KR20070032078A - 재조합 폴리클로날 단백질 또는 폴리클로날 세포주의구조적 특성화 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생성 동안 폴리클로날 세포주의 안정성 및 최종 폴리클로날 생성물의 배치-투-배치 일관성을 평가하는데 사용될 수 있는 구조적 특성화 플랫폼을 제공한다. 구조적 특성화 플랫폼은 유전자 분석 뿐만 아니라 단백질 특성화 기술에 기초하며, 단독으로 또는 조합하여 폴리클로날 세포주 및 최종 생성물을 특성화하기 위해 필요한 정보를 제공한다. 예를 들어 재조합 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체의 혼합물의 경우에 상이한 동형 단백질의 수집물을 플랫폼 기술로 분석한다.

Description

재조합 폴리클로날 단백질 또는 폴리클로날 세포주의 구조적 특성화 방법 {A PROCEDURE FOR STRUCTURAL CHARACTERIZATION OF A RECOMBINANT POLYCLONAL PROTEIN OR A POLYCLONAL CELL LINE}
본 발명은 최종 생성물의 배치-투-배치 (batch-to-batch) 일관성 뿐만 아니라 단일 생성을 진행하는 동안 조성물의 안정성을 입증하기 위해, 재조합 폴리클로날 단백질 또는 상기 단백질을 생성하는 폴리클로날 세포주의 구조적 특징을 나타내는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 재조합 폴리클로날 항체의 특징을 나타내는 방법에 관한 것이다.
항체의 예방적 또는 치료적 투여가 (소위 수동적 면역화) 감염성 작용제를 제거하는 신체의 면역 시스템의 능력을 증진시킬 수 있음이 오랫동안 인식되어 왔다. 이러한 치료적 항체는 역사적으로 인간 혈장으로부터 수득되었다 (이로부터 항체 조성물이 면역글로불린 또는 감마글로불린이라 명명됨). 상기 항체를 수득하기 위하여, 혈액의 푸울(pool)을 사람의 면역 공여체로부터 수집하고 면역글로불린 분획을 추출 및 정제한다. 면역글로불린의 분회만이 특정 항원에 특이적일 것이다. 면역글로불린의 치료적 사용은 제한된 수의 공여체, 고가의 제조과정, 공여체로부터의 감염성 오염물질의 위험성, 부득이한 배치-투-배치 변형 뿐만 아니라 성 가신 투여 섭생과 같은 여러 가지 제한으로 인해 까다롭다.
최근에 재조합 모노클로날 항체가 대안적인 면역글로불린 생성물로서 제공되었다. 그러나, 이들은 단일 표적에 대해서만 유도되며, 따라서 감염성 작용제와 같은 복잡하거나 동적인 표적에 대해서는 유효하지 않을 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해 모노클로날 항체를 혼합시키는 몇몇 실례가 존재한다 (예컨대, Nowakowski, A. et al. 2002. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 11346-11350 and US 5,123,130).
최근의 재조합 생성 기술은 예방적 및 치료적 투여에 적합한 고도로 특이적인 폴리클로날 항체를 개발하였다 (WO 2004/061104). 재조합 폴리클로날 항체 (rpAb)는 재조합 폴리클로날 단백질을 구성하는 개체원에 대한 별도의 조작, 제조, 정제 또는 특성화 없이 생체반응기로부터 단일 제조물로서 정제될 수 있다. 그러나, 이러한 생성 방법은 경시적으로 항체 분자의 복잡한 혼합물의 동정을 입증하고 이들의 일관된 생성을 증명하기 위한 공정을 필요로 한다.
또한, 재조합 기술을 이용하여 산업적으로 생성된 폴리클로날 항체는 국가적 및 초국가적인 관리 기관으로부터 연구 또는 치료 약물로서 승인되기 위해 어느 정도까지 특성화되어야 할 것이다. 재조합 폴리클로날 항체 접근법이 전혀 새로운 개념이기 때문에, 개개 단백질의 상대적인 비율과 관련하여 다수의 차이를 지니나 고도로 동형인 단백질을 포함하는 샘플을 특성화한다는 발표는 이전에 대두된 바 없다. 따라서, 혈액-유래된 면역글로불린은 비임상적 및 임상적 효능 데이터 및 종종 역사적 안전성 데이터 뿐만 아니라 미정제 화학, 제조과정, 및 대조군 (CMC) 파라미터, 예컨대 정제, 결합 역가, 및 외래 작용제의 부재를 근거로 하여 일반적으로 승인된다. 이렇게 단순한 접근법은 물론 재조합에 의해 생성된 단백질에 대해서는 허용될 수 없다. 따라서, 소수의 모노클로날 항체의 혼합물에 대하여, 상기 혼합물은, 생물학적 검정과 결합된 광범위한 단백질 화학 특성화 기술을 이용하여 혼합물 중 각 구성 항체를 개별적으로 특성화하기 위해 처리되어야 한다라고 관리 지침에 언급되어 있다. 그러나, 이것은 기술적으로 실행할 수 있는 접근법이 아니거나, 10개, 20개 또는 심지어 더 상이한 항체를 기재로 하는 순종 폴리클로날 조성물에 적합하다.
본 발명은 재조합 폴리클로날 단백질, 특히 폴리클로날 세포주로부터의 재조합 폴리클로날 항체와 같은 상이한 동형 단백질의 혼합물의 일관된 생성을 입증하기 위한 구조적 특성화 플랫폼을 제공한다.
예방적 및 치료적 용도의 재조합 폴리클로날 단백질을 산업적으로 생성하기 위한 선행조건은 발현 동안 클로날 다양성의 유지이다. 따라서, 폴리클로날 항체를 생성하는 폴리클로날 세포주의 클로날 다양성 뿐만 아니라 임의의 요망되는 시점, 및 임의의 적절한 샘플에서 폴리클로날 단백질 중 개개 단백질의 상대적인 표시를 모니터링하고 측정하여 단일 진행시 뿐만 아니라 최종 생성물의 배치-투-배치 변형의 안정성을 분석할 수 있는 것이 중요하다.
재조합 폴리클로날 항체 또는 재조합 폴리클로날 T 세포 수용체 (TcR)와 같은 동형의 단백질 조성물은 매우 유사한 물리-화학적 특성을 지니는 상이한 단백질로 구성된다. 단일 단백질인 경우 정제가 공정 동안 다양성의 손실 없이 수행될 수 있으므로, 이렇게 하는 것이 재조합적으로 생성된 폴리클로날 단백질을 정제할 때 이롭다. 그러나, 물리-화학적 특성에 있어서의 유사성이 하나의 개체원을 다른 개체원으로부터 구분짓기 어렵게 만들기 때문에, 이러한 유사성이 폴리클로날 단백질의 개체원의 상대적인 분포를 특성화할 때 챌린지(challenge)를 제공한다.
가장 일반적으로, 재조합 폴리클로날 단백질을 생성할 때, 폴리클로날 단백질을 엔코딩하는 서열이 재조합 폴리클로날 단백질을 생성하기 위한 폴리클로날 제조용 세포주의 발생 이전에 단리, 스크리닝 및 서열화되었기 때문에, 원래 조성물이 공지되어 있다. 이러한 세포주를 생성하려면 참조로서 본원에 포함된 WO 2004/061104호를 참조한다. 이에 대한 예외로는, 예컨대 회복기 환자로부터의 스크리닝되지 않았거나 선별되지 않은 라이브러리를 직접 사용하여 재조합 폴리클로날 항체를 생성하는 경우가 있을 수 있다.
배양 및 정제 후 출력물(재조합 폴리클로날 단백질)의 다양성이 입력물(엔코딩 서열의 라이브러리)의 다양성과 공통점이 있음을 보장하기 위해, 폴리클로날 단백질의 개체원 및/또는 폴리클로날 제조용 세포주내에서 이들의 엔코딩 서열의 상대적인 비율과 관련된 정보를 수득하는 것이 필요할 것이다. 본 발명은 유전적 분석 뿐만 아니라 단백질 특성화 기술에서 폴리클로날 세포주 및 폴리클로날 단백질 둘 모두의 다양성과 관련된 정보를 제공할 수 있는 구조적인 특성화 플랫폼을 제공한다.
정의
"항-유전형 항체"라는 용어는 폴리클로날 단백질의 개체원의 변이 부분에 특이적으로 결합하는 전장 항체 또는 이의 단편 (예컨대 Fv, scFv, Fab, Fab' 또는 F(ab)2)을 언급한다. 바람직하게는 본 발명의 항-유전형 항체가 폴리클로날 항체 또는 폴리클로날 TcR의 개체원의 변이 부분에 특이적으로 결합된다. 항-유전형 항체의 특이성은 폴리클로날 항체 또는 폴리클로날 T 세포 수용체의 개체원의 항원-특이적 부분, 소위 V- 영역에 대해 유도되는 것이 바람직하다. 그러나, 이것은 또한 개체원의 정의된 서브-개체, 예컨대 혼합물에서 표시되는 특이적 VH 유전자 패밀리에 대해 특이성을 나타낼 수 있다.
"항-유전형 펩티드"라는 용어는 특이적으로 결합할 수 있어서 동형 단백질의 혼합물내에서 개개 단백질원을 동정할 수 있도록 하는 특이적 펩티드-리간드를 언급한다. 바람직하게는 본 발명의 항-유전형 펩티드가 폴리클로날 항체 또는 폴리클로날 TcR의 개체원에 특이적으로 결합된다. 본 발명의 항-유전형 펩티드는 개개 항체 또는 개개 T 세포 수용체의 서열의 항원-특이적 부분에 대해 유도되는 것이 바람직하다. 그러나 항-유전형 펩티드는 또한 개개 멤버의 정의된 서브-개체에 대해 특이성을 나타낼 수 있다.
""벌크" N-말단 서열화"라는 용어는 다수의 동형의 변이 단백질 분자를 포함하는 샘플, 예컨대 폴리클로날 단백질의 N-말단 단백질 서열화를 언급한다. 이러한 벌크 서열화는 샘플내에 동시에 존재하는 상이한 모든 단백질의 서열 정보를 제공한다. 샘플의 개개 멤버 중에서 아미노산이 변경된 위치에서, 이들의 양을 측정할 수 있고, 일정치 않은 위치에서 개개 아미노산의 상이한 양은 특정 변이를 함유하는 단백질 서브-개체와 관련된 정보를 제공할 것이다. N-말단 서열화된 단백질이 하나 이상의 서브-유닛을 함유하는 경우, 이들을 서열화 이전에 분리시켜 복잡성을 감소시키는 것이 바람직하며, 예컨대 샘플이 폴리클로날 항체인 경우, 서열화 이전에 중쇄를 경쇄로부터 분리시킬 수 있다.
"클로날 다양성" 또는 "폴리클로날"이라는 용어는 폴리클로날 단백질, 이를 엔코딩하는 핵산 서열, 또는 이를 생성하는 폴리클로날 세포주의 변이성 또는 다양성을 언급한다. 변이성은 폴리클로날 단백질의 개체원 또는 엔코딩 서열의 라이브러리 간의 아미노산 서열 또는 핵선 서열의 차이를 특징으로 한다. 폴리클로날 세포주에 대하여, 클로날 다양성은 세포주내에 표시되는 핵산 서열의 변이성에 의해, 예컨대 개개 세포의 게놈으로의 단일-부위 통합으로서 평가될 수 있다. 그러나, 이것은 세포주내에서 세포 표면상에 표시되는 아미노산 서열의 변이성으로서 평가될 수도 있다.
"에피토프"라는 용어는 T-세포 수용체 또는 항체가 결합될 항원성 분자의 일부를 언급한다. 항원 또는 항원성 분자는 일반적으로 수 개 또는 더욱 많은 에피토프를 동시에 제공할 것이다.
"면역글로불린"이라는 용어는 일반적으로 혈액 또는 혈청에서 발견되는 항체 혼합물의 집합적인 명시로서 사용된다. 그러므로, 면역글로불린은 다른 기원으로부터 유래된 항체 혼합물, 예컨대 재조합 면역글로불린을 명시하기 위해 사용될 수도 있다.
본원에서 사용된 "개개 클론"이라는 용어는 특정 단백질, 예컨대 모노클로날 항체를 발현시키는 동질유전자 개체군을 언급한다. 이러한 개개 클론은 예를 들어 숙주 세포를 요망되는 핵산으로 트랜스펙션시켜 수득될 수 있고, 포지티브 트랜스펙턴트를 선별한 후, 단일 클론을 전개시키거나 다수의 단일 클론은 푸울링하고 전개시킬 수 있다. 폴리클로날 세포주는 폴리클로날 단백질의 상이한 개별적인 멤버를 발현시키는 개개 클론을 혼합시켜 생성될 수 있다.
"개별적인 멤버" 또는 "별개의 멤버"라는 용어는 상이하나 동형인 단백질 분자, 예컨대 폴리클로날 단백질을 포함하는 단백질 조성물의 단백질 분자를 언급하며, 개별적인 단백질 분자는 조성물의 다른 분자와 동형이나, 또한 폴리펩티드 서열의 하나 이상의 스트레치를 함유하고, 이것은 폴리클로날 단백질의 개별적인 멤버 간에 가변 영역이라 불리는 아미노산 서열의 차이를 특징으로 한다. 예를 들어, Ab1 내지 Ab50으로 구성된 폴리클로날 항체에서, 서열이 Ab1인 모든 단백질은 폴리클로날 항체의 개별적인 멤버로서 고려될 것이며 Ab1은 CDR3 영역에서 예를 들어 Ab2 단백질과 상이할 수 있다. 개별적인 멤버의 서브-개체군은 예를 들어 Ab1, Ab12 및 Ab33에 속하는 항체로 구성될 수 있다.
"폴리클로날 항체"라는 용어는 동일하거나 상이한 항원 상에서 수 개의 상이한 특이적인 항원성 결정인자와 결합하거나 반응할 수 있는 상이한 항체 분자의 조성물을 언급한다. 폴리클로날 항체의 변이성은 폴리클로날 항체를 구성하는 개개 항체의 소위 가변 영역, 특히 상보성 결정 영역 (CDR)1, CDR2 및 CDR3 영역에 존재한다.
"폴리클로날 제조용 세포주", "폴리클로날 세포주", "폴리클로날 마스터 세포 뱅크 (pMCB)" 및 "폴리클로날 작업 세포 뱅크 (pWBC)"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 관심있는 변이 핵산 서열의 라이브러리로 트랜스펙션된 단백질-발현 세포의 개체군을 언급한다. 바람직하게는, 재조합 폴리클로날 제조용 세포주를 함께 구성하는 개개의 세포가 관심있는 별개의 핵산 서열의 단 한개의 복사체를 지니며, 이는 관심있는 재조합 폴리클로날 단백질의 하나의 멤버를 엔코딩하고, 각 복사체는 각 세포 게놈의 동일 부위로 통합된다. 이러한 제조용 세포주를 구성할 수 있는 세포는, 예를 들어 세균, 진균, 진핵 세포, 예컨대 효모, 곤충 세포 또는 포유동물 세포일 수 있고, 특히 무한증식 포유동물 세포주, 예컨대 CHO 세포, COS 세포, BHK 세포, 골수종 세포 (예컨대, Sp2/0 세포, NS0), NIH 3T3, YB2/0 및 무한증식하도록 된 사람 세포, 예컨대 HeLa 세포, HEK 293 세포 또는 PER.C6일 수 있다.
본원에서 사용된 "폴리클로날 단백질"이라는 용어는 바람직하게는 면역글로불린 슈퍼패밀리로부터 선택된, 상이한 동형의 단백질 분자를 포함하는 단백질 조성물을 언급한다. 보다 바람직한 것은 항체 또는 T 세포 수용체 (TcR)인 동형의 단백질 분자이다. 따라서, 각 단백질 분자는 조성물의 다른 분자와 동형이나, 폴리클로날 단백질의 별개의 변이 멤버로서 명명된 개별적인 멤버 간의 아미노산 서열의 차이를 특징으로 하는 다양한 폴리펩티드 서열의 하나 이상의 스트레치를 함유한다. 이러한 폴리클로날 단백질의 공지된 예로는 항체, T 세포 수용체 및 B 세포 수용체가 있다. 폴리클로날 단백질은 단백질 분자의 규정된 서브세트로 구성될 수 있으며, 이것은 예컨대 요망된 표적 항원에 대한 폴리클로날 항체의 경우에 요망되는 표적에 대한 공유된 결합 활성과 같은 공통의 특징에 의해 정의된다. 재조합 폴리클로날 단백질은 일반적으로 이러한 규정된 분자의 서브세트로 구성되며, 이 때 각 멤버의 서열의 공지되어 있다. 단지 드물게, 재조합 폴리클로날 단백질이 비-표적-특이적 단백질의 상당 부분을 함유한다는 점에서, 재조합 폴리클로날 단백질이 혈청-유래된 면역글로불린과 공통점을 지니는 경우가 있을 수 있다.
"폴리클로날 T 세포 수용체 (TcR)"라는 용어는 동일하거나 상이한 항원으로부터의 수 개이 상이한 특이적인 항원성 결정인자와 결합할 수 있거나 반응할 수 있는 상이한 TcR 분자의 조성물을 언급한다. 폴리클로날 TcR의 변이성은 소위 폴리클로날 TcR을 구성하는 개개 TcR 분자의 가변 영역, 특히 CDR1, CDR2, CDR3 및 CDR4 영역에 존재한다. 본 발명의 TcR 분자는 알파-베타 사슬 또는 감마-델타 사슬의 공학처리된 가용성 이량체이다. 이렇게 공학처리된 TcR이 예를 들어 문헌[Willcox, B.E. et al. 1999. Protein Sci 8, 2418-2423]에 개시되어 있다.
"단백질"이란 용어는 길이 또는 번역 후 개질과 무관하게, 임의의 아미노산 사슬을 언급한다. 단백질은 단량체 또는 다량체로 존재할 수 있으며, 둘 이상이 어셈블링된 폴리펩티드 사슬, 단백질의 단편, 폴리펩티드, 올리고펩티드 또는 펩티드를 포함한다.
"파수(sentinel) 단백질"이라는 용어는 폴리클로날 단백질의 생성 동안 또는 상이한 배치에서 폴리클로날 단백질의 존재를 모니터링할 수 있는 이의 개별적인 멤버를 언급한다. 일련의 관련 샘플에서 파수 단백질의 존재에 대한 일관성은 배치 간에 폴리클로날 단백질의 발현 또는 경시적으로 단일 생성에서의 안정성을 반영할 것이다. 추가로, 이것은 재조합에 의해 생성된 폴리클로날 단백질의 정제와 같은 다운스트림 공정 동안 다양성의 유지를 반영할 것이다.
"유일한 마커 펩티드"라는 용어는 폴리클로날 단백질의 개별적인 멤버의 가변 영역으로부터 유래된 다수의 펩티드를 언급한다. 펩티드는 프로테아제 처리 또는 단백질 단편화의 다른 수단에 의해 생성되는 것이 바람직하며, 폴리클로날 단백질의 개별적인 단일 멤버로 분명하게 할당될 수 있는 펩티드를 유일한 마커 펩티드로서 명명한다.
도면의 설명
도 1: 9주 배양 후 부분표본 3948 및 3949로부터의 항-RhD 재조합 폴리클로날 항체 (항-RhD rpAb) 조성물의 양이온-교환 크로마토그램. 하부 다이어그램이 부분표본 3949를 나타내고 상부 다이어그램이 부분표본 3948을 나타낸다. 상부 다이어그램의 Y-축은 이를 하부 다이어그램으로부터 분리하기 위해 제거되었다. 피크 A-J는 최종 전하가 상이한 항체 및 이질의 전하를 나타내는 개별적인 항체들을 포함한다.
도 2: 11주 배양 후 항-RhD rpAb를 생성하는 폴리클로날 세포주 부분표본 3948+ 및 3949+ (FCW065)로부터 유래된 RT-PCT 생성물 상의 HinfI RFLP 분석을 도시하는 겔 사진.
도 3: 8개의 상이한 항-레수스(Rhesus) D 항체를 지니는 항-RhD rpAb를 발현시키는 폴리클로날 세포 배양액으로부터의 항-레수스 D 항체 경쇄의 T-RFLP 패턴. 8개의 상이한 항-레수스 D 클론이 화살표로 표시된 피크에 할당되었다.
도 4: 25개의 상이한 항-레수스 D 항체를 지니는 항-RhD rpAb를 발현시키는 폴리클로날 세포 배양액으로부터의 항-레수스 D 항체의 중쇄 가변 영역의 T-RFLP 패턴. 25개의 상이한 항-레수스 D 클론이 화살표로 표시된 피크에 할당되었다.
도 5: 5주 동안 배양된 폴리클로날 세포 배양액으로부터의 서열을 엔코딩하는 8개의 상이한 항-레수스 D 중쇄의 T-RFLP에 의해 예측되는 cDNA 분포.
도 6: 8개의 상이한 항체를 지니는 항-RhD rpAb의 상대적인 함량(%)을 양이온-교환 크로마토그래피를 이용하여 도시한다. 통합된 크로마토그래피 피크를 체류 시간으로부터 개별 항체 및 동일한 조건하에 개별적으로 양이온-교환 크로마토그래피를 이용하여 분석된 단일 항체로부터 수득되어진 피크 패턴에 할당하였다.
도 7: 4주 배양 후 수득된 샘플로부터의 25개의 개별적인 멤버를 지니는 항-RhD rpAb의 양이온-교환 크로마토그램. 피크 AC1 내지 25는 최종 전하가 상이한 항체 및 이질의 전하를 나타내는 개별적인 항체들을 포함한다.
도 8: 10개의 개별적인 멤버를 지니는 재조합 폴리클로날 항-RhD 항체의 양이온-교환 크로마토그래피로부터의 용리 프로파일. 글자는 2차원에서 RP-HPLC 처리된 피크를 나타낸다.
도 9: 도 8의 분획 B5의 RP-HPLC로부터의 용리 프로파일을 도시한다.
도 10: 컬러로 작성된 단백질-지도 (회색-등급으로 표시됨)에 의해 가시화된, 10개의 개별적인 멤버를 지니는 재조합 폴리클로날 항-RhD 항체의 2D LC 조성물 분석을 도시한다.
도 11: 8개의 개별적인 멤버를 지니는 재조합 폴리클로날 항-RhD 항체로부터 정제된 LC의 Asp-N 분해의 강한 양이온-교환 크로마토그래피에서 얻은 용리 프로파일을 도시한다. 굵게 표시된 수평선은 마커 펩티드를 동정하기 위해 MALDI-TOF 분석된 분획을 나타낸다.
도 12: 항-유전형 펩티드 PEP162, PEP202 및 PEP305를 이용하여 3개의 개별적인 ELISA 분석으로부터 수득된 ELISA 데이터를 이용하여, 25개의 개별적인 멤버를 지니는 항-RhD rpAb 상에서 수득된 OD280 IEX 크로마토그램의 오버레이를 도시한다. ELISA 분석을 이온-교환 크로마토그래피에 의해 수득된 각 분획에 대해 수행하였다. ELISA 데이터를 총 OD%에 대하여 표준화하여 서로에 대해 비교되는 PEP162, PEP202 및 PEP305 각각을 이용한 3개의 ELISA 검정을 수행하였다.
도 13: 배양 동안 상이한 배양 시점에서 3개의 파수 항체 항-RhD162, 202 및 305의 분포를 도시한다. G8은 생체반응기에 접종한 지 8일 후에 상응한다.
