadores directos e inversos como en la PCR estándar más una o más secuencias de ácidos nucleicos adicionales que hibridan con la secuencia de ácido nucleico que deberá amplificarse. Esta secuencia de ácido nucleico adicional, denominada una “sonda”, hibrida con una porción del ácido nucleico que se va a amplificar entre las porciones que hibridan con los dos cebadores, y está marcada de tal manera que cada ciclo sucesivo de la PCR produce un cambio en la sonda o su marca. Este cambio en la sonda o su marca produce la activación o la acentuación de la marca hasta un grado que está relacionado con el número de copias adicionales del ácido nucleico amplificado durante cada ciclo de la PCR. Dichos procedimientos se denominan generalmente como PCR “en tiempo real”, y proporciona una detección ciclo a ciclo del aumento del producto de la PCR combinando la ciclación térmica con la detección de la marca. En una versión particular de la PCR en tiempo real, el cambio en la sonda o su marca se produce mediante la actividad de la exonucleasa de la polimerasa, por ejemplo, la polimerasa Taq, por tanto, ésta técnica se denomina generalmente como PCR en tiempo real TaqMan o Taq (por ejemplo, Holland, P.M. y col. 1991. PNAS 88, 7276-7280).

Las marcas adecuadas pueden proporcionar señales detectables mediante fluorescencia, radioactividad, colorimetría, difracción o absorción por rayos X, magnetismo o actividad enzimática e incluir, por ejemplo, fluoróforos, cromóforos, isótopos radioactivos (particularmente 32P, 33P, 35S y 125I), reactivos densos a electrones, enzimas, y ligandos que tienen compañeros de unión específicos.

Más comúnmente, la marca de la sonda es una marca fluorescente que proporciona una señal de salida fluorescente. Se puede conseguir esto proporcionando una sonda que esté doblemente marcada con un colorante indicador fluorescente en un extremo, normalmente el extremo 5’, y un colorante apagador en el otro, el extremo 3’ (por ejemplo, Livak, K.J. y col. 1995 PCR Methods Appl. 4, 357-362). Cuando la sonda está intacta, la proximidad del colorante apagador con el colorante indicador suprime la fluorescencia del colorante indicador. Se revisan los colorantes adecuados en Wilhelm, J. y Pingoud, A., 2003. Chembiochem. 4, 1120-1128. Durante cada ciclo de la PCR, la actividad de la exonucleasa 5’-3’ de la ADN polimerasa rompe la sonda, que separa el colorante indicador del colorante apagador. Esta separación da como resultado un aumento en la fluorescencia del colorante indicador.

Durante la PCR, si la diana de interés está presente en una muestra, la sonda se hibridará específicamente entre los sitios del cebador directo e inverso de la PCR. La actividad de la exonucleasa de la ADN polimerasa rompe la sonda entre los colorantes indicador y apagador únicamente si la sonda se hibrida con la molécula diana. Estas sondas se denominan a menudo sondas Taqman. El aumento en la fluorescencia se detecta únicamente si la secuencia diana es complementaria con la sonda y se amplifica durante la PCR. Debido a estos requerimientos, no se detecta laamplificación no específica. Únicamente se reconocen los productos amplificados que contienen la secuencia complementaria con la sonda mediante la presencia de la señal fluorescente, eliminando por tanto algunos elementos relacionados con el análisis de los falsos positivos. Adicionalmente, se pueden utilizar uno o más enzimas diferentes para ayudar a limitar la amplificación de los productos trasladados de la transcripción.

Este tipo de PCR cuantitativa permite la normalización de los errores de pipeteado y los cambios de volumen, lo que se puede llevar a cabo dividiendo la fluorescencia indicadora por una referencia pasiva, contenida dentro de cada reacción, para determinar la señal indicadora normalizada de cada reacción individual. Se puede usar software para analizar el aumento ciclo a ciclo en la intensidad de la fluorescencia y comparar estos datos con los estándares con el fin de determinar los números iniciales de copia para la cuantificación absoluta o comparar frente a otras muestras desconocidas para una comparación de la cantidad relativa.

En concreto, se ha encontrado que la PCR en tiempo real TaqMan en la presente invención es adecuada para la caracterización de una línea celular policlonal. De esta manera, cuando se aplica a una línea celular que expresa un anticuerpo policlonal, la técnica sirve para cuantificar las proporciones relativas de las secuencias que codifican el anticuerpo individual, debido a que se puede diseñar una sonda TaqMan única para la cadena pesada y/o la cadena ligera de cada miembro representado en la línea celular policlonal. Preferiblemente una de las regiones CDR, CDR1, CDR2 o CDR3, se selecciona para diseñar la sonda TaqMan. Más preferiblemente, se selecciona la región CDR3 para diseñar la sonda TaqMan. Se pueden encontrar ejemplos de las sondas TaqMan de CDR3 de la cadena pesada variable en Rasmussen, T. y col. 2000. Exp. Hematol. 28, 1039-1045.

Secuenciación de ácidos nucleicos

La secuenciación de ácidos nucleicos es una técnica bien conocida, que se puede utilizar con la presente invención para proporcionar información cualitativa con respecto a la diversidad de una línea celular de fabricación policlonal.

Se puede llevar a cabo la secuenciación tanto sobre células individuales derivadas de la línea celular policlonal mediante clonación de célula individual como sobre una muestra sin procesar de células variables obtenida de una línea celular de fabricación policlonal.

La secuenciación en el nivel de célula individual proporcionará información con respecto a la proporción relativa de células dentro de la línea celular de fabricación que produce un miembro individual de la proteína policlonal. En este procedimiento, se obtiene una muestra de una línea celular de fabricación policlonal en un momento deseado, y las células que codifican la proteína policlonal que se va a caracterizar se clonan en células individuales, usando, por ejemplo, dilución limitada o mediante un clasificador celular tal como FACS Aria. El número de células individuales que debería obtenerse de la muestra de la línea celular policlonal depende de la variedad de secuencias esperadas que se van a representar dentro de la línea celular. Preferiblemente, al menos 3 veces el número de secuencias de codificación individuales que forman la entrada durante la generación de la línea celular debería clasificarse como célula individual para dar una probabilidad del 95 % de volver a encontrarlas a todas en la muestra de ensayo. De esta manera, si se usó una biblioteca de 25 secuencias de codificación diferentes para general la línea celular, al menos, deberían obtenerse 75 clones de células individuales procedentes de la muestra para la secuenciación, proporcionando que las 25 secuencias diferentes se representen en cantidades iguales. Esto aseguraría que la mayor parte de las secuencias de codificación individuales representadas en la línea celular policlonal estén representadas entre los clones de células individuales, si no se han perdido durante el procedimiento de fabricación. Las células individuales se hacen crecer hasta confluencia en pocillos separados y se usan alícuotas de cada pocillo como plantillas en las reacciones de secuenciación de los ácidos nucleicos. Se puede llevar a cabo la secuenciación al nivel del ARNm o al nivel genómico, usando una RT-PCR o una etapa de amplificación de la PCR, respectivamente, antes de la secuenciación. La información de la secuencia obtenida tanto al nivel del ARNm como genómico, puede determinar el porcentaje de células que codifican cada uno de los componentes del anticuerpo individual. Además, la información de la secuencia obtenida al nivel del ARNm se puede usar para evaluar el nivel de expresión de cada uno de los anticuerpos individuales en la composición policlonal. Además de la secuenciación es posible llevar a cabo una PCR en tiempo real TaqMan en el nivel del ARNm para obtener información con respecto al nivel potencial de expresión del clon de célula individual. Los análisis RFLP o T-RFLP descritos anteriormente pueden llevarse a cabo igualmente en el nivel de célula individual.

La secuenciación de una muestra sin procesar de células variables obtenidas de una línea celular de fabricación policlonal puede proporcionar también información con respecto al nivel potencial de expresión de un miembro individual de la proteína policlonal producida a partir de la línea celular, basándose en el nivel relativo de ARNm de las secuencias de codificación de los miembros individuales de la proteína policlonal. En este procedimiento se obtiene una muestra de una línea celular de fabricación policlonal en el momento deseado. Ase lleva a cabo la RT-PCR directamente sobre las células lisadas dentro de la muestra El conjunto de cebadores aplicados para la reacción de la RT-PCR se diseña de tal manera que se esperará amplificar todas las secuencias de codificación con la misma eficiencia si los cebadores de sentido directo y de sentido contrario hibridan las regiones que son idénticas en todos los ARNm (se pueden usar, por ejemplo, un cebador de sentido directo en la región 5’ no traducida o en la secuencia que codifica el péptido señal y un cebador de sentido contrario en la secuencia de la región constante. Los fragmentos amplificados de la PCR se clonan en un vector de secuenciación y se transfectan en una célula huésped, preferiblemente E. coli, Se secuencia el ADN plásmido de las colonias únicas que representan una secuencia de codificación individual de la línea celular de fabricación policlonal, la proporción de las secuencias de codificación individuales obtenidas reflejará el nivel del ARNm de cada secuencia de codificación individual en la línea celular policlonal así como el nivel potencial de expresión de los miembros de la proteína individual.

Los análisis genéticos descritos anteriormente se aplican como análisis separados. Preferiblemente, uno o más de los análisis se llevan a cabo en alícuotas de la misma muestra, con el fin de obtener tanta información sobre la diversidad clonal de la línea celular como sea posible. Se pueden combinar alternativamente los análisis genéticos de una manera multidimensional, se pueden llevar a cabo, por ejemplo, análisis en micromatriz en los fragmentos RFLP o T-RFLP tras este análisis, o se pueden secuenciar los fragmentos RFLP posteriormente al análisis RFLP. En concreto, es una ventaja llevar a cabo la secuenciación en los fragmentos RFLP que representan más de un componente individual, y que no se pueden separar debido a su tamaño idéntico del fragmento de restricción.

Técnicas de caracterización de proteínas para evaluar la policlonalidad

De acuerdo con la presente invención se vigila la policlonalidad de un combinado de proteínas homólogas o el sistema de expresión para producir las proteínas homólogas mediante una o más técnicas de caracterización de proteínas seleccionadas de análisis cromatográficos que separan proteínas de acuerdo con una propiedad físicoquímica distinta del tamaño. Las técnicas de caracterización de proteínas se refieren a cualquier técnica que sola o en combinación con otras técnicas es capaz de proporcionar información con respecto a la presencia y proporción relativa de lo miembros individuales de una mezcla de proteínas monoclonales o una proteína policlonal recombinante en solución o en la superficie de una célula presente en una línea celular policlonal. Dependiendo de la complejidad de la proteína policlonal recombinante, se pueden usar una o más de las siguientes técnicas: I) técnicas de separación cromatográfica, ii) análisis de digestiones proteolíticas de la proteína policlonal para la identificación de un péptido marcador único que representa los miembros individuales de la proteína policlonal, iii) secuenciación N-terminal “en masa”, y iv) análisis usando moléculas detectoras específicas, por ejemplo, par la caracterización de miembros de proteínas centinela de la proteína policlonal.

La muestra que contiene las diferentes proteínas homólogas puede ser una mezcla de proteínas monoclonales purificadas, o una proteína policlonal. La proteína policlonal puede por ejemplo derivarse de un sobrenadante de cultivo celular obtenido de un cultivo celular policlonal, por ejemplo, en forma de un sobrenadante “bruto” que sólo se ha separado de las células, por ejemplo, mediante centrifugación, o sobrenadantes que se han purificado, por ejemplo, mediante purificación de afinidad de la proteína A, inmunoprecipitación o filtración en gel. Estas etapas de prepurificación no son, sin embargo, una parte de la caracterización de la proteína policlonal recombinante debido a que no proporcionan ninguna separación de las diferentes proteínas homólogas en la composición. Preferiblemente, la muestra sometida al procedimiento de caracterización de la presente invención se ha sometido a al menos una etapa de purificación. Más preferidas son las muestras que comprenden un 90 %, 95 % o 99 % de proteínas homólogas puras.

Se pueden vigilar las diferentes proteínas homólogas que constituyen la proteína policlonal en las muestras obtenidas de un cultivo celular policlonal único en diferentes momentos durante el cultivo, vigilando por tanto las proporciones relativas de los miembros individuales de la proteína policlonal a lo largo del transcurso de la producción para evaluar su estabilidad composicional. Alternativamente, se pueden vigilar diferentes proteínas homólogas que constituyen la proteína policlonal en las muestras obtenidas de diferentes cultivos celulares policlonales en un momento concreto vigilando por tanto las proporciones relativas de las secuencias de codificación individuales en diferentes lotes para evaluar la consistencia lote a lote.

Técnicas de separación cromatográfica

La separación cromatográfica de los miembros individuales de la proteína policlonal puede estar basada en diferencias en las propiedades fisicoquímicas tales como i) carga neta (a modo de ejemplo mediante cromatografía de intercambio iónico (IEX)), ii) hidrofobia (a modo de ejemplo mediante cromatografía en fase inversa (RP-HPLC), y cromatografía de interacción hidrófoba basada en la concentración de sal (HIC)), iii) puntos isoeléctricos (valores pI) (a modo de ejemplo mediante cromatofocalización) o iv) afinidad (a modo de ejemplo mediante cromatografía de afinidad usando péptidos/anticuerpos anti-idiotipo o cromatografía de L-proteínas para la separación de las cadenas ligeras Kappa y Lambda del anticuerpo). Una quinta técnica cromatográfica bien conocida se basa en la siguiente propiedad fisicoquímica: el tamaño. Esta no es, sin embargo, una técnica particularmente adecuada para la caracterización de proteínas homólogas tales como un anticuerpo policlonal o un TcR policlonal, debido a que todos los miembros son del mismo tamaño esencialmente. Se puede omitir completamente la separación por tamaño desde el procedimiento de caracterización. Se ha empleado alguna de estas técnicas cromatográficas anteriormente mencionadas en la separación de los tipos de inmunoglobulina tales como IgA, IgG e IgM (Gallo, P. y col. 1987. J. Chromatogr. 416, 53-62) o subtipos tales como, IgG1, IgG2, IgG3 (Scharf, O y col. 2001. J. Virol. 75, 6558-6565) procedentes de suero humano. Sin embargo, no se ha llevado a cabo anteriormente la separación con respecto a la diversidad de los anticuerpos individuales en una inmunoglobulina derivada de suero o un anticuerpo policlonal recombinante.

a) Cromatografía de intercambio iónico

En realizaciones de la presente invención, la cromatografía de intercambio iónico se usa para separar miembros individuales de una proteína policlonal recombinante o una subpoblación de miembros individuales de una proteína policlonal. La separación mediante cromatografía de intercambio iónico se basa en la carga neta de las proteínas individuales en la composición que se va a separar, Dependiendo de los valores pl de la proteína policlonal recombinante, los valores de pH y las concentraciones de sal del tampón de columna escogido, se pueden separar los miembros individuales de la proteína policlonal recombinante, al menos en alguna extensión, usando cualquiera de la cromatografía de intercambio aniónico o catiónico. Por ejemplo, todos los miembros individuales de una proteína policlonal recombinante se unirán normalmente a medios de intercambio catiónico cargados negativamente siempre que el pH esté por debajo del valor pl más bajo de los miembros individuales de la composición de proteína policlonal recombinante. Los miembros individuales de la proteína policlonal recombinante unida pueden posteriormente eludirse de la columna dependientes de la carga neta de las proteínas individuales usando normalmente un gradiente creciente de una sal (por ejemplo, cloruro de sodio) o un valor creciente de pH. Se obtendrán algunas fracciones durante la elución. Una fracción individual contiene preferiblemente un miembro individual de la proteína policlonal, pero contiene también 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o más miembros distintos de la proteína policlonal. Los principios generales del intercambio catiónico y aniónico son bien conocidos en la técnica, y están disponibles comercialmente columnas de cromatografía de intercambio iónico.

b) Cromatofocalización

En realizaciones adicionales de la presente invención, se usa la cromatofocalización para separar los miembros individuales de una proteína policlonal recombinante o una subpoblación de miembros individuales de una proteína policlonal. La separación mediante cromatofocalización se basa en las diferencias en los valores pl de las proteínas individuales y se lleva a cabo usando un tampón de columna con un valor de pH por encima del valor pl de la proteína policlonal recombinante. Una proteína policlonal recombinante en la que los miembros individuales tienen valores pl relativamente bajos se unirá a medio de intercambio aniónico débiles cargados positivamente. Los miembros individuales de la proteína policlonal recombinante unida se pueden eludir posteriormente a partir de la columna dependiendo de los valores pl de los miembros individuales generando en el interior de la columna un

gradiente decreciente de pH usando un politampón diseñado para cubrir el intervalo de pH de los valores pl de los miembros individuales. Se obtendrán varias fracciones durante la elución. Una fracción individual contiene preferiblemente un miembro individual de la proteína policlonal, pero contiene también 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20

o más miembros distintos de la proteína policlonal. Los principios generales de la cromatofocalización usando intercambiadores aniónicos son bien conocidos en la técnica, y están comercialmente disponibles columnas aniónicas. La cromatofocalización con intercambiadores catiónicos es también conocida en la técnica (Kang, X. y Frey, D.D., 2003. J. Chromatogr. 991, 117-128).

c) Cromatografía de interacción hidrófoba

En realizaciones adicionales de la presente invención se usa la cromatografía de interacción hidrófoba para separar los miembros individuales de una proteína policlonal recombinante o una subpoblación de miembros individuales de una proteína policlonal. La separación mediante cromatografía de interacción hidrófoba se basa en las diferencias en la hidrofobia de las proteínas individuales en la composición que se va a separar. La proteína policlonal producida de manera recombinante se une a los medios modificados de la cromatografía con un ligando hidrófobo en un tampón que favorece las interacciones hidrófobas. Esto se consigue normalmente en un tampón que contiene un porcentaje bajo de disolvente orgánico (RP-HPLC) o en un tampón que contiene una concentración bastante alta de una sal escogida (HIC). Los miembros individuales de la proteína policlonal recombinante unida se eludirán posteriormente de la columna dependientes de la hidrofobia de los miembros individuales usando normalmente un gradiente creciente de disolvente orgánico (RP-HPLC) o un gradiente decreciente de una sal escogida (HIC). Se obtendrán algunas fracciones durante la elución. Una fracción individual contiene preferiblemente un miembro individual de la proteína policlonal, pero contiene también 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o más miembros distintos de la proteína policlonal. Los principios generales de la cromatografía de interacción hidrófoba son bien conocidos en la técnica, y están comercialmente disponibles columnas par ala RP-HPLC así como para HIC.

d) Cromatografía de afinidad

En realizaciones adicionales de la presente invención se usa la cromatografía de afinidad para separar los miembros individuales de una proteína policlonal o una subpoblación de miembros individuales de una proteína policlonal. La separación mediante la cromatografía de afinidad se basa en las diferencias en la afinidad hacia una molécula detectora específica, ligando o proteína, la molécula detectora, ligando o proteína o una pluralidad de éstas (estas diferentes opciones se denominan exactamente ligando en lo siguiente) se inmovilizan en un medio cromatográfico y se aplica la proteína policlonal recombinante a la columna de afinidad en condiciones que favorezcan la interacción entre los miembros individuales y el ligando inmovilizado. Las proteínas que no muestran afinidad hacia el ligando inmovilizado se recogen a través del flujo de la columna y las proteínas que muestran afinidad hacia el ligando inmovilizado se eluyen posteriormente de la columna en condiciones que no favorecen la unión (por ejemplo, pH bajo, concentración elevada de sal o concentración elevada de ligando). Se pueden obtener algunas fracciones durante la elución. Una fracción individual contiene preferiblemente un miembro individual de la proteína policlonal, pero puede contener también 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o más miembros distintos de la proteína policlonal. Los ligandos que se pueden usar para caracterizar una proteína policlonal recombinante son por ejemplo antígenosdiana, moléculas anti-idiotipo, o proteína L para la separación de anticuerpos con las cadenas ligeras Kappa o Lambda.

La cromatografía de afinidad con antígenos-diana será particularmente apropiada cuando una proteína policlonal recombinante comprenda afinidades hacia más de un epitopo. La diana puede ser, por ejemplo, una célula cancerosa o un virus o una combinación de dianas, que contienen muchos epitopos. Se pueden sintetizar estos epitopos sintéticamente e inmovilizarse en un medio cromatográfico. Se puede diseñar el ensayo con un epitopo por columna o algunos epitopos diferentes por columna, permitiendo por tanto la caracterización de la mezcla de proteína policlonal recombinante con respecto a la distribución de los miembros individuales hacia los epitopos concretos. Alternativamente, se pueden inmovilizar en un medio cromatográfico los antígenos completos o las moléculas diana.

Se puede llevar a cabo la cromatografía de afinidad con moléculas anti-idiotipo (por ejemplo, péptidos anti-idiotipo o anticuerpos anti-idiotipo) que se unen específicamente a los miembros individuales de una proteína policlonal o una subpoblación de dichos miembros individuales para obtener información con respecto a la proporción relativa de los miembros seleccionados de la proteína policlonal recombinante (denominados también proteínas centinela), o una subpoblación de miembros individuales. Idealmente, cada molécula anti-idiotipo individual se une sólo específicamente con un miembro individual, pero no con otros miembros de la proteína policlonal recombinante, aunque una molécula anti-idiotipo que se une a un subconjunto definido de miembros es también aplicable en la presente invención. Preferiblemente, las moléculas anti-idiotipo se generan hacia todos los miembros individuales, de tal manera que se puede caracterizar la composición policlonal completa. Cuando la proteína policlonal recombinante es un anticuerpo policlonal o TcR, las moléculas anti-idiotipo se dirigen contra la parte específica del antígeno de la secuencia de un anticuerpo o un receptor de linfocitos T. Se pueden inmovilizar las moléculas antiidiotipo en el medio cromatográfico individualmente, de tal manera que una columna contenga una molécula antiidiotipo, por lo cual se obtiene información acerca de un miembro de proteína concreto o subpoblación de proteínas. A continuación se puede aplicar el flujo pistón a través de una segunda columna con una segunda molécula antiidiotipo inmovilizada y así sucesivamente. Alternativamente, algunas moléculas anti-idiotipo se inmovilizan en el

mismo medio cromatográfico aplicado a la misma columna. A continuación se lleva a cabo la elución en condiciones que permitan eludir las proteínas individuales en diferentes fracciones, añadiendo, por ejemplo, cantidades crecientes de moléculas idiotipo libres a la columna, o usando un pH o gradiente de sal. Con ésta solución, será posible obtener información sobre las proporciones de algunos miembros de la proteína policlonal con un análisis dimensional.

Cuando la proteína policlonal recombinante es un anticuerpo policlonal, éste puede estar compuesto de miembros individuales que contienen tanto una cadena ligera Kappa como una cadena ligera Lambda. En dicho anticuerpo policlonal, los anticuerpos con una cadena ligera Lambda se pueden separar de los anticuerpos con una cadena ligera Kappa usando la ausencia de afinidad hacia la proteína L de la cadena ligera Lambda de los anticuerpos. De esta manera, se puede separar un subconjunto de miembros de anticuerpos que contienen la cadena ligera Lambda de un subconjunto de miembros de anticuerpos que contienen la cadena ligera Kappa usando la cromatografía de afinidad de la Proteína L. Se pueden caracterizar posteriormente los subconjuntos de anticuerpos Kappa y Lambda usando además las técnicas cromatográficas alternativas para la cuantificación individual de anticuerpos, por ejemplo, tal como se describe anteriormente.

Cromatografía multidimensional

Dependiendo de la complejidad de las proteínas homólogas variables en la muestra que se va a analizar, por ejemplo, una proteína policlonal recombinante, puede ser deseable combinar dos o más de las técnicas cromatográficas descritas anteriormente en a) a d) en formato bidimesional, tridimensional o multidimensional. Se prefiere usar la cromatografía líquida en todas las dimensiones en vez de la electroforesis en gel bidimensional. Esto no excluye, sin embargo, el uso de la electroforesis en gel o las técnicas de precipitación en una o más dimensiones para la caracterización de una proteína policlonal recombinante.

Se ha descrito la cromatografía líquida bidimensional en por ejemplo Lubman, D.M. y col. 2002. J.Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 782, 183-196; el documento WO 01/58925 y el documento WO 01/58926. Se ha usado el procedimiento para comparar la expresión de las proteínas de células sanas y células cancerosas, generando por tanto una lectura diferencial al nivel de la proteína. Además, se ha descrito la cromatografía tridimensional, en la que la tercera dimensión es la separación por tamaños, en el documento WO 03/102539 para la separación de proteínas en por ejemplo, extractos celulares generando por tanto igualmente una lectura diferencial.

En realizaciones adicionales de la presente invención se usa la cromatografía multidimensional para la caracterización de diferentes proteínas homólogas dentro de una muestra. En muestras concretas de proteína homólogas que tienen diferentes regiones variables, dichos anticuerpos y receptores de linfocitos T se caracterizan con la cromatografía multidimensional. Preferiblemente, se lleva a cabo la dimensión adicional sobre las fracciones obtenidas durante la elución en la dimensión anterior. Sin embargo, se puede usar también el flujo pistón para el análisis dimensional adicional. Esto puede en particular llegar a ser relevante cuando la dimensión anterior es cromatografía de afinidad.

En una realización de la presente invención se usa la cromatografía multidimensional en la separación de moléculas de anticuerpo individuales con respecto a su diversidad, procedentes tanto de un anticuerpo policlonal (inmunoglobulina derivada de suero o recombinante) como de una mezcla de anticuerpos monoclonales. Preferiblemente, la cromatografía multidimensional es una cromatografía líquida.

En otra realización de la presente invención, se usa la cromatografía multidimensional en la separación de moléculas receptoras de linfocitos T individuales con respecto a su diversidad, tanto de un receptor de linfocitos T policlonales como de una mezcla de receptores de linfocitos T monoclonales. Preferiblemente, la cromatografía multidimensional es una cromatografía líquida.

Generalmente, se intenta usar técnicas cromatográficas basadas en diferentes propiedades fisicoquímicas en las diferentes dimensiones de una cromatografía multidimensional, por ejemplo, separación por carga en la primera dimensión y separación por hidrofobia en la segunda dimensión y afinidad en la tercera dimensión. Sin embargo, algunas técnicas cromatográficas pueden proporcionar la separación adicional cuando se usan en una dimensión posterior, incluso si aprovechan propiedades fisicoquímica similares de la proteína. Se puede obtener, por ejemplo, la separación adicional cuando la cromatofocalización está seguida por la cromatografía de intercambio iónico o la cromatografía de afinidad con diferentes ligandos que se suceden entre sí.

La Tabla 1 enumera hasta cinco dimensiones, en las que se pueden emplear técnicas cromatográficas como parte del procedimiento de caracterización de la presente invención. Esto no debería considerarse, sin embargo, como un número obligatorio de dimensiones. Si se ha obtenido una separación suficiente, para caracterizar la proteína policlonal recombinante, tras una, dos, tres o cuatro dimensiones, se pueden omitir las dimensiones restantes. Por tanto, si se obtiene una separación suficiente con la cromatografía de intercambio iónico (IEX), no es necesario llevar a cabo la cromatofocalización, la RP-HPLC, y así sucesivamente. Si por otra parte, cinco dimensiones prueban ser insuficientes, se pueden añadir dimensiones adicionales. Además, no debería considerarse la Tabla 1 como un lista exhaustiva de posibles combinaciones de técnicas cromatográficas, o como una lista exhaustiva de las propias técnicas.

Tabla 1 5

1ª dimensión

2ª dimensión 3ª dimensión 4ª dimensión 5ª dimensión

IEX

Cromatofocalización RP-HPLC/HIC Afinidad proteína L Afinidad antiidiotipo

IEX

RP-HPLC/HIC Afinidad proteína L Afinidad anti-idiotipo

IEX

RP-HPLC/HIC Afinidad antiidiotipo Afinidad proteína L

IEX

Afinidad proteína L Afinidad antiidiotipo RP-HPLC/HIC

IEX

Afinidad proteína L RP-HPLC/HIC Afinidad anti-idiotipo

IEX

Afinidad anti-idiotipo Afinidad proteína L RP-HPLC/HIC

IEX

Afinidad anti-idiotipo RP-HPLC/HIC

Cromatofocalización

IEX RP-HPLC/HIC Afinidad proteína L Afinidad antiidiotipo

Cromatofocalización

RP-HPLC/HIC Afinidad proteína L Afinidad anti-idiotipo

Cromatofocalización

RP-HPLC/HIC Afinidad antiidiotipo

Cromatofocalización

Afinidad proteína L RP-HPLC/HIC Afinidad anti-idiotipo

Cromatofocalización

Afinidad proteína L Afinidad antiidiotipo RP-HPLC/HIC

Cromatofocalización

Afinidad anti-idiotipo Afinidad proteína L RP-HPLC/HIC

HIC

IEX/cromatofocalización Afinidad proteína L Afinidad anti-idiotipo

HIC

Afinidad proteína L IEX/cromatofocalización Afinidad anti-idiotipo

HIC

Afinidad proteína L Afinidad antiidiotipo IEX/cromato-focalización

HIC

Afinidad anti-idiotipo IEX/cromatofocalización RP-HPLC/HIC

Afinidad proteína L

RP-HPLC/HIC IEX/cromatofocalización Afinidad anti-idiotipo

Afinidad proteína L

IEX/cromatofocalización RP-HPLC/HIC Afinidad anti-idiotipo

Afinidad proteína L

Afinidad anti-idiotipo IEX/cromatofocalización RP-HPLC/HIC

Afinidad proteína L

Afinidad anti-idiotipo RP-HPLC/HIC IEX/cromato-focalización

Afinidad antiidiotipo

IEX/cromatofocalización RP-HPLC/HIC Afinidad proteína L

Afinidad antiidiotipo

RP-HPLC/HIC IEX/cromatofocalización Afinidad proteína L

(continuación)

Afinidad idiotipo

anti- Afinidad proteína L IEX/cromatofocalización RP-HPLC/HIC

Afinidad idiotipo

anti- Afinidad proteína L RP-HPLC/HIC IEX/cromato-focalización

En realizaciones preferidas de la presente invención, la cromatografía líquida (LC) multidimensional es una técnica de LC bidimensional seleccionada entre las dos primeras dimensiones que se muestran en la Tabla 1.

En realizaciones adicionales de la presente invención, la LC multidimensional es una técnica LC tridimensional seleccionada entre las primeras tres dimensiones que se muestran en la Tabla 1.

Como una alternativa a las técnicas de LC multidimensionales, se puede usar la inmunoprecipitación combinada con una técnica de electroforesis adecuada, tal como una electroforesis en gel o electroforesis capilar, y la posterior cuantificación de los antígenos, para caracterizar una proteína policlonal recombinante. Esta técnica será particularmente útil para caracterizar un anticuerpo policlonal recombinante dirigido contra antígenos complejos. Se puede inmunoprecipitar un anticuerpo policlonal recombinante dirigido contra, por ejemplo, un antígeno complejo de virus usando una mezcla de antígeno marcado y unas perlas de proteína A. Los antígenos se separarían posteriormente usando focalización isoeléctrica o PAGE en 2D seguido por la cuantificación de los antígenos individuales, reflejando la cantidad de anticuerpos en un anticuerpo policlonal recombinante dirigido contra los antígenos específicos.

Eliminación de la heterogeneidad de la carga N terminal en proteínas recombinantes

En las técnicas de caracterización de proteínas descritas en lo anterior, la heterogeneidad de la proteína individual en un combinado de proteínas homólogas puede complicar incluso más la caracterización debido a que una proteína única puede dar como resultado diversos picos en por ejemplo un perfil IEX. La heterogeneidad es un fenómeno común en los anticuerpos y otras proteínas recombinantes, y es debida a modificaciones post-traduccionales enzimáticas o no enzimáticas. Estas modificaciones pueden producir heterogeneidad en el tamaño o la carga. Las modificaciones post-traduccionales comunes incluyen la N-glicosilación, oxidación de la metionina, fragmentación proteolítica, y desamidación. La heterogeneidad puede originarse también a partir de modificaciones al nivel genético, tales como mutaciones introducidas durante la transfección (Harris, J.R, y col. 1993. Biotechnology 11,1293-7) y episodios de entrecruzamiento entre genes variables de cadenas ligera y pesada durante la transcripción (Wan, M. y col. 1999. Biotechnol Bioeng. 62,485-8). Estas modificaciones son epigenéticas y de esta manera no predecibles a partir de la estructura genética del constructo sólo.

Algunas de estas modificaciones post-traduccionales que pueden dar como resultado heterogeneidad pueden ser tratadas antes de la caracterización. La variación de carga surge de la eliminación enzimática de la lisina C terminal que se puede solventar mediante el uso de inhibidores específicos de la carboxipeptidasa o tratar el anticuerpo con carboxipeptidasa para simplificar el modelo global (Perkins, M. y col. 2000. Pharm Res. 17,1110-7). La variación en el tamaño que surge de diferencias en los modelos de glicosilación puede tratarse también mediante desglicosilación enzimática usando por ejemplo PNGasa F, Endo H, O-glicosidasa o neuraminidasa.

La degradación química de las proteínas, tal como la desamidación, ha mostrado ser un problema significativo durante la producción y el almacenamiento, y da como resultado heterogeneidad de carga. La desamidación de Asn a Asp y la formación de Isoasp (péptidos unidos a isoaspartilo) tiene lugar en condiciones suaves (Aswad, D.W. y col. 2000. J Pharm Blomed Anal. 21, 1129-36). Estas transposiciones se producen más fácilmente en secuencias Asn-Gly, Asn-Ser, y Asp-Gly en las que la flexibilidad de la cadena polipeptídica local es elevada.

Otra causa de heterogeneidad de carga puede ser el resultado del bloqueo N terminal por el ácido piroglutámico (PyroGlu) resultante de la ciclación de los restos de glutamina N terminales (desamidación). Dichas modificaciones post-traduccionales se han descrito para IgG así como otras proteínas. La ciclación parcial del N terminal de un anticuerpo, especialmente si están implicadas HC y LC, dará como resultado heterogeneidad de carga proporcionando un modelo IEX complejo. En la Fig. 16 se muestran los modelos IEX potenciales debidos a la formación de un PyroGlu N terminal en una o más de las cadenas VH y VL de un anticuerpo. Si se va a caracterizar una muestra que comprende diferentes proteínas homólogas que tienen diferentes regiones variables, tales como un anticuerpo policlonal recombinante, mediante técnicas basadas en la carga neta, es obvio que dicho análisis se complicará incluso si exactamente un poco de los componentes de la muestra tiene modelos IEX tal como se muestra en la Fig 16B y C, debido a que ésta enmascarará la diversidad clonal en un perfil IEX de por ejemplo, una composición de anticuerpo policlonal. Este problema no se puede solventar mediante el uso del enzima específico, piroglutamato aminopeptidasa, en primer lugar de todo debido a que el desbloqueo ha de llevarse a cabo en anticuerpos reducidos y alquilados con el fin de obtener rendimientos elevados de anticuerpos desbloqueados (Mozdzanowski, J. y col. 1998Anal Blochem. 260,183-7) no compatibles con un análisis IEX posterior, y en segundo lugar debido a que no será posible obtener un 100 % de rotura de todos los anticuerpos.

También se ha descrito en el presente documento la eliminación de la heterogeneidad de carga producida por la ciclación de los restos de glutamina N terminales. Esta es particularmente útil si se combina con cualquiera de las herramientas de caracterización anteriormente descritas, que se basan en la propiedad fisicoquímica de la carga neta, por ejemplo, la cromatografía IEX y la cromatofocalización. Se elimina la formación de restos PyroGlu N terminales asegurando que una glutamina N terminal no contiene cadenas de polipéptidos, cambiando, por ejemplo, dicho resto de glutamina N terminal por otro aminoácido. Si la proteína es una proteína heteromérica compuesta de diferentes subunidades, preferiblemente, todos los restos Gln N terminales se intercambian por otros restos. Para los restos Gln de anticuerpos se intercambian en el N terminal de la cadena pesada y/o la cadena ligera. Esto se lleva a cabo mediante mutagénesis dirigida al sitio de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos con una glutamina N terminal. Preferiblemente, los restos de glutamina N terminal se sustituyen por restos de ácido glutámico, debido a que éste es un derivado no cargado de la glutamina. En una proteína policlonal recombinante, se deben cambiar y volver a insertar las secuencias individuales que codifican los miembros en un vector de expresión para generar una nueva línea celular que exprese la proteína cambiada. A continuación puede incluirse esta línea celular en la colección de células que produce la proteína policlonal.

Análisis de digestiones proteolíticas de la región variable de las proteínas homólogas

Una muestra de proteínas que comprende diferentes proteínas homólogas que tienen diferentes regiones variables puede caracterizarse, tal como se describe en lo anterior, en función de las propiedades fisicoquímicas de las proteínas intactas usando un intervalo de técnicas cromatográficas. La información obtenida de estos análisis anteriormente descritos puede suplementarse adicionalmente con la información obtenida de los análisis de las digestiones proteolíticas de las proteínas homólogas. Preferiblemente, la digestión proteolítica se lleva a cabo en una alícuota de la misma muestra tal como se llevaron a cabo los análisis cromatográficos de las proteínas intactas.

En realizaciones adicionales de la presente invención se usa la identificación de péptidos marcadores únicos que se originan en la región variable de los miembros individuales de una composición de proteínas homólogas para caracterizar la composición de proteínas para la presencia de los miembros individuales de una manera cualitativa. Estos péptidos marcadores únicos se generan mediante digestión proteolítica de la composición de proteínas (muestra) que comprende las diferentes proteínas homólogas.

Con el fin de llevar a cabo el mapeado de los péptidos de las regiones variables de una mezcla de proteínas homólogas, es importante que la parte o partes de las regiones variables que diferencian los miembros individuales dentro de la mezcla de los otros miembros, se mantenga intacta tras la digestión proteolítica. Por tanto, deberían seleccionarse una o más proteasas de tal manera que se pueda obtener al menos una secuencia única, denominada también un péptido marcador, para cada miembro individual de una proteína policlonal recombinante. Cuando la mezcla de proteínas homólogas es un anticuerpo policlonal recombinante o TcR policlonal recombinante, las secuencias que diferencian los miembros individuales entre sí se caracterizan normalmente por las regiones CDR. La elección de la proteasa, proteasas o compuestos químicos usados para generar los péptidos marcadores únicos se basa en un análisis de las secuencias de proteínas que constituyen la muestra de la proteína homóloga. Generalmente, las proteasas o unos compuestos químicos deberían romper en sitios definidos en la proteína con elevada especificidad. Dichas proteasas específicas de rotura son bien conocidas en la técnica y pueden ser, por ejemplo, tripsina, endo Glu-C, lisil endopeptidasa, endo Arg-C, endo Asp-N o endo Asn-C. Estas son meramente ejemplos y no deberían considerarse como limitantes de esta realización.