도 14: PEP202 사량체로 염색된 3개의 세포주의 FACS 데이터. (A) PEP202 네거티브 세포주 RhD162를 도시하고, (C) 세포주 RhD162 및 RhD202의 50% 혼합물을 도시한다 (실험에서 혼합물 a에 상응함). A, B 및 C의 제1 패널은 FSC-SSC의 점 도면을 나타내고, 이 때 R1은 크기(FSC) 및 입도(SSC)에 기초한 살아있는 건강한 세포에 대한 게이팅(gating)이다. 중간 패널의 히스토그램은 세포의 형광 강도를 나타낸다. R6 게이트는 사량체 염색된 세포로 둘러싸인다. 마지막 패널은 계산에 사용된 R6의 세포의 백분율을 나타낸다.
도 15: 포획 용리(A), 세파덱스(Sephadex) G-25(B), DEAE-세파로스(C), 및 MEP 하이퍼셀(Hypercel)(D)에 따라서 수집된 재료에 의해 표시되는 25개의 개별적인 멤버를 함유하는 항-RhD rpAb 샘플을 다운스트림 가공하는 동안 상이한 단계에서 취해진 샘플을 나타내는 양이온-교환 크로마토그래피 프로파일.
도 16: 3개의 상이한 전하 패턴을 나타내는 3개의 대표적인 모노클로날 항-RhD 항체의 IEX 프로파일. (A) 동종, (B) "3 피크" 패턴, (C) 복합 패턴.
도 17: RhD189의 IEX 분석 및 돌연변이된 Glu 변이 RhD189E.
도 18: Glu 변이 RhD189E의 결합 활성, 및 이의 본래의 대조물 RhD189. RhD-포지티브 적혈구에 대한 항체의 결합을 FACS에 의해 측정하고, 평균 형광 강도(MFI)를 항체 농도의 함수로서 도시한다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 한 측면은 (i) 상이한 가변 영역을 지니는 상이한 동형 단백질 또는 (ii) 이러한 단백질을 생성하는 세포주를 포함하는, 샘플 중 개별적인 멤버의 상대적인 비율과 관련된 정보를 수득하기 위해 구조적 특성화에 대한 플랫폼을 제공하는 것이다. 특성화 플랫폼은 생성 또는 정제 과정 동안이나 상이한 동형의 단백질을 포함하는 조성물의 장기간 저장 동안 상이한 양상들을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 특성화 플랫폼이 i) 단일 샘플내에서 개별적인 멤버 또는 서로에 관련된 다소의 개별적인 멤버의 상대적인 표시를 측정하고, (ii) 상이한 샘플에서 하나 이상의 개별적인 멤버의 상대적인 비율을 평가하여 배치-투-배치 일관성을 측정하고, (iii) 하나 이상의 개별적인 멤버의 실질적인 비율을 평가하는 목적 중 어느 하나를 위해 사용된다. 임의로, 이것을 최초에 폴리클로날 제조용 세포주를 생성하기 위해 사용된 벡터의 라이브러리와 비교할 수 있다. 특성화 플랫폼은 특히 폴리클로날 세포주의 클로날 다양성 및/또는 세포주에 의해 생성된 폴리클로날 단백질에서 개별적인 단백질의 표시를 모니터링하는데 유용하다. 개개의 생성을 진행하는 동안 조성물의 안정성 및 배치-투-배치 일관성 둘 모두를 모니터링할 수 있다. 대안적으로, 플랫폼 절차는 또한 폴리클로날 단백질 또는 모노클로날 항체의 혼합물을 포함하는 상이한 동형의 단백질 혼합물의 정제된 조성물에 적용되어, 예를 들어 그러한 조성물에서 개별적인 멤버의 장기간 안정성을 평가할 수 있다.
본 발명의 일 구체예는 상이한 가변 영역을 지니는 상이한 동형의 단백질 또는 그러한 단백질을 생성하는 세포를 포함하는 샘플을 특성화하여, 상기 단백질의 개별적인 멤버 또는 이의 엔코딩 서열의 상대적인 비율 또는 존재에 관한 정보를 수득하는 방법이며, 상기 방법은 하나 이상의 단백질 특성화 기술 및/또는 단백질-엔코딩 서열의 하나 이상의 유전자 분석에 의해 상기 샘플의 부분표본을 분석하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 구조적 특성화 플랫폼은 단백질 특성화 기술 뿐만 아니라 유전자 분석으로부터 선택된 다수의 분석적 기술로 구성된다. 따라서, 구조적 특성화 플랫폼은 하기 섹션에 기술된 임의의 수의 개별적인 구체예들로 구성될 수 있다. 구체예에 기술된 분석적 기술 중 어느 하나로부터 샘플에 관한 정보를 수득하는 것이 충분할 수 있다. 그러나, 상기 분석적 기술 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개로부터 정보를 수득하고, 하기 개시된 개별적인 구체예들을 조합시켜 특성화 플랫폼을 생성하는 것이 바람직하다. 수 개의 분석적 기술의 조합은 폴리클로날 혼합물의 상대적인 또는 절대적인 조성과 관련된 보다 설명적인 데이터를 제공할 수 있게 해 준다. 이러한 기술로부터 수득된 정보는 정량적일 뿐만 아니라 정성적인 성질일 수 있고, 협력하여 분석되는 샘플의 전체적인 특성을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 하나의 분석적 기술은 단백질 특성화 기술이고, 또 다른 분석적 기술은 유전자 분석이다.
유전자 분석이란 제한 단편 길이 다형태성(RFLP) 분석, 말단-RFLP(T-RFLP), 마이크로어레이 분석, 정량적 PCR, 예컨대 실시간 PCR, 및 핵산 서열화와 같은 기술을 언급한다.
단백질 특성화 기술은 공지되지 않은 단백질을 특성화하기 위해 단백질학 분야에서 일반적으로 사용되는 기술을 언급하며, 예컨대 i) 물리-화학적 특성에 따라 단백질을 분리하는 크로마토그래피 분석, (ii) 동형 단백질의 단백질분해 소화물의 분석, (iii) 동형 단백질에 대한 특이적 검출 분자를 이용한 분석이 있다.
동형 단백질의 복잡한 푸울을 특성화하기 위해 상기 기술된 분석적 기술과 함께 사용될 수 있는 본 발명의 추가의 개념이 본 발명과 관련하여 개발되었다. 상기 개념은 동형 단백질 (예컨대, 폴리클로날 항체 또는 폴리클로날 TcR)의 푸울 또는 동형 단백질을 생성하는 세포 푸울 (예컨대, 폴리클로날 제조용 세포주)의 표면상에 존재하는 다수의 파수 단백질의 선별에 기초한다. 파수 단백질을 정량적 및 정성적으로 특성화하여, 이러한 단백질의 서브-개체군이 생성 동안 폴리클로날 세포 배양액의 상청액 또는 세포 표면상에서 일관된 방식으로 존재하는지를 입증한다. 파수 단백질은 예를 들어 동형 단백질, 예컨대 항-유전형 분자와 같은 개별적인 멤버에 특이적인 검출 분자를 이용하여 분석될 수 있다. 파수 단백질 개념은 상이한 세포 배양 배치간에 일관성을 측정하는데 적용될 수 있다. 파수 단백질의 개념은 프로테아제 처리에 의해 폴리클로날 단백질로부터 유래된 유일한 펩티드로 연장될 있고, 폴리클로날 단백질이 폴리클로날 항체 또는 TcR인 경우 상기 파수 단백질이 CDR의 일부를 함유하는 것이 바람직하다. 유전자 레벨에서 수행된 분석을 폴리클로날 단백질을 엔코딩하는 라이브러리의 개별적인 멤버로부터의 유일한 핵산 서열에 기초하여, 파수 원리에 적용시킬 수 있다. 특히, 항체 또는 TcR의 CDR 영역에 상응하는 핵산 서열을 파수 핵산 서열로서 선택할 수 있고, 가장 바람직한 것은 CDR3 영역이다. 파수 단백질, 펩티드 또는 핵산 서열은 폴리클로날 단백질의 멤버 또는 이를 엔코딩하는 핵산 서열이 선택된 분석적인 기술에 의해 구분될 수 있는가에 따라서, 개별적인 분석 기술에 대해 달라질 수 있다.
폴리클로날 제조용 세포주의 클로날 다양성의 유전자 분석
본 발명의 몇몇 구체예에서, 폴리클로날 단백질을 생성하기 위한 발현 시스템의 폴리클론성을 폴리클로날 단백질의 특정 멤버를 엔코딩하는 세포량 및/또는 폴리클로날 단백질의 개별적인 멤버를 엔코딩하는 mRNA 레벨을 평가하기 위해 모니터링한다. 이것은, 예를 들어, RFLP 또는 T-RFLP 분석, 올리고누클레오티드 마이크로어레이 분석, 정량적 PCR, 예컨대 실시간 PCR, 및 제조용 세포주로부터 수득된 유전자 서열의 가변 영역의 핵산 서열화를 이용하여 핵산 mRNA 또는 게놈 레벨에서 모니터링될 수 있다. 대안적으로, 동일한 기술을 정성적으로 이용하여 폴리클로날 세포주의 다양성을 입증할 수 있다. 폴리클로날 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열은 배양 동안 상이한 시점에 단일 폴리클로날 세포 배양액으로부터 수득된 샘플상에서 모니터링하여, 생성을 진행하는 내내 개별적인 엔코딩 서열의 상대적인 비율을 모니터링하고 이의 조성물 안정성을 측정할 수 있다. 대안적으로, 폴리클로날 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 특정 시점에 상이한 폴리클로날 세포 배양액으로부터 수득된 샘플상에서 모니터링하여, 상이한 배치에서 개별적인 엔코딩 서열의 상대적인 비율을 모니터링하고, 배치-투-배치 변화를 측정할 수 있다.
바람직하게는 유전자 분석에 사용된 샘플이, 예컨대 침전에 의해 배양액의 샘플이 부화된 세포 배양 분획이다. 샘플은 일반적으로 요망되는 시점에 세포 배양액의 분획을 회수하고, 매질을, 예를 들어 원심분리에 의해 제거시켜 수득된다. 배치-투-배치 일관성을 비교하기 위한 샘플은 바람직하게 생성을 위한 시험관내 세포 연령이 지정된 세포로부터 수득된다.
RFLP/T-RFLP
RFLP 및 T-RFLP 분석은 게놈 레벨 또는 mRNA 레벨에서 수행될 수 있다. 각 세포만이 관심있는 서열의 일 복사체를 함유하도록 폴리클로날 제조용 세포주를 생성하는 경우, 게놈 레벨에서의 분석은 폴리클로날 단백질의 개별적인 멤버를 생성하는 제조용 세포주내에서 세포의 상대적인 비율과 관련된 정보를 제공할 것이다. 반면 mRNA 레벨에서의 분석은 폴리클로날 단백질의 개별적인 멤버의 잠재적인 발현 레벨과 관련된 정보를 제공할 것이다. mRNA 레벨에서의 분석은 일반적으로 제한 분석 이전에 mRNA를 cDNA로 역전사시켜 수행된다. 그러나, mRNA상에서 분석을 직접 수행할 수도 있다.
말단-RFLP 분석에서, PCR 또는 RT-PCR에 사용된 전향 및/또는 역향 프라이머(들)를 표지하여 PCR 단편의 말단 표지를 제공한다. 적합한 제한 효소로 분해시켜 상이한 크기의 단편을 얻고 전기영동, 바람직하게는 모세관 전기영동에 의해 분리할 수 있으며, 단편은 표지 암플리콘을 통해 검출될 수 있다 (Liu et al. 1997, Applied and Environmental Microbiology 63, 4516-4522). 적합한 표지가 형광, 방사능, 비색, X-선 회절 또는 흡수, 자기 또는 효소 활성에 의해 검출될 수 있는 시그날을 제공할 수 있으며, 예를 들어 형광발색단, 발색단, 방사성 동위원소(특히, 32P, 33P, 35S 및 125I), 전자-조밀 시약, 효소, 및 특이적 결합 파트너를 지니는 리간드가 있다. 바람직하게는, 형광발색단을 표지로서 이용한다.
많은 다양성을 지니는 폴리클로날 제조용 세포주에서, 각각의 개별적인 엔코딩 서열에 대하여 유일한 제한 단편을 수득하는 것을 불가능할 수 있다. 그러한 경우에는, 폴리클로날 제조용 세포주의 클로날 다양성을 모니터링하기 위해 파수 핵산 서열을 선택할 수 있다. 대안적으로, 크기에 따라서 분리될 수 없는 단편을 서열화하여 모든 개별적인 엔코딩 서열의 분포를 평가할 수 있다.
올리고누클레오티드 마이크로어레이 분석
DNA 칩(chip)과 같은 올리고누클레오티드 마이크로어레이를 이용하여 고체 표면에 부착된 프로브에 대한 세포주로부터 생성된 표지된 DNA의 하이브리드화를 측정함에 의해 폴리클로날 세포주의 게놈 DNA 레벨 또는 mRNA 레벨을 측정할 수 있다 (Guo, Z. et al 1994. Nucleic Acids Res. 22, 5456-5465).
프로브는 폴리클로날 세포주에 존재할 것으로 예상되는 서열을 대표하는 이중 가닥 cDNA 서열 (폴리클로날 세포주 자체 또는 폴리클로날 세포주를 포함하는 숙주 세포를 트랜스펙션시키는데 이용된 DNA 라이브러리로부터 유래됨) 또는 센스 올리고누클레오티드 (길이 20-90 nt)일 수 있다. 프로브를 유리, 플라스틱 또는 겔 매트릭스와 같은 고체 표면에 부착시키고, 이중 가닥 프로브를 사용하는 경우 검정을 수행하기 전에 변성시킨다. 동형 단백질을 발현시키는 폴리클로날 세포주, 예컨대 폴리클로날 항체 또는 폴리클로날 TcR를 분석할 때, 프로브 및 폴리클로날 세포주로부터 유래된 표지된 cDNA간에 요망되지 않는 교차-하이브리드화를 방지하기 위해 신중하게 설계된 올리고누클레오티드를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 프로브는 폴리클로날 생성물의 각각의 개별적인 멤버에 대한 특이적 프로브를 고안하기 위해 폴리클로날 제조용 세포주를 생성하기 위해 사용되었던 가변 영역 엔코딩 서열의 정렬에 기초하여 설계된다. 항체에 대한 엔코딩 서열은 원래 CDR3 영역에서 가장 높은 정도의 변이성을 지니는 CDR 영역과 상이할 것이다. 가장 큰 변이성을 지니는 영역을 센스 올리고누클레오티드 프로브를 고안하기 위해 사용하는 것이 바람직하다. 프로브는 폴리클로날 세포주를 구성하는 개별적인 멤버의 서열에서 상보적인 것이 바람직하고, 가능한 다른 멤버에 대해 고도의 이화성을 지닌다. 각 가변 영역에 특이적인 하나 이상의 프로브를 사용할 수 있다. 표준화를 목적으로, 불변 영역에서 서열과 하이브리드화된 프로브를 사용할 수 있다. 프로브는 하이브리드화를 위해 사용된 표면상에 직접 놓여지거나 동일계내에서 표면상에서 합성된다 (Pease et al. 1994. PNAS 91: 5022-5026, Singh-Gasson et al. 1999. Nature Biotech. 17: 974-978).
폴리클로날 세포 개체군을 회수하고, 세포로부터 게놈 DNA, 총 RNA 또는 mRNA를 제조함에 의해 분석을 위해 표지된 DNA를 생성한다. 게놈 DNA를 사용하는 경우, 표지화는 적절한 엔코딩 서열의 PCR 증폭에서 적합하게 표지된 프라이머 또는 표지된 누클레오티드를 이용하여 수득된다. 총 RNA 또는 mRNA를 이용하는 경우, 역전사에 의해 표지된 cDNA를 수득하거나 표지된 프라이머를 이용하여 PCR 단계와 조합시킬 수 있다. 적합한 표지는 형광, 방사능, 비색, X-선 회절 또는 흡수, 자기 또는 효소 활성에 의해 검출될 수 있는 시그날을 제공할 수 있으며, 예를 들어 형광발색단, 발색단, 방사성 동위원소(특히, 32P, 33P, 35S 및 125I), 전자-조밀 시약, 효소, 및 특이적 결합 파트너를 지니는 리간드가 있다. 바람직하게는, 형광발색단을 표지로서 이용한다. 분석을 위한 엔코딩 서열이 항체일 때, 가변 영역으로의 불변 영역 3'에 위치하는 항-센스 프라이머로 프라이밍시킴에 의해 중쇄 및 경쇄 단일 가닥 cDNA를 역전사에 의해 제조한다. 추가의 PCR을 수행하지 않는 경우, 표지된 누클레오티드로 합성을 수행하는 것이 바람직하다. PCR에 이어 역전사를 진행하는 경우, 가변 영역의 모든 패밀리가 증폭되도록 보장하는 일련의 센스 프라이머를 사용한다. 대안적으로, 모든 mRNA에서 동일한 영역 (예컨대, 5' 비번역된 영역 또는 시그날 펩티드-엔코딩 서열)에 하이브리드화하는 센스 프라이머를 사용할 수 있다. 본 접근법에서 센스, 및/또는 항-센스 프라이머를 형광 표지하거나 표지된 누클레오티드를 이용할 수 있다.
프로브 및 표지된 DNA를 제조할 때, 변성되고 표지된 DNA를 잡음이 낮고 고도로 특이적인 시그날을 위해 최적화된 조건하에 고정된 올리고누클레오티드에 하이브리드화시켜 마이크로어레이 분석을 수행한다. 세척 후, 각각의 하이브리드화된 프로브를 평가하고, 특이적 메시지의 양을 산정한다.
정량적 PCR
PCR 방법은 종래에 샘플에서 핵산 서열을 검출하고 정량하기 위해 사용되어 왔으며, 예를 들어 문헌[Higuchi, R. et al. 1993. Kinetic Biotechnology 11, 1026-1030; Holland, P.M. et al. 1991. PNAS 88, 7276-7280; Livak, K.J. et al. 1995 PCR Methods Appl. 4, 357-362]을 참조한다. 상기 방법은 증폭될 핵산에 하이브리드화되는 하나 이상의 추가의 핵산 서열에 더하여 표준 PCR에서와 같이 전향 및 역향 프라이머를 적용시킨다. "프로브"라 불리는 이러한 추가의 핵산 서열은 두 프라이머를 하이브리드화하는 부분들 사이에서 증폭된 핵산의 일부에 하이브리드화되며, 각 연속하는 PCR 싸이클이 프로브 또는 이의 표지의 변화를 야기시키는 방식으로 표지된다. 프로브 또는 이의 표지에서의 이러한 변화가 표지를 PCR 싸이클 동안 증폭된 핵산의 추가의 복사체 수와 관련된 정도로 활성화시키거나 두드러지게 한다. 상기 방법을 일반적으로 "실시간" PCR로서 언급하며, 열적 싸이클링을 표지 검출과 조합시킴에 의해 증가하는 PCR 생성물의 싸이클-바이-싸이클 검출을 제공한다. 실시간 PCR의 특별한 변형에서, 프로브 또는 이의 표지의 변화는 폴리머라제, 예컨대 Taq 폴리머라제의 엑소누클레아제 활성에 의해 초래되며, 따라서 상기 기술을 일반적으로 Taq 또는 TaqMan 실시간 PCR이라고 부른다 (예컨대, Holland, P.M. et al. 1991. PNAS 88, 7276-7280).
적합한 표지는 형광, 방사능, 비색, X-선 회절 또는 흡수, 자기 또는 효소 활성에 의해 검출될 수 있는 시그날을 제공할 수 있으며, 예를 들어 형광발색단, 발색단, 방사성 동위원소(특히, 32P, 33P, 35S 및 125I), 전자-조밀 시약, 효소, 및 특이적 결합 파트너를 지니는 리간드가 있다. 가장 일반적으로, 프로브에 대한 표지는 형광 출력 시그날을 제공하는 형광 표지이다. 이것은 형광 리포터 염료를 지니는 이중-표지된 프로브를 한 말단, 통상적으로 5' 말단에 제공하고, 켄쳐(quencher)를 다른 말단, 즉 3' 말단에 제공함에 의해 달성될 수 있다 (예컨대, Livak, K.J. et al. 1995 PCR Methods Appl. 4, 357-362). 프로브가 완전한 경우, 켄쳐 염료와 리포터 염료의 근접함은 리포터 염료의 형광성을 억제한다. 적합한 염료가 문헌[Wilhelm, J. and Pingoud, A., 2003. Chembiochem. 4, 1120-1128]에 검토되어 있다. 각 PCR 싸이클 동안, DNA 폴리머라제의 5'→3' 엑소누클레아제 활성은 프로브를 절단하고, 이는 켄쳐 염료로부터 리포터 염료를 분리한다. 이러한 분리가 리포터 염료의 형광성을 증가시킨다.
PCR 동안, 관심있는 표적이 샘플에 존재하는 경우, 프로브는 전향 및 역향 PCR 프라이머 부위 사이에서 특이적으로 어닐링될 것이다. DNA 폴리머라제의 엑소누클레아제 활성은 프로브가 표적 분자에 하이브리드화되는 경우에만 리포터 및 켄쳐 염료 사이의 프로브를 절단한다. 이러한 프로브를 종종 TaqMan 프로브라 명명한다. 형광성의 증가는 표적 서열이 프로브에 상보적이고 PCR 동안 증폭되는 경우에만 검출된다. 이러한 요건으로 인해, 비특이적인 증폭은 검출되지 않는다. 프로브에 상보적인 서열을 함유하는 증폭된 생성물만이 형광 시그날의 존재에 의해 인식되어, 거짓-포지티브의 분석과 관련된 특정 엘리먼트를 제거한다. 추가로, 하나 이상의 다른 효소가 잔여 전사 생성물의 증폭의 제한을 돕는데 사용될 수 있다.
이러한 유형의 정량적 PCR은 피펫팅 오류 및 부피 변화를 표준화시킬 수 있고, 이것은 각 반응내에 함유된 수동적 기준에 의해 리포터 형광성을 분할함에 의해 수행되어 각 개별적인 반응에 대한 표준화된 리포터 시그날을 결정할 수 있다. 형광성 강도의 싸이클-투-싸이클 증가를 분석하고 이러한 데이터를 표준과 비교하여 순수한 정량을 위한 출발 복사체 수를 결정하거나 상대적인 양 비교를 위해 다른 공지되지 않은 샘플과 비교하는 소프트웨어가 사용될 수 있다.
특히, 본 발명의 TagMan 실시간 PCR은 폴리클로날 세포주의 특성화에 적합한 것으로 발견되었다. 따라서, 상기 기술을 폴리클로날 항체를 발현시키는 세포주에 적용시키는 경우, 유일한 TaqMan 프로브가 폴리클로날 세포주에 표시된 각 멤버의 중쇄 및/또는 경쇄에 대해 설계될 수 있으므로 이 기술은 서열을 엔코딩하는 개별적인 항체의 상대적인 비율을 정량하는데 도움이 된다. 바람직하게는, CDR 영역, CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 하나를 선택하여 TaqMan 프로브를 설계한다. 가장 바람직하게는, TaqMan 프로브를 설계하기 위해 CDR3 영역을 선택한다. 상기 가변 중쇄 CDR3 TaqMan 프로브의 예를 본원에 참조로서 포함된 문헌[Rasmussen, T. et al. 2000. Exp. Hematol. 28, 1039-1045]에서 찾아볼 수 있다.
핵산 서열화
핵산 서열화는 폴리클로날 제조용 세포주의 다양성과 관련된 정성적인 정보를 제공하기 위해 본 발명에서 사용될 수 있는 널리 공지된 기술이다. 서열화는 단일-세포 클로닝에 의해 폴리클로날 세포주로부터 유래된 단일 세포상에서 또는 폴리클로날 제조용 세포주로부터 수득된 변이 세포의 비가공된 샘플상에서 수행될 수 있다.
단일 세포 레벨에 대한 서열화는 폴리클로날 단백질의 개별적인 멤버를 제공하는 제조용 세포주내에서 세포의 상대적인 비율에 관한 정보를 제공할 것이다. 이러한 공정에서, 폴리클로날 제조용 세포주로부터의 샘플은 요망되는 시점에 수득되며, 특성화를 위한 폴리클로날 단백질을 엔코딩하는 세포는, 에컨대 제한된 희석 또는 FACS Aria와 같은 세포 분류기에 의해 클로닝된 단일-세포이다. 폴리클로날 세포주 샘플로부터 수득되어야 하는 단일 세포의 수는 세포주내에서 표시될 것으로 예상되는 서열의 종류에 의존적이다. 바람직하게는, 시험 샘플에서 이들 모두를 재발견할 가능성이 95%가 되려면 세포주 생성 동안 입력을 형성하는 개별적인 엔코딩 서열의 적어도 3배수가 분류되는 단일 세포여야 한다. 따라서, 25개의 상이한 엔코딩 서열의 라이브러리를 사용하여 세포주를 생성하는 경우, 적어도 75개의 단일 세포 클론이 서열화를 위한 샘플로부터 수득되어야 25개의 상이한 서열이 동일한 양으로 표시된다. 이것은 이들이 제조 과정 동안 손실되지 않았을 경우, 폴리클로날 세포주에서 표시되는 개별적인 엔코딩 서열의 대부분이 단일 세포 클론 중에서 표시됨을 보장하여야 한다. 단일 세포를 성장시켜 분리된 웰에서 융합시키고 각 웰로부터의 부분표본을 핵산 서열화 반응에서의 주형으로서 사용한다. 서열화는 mRNA 레벨 또는 게놈 레벨에서 서열화 이전에 RT-PCR 또는 PCR 증폭 단계를 각각 이용하여 수행될 수 있다. mRNA 또는 게놈 레벨상에서 수득된 서열 정보로부터 개별적인 항체 성분 각각을 엔코딩하는 세포의 백분율을 결정할 수 있다. 추가로, mRNA 레벨에서 수득된 서열 정보를 이용하여 폴리클로날 조성물에서 개별적인 항체 각각의 발현 레벨을 평가할 수 있다. 서열화에 추가하여, mRNA 레벨 상에서 TaqMan 실시간 PCR을 수행하여 단일 세포 클론의 잠재적인 발현 레벨과 관련된 정보를 수득할 수 있다. 종래에 기술된 RFLP 또는 T-RFLP 분석이 단일 세포 레벨에서 유사하게 수행될 수 있다.
폴리클로날 제조용 세포주로부터 수득된 변이 세포의 비가공된 샘플에 대한 서열화는 폴리클로날 단백질의 개별적인 멤버의 엔코딩 서열의 상대적인 mRNA 레벨에 기초하여, 세포주로부터 생성된 폴리클로날 단백질의 개별적인 멤버의 잠재적인 발현 레벨과 관련된 정보를 제공할 수 있다. 상기 공정에서, 폴리클로날 제조용 세포주로부터의 샘플을 요망되는 시점에 수득한다. RT-PCR을 샘플내의 용해된 세포상에서 직접 수행한다. RT-PCR 반응에 적용되는 프라이머 세트는, 센스 및 안티센스 프라이머가 모든 mRNA와 동일한 영역에 하이브리드화되는 경우 동일한 효율로 모든 엔코딩 서열을 증폭시킬 것으로 예상하여 설계된다 (예컨대, 5' 비번역 영역 또는 서열을 엔코딩하는 시그날 펩티드의 센스 프라이머 및 불변 영역 서열의 안티센스 프라이머를 사용할 수 있다). 증폭된 PCR 단편을 서열화 벡터로 클로닝시키고, 숙주 세포, 바람직하게는 대장균(E.coli)으로 트랜스펙션시킨다. 폴리클로날 제조용 세포주로부터의 개별적인 엔코딩 서열을 표시하는 단일 콜로니로부터 수득된 플라스미드 DNA를 서열화하며, 수득된 개별적인 엔코딩 서열의 비율은 폴리클로날 세포주의 각각의 개별적인 엔코딩 서열의 mRNA 레벨 뿐만 아니라 개별적인 단백질 멤버의 잠재적인 발현 레벨을 반영할 것이다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 상기 기술된 유전자 분석은 별개의 분석으로서 적용된다. 바람직하게는, 하나 이상의 분석을 동일한 샘플로부터의 부분표본에 대해 수행하여 가능한 세포주의 클로날 다양성에 대한 많은 정보를 수득한다. 유전자 분석은 대안적으로 다차원적인 방식으로 조합될 수 있는데, 예를 들어 상기 분석 후에 RFLP 또는 T-RFLP 단편에 대한 마이크로어레이 분석을 수행하거나, RFLP 분석에 후속하여 RFLP 단편을 서열화할 수 있다. 특히, 하나 이상의 개별적인 성분을 나타내고, 이들의 동일한 제한 단편 크기로 인해 분리될 수 없는 RFPL 단편에 대해 서열화를 수행하는 것이 바람직하다.
폴리클론성을 평가하기 위한 단백질 특성화 기술
본 발명의 구체예에서, 동형 단백질의 푸울 또는 동형 단백질을 생성하는 발현 시스템의 폴리클론성을 하나 이상의 단백질 특성화 기술에 의해 모니터링한다. 단백질 특성화 기술이란 단독으로 또는 다른 기술과 조합하여 용액 또는 폴리클로날 세포주에 존재하는 세포의 표면상에서 모노클로날 단백질의 혼합물 또는 재조합 폴리클로날 단백질의 개별적인 멤버들의 존재 또는 상대적인 비율에 관련된 정보를 제공할 수 있는 임의의 기술을 언급한다. 재조합 폴리클로날 단백질의 복잡성에 따라서, 하나 이상의 하기 기술을 이용할 수 있다: (i) 크로마토그래피 분리 기술, (ii) 폴리클로날 단백질의 개별적인 멤버를 나타내는 유일한 마커 펩티드를 동정하기 위한 폴리클로날 단백질의 단백질분해 소화물의 분석, (iii) "벌크" N-말단 서열화, 및 (iv) 특이적 검출 분자를 이용한 분석, 예컨대 폴리클로날 단백질의 파수 단백질 멤버의 특성화를 분석.
상이한 동형 단백질을 함유하는 샘플은 정제된 모노클로날 단백질의 혼합물, 또는 폴리클로날 단백질일 수 있다. 예를 들어, 폴리클로날 단백질은 예컨대 단지 원심분리에 의해 세포로부터 분리된 "원료" 상청액 또는 예컨대 단백질 A 친화력 정제, 면역침전 또는 겔 여과에 의해 정제된 상청액 형태로 폴리클로날 세포 배양액으로부터 수득된 세포 배양 상청액으로부터 유래될 수 있다. 그러나 이러한 예비-정제 단계는 조성물에 존재하는 상이한 동형 단백질에 대한 임의의 분리를 제공하지 않기 때문에 재조합 폴리클로날 단백질의 특성화의 일부가 아니다. 바람직하게는, 본 발명의 특성화 방법으로 처리된 샘플을 1회 이상의 정제 단계로 처리하였다. 가장 바람직한 것은 90%, 95% 또는 99%의 순수한 동형 단백질을 포함하는 샘플이다.
폴리클로날 단백질을 구성하는 상이한 동형 단백질들을 배양 동안의 상이한 시점에서 단일 폴리클로날 세포 배양액으로부터 수득된 샘플에 대해 모니터링하고, 생성을 진행하는 내내 개별적인 폴리클로날 단백질 멤버의 상대적인 비율을 모니터링하여 조성물 안정성을 평가할 수 있다. 대안적으로, 폴리클로날 단백질을 구성하는 상이한 동형의 단백질을 특정 시점에 상이한 폴리클로날 세포 배양액으로부터 수득된 샘플에서 모니터링하고, 상이한 배치에서 개별적인 엔코딩 서열의 상대적인 비율을 모니터링하여, 배치-투-배치 일관성을 평가할 수 있다.
크로마토그래피 분리 기술
폴리클로날 단백질의 개별적인 멤버의 크로마토그래피 분리는 생리-화학적 특성에서의 차이 예를 들어, i) 순전하 (이온-교환 크로마토그래피(IEX)에 의해 예시됨), ii) 소수성 (역상 크로마토그래피(RP-HPLC), 및 염 농도에 기초한 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 의해 예시됨), iii) 등전자점 (pI 값) 크로마토포커싱에 의해 예시됨) 또는 iv) 친화성 (항-유전형 펩티드/항체를 이용한 친화성 크로마토그래피 또는 카파 및 람다 항체 경쇄의 분리를 위한 단백질-L 크로마토그래피에 의해 예시됨)에 기초할 수 있다. 다섯번째의 널리 공지된 크로마토그래피 기술은 하기 물리-화학적 특성에 기초한다: 크기. 그러나, 이것은 모든 멤버가 본질적으로 동일한 크기여야 하기 때문에, 폴리클로날 항체 또는 폴리클로날 TcR과 같은 동형의 단백질을 특성화하는 기술로는 특히 적합하지 않다. 크기에 의한 분리는 특성화 플랫폼으로부터 완전히 생략될 수 있다. 상기 언급된 크로마토그래피 기술 중 몇몇은 IgA, IgG 및 IgM과 같은 면역글로불린 클래스의 분리 (Gallo, P. et al. 1987. J. Chromatogr. 416, 53-62) 또는 사람 혈청으로부터의 IgG1, IgG2, IgG3와 같은 서브-클래스의 분리 (Scharf, O et al. 2001. J. Virol. 75, 6558-6565)에 사용되었다. 그러나, 혈청-유래된 면역글로불린 또는 재조합 폴리클로날 항체에서 개별적인 항체의 다양성과 관련된 분리는 이전에 수행된 바 없다.
a) 이온-교환 크로마토그래피
본 발명의 구체예에서, 재조합 폴리클로날 단백질의 개별적인 멤버 또는 폴리클로날 단백질의 개별적인 멤버의 서브-개체군을 분리하는데 이온-교환 크로마토그래피를 이용한다. 이온-교환 크로마토그래피에 의한 분리는 분리되는 조성물에서 개별적인 단백질의 순전하에 기초한다. 재조합 폴리클로날 단백질의 pI-값, 선택된 컬럼 완충액의 pH 값 및 염 농도에 따라서, 재조합 폴리클로날 단백질의 개별적인 멤버를 음이온 또는 양이온-교환 크로마토그래피를 이용하여 적어도 어느 한도까지 분리할 수 있다. 예를 들어, 재조합 폴리클로날 단백질의 모든 개별적인 멤버는 pH가 재조합 폴리클로날 단백질 조성물의 개별적인 멤버의 가장 낮은 pI-값보다 훨씬 낮은 한, 일반적으로 음성으로 하전된 양이온-교환 매질에 결합될 것이다. 결합된 재조합 폴리클로날 단백질의 개별적인 멤버는 후속하여 개별적인 단백질의 순전하에 의존적인 컬럼으로부터, 통상적으로 증가된 염 구배 (예컨대, 염화나트륨) 또는 증가된 pH 값을 이용하여 용리될 수 있다. 용리 동안 수 개의 분획을 수득할 것이다. 단일 분획은 폴리클로날 단백질의 개별적인 멤버를 함유하나, 또한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20개 이상의 폴리클로날 단백질의 별개의 멤버를 함유할 수 있다. 양이온 및 음이온 교환의 일반적인 원리는 당 분야에 널리 공지되어 있고, 이온-교환 크로마토그래피를 위한 컬럼은 시판된다.
b) 크로마토포커싱
본 발명의 추가의 구체예에서, 재조합 폴리클로날 단백질의 개별적인 멤버 또는 폴리클로날 단백질의 개별적인 멤버의 서브-개체군을 분리하는데 크로마토포커싱을 이용한다. 크로마토포커싱에 의한 분리는 개별적인 단백질의 pI 값의 차이에 기초하며, 재조합 폴리클로날 단백질의 pI 값을 초과하는 pH 값을 지니는 컬럼 완충액을 이용하여 수행된다. 개별적인 멤버가 비교적 낮은 pI 값을 지니는 재조합 폴리클로날 단백질이 양성으로 하전된 약 음이온-교환 매질에 결합될 것이다. 결합된 재조합 폴리클로날 단백질의 개별적인 멤버를 후속하여 개별적인 멤버의 pI 값에 의존적인 컬럼으로부터 개별적인 멤버의 pI 값의 pH 범위를 포괄하도록 고안된 폴리완충액을 이용하여 컬럼 내에서 감소된 pH 구배를 생성시킴에 의해 용리시킬 수 있다. 용리 동안 수 개의 분획을 수득할 것이다. 단일 분획은 폴리클로날 단백질의 개별적인 멤버를 함유하나, 또한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20개 이상의 폴리클로날 단백질의 별개의 멤버를 함유할 수 있다. 음이온 교환기를 이용한 크로마토포커싱의 일반적인 원리는 당 분야에 널리 공지되어 있고, 음이온 컬럼은 시판된다. 양이온-교환기를 이용한 크로마토포커싱이 또한 당 분야에 공지되어 있다 (Kang, X. and Frey, D.D., 2003. J. Chromatogr. 991, 117-127, 본원에서 참조로서 포함됨).
c) 소수성 상호작용 크로마토그래피
본 발명의 추가의 구체예에서, 재조합 폴리클로날 단백질의 개별적인 멤버 또는 폴리클로날 단백질의 개별적인 멤버의 서브-개체군을 분리하는데 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용한다. 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 분리는 분리되는 조성물에서 개별적인 단백질의 소수성의 차이에 기초한다. 재조합에 의해 생성된 폴리클로날 단백질을 소수성 상호작용을 촉진하는 완충액에서 소수성 리간드로 개질된 크로마토그래피 매질에 결합시킨다. 이것은 통상적으로 낮은 비율의 유기 용매를 함유하는 완충액에서 (RP-HPLC) 또는 상당히 높은 농도의 선택된 염을 함유하는 완충액에서 (HIC) 달성된다. 결합된 재조합 폴리클로날 단백질의 개별적인 멤버를 후속하여 개별적인 멤버의 소수성에 의존적인 컬럼으로부터 통상적으로 증가된 유기 용매 구배 (RP-HPLC) 또는 감소된 선택된 염 구배 (HIC)를 이용하여 용리시킬 것이다. 용리 동안 수 개의 분획을 수득할 것이다. 단일 분획은 폴리클로날 단백질의 개별적인 멤버를 함유하나, 또한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20개 이상의 폴리클로날 단백질의 별개의 멤버를 함유할 수 있다. 소수성 상호작용 크로마토그래피의 일반적인 원리는 당 분야에 널리 공지되어 있고, RP-HPLC 뿐만 아니라 HIC를 위한 컬럼은 시판된다.
d) 친화성 크로마토그래피
본 발명의 추가의 구체예에서, 재조합 폴리클로날 단백질의 개별적인 멤버 또는 폴리클로날 단백질의 개별적인 멤버의 서브-개체군을 분리하는데 친화성 크로마토그래피를 이용한다. 친화성 크로마토그래피에 의한 분리는 특이적 검출 분자, 리간드 또는 단백질에 대한 친화성의 차이에 기초한다. 검출 분자, 리간드 또는 단백질 또는 이들 중 다수를 (이렇게 상이한 옵션을 하기에서 단지 리간드라고 명명함) 크로마토그래피 매질에 고정시키고, 재조합 폴리클로날 단백질을 개별적인 멤버 및 고정된 리간드 사이의 상호작용을 촉진하는 조건하에 친화성 컬럼에 적용시킨다. 고정된 리간드에 대해 친화성을 나타내지 않는 단백질을 컬럼 흐름으로부터 완전히 수집하고 고정된 리간드에 대해 친화성을 나타내는 단백질을 후속하여 결합을 억제하는 조건하에 (예컨대, 낮은 pH, 높은 염 농도 또는 높은 리간드 농도) 컬럼으로부터 용리시킨다. 용리 동안 수 개의 분획을 수득할 것이다. 단일 분획은 폴리클로날 단백질의 개별적인 멤버를 함유하나, 또한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20개 이상의 폴리클로날 단백질의 별개의 멤버를 함유할 수 있다. 재조합 폴리클로날 단백질을 특성화하는데 이용될 수 있는 리간드는 예를 들어 표적-항원, 항-유전형 분자, 또는 카파 또는 람다 경쇄를 지니는 항체를 분리하기 위한 단백질 L이다.
표적-항원을 이용한 친화성 크로마토그래피는 재조합 폴리클로날 단백질이 하나 이상의 에피토프에 대해 친화성을 지니는 경우에 특히 적합할 것이다. 표적은 예를 들어 암 세포 또는 바이러스 또는 표적 조합물일 수 있고, 이들은 다수의 에피토프를 함유한다. 상기 에피토프는 종합적으로 합성되고 크로마토그래피 매질상에 고정될 수 있다. 검정은 컬럼 당 하나의 에피토프 또는 컬럼 당 수 개의 상이한 에피토프를 지니도록 고안될 수 있어서, 특정 에피토프에 대한 개별적인 멤버의 분포와 관련하여 재조합 폴리클로날 단백질의 혼합물을 특성화할 수 있다. 대안적으로, 완전한 항원 또는 표적 분자를 크로마토그래피 매질상에 고정시킬 수 있다.
폴리클로날 단백질의 개별적인 멤버 또는 상기 개별적인 멤버의 서브-개체군에 특이적으로 결합하는 항-유전형 분자(예컨대, 항-유전형 펩티드 또는 항-유전형 항체)를 이용한 친화성 크로마토그래피를 수행하여 재조합 폴리클로날 단백질의 선택된 멤버 (또한 파수 단백질로서 명명됨), 또는 개별적인 멤버의 서브-개체군의 상대적인 비율과 관련된 정보를 수득할 수 있다. 이상적으로, 규정된 멤버의 서브-세트에 결합하는 항-유전형 분자가 본 발명에서 또한 이용될 수 있으나, 개별적인 항-유전형 분자만이 하나의 개별적인 멤버에 특이적으로 결합할 뿐 재조합 폴리클로날 단백질의 다른 멤버에는 결합하지 않는다. 바람직하게는, 항-유전형 분자가 모든 개별적인 멤버에 대하여 생성되어, 완전한 폴리클로날 조성물이 특성화될 수 있다. 재조합 폴리클로날 단백질이 폴리클로날 항체 또는 TcR인 경우, 항-유전형 분자가 항체 또는 T 세포 수용체의 서열의 항원-특이적 부분에 대하여 유도된다. 항-유전형 분자는 개별적으로 크로마토그래피 매질에 고정될 수 있어서, 하나의 컬럼이 하나의 항-유전형 분자를 함유함으로써, 특정 단백질 멤버 또는 단백질의 서브-개체군에 대한 정보가 수득된다. 이후, 직행-흐름이 제2의 고정된 항-유전형 분자 등을 지니는 제2의 컬럼에 적용될 수 있다. 대안적으로, 수 개의 상이한 항-유전형 분자가 동일한 컬럼에 적용되는 동일한 크로마토그래피 매질상에 고정된다. 이후, 개별적인 단백질이 상이한 분획으로 용리되는 조건하에, 예컨대 컬럼에 증가량의 유리 유전형 분자를 첨가하거나, pH 또는 염 구배를 이용하여 용리를 수행한다. 이러한 접근법에서, 일차원적인 분석으로 폴리클로날 단백질의 수 개의 멤버의 비율에 대한 정보를 수득할 수 있을 것이다.
재조합 폴리클로날 단백질이 폴리클로날 항체인 경우, 카파 경쇄 또는 람다 경쇄를 함유하는 개별적인 멤버들로 구성될 수 있다. 이러한 폴리클로날 항체에서, 람다 경쇄를 지니는 항체를 람다 경쇄 항체에 대한 단백질 L에 대한 친화성의 부족을 이용하여 카파 경쇄를 지니는 항체로부터 분리할 수 있다. 따라서, 람다 경쇄를 함유하는 서브세트의 항체 멤버를 단백질 L 친화성 크로마토그래피를 이용하여 카파 경쇄를 함유하는 서브세트의 항체 멤버로부터 분리할 수 있다. 카파 및 람다 항체 서브세트는 후속하여 상기 기술된 바와 같이 개별적인 항체 정량에 대한 대안적인 크로마토그래피 기술을 추가로 이용하여 특성화될 수 있다.
다차원적 크로마토그래피
분석되는 샘플, 예컨대 재조합 폴리클로날 단백질의 변이 동형 단백질의 복잡성에 따라서, 상기 a) 내지 d)에 기술된 크로마토그래피 기술을 2차원, 3차원 또는 다차원적 포맷으로 조합시키는 것이 바람직할 수 있다. 모든 차원에서 2차원적인 겔 전기영동 대신에 액체 크로마토그래피를 이용하는 것이 바람직하다. 그러나, 이것은 재조합 폴리클로날 단백질의 특성화를 위해 하나 이상의 차원으로 겔 전기영동 또는 침전 기술을 이용하는 것을 배제시키지 않는다.
2차원적 액체 크로마토그래피는 예를 들어 문헌[Lubman, D.M. et al. 2002. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 782, 183-196; WO 01/58925 및 WO 01/58926]에 기술되어 있다. 상기 방법은 건강한 세포 및 암 세포의 단백질 발현을 비교하여 단백질 레벨에서 차별적인 디스플레이를 생성시키는데 이용되어 왔다. 3차원이 크기에 의한 분리인 3차원적 크로마토그래피가 예를 들어 세포 추출물에서 단백질을 분리하여 유사하게 차별적인 디스플레이를 생성하는 WO 03/102539호에서 기술되었다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 다차원적 크로마토그래피는 샘플내 상이한 동형의 단백질을 특성화하기 위해 사용된다. 특히, 상이한 가변 영역을 지니는 동형의 단백질의 샘플들, 예컨대 항체 및 T 세포 수용체는 다차원적 크로마토그래피에 의해 특성화된다. 바람직하게는, 전술한 차원에서 용리 동안 수득된 분획상에서 추가 차원을 실행한다. 그러나, 직행-흐름이 또한 추가의 차원 분석에 이용될 수 있다. 이것은 특히 전술한 차원이 친화성 크로마토그래피일 때 적합할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 다차원적 크로마토그래피를 폴리클로날 항체 (혈청-유래된 면역글로불린 또는 재조합) 또는 모노클로날 항체의 혼합물로부터의 이들의 다양성과 관련된 개별적인 항체 분자의 분리에 이용한다. 바람직하게는 다차원적 크로마토그래피가 액체 크로마토그래피이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 다차원적 크로마토그래피를 폴리클로날 T 세포 수용체 또는 모노클로날 T 세포 수용체의 혼합몰로부터의 이들의 다양성과 관련된 개별적인 T 세포 수용체 분자의 분리에 이용한다. 바람직하게는 다차원적 크로마토그래피가 액체 크로마토그래피이다.