Cuando se digiere una muestra de proteína policlonal con una o más proteasas seleccionadas se generará un combinado de péptidos que se originan procedentes de las regiones tanto constante como variable de todos los miembros individuales. Una proporción de los péptidos marcadores únicos mostrará diferencias en sus propiedades fisicoquímicas en comparación con la población principal de péptidos que se originan de las regiones constantes. Los péptidos marcadores únicos pueden por tanto aislarse usando una de las técnicas cromatográficas descritas en lo anterior. Preferiblemente, se usan la cromatografía de intercambio iónico o la RP-HPLC diseñada específicamente para la separación de péptidos, para separar los péptidos únicos de la fracción principal de los péptidos de la región constante. Se pueden aplicar igualmente técnicas cromatográficas multidimensionales tal como se ha descrito anteriormente para separar los péptidos marcadores únicos. Tras la separación en una o más dimensiones, se puede usar la espectrometría de masas (EM) para la identificación de los diferentes péptidos. Las técnicas de EM preferidas son la espectrometría de masas de desorción con ionización mediante láser UV asistida por matriz (MALDI) y analizador de tiempo de vuelo (TOF), y la espectrometría de masas con ionización por electropulverización y analizador de tiempo de vuelo (ESI-TOF).

Alternativamente, se puede llevar a cabo la digestión proteolítica de proteínas intactas separadas por una cromatografía dimensional o multidimensional tal como se describe en a) a d) y en “Cromatografía líquida multidimensional” de la sección anterior, seguido por la rotura de las fracciones de proteínas separadas. A continuación se pueden analizar estas digestiones mediante EM (Kachman, M.T. y col. 2002. Anal. Chem. 74, 17791791). Esta solución puede ser ventajosa para la caracterización de proteínas policlonales muy complejas, debido a que se puede aplicar selectivamente a una proporción de las fracciones obtenidas mediante un análisis dimensional

o multidimensional de las proteínas intactas con el fin de caracterizar éstas adicionalmente.

Se puede, además, llevar a cabo la digestión proteolítica con el fin de aislar péptidos marcadores N terminales, si

éstos contienen regiones variables únicas. Se pueden aislar péptidos N terminales tal como se describe esencialmente en Gevaert, K. y col., 2003. Nat. Biotechnol. 21, 566-569. De manera breve, se bloquean los grupos amino libres en la proteína policlonal recombinante, por ejemplo, mediante acetilación, y la mezcla de proteínas se digiere posteriormente con una proteasa adecuada. La digestión genera un grupo amino N terminal libre en los péptidos internos que se bloquea posteriormente con un compuesto que permite la separación de los péptidos internos de los péptidos N terminales. Dichos compuestos pueden ser i) ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBS) tal como se describe por Gevaert, lo que permite el aislamiento mediante interacciones hidrófobas ii) biotina, seguido por la eliminación posterior tras la unión con estreptavidina inmovilizada, o iii) matrices preactivadas (por ejemplo, NHS-activada, CNBr-activada, material de ECH Sefarosa o soporte de UltraLink bis-acrilamida con grupos Azlactona) seguido por centrifugación por la cual los péptidos internos unidos se separan de los péptidos N terminales acetilados, que están presentes en el sobrenadante. Posteriormente, se pueden analizar los péptidos N terminales acetilados aislados mediante una cromatografía líquida dimensional o multidimensional combinada con análisis de EM tal como se describe en lo anterior. Alternativamente, se bloquean los N terminales de las proteínas intactas con un compuesto que permite su separación específica y los péptidos internos generados tras la rotura se acetilan o bloquean con un segundo compuesto.

Adicionalmente, se puede llevar a cabo la identificación de los péptidos marcadores únicos tras digestión proteolítica usando la funcionalidad característica de la cadena latera de aminoácidos. Se puede usar una o una combinación de diferentes técnicas de afinidad que capturan los péptidos que contienen los restos de aminoácidos específicos con o sin modificación relevante de la cadena lateral de aminoácidos. Se pueden purificar los péptidos que contienen por ejemplo, cisteína, metionina, triptófano, histidina, y tirosina usando material de la columna o perlas inmovilizadas con etiquetas de afinidad específicas que capturan los péptidos que contienen estos restos de aminoácidos (Bernhard,

O.K. y col. 2003. Proteomics 3, 139-146; Chelius, D. y Shaler, T.A., 2003. Bioconjug. Chem. 14, 205-211; Gevaert, K. y col. 2002. Mol. Cell Proteomics 1, 896-903; Gygi, S.P. y col., 1999. Nat. Biotechnol 17, 994-999). Los péptidos únicos de la región variable que contienen una cisteína y una tirosina pueden por ejemplo capturarse en una columna de estreptavidina tras la biotinilación del resto de cisteína y posteriormente tras la elución de los péptidos que contienen la cisteína, se pueden aplicar éstos a cualquiera de una columna o perlas que unen específicamente los restos de tirosina. Se puede llevar a cabo esta captura del péptido basada en la afinidad con los restos de aminoácidos específicos como una dimensión adicional de las técnicas cromatográficas anteriormente descritas de tipo RP-HPLC y cromatografía de intercambio iónico. En primer lugar, las técnicas cromatográficas se aplican a una digestión proteolítica de la proteína policlonal recombinante en una o más dimensiones, a continuación se lleva a cabo la captura específica del aminoácido en una o más fracciones en una dimensión final seguido por el análisis mediante EM. El aislamiento de los péptidos basado en la funcionalidad de la cadena lateral puede llevarse a cabo además en combinación con la técnica de aislamiento de péptidos N terminales.

Cuando la proteína policlonal recombinante que se va a analizar mediante digestión proteolítica seguida por el aislamiento del péptido es una proteína multimérica, la separación de las subunidades se lleva a cabo preferiblemente antes de la proteolisis con el fin de simplificar la “huella impresa” de la digestión proteolítica. Esto puede por ejemplo llevarse a cabo mediante reducción y alquilación de los restos libres de cisteína seguido por la filtración en gel para separar las subunidades, por ejemplo, separación de las cadenas pesadas de la cadena ligera

o las cadenas alfa de las cadenas beta si la proteína policlonal es un anticuerpo o TcR, respectivamente. Alternativamente, se puede llevar a cabo la digestión proteolítica en condiciones naturales. Particularmente, para los anticuerpos, esto puede ser una alternativa adecuada, debido a que la estructura cuaternaria de un anticuerpo conduce a una elevada resistencia a la rotura proteolítica en el interior de las regiones constantes. De esta manera, la rotura proteolítica de un anticuerpo policlonal no reducido intacto es probable que genere péptidos, principalmente procedente de las regiones variables.

Las técnicas de digestión proteolítica descritas anteriormente se pueden aplicar también de acuerdo con el concepto centinela, seleccionando los péptidos centinela que se pueden caracterizar dentro de una digestión proteolítica.

Secuenciación N terminal “en masa”

Tal como se describe, se pueden aislar las secuencias N terminales y usarse para imprimir la huella de una digestión proteolítica de una proteína policlonal. Alternativamente, se puede secuenciar la secuencia N terminal directamente a partir de la proteína intacta, omitiendo por tanto la etapa proteolítica. Se puede usar el análisis de la secuencia N terminal “en masa” de una muestra de proteínas que comprende diferentes proteínas homólogas que tienen diferentes regiones variables para comparar los productos de lotes purificados de por ejemplo una proteína policlonal recombinante. Cuando la proteína policlonal es un anticuerpo policlonal recombinante o TcR la secuenciación N terminal “en masa” se lleva a cabo preferiblemente en combinaciones de las cadenas ligera y pesada separadas o de cadenas alfa y beta separadas, respectivamente. En un combinado de, por ejemplo, cadenas pesadas homólogas, algunas posiciones de aminoácidos pueden conservarse completamente mientras que otras posiciones pueden variar, esto se puede evaluar mediante la alineación de las secuencias de aminoácidos. De esta manera, se pueden obtener diversos aminoácidos diferentes durante los ciclos particulares de secuenciación. Por ejemplo, se puede representar la posición cuatro mediante 5 aminoácidos diferentes en una muestra policlonal, tal como se predetermina mediante la alineación de las secuencias homólogas. Durante el análisis de la secuencia N terminal “en masa”, se pueden cuantificar estos aminoácidos variables y las diferentes cantidades de aminoácidos individuales que representan, por ejemplo, se puede usar la posición cuatro en un anticuerpo policlonal

recombinante para comparar la composición relativa de diferentes muestras.

Caracterización de mezclas complejas de proteínas homólogas con moléculas detectoras específicas

La plataforma de caracterización de la presente invención emplea además moléculas detectoras específicas, en el que cada molécula detectora específica es capaz de identificar un miembro de proteína individual dentro de una mezcla compleja de proteínas homólogas, ayudando por tanto a la vigilancia de la presencia del miembro concreto en una muestra. Las moléculas detectoras específicas pueden ser por ejemplo ligandos específicos tales como pequeñas moléculas orgánicas, péptidos o proteínas con especificidad por un miembro individual de una proteína policlonal. En concreto, son formas de realización preferidas de la presente invención los ligandos-péptidos o proteínas tales como péptidos anti-idiotipo o anticuerpos anti-idiotipo. Es también de aplicación una molécula detectora que se une a un subconjunto definido de la mezcla compleja de proteínas homologas en la presente invención.

Se pueden usar moléculas detectoras específicas para caracterizar mezclas complejas de proteínas homólogas mediante, i) permitir la determinación de concentraciones o proporciones relativas de una o más proteínas individuales en una muestra que comprende una mezcla compleja de proteínas homólogas, ii) actuar como una dimensión adicional en los análisis cromatográficos, iii) permitir la determinación de concentraciones de proteínas individuales en las muestras obtenidas durante la fermentación de una mezcla compleja de proteínas homólogas, y iv) permitir la determinación de las células que producen proteínas individuales en una línea celular policlonal, tales como un banco celular de trabajo o una muestra celular de biorreactor, que expresan una mezcla de proteínas homólogas. Etapa iv) puede llevarse a cabo tanto sobre una línea celular policlonal como en células individuales distribuidas en tubos únicos de una línea celular policlonal seguido por un periodo de cultivo posterior.

Para la generación de péptidos-ligandos específicos capaces de identificar miembros de proteínas individuales en el interior de una mezcla compleja de proteínas homólogas, se pueden rastrear vastas bibliotecas de vectores de expresión de fagos filamentosos que muestran péptidos oligoméricos extraños en la superficie del virión, mediante afinidad, seguido por la purificación de los fagos que muestran un péptido extraño que se une con un anticuerpo, TcR u otro miembro de proteína individual deseado (Scott y Smith 1990. Science 249, 386-90). El documento EP 1 106 625 describe en concreto la generación de péptidos capaces de unirse a anticuerpos anti-RhD con objetivos de inmunización. Las bibliotecas de péptidos mostradas tienen aproximadamente entre 5 y 50 aminoácidos de longitud, y preferiblemente entre 7 y 20 aminoácidos de longitud, incluso más preferido entre 8 y 15 aminoácidos de longitud y lo más preferido entre 9 y 12 aminoácidos de longitud. Cuando se han identificado los péptidos relevantes, se pueden sintetizar.

Se conoce generalmente en la técnica la generación de anticuerpos anti-idiotipo. De manera breve, se inmunizan ratones con los anticuerpos hacia los cuales se desean anticuerpos anti-idiotipo. Se generan anticuerpos monoclonales a partir de los ratones inmunizados, que se rastrean para la producción de un anticuerpo anti-idiotipo con la especificidad deseada usando por ejemplo la tecnología del hibridoma o la presentación de fago. Los péptidos anti-idiotipo o los anticuerpos anti-idiotipo deberían caracterizarse con respecto a la especificidad y la reactividad cruzada potencial. Este análisis verificará si un péptido anti-idiotipo o anticuerpo anti-idiotipo reconocen un miembro específico o reconocen alternativamente un subconjunto de miembros estrechamente relacionados dentro de una proteína policlonal (para los anticuerpos, los miembros relacionados pueden ser por ejemplo una familia específica del gen VH).

Los péptidos/anticuerpos anti-idiotipo se pueden aplicar en ensayos de inmunodetección tales como ELISA, FLISA,

o RIA para una cuantificación directa de los miembros individuales de las proteínas (por ejemplo, un anticuerpo específico o TcR específico). Alternativamente, los péptidos/anticuerpos anti-idiotipo se pueden aplicar en cromatografía de afinidad, tanto sólo como en una primera o adicional dimensión tras otras separaciones cromatográficas tal como se ha descrito anteriormente. La inmunoprecipitación es un procedimiento adicional en el que se pueden usar moléculas detectoras para separar y caracterizar los miembros individuales de una proteína policlonal. Además, se pueden usar péptidos anti-idiotipo o anticuerpos anti-idiotipo para el aislamiento y/o la determinación de células que producen proteínas individuales en una línea celular policlonal. Las técnicas descritas por Borth, N. y col. 2000-2001. Biotechnol Bioeng. 71, 266-273 y Brezinsky, S.C. y col. 2003. J. Immunol. Methods 277, 141-155, son ambas aplicables para el aislamiento de células que producen proteínas individuales procedentes de un cultivo celular.

Potencialmente, es posible generar moléculas detectoras específicas para cada y todo miembro individual en una proteína policlonal para obtener una caracterización completa. Sin embargo, con el fin de vigilar la estabilidad de la expresión o la consistencia lote a lote, está suficientemente de acuerdo con la presente invención identificar numerosos miembros individuales, denominados así proteínas centinela, dentro de una proteína policlonal recombinante para la caracterización cuantitativa y/o cualitativa para asegurar que esta colección de miembros individuales de proteínas se expresa consistentemente y se purifica en diferentes lotes de la proteína policlonal producida de manera recombinante. Se puede usar en particular esta solución para simplificar la caracterización de un combinado complejo de moléculas de proteínas. El concepto de proteínas centinela como representativas de una proteína policlonal recombinante no se aplica sólo a la molécula detectora específica, virtualmente, cualquiera de las técnicas de caracterización anteriormente descritas o las combinaciones de éstas pueden aplicarse al concepto de

proteínas o péptidos centinela. Además, las proteínas centinelas pueden variar de técnica a técnica. Algunos miembros específicos de la proteína policlonal pueden separarse particularmente bien en función de la diferencia en sus propiedades fisicoquímicas, mientras que los péptidos anti-idiotipo con afinidad elevada son particularmente útiles para la separación de proteínas con idénticas propiedades fisicoquímicas.

En realizaciones de la presente invención, se usan una o más moléculas detectoras específicas para vigilar la proporción relativa de una o más proteínas centinela en las muestras que comprenden diferentes proteínas homólogas que tienen diferentes regiones variables. La consistencia en la proporción de una o más proteínas centinela en una serie de muestras relacionadas reflejará la estabilidad composicional en la expresión de una proteína policlonal entre lotes así como durante el tiempo en un ciclo de producción único. Además, se puede evaluar la estabilidad composicional durante el almacenamiento a largo plazo de una proteína policlonal recombinante o una mezcla de proteínas monoclonales.

En realizaciones preferidas de la presente invención, las proteínas centinela de una proteína policlonal recombinante se caracterizan por una o más de las siguientes técnicas, i) cromatografía de afinidad de péptidos/anticuerpos antiidiotipo, ii) inmunodetección con péptidos/anticuerpo anti-idiotipo, iii) aislamiento cromatográfico multidimensional de miembros intactos con respecto a sus propiedades fisicoquímicas características, y iv) mapeado peptídico proteolítico usando cromatografía y EM.

Complejidad de una mezcla de diferentes proteínas homólogas que se va a caracterizar

Una muestra que se va a caracterizar mediante la plataforma de la presente invención comprende un subconjunto definido de diferentes proteínas homólogas que tienen diferentes proteínas con regiones variables, por ejemplo una proteína o anticuerpos policlonales con diferentes regiones CDR. (por ejemplo, un anticuerpo policlonal o una mezcla de anticuerpos monoclonales) o receptores de células C con diferentes regiones CDR (por ejemplo, un TcR policlonal o una mezcla de TcR monoclonales). Es de preferencia que las diferentes proteínas homólogas que tienen diferentes regiones variables sean proteínas recombinantes. Además, se prefiere que los miembros individuales de una proteína policlonal o mezcla de proteínas monoclonales se hayan definido por una característica común tal como la actividad de unión compartida hacia una diana deseada, por ejemplo, en el caso de anticuerpos o TcR contra el antígeno diana deseado. Normalmente, una composición de proteína policlonal que se va a analizar mediante el procedimiento de caracterización de la presente invención comprende al menos 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 1000, 10º, 105 ó 106 miembros variables distintos. Normalmente, el miembro variable no único constituye más del 75 % del número total de miembros individuales en la composición de proteína policlonal. Preferiblemente, los miembros individuales no exceden más del 50 %, incluso más preferido el 25 % y lo más preferido el 10 % del número total de miembros individuales en la composición policlonal final.

En el caso de los anticuerpos, la complejidad del(de los) antígeno(s) diana, influenciará el número de miembros variables distintos en la composición de proteína policlonal que se va a caracterizar utilizando el procedimiento de la presente invención. Con dianas pequeñas o no muy complejas, por ejemplo, una proteína diana pequeña, se establecerá una composición de proteína policlonal que comprenda entre 3 y 100 miembros variables distintos para la caracterización, y se prefiere que el número de variables no exceda de 90, o incluso 80 ó 70. En muchos ejemplo, el número de variables distintas no excederá de 60 ó 50, y se prefiere que el número de variables esté en el intervalo entre 5 y 40, tal como entre 5 y 30. Mientras que para dianas más complejas, por ejemplo, virus con proteínas superficiales complejas o intercambiables, o que abarquen diversos subtipos de virus, se establecerá para caracterización una composición de proteína policlonal que comprenda entre 20 y 500 miembros variables distintos para la caracterización. Para dianas muy complejas, en las que el antígeno comprende muchas moléculas diferentes, una composición de proteína policlonal que comprenda entre 50 y 10.000 miembros variables distintos puede necesitar caracterizarse de acuerdo con la presente invención.

En una realización de la presente invención, la muestra que comprende las diferentes proteínas homólogas que tienen diferentes regiones variables es un anticuerpo policlonal. El anticuerpo policlonal puede estar compuesto de uno o más diferentes isotipos de anticuerpo, tales como los isotipos humanos IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2,

o los isotipos IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, e IgA de murino.

En una realización de la presente invención, la muestra que comprende las diferentes proteínas homólogas que tienen diferentes regiones variables es un TcR policlonal.

EJEMPLOS

En los siguientes ejemplos, para ilustrar la plataforma de caracterización estructural de la presente invención se han usado diversas composiciones de anticuerpos policlonales recombinantes anti-RhD (anti-RhD rpAb) comprendidas por diferentes miembros individuales de anticuerpos anti-RhD o las líneas celulares que producen los anti-RhD rpAb. Los anticuerpos individuales específicos de anti-RhD y las líneas celulares que los producen corresponden a lo descrito en la solicitud de patente danesa PA 2004 01133 presentada el 20 de Julio de 2004 de los actuales titulares. De manera breve, se generó una biblioteca combinatoria que mostraba fagos de las regiones variables de cadena pesada y las cadenas ligeras kappa/lambda procedentes de donantes Rhesus D-negativos inmunizados con eritrocitos RhD-positivos. Se cribó la biblioteca para los clones que producían anticuerpos anti-RhD específicos. Las

parejas génicas variables de las cadenas ligera y pesada de los fagos específicos de antígeno se transfirieron a vectores de expresión de mamífero. Los vectores de mamíferos se transfectaron individualmente en la línea celular CHO Flp-In (Invitrogen, CA), de una manera específica del sitio usando el sistema de recombinación Flp-FRT. Se identificaron las secuencias de ácidos nucleicos (nuc.) así como las de las proteínas (a.a.) de las cadenas ligeras 5 completas (LC) así como la región variable de las cadenas pesadas (VH) mediante los números de identidad de la secuencia (id sec) que se muestran en la tabla 2. Estos números corresponden a las ID DE SEC Nos en los actuales titulares de la solicitud de patente internacional PCT/DK2005/000501 titulada “ANTI-RHESUS D RECOMBINANT POLYCLONAL ANTIBODY AND METHODS OF MANUFACTURE” y presentada el 18 de Julio de 2005. Las id sec de la Tabla 2 deben distinguirse de las ID DE SEC Nos de la presente solicitud, debido a que éstas no son idénticas. 10 La región constante de las cadenas pesadas corresponde a la IgG1 humana.