일반적으로, 다차원적 크로마토그래피에서 상이한 차원으로 상이한 물리-화학적 특성에 기초한 크로마토그래피 기술, 예컨대 일차원에서 전하에 의한 분리 및 이차원에서 소수성에 의한 분리 및 삼차원에서 친화성에 의한 분리를 사용하려고 시도하였다. 그러나, 몇몇 크로마토그래피 기술은 비록 이들이 단백질의 유사한 물리-화학적 특성을 활용하는 것일지라도, 후속적 차원에서 이용될 때 추가의 분리를 제공할 수 없었다. 예를 들어, 크로마토포커싱에 이어 이온-교환 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피를 상이한 리간드를 이용하여 서로에 잇따라 오게 한 경우, 추가의 분리가 수득될 수 없다.
표 1은 5차원 이하를 나열하며, 여기에서 크로마토그래피 기술은 본 발명의 특성화 플랫폼의 일부로서 적용될 수 있다. 그러나, 이것이 강제적인 차원수인 것으로 고려되어서는 안된다. 재조합 폴리클로날 단백질을 특성화하기 위한 충분한 분리가 1, 2, 3 또는 4차원 이후에 수득된다면, 남아있는 차원은 생략될 수 있다. 따라서, 충분한 분리가 이온-교환 크로마토그래피(IEX)로 얻어진다면, 크로마토포커싱, RP-HPLC 등을 반드시 수행할 필요는 없다. 반면, 5차원이 불충분한 것으로 입증되면, 추가의 차원이 첨가될 수 있다. 또한, 표 1이 크로마토그래피 기술의 가능한 조합을 완전히 나열한 것으로 고려되거나, 기술 자체의 철저한 목록으로서 고려되어서도 안된다.
표 1
1차원 2차원 3차원 4차원 5차원
IEX 크로마토포커싱 RP-HPLC/HIC 단백질 L 친화성
IEX RP-HPLC/HIC 단백질 L 친화성 힝-유전형 친화성
IEX RP-HPLC/HIC 항-유전형 친화성 단백질 L 친화성
IEX 단백질 L 친화성 항-유전형 친화성 RP-HPLC/HIC
IEX 단백질 L 친화성 RP-HPLC/HIC 항-유전형 친화성
IEX 항-유전형 친화성 단백질 L 친화성 RP-HPLC/HIC
IEX 항-유전형 친화성 RP-HPLC/HIC
크로마토포커싱 IEX RP-HPLC/HIC 단백질 L 친화성 항-유전형 친화성
크로마토포커싱 RP-HPLC/HIC 단백질 L 친화성 항-유전형 친화성
크로마토포커싱 RP-HPLC/HIC 항-유전형 친화성
크로마토포커싱 단백질 L 친화성 RP-HPLC/HIC 항-유전형 친화성
크로마토포커싱 단백질 L 친화성 항-유전형 친화성 RP-HPLC/HIC
크로마토포커싱 항-유전형 친화성 단백질 L 친화성 RP-HPLC/HIC
HIC IEX/ 크로마토포커싱 단백질 L 친화성 항-유전형 친화성
HIC 단백질 L 친화성 IEX/ 크로마토포커싱 항-유전형 친화성
HIC 단백질 L 친화성 항-유전형 친화성 IEX/ 크로마토포커싱
HIC 항-유전형 친화성 IEX/ 크로마토포커싱 RP-HPLC/HIC
단백질 L 친화성 RP-HPLC/HIC IEX/ 크로마토포커싱 항-유전형 친화성
단백질 L 친화성 IEX/ 크로마토포커싱 RP-HPLC/HIC 항-유전형 친화성
단백질 L 친화성 항-유전형 친화성 IEX/ 크로마토포커싱 RP-HPLC/HIC
단백질 L 친화성 항-유전형 친화성 RP-HPLC/HIC IEX/ 크로마토포커싱
항-유전형 친화성 IEX/ 크로마토포커싱 RP-HPLC/HIC 단백질 L 친화성
항-유전형 친화성 RP-HPLC/HIC IEX/ 크로마토포커싱 단백질 L 친화성
항-유전형 친화성 단백질 L 친화성 IEX/ 크로마토포커싱 RP-HPLC/HIC
항-유전형 친화성 단백질 L 친화성 RP-HPLC/HIC IEX/ 크로마토포커싱
본 발명의 바람직한 구체예에서, 다차원적 액체 크로마토그래피 (LC)는 표 1에 도시된 처음 두 개의 차원으로부터 선택된 이차원적 LC 기술이다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, 다차원적 LC는 표 1에 도시된 처음 3개의 차원으로부터 선택된 삼차원적 LC 기술이다.
다차원적 LC 기술에 대안적으로, 적합한 전기영동 기술, 예컨대 겔 전기영동 또는 모세관 전기영동과 조합된 면역침전 및 후속적인 항원의 정량을 재조합 폴리클로날 단백질을 특성화하는데 이용할 수 있다. 상기 기술은 특히 복잡한 항원에 대해 표적화된 재조합 폴리클로날 항체를 특성화하는데 유용할 것이다. 예컨대 복합 바이러스 항원에 대해 표적화된 재조합 폴리클로날 항체를 표지된 항원 혼합물 및 단백질 A 비즈를 이용하여 면역침전시킬 수 있다. 항원은 후속하여 등전자 포커싱 또는 2D PAGE를 이용하여 분리할 수 있었으며, 개별적인 항원을 정량하여 특이적 항원에 대해 표적화된 재조합 폴리클로날 항체의 항체량을 반영한다.
재조합 단백질에서 N-말단 전하 이질성의 제거
상기 기술된 단백질 특성화 기술에서, 동형 단백질의 푸울에서 개별적인 단백질의 이질성은 단일 단백질이 예를 들어 IEX 프로파일에서 수 개의 피크를 초래할 수 있으므로 특성화를 보다 더 복잡하게 할 수 있다. 이질성은 항체 및 다른 재조합 단백질에서 공통의 현상이며, 효소적 또는 비효소적 번역후 개질에 기인한다. 이러한 개질은 크기 또는 전하 이질성을 초래할 수 있다. 공통의 번역후 개질은 N-글리코실화, 메티오닌 산화, 단백질분해 단편화, 및 탈아미드화를 포함한다. 이질성은 또한 트랜스펙션 동안 도입된 돌연변이와 같은 유전자 레벨에서의 개질 (Harris, J.R, et al. 1993. Biotechnology 11, 1293-7) 및 전사 동안 중쇄 및 경쇄의 가변 유전자 간의 교차 사건(Wan, M. et al. 1999. Biotechnol Bioeng. 62, 485-8)으로부터 비롯될 수 있다. 이러한 개질은 후생적이므로, 구성물만의 유전자 구조로부터 예측될 수 없다.
이질성을 초래할 수 있는 번역후 개질 중 몇몇은 특성화 이전에 다루어질 수 있다. C-말단 라이신의 효소적 제거로부터 초래된 전하 변화는 특이적 카르복시펩티다제 억제제를 사용하거나 항체를 카르복시펩티다제로 처리하여 전체 패턴을 단순화함에 의해 해결될 수 있다 (Perins, M. et al. 2000. Pharm Res. 17, 1110-7). 또한 글리코실화 패턴의 차이로부터 초래된 크기 변화는 예를 들어 PNGase F, 엔도 H, O-글리코시다제 또는 뉴라미니다제를 이용한 효소적 탈글리코실화에 의해 다루어질 수 있다.
탈아미드화와 같은 단백질의 화학적 분해는 생성 동안 심각한 문제로 나타나며 전하 이질성을 초래한다. Asn의 Asp로의 탈아미드화 및 이소Asp의 형성 (이소아스파르틸 펩티드 결합)은 온화한 조건하에 발생한다 (Aswad, D.W. et al. 2000. J Pharm Biomed Anal. 21, 1129-36). 이러한 재배열은 국소 폴리펩티드 사슬 유연성이 높은 Asn-Gly, Asn-Ser 및 Asp-Gly 서열에서 가장 용이하게 일어난다.
전하 이질성의 또 다른 원인은 N-말단 글루타민 잔기의 고리화로부터 초래된 피로글루탐산(PyroGlu)의 N-말단 차단으로부터 초래될 수 있다 (탈아미드화). 상기 번역후 개질은 IgG 뿐만 아니라 다른 단백질에 대해서 기술되었다. 부분적으로 항체의 N-말단의 고리화는, 특히 HC 및 LC 둘 모두가 포함된 경우, 전하 이질성을 초래하여 복잡한 IEX 패턴을 제공할 것이다. 항체의 하나 이상의 VH 및 VL 사슬에서 N-말단의 PyroGlu의 형성으로 인한 잠재적인 IEX 패턴이 도 16에 도시되어 있다. 상이한 가변 영역을 지니는 상이한 동형의 단백질을 포함하는 샘플, 예컨대 재조합 폴리클로날 항체가 순전하에 기초한 기술에 의해 특성화되는 경우, 상기 분석은 소수의 샘플 성분만이 도 16B 및 C에 도시된 IEX 패턴을 지닌다고 할지라도, 이들이 예를 들어 폴리클로날 항체 조성물의 IEX 프로파일에서의 클로날 다양성을 차폐할 것이기 때문에 복잡해질 것이다. 이러한 문제는 무엇보다도 먼저 탈차단이 환원되고 알킬화된 항체상에서 수행되어 후속하는 IEX 분석에 적합하지 않은 고수율의 탈차단된 항체를 수득해야 하고, 둘째로 모든 항체에 대하여 100% 절단을 수득할 수 없을 것이기 때문에, 특이적 효소, 피로글루타메이트 아미노펩티다제를 사용하여 해결될 수 없다 (Mozdzanowski, J. et al. 1998 Anal Biochem. 260, 183-7).
본 발명의 추가의 측면은 따라서 N-말단 글루타민 잔기의 고리화에 의해 야기된 전하 이질성의 제거에 관한 것이다. 본 발명의 상기 측면은 생리-화학적 특성인 순전하에 기초한 종래에 기술된 특성화 도구 중 임의의 것, 예컨대 IEX 크로마토그래피 및 크로마토포커싱과 조합되는 경우에 특히 유용하다. N-말단 PyroGlu 잔기의 형성은 예컨대 상기 N-말단 글루타민 잔기를 또 다른 아미노산으로 변경시킴에 의해, 어떠한 폴리펩티드 사슬도 N-말단 글루타민을 함유하지 않음을 보장함에 의해 제거된다. 단백질이 상이한 서브-유닛으로 구성된 이형 단백질인 경우에, 모든 N-말단 Gln 잔기가 다른 잔기로 교환되는 것이 바람직하다. 항체에 대하여 중쇄 및/또는 경쇄의 N-말단에서 Gln 잔기가 교환된다. 이것은 N-말단 글루타민을 지니는 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 서열의 부위-유도된 돌연변이유발에 의해 수행된다. 바람직하게는, N-말단 글루타민 잔기가 글루탐산 잔기로 교체되는데, 이것이 비하전된 글루타민 유도체이기 때문이다. 재조합 폴리클로날 단백질에서, 멤버들을 엔코딩하는 개별적인 서열은 변경되고 발현 벡터내로 재삽입되어 변경된 단백질을 발현시키는 신규한 세포주를 생성하여야 한다. 이후, 이러한 세포주는 폴리클로날 단백질을 생성하는 세포의 수집물에 포함될 수 있다.
동형 단백질의 가변 영역의 단백질분해 소화물의 분석
상이한 가변 영역을 지니는 상이한 동형의 단백질을 포함하는 단백질 샘플을 상기 기술된 크로마토그래피 기술의 범위내에서 완전한 단백질의 물리-화학적 특성에 기초하여 특성화시킬 수 있다. 이러한 사전에 기술된 분석으로부터 수득된 정보는 동형 단백질의 단백질분해 소화물의 분석으로부터 수득된 정보로 추가로 보충될 수 있다. 바람직하게는, 단백질분해 소화를 완전한 단백질의 크로마토그래피 분석이 수행된 것과 동일한 샘플의 부분표본상에서 수행한다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 동형 단백질 조성물의 개별적인 멤버의 가변 영역에서 기원한 유일한 마커 펩티드의 동정을 정성적인 방식으로 개별적인 멤버의 존재에 대하여 단백질 조성물을 특성화하는데 이용한다. 이렇게 유일한 마커 펩티드가 상이한 동형 단백질을 포함하는 단백질 조성물 (샘플)의 단백질분해 소화에 의해 생성된다.
동형 단백질 혼합물의 가변 영역의 펩티드 지도화를 수행하기 위하여, 혼합물내에서 개별적인 멤버들을 다른 멤버로부터 구별짓는 가변 영역의 부분 또는 부분들이 단백질분해 소화 이후에 완전하게 유지되는 것이 중요하다. 따라서, 하나 이상의 프로테아제를 선택하여, 마커 펩티드라 불리는 하나 이상의 유일한 서열을 재조합 폴리클로날 단백질의 각각의 개별적인 멤버로부터 수득할 수 있다. 동형 단백질 혼합물이 재조합 폴리클로날 항체 또는 재조합 폴리클로날 TcR인 경우, 개별적인 멤버들을 서로에 대해 구별짓는 서열은 일반적으로 CDR 영역에 의해 특성화된다. 유일한 마커 펩티드를 생성하기 위해 사용되는 프로테아제, 프로테아제들 또는 화학 화합물의 선택은 동형 단백질의 샘플을 구성하는 단백질 서열의 분석에 기초한다. 일반적으로, 프로테아제 또는 화학 화합물은 단백질의 규정된 부위를 높은 특이성으로 절단하여야 한다. 이러한 절단-특이적 프로테아제가 당 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 트립신, 엔도 Glu-C, 라이실 엔도펩티다제, 엔도 Arg-C, 엔도 Asp-N 또는 엔도 Asn-c일 수 있다. 이들은 단지 예일 뿐이며 상기 구체예로 제한하는 것으로 고려되어서는 안된다.
폴리클로날 단백질 샘플이 하나 이상의 선택된 프로테아제로 소화되는 경우, 모든 개별적인 멤버의 불변 및 가변 영역 둘 모두로부터 초래된 펩티드의 푸울이 생성될 것이다. 유일한 마커 펩티드의 비율은 불변 영역으로부터 초래된 펩티드의 주된 개체군과 비교하여 이들의 물리-화학적 특성에서 차이를 나타낼 것이다. 따라서, 유일한 마커 펩티드는 상기 기술된 크로마토그래피 기술 중 하나에 의해 분리될 수 있다. 바람직하게는, 펩티드 분리를 위해 특히 고안된 이온-교환 크로마토그래피 또는 RP-HPLC가 불변 영역 펩티드의 주된 분획으로부터 유일한 펩티드를 분리하기 위해 사용된다. 상기 기술된 다차원적 크로마토그래피 기술은 유일한 마커 펩티드를 분리하기 위해 유사하게 적용될 수 있다. 하나 이상의 차원에서의 분리에 이어서, 상이한 펩티드를 동정하기 위해 매스 스펙트로메트리(MS)를 이용할 수 있다. 단백질학 분야의 당업자에게 공지된 MS 기술을 펩티드를 동정하는데 사용할 수 있다. 바람직한 MS 기술로는 매트릭스-보조된 UV 레이져 탈착/이온화 (MALDI) 비행시간 (TOF) 매스 스펙트로메트리, 및 전자분무 이온화 비행시간 (ESI-TOF) 매스 스펙트로메트리가 있다.
대안적으로, 단백질분해 소화는 a) 내지 d) 및 상기 "다차원적 액체 크로마토그래피" 섹션에 기술된 일차원적 또는 다차원적 크로마토그래피에 의해 분리되고, 분리된 단백질 분획의 단백질분해 절단된 완전한 단백질에 대해 수행될 수 있다 (Kachman, M.T. et al. 2002. Anal. Chem. 74, 1779-1791). 이러한 접근법은 완전한 단백질의 일차원적 또는 다차원적 분석에 의해 수득된 분획들의 부분에 선택적으로 이용되어 이들을 추가로 특성화시킬 수 있으므로, 매우 복잡한 폴리클로날 단백질의 특성화에 유리할 수 있다.
단백질분해 소화는 추가로 N-말단 마커 펩티드가 유일한 가변 영역을 함유하는 경우 이들을 분리하기 위해 수행될 수 있다. N-말단 펩티드는 문헌[Gevaert, K. et al., 2003. Nat. Biotechnol. 21, 566-569, 본원에서 참조로서 포함됨]에 본질적으로 기술된 대로 분리될 수 있다. 간단히 말해, 재조합 폴리클로날 단백질에서 유리 아미노기를 예컨대 아세틸화에 의해 차단하고, 단백질 혼합물을 후속하여 적합한 프로테아제로 소화시킨다. 소화는 내부 펩티드상에 유리 N-말단 아미노기를 생성하고, 이것을 후속하여 N-말단 펩티다제로부터 내부 펩티드를 분리시킬 수 있는 화합물로 차단한다. 이러한 화합물로는 i) 소수성 상호작용에 의해 분리시킬 수 있는 Gevaert에 의해 기술된 2,4,6-트리니트로벤젠설폰산 (TNBS), ii) 고정된 스트렙타비딘에 결합 후 후속적으로 제거되는 비오틴, 또는 iii) 원심분리되어 상청액에 존재하는 아세틸화된 N-말단 펩티드로부터 결합된 내부 펩티드를 분리시키는 미리-활성화된 매트릭스 (예컨대, NHS-활성화, CNBr-활성화, ECH 세파로스 재료, 또는 아즐락톤기를 지니는 울트라링크(UltraLink) 비스-아크릴아미드 지지체)가 있을 수 있다. 분리된 아세틸화된 N-말단 펩티드를 후속하여 상기 기술된 대로 MS 분석과 조합된 일차원적 또는 다차원적 액체 크로마토그래피에 의해 분석할 수 있다. 대안적으로, 완전한 단백질의 N-말단을 특이적 분리를 허용하는 화합물로 차단하고, 절단 후 생성된 내부 펩티드를 제2의 화합물로 아세틸화하거나 차단한다.
추가로, 단백질분해 소화에 이은 유일한 마커 펩티드의 동정이 특징적인 아미노산 측쇄 작용기를 이용하여 수행될 수 있다. 적절하게 아미노산 측쇄를 개질시키거나 이러한 개질 없이 특이적 아미노산 잔기를 함유하는 펩티드를 포획하는 하나 또는 상이한 친화성 기술의 조합을 이용할 수 있다. 예컨대 시스테인, 메티오닌, 트립토판, 히스티딘 및 티로신을 함유하는 펩티드를 상기 아미노산 잔기를 함유하는 펩티드를 포획하는 특이적 친화성 태그로 고정된 컬럼 재료 또는 비즈를 이용하여 정제시킬 수 있다 (Bernhard, O.K. et al. 2003. Proteomics 3, 139-146; Chelius, D. and Shaler, T.A., 2003. Bioconjug. Chem. 14, 205-211; Gevaert, K. et al. 2002. Mol. Cell Proteomics 1, 896-903; Gygi, S.P. et al., 1999. Nat. Biotechnol 17, 994-999). 시스테인 및 티로신을 함유하는 유일한 가변 영역 펩티드는 예를 들어 시스테인 잔기의 비오티닐화 이후에 스트렙타비딘 컬럼상에 포획될 수 있고, 후속하여 펩티드를 함유하는 시스테인의 용리 후 이들을 티로신 잔기에 특이적으로 결합되는 컬럼 또는 비즈에 적용시킬 수 있다. 특이적 아미노산 잔기에 대한 친화성에 기초한 이러한 펩티드 포획은 RP-HPLC 및 이온-교환 크로마토그래피와 같은 상기 기술된 크로마토그래피 기술에 대한 추가의 차원으로서 수행될 수 있다. 먼저, 크로마토그래피 기술을 하나 이상의 차원으로 재조합 폴리클로날 단백질의 단백질분해 소화물에 적용시킨 다음, 아미노산-특이적 포획을 최종 차원에서 하나 이상의 분획에 대해 수행하고 이어서 MS 분석한다. 측쇄 작용기에 기초한 펩티드의 분리를 N-말단 펩티드 분리 기술과 조합하여 수행할 수 있다.
단백질분해 소화에 이어서 펩티드 분리에 의해 분석되는 재조합 폴리클로날 단백질이 다량체 단백질인 경우, 단백질분해 이전에 서브유닛의 분리를 수행하여 단백질분해 소화물의 "핑거프린팅(fingerprinting)"을 단순화하는 것이 바람직하다. 이것은 예를 들어 유리 시스테인 잔기의 환원 및 알킬화에 이어 겔 여과에 의해 서브유닛을 분리하고, 예컨대 폴리클로날 단백질이 각각 항체 또는 TcR인 경우 경쇄로부터 중쇄를 분리하거나 베타 사슬로부터 알파 사슬을 분리함에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 단백질분해 소화를 본래의 조건하에 수행할 수 있다. 특히 항체에 대하여, 이것은 적합한 대안책이 될 수 있는데, 그 이유는 항체의 4차 구조가 불변 영역내에서 단백질분해 절단에 높은 내성을 초래하기 때문이다. 따라서, 완전한 비-환원된 폴리클로날 항체의 단백질분해 절단은 주로 가변 영역으로부터 펩티드를 생성할 것이다.
상기 기술된 단백질분해 소화 기술을 또한 단백질분해 소화물내에서 특성화될 수 있는 파수 펩티드를 선택함에 의해 파수 개념에 따라서 적용시킬 수 있다.
"벌크" N-말단 서열화
기술된 대로, N-말단 서열은 분리될 수 있고 폴리클로날 단백질의 단백질분해 소화물을 핑커프린팅하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, N-말단 서열은 완전한 단백질로부터 직접 서열화될 수 있어서, 단백질분해 단계를 생략할 수 있다. 상이한 가변 영역을 지니는 상이한 동형 단백질을 포함하는 단백질 샘플의 "벌크" N-말단 서열 분석을 예를 들어 재조합 폴리클로날 단백질의 정제된 배치 생성물들을 비교하는데 사용할 수 있다. 폴리클로날 단백질이 재조합 폴리클로날 항체 또는 TcR인 경우, "벌크" N-말단 서열화는 분리된 경쇄 및 중쇄 및 분리된 알파 및 베타 사슬의 푸울에서 각각 수행하는 것이 바람직하다. 예를 들어 동형 중쇄의 푸울에서, 몇몇 아미노산 위치가 완전하게 보존될 수 있는 반면, 다른 위치는 다양할 수 있으며, 이것은 아미노산 서열의 정렬에 의해 측정될 수 있다. 따라서, 수 개의 상이한 아미노산이 특정 라운드의 서열화 동안 수득될 수 있다. 예를 들어, 위치 4는 폴리클로날 샘플의 5개의 상이한 아미노산에 의해 대표될 수 있으며, 동형 서열의 정렬에 의해 미리 결정된다. "벌크" N-말단 서열 분석 동안 상기 다양한 아미노산을 정량할 수 있고, 예컨대 재조합 폴리클로날 항체에서 위치 4를 대표하는 개별적인 아미노산의 상이한 양을 이용하여 상이한 샘플의 상대적인 조성을 비교할 수 있다.