Tabla 2 Lista de anticuerpos anti-RhD/clones celulares individuales usados en los siguientes ejemplos

Sinónimo

Clon/Nombre Ab Id sec nuc de VH Id sec nuc de LC Id sec a.a. de VH Id sec a.a. de LC

RhD157

Rhd157.119D11 35 91 147 203

RhD158

RhD158.119B06 36 92 148 204

RhD159

RhD159.119B09 37 93 149 205

RhD160

RhD160.119C07 38 94 150 206

RhD161

RhD161.119E09 39 95 151 207

RhD162

RhD162.119G12 40 96 152 208

RhD163

RhD163.119A02 41 97 153 209

RhD189

RhD189.181E07 42 98 154 210

RhD190

RhD190.119F05 43 99 155 211

RhD191

RhD191.119E08 44 100 156 212

RhD192

RhD192.119G06 45 101 157 213

RhD196

RhD196.126H11 49 105 161 217

RhD197

RhD197.127A08 50 106 162 218

RhD198

RhD198.127F10 51 107 163 219

RhD199

RhD199.164E03 52 108 164 220

RhD201

RhD201.164H12 54 110 166 222

RhD202

RhD202.158E07 55 111 167 223

RhD203

RhD203.179F07 56 112 168 224

Rh204

RhD204.128A03 57 113 169 225

RhD207

RhD207.127A11 60 116 172 228

RhD240

RhD240.125A09 63 119 175 231

RhD241

RhD241.119B05 64 120 176 232

RhD244

RhD244.158B10 67 123 179 235

RhD245

RhD245.164E06 68 124 180 236

RhD293

RhD293.109A09 71 127 183 239

RhD301

RhD301.160A04 79 135 191 247

RhD305

RhD305.181E06 83 139 195 251

(continuación)

RhD306

RhD306.223E11 84 140 196 252

RhD307

RhD307.230E11 85 141 197 253

RhD317

RhD317.144A02 86 142 198 254

RhD319

RhD319.187A11 87 143 199 255

RhD321

RhD321.187G08 88 144 200 256

RhD324

RhD324.231F07 90 146 202 258

EJEMPLO 1

El presente ejemplo ilustra la generación de una línea celular de fabricación policlonal, y la caracterización de la variación en el nivel de proteínas lote a lote usando una técnica cromatográfica en una dimensión y al nivel genético usando el análisis RFLP.

Establecimiento de una línea celular de fabricación para la producción de anticuerpo policlonal recombinante anti-Rhesus D

Se seleccionaron diez líneas celulares expresando cada una un anticuerpo anti-Rhesus recombinante distinto procedente de un sitio específico en su genoma (RhD157.119D11, RhD158.119B06, RhD159.119B09, RhD161.119E09, RhD163.119A02, RhD190.119F05, RhD191.119E08, RhD192.119G06, RhD197.127A08 y RhD204.128A03) y se mezclaron para constituir la línea celular de fabricación policlonal recombinante. RhD197 y RhD204 fueron clones Lambda mientras que el resto fueron clones Kappa.

Después de que los cultivos celulares que expresaban los anticuerpos anti-Rhesus individuales se adaptaron completamente al cultivo en suspensión libre de suero y se mezclaron en matraces con agitación con un número igual de células, generando por tanto una línea celular CHO-Flp-In policlonal (019). El cultivo celular mixto se centrifugó y congeló en alícuotas de 10 x 106 células/tubo.

Se descongelaron dos tubos (3948 FCW065 y 3949 FCW065) y se cultivaron individualmente durante 11 semanas en matraces de 1000 ml con agitación que contenían 100 ml de medio Excell302 libre de suero con neomicina.

Se cosechó el sobrenadante y se filtró antes de la purificación del anti-RhD rpAb.

Diversidad clonal

Se evaluó la diversidad clonal al nivel de la proteína así como al nivel del ARNm. La muestra de sobrenadante usada para analizar la composición del anticuerpo se tomó tras 9 semanas de cultivo, mientras que la muestra de células usada para analizar la composición del ARNm se tomó en la cosecha tras 11 semanas de cultivo.

Composición del anticuerpo:

El anti-RhD rpAb expresado a partir de la línea celular CHO-Flp-In policlonal (019) es un anticuerpo isotipo IgG1. Se purificó el anti-RhD rpAb procedente de ambas alícuotas (3948 y 3949) usando una columna inmovilizada con Proteína A. Los anticuerpos individuales interactuaron con la Proteína A inmovilizada a pH 7,4, mientras que las proteínas contaminantes se eliminaron de la columna por lavado. Los anticuerpos unidos se eluyeron posteriormente de la columna a un valor de pH bajo (pH 2,7). Las fracciones que contenían los anticuerpos, determinadas mediante las medidas de la absorbancia a 280 nm, se combinaron y dializaron frente a acetato de sodio 5 mM a pH 5.

Las composiciones anti-RhD rpAb obtenidas de la alícuota 3948 y la 3949 (FCW065) tras 9 semanas de cultivo se analizaron usando la cromatografía de intercambio catiónico. El anti-RhD rpAb de la Proteína A purificada se aplicó a una columna PolyCatA (4,6 x 100 mm) operada a temperatura ambiente en acetato de sodio 25 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 5,0 a un caudal de 60 ml h-1. Los componentes del anticuerpo se eluyeron posteriormente usando un gradiente lineal de cloruro de sodio 150 – 350 mM en acetato de sodio 25 mM, pH 5,0 a un caudal de 60 ml h-1.

Los componentes del anticuerpo se detectaron espectrofotométricamente a 280 nm. El cromatograma (Fig. 1) se integró posteriormente y las áreas de los picos individuales A-J se usaron para cuantificar los componentes del anticuerpo (Tabla 3). El área total de los picos se ajustó a un 100 %. El cromatograma procedente de las dos alícuotas mostró una distribución idéntica de picos, así como concentraciones similares de los componentes en cada pico. A partir de estos resultados se puede concluir que las alícuotas de la misma línea celular policlonal que crecen en condiciones idénticas producirán anti-RhD rpAb con una distribución similar de los miembros individuales del anticuerpo.

Los miembros individuales del anti-RhD rpAb se asignaron a una o más picos concretos (resumidos en la Tabla 3). Esta asignación se basa en los cromatogramas obtenidos de los anticuerpos individuales, analizados en condiciones idénticas. No se obtuvo un cromatograma individual para el RhD158 Ab, de esta manera, éste clon no se asignó a ninguno de los picos. Sin embargo, se considera probable que el pico D constituya RhD158, este anticuerpo puede 5 también representarse en alguno de los otros picos debido a la heterogeneidad. En particular, el producto del anticuerpo procedente del clon RhD197 muestra un elevado grado de heterogeneidad en el perfil IEX. El RhD190 debería ser visible a un tiempo de retención de 15,3 min. Sin embargo no fue detectable, lo que indica que este clon se perdió o se produjo alternativamente en cantidades por debajo del límite de detección en la línea celular de fabricación policlonal recombinante. La pérdida del clon RhD190 corresponde a una reducción del 10 % de la

10 diversidad que se considera aceptable con respecto a la diversidad de la composición final de anti-RhD rpAb.

Tabla 3

Pico

Cantidad de 3948 (% de área) Cantidad de 3949 (% de área) Nombre Ab Comentario

A

5,1 5,1 RhD157 Este Ab está también presente en el pico B

B

12,0 10,2 Rh157 Rh159 Rh192 Este pico representa al menos tres Ab diferentes

C

5,2 5,3 RhD191

D

1,2 0,8 (RhD158) No asignado realmente a este pico, pero es probable que sea. RhD158 puede representarse también en otros picos.

E

10,9 14,4 RhD204

F

24,3 23,0 RhD197 Este clon se divide en diversos picos, debido a la heterogeneidad

G

13,6 12,5 RhD197

H

3,3 4,0 RhD197

I

14,0 13,7 RhD161

J

10,5 10,5 RhD163

RhD190

Este Ab no se detectó

Composición de ARNm:

Se estimó la diversidad clonal dentro de la línea celular CHO-Flp-In policlonal (019) después de 11 semanas de

15 cultivo mediante el análisis de la PCR-RFLP. Brevemente, suspensiones celulares correspondientes a 200 células se sometieron a un procedimiento de congelación-descongelación y estos lisados se usaron como plantilla en una RT-PCR usando el kit de la RT-PCR One-STEP (Quiagen) con cebadores que amplifican la cadena ligera. Las secuencias del cebador fueron:

20 Cebador directo: 5’-TCTCTTCCGCATCGCTGTCT (ID DE SEC Nº 1)

Cebador inverso: 5’-AGGAAAGGACAGTGGGAGTGGCAC (ID DE SEC Nº 2)

Los productos de la RT-PCR se digirieron con Hinfl y se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa, visualizando el producto de la restricción con la tinción de bromuro de etidio (Fig. 2).

25 En la Tabla 4 se muestra el tamaño esperado de los fragmentos obtenidos mediante la digestión con Hinfl de las cadenas ligeras amplificadas mediante la RT-PCR para cada clon individual. Se indican en negrita los seis tamaños de fragmentos únicos, que se asignarían a los miembros individuales de los genes que codifican el anticuerpo anti

Rhesus D policlonal. No todos los fragmentos únicos se identificarían en el gel, estos se indican en cursiva. Esto, sin embargo, no impide necesariamente que estos clones estén representados realmente en el cultivo, debido a que los fragmentos pueden tanto no haberse separado suficientemente de los otros fragmentos para ser identificables, como alternativamente, que la concentración ha sido demasiado débil en comparación con las bandas que aparecen más fuertes. Esto puede ser más pronunciado para los fragmentos más cortos, debido a que se unen a un número más pequeño de moléculas de bromuro de etidio y por tanto son menos visibles.

Tabla 4

RhD nº

157 158 159 161 163 190 191 192 197 204

825

671 505 696 505 502 475 671 743 521

Tamaño del fragmento Hinfl

138 138 320 138 166 191 268 149 138 167

76

126 138 126 154 138 138 138 85 138

76

77 76 138 126 85 76 76 88

22

76 76 76

Las dos alícuotas (3948 y 3949) de la misma línea celular policlonal, mostraron un modelo de expresión similar en el gel, aunque la intensidad de las bandas no fue completamente idéntica. Esto indica que las alícuotas de la misma línea celular policlonal que crecen en condiciones idénticas, producirán anti-RhD rpAb con una diversidad clonal similar.

Resumen

Diez líneas celulares expresando cada una un anticuerpo anti-RhD monoclonal se mezclaron con el fin de generar una línea celular de fabricación de anti-RhD rpAb, que después de 9 semanas de cultivo mantuvieron todavía un 90 % de la diversidad inicial. Tras 11 semanas de cultivo, se identificaría sin ambigüedad el ARNm de seis clones diferentes y otros diversos clones están probablemente representados en la banda en aproximadamente 500 pb.

El hecho de que dos alícuotas de las líneas celulares CHO-Flp-In policlonales (019) mostraran resultados similares con respecto a la diversidad clonal, ilustra que se pueden obtener resultados reproducibles entre diferentes lotes.

EJEMPLO 2

El presente ejemplo ilustra la caracterización de un cultivo celular policlonal con 8 miembros en el tiempo. Se evaluó la diversidad clonal del cultivo al nivel genético usando el análisis RFLP y al nivel de la proteína usando una técnica cromatográfica en una dimensión

Análisis RFLP para estimar la diversidad clonal en cultivos celulares policlonales.

Se estimó la distribución de los clones individuales en un cultivo celular policlonal que expresaba ocho anticuerpos diferentes anti-Rhesus D mediante el análisis RFLP terminal (T-RFLP) de los productos de la RT-PCR derivados de la línea celular policlonal. En el procedimiento T-RFLP el(los) cebador(es) directo y/o inverso se marca(n) fluorescentemente y por tanto, una proporción de los fragmentos de restricción generados a partir de los amplicones contendrá la marca. Los fragmentos marcados se pueden separar posteriormente mediante electroforesis capilar y detectarse mediante fluorescencia. El análisis se puede llevar a cabo en las secuencias que codifican la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada, dependiendo de los cebadores aplicados.

De manera breve, una suspensión celular correspondiente a 200 células se lavó una vez en PBS y se sometió al procedimiento de congelación-descongelación generando lisados usados como plantilla en una amplificación de la RT-PCR usando un kit de la RT-PCR One-Step (Quiagen) y los cebadores adecuados.

Se llevó a cabo la RT-PCR en un ciclador térmico estándar con las siguientes condiciones: Hibridación 60º C durante 30 s Alargar 72º C durante 5 min Fin del bucle cíclico Alargar 72º C durante 15 min Terminación 8º C siempre

Transcripción inversa

55º C durante 30 min

Desnaturalizar

95º C durante 15 min

Inicio del bucle cíclico (35 ciclos)

Desnaturalizar

95º C durante 30 s

Para el análisis de la cadena ligera se usaron los siguientes cebadores para la amplificación de la RT-PCR. Se marcó el cebador inverso con 6-carboxifluoresceína (FAM) y las secuencias de los cebadores fueron como sigue:

5 VL Cebador directo: 5’-TCTCTTCCGCATCGCTGTCT (ID DE SEC Nº 1) CL Cebador inverso: 5’-FAM-AGGAAAGGACAGTGGGAGTGGCAC (ID DE SEC Nº 2)

Se digirieron veinte 1l del producto de la RT-PCR con 1 U de NheI, 1 U de PstI y 1 U de Hinfl (todos de New England Biolabs) en NEB1 durante 2 horas.

10 Los fragmentos marcados se detectaron mediante electroforesis capilar con fluorescencia en un ABI3700 (Applied Biosystems) en el Statens Serum Institute, Copenhague, DK

En la Tabla 5 se muestran los fragmentos esperados para cada uno de los clones celulares que producían el anticuerpo anti-RhD y los fragmentos marcados con FAM se indican en negrita.

Tabla 5

RhD nº

191 196 201 203 244 306 319 324

Tamaño del fragmento NheI/Pstl/Hinfl

475 696 516 422 690 682 761 513

210

138 166 318 138 138 138 166

138

76 138 138 76 76 76

138

76

67 76 76 67 67 67 76

67

59 76 67 41 59 76

58

67 18 18 17 67

18

En la Figura 3 se muestra el modelo T-RFLP y los ocho clones que producían el anticuerpo anti-Rhesus D se han asignado a picos específicos. Bajo la suposición de que no hubo competición molde/cebador durante la RT-PCR, el área relativa del pico corresponderá a la cantidad relativa de ARNm transcrito de cada gen de cadena ligera del anticuerpo representado en la línea celular policlonal.

20 Para el análisis de la región variable de la cadena pesada dentro de la misma línea celular policlonal, se llevó a cabo la amplificación de la RT-PCR con los cebadores específicos de VH. Las secuencias de los cebadores fueron como sigue:

VH Cebador directo: 5’-FAM CGTAGCTCTTTTAAGAGGTG (ID DE SEC Nº 3)

25 VH Cebador inverso: S’-HEX-ACCGATGGGCCCTTGGTGGA (ID DE SEC Nº 4)

Se digirieron veinte 1l del producto de la RT-PCR con 1 U de RsaI y 1 U de NdeI (todos de New England Biolabs) en WEB2 durante 2 horas.

Los fragmentos marcados se detectaron mediante electroforesis capilar con fluorescencia en un ABI3700. Se llevó a cabo el análisis por el Statens Serum Institute, Copenhague, DK.

En la Tabla 6 se muestran los modelos T-RFLP esperados, en los que los fragmentos marcados con FAM se muestran en negrita y los fragmentos marcados con HEX (succinimidil éster de 6-carboxi-2’,4,4’,5,7,7’hexaclorofluoresceína) están subrayados.

Tabla 6

RhD nº

191 196 201 203 244 306 319 324

203

429 186 350 435 328 232 266

Tamaño del fragmento RsaI/NdeI

166 142 88 79 118 157

63

79 22 79

22

9 9

9

Se cultivó la línea celular policlonal durante 5 semanas y se tomaron muestras una vez a la semana para los análisis T-RFLP. Se llevó a cabo el análisis sobre la cadena pesada variable, pero también se podría haber llevado a cabo sobre la cadena ligera si se deseara.

Tras la electroforesis capilar de los fragmentos de restricción, se integraron las áreas relativas de los picos y se usaron para estimar la diversidad clonal del cultivo celular policlonal. En la Figura 5 se muestran las cantidades relativas en el tiempo.

Basándose en estos resultados, parece que RhD196 aumenta mientras parece que RhD203 disminuye en el tiempo. Las cantidades de los otros clones son bastante estables durante el periodo de cultivo y se podrían detectar los ocho ADNc después de cinco semanas de cultivo.

Llevando a cabo T.RFLP en la cadena ligera y la cadena pesada así como en el ARNm y el ADN debería ser posible obtener una huella impresa de la diversidad clonal dentro del cultivo celular policlonal, por ejemplo en las células en el límite de la edad celular in vitro o en cualquier momento dado durante el cultivo.

Se puede usar por tanto la técnica para vigilar la estabilidad de la diversidad clonal en un cultivo celular en el tiempo durante la producción del anticuerpo. Se puede aplicar también la técnica para vigilar la consistencia lote a lote por ejemplo de diferentes ampollas congeladas del mismo banco celular de trabajo (pWCB) o en células cosechadas tras dos o más ciclos de fabricación.

Análisis cromatográfico de intercambio catiónico para estimar la diversidad clonal en un cultivo celular policlonal

El anti-RhD rpAb producido a partir del mismo cultivo celular policlonal que se usó en el análisis T-RFLP descrito anteriormente se analizó usando la cromatografía de intercambio catiónico. La proteína A purificada de manera recombinante que produjo el anticuerpo policlonal se aplicó a una columna PolyCatA (4,6 x 100 mm) en acetato de sodio 25 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 5,0 a un caudal de 60 ml h-1 operada a temperatura ambiente. Los componentes del anticuerpo se eluyeron posteriormente usando un gradiente lineal de cloruro de sodio 150-350 mM en acetato de sodio 25 mM, pH 5,0 a un caudal de 60 ml h-1. Los componentes del anticuerpo se detectaron espectrofotométricamente a 280 nm y el cromatograma se integró posteriormente y a continuación se usó el área de los picos individuales para cuantificar los componentes del anticuerpo. En la Figura 6, se muestran las cantidades relativas en el tiempo.

Resumen

Los resultados obtenidos al nivel genético mediante el análisis RFLP y al nivel de proteínas mediante la cromatografía de intercambio catiónico son comparables. La Figura 5 y la 6 ilustran claramente que la mayor parte de los clones individuales en la línea celular policlonal así como los anticuerpos individuales del anticuerpo policlonal expresado a partir de la línea celular sigue las mismas tendencias durante las 5 semanas de cultivo. De esta manera, los análisis al nivel genético así como al de las proteínas son equivalentes buenos para evaluar la diversidad composicional de una línea celular al nivel genético de la proteína policlonal recombinante producida a partir de la línea celular.