특이적 검출 분자를 이용한 복잡한 동형 단백질 혼합물의 특성화
본 발명의 특성화 플랫폼은 추가로 특이적 검출 분자를 이용하며, 각각의 특이적 검출 분자는 동형 단백질의 복잡한 혼합물내에서 개별적인 단백질 분자를 동정할 수 있기 때문에 샘플에서 특정 멤버의 존재를 모니터링하는 것을 보조한다. 특이적 검출 분자는 폴리클로날 단백질의 개별적인 멤버에 특이성을 지니는 예를 들어 소형 유기 분자, 펩티드 또는 단백질과 같은 특이적 리간드일 수 있다. 특히, 항-유전형 펩티드 또는 항-유전형 항체와 같은 리간드-펩티드 또는 단백질이 본 발명의 바람직한 구체예이다. 동형 단백질의 복잡한 혼합물의 규정된 서브세트에 결합하는 검출 분자를 본 발명에 적용시킬 수도 있다.
특이적 검출 분자를 사용하여 i) 동형 단백질의 복잡한 혼합물을 포함하는 샘플에서 하나 이상의 개별적인 단백질의 농도 또는 상대적인 비율을 결정할 수 있도록 하고, ii) 크로마토그래피 분석에서 추가의 차원으로서 작용시키고, iii) 동형 단백질의 복잡한 혼합물의 발효 동안 수득된 샘플에서 개별적인 단백질의 농도를 결정할 수 있도록 하고, iv) 동형 단백질의 혼합물을 발현시키는 작업 세포 뱅크 또는 생체반응기 세포 샘플과 같은 폴리클로날 세포주에서 세포를 생성하는 개별적인 단백질을 결정할 수 있도록 함에 의해 동형 단백질의 복잡한 혼합물을 특성화할 수 있다. 단계 iv)는 폴리클로날 세포주로부터 단일 튜브로 분배되고 후속적인 배양 기간을 거친 폴리클로날 세포주 또는 단일 세포상에서 수행될 수 있다.
동형 단백질의 복잡한 혼합물내에서 개별적인 단백질 멤버를 동정할 수 있는 특이적 펩티드-리간드를 생성하기 위해, 비리온 표면상에서 외래 올리고머 펩티드를 디스플레이하는 섬유상 파지 발현 벡터의 거대 라이브러리를 친화성에 의해 스크리닝하고, 항체, TcR 또는 또 다른 요망되는 개별적인 단백질 멤버에 결합하는 외래 펩티드를 디스플레이하는 파지를 정제시킬 수 있다 (Scott and Smith 1990. Science 249, 386-90). EP 1 106 625호는 특히 면역화를 목적으로 항-RhD 항체에 결합할 수 있는 펩티드의 생성에 대해 기술한다. 디스플레이된 펩티드 라이브러리의 길이는 대략 5 내지 50개의 아미노산이고, 바람직하게는 7 내지 20개의 아미노산이며, 심지어 보다 바람직하게는 8 내지 15개의 아미노산이고, 가장 바람직하게는 9 내지 12개의 아미노산이다. 적절한 펩티드가 동정되었을 때, 이들을 합성할 수 있다.
항-유전형 항체의 생성은 일반적으로 당 분야에 공지되어 있다. 간단히 말해, 마우스를 항-유전형 항체가 요망되도록 항체로 면역화시킨다. 모노클로날 항체를 면역화된 마우스로부터 생성하고, 이것을 예를 들어 하이브리도마 기술 또는 파지 디스플레이를 이용하여 요망되는 특이성을 지니는 항-유전형 항체의 생성을 위해 스크리닝한다. 항-유전형 펩티드 또는 항-유전형 항체는 특이성 및 잠재적인 교차-반응성과 관련하여 특성화되어야 한다. 이러한 분석은 항-유전형 펩티드 또는 항-유전형 항체가 특이적 멤버를 인식하는지 또는 대안적으로 폴리클로날 단백질내에서 밀접하게 관련된 멤버의 서브세트를 인식하는지를 입증할 것이다 (항체에 대하여, 관련 멤버는 예를 들어 특이적 VH 유전자 패밀리일 수 있다).
항-유전형 펩티드/항체는 개별적인 멤버 단백질 (예컨대 특이적 항체 또는 특이적 TcR)의 직접 정량을 위해 ELISA, FLISA 또는 RIA와 같은 면역검출 검정에 적용될 수 있다. 대안적으로, 항-유전형 펩티드/항체는 단독으로 또는 상기 기술된 대로 다른 크로마토그래피 분리에 이어서 추가의 차원으로서 친화성 크로마토그래피에 적용될 수 있다. 면역침전은 검출 분자가 폴리클로날 단백질의 개별적인 멤버를 분리하고 특성화하는데 사용될 수 있는 추가의 공정이다. 또한, 항-유전형 펩티드 또는 항-유전형 항체를 폴리클로날 세포주에서 개별적인 단백질 생성 세포의 분리 및/또는 결정에 이용할 수 있다. 문헌[Borth, N. et al. 2000-2001. Biotechnol Bioeng. 71, 266-273 and Brezinsky, S.C. et al. 2003. J. Immunol. Methods 277, 141-155]에 개시된 기술들을 세포 배양액으로부터 개별적인 단백질 생성 세포를 분리하는데 이용할 수 있다.
잠재적으로, 폴리클로날 단백질에서 각각의 모든 개별적인 멤버에 대한 특이적 검출 분자를 생성하여 완전한 특성화를 수득할 수 있다. 그러나, 발현 안정성 또는 배치-투-배치 일관성을 모니터링하기 위하여, 이것은 본 발명에 따라서 정량적 및/또는 정성적인 특성화를 위한 재조합 폴리클로날 단백질내에서 다수의 개별적인 멤버, 소위 파수 단백질을 동정하기에 충분하며, 개별적인 단백질 멤버의 이러한 수집물이 일관되게 발현하고 재조합에 의해 생성된 폴리클로날 단백질의 상이한 배치에서 정제됨을 보장한다. 이러한 접근법은 특히 단백질 분자의 복잡한 푸울의 특성화를 단순화하는데 이용될 수 있다. 재조합 폴리클로날 단백질을 대표하는 파수 단백질의 개념은 특이적 검출 분자에만 적용되는 것이 아니며, 실질적으로 임의의 사전에 기술된 특성화 기술 또는 이들의 조합이 파수 단백질 또는 펩티드의 개념을 적용시킬 수 있다. 또한, 파수 단백질은 기술에 따라서 달라질 수 있다. 폴리클로날 단백질의 몇몇 특이적 멤버를 이들의 물리-화학적 특성에서의 차이에 기초하여 특히 잘 분리할 수 있는 반면, 높은 친화성을 지니는 항-유전형 펩티드는 동일한 물리-화학적 특성을 지니는 단백질의 분리에 특히 유용하다.
본 발명의 구체예에서, 하나 이상의 특이적 검출 분자를 사용하여 상이한 가변 영역을 지니는 상이한 동형 단백질을 포함하는 샘플에서 하나 이상의 파수 단백질의 상대적인 비율을 모니터링한다. 일련의 관련 샘플에서 하나 이상의 파수 단백질의 비율에서의 일관성이 배치들 간에 뿐만 아니라 단일 생성을 진행하는 동안 경시적으로 폴리클로날 단백질 발현에서의 조성물 안정성을 반영할 것이다. 추가로, 이것은 재조합 폴리클로날 단백질 또는 모노클로날 단백질 혼합물의 장기간 저장 동안 조성물 안정성을 측정할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 재조합 폴리클로날 단백질의 파수 단백질은 하나 이상의 하기 기술에 의해 특성화된다: i) 항-유전형 펩티드/항체 친화성 크로마토그래피, ii) 항-유전형 펩티드/항체를 이용한 면역검출, iii) 완전한 멤버의 특징적인 물리-화학적 특성과 관련된 이들의 다차원적 크로마토그래피 분리, 및 iv) 크로마토그래피 및 MS를 이용하여 단백질분해 펩티드 지도화.
특성화되는 상이한 동형 단백질 혼합물의 복잡성
본 발명의 플랫폼에 의해 특성화되는 샘플은 상이한 가변 영역 단백질을 지니는 상이한 동형 단백질의 규정된 서브세트, 예를 들어 상이한 CDR 영역을 지니는 폴리클로날 단백질 또는 항체 (예컨대, 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체의 혼합물) 또는 상이한 CDR 영역을 지니는 T 세포 수용체 (예컨대, 폴리클로날 TcR 또는 모노클로날 TcR의 혼합물)를 포함한다. 상이한 가변 영역을 지니는 상이한 동형 단백질이 재조합 단백질인 것이 바람직하다. 또한, 폴리클로날 단백질의 개별적인 멤버 또는 모노클로날 단백질의 혼합물이 예컨대 요망되는 표적 항원에 대한 항체 또는 TcR의 경우에 요망되는 표적에 대해 공유된 결합 활성과 같은 공통의 특징에 의해 정의되는 것이 바람직하다. 통상적으로, 본 발명의 특성화 플랫폼에 의해 분석되는 폴리클로날 단백질 조성물은 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 1000, 104, 105 또는 106개 이상의 별개의 변이 멤버를 포함한다. 일반적으로, 어떠한 단일 변이 멤버도 폴리클로날 단백질 조성물에서 75%를 초과하는 총 개별적인 멤버수를 구성하지 않는다. 바람직하게는, 어떠한 개별적인 멤버도 최종 폴리클로날 조성물에서 개별적인 멤버의 총 수의 50%, 보다 바람직하게는 25% 및 가장 바람직하게는 10%를 초과하지 않는다.
항체의 경우에 표적화된 항원(들)의 복잡성은 본 발명의 플랫폼을 이용하여 특성화되는 폴리클로날 단백질 조성물의 별개의 변이 멤버의 수에 영향을 미칠 것이다. 소수 또는 그리 복잡하지 않은 표적, 예를 들어 소수의 표적 단백질인 경우에, 3 내지 100개의 별개의 변이 멤버를 포함하는 폴리클로날 단백질 조성물이 특성화를 위해 확립될 것이고, 변이의 수는 90, 또는 80 또는 70을 초과하지 않는다. 많은 경우에, 별개의 변이 수는 60 또는 50을 초과하지 않을 것이고, 변이의 수는 5 내지 40개, 예컨대 5 내지 30개인 것이 바람직하다. 보다 복잡한 표적, 예를 들어 복잡하거나 교환할 수 있는 표면 단백질을 지니거나 수 개의 바이러스 서브타입을 포함하는 바이러스에 대한 것인 까닭에, 20 내지 500개의 별개의 변이 멤버를 포함하는 폴리클로날 단백질 조성물이 특성화를 위해 확립될 것이다. 매우 복잡한 표적에 대하여, 항원이 많은 상이한 분자를 포함하는 경우, 50 내지 10,000개의 별개의 변이 멤버를 포함하는 폴리클로날 단백질 조성물이 본 발명에 따라서 특성화될 필요가 있을 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상이한 가변 영역을 지니는 상이한 동형 단백질을 포함하는 샘플이 폴리클로날 항체이다. 폴리클로날 항체는 사람 이소형 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2, 또는 뮤린 이소형 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 및 IgA와 같은 하나 이상의 상이한 항체 이소형으로 구성될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상이한 가변 영역을 지니는 상이한 동형 단백질을 포함하는 샘플이 폴리클로날 TcR이다.
하기 실시예에서, 상이한 개별적인 항-RhD 항체 멤버 또는 항-RhD rpAb를 생성하는 세포주로 구성된 다양한 항-RhD 재조합 폴리클로날 항체 (항-RhD rpAb) 조성물을 이용하여 본 발명의 구조적 특성화 플랫폼을 설명하였다. 개별적인 항-RhD-특이적 항체 및 이들을 생성하는 세포주는 2004년 7월 20일에 출원된 본 양도인의 덴마크 특허 출원 PA 2004 01133호에 기술된 것들에 상응한다. 간단히 말해, 경쇄 가변 영역 및 카파/람다 경쇄의 조합 파지 디스플레이 라이브러리를 RhD-포지티브 적혈구로 면역화된 레수스 D-네거티브 공여체로부터 생성하였다. 라이브러리 를 클론을 생성하는 항-RhD-특이적 항체에 대해 가려내었다. 항원-특이적 파지로부터의 가변 중쇄 및 경쇄 유전자 쌍을 포유동물 발현 벡터로 이동시켰다. 포유동물 벡터를 부위-특이적 방식으로 Flp-FRT 재조합 시스템을 이용하여 CHO Flp-In 세포주 (Invitrogen, CA)로 개별적으로 트랜스펙션시켰다. 완전한 경쇄 (LC) 뿐만 아니라 중쇄(VH) 가변 영역에 대한 핵산 (nuc.) 및 단백질 (a.a.) 서열을 표 2에 도시된 서열 동정 번호(서열 id)에 의해 동정하였다. 이러한 번호는 2005년 7월 18일 출원된 "항-레수스 D 재조합 폴리클로날 항체 및 제조 방법"이라는 명칭의 본 양도인의 국제 특허 출원 PCT/DK2005/000501호에 개시된 서열 번호에 상응한다. 표 2의 서열 id는 본 출원의 서열번호와 동일하지 않기 때문에 구별되어야 한다. 중쇄의 불변 영역은 사람 IgG1과 일치한다.
표 2. 하기 실시예에 사용된 개별적인 항-RhD 항체/세포 클론의 목록
Figure 112007014974017-PCT00001
실시예 1
본 실시예는 폴리클로날 제조용 세포주의 생성, 및 일차원적인 크로마토그래피 기술을 이용하여 단백질 레벨에서 및 RFPL 분석을 이용하여 유전자 레벨에서 배치-투-배치 변화의 특성화를 설명한다.
항-레수스 D 재조합 폴리클로날 항체 생성을 위한 제조용 세포주의 확정
특정 부위로부터의 별개의 재조합 항-레수스 D 항체를 이들의 게놈에서 각각 발현시키는 10개의 세포주 (RhD157.119D11, RhD158.119B06, RhD159.119B09, RhD161.119E09, RhD163.119A02, RhD190.119F05, RhD191.119E08, RhD192.119G06, RhD197.127A08 및 RhD204.128A03)를 선택하고, 혼합시켜 재조합 폴리클로날 제조용 세포주를 구성하였다. RhD197 및 RhD204는 람다 클론인 반면 나머지는 카파 클론이었다.
개별적인 항-레수스 항체를 발현시키는 세포 배양액을 진탕 플라스크에서 무혈청 현탁 배양액에 완전히 순응시킨 후, 이들을 동일 세포수로 혼합시켜 폴리클로날 CHO-Flp-In (019) 세포주를 생성하였다. 혼합된 세포 배양액을 원심분리하고 10 x 106 세포/튜브 미만의 부분표본으로 동결시켰다.
두 개의 튜브 (3948 FCW065 및 3949 FCW065)를 해동시키고 네오마이신과 함께 100 ml의 Excel302 무혈청 배지를 함유하는 1000 ml의 진탕 플라스크에서 11주 동안 개별적으로 배양하였다.
상청액을 회수하고, 여과시킨 후 항-RhD rpAb를 정제하였다.
클론 다양성
단백질 레벨 및 mRNA 레벨 둘 모두에서 클론 다양성을 검정하였다. 항체 조성을 분석하기 위해 사용된 상청액 샘플을 배양한 지 9주 후에 수득한 반면, mRNA 조성을 분석하기 위해 사용된 세포 샘플은 배양한 지 11주 후에 회수하였다.
항체 조성:
폴리클로날 CHO-Flp-In (019) 세포주로부터 발현된 항-RhD rpAb는 IgG1 이소형 항체이다. 항-RhD rpAb를 단백질 A가 고정된 컬럼을 이용하여 두 표본 (3948 및 3949)으로부터 정제시켰다. 개개의 항체가 pH 7.4에서 고정된 단백질 A와 상호작용하는 반면, 오염 단백질은 컬럼으로부터 세척되었다. 결합된 항체를 후속하여 컬럼으로부터 낮은 pH 값 (pH 2.7)으로 용리시켰다. 280 nm의 흡광 측정으로 결정된 항체를 함유하는 분획을 푸울링하고 5 mM 나트륨 아세테이트 (pH 5)에 대하여 투석하였다.
9주의 배양 후에 부분표본 3948 및 3949 (FCW065)로부터 수득된 항-RhD rpAb 조성물을 양이온-교환 크로마토그래피를 이용하여 분석하였다. 단백질 A 정제된 항-RhD rpAb를 25 mM 나트륨 아세테이트, 150 mM 염화나트륨, pH 5.0에서 60 ml h-1의 유속으로 실온에서 작업하여 PolyCapA 컬럼 (4.6 x 100 mm)상에 적용시켰다. 후속하여 항체 성분을 25 mM 나트륨 아세테이트, pH 5.0에서 60 ml h-1의 유속으로 150 내지 350 mM 염화나트륨의 선형 구배를 이용하여 용리시켰다. 항체 성분을 280 nm에서 스펙트로포토메트리에 의해 검출하였다. 후속하여 크로마토그램(도 1)을 통합하고, 개별적인 피크 A-J의 면적을 이용하여 항체 성분을 정량하였다 (표 3). 피크의 총 면적은 100%이었다. 두 부분표본으로부터의 크로마토그램이 동일한 피크 분포 뿐만 아니라 각 피크에서 성분들의 유사한 농도를 나타내었다. 이러한 결과로부터, 동일한 조건하에 성장한 동일한 폴리클로날 세포주의 부분표본은 개별적인 항체 멤버의 동일한 분포를 나타내는 항-RhD rpAb를 생성한다는 결론을 내릴 수 있다.
항-RhD rpAb의 개별적인 멤버는 하나 이상의 특정 피크에 할당하였다 (표 3에 요약함). 이러한 할당은 동일한 조건하에 분석되는 개별적인 항체에 대해 수득된 크로마토그램에 기초한 것이다. 개별적인 크로마토그램이 RhD158 Ab에 대해서는 수득되지 않으므로, 이 클론은 어떠한 피크에도 할당되지 않았다. 그러나, 피크 D가 다른 피크 중 몇몇에서 이질성으로 인해 표시될 수도 있는 항체, RhD158을 구성할 것으로 고려된다. 특히, 클론 RhD197로부터의 항체 생성물은 IEX 프로파일에서 고도의 이질성을 나타낸다. RhD190 Ab는 15.3분의 체류 시간에서 뚜렷하여야 한다. 그러나, 이것이 검출될 수 없다는 것은, 이 클론이 손실되었거나 대안적으로 재조합 폴리클로날 제조용 세포주에서 검출 한계 미만의 양으로 생성된 것을 나타낸다. 클론 RhD190의 손실은 최종 항-RhD rpAb 조성물의 다양성과 관련하여 허용되는 것으로 고려되는 다양성의 10% 감소에 상응한다.
표 3
피크 3948 양 (면적%) 3949 양 (면적%) Ab 명칭 코멘트
A 5.1 5.1 RhD157 본 Ab가 피크 B에도 존재한다
B 12.0 10.2 RhD157 RhD159 RhD192 본 피크가 3개 이상의 상이한 Ab에서 표시된다
C 5.2 5.3 RhD191
D 1.2 0.8 (RhD158) 실질적으로 본 피크에 할당되지 않으나 존재할 것으로 여겨짐. RhD158은 다른 피크에서도 표시될 수 있다.
E 10.9 14.4 RhD204
F 24.3 23.0 RhD197 본 피크는 이질성으로 인해 수 개의 피크로 나뉜다.
G 13.6 12.5 RhD197
H 3.3 4.0 RhD197
I 14.0 13.7 RhD161
J 10.5 10.5 RhD163
RhD190 본 Ab는 검출되지 않았다.
mRNA 조성:
배양한 지 11주 후 폴리클로날 CHO-Flp-In (019) 세포주내에서 클론 다양성을 RT-PCR-RFLP 분석에 의해 측정하였다. 간단히 말해, 200개의 세포에 상응하는 세포 현탁액을 동결-건조 공정으로 처리하고, 이러한 용해물을 경쇄를 증폭시키는 프라이머를 지니는 One-STEP RT-PCR 키트 (Qlagen)를 이용한 RT-PCR에서 주형으로서 사용하였다.
전향 프라이머: 5'-TCTCTTCCGCATCGCTGTCT (서열번호 1)
역향 프라이머: 5'-AGGAAAGGACAGTGGGAGTGGCAC (서열번호 2)
RT-PCR 생성물을 HinfI로 소화시키고 아가로스 겔 전기영동으로 분석하여, 제한 생성물을 에티듐 브로마이드 염색으로 가시화시켰다 (도 2).
RT-PCR 증폭된 경쇄의 HinfI 소화에 의해 수득된 제한 단편의 예상되는 크기를 표 4에서 각각의 개별적인 클론에 대하여 도시한다. 폴리클로날 항-레수스 D 항체 엔코딩 유전자의 개별적인 멤버로 할당될 수 있었던, 겔 상의 6개의 유일한 단편 크기를 굵게 표시한다. 유일한 단편 모두가 겔 상에 동정될 수 있는 것은 아니며, 이를 이탤릭체로 표시한다. 그러나, 단편이 동정될 수 있는 다른 단편으로부터 충분히 분리되지 않았거나 농도가 보다 강하게 나타나는 밴드에 비해 지나치게 약한 것일 수 있으므로, 이것은 상기 클론이 실제로 배양액에 표시되는 것을 반드시 배제하는 것은 아니다. 이들은 보다 작은 수의 에티듐 브로마이드 분자에 결합하여 덜 뚜렷하기 때문에, 보다 짧은 단편에 대해 한층 더 단언될 수 있다.
표 4
Figure 112007014974017-PCT00002
동일한 폴리클로날 세포주의 두 부분표본(3948 및 3949)이 완전히 동일한 강도의 밴드는 아닐지라도 겔에서 유사한 발현 패턴을 나타낸다. 이것은 동일한 조건하에 성장한 동일한 폴리클로날 세포주의 부분표본은 유사한 클론 다양성을 갖는 항-RhD rpAb를 생성할 것임을 나타낸다.
요약
모노클로날 항-RhD 항체를 각각 발현시키는 10개의 세포주를 혼합하여 항-RhD rpAb 제조용 세포주를 생성하였고, 이것은 배양한 지 9주 후에 여전히 90%의 초기 다양성을 유지하였다. 배양한 지 11주 후, 6개의 상이한 클론으로부터의 mRNA는 분명하게 동정될 수 있었고, 수 개의 다른 클론은 약 500 bp에서 밴드로 표시될 것이다.
폴리클로날 CHO-Flp-In (019) 세포주의 두 부분표본이 클론 다양성과 관련하여 유사한 결과를 나타내었다는 사실은 상이한 배치간에 재현가능한 결과를 수득할 수 있음을 설명한다.
실시예 2
본 실시예는 8개의 멤버를 지니는 폴리클로날 세포 배양액의 경시적인 특성화를 설명한다. 배양액의 클론 다양성을 유전자 레벨에서 RFLP 분석을 이용하고 단백질 레벨에서 일차원적 크로마토그래피 기술을 이용하여 측정하였다.
폴리클로날 세포 배양액의 클론 다양성을 측정하기 위한 RFLP 분석
8개의 상이한 항-레수스 D 항체를 발현시키는 폴리클로날 세포 배양액에서 개별적인 클론의 분포를 폴리클로날 세포주로부터 유래된 RT-PCR 생성물의 말단 RFLP (T-RFLP) 분석에 의해 평가하였다. T-RFLP 공정에서, 전향 및/또는 역향 프라이머(들)를 형광으로 표지하며, 따라서 암플리콘으로부터 생성된 제한 단편의 부분들은 표지를 함유할 것이다. 표지된 단편을 후속하여 모세관 전기영동에 의해 분리하고 형광성에 의해 검출할 수 있다. 적용된 프라이머에 따라서 경쇄 및 중쇄 가변 영역 엔코딩 서열 상에서 분석을 수행할 수 있다.
간단히 말해, 200개의 세포에 상응하는 세포 현탁액을 PBS에서 1회 세척하고, 동결-해동 공정으로 처리하여 One-Step RT-PCR 키트 (Qiagen) 및 적합한 프라이머를 사용하는 RT-PCR 증폭에서 주형으로서 사용되는 용해물을 생성하였다.
RT-PCR을 하기 조건으로 표준 열적 싸이클러에서 수행하였다:
역전사 55℃에서 30분
변성 95℃에서 15분
개시 싸이클 루프 (35 싸이클)
변성 95℃에서 30초
어닐링 60℃에서 30초
연장 72℃에서 5분
종료 싸이클 루프
연장 72℃에서 15분
종료 영구적으로 8℃
경쇄 분석에 대하여, RT-PCR 증폭을 위해 하기 프라이머를 이용하였다. 역향 프라이머는 표지된 6-카르복시플루오레세인 (FAM)이었고, 프라이머 서열은 다음과 같았다:
VL 전향 프라이머: 5'-TCTCTTCCGCATCGCTGTCT (서열번호 1)
CL 역향 프라이머: 5'-FAM-AGGAAAGGACAGTGGGAGTGGCAC (서열번호 2)
20 ㎕의 RT-PCR 생성물을 NEB1에서 1 U의 NheI, 1 U의 PstI 및 1 U의 HinfI (모두 New England Biolabs로부터 수득함)로 2시간 동안 소화시켰다.
표지된 단편을 ABI3700 (Applied Biosystems at Statens Serum Institute, Copenhagen, DK)상에서 형광 모세관 전기영동에 의해 검출하였다.
세포 클론을 생성하는 항-RhD 항체 각각에 대해 예상되는 단편을 표 5에 나 타내며, FAM 표지된 단편을 굵게 나타낸다.
표 5
Figure 112007014974017-PCT00003
T-RFLP 패턴을 도 3에 도시하며 클론을 생성하는 모든 8개의 항-레수스 D 항체를 특정 피크에 할당하였다. RT-PCR 동안 주형/프라이머 경쟁이 없다는 가정하에, 상대적인 피크 면적은 폴리클로날 세포주에 표시되는 각각의 항체 경쇄 유전자로부터 전사되는 mRNA의 상대적인 양에 일치할 것이다.
동일한 폴리클로날 세포주내에서 경쇄 가변 영역의 분석을 위하여, VH-특이적 프라이머를 이용하여 RT-PCR 증폭을 수행하였다. 프라이머 서열은 다음과 같았다:
VH 전향 프라이머: 5'-FAM CGTAGCTCTTTTAAGAGGTG (서열번호 3)
VH 역향 프라이머: 5'-HEX-ACCGATGGGCCCTTGGTGGA (서열번호 4)
20 ㎕의 RT-PCR 생성물을 NEB2에서 1 U의 RSAi 및 1 U의 NdeI (모두 New England Biolabs로부터 수득함)로 2시간 동안 소화시켰다.
표지된 단편을 ABI3700 상에서 형광 모세관 전기영동에 의해 검출하였다. 분석을 Statens Serum Institute, Copenhagen, DK에 의해 수행하였다.
예상되는 T-RFLP 패턴은 표 6에 나타내며, 여기서 FAM 표지된 단편을 굵게 나타내고 HEX (6-카르복시-2',4,4',5,7,7'-헥사클로로플루오레세인 숙신이미딜 에스테르) 표지된 단편을 밑줄로 표시한다.
표 6
Figure 112007014974017-PCT00004
폴리클로날 세포주를 5주 동안 배양하고, 매주 1회 T-RFLP 분석을 위해 샘플을 취하였다. 가변 중쇄상에서 분석을 수행하였으나, 요망된다면 경쇄에서도 또한 분석을 수행할 수 있다.
제한 단편의 모세관 전기영동 후, 상대적인 피크 면적을 통합하여 폴리클로날 세포 배양액의 클론 다양성을 판단하는데 사용하였다. 시간에 따라 상대적인 양을 도 5에 도시한다.
이러한 결과에 기초하여, RhD196은 경시적으로 증가하는 반면 RhD203은 감소하는 것으로 보인다. 다른 클론의 양이 배양 기간 동안 매우 안정적이며, 8개의 cDNA 모두가 배양한 지 5주 후에 검출될 수 있었다.
경쇄 및 중쇄 뿐만 아니라 mRNA 및 DNA 둘 모두에 대하여 T-RFLP를 수행함으 로써, 예를 들어 지정된 시험관내 세포 연령을 지닌 세포에서 또는 배양 동안 임의의 시점에서 폴리클로날 세포 배양액내 클론 다양성의 정확한 핑거프린트를 수득할 수 있을 것이다.
따라서, 상기 기술은 항체 생성 동안 세포 배양액내 클론 다양성의 안정성을 경시적으로 모니터링하는데 이용될 수 있다. 상기 기술은 또한 동일한 폴리클로날 작업 세포 뱅크 (pWCB)로부터 또는 2회 이상의 제조를 진행한 후 회수된 세포에서 동결된 예를 들어 상이한 앰플의 배치-투-배치 일관성을 모니터링하는데 적용될 수 있다.
폴리클로날 세포 배양액의 클론 다양성을 판단하기 위한 양이온-교환 크로마토그래피 분석
상기 기술된 T-RFLP 분석에 이용된 동일한 폴리클로날 세포 배양액으로부터 생성된 항-RhD rpAb를 양이온-교환 크로마토그래피를 이용하여 분석하였다. 단백질 A 정제된 재조합에 의해 생성된 폴리클로날 항체를 25 mM 나트륨 아세테이트, 150 mM 염화나트륨, pH 5.0에서 60 ml h-1의 유속으로 실온에서 작업되는 PolyCatA 컬럼 (4.6 x 100 mm)상에 적용시켰다. 항체 성분을 후속하여 25 mM 나트륨 아세테이트, pH 5.0에서 60 ml h-1의 유속으로 150 내지 350 mM 염화나트륨의 선형 구배를 이용하여 용리시켰다. 항체 성분을 280 nm에서 스펙트로포토메트리에 의해 검출하였고, 후속하여 크로마토그램을 통합한 다음, 개별적인 피크의 면적을 항체 성분을 정량하는데 이용하였다. 시간에 따른 상대적인 양을 도 6에 도시한다.
요약
RFLP 분석에 의해 유전자 레벨에서 그리고 양이온-교환 크로마토그래피에 의해 단백질 레벨에서 수득된 결과는 동등하다. 도 5 및 6은 폴리클로날 세포주 중 대부분의 개별적인 클론 뿐만 아니라 세포주로부터 발현된 폴리클로날 항체의 개별적인 항체들이 5주의 배양 동안 동일한 경향에 따름을 설명한다. 따라서, 유전자 레벨은 물론 단백질 레벨에서의 분석은 유전자 레벨에서 세포주 및 세포주로부터 생성된 재조합 폴리클로날 단백질의 조성 다양성을 측정하기 위해 양호한 등가물이다.
실시예 3
본 발명은 25개의 멤버를 지니는 폴리클로날 세포 배양액의 경시적인 특성화를 설명한다. 배양액의 클론 다양성을 T-RFLP 분석을 이용하여 유전자 레벨에서 그리고 일차원적 크로마토그래피 기술을 이용하여 단백질 레벨에서 측정하였다.
5주의 배양 기간 동안 25개의 상이한 항-레수스 D 항체를 발현시키는 폴리클로날 세포 배양액으로부터 유래된 중쇄 유전자의 가변 부분의 T-RFLP 분석
본 실시예에서 조사된 폴리클로날 세포 배양액은 25개의 상이한 항-레수스 D 항체 (실시예 1에 기술된 대로 생성됨)를 발현시키는 세포 배양액의 혼합물로 구성되었다. 폴리클로날 세포 배양액을 5주 동안 배양하였고, T-RFLP 분석을 위해 1주일에 1회 샘플을 취하였다.
실시예 2에 개시된 VH-특이적 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하였고, 제한 단편화를 유사하게 수행하였다.
모든 유전자형이 존재하는 경우, 25개의 상이한 항-레수스 D 엔코딩 서열의 T-RFLP가 17개의 상이한 FAM 표지된 단편을 생성할 것이다. 몇몇 단편은 3개 이하의 상이한 유전자형을 제시하는 반면, 다른 것들은 단일의 유전자형을 제시할 것이다. FAM 표지된 단편의 예상되는 크기를 경시적인 상이한 FAM 표지된 단편의 상대적인 양과 함께 표 7에 도시한다. 추가로, T-RFLP 프로파일의 한 예를 도 4에 도시한다.
표 7
Figure 112007014974017-PCT00005
세포주를 구성하는 25개 클론 중 12개의 개별적인 클론에 대한 정보를 수득할 수 있는 한도로 제한 단편을 분리할 수 있었다. 남아있는 단편들을 잠재적으로 서열화하여 잔여 클론에 대한 더 많은 정보를 수득할 수 있다.
25개의 상이한 항-레수스 D 항체를 발현시키는 폴리클로날 세포 배양액에서 클론 다양성을 판단하기 위한 양이온-교환 크로마토그래피 분석
상기 기술된 T-RFLP 분석에 사용된 것과 동일한 폴리클로날 세포 배양액으로부터 생성된 항-RhD rpAb를 양이온-교환 크로마토그래피를 이용하여 분석하였다. 단백질 A 정제된 재조합에 의해 생성된 폴리클로날 항체를 25 mM 나트륨 아세테이트, 150 mM 염화나트륨, pH 5.0에서 60 ml h-1의 유속으로 실온에서 작업되는 PolyCatA 컬럼 (4.6 x 100 mm)상에 적용시켰다. 항체 성분을 후속하여 25 mM 나트륨 아세테이트, pH 5.0에서 60 ml h-1의 유속으로 150 내지 350 mM 염화나트륨의 선형 구배를 이용하여 용리시켰다. 항체 성분을 280 nm에서 스펙트로포토메트리에 의해 검출하고, 크로마토그램을 후속하여 통합하고, 개별적인 피크의 면적을 사용하여 상이한 항체 성분들을 정량하였다. 도 7은 4주째에 수득된 샘플로부터 생성된 크로마토그램이며, 피크를 함유하는 항체를 1 내지 25의 숫자로 표시하였다. 크로마토그램이 분석되는 폴리클로날 항체에서 개별적인 항체의 수와 동일한 수의 피크를 함유하는 것은 단순의 일치이다. 표 8은 총 항체 성분 (AC1 내지 25)의 상대적인 함량 (%)을 도시할 뿐만 아니라 각 항체 성분에서 (피크) 개별적인 항체를 표시한다. 통합된 크로마토그래피 피크로의 개별적인 항체의 할당은 동일한 조건하에 양이온-교환 크로마토그래피를 이용하여 분석된 모노클로날 항체로부터 수득된 체류 시간 및 피크 패턴에 기초한다.
표 8
Figure 112007014974017-PCT00006
양이온-교환 크로마토그래피는 순전하의 차이에 기초하여 폴리클로날 항체로부터 개별적인 항체 멤버를 분리하고, 또한 이질의 전하를 나타내는 개별적인 항체의 형태를 분리한다. 따라서, 수 개의 항체가 RhD293 및 RhD319를 함유하는 AC1 (참조 표 8)과 같이 단일 피크에서 표시되며, 몇몇 개별적인 항체가 AC1 및 5 둘 모 두에 존재하는 RhD319 (참조 표 8)와 같이 수 개의 크로마토그래피 피크에서 추가로 표시되었다.
하나 이상의 개별적인 항체를 함유하는 피크를 추가의 단백질 화학 특성화 기술, 예컨대 항-유전형 펩티드를 이용한 정량 분석, 단백질분해 펩티드 지도화, N-말단 서열화 또는 2차원 크로마토그래피로 처리할 수 있다.
요약
본 실시예는 T-RFLP 분석 및 양이온-교환 크로마토그래피의 조합된 이용으로 일차 전사체 및 항체 성분 각각의 분포를 배양 기간 동안 측정하는 것을 설명한다. T-RFLP 분석으로 폴리클로날 세포주에서 발현되는 25개 클론 중 12개의 개별적인 클론을 유일하게 동정할 수 있고, 본 실시예에서, 상기 12개 클론이 4주의 배양 동안 T-RFLP 분석으로 검출될 수 있었음을 설명한다. 잠재적으로, 더 많은 클론이 하나 이상의 클론을 나타내는 단편의 서열 분석에 의해 동정될 수 있었다. 항체 성분의 분포를 양이온-교환 크로마토그래피를 이용하여 분석하였으며, 본 실시예에서, 25개의 분석된 성분의 분포는 배양 동안 비교적 안정한 것으로 보인다. 발현되는 항체 고유의 전하 이질 특성으로 인해 모든 개별적인 항체의 유일한 동정이 어려울지라도, RhD160 항체를 나타내는 항체 성분 8이 배양 기간 동안 RhD160, 293 및 196 클론을 나타내는 그룹 13에 대해 수득된 높은 T-RFLP 값에 따라서 가장 높은 항체 레벨을 나타내었음이 본 실시예에서 입증되었다. 추가로, T-RFLP 뿐만 아니라 양이온-교환 크로마토그래피에 의해 유일하게 동정될 수 있었던 RhD 207 성분이 10-11%의 T-RFLP 레벨을 나타내었고 항체 레벨에서 다소 낮은 5.5 내지 10%의 레벨을 수득하였다. 종합적으로, 두 기술을 함께 이용하여 배양 동안 mRNA 및 항체 레벨에서 비교적 안정한 생성을 입증하나; 항체 레벨에서 수득된 결과와 대조적인, 5주의 배양에서 몇몇 클론의 명백한 전사의 손실에 의해 설명되는 대로 두 기술간에 잠재적인 불일치가 보여질 수 있다. 따라서, 본 실시예는 복잡한 폴리클로날 단백질의 안정한 생성이 수득될 수 있는 범위내에서 배양 간격을 규정하기 위해 두 기술의 상보적인 이용을 정당화한다.
실시예 4
본 실시예는 폴리클로날 세포 배양액으로 유래된 10개의 개별적인 멤버를 지니는 폴리클로날 항-RhD 항체의 조성 분석을 설명한다. 폴리클로날 항체 샘플의 다양성을 일차원에서 양이온-교환 및 이차원에서 역상(RP)-HPLC를 각각 이용하는, 순전하와 소수성의 차이에 기초하여 항체를 분리시키는 이차원적 액체 크로마토그래피를 이용하여 평가하였다.
10개의 개별적인 멤버를 지니는 폴리클로날 항-RhD 항체 샘플을 폴리클로날 세포 배양액으로부터 유래시켰다. 항-RhD rpAb를 단백질 A 컬럼을 이용하여 상청액으로부터 정제하였다 (HiTrap™ Protein A column, Amersham Biosciences GE Healthcare, England).
정제된 폴리클로날 항체를 Ettan LC 시스템(Amersham Biosystems, GE Healthcare, England)상에서 25 mM 나트륨 아세테이트, 150 mM 염화나트륨, pH 5.0에서 60 ml h-1의 유속으로 실온에서 작업되는 ProPac WCE10 컬럼 (4 x 250 mm)상에 적용시켜 일차원을 수행하였다. 항체 성분을 후속하여 25 mM 나트륨 아세테이트, pH 5.0에서 60 ml h-1의 유속으로 150 내지 350 mM NaCl의 선형 구배를 이용하여 용리시켰다. 항체 성분을 280 nm에서 스펙트로포토메트리에 의해 검출하고, 특정 피크에 상응하는 분획을 수집하고, 추가로 농축시킨 후 RP-HPLC로 분석하였다.
도 8에 표시된 분획을 RP-HPLC를 이용하여 이차원적으로 추가로 분리하였다. Zorbax Poroshell 300SB-C8 컬럼 (2.1 x 75 mm (5㎛)을 이용하여 이차원을 Summit HPLC 시스템 (Dionex, CA)상에서 수행하였고, HPLC 시스템을 Poroshell 컬럼 (Agilent Technologies, CA)에 대한 지침서에 추천된 대로 구성하였다. 양이온-교환 크로마토그래피로부터 수집된 항체 성분을 10% CH3CN, 0.1% TFA, 0.3% PEG에서 120 ml h-1의 유속으로 컬럼 (5㎕)상에 적용시키고, 90% CH3CN, 0.08% TFA, 0.3% PEG의 선형 구배로 용리시켰다. 컬럼을 70℃에서 작업하였다. 모든 항체 성분 샘플이 하나 또는 두 개의 폭이 좁은 피크를 지니는 크로마토그램을 초래하였다. 항체 성분 B5의 RP-HPLC 프로파일을 도 9에 도시한다.
요약
일차원의 양이온-교환 크로마토그래피가 순전하가 상이한 개별적인 항체 및 이질의 전하를 나타내는 개별적인 항체를 분리하기 때문에, 수 개의 항체가 단일 피크에 표시될 수 있다.
수 개의 항체 성분을 분리하여 도 8에 도시된 대로 다소 복잡한 프로파일을 생성하였다. 실시예 2 및 3에 설명된 대로, 동일한 조건하에 분석된 모노클로날 항체와의 비교 분석에 의해 각 피크에서 개별적인 성분들을 동정할 수 있다. 그러나, rpAb에서 각각의 모노클로날 항체를 할당하여야 할 필요 없이 서로에 대한 샘플의 비교를 위한 핑거프린트를 제공하는 것이 목적이므로 이것은 본 실시예에서 수행되지 않았다. 따라서, 양이온-교환에 이어 RP-HPLC의 조합은 이차원으로부터의 데이터를 생성하며, 도 10에 설명된 상세한 컬러-코딩 단백질 지도 (ProteoVue software, Eprogen, USA)는 복잡한 rpAb의 개별적인 멤버를 특성화하기 위해 모노클로날 항체를 분석할 필요 없디 배치-투-배치 일관성의 평가를 위해 연구될 수 있다.
실시예 5
본 실시예는 폴리클로날 세포 배양액으로부터 유래된 8개의 개별적인 멤버를 지니는 폴리클로날 항-RhD 항체의 특성화를 설명한다. 폴리클로날 항체의 다양성을 "벌크" N-말단 서열 분석을 이용하여 평가하였다.
본 실시예에서 분석되는 폴리클로날 항-RhD 항체 샘플에 존재하는 개별적인 멤버의 N-말단 서열을 하기 표 9에 나타낸다. 람다 경쇄 서열을 이탤릭체로 표시한다.
표 9
Figure 112007014974017-PCT00007
단백질 A 정제된 항-RhD rpAb를 SDS-PAGE (NuPAGE 4-12%)를 환원시켜 분석하였다. 폴리펩티드를 PVDF 막상에 전기운반하고, 후속하여 제조자의 지시에 따라 코마시 블루로 염색하였다.
중쇄(HC)에 상응하는 약 53 kDa의 하나의 밴드와 카파 및 람다 + 카파 경쇄에 상응하는 약 25 및 30 kDa의 두 개의 밴드가 코마시 블루 염색된 PVDF 막상에서 각각 뚜렷하게 보였다. 상기 밴드를 절단하고, ABI 프로사이즈 단백질 서열화기 (Applied Biosystems, CA) 및 표준 프로그램을 이용하여 N-말단 서열 분석으로 처리하였다. 서열화 결과를 하기 표 10에 요약한다.
표 10
Figure 112007014974017-PCT00008
HC에 대한 서열은 제1 잔기를 제외하고 동일한 반면, 카파 LC는 잔기 2, 5, 6 및 7에서 보존되었고 람다 LC는 잔기 1, 5 및 6에서 보존되었다 (참조 표 9).
HC의 서열화로부터 수득된 결과는 표 10에 제시된 예상되는 서열과 일치하였다. ~25 kDa의 카파 밴드로부터의 서열 데이터는 RhD191, 324, 201 및 306에 상응하는 N-말단 서열 EIVLTQS (서열번호 7)을 지니는 항체, 및 RhD244 및 196에 상응하는 N-말단 서열 DIQMTQS (서열번호 8)을 지니는 항체의 존재를 나타낸다. 그러나 본 기술을 이용하여, 모든 개별적인 멤버가 폴리클로날 항체 샘플에 존재하는지를 평가할 수는 없었다. ~30 kDa의 LC 밴드의 서열화는 3 및 4 싸이클에 Val의 존재에 의해 판단되는 RhD319 항체의 존재를 나타내었다. RhD203 항체의 존재에 관해서는 아무런 증거도 수득하지 못하였다 (2 및 3 싸이클에서 각각 S 및 A 없음). 그러나, 상기 재조합 모노클로날 항체의 이온-교환 크로마토그래피 및 N-말단 서열 분석은 RhD203의 LC가 부분적으로 차단된 N-말단을 지님을 강력하게 시사한다. 따라서, N-말단 서열 분석에 의해, 상기 항체가 분석되는 혼합물에 존재하는지 또는 존재하지 않는지가 확실하게 결정될 수 없다. 또한, E 및 D 잔기가 1 싸이클에 존 재하고 M 잔기가 4 싸이클에 존재하기 때문에, 30 kDa 밴드가 또한 몇몇 카파 LC를 함유하는 것처럼 보인다.
요약해 보면, 벌크 N-말단 서열 분석은 개별적인 항체들의 서열이 HC 또는 LC에서 상이하고 N-말단에서 차단되지 않은 경우, 이들 서열의 존재를 동정하는데 사용될 수 있다. 상기 방법은 개별적인 폴리펩티드의 N-말단이 부분적으로 차단되지 않는 한 정량적이다.
실시예 6
본 실시예는 폴리클로날 세포 배양액으로부터 유래된 8개의 개별적인 멤버를 지니는 폴리클로날 항-RhD 항체의 특성화를 설명한다. 항체의 다양성을 펩티드 분리를 위한 RP-HPLC 또는 이온-교환 크로마토그래피 (IEX)를 이용하여 가변 영역에 기원한 유일한 마커 펩티드를 분리함에 의해 분석하였다.
분리된 중쇄 및 경쇄의 소화에 의한 펩티드 생성
8개의 개별적인 멤버를 지니는 폴리클로날 항-RhD 항체 샘플을 HiTrap rProtein A 컬럼을 이용한 친화성 크로마토그래피에 의해 폴리클로날 세포 배양액의 상청액으로부터 정제하였다. 동결건조된 재료를 환원되고 (DTT) 카르복시메틸화된 (요오도아세트산) 6 M 구아니듐 히드로클로라이드, 0.5 M EDTA, 0.2 M Tris HCl, pH 8.4에 용해시켰다. 중쇄 및 경쇄를 Ettan LC 시스템 (Amersham Biosciences, GE Healthcare, England)상에서 6 M 구아니듐 HCl, 50 mM 인산나트륨, pH 8.4로 수퍼로스 12 컬럼 (10/300 from Amersham Biosciences, GE Healthcare) 상의 겔 여과에 의해 분리하였다. 분리된 HC (~3.5 mg/ml) 및 LC (6.5 mg/ml)를 엔도단백분해효소 Asp-N (Roche, 1 054 569)을 이용하여 인산나트륨 (pH 8)에서 1:500의 효소 대 기질 농도로 소화시켰다.