EJEMPLO 3

El presente ejemplo ilustra la caracterización en el tiempo de un cultivo celular policlonal con veinticinco miembros.

Se evaluó la diversidad clonal del cultivo al nivel genético usando el análisis T-RFLP y al nivel de las proteínas usando una técnica cromatográfica en una dimensión

Análisis T-RFLP de la parte variable de los genes de cadena pesada derivados de un cultivo celular policlonal que expresa veinticinco anticuerpos diferentes anti-Rhesus D durante un periodo de cultivo de 5 semanas.

5 El cultivo celular policlonal examinado en el presente ejemplo estaba compuesto por una mezcla de cultivos celulares que expresaban veinticinco anticuerpos diferentes anti-Rhesus D (generados tal como se describe en el Ejemplo 1). El cultivo celular policlonal se cultivó durante 5 semanas y se tomaron muestras una vez a la semana para los análisis T-RFLP.

Se llevó a cabo la RT-PCR con los cebadores específicos de VH descritos en el Ejemplo 2 y se llevó a cabo 10 igualmente la fragmentación de restricción.

El T-RFLP de las veinticinco secuencias diferentes que codifican anti-Rhesus D dará como resultado, si están presentes todos los genotipos, diecisiete fragmentos diferentes marcados con FAM. Algunos fragmentos representan hasta tres genotipos diferentes mientras que otros representarán un genotipo único. En la Tabla 7 se muestran los tamaños esperados de los fragmentos marcados con FAM junto con las cantidades relativas de los

15 diferentes fragmentos marcados con FAM. Además, en la Figura 4 se muestra un ejemplo de un perfil T-RFLP.

Tabla 7 Fue posible separar los fragmentos de restricción hasta una extensión que permitió que se obtuviera información de doce clones individuales de los veinticinco clones que constituían la línea celular. Las fracciones restantes podrían someterse potencialmente a la secuenciación con el fin de obtener más información de los clones restantes.

RhD nº

Tamaño del fragmento RsaI/NdeI marcado con FAM (pb) Grupo Semana 1 % de área Semana 2 % de área Semana 3 % de área Semana 4 % de área Semana 5 % de área

RhD157

63 1 9,5 5,0 5,3 4,8 4,6

RhD159

63 1

RhD191

63 1

RhD319

118 2 0,8 0,2 0,2 0,2 0,0

RhD201

186 3 1,5 0,8 0,9 1,1 0,7

RhD192

187 3

RhD199

203 4 0,9 0,3 0,3 0,4 0,4

RhD162

260 5 7,4 3,6 1,7 1,0 0,0

RhD324

266 6 1,0 0,8 0,6 0,5 0,0

RhD306

328 7 10,3 8,0 7,2 7,9 7,8

RhD203

350 8 6,0 3,4 3,8 5,9 8,9

RhD305

350 8

RhD197

356 9 5,1 1,8 1,7 1,8 1,3

RhD202

359 10 3,8 4,3 5,6 5,2 3,7

RhD240

369 11 3,3 1,8 1,3 0,8 0,0

RhD207

414 12 11,7 10,5 10,1 9,9 11,1

RhD160

426 13 11,3 17,1 17,5 18,1 17,2

RhD293

426 13

RhD196

426 13

RhD245

429 14 6,5 7,1 8,3 11,0 16,8

RhD321

432 15 6,8 9,4 8,3 7,5 4,9

(continuación)

RhD241

435 16 4,8 13,7 12,5 7,2 4,0

RhD189

438 17 9,4 12,3 14,8 16,8 18,7

RhD301

438 17

RhD317

438 17

5 Análisis cromatográfico de intercambio catiónico para estimar la diversidad clonal en un cultivo que expresa veinticinco anticuerpos diferentes anti-Rhesus D

El anti-RhD rpAb producido a partir del mismo cultivo celular policlonal que se usó en el análisis T-RFLP descrito anteriormente, se analizó usando la cromatografía de intercambio catiónico. La proteína A del anticuerpo policlonal producido de manera recombinante se aplicó a una columna PolyCatA (4,6 x 100 mm) en acetato de sodio 25 mM, 10 cloruro de sodio 150 mM, pH 5,0 a un caudal de 60 ml h-1 operada a temperatura ambiente. Los componentes del anticuerpo se eluyeron posteriormente usando un gradiente lineal de cloruro de sodio 150 -350 mM en acetato de sodio 25 mM, pH 5,0 a un caudal de 60 ml h-1. Se detectaron los componentes del anticuerpo espectrofotométricamente a 280 nm y se integró el cromatograma posteriormente y se usó el área de los picos individuales para cuantificar los componentes diferentes del anticuerpo. La Figura 7 muestra el cromatograma 15 producido a partir de la muestra obtenida en la semana 4, los picos que contenían el anticuerpo se numeraron desde 1 a 25. Es una verdadera casualidad que el cromatograma contenga un número idéntico de picos que el número de anticuerpos individuales en el anticuerpo policlonal analizado. La Tabla 8 muestra el contenido relativo en porcentaje de los componentes totales del anticuerpo (AC1 a 25), así como la representación de los anticuerpos individuales en cada componente del anticuerpo (pico). La asignación de los anticuerpos individuales a los picos cromatográficos

20 integrados se basó en los tiempos de retención y los modelos de picos obtenidos de los anticuerpos monoclonales analizados usando la cromatografía de intercambio catiónico en condiciones idénticas.

Tabla 8

Pico

RhD nº Ab representado Semana 1 % de Área Rel. Semana 2 % de Área Rel. Semana 3 % de Área Rel. Semana 4 % de Área Rel. Seman a 5 % de Área Rel.

AC1

293, 319 2,06 2,3 1,7 1,06 0,81

AC2

157, 293 3,63 3,83 3,97 3,89 3,06

AC3

157, 192 2,66 2,8 2,89 2,83 2,34

AC4

159, 189, 199 6,11 5,52 5,1 4,1 2,99

AC5

319 2,18 1,94 1,33 1,08 1,26

AC6

241, 191 6,01 6,4 6,32 5,42 4,1

AC7

189, 192, 199, 201 3,89 4,21 3,38 2,95 2,63

AC8

160 12,1 15,77 18,71 17,59 15,56

AC9

203, 191 2,65 3,89 3,69 3,99 4,14

AC10

162, 202 6,78 10,22 13,52 12,29 9,75

AC11

203, 306, 301 2,86 3,63 4,35 3,66 3,92

AC12

245 1,43 1,63 1,5 2,27 2,02

(continuación)

AC13

301, 321 2,5 3,35 3,92 4,16 3,64

AC14

305 2,44 2,61 3,12 4,23 6,07

AC15

196, 197, 240, 305, 321 8,33 7,22 7,36 8,49 4,01

AC16

197 3,82 2,71 2,15 1,86 7,86

AC17

196, 240, 324 7,57 5,12 4,86 6,89 7,79

AC18

197, 321 2,27 1,44 1,51 1,39 2,83

AC19

196,240 3,8 2,63 2,87 3,98 6,35

AC20

317 4,58 1,39 0,77 0,71 0,86

AC21

317 2,86 0,59 0,36 0,83 0,42

La cromatografía de intercambio catiónico separa los miembros individuales del anticuerpo de un anticuerpo policlonal basándose en las diferencias en la carga neta entre los miembros individuales y separa además las formas de anticuerpos individuales que aparecen con carga heterogénea. Se representaron por tanto diversos anticuerpos en un pico único, por ejemplo, AC1, que contenía RhD293 y RhD319 (véase la Tabla 8) y algunos anticuerpos individuales se representaron además en diversos picos cromatográficos, por ejemplo, RhD319, que está presente en AC1 y 5 (véase la Tabla 8).

Los picos que contienen más de un anticuerpo individual se someterían a técnicas de caracterización química de proteínas adicionales, tales como el análisis cuantitativo con péptidos anti-idiotipo, mapeado peptídico proteolítico, secuenciación N terminal, o una cromatografía con una segunda dimensión.

Resumen

El presente ejemplo ilustra el uso combinado de los análisis T-RFLP y la cromatografía de intercambio catiónico para evaluar la distribución de los transcriptos primarios y de los componentes del anticuerpo, respectivamente, durante un periodo de cultivo. El análisis T-RFLP permite la identificación única de 12 clones individuales de los 25 clones expresados en la línea celular policlonal y en el presente ejemplo se ilustra que estos 12 clones podrían detectarse durante 4 semanas de cultivo con el análisis T-RFLP. Potencialmente, podrían detectarse más clones mediante el análisis de la secuencia de los fragmentos que representan más de un clon. Se analizó la distribución de los componentes del anticuerpo usando la cromatografía de intercambio catiónico y en el presente ejemplo parece que la distribución de los 25 componentes analizados es relativamente estable durante el cultivo. Aunque es difícil la identificación única de todos los anticuerpos individuales debido a la naturaleza heterogénea de la carga inherente de los anticuerpos expresados, se demostró en el presente ejemplo que el componente 8 del anticuerpo que representa el anticuerpo Rhd160 mostró un nivel muy elevado del anticuerpo durante el periodo de cultivo de acuerdo con los valores altos de T-RFLP obtenidos para el grupo 13 que representa los clones RhD160, 293, y 196. Además, el componente RhD207, que se identificaría únicamente mediante T-RFLP así como mediante cromatografía de intercambio catiónico, mostró niveles T-RFLP del 10-11 % y niveles ligeramente inferiores de 5,510 % obtenidos al nivel del anticuerpo. Globalmente, las dos técnicas conjuntas demuestran una producción relativamente estable al nivel del ARNm y el anticuerpo durante el cultivo; sin embargo, podrían también observarse discrepancias potenciales entre las dos técnicas, ilustradas por la pérdida aparente de la transcripción de algunos clones a las 5 semanas de cultivo en contraste con los resultados obtenidos al nivel del anticuerpo. De esta manera, el presente ejemplo justifica el uso complementario de ambas técnicas para definir los intervalos de cultivo dentro de los cuales se puede obtener la producción estable del complejo de proteína policlonal.

EJEMPLO 4

El presente ejemplo ilustra un análisis composicional de un anticuerpo anti-RhD policlonal con diez miembros individuales derivados de un cultivo celular policlonal. Se evaluó la diversidad de la muestra del anticuerpo policlonal usando la cromatografía líquida bidimensional que separó los anticuerpos basándose en las diferencias en su carga neta y la hidrofobia, usando el intercambio catiónico en la primera dimensión y la fase inversa (RP)-HPLC en la segunda dimensión, respectivamente.

Se derivó una muestra de anticuerpo anti-RhD policlonal con diez miembros individuales de un cultivo celular policlonal. El anti-RhD rpAb se purificó a partir del sobrenadante usando una columna de proteína A (columna de Proteína A HiTrapTM, Amersham Biosciences GE Healthcare, Inglaterra).

Se ejecutó la primera dimensión aplicando el anticuerpo policlonal purificado sobre una columna WCE10 de ProPac

(4 x 250 mm) en acetato de sodio 25 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 5,0 a un caudal de 60 ml h-1 operada a temperatura ambiente en un sistema Ettan LC (Amersham Biosystems, GE Healthcare, Inglaterra). Los componentes del anticuerpo se eluyeron posteriormente usando un gradiente lineal de NaCl de 150 a 350 mM en acetato de sodio 25 mM, pH 5,0 a un caudal de 60 ml h-1. Los componentes del anticuerpo se detectaron espectrofotométricamente a 280 nm y las fracciones correspondientes a picos concretos se recogieron y se concentraron adicionalmente antes del análisis mediante RP-HPLC.

Las fracciones indicadas en la Fig. 8 se separaron adicionalmente en una segunda dimensión usando la RP-HPLC. La segunda dimensión se llevó a cabo en un sistema Summit HPLC (Dionex, CA) usando una columna Zorbax Poroshell 300SB-C8 (2,1 x 75 mm (5 1m), y el sistema HPLC se configuró tal como se recomendaba en las instrucciones de la columna Poroshell (Agilent Technologies, CA). Los componentes del anticuerpo se recogieron de la cromatografía de intercambio catiónico y se aplicaron sobre la columna (5 1l) en CH3CN al 10 %, TFA al 0,1 %, PEG al 0,3 % a un caudal de 120 ml h-1 y se eluyeron mediante un gradiente lineal de CH3CN al 90 %, TFA al 0,08 %, PEG al 0,3 %. La columna se operó a 70º C. Todas las muestras de componentes del anticuerpo dieron como resultado cromatogramas con uno o dos picos estrechos. En la Fig 9 se muestra el perfil RP-HPLC de un componente B5 del anticuerpo.

Resumen

Debido a que la cromatografía de intercambio catiónico en la primera dimensión separa los anticuerpos individuales que difieren en la carga neta así como los anticuerpos individuales que aparecen con carga heterogénea, se pueden representar diversos anticuerpos en un pico único.

Se separaron diversos componentes del anticuerpo dando como resultado un perfil más bien complejo tal como se muestra en la Fig. 8. Como se ilustró en el Ejemplo 2 y el 3 es posible identificar los componentes individuales en cada pico mediante un análisis comparativo con anticuerpos monoclonales analizados en condiciones idénticas. Esto no se llevó a cabo, sin embargo, en el presente experimento debido a que el objetivo fue proporcionar una huella impresa para la comparación de la muestras entre sí sin tener que asignar cada anticuerpo monoclonal en el rpAb. De esta manera, la combinación del intercambio catiónico seguido por la RP-HPLC genera datos de dos dimensiones, y se pueden construir mapas detallados de proteínas codificadas en color (software ProteoVue, Eprogen, EE.UU), tal como se ilustra en la Fig 10, para la evaluación de la consistencia lote a lote, sin la necesidad de analizar los anticuerpos monoclonales para caracterizar los miembros individuales del complejo rpAb.

EJEMPLO 5

El presente ejemplo ilustra la caracterización de un anticuerpo anti-RhD policlonal con ocho miembros individuales derivados de un cultivo celular policlonal. Se evaluó la diversidad del anticuerpo policlonal usando el análisis de la secuencia N terminal “en masa”.

Se muestran a continuación en la Tabla 9 las secuencias N terminales de los miembros individuales presentes en la muestra de anticuerpo anti-RhD policlonal que se analizaron en el presente ejemplo. Se muestran en cursiva las secuencias de la cadena ligera Lambda.

Tabla 9

RhD nº

Secuencias N terminales para HC Secuencias N terminales para LC

191

QVQLVESG (ID DE SEC Nº 5) EIVLTQS (ID DE SEC Nº 7)

306

QVQLVESG (ID DE SEC Nº 5) EIVLTQS (ID DE SEC Nº 7)

201

QVQLVESG (ID DE SEC Nº 5) EIVLTQS (ID DE SEC Nº 7)

196

QVQLVESG (ID DE SEC Nº 5) DIQMTQS (ID DE SEC Nº 8)

244

QVQLVESG (ID DE SEC Nº 5) DIQMTQS (ID DE SEC Nº 8)

324

EVQLVESG (ID DE SEC Nº 6) EIVLTQS (ID DE SEC Nº 7)

319

QVQLVESG (ID DE SEC Nº 5) QTVVTQE (ID DE SEC Nº 9)

203

EVQLVESG (ID DE SEC Nº 6) QSALTQP (ID DE SEC Nº 10)

Se analizó el anti-RhD rpAb de la proteína A purificada mediante reducción con SDS-PAGE (NuPAGE 4-12 %). Los polipéptidos se electrotransfirieron sobre una membrana PVDF y se tiñeron posteriormente con Azul de Coomasie de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Una banda de aproximadamente 53 kDa correspondiente a la cadena pesada (HC) y dos bandas de aproximadamente 25 y 30 kDa correspondientes a las cadenas ligeras Kappa y Kappa + Lambda, respectivamente, fueron claramente visibles en la membrana PVDF teñida con azul de Coomasie. Se cortaron estas bandas y se sometieron al análisis de la secuencia N terminal, usando un secuenciador de proteínas ABI Procise (Applied Biosystems, CA) y programas estándares. En la Tabla 10 a continuación se resumen los resultados de la secuenciación.

Tabla 10

Ciclo nº

HC LC (~ 25 kDa) LC (~ 30 kDa)

1

Q, E E, D E, D, Q

2

V I I, T

3

Q V, Q V, Q

4

L L, M L, M, V

5

V T T

6

E Q ND

7

S S ND

ND = No determinado

Las secuencias para las HC son idénticas excepto para el primer resto, mientras que las LC de Kappa se conservaron para el resto dos, cinco, seis y siete y las LC de Lambda se conservaron para el resto uno, cinco y seis (véase la Tabla 9).

El resultado obtenido para la secuenciación de la HC está de acuerdo con las secuencias esperadas que se presentan en la Tabla 10. Los datos de las secuencias de la banda LC de Kappa de ~ 25 kDa indicaron la presencia de anticuerpos con la secuencia N terminal EIVLTQS (ID DE SEC Nº 7), correspondiente a RhD191, 324, 201, y 306, y los anticuerpos con la secuencia N terminal DIQMTQS (ID DE SEC Nº 8) correspondiente a RhD244 y 196. Con la técnica presente no fue, sin embargo, posible, evaluar si todos los miembros individuales estuvieron presentes en la muestra de anticuerpo policlonal. La secuenciación de la banda LC de ~ 30 kDa indicó la presencia del anticuerpo RhD319 juzgada por la presencia de una Val en el ciclo tres y cuatro. No se obtuvo evidencia de la presencia del anticuerpo RhD203 (sin S y A en el ciclo dos y el tres, respectivamente). Sin embargo, la cromatografía de intercambio iónico y el análisis de la secuencia N terminal de este anticuerpo monoclonal recombinante sugieren fuertemente que la LC de RhD203 tiene un término N bloqueado parcialmente. De esta manera, no se puede determinar de manera concluyente mediante el análisis de la secuencia N terminal si este anticuerpo está presente o no en la mezcla analizada. Además, parece que la banda de 30 kDa contiene también alguna LC de Kappa, debido a que los restos E y D están presentes en el ciclo uno y el resto M presente en el ciclo 4.

En resumen, el análisis de la secuencia N terminal en masa se puede usar para identificar la presencia de anticuerpos individuales si difieren en sus secuencias tanto en la HC como en la LC y no están bloqueados en la N terminal. Este procedimiento es cuantitativo siempre que los términos N de los polipéptidos individuales no estén parcialmente bloqueados.

EJEMPLO 6

El presente ejemplo ilustra la caracterización de un anticuerpo anti-RhD policlonal con ocho miembros individuales derivado de un cultivo celular policlonal. Se analizó la diversidad del anticuerpo aislando péptidos marcadores únicos que se originaban de la región variable usando tanto la RP-HPLC como la cromatografía de intercambio iónico (IEX) para la separación de péptidos.

Generación de péptidos mediante digestión de cadenas pesadas y cadenas ligeras aisladas

Se purificó una muestra de anticuerpo anti-RhD policlonal con ocho miembros individuales a partir del sobrenadante de un cultivo celular policlonal mediante cromatografía de afinidad usando columnas de Proteína A HiTrap. Se disolvió el material liofilizado en clorhidrato de guanidinio 6 M, EDTA 0,5 M, Tris HCl 0,2 M, pH 8,4, se redujo (DTT) y se carboximetiló (ácido yodoacético). Las cadenas pesadas y las cadenas ligeras se separaron mediante filtración en gel en una columna Superose 12 (10/300 de Amersham Biosciences, GE Healthcare) en HCl de Guanidinio 6 M, fosfato de sodio 50 mM, pH 8,4 en un sistema Ettam LC (Amersham Biosciences, GE Healthcare, Inglaterra). La HC separada (~ 3,5 mg/ml) y la LC (6,5 mg/ml) se digirieron con Endoproteinasa Asp-N (Roche, 1 054 589) en un enzima hasta una concentración del sustrato de 1:500 en fosfato de sodio, pH 8

Aislamiento de péptidos únicos mediante RP-HPLC

Alícuotas de digestiones de Asp-N individuales de la HC y LC aisladas obtenidas de la muestra de anticuerpo policlonal se aplicaron a un sistema 1100 LC/MSD SL de Agilent equipado con una columna 5 1m Zorbax 300SB-C18 (2,1 x 150 mm) conectada a una columna de guarda (Zorbax 300SB-C8, 2,1 x 12,5 mm, 5 1m) equilibrada en TFA al 0,1 % usando un caudal de 0,2 ml/min. Se eluyeron los péptidos usando un gradiente lineal de TFA al 0,08 %,

5 acetonitrilo al 70 %. Se detectaron los péptidos espectrofotométricamente a 220 nm y se analizaron mediante EM en línea (ionización por electropulverización a presión atmosférica (API)). Se añadió una mezcla de ácido propiónico al 75 %/isopropanol al 25 % después de la columna en la fase móvil para aumentar la señal. Se analizaron los espectros de masas obtenidos usando el software Chemstation (Agilent Technologies, CA) y el software BioLynx (Micromass, Waters Corporation, MA).

10 En las Tablas 11 y 12 se resumen los resultados de los análisis de EM de las digestiones de Asp-N de la HC y la LC, respectivamente. Ambas tablas indican las masas teórica y detectada que se proporcionan como masas promedio.

Tabla 11: Resultados para la cadena pesada

RhD nº

Péptidos Masa teórica (Da) Masa encontrada (Da Índice HPLC teórico Tiempo de retención (min)

191

D2 D8 5891,6 4208,8 5891,3 4208,4 156,5 133,8 137,0 110

196

D1 D1-2 D7 5795,6a* 6297,1* 4196,7b 5795,1 6296,7 4196,4 196,7 179,1 114,6 161,7 158,0 98,1

201

D6 D1 4196,7b 5710,5* 4196,4 5709,5 114,6 184,8 98,1 159

203

D1 D6 5840,6 4196,8b 5840,4 4196,5 188,0 111,2 156,3 95,1

244

D1 D1-2 D7 5795,6a* 6644,5* 4196,7b 5795,1 6644,0 4196,4 194,9 210,5 114,6 161,7 171,2 98,1

306

D1 D1-2 D8 5795,6a* 6694,5* 4168,6 5795,1 6693,9 4168,4 196,7 198,2 118,4 161,7 162,5 94,7

319

D1 D1-2 D7 5809,6* 6659,5* 4196,7b 5809,2 6659,1 4196,4 201,6 191,5 114,6 162,5 159,6 98,1

324

D1 D1-2 5919,8 6729,7 4224,8 5919,4 6729,3 4224,6 183,7 181,7 111,3 146,3 166,5 96,1

a

Péptidos diferentes con la misma masa. b péptidos (cuatro idénticos y uno diferente) con aproximadamente la misma masa. * Indica una Gln ciclada N terminal (PyroGlu)

Tabla 12: Resultados para la cadena ligera

RhD nº

Péptidos Masa teórica (Da) Masa encontrada (Da Índice HPLC teórico Tiempo de retención (min)

191

d1 d1-2 d1-4 d1-6 d5-6 6537,3 7530,3 10281,4 13719,3 3455,9 6537,2 7530,2 10281,1 13718,8 3455,5 167,5 168,9 259,0 367,2 114,8 74,2 71,7 91,0 109,8 95,1

196

d2 d3 7151,0 4649,2 7150,7 4648,8 186,6 150,4 93,9 84,8

201

d1 8504,5 8504,1 229,7 82,5

203

d5 6356,1 6355,6 168,5 90,6

244

d2-3 d4 7165,1 4520,1 7164,7 4520,0 180,5 122,2 88,2 75,2

306

d1-d2 d1-d5 d2 6565,6 11727,2 3206,7 6565,2 11726,8 3206,5 231,7 380,0 152,9 90,2 105,2 80,3

319

d1 parte de d1 (783) 8668,7* 8029,0 8668,2 8028,6 255,1 246,8 85,2 84,3

324

d1 d2 8518,5 4862,5 ND ND 232,8 164,2 ND ND

Tal como se observa en la Tabla 11, se pueden identificar trece péptidos de la HC variable y dieciséis péptidos de la LC variable como péptidos marcadores únicos y algunos péptidos de la región variable de HC (por ejemplo D1 de 5 RhD196, RhD244 y RhD306 indicados por a) tienen la misma masa, y de esta manera, estas masas no se pueden asignar sin ambigüedad. Sin embargo, debido a que se pueden asignar otras masas sin ambigüedad a péptidos únicos en todos los casos de identificación positiva de los ocho anticuerpos que se han obtenido. Para la LC, se han asignado péptidos únicos para siete de los ocho anticuerpos (Tabla 12). El anticuerpo del cual se carece de información para la LC fue RhD324. De esta manera, los datos combinados de EM de la HC y LC demuestran que

10 podrían identificarse los ocho anticuerpos en la muestra de anti-RhD basándose en la detección de los péptidos únicos de cada uno de los anticuerpos.

Aislamiento de péptidos únicos mediante cromatografía de intercambio catiónico

Se separaron las digestiones de Asp-N de la HC y la LC mediante cromatografía de intercambio catiónico fuerte como sigue: alícuotas de las digestiones de Asp-N individuales de la HC y la LC aisladas obtenidas del anticuerpo

15 policlonal, tal como se describe anteriormente, se aplicaron en una columna PolySulfoethil A (2,1 x 100 mm) equilibrada en fosfato de potasio 10 mM, acetonitrilo al 20 % (v/v), pH 3,0 usando un caudal de 0,2 ml/min a temperatura ambiente en un sistema Ettan LC (Amersham Biosciences, GE Healthcare, Inglaterra). Los péptidos se eluyeron posteriormente usando un gradiente lineal de cloruro de potasio de 0 – 500 mM en fosfato de potasio 10 mM, acetonitrilo al 20 % o 30 % (v/v), pH 3,0. Los péptidos eludidos se detectaron espectrofotométricamente a 215

20 nm y se recogieron las fracciones basándose en el fraccionamiento temporal. Se mezclaron alícuotas de las fracciones (1 1l) con 1 1l de una solución de ácido a-ciano-4-hidroxicinámico (20 mg/ml) en acetonitrilo al 70 %/30 %, TFA al 0,1 % y se aplicaron sobre la diana EM y se lavaron con TFA al 0,1 %. Las muestras se analizaron mediante MALDI-TOF en un Autoflex TOF (Bruker Daltronics, Bremen, Alemania), y se llevó a cabo la calibración de la masa externa usando mezclas de calibración de Bruker Daltronics (Bremen, Alemania). Se analizaron los espectros

25 MALDI (búsqueda de masa y calibración interna) usando el software GPMAW 6.1 (Lighthouse data, Odense, Dinamarca).

En la Fig. 11 se muestra un cromatograma representativo que contiene diversos picos de la digestión de Asp-N de la LC. En la Tabla 13 y la 14 se muestran los resultados del análisis MALDI-TOF de las fracciones de las digestiones de Asp-N de la LC y la HC, respectivamente. Las masas teóricas y encontradas se proporcionan como masas monoisótópicas para las masas < 3500 Da y como masas promedio para las masas > 3500 Da.

Tabla 13: Resultados de la cadena ligera.

RhD nº

Péptidos Masa observada (Da) Masa teórica (Da) Nº de fracción SCX pI teórico

d4

1365,54 1365,53 B10 4,15

d3

1419,74a 1419,72 B10 3,87

Parte de d3-6 (parte)

3090,33 3090,31 B3 3,42

d6 (parte)

1256,60 1256,59 B9 3,0

191

d2

1010,45 1010,44 B7 7,04

d6 (parte)

1858,05b 1858,04 B7 10,10

d1

6536,30 6537,33 B1 y B2 10,28

d1 + d2 (parte)

7530,25 7530,34 B1 9,91

196

d3 (parte) 1858,05b 1858,04 B7 10,10

201

d3 1844,01c 18,44,02 B7 y B8 10,15

d4

2251,11 2251,11 B6 7,03

d3

1068,57 1067,57 B4 10,15

203

d2

2756,42 2756,41 B2 9,44

d4 + d5 (parte)

2566,23 2566,21 B7 4,11

244

d4 (parte) d4 1858,05b 4519,42 1858,04 4520,10 B7 B1 10,10 9,47

306

d5 2771,21 2771,18 B9 5,27

d3-4

2423,21 2423,20 B8 4,11

d1

3374,77 3374,75 B7 6,55

d4

1419,74a 1419,72 B10 3,87

d6

1844,01c 1844,02 B7 y B8 10,15

d2 (parte)

1794,91 1794,90 B2 8,91

319

324

d2 (parte) 1858,05b 1858,04 B7 10,10

a Mismos péptidos. b Mismos péptidos. c Mismos péptidos

Tabla 14: Resultados de la cadena pesada

RhD nº

Péptidos Masa teórica (Da) Masa observada (Da) Nº de fracción SCX pI teórico

191

D4 parte de D2-4 (46-89) 1953,0 5134,76 1953,01 5136,35 B3 C1 y C4 6,98 10,08

196

parte de D6 (99-113)b parte de D1-4 (6-72) D5 1888,89 7343,21 1981,95 1888,93 7344,01 1981,95 B1 C4 B6 9,51 9,41 7,01

201

D4 1995,97a 1995,98 B6 y B7 7,01

203

D4 1995,97a 1995,98 B6 y B7 7,01

244

D4 D6 1982,95 2002,97 1982,94 2002,94 B1 B1 y B3 7,04 10,12

306

D4 1809,90 1809,91 B6 10,23

319

D6 D4 2401,03 1995,97a 2401,01 1995,98 B5 B6 y B7 9,27 7,01

324

a Mismo péptido. b verificado mediante identificación del mismo péptido con una Met oxidada

Tal como se observa en las Tablas 13 y 14, se pueden identificar quince péptidos procedentes de la LC variable y nueve péptidos procedentes de la HC variable como péptidos marcadores únicos y algunos péptidos procedentes de

5 la región variable de HC así como procedentes de la LC tienen la misma masa, y no se pueden asignar sin ambigüedad. De esta manera, no ha sido posible asignar péptidos únicos para la HC de RhD201, 203 y 324 y para la LC de RhD201 y 319 usando la cromatografía de intercambio catiónico fuerte.

Resumen

Los resultados obtenidos de los dos análisis de péptidos marcadores diferentes son suficientes para sustanciar que

10 los datos combinados obtenidos de los análisis de EM de la HC y la LC permiten la identificación de los péptidos únicos procedentes de la región variable de los ocho anticuerpos que constituyen el anti-RhD rpAb usando la RP-HPLC. Mediante el uso de la cromatografía de intercambio catiónico se identificarían seis de los ocho miembros individuales en la composición de anti-RhD rpAb. Los resultados de los análisis de EM no se han analizado hasta el momento con completo detalle, sino únicamente en la extensión mostrada en las Tablas 11 a 14.

15 EJEMPLO 6A

El presente ejemplo ilustra la caracterización de un anticuerpo anti-RhD policlonal recombinante con 25 miembros individuales derivados de un cultivo celular policlonal (ciclo del biorreactor). Se analizó la diversidad del anticuerpo mediante el aislamiento de péptidos marcadores únicos que se originan desde las regiones variables de la LC o la HC usando la RP-HPLC combinada con la espectrometría de masas para la identificación de los péptidos.

20 Generación de péptidos mediante digestión de cadenas pesadas y cadenas ligeras aisladas

Una muestra de anticuerpo anti-RhD policlonal con 25 miembros individuales se purificó a partir del sobrenadante de un cultivo celular policlonal procedente de un ciclo de biorreactor. La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía de afinidad usando una columna MabSelect (Amersham Biosciences, GE Healthcare) y se desaló en una columna G25 (Amersham Biosciences, GE Healthcare). El material liofilizado se disolvió en clorhidrato de

25 guanidinio 6 M, Tris HCl 0,2 M, pH 8,4, se redujo (DTT) y se carboximetiló (ácido yodoacético). Las cadenas pesadas y las cadenas ligeras se separaron mediante filtración en gel en una columna Superose 12 (10/300 GL de Amersham Biosciences, GE Healthcare) en HCl de Guanidinio 6 M, fosfato de sodio 50 mM, pH 8,4. La HC y la LC separadas se digirieron con Endoproteinasa Asp-N (Roche, 1 054 589) en un enzima hasta la concentración del sustrato de 1:200 en urea 1 M, fosfato de sodio 50 mM, pH 8 durante la noche a 37º C.

30 Aislamiento de péptidos únicos mediante LC-EM

Alícuotas de las digestiones de Asp-N individuales de la HC y la LC aisladas obtenidas de la muestra de anticuerpo policlonal se aplicaron a un sistema 1100 LC/MSD SL de Agilent equipado con una columna de 5 1m Zorbax 300SB-C18 (2,1 x 150 mm) conectada a una columna de guarda (Zorbax 300SB-C8, 2.1 x 12.5 mm, 5 1m) equilibrada en TFA al 0,1 %, ACN al 14 % usando un caudal de 0,2 ml/min. Se eluyeron los péptidos usando un gradiente lineal de

5 TFA al 0,08 %, acetonitrilo al 70 %. Se detectaron los péptidos espectrofotométricamente a 220 nm y se analizaron mediante EM en línea (ionización a presión atmosférica (API) por electropulverización). Se añadió una mezcla de ácido propiónico al 75 %/isopropanol al 25 % después de la columna en la fase móvil para aumentar la señal. Los espectros de masas obtenidos se analizaron usando el software Chemstation (Agilent Technologies, CA) y el software GPMAW 6.2 (Lighthouse data, Odense, Dinamarca).

10 En la Tabla 14A se resumen los resultados del análisis de EM de las digestiones de Asp-N de la HC y la LC, en los que las masas teórica y detectada se proporcionan como masas promedio.

Tabla 14A: Identificación de péptidos hidrófobos únicos de 25 anticuerpos en un anti-RhD rpAb empleando la rotura de Asp-N y el análisis LC-EM.

RhD nº

Péptidosa Masa teórica (Da) Masa encontrada (Da) Tiempo de retención (min)

157

d1 7358,2 7357,2 211

159

d4 4483,0 4482,2 213

160

d2 5585,3 5584,5 216

162

d2 4322,0 4321,1 245

189

d1 8536,5 8535,3 203

191

d1 6537,3 6536,4 179

192

d2 5667,4 5666,5 217

196

D1-D2*b 6297,1 6295,8 303

197

d1* 8696,8 8695,5 206

199

d2 5709,4 5708,6 212

201

d1 8504,5 8503,3 202

202

d1 6448,2 6447,3 188

203

d5 6356,1 6355,4 184

207

d1* 8626,7 8625,5 198

240

d2 7056,0 7054,9 235

241

d1 6464,4 6463,4 215

245

d2 5749,4 5748,6 226

293

D1 5854,7 5854,1 277

301

d4 4559,3 4558,5 221

305

d4 4510,1 4509,3 187

306

d2 3206,7 3206,1 189

317

d1 6364,2 6363,2 225

319

d1* 8668,7 8667,4 210

321

d7 4945,6 4944,9 222

324

D1 5919,8 5919,3 280

desde el término N al término C de las secuencias predichas. Por tanto, d4 indica un péptido producido por la rotura en el sitio 3º y 4º de Asp-N en el polipéptido LC.

b Este péptido contiene un sitio de rotura perdido. * Indica una Gln ciclada N terminal (pyroGlu)

Tal como se observa en la Tabla 14A, se pueden identificar 22 péptidos procedentes de la parte variable de una LC y 3 péptidos procedentes de la parte variable de una HC como péptidos marcadores únicos. De esta manera, los datos de EM de la HC y la LC demuestran sin ambigüedad que se identificarían los 25 anticuerpos en la muestra de anti-RhD rpAB basándose en la detección de los péptidos únicos de cada uno de los anticuerpos.

EJEMPLO 7

El presente ejemplo ilustra la generación de péptidos anti-idiotipo con especificidad hacia los miembros individuales de un anticuerpo anti-RhD policlonal recombinante, así como la evaluación de la concentración de un miembro individual en un anticuerpo policlonal recombinante.

Generación de ligandos péptidos específicos del anticuerpo anti-RhD.

Se usó una biblioteca de fagos que mostraba siete aminoácidos ordenados en secuencia aleatoria en el extremo N terminal de pIII (New England Biolab) para la selección por afinidad de los ligantes péptidos de los anticuerpos anti-RhD individuales. Se usaron una versión lineal y una restringida de la biblioteca peptídica para la selección. Se recubrieron placas de microvaloración (Maxisorb, NUNC) a 4º C durante 12-16 h con el anticuerpo anti-RhD monoclonal purificado a 10 1g/ml usando 100 1l por pocillo. Los veinticinco anticuerpos individuales contenidos en el anticuerpo anti-RhD policlonal recombinante se usaron para rastrear los péptidos anti-idiotipo. Sin embargo, en situaciones en las que el anticuerpo policlonal recombinante contiene un gran número de miembros individuales (por ejemplo, por encima de 50), se pueden seleccionar anticuerpos centinela para el rastreo. Preferiblemente, se seleccionan numerosos anticuerpos centinela que corresponden a al menos un 4 % del número total de anticuerpos que constituyen la proteína policlonal recombinante, incluso más preferido, se seleccionan anticuerpos centinela que constituyen al menos un 8 %, 12 %, 16 %, 20 %, 30 % o 50 % del número total de anticuerpos que constituyen la proteína policlonal recombinante. Las placas recubiertas se lavaron posteriormente en PBS, Tween-20 al 0,05 % y a continuación se bloquearon con leche desnatada al 2 %/PBS. Se usaron bacteriófagos a ~ 1011 ufp/100 1l por cada ciclo de criba. Las bibliotecas restringida y lineal se mezclaron y cribaron junto con una mezcla de leche desnatada al 2 %/PBS. Tras 1 h de incubación a temperatura ambiente, los fagos unidos se eluyeron con glicina/HCl, pH = 2,2 durante 10 min seguido por neutralización con Tris-HCl, pH = 9,0. Después de tres a cuatro ciclos de criba, se aislaron clones únicos, se extrajo el ADN y se secuenció en la región correspondiente a la región peptídica aleatoria. La Tabla 15 a continuación muestra las alineaciones de las secuencias de aminoácidos deducidas de los distintos clones.