RP-HPLC에 의한 유일한 펩티드의 분리
폴리클로날 항체 샘플로부터 수득된 분리된 HC 및 LC의 개별적인 Asp-N 소화물의 부분표본을 0.1 TFA에서 평형화된 가드 컬럼 (Zorbax 300SB-C8, 2.1 x 12.5 mm, 5 ㎛)에 연결된 Zorbax 300SB-C18 (2.1 x 150 mm) 5 ㎛ 컬럼을 장착한 Agilent 1100 LC/MSD SL 시스템에 0.2 ml/분의 유속으로 적용시켰다. 펩티드를 0.08% TFA, 70% 아세토니트릴의 선형 구배를 이용하여 용리시켰다. 펩티드를 220 nm에서 스펙트로포토메트리에 의해 검출하고, 온-라인 MS (atmospheric pressure ionization (API) 일렉트로스프레이)에 의해 분석하였다. 75% 프로피온산/25% 아소프로판올의 혼합물을 컬럼뒤 이동상에 첨가시켜 시그날을 증가시켰다. 수득된 매스 스펙트럼을 Chemstation 소프트웨어 (Agilent Technologies, CA) 및 BioLynx 소프트웨어 (Micromass, Waters Corporation, MA)를 이용하여 분석하였다.
HC 및 LC의 Asp-N 소화물의 MS 분석으로부터의 결과를 표 11 및 12에 각각 요약한다. 두 표 모두는 평균 매스로서 제공된 이론적 매스 및 검출된 매스를 표시한다.
표 11: 중쇄에 대한 결과
Figure 112007014974017-PCT00009
표 12: 경쇄에 대한 결과
Figure 112007014974017-PCT00010
Figure 112007014974017-PCT00011
표 11에 나타낸 대로, 가변 HC로부터의 13개 펩티드 및 가변 LC로부터의 16개 펩티드를 유일한 마커 펩티드로서 동정할 수 있고, HC의 가변 영역으로부터의 몇몇 펩티드 (예컨대, a로서 표시된 RhD196, RhD244 및 RhD306으로부터의 D1)가 동일한 매스를 지니므로, 이들 매스를 명확하게 할당할 수 없다. 그러나, 다른 매스가 모든 경우에 유일한 펩티드로 명확하게 할당될 수 있기 때문에 8개의 모든 항체의 포지티브 동정을 수득하였다. LC에 대하여, 유일한 펩티드를 8개의 항체 중 7개에 대하여 할당하였다 (표 12). LC에 대한 정보가 없는 항체는 RhD324였다. 따라서, HC 및 LC로부터의 조합된 MS 데이터는 8개의 항체 모두가 항-RhD rpAb 샘플에서 항체 각각으로부터의 유일한 펩티드의 검출에 기초하여 동정될 수 있었음을 입증한다.
양이온-교환 크로마토그래피에 의한 유일한 펩티드의 분리
HC 및 LC의 Asp-N 소화물을 하기와 같이 강력한 양이온-교환 크로마토그래피에 의해 분리하였다: 상기 기술된 대로 폴리클로날 항체로부터 수득된 분리된 HC 및 LC의 개별적인 Asp-N 소화물의 부분표본을 Ettan LC 시스템 (Amersham Biosciences, GE Healthcare, England)에서 10 mM 인산칼륨, 20% (v/v) 아세토니트릴, pH 3.0에서 평형화된 폴리설포에틸 A 컬럼 (2.1 x 100 mm) 상에 0.2 ml/분의 유속을 이용하여 실온에서 적용시켰다. 펩티드를 후속하여 10 mM 인산칼륨, 20% 또는 30% (v/v) 아세토니트릴, pH 3.0에서 0 내지 500 mM 염화칼륨의 선형 구배를 이용하여 용리시켰다. 용리된 펩티드를 215 nm에서 스펙트로포토메트리에 의해 검출하였고, 분획을 정기적인 분획화에 기초하여 수집하였다. 분획의 부분표본 (1㎕)을 70% 아세토니트릴/30% 0.1% TFA에서 1 ㎕의 α-시아노-4-히드록시신남산 (20 mg/ml) 용액과 혼합하고, MS 표적상에 적용시키고 0.1% TFA로 세척하였다. 샘플을 Autoflex TOF (Bruker Daltronics, Bremen, Germany) 상에서 MALDI-TOF에 의해 분석하고, Bruker Daltronics (Bremen, Germany)로부터의 눈금교정 혼합물을 이용하여 외부 매스 눈금교정을 수행하였다. GPMAW 6.1 소프트웨어 (Lighthouse data, Odense, Denmark)를 이용하여 MALDI 스펙트럼을 분석하였다 (매스 조사 및 내부 눈금교정).
LC의 Asp-N 소화물로부터의 수 개의 피크를 함유하는 대표적인 크로마토그램을 도 11에 도시한다. LC 및 HC의 Asp-N 소화물로부터의 분획을 MALDI-TOF 분석한 결과를 표 13 및 14에 각각 도시한다. 이론적 매스 및 실측 매스를 3500 Da 미만의 매스에 대해 일동위원소 매스로서 및 3500 Da 초과의 매스에 대해 평균 매스로 서 제시한다.
표 13. 경쇄로부터의 결과
Figure 112007014974017-PCT00012
표 14: 경쇄로부터의 결과
Figure 112007014974017-PCT00013
표 13 및 14에서 나타낸 대로, 가변 LC로부터의 15개 펩티드 및 가변 HC로부터의 9개 펩티드가 유일한 마커 펩티드로서 동정될 수 있고, HC 뿐만 아니라 LC의 가변 영역으로부터의 몇몇 펩티드가 동일한 매스를 지니며, 명확하게 할당될 수 없다. 따라서, 강력한 양이온-교환 크로마토그래피를 이용하여 HC RhD201, 203 및 324, 및 LC RhD201 및 319에 대한 유일한 펩티드를 할당할 수 없었다.
요약
두 개의 상이한 마커 펩티드 분석으로부터 수득된 결과는 HC 및 LC의 MS 분석으로부터 수득된 조합된 데이터가 RP-HPLC를 이용하여 항-RhD rpAb를 구성하는 8개 항체 모두의 가변 영역으로부터의 유일한 펩티드를 동정할 수 있게 함을 입증하는데 충분하다. 강력한 양이온-교환 크로마토그래피를 이용하여, 항-RhD rpAb 조성물에서 8개의 개별적인 멤버 중 6개를 동정할 수 있었다. MS 분석으로부터의 결과는 세목을 완성할 정도로 분석하지 았았으며, 단지 표 11 내지 14에 도시된 정도이다.
실시예 6A
본 실시예는 폴리클로날 세포 배양액 (생체반응기 진행)으로부터 유래된 25개의 개별적인 멤버를 지니는 재조합 폴리클로날 항-RhD 항체의 특성화를 설명한다. 항체의 다양성을 펩티드를 동정하기 위해 매스 스펙트로메트리와 조합된 RP-HPLC를 이용하여 LC 또는 HC로부터의 가변 영역에 기원한 유일한 마커 펩티드의 분리에 의해 분석하였다.
분리된 중쇄 및 경쇄의 소화에 의한 펩티드 생성
25개의 개별적인 멤버를 지니는 폴리클로날 항-RhD 항체 샘플을 진행된 생체반응기로부터 폴리클로날 세포 배양액의 상청액으로부터 정제하였다. 정제는 MabSelect (Amersham Biosciences, GE Healthcare) 컬럼을 이용한 친화성 크로마토그래피에 의해 수행되었고 G25 컬럼 (Amersham Biosciences, GE Healthcare)상에서 탈염되었다. 동결건조된 재료를 환원되고 (DTT) 카르복시메틸화된 (요오도아세트산) 6 M 구아니듐 히드로클로라이드, 0.2 M Tris HCl, pH 8.4에 용해시켰다. 중쇄 및 경쇄를 6 M 구아니듐 HCl, 50 mM 인산나트륨, pH 8.4로 수퍼로스 12 컬럼 (10/300 GL from Amersham Biosciences, GE Healthcare) 상의 겔 여과에 의해 분리하였다. 분리된 HC 및 LC를 1 M 우레아, 50 mM 인산나트륨, pH 8에서 밤새 37℃에서 엔도단백분해효소 Asp-N (Roche, 1 054 589)을 이용하여 1:200의 효소 대 기질 농도로 소화시켰다.
LC-MS에 의한 유일한 펩티드의 분리
폴리클로날 항체 샘플로부터 수득된 분리된 HC 및 LC의 개별적인 Asp-N 소화물의 부분표본을 0.1% TFA, 14% ACN에서 평형화된 가드 컬럼 (Zorbax 300SB-C8, 2.1 x 12.5 mm, 5 ㎛)에 연결된 Zorbax 300SB-C18 (2.1 x 150 mm) 5 ㎛ 컬럼을 장착한 Agilent 1100 LC/MSD SL 시스템에 0.2 ml/분의 유속으로 적용시켰다. 펩티드를 0.08% TFA, 70% 아세토니트릴의 선형 구배를 이용하여 용리시켰다. 펩티드를 220 nm에서 스펙트로포토메트리에 의해 검출하고, 온-라인 MS (atmospheric pressure ionization (API) 일렉트로스프레이)에 의해 분석하였다. 75% 프로피온산/25% 아소프로판올의 혼합물을 컬럼뒤 이동상에 첨가시켜 시그날을 증가시켰다. 수득된 매스 스펙트럼을 Chemstation 소프트웨어 (Agilent Technologies, CA) 및 GPMAW 6.2 소프트웨어 (Lighthouse data, Odense, Denmark)를 이용하여 분석하였다.
HC 및 LC의 Asp-N 소화물의 MS 분석으로부터의 결과를 표 14A에 요약하며, 이론적 매스 및 검출된 매스를 평균 매스로서 제시한다.
표 14A: Asp-N 절단 및 LC-MS 분석을 적용시켜 항-RhD rpAb에서 25개 항제로부터 유일한 소수성 펩티드의 동정
Figure 112007014974017-PCT00014
Figure 112007014974017-PCT00015
aD 및 d는 각각 Asp-N에 의해 생성된 HC 및 LC로부터의 펩티드를 언급하고, 펩티드는 예상되는 서열의 N-말단으로부터 C-말단까지 번호를 매겼다. 따라서, d4는 LC 폴리펩티드의 3번째 및 4번째 Asp-N 부위에서의 절단에 의해 생성된 펩티드를 언급한다. b이 펩티드는 생략된 절단 부위 포함한다. *N-말단 고리화된 Gln(PyroGlu)를 나타낸다.
표 14A에 나타낸 대로, LC의 가변 부분으로부터의 22개 펩티드 및 HC의 가변 부분으로부터의 3개 펩티드를 유일한 마커 펩티드로서 동정할 수 있다. 따라서, HC 및 LC로부터의 MS 데이터는 25개 항체 모두가 각 항체로부터의 유일한 펩티드의 검출에 기초하여 항-RhD rpAb 샘플에서 동정될 수 있었음을 명확하게 입증한다.
실시예 7
본 실시예는 재조합 폴리클로날 항-RhD 항체의 개별적인 멤버에 대한 특이성을 이용한 항-유전형 펩티드의 생성 뿐만 아니라 재조합 폴리클로날 항체에서 하나의 개별적인 멤버의 농도 측정을 설명한다.
항-RhD 항체-특이적 펩티드 리간드의 생성
pIII (New England Biolab)의 N-말단 끝에서 7개의 아미노산을 임의의 서열 순서로 디스플레이하는 파지 라이브러리를 개별적인 항-RhD 항체에 대한 펩티드 결합제의 친화성 선택을 위해 이용하였다. 펩티드 라이브러리의 선형 및 구속된 버젼 둘 모두를 선택에 이용하였다. 마이크로역가 플레이트 (Maxisorb, NUNC)를 4℃에서 12-16시간 동안 웰 당 100 ㎕를 이용한 10 ㎍/ml에서 정제된 모노클로날 항-RhD 항체로 코팅하였다. 재조합 폴리클로날 항-RhD 항체에 함유된 25개의 개별적인 항체 모두를 항-유전형 펩티드를 스크리닝하는데 이용하였다. 그러나, 재조합 폴리클로날 항체가 다수의 개별적인 멤버 (예컨대, 50개 이상)를 함유하는 경우에, 파수 항체가 스크리닝을 위해 선택될 수 있다. 바람직하게는 재조합 폴리클로날 단백질을 구성하는 항체의 총 수의 4% 이상에 해당하는 다수의 파수 항체가 선택되며, 보다 바람직하게는 재조합 폴리클로날 단백질을 구성하는 항체의 총 수의 8%, 12%, 16%, 20%, 30% 또는 50% 이상을 구성하는 파수 항체가 선택된다. 코팅된 플레이트를 후속하여 PBS, 0.05%Tween-20으로 세척한 다음 2% 스키밍된(skimmed) 유제/PBS로 차단하였다. ~1011 pfu/100 ㎕의 박테리오파지를 각 패닝 라운드에 이용하였다. 함유된 선형 라이브러리를 혼합하고, 2% 스키밍된 유제/PBS에서 혼합물로 서 함께 패닝시켰다. 실온에서 1시간 인큐베이션 후에, 결합된 파지를 글리신/HCl, pH=2.2에서 10분 동안 용리시킨 다음 Tris-HCl, pH=9.0으로 중화시켰다. 3 내지 4 라운드의 패닝 후에, 단일 클론을 분리하고, DNA를 추출하고, 랜덤 펩티드 영역에 상응하는 영역에서 서열화시켰다. 하기 표 15는 단일 클론으로부터 추론되는 아미노산 서열의 정렬을 도시한다.
표 15
Figure 112007014974017-PCT00016
항-RhD162, 202 또는 305에 대해 각각 특이적 친화성을 지니는 3개의 합성 펩티드를 관련 서열 그룹의 추론되는 일치 아미노산 서열에 따라 합성하였다. 각 합성 펩티드를 C-말단에서 비오틴에 커플링시켰다.
각 펩티드의 특이성을 ELISA에 의해 시험하였다. 간단히 말해, ELISA 플레이트를 4℃에서 12-16시간 동안 웰 당 100 ㎕를 이용한 5 ㎍/ml에서 스트렙타비딘으로 코팅하였다. 이후 PBS에서 ~10 ㎍/ml로 희석된 펩티드를 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션시키고, 세척에 의해 과량의 펩티드를 제거하였다. 플레이트를 후속하여 2% 스키밍된 유제/PBS로 차단하고 PBS에서 3회 세척하였다. 개별적인 항-RhD 항체 각각을 10 ㎍/ml로 다양한 희석 시작시에 개별적으로 첨가하였다. 결합된 항체를 항-사람 IgG-컨쥬게이트 (Caltag cat # H10307)를 이용하여 검출하였다. 플레이트를 5회 세척하고 25 ㎕의 색소원 (TMB, Kem-En-Tech)을 첨가하여 검출을 수행하였다. 25 ㎕의 1 M H2SO4를 첨가하여 15-25분 후에 반응을 종료시켰다. 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 모노클로날 항-RhD 항체의 패널에 대해 각 펩티드를 시험한 결과, 반응성이 적합한 개별적인 멤버-단백질에 대해 특이적인 것으로 나타났다. 따라서, 10 이상의 시그날 대 잡음 비 (signal-to-noise ratio)로 PEP162만이 항-RhD162항체에 결합하고, PEP202만이 항-RhD202에 결합하며, PRP305만이 항-RhD305에 결합하였다.
재조합 폴리클로날 항-RhD 항체에서 항-RhD305 양의 결정
적당하게 희석된 정제된 항-RhD305 모노클로날 항체를 대조 표준으로서 이용 하여, 재조합 폴리클로날 항-RhD 항체의 혼합물에서 항체의 총 양에 대한 항-RhD305 항체의 결정할 수 있다. 간단히 말해, ELISA 플레이트를 스트렙타비딘으로 코팅하고 PBS에서 ~10 ㎍/ml로 희석된 PEP305와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세척에 의해 과량의 펩티드를 제거하였다. 플레이트를 후속하여 2% 스키밍된 유제/PBS로 차단하고 PBS에서 3회 세척하였다. 25개의 개별적인 항-RhD 항체로 구성된 재조합 폴리클로날 항-RhD 항체 (샘플)를 1 내지 16348배로 희석시켜 첨가하였다. 샘플을 사중으로 분석하였다. 동일한 플레이트상의 분리된 웰에서, 10 ㎍/ml에서 시작된 모노클로날 항-RhD305 항체의 연속 희석물을 (3배) 대조 샘플로서 첨가하여, 표준 곡선을 생성하였다. 결합된 항체를 항-사람 IgG-컨쥬게이트 (Caltag cat # H10307)를 이용하여 검출하였다. 플레이트를 5회 세척하고 25 ㎕의 색소원 (TMB, Kem-En-Tech)을 첨가하여 검출을 수행하였다. 25 ㎕의 1 M H2SO4를 첨가하여 15-25분 후에 반응을 종료시켰다. 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
표준 곡선은 하기 범위내에서 농도에 선형 비례하였다:
모노클로날 항-RhD Ab ㎍/ml 0,156 0,078 0,039 0,0195
OD450 1,509 0,990 0,567 0,338
상기 데이터는 방정식 y=0.1161x-0.0256 및 R2=0.9812의 표준 곡선을 생성하였다.
표준 곡선에 대해 결정된 방정식 뿐만 아니라 샘플의 희석 인자를 사용하여 재조합 폴리클로날 항-RhD 항체 샘플에서 항-RhD305 항체의 농도를 산출하였다.
32배 희석시에, 샘플에 대해 측정된 평균 OD450은 폴리클로날 항-RhD 항체에서 3.8±0.5 ㎍/ml의 항-RhD305 항체에 상응하는 1.24±0.14였다. 재조합 폴리클로날 항-RhD 항체 샘플의 총 항체 농도는 100 ㎍/ml였다. 따라서, 항-RhD305 항체는 3.8%의 폴리클로날 항체 샘플을 나타낸다.
실시예 8
본 실시예는 재조합 폴리클로날 항-RhD 항체의 액체 이온-교환 크로마토그래피 분석에 의한 일차원 분리에 의해서 특이적 분획/피크 중 파수 항체를 동정하기 위한 항-유전형 펩티드의 용도를 설명한다.
25개의 개별적인 항-RhD 항체로 구성된 재조합 폴리클로날 항-RhD 항체를 양이온-교환 크로마토그래피에 의해 분리하고, 분획을 수집하였다. 각 분획을 3개의 항-유전형 펩티드 (실시예 7에 기술됨)를 이용한 ELISA에 의해 조사하여, 각 분획에서 특정 항-RhD 항체의 존재를 검출하였다. 크로마토그램을 각 분획에 대해 수행된 ELISA 데이터와 오버레이시켜 보면, 상기 방법이 특정 분획에서 개별적인 항체를 동정하는데 사용될 수 있는 것으로 나타났다 (도 12). 따라서, 특정 피크에서 흡광도를 ELISA 데이터와 비교하여, 동형 단백질의 복잡한 혼합물 조성물의 반-정량적 평가를 수행할 수 있다.
실시예 9
의약 용도를 위한 폴리클로날 단백질을 제조할 때 조성물 안정성을 보장하는 것이 중요한 논제이다. 동형 단백질의 복잡한 혼합물내에서 개별적인 단백질 멤버 를 동정할 수 있는 특이적 펩티드-리간드를 발효 동안 상이한 생성 시점에 매질 샘플을 추출하고 실시예 7에 개시된 ELISA 방법과 같은 정량적인 검출 방법을 적용시키는 제조 동안 폴리클로날 단백질의 조성 안정성을 모니터링하는데 사용할 수 있다.
본 실시예에서, 3개의 파수 단백질, 항-RhD162, 202 및 305 항체의 실제량을 25개의 유일한 항-RhD 항체로 구성된 재조합 폴리클로날 항-RhD 항체를 생성하는 pWCB의 관류 발효 공정으로 평가하였다. 도 13은 생체반응기의 접종 후 8일에 상응하는 G8에서 발효 동안 상이한 배양 시점에서 3개의 파수 항체 (항-RhD162, 202 및 305)의 분포를 설명한다.
실시예 10
본 실시예는 세포 배양 혼합물에서 특정 항-RhD 항체를 생성하는 세포를 동정하는 방법을 설명한다. 실시예에서, 두 상이한 항체 생성 세포주의 혼합물을 검출을 위해 항-유전형 펩티드 및 흐름 세포계수기를 이용하여 분석하였다.
두 개별적인 항-RhD 항체 생성 세포주, RhD162 및 RhD202를 규정된 비율로 혼합하였다. 클론 RhD202의 백분율을 표 16에 나타낸다.
비오티닐화된 펩티드 202 (실시예 7에서 제조된 PEP202)를 피코에리트린 컨쥬게이션된 스프렙타비딘 (SA-PE)과 함께 인큐베이션시켜 펩티드 사량체를 형성하였다. 사량체를 세포주 혼합물과 함께 20분 동안 실온에서 인큐베이션하고 세포를 FACS CAlibur 흐름 세포계수기를 통해 진행시켰다 (Becton Dickinson). 사량체에 포지티브인 세포를 도 14의 R1에 표사된 대로 게이팅시켰다. 개별적인 혼합되지 않은 세포주를 또한 측정하였다 (도 14A 및 B).
항-RhD 항체 생성 세포주에 대해 나타난 특징은 세포주내에서 항체 발현 및 비항체 발현 세포 둘 모두의 존재이다. 혼합물에서 PEP202 포지티브 세포의 공유를 측정하기 위해, 본 발명자들은 RhD162 및 RhD202의 혼합물에서 세포 발현의 공유가 RhD202 단독에서와 동일하다고 가정하였다. 이것은 Pep202 및 항-IgG 항체를 지니는 세포를 이중염색함으로써 평가될 수 있었다 (수행되지 않음). 그러나, 이 결과는 상기 가정이 맞았음을 나타내었다. 혼합물에서 PEP202 사량체에 의해 결합된 RhD202 세포의 백분율을 도 14에 도시된 대로 게이트 6 (R6)에서 세포의 백분율로부터 계산하였다.
혼합물 a)에서 RhD202 세포주의 백분율을 혼합물 a에 대한 측정치로 예시된 하기 방정식에 따라 계산하였다.
Figure 112007014974017-PCT00017
표 16
혼합물 실제 RhD202% 측정 RhD202%
a 50 45
b 83 79
c 96 87
d 17 15
실시예 11
본 실시예는 폴리클로날 세포 배양액내에서 개별적인 클론의 분포를 측정하기 위한 실시간 PCR의 이용 및 상기 클론의 파수 선택을 설명한다.
본 기술은 개별적인 항체 엔코딩 핵산 서열간의 서열 차이에 기초한다. 개별적인 항체 엔코딩 서열의 변화에 따라서, 독특한 TaqMan 프로브를 폴리클로날 세포주에 표시된 각 멤버에 대한 중쇄 및/또는 경쇄에 대하여 설계할 수 있다. 바람직하게는, CDR 영역, CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 하나를 TaqMan 프로브를 설계하기 위해 선택한다. 가장 바람직하게는, CDR3 영역을 TaqMan 프로브를 설계하기 위해 선택한다.
올리고누클레오티드 설계
프라이머를 바람직하게느 설계하여 70 내지 150개의 누클레오티드를 수득한다. 몇몇 가능한 프라이머 설계로는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역의 FR3 영역에서 일치 전향 프라이머 어닐링, 및 불변 영역에서 역향 프라이머 어닐링이 있다. 샘플의 개별적인 멤버간에 상이한 CDR 영역의 일부, 바람직하게는 CDR3 영역에 특이적인 TaqMan 프로브를 관심있는 각 클론에 대해 설계한다.