Tabla 15

Anticuerpo diana

Clon nº Secuencia peptídica

162-B11

ACMGYGPRMCGGG (ID DE SEC Nº 11)

162-B12

ACMGYGPRMCGGG (ID DE SEC Nº 11)

162-C01

ACMGYGPRMCGGG (ID DE SEC Nº 11)

162-C02

ACMGYGPRMCGGG (ID DE SEC Nº 11)

162-C04

ACMGYGPRMCGGG (ID DE SEC Nº 11)

162-C05

ACMGYGPRMCGGG (ID DE SEC Nº 11)

Anti-RhD162

162-C06 ACMGYGPRMCGGG (ID DE SEC Nº 11)

162-C07

ACMGYGPRMCGGG (ID DE SEC Nº 11)

162-C08

ACMGYGPRMCGGG (ID DE SEC Nº 11)

162-C09

ACMGYGPRMCGGG (ID DE SEC Nº 11)

162-C10

ACPGDGPRMCGGG (ID DE SEC Nº 12)

162-C12

ACMGYGPRMCGGG (ID DE SEC Nº 11)

162-D01

ACMGYGPRMCGGG (ID DE SEC Nº 11)

30 (continuación)

162-D03

ACMGYGPRMCGGG (ID DE SEC Nº 11)

162-D04

ACMGYGPRMCGGG (ID DE SEC Nº 11)

Consenso – PEP162

CMGYGPRMC (ID DE SEC Nº 13)

Anti-RhD202

202-01 ACMPRNPLECGGG (ID DE SEC Nº 14)

202-05

ACAPRNPYECGGG (ID DE SEC Nº 15)

202-07

ACPRNPFEMCGGG (ID DE SEC Nº 16)

202-06

ACYPRHPLDCGGG (ID DE SEC Nº 17)

Consenso – PEP 202

CAPRNPYEC (ID DE SEC N1 18)

305-01

ACTTLLHFLCGGG (ID DE SEC Nº 19)

305-06

ACTTLLHFLCGGG (ID DE SEC Nº 19)

Anti-RhD305

305-07 ACTTLLSFLCGGG (ID DE SEC Nº 20)

305-10

AGTSLLAFLCGGG (ID DE SEC Nº 21)

305-05

ACNLLLQFLCGGG (ID DE SEC Nº 22

Consenso – PEP305

CTTLLHFLC (ID DE SEC Nº 23)

Se sintetizaron tres péptidos sintéticos con afinidad específica hacia cualquiera de anti-RhD162, 202 ó 305, respectivamente, de acuerdo con la secuencia consenso de aminoácidos de los grupos de secuencias relacionadas. Cada péptido sintético se acopló con Biotina en el término C.

Se ensayó la especificidad de cada péptido mediante ELISA. De manera breve, las placas ELISA se recubrieron, con Estreptavidina a 4º C durante 12-16 h, con Estreptavidina a 5 1g/ml usando 100 1l por pocillo. A continuación, se añadió el péptido diluido a ~ 10 1g/ml en PBS, seguido por la incubación durante 1 h y la eliminación del péptido en exceso mediante lavado. Las placas se bloquearon posteriormente en leche desnatada al 2 %/PBS y se lavaron tres veces en PBS. Cada uno de los anticuerpos anti-RhD individuales se añadió separadamente a diversas diluciones comenzando a 10 1g/ml. Se detectó el anticuerpo unido usando un IgG-conjugado anti-humano (nº de catálogo Caltag H10307). Las placas se lavaron cinco veces y se llevó a cabo la detección añadiendo 25 1l de cromógeno (TMB, Kem-En-Tech). Se finalizaron las reacciones 15-25 minutos después añadiendo 25 1l de H2SO4 1 M. Se midieron los valores de la absorbancia a 450 nm. El ensayo de cada péptido frente al panel de anticuerpos anti-RhD monoclonales mostró que la reactividad es específica de cada miembro individual-proteína apropiado. Por tanto, PEP se une únicamente al anticuerpo anti-RhD162, PEP202 se une únicamente al anti-RhD202 y PRP305 se una únicamente al anti-RhD305 con una relación señal a ruido por encima de 10.

Determinación de la cantidad de anticuerpo anti-RhD305 en un anticuerpo anti-RhD policlonal recombinante

Usando diluciones apropiadas del anticuerpo monoclonal anti-RhD305 purificado como patrón de referencia, fue posible determinar la cantidad de anticuerpo anti-RhD305 en relación con la cantidad total de anticuerpos en una mezcla del anticuerpo anti-RhD policlonal recombinante. De manera breve, se recubrieron placas ELISA con Estreptavidina y se incubaron con PEP305 diluido hasta ~ 10 1g/ ml en PBS durante 1 h. Tras la incubación, se eliminó el péptido en exceso mediante lavado. Las placas se bloquearon posteriormente en leche desnatada al 2 %/PBS y se lavaron tres veces. Se añadió un anticuerpo anti-RhD policlonal recombinante compuesto por 25 anticuerpos anti-RhD individuales (la muestra) en diluciones que oscilaban desde 1 a 16384 veces. Se analizó la muestra por cuadruplicado. En pocillos separados en la misma placa, se añadieron diluciones en serie (por triplicado) de anticuerpo anti-RhD305 monoclonal comenzando a 10 ug7ml como muestras de referencia con el fin de generar una curva estándar. Se detectó el anticuerpo unido usando un IgG-conjugado anti-humano (nº de catálogo Caltag H10307). Se lavaron las placas cinco veces y se llevó a cabo la detección añadiendo 25 1l de cromógeno (TMB, Kem-En-Tech). Se finalizaron las reacciones 15-25 min después añadiendo 25 1l de H2SO4 1 M. Se midieron los valores de la absorbancia a 450 nm.

La curva estándar fue linealmente proporcional a la concentración dentro del siguiente intervalo:

Anti-RhD305 Ab monoclonal 1g/ml

0,156 0,078 0,039 0,0195

DO450

1,509 0,990 0,567 0,338

Estos datos dieron como resultado una curva estándar con la ecuación y = 0,1161x-0,0256 y R2 = 0,9812.

La ecuación determinada para la curva estándar así como el factor de dilución de la muestra se usaron para calcular la concentración del anticuerpo anti-RhD305 en la muestra de anticuerpo anti-RhD policlonal recombinante.

En una dilución de 32 veces, la DO450 promedio medida para la muestra fue 1,24 ± 0,14, correspondiente a una concentración de anticuerpo anti-RhD305 de 3,8 ± 0,5 1g/ml en el anticuerpo anti-RhD policlonal. La concentración total de anticuerpo en la muestra de anticuerpo anti-RhD policlonal recombinante fue de 100 1g/ml. De esta manera, el anticuerpo anti-RhD305 representa el 3,8 % de la muestra de anticuerpo policlonal.

EJEMPLO 8

El presente ejemplo ilustra el uso de péptidos anti-idiotipo para identificar anticuerpos centinela en fracciones/picos específicos tras la separación en una dimensión mediante el análisis cromatográfico líquido de intercambio iónico de un anticuerpo anti-RhD policlonal recombinante.

Un anticuerpo anti-RhD policlonal recombinante compuesto por 25 anticuerpos anti-RhD individuales se separó mediante cromatografía de intercambio catiónico y se recogieron las fracciones. Cada fracción se examinó mediante ELISA usando los tres péptidos anti-idiotipo (tal como se describe en el Ejemplo 7) con el fin de detectar la presencia de un anticuerpo anti-RhD concreto en cada fracción. Una superposición del cromatograma con los datos ELISA llevada a cabo sobre cada fracción mostró que se puede usar este procedimiento para identificar anticuerpos individuales en una fracción concreta (Fig. 12). De esta manera, comparando la absorbancia en un pico concreto con los datos ELISA, es posible hacer una evaluación semicuantitativa de la composición de las mezclas complejas de proteínas homólogas.

EJEMPLO 9

Asegurar la estabilidad composicional es una característica clave cuando se fabrican proteínas policlonales para uso médico. Se pueden usar péptidos-ligandos específicos capaces de identificar miembros individuales de proteínas dentro de una mezcla compleja de proteínas homólogas para vigilar la estabilidad composicional de una proteína policlonal durante la fabricación extrayendo las muestras de los medios durante la fermentación en diferentes momentos de generación y aplicando un procedimiento de detección cuantitativa tal como los procedimientos ELISA descritos en el Ejemplo 7.

En el presente ejemplo, se estimó la cantidad real de las tres proteínas centinela, los anticuerpos anti-RhD162, 202 y 305 en un procedimiento de fermentación por perfusión de un PWCB que produce un anticuerpo anti-RhD policlonal recombinante compuesto por 25 anticuerpos anti-RhD únicos. La Figura 13 ilustra la distribución de los tres anticuerpos centinela (anti-RhD162, 202 y 305) en diferentes momentos del cultivo durante la fermentación, correspondiendo G8 al día 8 tras la inoculación del biorreactor.

EJEMPLO 10

El presente ejemplo ilustra un procedimiento para la identificación de células que producen un anticuerpo anti-RhD concreto en una mezcla de cultivo celular. En el ejemplo, se analizó una mezcla constituida por líneas celulares que producían dos anticuerpos diferentes usando un péptido anti-idiotipo y la citometría de flujo para la detección.

Las líneas celulares que producían dos anticuerpos anti-RhD individuales, RhD162 y RhD202, se mezclaron en relaciones definidas. En la Tabla 16 se indican los porcentajes del clon RhD202.

Se incubó el péptido 202 biotinilado (PEP202 preparado en el Ejemplo 7) con estreptavidina conjugada con ficoeritrina (SA-PE) para formar péptidos tetrámeros. Se incubaron los tetrámeros con las mezclas de la línea celular durante 20 min a TA y se hizo avanzar las células a través de un citómetro de flujo FACS CAlibur (Becton Dickinson). Las células positivas para los tetrámeros se seleccionaron tal como se representa gráficamente para R1 en la Fig.

14. Se midieron también las líneas celulares no mezcladas individuales (Fig. 14A y B).

Una característica que se observa de las líneas celulares que producen el anticuerpo anti-RhD es la presencia de células que expresan el anticuerpo y que no expresan el anticuerpo dentro de la línea celular. Para evaluar la presencia de células PEP202 positivas en una mezcla, necesita determinarse el número total de células expresantes. En este ejemplo, se supuso que la presencia de células expresantes en la mezcla de RhD162 y RhD202 era la misma que en RhD202 sólo. Esto se podría evaluar mediante la tinción doble de las células con Pep202 y un anticuerpo anti-IgG (no llevada a cabo). Sin embargo, los resultados indicaron lo correcto de la suposición. Se calculó el porcentaje de células RhD202 unidas mediante el tetrámero PEP202 en las mezclas a partir del porcentaje de células en el selector 6 (R6), tal como se muestra en la Fig. 14

Se calculó el porcentaje de la línea celular RhD202 en la mezcla a) de acuerdo con la siguiente ecuación, ejemplificada con las medidas para la mezcla a.

Tabla 16

Mezcla

% de RhD202 real % de RhD202 medido

a

50 45

b

83 79

c

96 87

d

17 15

5 EJEMPLO 11

El presente ejemplo ilustra el uso de la PCR en tiempo real para evaluar la distribución de los clones individuales o una selección centinela de dichos clones dentro de un cultivo celular policlonal.

La técnica se basa en las diferencias de secuencias entre las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo individual. Debido a la variedad de secuencias que codifican en Anticuerpo individual, se puede diseñar

10 una sonda TaqMan única para la cadena pesada y/o la cadena ligera de cada miembro representado en la línea celular policlonal. Preferiblemente, se selecciona una de las regiones CDR, CDR1, CDR2 o CDR3 para diseñar la sonda TaqMan. Lo más preferible, se selecciona la región CDR3 para diseñar la sonda TaqMan.

Diseño de oligonucleótidos

Los cebadores se diseñan preferiblemente de tal manera que se obtienen los amplicones de 70 – 150 nucleótidos.

15 Algunos diseños de cebador posibles son: Un cebador directo de consenso que hibrida la región FR3 de la región variable de la cadena ligera o pesada, y el cebador inverso que hibrida en la región constante. Se diseña una sonda TaqMan específica para una parte de la región CDR que difiere entre los miembros individuales de la muestra, preferiblemente la región CDR3, para cada clon de interés.

Se puede diseñar un conjunto potencial de cebadores y sondas para el análisis de la línea celular policlonal que 20 expresa los siguientes ocho anticuerpos anti-RhD tal como se indica a continuación.

El cebador directo y el inverso para todos los clones:

Cebador directo: CAC GGC TGA GTA TTA CTG TGC (ID DE SEC Nº 24)

Cebador inverso: TTG GTG GAG CCA CTC GA (ID DE SEC Nº 25)

En la tabla 17 se muestran las sondas TawMan para todos los clones individuales.

25 Tabla 17

RhD nº

Sondas TaqMan

191

AGA AAT TTG TTC GGT GAC TAC GAT CTT AAG TCC (ID DE SEC Nº 26)

196

AGA GAA TTG AGC ACG CAA CGT GGA TAC A (ID DE SEC Nº 27)

201

AGA GAG AGT ACT CTA TAT AGC AGC AGC TGG TAC A (ID DE SEC Nº 28)

203

GAT GGT CTC CTA TAG CAG CAG CTG GTA CC (ID DE SEC Nº 29)

244

GAG AGA CTC TGT TCG GGG AGT CAG TAG AT (ID DE SEC Nº 30)

306

GGG TAC TCT GTA TAG CAG CAG CTG GTA CA (ID DE SEC Nº 31)

319

AGA GAC CTA CAA GGG TAT AGA AGC AGC TGG TAC (ID DE SEC Nº 32)

324

CCG ACG ATT TTT GGA GTG GGC C (ID DE SEC Nº 33)

Un diseño alternativo de cebador para las secuencias que codifican la cadena pesada constituye un cebador directo que hibrida en la unión VH-DH y un cebador inverso en la región constante, y la sonda TaqMan en la unión JH-C tal como se describe en Rasmussen, T. y col. 2000. Exp. Hematol. 28, 1039-1045.

PCR cuantitativa en tiempo real

Se extrajo el ARNm o el ADN genómico de sedimentos celulares. Si se usa ARNm como plantilla se transcribe de manera inversa para generar el ADNc antes de la PCR en tiempo real. Se realizaron numerosas reacciones de la PCR en tiempo real que correspondían al número de clones que se iba a analizar.

Se optimizaron los ensayos en tiempo real con respecto a las concentraciones del cebador y a las concentraciones de la sonda TaqMan. Se llevaron a cabo las reacciones por triplicado en placas de 96 pocillos cerradas herméticamente con un revestimiento de adhesivo óptico. Las reacciones de la PCR se realizaron en un equipo PCR mastermix comercial y se llevaron a cabo en un sistema ABI prism 7000 (Applied Biosystems) con análisis posterior usando el software ABI prism 7000 SDS.

Análisis de la diversidad

Se compararon entre sí los valores CT de los clones diferentes, y se calculó la distribución de cada clon en la línea celular policlonal. Se puede aplicar el procedimiento para evaluar la variación lote a lote así como la estabilidad clonal en el tiempo durante un ciclo de producción individual.

EJEMPLO 12

El presente ejemplo ilustra un procedimiento para evaluar y demostrar la naturaleza policlonal de una línea celular policlonal (por ejemplo, una pWCB) capaz de producir un anticuerpo policlonal recombinante por medio de la secuenciación del ADN de la región variable de los genes de cadena pesada y/o ligera del anticuerpo a partir de clones de células individuales derivados de la línea celular policlonal.

Clonación de células individuales

Se descongeló y cultivó una ampolla de pWCB durante unos pocos días en medio completo para reconstituir la viabilidad de las células sanas. Posteriormente se obtuvieron clones de células individuales mediante dilución limitante, en la que las células se plaquearon en placas de cultivo de 96 pocillos a una densidad de 1 célula/pocillo, en medio de cultivo completo. Se incubaron las células a 37º C, CO2 al 5 % durante 10-20 días y a continuación se puntuaron las placas para los pocillo con colonias únicas bajo un microscopio. Alternativamente, se obtuvieron clones de células individuales de pWCB usando un clasificador celular FACS. Las células pWCB viables se seleccionaron y se clasificaron en placas de 96 pocillo precargadas con 100 1l de medio completo acondicionado a 1 célula/pocillo. Se incubaron las células y se puntuaron para las distintas colonias tal como se describe anteriormente.

Secuenciación de ácido nucleico

Cuando las colonias de células individuales en los pocillos han crecido hasta confluencia, se transfirieron alícuotas (10-20 1l) de cada uno de un número deseado de pocillos (por ejemplo 100) a nuevas placas de 96 pocillos que se van a usar como plantilla en reacciones de secuenciación del ADN. La secuenciación se llevó a cabo tanto al nivel del ARNm como al nivel genómico usando entre 1 y 100 o 1 y 1000 células, respectivamente. En el primer caso, se generó un fragmento de la PCR que cubría suficientemente la región variable para distinguir los diferentes genes de la cadena pesada y la ligera del anticuerpo presentes en la PWCB (normalmente al menos la región CDR3) mediante tecnología RT-PCR estándar, usando, por ejemplo, el kit de la RT-PCR en una etapa comercialmente disponible de Quiagen, seguido por las instrucciones del fabricante. Se lisaron las células antes de la reacción de la PCR. El fragmento PCR resultante se purificó en gel usando el kit Quiaquick Gel Extraction de Quiagen y se usó como plantilla en una reacción estándar de secuenciación del ADN seguido por el análisis en un equipo automatizado de secuenciación del ADN tal como el ABI PrismTM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Alternativamente, se llevó a cabo la secuenciación del ADN sobre el ADN genómico tal como se describe anteriormente, excepto en que no se realizó la etapa de la transcripción inversa.

Para la caracterización del anticuerpo anti-RhD policlonal recombinante, se usaron los siguientes cebadores:

Cebadores de la PCR para la amplificación de VH:

RhD nº 001: 5TCTCTTCCGCATCGCTGTCT (ID DE SEC Nº 34)

RhD nº 007: 5’AGGAAAGGACAGTGGGAGTGGCAC (ID DE SEC Nº 35)

Cebadores de la PCR para la amplificación de VL

RhD nº 005: 5’CGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTG (ID DE SEC Nº 36)

RhD nº 008: 5’AAGACCGATGGGCCCTTGGTGGA (ID DE SEC Nº 37)

Los cebadores de la secuenciación son:

VH: 5’AACGGGTTTGCCGCCAGAACA (ID DE SEC Nº 38)

VL: 5’CCGAGGGACCTGAGCGAGT (ID DE SEC Nº 39)

ELISA en células individuales usando péptidos anti-idiotipo

Como suplemento a la secuenciación del ácido nucleico, se puede evaluar la composición clonal de una mezcla de células que producen anticuerpos tal como un banco celular policlonal de trabajo usando un ELISA con péptidos anti-idiotipo.

Las células individuales clasificadas se cultivaron durante aproximadamente 14 días, generando por tanto cultivos celulares isogénicos a partir de clones únicos. Se puede analizar el sobrenadante de estos cultivos para la presencia de anticuerpos anti-RhD específicos usando péptidos anti-idiotipo en un ensayo ELISA tal como se describe en el Ejemplo 7. Esto proporcionará información con respecto al número de clones que producen un miembro individual concreto. Si se compara la cantidad de un miembro individual con la cantidad total de células que producen anticuerpos (midiendo, por ejemplo, IgG en todos los cultivos celulares isogénicos, se puede obtener una medida cuantitativa de las fracciones de células que producen anticuerpos anti-RhD individuales en el cultivo celular policlonal.

EJEMPLO 13

El presente ejemplo demuestra el uso del análisis cromatográfico de intercambio catiónico para estimar la diversidad clonal durante el procesamiento aguas abajo (DSP) de un anticuerpo policlonal recombinante.

Procesamiento aguas abajo

Una muestra de anti-RhD rpAb, que contenía 25 miembros individuales, procedente de un ciclo de biorreactor experimental se purificó usando las siguientes etapas DSP:

1.

captura de los anticuerpos usando una columna MAbSelect

2.

inactivación del virus a pH 3

3.

intercambio del tampón usando una columna Sephadex G-25

4.

cromatografía de intercambio aniónico usando una columna DEAE-sepharose

5.

filtración del virus usando un filtro Planova 15N, y

6.

cromatografía de inducción de carga hidrófoba usando una columna MEP hypercel

7.

ultrafiltración/diafiltración usando un filtro biomax de milipore

Análisis de la diversidad clonal después de las etapas DSP individuales

Se usó la cromatografía de intercambio catiónico para analizar la diversidad clonal durante la DSP de una composición de anticuerpo policlonal recombinante. Se tomaron las muestras después de la etapa 1, 3, 4 y 6 durante la DSP de un anti-RhD rpAb que se aplicó a una columna PolyCatA (4,6 x 100 mm) en acetato de sodio 25 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 5,0 a un caudal de 60 ml h-1 operada a temperatura ambiente. Los componentes del anticuerpo se eluyeron posteriormente usando un gradiente lineal de cloruro de sodio 150 – 500 mM en acetato

h-1

de sodio 25 mM, pH 5,0 a un caudal de 60 ml . Los componentes del anticuerpo se detectaron espectrofotométricamente a 280 nm y se compararon los cromatogramas (Fig. 15) para detectar la pérdida potencial de la diversidad clonal durante la DSP. En el presente ejemplo se demostró, usando la cromatografía de intercambio catiónico, que la diversidad clonal no cambió esencialmente durante la DSP de un anticuerpo policlonal recombinante.

EJEMPLO 14

El análisis IEX de más de 40 anticuerpos frente a RhD ha revelado que un número sustancial de los anticuerpos individuales muestra un “modelo de 3 picos” tal como se muestra en la Fig. 16B. El tratamiento con carboxipeptidasa B, así como el análisis de carbohidratos han indicado que esta heterogeneidad de carga no está producida por el recorte de la lisina C terminal o la presencia de ácido siálico (no se muestran los datos).

El presente ejemplo demuestra que la heterogeneidad de carga es debida a la formación de PyroGlu, y cómo se puede usar la mutagénesis dirigida al sitio para obtener modelos IEX homogéneos.

Expresión y purificación de anticuerpos

Se adaptaron líneas celulares estables (obtenidas tal como se describe en la solicitud de patente danesa PA 2004 01133 presentada el 20 de Julio de 2004) que expresaban cada una un anticuerpo monoclonal anti-Rhesus D recombinante distinto procedente de un sitio específico en su genoma a un cultivo en suspensión en medio Excell 302 libre de suero (JRH Biosciences, Andover, UK) suplementado con L-glutamina 4 mM (Invitrogen) y agente antiagrupamiento (Invitrogen) diluido 1:250, se expandió y se depositó a -150º C usando procedimientos de congelación convencionales.

Los sobrenadantes se cosecharon a partir de los cultivos celulares antes del depósito y los sobrenadantes se filtraron antes de la purificación de los anticuerpos anti-RhD monoclonales usando la cromatografía de afinidad (Proteína A) esencialmente tal como se describe en el Ejemplo 1.

Cromatografía de intercambio catiónico fuerte

Los anticuerpos monoclonales purificados en las etapas anteriores se sometieron a la cromatografía IEX fuerte, esencialmente tal como se describe en el Ejemplo 1. La columna IEX de la Tabla 18 resume el número de picos presentes en los perfiles IEX de los anticuerpos seleccionados, dichos perfiles IEX se presentan también en la Fig.

16.

Análisis de la secuencia N terminal

Se llevó a cabo el análisis de la secuencia N terminal de los picos separados procedentes del análisis IEX de 2 anticuerpos seleccionados (RhD198 y RhD307) en solución, mediante la secuenciación de Edman usando un Secuenciador Procise 494 (Applied Biosystems, CA) operado tal como describe el fabricante. El análisis de la secuencia demostró que la heterogeneidad de carga fue debida a una ciclación parcial de la Gln N terminal de la HC (véase la Tabla 18). De esta manera, el primer pico contenía los anticuerpos que bloquearon totalmente el término N de la HC (los términos N de la HC tienen carga 0); el segundo pico correspondió a los anticuerpos en los que uno de los términos N de la HC se bloquearon (los términos N de la HC tienen carga +1), y el tercer pico representó más probablemente los anticuerpos en los que la Gln N terminal no se modificó (los términos N de la HC tienen carga 2+). La ciclación del resto de glutamina N terminal a PyroGlu vuelve ésta refractaria a la secuenciación de Edman.

Una serie de otros anticuerpos anti-RhD que muestran igualmente dicho “modelo de 3 picos” o un “modelo de 1 pico” se analizaron mediante el análisis de la secuencia N terminal sometiendo el anticuerpo a SDS page que se electrotransfirió sobre membranas PVDF. La banda HC y la LC de estas transferencias se sometieron a la secuenciación de Edman.

Unos pocos anticuerpos que albergaban una Gln N terminal en la HC (RhD162, RhD240) mostaron estar totalmente bloqueados de acuerdo con sus perfiles IEX (“modelo de 1 pico”, mientras que los anticuerpos (RhD196, RhD305 y RhD306) con el “modelo de 3 picos” se encontró que estaban parcialmente bloqueados tal como se esperaba (véase la Tabla 18). Las interpretaciones se basan en los rendimientos de las secuencias así como en el porcentaje relativo de las variantes con carga diferente (0, +1 y 2+) en el perfil IEX.

Tabla 18 5

RhD nº

Análisis de la secuencia. de la HCa Análisis de la secuencia de la LCa Modelo IEX Comentarios

162b

QVQLV; sin sec. d ID DE SEC Nº 40 DIQLT; DIQ ID DE SEC Nº 42 1 pico Términos N de HC totalmente bloqueados

196b

QVQLV; QVQLV ID DE SEC Nº 40 n.d. 3 picos Términos N de HC parcialmente bloqueados

306b

QVQLV; QVQLV ID DE SEC Nº 40 EIVLTQS; EIVLTQS ID DE SEC Nº 7 3 picos Términos N de HC parcialmente bloqueados

240b

QLQLQ; sin sec.d SEQ ID NO 41 DIQMT; DIQMT ID DE SEC Nº 43 1 pico Términos N de HC totalmente bloqueados

305b

QVQLV; QVQLV ID DE SEC Nº 40 n.d 3 picos Términos N de HC parcialmente bloqueados

198c

P1: QVQLV; sin sec.d P2:QVQLV; QVQLV SEQ ID Nº 40 P1: DIQMT; DIQMT P1: DIQMT; DIQMT ID DE SEC Nº 43 3 picos Los términos N de HC totalmente bloqueados y parcialmente bloqueados se observan en p1 y p2, respectivamente

40 (continuación)

307c

P1: QVQLV; sin sec. d P2: QVQLV; QVQLV SEQ ID NO 40 P1: DIQLT; DIQLT P1: 42 DIQLT; DIQLT ID DE SEC Nº 42 3 picos Los términos N de HC totalmente bloqueados y parcialmente bloqueados se observan en p1 y p2, respectivamente.

a Las secuencias N terminales esperadas y obtenidas se indican en estilo de fuente regular y en negrita, respectivamente. b Datos obtenidos de la transferencia. c datos obtenidos de las fracciones aisladas (pico 1 y 2) de los análisis IEX (analizados en solución). d La ciclación del resto de glutamina N terminal a PyroGlu vuelve ésta refractaria a la secuenciación de Edman. n.d.; no determinado

Mutagénesis dirigida específica de sitio

Se usó la mutagénesis dirigida específica de sitio para eliminar la heterogeneidad de carga de un anticuerpo seleccionado cambiando Gln N terminal a Glu. Se usó el plásmido de expresión RhD189 que codifica un anticuerpo de longitud completa con una Gln N terminal en la cadena pesada y un resto Glu N terminal en la cadena LC. La región VH es éste plásmido está flanqueada por un sitio Ascl en el extremo 3’ de la región que codifica el péptido señal y un sitio XhoI silencioso en la región J.

Se llevó a cabo la mutagénesis con los siguientes cebadores:

RhD189 directo: TGGGCGCGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG (ID DE SEC Nº 44)

RhD189 inverso: GGAGGCGCTCGAGACGGTGACCGTGGTCCC (ID DE SEC Nº 45)

El sitio AscI en el cebador directo y el sitio XhoI en el cebador inverso están subrayados, mientras que el codón Glu (GAG) en el término N de la región VH se muestra en negrita. Se usó el plásmido RhD189 como molde en las reacciones de la PCR con los cebadores anteriormente mencionados. Se llevaron a cabo las reacciones de la PCR con la ADN polimerasa Phusion (Finnzymes, Finlandia) durante 25 ciclos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La banda VH de aproximadamente 400 pb se purificó en un gel de agarosa al 1 %, se incubó con ADN polimerasa BioTaq, se volvió a purificar en un gel de agarosa y se clonó en el vector pCR2.1TOPO (Invitrogen, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los clones que contenían el inserto de VH se verificaron mediante secuenciación. El fragmento VH original se escindió del plásmido RhD 189 con AscI y XhoI y el fragmento mutado procedente del plásmido pCR2.1TOPO se insertó a su vez. Se preparó plásmido midiprep libre de endotoxina (Macherey-Nagel, Alemania) a partir de una colonia positiva procedente de la clonación y se secuenció para verificar la presencia del fragmento correcto

Se sometió el anticuerpo a análisis SDS-PAGE, se electrotransfirió seguido por la secuenciación N terminal de la banda HC para verificar la sustitución de Gln por Glu (no se muestran los datos).

El intercambio de la Gln N terminal por Glu de la HC del anticuerpo RhD189, muestra un perfil IEX de “3 picos” dando como resultado un perfil diferente característico con sólo un pico (Fig. 17). De esta manera, se eliminó satisfactoriamente la heterogeneidad de carga cambiando el resto de Gln N terminal por un resto de Glu.

Ensayo de unión

Para evaluar si la mutación N terminal afectó la funcionalidad del anticuerpo, se evaluaron tanto el anticuerpo natural, RhD189, como su contraparte Glu mutada, RhD189E, para la unión a eritrocitos RhD positivos.

Se prepararon los eritrocitos a partir de sangre completa obtenida de donantes sanos tras consentimiento informado en el Blood Bank, Aalborg Hospital, DK, lavando la sangre tres veces en PBS (Gibco, Invitrogen, Reino Unido) que contenía albúmina de suero bovino al 1 % (BSA, Sigma-Aldrich, Alemania). Los eritrocitos se volvieron a suspender y se almacenaron a 4º C como una solución al 10 % en ID-Cellstab (DiaMed, Suiza).

Se midió la capacidad de unión de los anticuerpos usando eritrocitos RhD positivos a 5 x 104 células/1l en PBS, BSA al 1 %. Se prepararon diluciones de los anticuerpos en PBS, BSA al 1 % por triplicado en placas de 96 pocillos (Becton Dickinson Labware, NJ, EE.UU.). Se mezclaron cincuenta 1l de la solución del anticuerpo con 50 1l de eritrocitos y se incubaron a 37º C durante 40 min. Se lavaron las células dos veces (300 g, 2 min) en PBS, se añadió BSA al 1 % a cada muestra y se mantuvieron a 4º C durante 30 min. Se lavaron las muestras en PBS, BSA al 1 % y en FacsFlow (Becton Dickinson, Bélgica) (300 g, 2 min), y se volvieron a suspender en 200 1l de FACSFlow. Se hicieron avanzar las muestras en un FACSCalibur (Becton Dickinson, CA, EE.UU) y se llevó a cabo el análisis de los datos usando CellQuest Pro y Excel.

Tal como se muestra en la Fig. 18, no se observó diferencia significativa en la capacidad de unión con los eritrocitos RhD positivos entre la variante Glu y su contraparte natural.

Resumen

La heterogeneidad observada en los perfiles IEX de muchos anticuerpos anti-RhD fue debida a la ciclación parcial del resto de Gln N terminal en estos anticuerpos. Intercambiar la Gln N terminal por los restos Glu de la HC en los anticuerpos anti-RhD elimina la heterogeneidad de carga N terminal inherente, presumiblemente, sin afectar la potencia de unión con los eritrocitos RhD positivos.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Symphogen A/S

<120> UN PROCEDIMIENTO PARA LA CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE UNA PROTEÍNA POLICLONAL RECOMBINANTE O UNA LÍNEA CELULAR POLICLONAL

<130 P104EP01

<160> 45

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<223> Secuencia del cebador

<400> 1 tctcttccgc atcgctgtct 20

<210> 2

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<223> Secuencia del cebador

<400> 2 aggaaaggac agtgggagtg gcac 24

<210> 3

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<223> Secuencia del cebador

<400> 3 cgtagctctt ttaagaggtg 20

<210> 4

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial 5 <223> Secuencia del cebador

<400> 4 accgatgggc ccttggtgga 20

<210> 5 10 <211> 8

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 5 15

<210> 6

<211> 8

<212> PRT 20 <213> Homo Sapiens

<400> 6

25 <210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

30 <400> 7

<210> 8

<211> 7 35 <212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 9

<210> 10

<211> 7

<212> PRT 15 <213> Homo Sapiens

<400> 10

20 <210> 11

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<223> péptido sintético 25

<400> 11

<210> 12 30 <211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<223> péptido sintético

35 <400> 12 <210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<223> péptido sintético

<400> 13

<210> 14

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<223> péptido sintético

<400> 14

<210> 15

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<223> péptido sintético

<400> 15

<210> 16

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<223> péptido sintético

<400> 16

5 <210> 17

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<223> péptido sintético 10

<400> 17

<210> 18 15 <211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<223> péptido sintético

20 <400> 18

<210> 19

<211> 13 25 <212> PRT

<213> Artificial

<223> péptido sintético

<400> 19

<210> 20

<211> 13

<212> PRT 35 <213> Artificial

<223> péptido sintético

<400> 20

<210> 21

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial 10 <223> péptido sintético

<400> 21

15 <210> 22

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<223> péptido sintético 20

<400> 22

<210> 23 25 <211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<223> péptido sintético

30 <400> 23

<210> 24

<211> 21 35 <212> ADN

<213> Artificial

<223> Secuencia del cebador

<400> 24 cacggctgag tattactgtg c 21

<210> 25 5 <211> 17

<212> ADN

<213> Artificial

<223> Secuencia del cebador

10 <400> 25 ttggtggagc cactcga 17

<210> 26

<211> 33 15 <212> ADN

<213> Artificial

<223> Secuencia del cebador

<400> 26 20 agaaatttgt tcggtgacta cgatcttaag tcc 33

<210> 27

<211> 28

<212> ADN 25 <213> Artificial

<223> Secuencia del cebador

<400> 27 agagaattga gcacgcaacg tggataca 28 30

<210> 28

<211> 34

<212> ADN

<213> Artificial 35 <223> Secuencia del cebador

<400> 28 agagagagta ctctatatag cagcagctgg taca 34

5

<210> 29 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial <223> Secuencia del cebador

10 15

<400> 29 gatggtctcc tatagcagca gctggtacc <210> 30 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial <223> Secuencia del cebador 29

<400> 30 gagagactct gttcggggag tcagtagat

29

20 25

<210> 31 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial <223> Secuencia del cebador <400> 31 gggtactctg tatagcagca gctggtaca 29

30 35

<210> 32 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <223> Secuencia del cebador <400> 32 agagacctac aagggtatag aagcagctgg tac 33

<210> 33

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<223> Secuencia del cebador 5

<400> 33 ccgacgattt ttggagtggg cc

<210> 34 10 <211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<223> Secuencia del cebador

15 <400> 34 tctcttccgc atcgctgtct

<210> 35

<211> 24 20 <212> ADN

<213> Artificial

<223> Secuencia del cebador

<400> 35 25 aggaaaggac agtgggagtg gcac

<210> 36

<211> 23

<212> ADN 30 <213> Artificial

<223> Secuencia del cebador

<400> 36 cgttcttttt cgcaacgggt ttg

35 <210> 37

<211> 23

<212> ADN 22

23 <213> Artificial

<223> Secuencia del cebador

<400> 37 5 aagaccgatg ggcccttggt gga 23

<210> 38

<211> 21

<212> ADN 10 <213> Artificial

<223> Secuencia del cebador

<400> 38

aacgggtttg ccgccagaac a 21 15

<210> 39

<211> 19

<212> ADN

<213> Artificial 20 <223> Secuencia del cebador

<400> 39 ccgagggacc tgagcgagt 19

<210>

40 25 <211> 5

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<210>

41 35 <211> 5

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

30

<400> 40

<400> 41

5 <210> 42

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

10 <400> 42

<210> 43

<211> 5

<212> PRT 15 <213> Homo Sapiens

<400> 43

20

<210> 44

<211>33

<212> ADN

<213> Artificial

<223> Secuencia del cebador

25

<400> 44

tgggcgcgcc gaggtgcagc tggtggagtc tgg

33

<210> 45

<211>30

30

<212> ADN

<213> Artificial

<223> Secuencia del cebador

<400> 45

35

ggaggcgctc gagacggtga ccgtggtccc 30

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un procedimiento para caracterizar una muestra que comprende un anticuerpo policlonal recombinante que comprende anticuerpos individuales que tienen diferentes regiones variables, en el que dicha muestra se deriva de un sobrenadante de cultivo celular de un cultivo celular policlonal que produce dicho anticuerpo policlonal recombinante, en el que el cultivo celular policlonal comprende clones individuales que expresan cada uno un miembro individual diferente del anticuerpo policlonal recombinante, tal información se obtiene en lo que respecta a la proporción relativa o presencia de miembros de anticupero individual de dicha muestra, comprendiendo el procedimiento analizar alícuotas de dicha muestra mediante al menos una técnica de caracterización de proteína seleccionada de análisis cromatográfico que separa proteína de acuerdo con una propiedad físico-química distinta del tamaño.

2. 2.

   El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende al menos un análisis cromatográfico individual basado en las propiedades fisicoquímicas seleccionadas entre i) carga neta, ii) hidrofobicidad, iii) punto isoeléctrico y iv) afinidad.

3. 3.

   El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, que comprende además al menos una técnica de caracterización de proteína seleccionada de i) análisis de digestiones proteolíticas de anticuerpos individuales, ii) secuenciación del terminal N “en masa” e iii) análisis usando moléculas de detector específico de los anticuerpos individuales.

4. 4.

   El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho análisis cromatográfico se lleva a cabo como una cromatografía multidimensional.

5. 5.

   El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el análisis de las digestiones proteolíticas de los anticuerpos individuales lleva a cabo con el fin de aislar péptidos marcadores N terminales o péptidos con funcionalidad característica de cadena lateral de aminoácidos.

6. 6.

   El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dichas moléculas detectoras específicas son péptidos anti-idiotipos o anticuerpos anti-idiotipos.

7. 7.

   El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho péptido anti-idiotipo o anticuerpo anti-idiotipo se utiliza en la determinación de las células que producen proteínas individuales en una línea celular policlonal.

8. 8.

   El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha caracterización se basa en el análisis de una o más proteínas centinela presentes en dicha muestra.

9. 9.

   El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que se aplican al menos dos técnicas analíticas para analizar dicha muestra.

10. 10.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que una técnica analítica es una técnica de caracterización de proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, y la otra técnica analítica es un análisis genético de las secuencias de codificación de proteína de las células de dicho cultivo.

11. 11.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho análisis genético se seleccionada de RFLP, T-RFLP, análisis por micromatriz, PCR cuantitativa y secuenciación de ácido nucleico.

12. 12.

    El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que (a) se obtienen muestras de un cultivo celular policlonal simple en diferentes momentos durante el cultivo, y se comparan las proporciones relativas de dichos anticuerpos individuales de sus secuencias de codificación, o

    (b) se obtienen muestras de diferentes cultivos de células policlonales en un determinado momento, y se comparan las proporciones relativas de dichos anticuerpos individuales y de forma opcional de sus secuencias de codificación.
13. 13. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, comprendiendo dicho procedimiento un análisis cromatográfico basado en la carga neta, en el que las proteínas recombinantes que presentan heterogeneidad de carga producida por ciclación de restos de glutamina N terminales se someten a un procedimiento en el que se elimina la heterogeneidad de carga N terminal mediante cambio de dichos residuos de glutamina N terminal por otro aminoácido.