하기 8개의 항-RhD 항체를 발현시키는 폴리클로날 세포주의 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 가능한 세트를 하기에 나타낸 대로 설계할 수 있다.
모든 클론에 대한 전향 및 역향 프라이머:
Fw 프라이머: CAC GGC TGA GTA TTA CTG TGC (서열번호 24)
Rw 프라이머: TTG GTG GAG CCA CTC GA (서열번호 25)
모든 개별적인 클론에 대한 TaqMan 프로브를 표 17에 도시한다.
표 17
Figure 112007014974017-PCT00018
중쇄 엔코딩 서열에 대한 대안적인 프라이머 고안은 VH-DH 이음부에서 전향 프라이머 어닐링 및 불변 영역에서 역향 프라이머, 및 문헌[Rasmussen, T. et al. 2000. Exp. Hematol. 28, 1039-1045]에 개시된 JH-C 이음부에서 TaqMan 프로브를 구성한다.
실시간 정량적 PCR
mRNA 또는 게놈 DNA를 펠릿화된 세포로부터 추출한다. mRNA를 주형으로서 이용하는 경우, 이것을 역전사시켜 cDNA를 생성하고 실시간 PCR 처리한다. 분석되는 클론의 수에 상응하는 다수의 실시간 PCR 반응을 적용한다.
실시간 검정은 프라이머 농도 및 TaqMan 프로브 농도와 관련하여 최적화된다. 광학 점착성 커버로 밀봉된 96 웰 플레이트에서 반응을 3중으로 수행하였다. PCR 반응을 시판되는 PCR 마스터믹스에서 수행하고 ABI 프리즘 7000 SDS 소프트웨어를 이용하여 후속적인 분석을 ABI 프리즘 7000 (Applied Biosystems)에서 수행하였다.
다양성의 분석
상이한 클론의 CT 값을 서로 비교하고, 폴리클로날 세포주에서 각 클론의 분포를 계산한다. 이 방법을 배치-투-배치 변화 뿐만 아니라 개별적인 생성을 진행하는 동안 경시적인 클론 안정성을 평가하는데 이용하였다.
실시예 12
본 실시예는 폴리클로날 세포주로부터 유래된 단일-세포 클론으로부터의 중쇄 및/또는 경쇄 항체 유전자의 가변 영역의 DNA 서열화에 의해 재조합 폴리클로날 항체를 생성할 수 있는 폴리클로날 세포주 (예컨대, pWCB)의 폴리클로날 특성을 평가하고 입증하는 방법을 설명한다.
단일-세포 클로닝
pCB의 앰플을 해동시키고 수 일 동안 완전 배지에서 배양하여 양호한 세포 생존력을 재구성한다. 후속하여, 단일-세포 클론을 제한 희석에 의해 수득하고, 여기서 세포를 완전 배양 배지에 1개 세포/웰의 밀도로 96-웰 세포 배양 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 10-20일 동안 인큐베이션하고, 플레이트에서 현미경하에 시각적으로 단일 콜로니를 지니는 웰을 기록하였다.
대안적으로, pWCB로부터의 단일-세포 클론을 FACS 세포 분류기를 이용하여 수득한다. 생존력이 있는 pWCB 세포를 게이팅하고 1개 세포/웰에서 100 ㎕의 조건화된 완전 배지로 미리 채워진 96-웰 플레이트로 분류하였다. 세포를 인큐베이션하고, 상기 기술된 대로 단일 콜로니를 기록하였다.
핵산 서열화
웰 중 단일 세포 콜로니가 성장하여 융합될 때, 각각의 요망되는 수의 웰 (예컨대 100)로부터의 부분표본 (10-20 ㎕)을 새로운 96-웰 플레이트로 옮겨서 DNA 서열화 반응에 주형으로서 이용한다. 서열화를 mRNA 레벨 또는 게놈 레벨에서 각각 1 내지 100개 또는 1 내지 1000개 세포를 이용하여 수행한다. 첫번째 경우에, pWCB에 존재하는 상이한 항체 중쇄 및 경쇄를 구분하기에 충분한 가변 영역(통상적으로 적어도 CDR3 영역)을 포함하는 PCR 단편을, 예컨대 제조자의 지시에 따라서 시판되는 Qiagen one-step RT-PCR 키트를 이용하여, 표준 RT-PCR 기술에 의해 생성한다. 세포를 PCR 반응 이전에 용해시킨다. 생성된 PCR 단편을, 예컨대 Qiagen Qiaquick Gel Extraction 키트를 이용하여 겔-정제시키고, 표준 DNA 서열화 반응에서 주형으로서 이용하며, ABI 프리즘™ 3100 유전자 분석기 (Applied Biosystems)와 같은 자동화된 DNA 서열화 기계상에서 분석한다. 대안적으로, 역전사 단계를 건너뛰는 것을 제외하고 DNA 서열화를 상기 기술된 대로 게놈 DNA상에서 수행한다.
항-RhD 재조합 폴리클로날 항체의 특성화를 위해, 하기 프라이머를 사용한다:
VH 증폭에 대한 PCR 프라이머:
RhD#001: 5' TCTCTTCCGCATCGCTGTCT (서열번호 34)
RhD#007: 5' AGGAAAGGACAGTGGGAGTGGCAC (서열번호 35)
VL 증폭에 대한 PCR 프라이머:
RhD#005: 5' CGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTG (서열번호 36)
RhD#008: 5' AAGACCGATGGGCCCTTGGTGGA (서열번호 37)
서열화 프라이머는 다음과 같다:
VH: 5' AACGGGTTTGCCGCCAGAACA (서열번호 38)
VL: 5' CCGAGGGACCTGAGCGAGT (서열번호 39)
항-유전형 펩티드를 이용한 단일 세포상의 ELISA
핵산 서열화에 보충하여, 폴리클로날 작업 세포 뱅크와 같은 항체 생성 세포 혼합물의 클론 조성을 항-유전형 펩티드 ELISA를 이용하여 평가할 수 있다.
분류된 단일 세포를 약 14일 동안 배양하여, 단일 클론으로부터 동질유전자 세포 배양액을 생성한다. 이들 배양액으로부터의 상청액을 실시예 7에 기술된 ELISA 검정에서 항-유전형 펩티드를 이용하여 특이적 항-RhD 항체의 존재에 대해 분석할 수 있다. 이것은 특정 개별적인 멤버를 생성하는 클론의 수와 관련된 정보를 제공할 것이다. 개별적인 멤버의 양을 항체 생성 세포의 총 양과 비교하는 경우 (예컨대, 모든 동질유전자 세포 배양액상에서 IgG를 측정함에 의해), 폴리클로날 세포 배양액에서 개별적인 항-RhD 항체를 생성하는 세포의 분획에 대한 정량적인 측정치를 수득할 수 있다.
실시예 13
본 실시예는 재조합 폴리클로날 항체의 다운스트림 가공(DSP) 동안 클론 다양성을 판단하는 양이온-교환 크로마토그래피 분석의 용도를 입증한다.
다운스트림 가공
25개의 개별적인 멤버를 함유하는 진행되는 발생적인 생체반응기로부터의 항-RhD rpAb 샘플을 하기 DSP 단계를 이용하여 정제하였다:
1. MABSelect 컬럼을 이용한 항체의 포획
2. pH 3에서 바이러스 불활성화
3. 세파덱스 G-25 컬럼을 이용한 완충액 교환
4. DEAE-세파로스 컬럼을 이용한 음이온-교환 크로마토그래피
5. Planova 15 N 필터를 이용한 바이러스 여과, 및
6. MEP 하이퍼셀 컬럼을 이용한 소수성 전하 유도 크로마토그래피
7. 밀리포어 바이오맥스 필터를 이용한 초 여과/투석여과.
개별적인 DSP 단계 후 클론 다양성의 분석
재조합 폴리클로날 항체 조성물의 DSP 동안 클론 다양성을 분석하는데 양이온-교환 크로마토그래피를 이용하였다. 항-RhD rpAb의 DSP 동안 단계 1, 3, 4 및 6 이후에 취해진 샘플을 25 mM 나트륨 아세테이트, 150 mM 염화나트륨, pH 5.0에서 60 ml h-1의 유속으로 실온에서 작업된 PolyCatA 컬럼 (4.6 x 100 mm)상에 적용시켰다. 항체 성분을 후속하여 25 mM 나트륨 아세테이트, pH 5.0에서 60 ml h-1의 유속으로 150 내지 500 mM의 염화나트륨의 선형 구배를 이용하여 용리시켰다. 항체 성분을 280 nm에서 스펙트로포토메트리에 의해 검출하고, 크로마토그램을 비교하여 (도 15) DSP 동안 클론 다양성의 잠재적인 손실을 검출하였다. 본 실시예에서 클론 다양ㅇ성이 재조합 폴리클로날 항체의 DSP 동안 본질적으로 변화되지 않음이 양이온-교환 크로마토그래피를 이용하여 입증되었다.
실시예 14
RhD에 대한 40개 이상의 항체의 IEX 분석은 실질적인 다수의 개별적인 항체가 도 16B에 도시된 "3 피크 패턴"을 나타내었음을 보이고 있다. 카르복시펩티다제 B 처리 뿐만 아니라 탄수화물 분석은 이러한 전하 이질성이 C-말단 라이신 클립핑 또는 시알산의 존재에 의해 야기되지 않았음을 나타내었다 (데이터를 도시하지 않음).
본 실시예는 전하 이질성이 PyroGlu 형성에 기인한 것이며, 부위-유도된 돌연변이유발이 동형 IEX 패턴을 수득하는데 어떻게 사용될 수 있는지를 입증한다.
항체의 발현 및 정제
특이적 부위로부터의 별개의 재조합 항-레수스 D 모노클로날 항체를 이들의 게놈상에 각각 발현시키는 안정한 세포주 (2004년 7월 20일 출원된 덴마크 특허출원 PA 2004 01133호에 기술된 대로 수득됨)를 -150℃에서 통상적인 동결 공정을 이용하여 확장되고 뱅킹된(banked), 1:250으로 희석된 4 mM L-글루타민 (Invitrogen) 및 항-클럼핑제 (Invitrogen)가 보충된 무혈청 Excell 302 배지 (JRH Biosciences, Andover, UK)에서 현탁 배양액에 적용시켰다.
상청액을 세포 배양액으로부터 회수한 후 뱅킹시키고, 상청액을 실시예 1에 기술된 대로 필수적인 친화성 크로마토그래피 (단백질 A)를 이용한 항-RhD 모노클로날 항체의 정제 이전에 여과시켰다.
강력한 양이온-교환 크로마토그래피
이전 단계에서 정제된 모노클로날 항체를 실시예 1에 기술된 대로 본질적인 강력한 IEX 크로마토그래피로 처리하였다. 표 18의 IEX 컬럼은 선택된 항체의 IEX 프로파일에 존재하는 피크의 수를 요약하며, 상기 IEX 프로파일을 또한 도 16에 제시한다.
N-말단 서열 분석
2개의 선택된 항체 (RhD198 및 RhD307)의 IEX 분석으로부터 분리된 피크의 N-말단 서열 분석을 제조자가 기술한 작업 조건하에 Procise 494 서열화기를 이용한 Edman 서열화 (Applied Biosystems, CA)에 의해 용액에서 수행하였다. 서열 분석은 전하 이질성이 HC의 N-말단 Gln의 부분적인 고리화로 인한 것임을 입증하였다 (참조 표 18). 따라서, 제1 피크는 완전히 차단된 HC의 N-말단을 지니는 항체를 함유하였고 (HC의 N-말단은 0 전하를 지님); 제2 피크는 HC의 하나의 N-말단이 차단된 항체에 상응하며 (HC의 N-말단은 +1 전하를 지님), 제3 피크는 대개 HC의 N-말단 Gln이 개질되지 않은 항체를 나타낼 것이다 (HC의 N-말단은 2+ 전하를 지님). PyroGlu에 대한 N-말단 글루타민 잔기의 고리화는 이것이 Edman 서열화에 반응하지 않도록 한다.
유사하게 그러한 "3 피크 패턴" 또는 "1 피크 패턴"을 나타내는 다수의 다른 항-RhD 항체를 PVDF 막상에서 일렉트로-블롯팅되는 SAS page로 처리하여 n-말단 서열 분석에 의해 분석하였다. 상기 블롯상의 HC 및 LC 밴드를 Edman 서열화로 처리하였다.
HC에서 N-말단 Gln을 제공하는 소수의 항체 (RhD162, RhD240)가 이들의 IEX 프로파일에 따라서 ("1 피크 패턴") 완전히 차단된 것으로 나타난 한편, "3 피크 패턴"을 지니는 항체 (RhD196, RhD305 및 RhD306)는 예상대로 부분적으로 차단된 것이 발견되었다 (표 18 참조). 이러한 해석은 서열 생성 뿐만 아니라 IEX 프로파일에서 상이한 전하 변화 (0, +1 및 2+)의 상대적인 백분율에 기초한다.
표 18
Figure 112007014974017-PCT00019
a예상되는 N-말단 서열 및 수득된 N-말단 서열을 각각 일반체 및 굵은체로 나타낸다. b블롯으로부터 수득된 데이터. cIEX 분석으로부터 분리된 분획 (피크 1&2)으로부터 수득된 데이터. dPyroGlu에 대한 N-말단 글루타민 잔기의 고리화는 이것이 Edman 서열화에 반응하지 않도록 한다. n.d.: 측정되지 않음.
부위-유도된 돌연변이유발
부위-유도된 돌연변이유발을 이용하여 N-말단 Gln을 Glu로 변경시킴으로써 선택된 항체로부터 전하 이질성을 제거하였다. 중쇄에서 N-말단 Gln 및 LC 사슬에서 N-말단 Glu 잔기를 지니는 전장 항체를 엔코딩하는 발현 플라스미드 RhD189를 이용하였다. 상기 플라스미드의 VH 영역을 시그날 펩티드 코딩 영역의 3' 말단의 AscI 부위 및 J-영역의 침묵(silent) XhoI 부위에 의해 플랭킹한다.
하기 프라이머를 이용하여 돌연변이유발을 수행하였다:
RhD189 전향: TGGGCGCGCC GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG (서열번호 44)
RhD189 역향: GGAGGCGCTCGAGACGGTGACCGTGGTCCC (서열번호 45)
전향 프라이머에서 AscI 부위 및 전향 프라이머에서 XhoI 부위를 밑줄로 표시하고, VH 영역의 N-말단의 Glu 코돈 (GAG)을 굵게 나타내었다. RhD189 플라스미드를 상기 언급된 프라이머와 함께 PCR 반응에서 주형으로서 사용하였다. PCR 반응을 25 싸이클 동안 Phusion DNA 폴리머라제 (Finnzymes, Finland)로 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 약 400 bp의 VH 밴드를 1% 아가로스 겔 상에서 정제하고, BioTaq DNA 폴리머라제와 함께 인큐베이션하고, 아가로스 겔 상에서 재정제하고, 제조자의 지시에 따라 pCR2.1TOPO 벡터(Invitrogen, CA)로 클로닝시켰다. VH 삽입물을 함유하는 클론을 서열화에 입증하였다. 원래 VH 단편을 AscI 및 XhoI로 플라스미드 RhD189로부터 잘라내고 pCR2.1TOPO 플라스미드로부터의 돌연변이된 단편을 대신 삽입하였다. 무-내독소 플라스미드 미디프렙 (Macherey-Nagel, Germany)을 클로닝으로부터의 포지티브 콜로니로부터 제조하고, 서열화하여 올바른 단편의 존재를 입증하였다.
항체를 SDS-PAGE 분석으로 처리하고, 일렉트로블롯팅하고, HC 밴드를 N-말단 서열화하여 Gln이 Glu로 교체되었음을 입증하였다 (데이터는 도시하지 않음).
"3 피크" IEX 프로파일을 나타내는 항체 RhD189의 HC의 N-말단 Gln을 Glu로 교체시켜 단 하나의 피크를 지니는 현저히 상이한 프로파일을 초래하였다 (도 17). 따라서, 전하 이질성은 N-말단 Gln 잔기를 Glu 잔기로 변경함에 의해 성공적으로 제거되었다.
결합 검정
N-말단 돌연변이가 항체의 작용기에 영향을 미치는지를 판단하기 위해, 원시 항체 RhD189 뿐만 아니라 이의 돌연변이된 Glu 대응물 RhD189E를 RhD-포지티브 적혈구에 대한 결합으로 검정하였다.
적혈구를 Blood Bank, Aalborg Hospital, DK에서 동의를 얻은 건강한 공여체로부터 수득된 전혈로부터 제조하고, 혈액을 1% 소혈청 알부민 (BSA, Sigma-Aldrich, Germany)을 함유하는 PBS (Gibco, Invitrogen, United Kingdom)에서 3회 세척하였다. 적혈구를 재현탁시키고, 4℃에서 ID-Cellstab (DiaMed, Switzerland) 중 10% 용액으로서 저장하였다.
항체의 결합 용량을 PBS, 1% BSA에서 5 x 104 세포/㎕의 RhD-포지티브 적혈구를 이용하여 측정하였다. 항체를 96 웰 플레이트에서 PBS, 1% BSA에서 3중으로 희석시켰다 (Becton Dickinson Labware, NJ, USA). 50 ㎕의 항체 용액을 50 ㎕의 적혈구와 혼합하고 37℃에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBS, 1% BSA에서 2회 세척하였다 (300 g, 2분). PBS, 1% BSA에서 1:20으로 희석된 80 ㎕의 피코에리트린-컨쥬게이션된 염소 항-사람 IgG (Beckman Coulter, CA, USA)를 각 샘플에 첨가하고 4℃에서 30분 동안 방치하였다. 샘플을 PBS, 1% BSA 및 FacsFlow (Becton Dickinson, Belgium)(300 g, 2분)에서 세척하고, 200 ㎕의 FACSFlow에 재 현탁시켰다. 샘플을 FACSCalibur (Becton Dickinson, CA, USA)상에서 진행시키고, CellQuest Pro 및 Excel을 이용하여 데이터 분석을 수행하였다.
도 18에 도시된 대로, RhD-포지티브 적혈구에 대한 결합 용량에서 Glu 변이 및 이의 원시 대응물간에 현저한 차이는 관찰되지 않았다.
요약
다수의 항-RhD 항체의 IEX 프로파일에서 관찰된 이질성은 상기 항체에서 N-말단 Gln 잔기의 부분적인 고리화에 기인한 것이다. 항-RhD 항체에서 HC의 N-말단 Gln을 Glu 잔기로 교환하는 것이 아마도 RhD-포지티브 적혈구에 대한 결합 효능에 영향을 미치지 않으며 고유의 N-말단 전하 이질성을 제거한다.
SEQUENCE LISTING <110> Symphogen A/S <120> A PROCEDURE FOR STRUCTURAL CHARACTERIZATION OF A RECOMBINANT POLYCLONAL PROTEIN OR A POLYCLONAL CELL LINE <130> 16270PCT00 <160> 45 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Aritficial <223> Primer sequence <400> 1 tctcttccgc atcgctgtct 20 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Aritficial <223> Primer sequence <400> 2 aggaaaggac agtgggagtg gcac 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Aritficial <223> Primer sequence <400> 3 cgtagctctt ttaagaggtg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Aritficial <223> Primer sequence <400> 4 accgatgggc ccttggtgga 20 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 5 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 7 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 9 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 10 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro 1 5 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Aritficial <223> synthetic peptide <400> 11 Ala Cys Met Gly Tyr Gly Pro Arg Met Cys Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Aritficial <223> synthetic peptide <400> 12 Ala Cys Pro Gly Asp Gly Pro Arg Met Cys Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Aritficial <223> synthetic peptide <400> 13 Cys Met Gly Tyr Gly Pro Arg Met Cys 1 5 <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Aritficial <223> synthetic peptide <400> 14 Ala Cys Met Pro Arg Asn Pro Leu Glu Cys Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> Aritficial <223> synthetic peptide <400> 15 Ala Cys Ala Pro Arg Asn Pro Tyr Glu Cys Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> Aritficial <223> synthetic peptide <400> 16 Ala Cys Pro Arg Asn Pro Phe Glu Met Cys Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> Aritficial <223> synthetic peptide <400> 17 Ala Cys Tyr Pro Arg His Pro Leu Asp Cys Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Aritficial <223> synthetic peptide <400> 18 Cys Ala Pro Arg Asn Pro Tyr Glu Cys 1 5 <210> 19 <211> 13 <212> PRT <213> Aritficial <223> synthetic peptide <400> 19 Ala Cys Thr Thr Leu Leu His Phe Leu Cys Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Aritficial <223> synthetic peptide <400> 20 Ala Cys Thr Thr Leu Leu Ser Phe Leu Cys Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 21 <211> 13 <212> PRT <213> Aritficial <223> synthetic peptide <400> 21 Ala Gly Thr Ser Leu Leu Ala Phe Leu Cys Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> Aritficial <223> synthetic peptide <400> 22 Ala Cys Asn Leu Leu Leu Gln Phe Leu Cys Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Aritficial <223> synthetic peptide <400> 23 Cys Thr Thr Leu Leu His Phe Leu Cys 1 5 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Aritficial <223> Primer sequence <400> 24 cacggctgag tattactgtg c 21 <210> 25 <211> 17 <212> DNA <213> Aritficial <223> Primer sequence <400> 25 ttggtggagc cactcga 17 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Aritficial <223> Primer sequence <400> 26 agaaatttgt tcggtgacta cgatcttaag tcc 33 <210> 27 <211> 28 <212> DNA <213> Aritficial <223> Primer sequence <400> 27 agagaattga gcacgcaacg tggataca 28 <210> 28 <211> 34 <212> DNA <213> Aritficial <223> Primer sequence <400> 28 agagagagta ctctatatag cagcagctgg taca 34 <210> 29 <211> 29 <212> DNA <213> Aritficial <223> Primer sequence <400> 29 gatggtctcc tatagcagca gctggtacc 29 <210> 30 <211> 29 <212> DNA <213> Aritficial <223> Primer sequence <400> 30 gagagactct gttcggggag tcagtagat 29 <210> 31 <211> 29 <212> DNA <213> Aritficial <223> Primer sequence <400> 31 gggtactctg tatagcagca gctggtaca 29 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Aritficial <223> Primer sequence <400> 32 agagacctac aagggtatag aagcagctgg tac 33 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Aritficial <223> Primer sequence <400> 33 ccgacgattt ttggagtggg cc 22 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Aritficial <223> Primer sequence <400> 34 tctcttccgc atcgctgtct 20 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Aritficial <223> Primer sequence <400> 35 aggaaaggac agtgggagtg gcac 24 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Aritficial <223> Primer sequence <400> 36 cgttcttttt cgcaacgggt ttg 23 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Aritficial <223> Primer sequence <400> 37 aagaccgatg ggcccttggt gga 23 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Aritficial <223> Primer sequence <400> 38 aacgggtttg ccgccagaac a 21 <210> 39 <211> 19 <212> DNA <213> Aritficial <223> Primer sequence <400> 39 ccgagggacc tgagcgagt 19 <210> 40 <211> 5 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 40 Gln Val Gln Leu Val 1 5 <210> 41 <211> 5 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 41 Gln Leu Gln Leu Gln 1 5 <210> 42 <211> 5 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 42 Asp Ile Gln Leu Thr 1 5 <210> 43 <211> 5 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 43 Asp Ile Gln Met Thr 1 5 <210> 44 <211> 33 <212> DNA <213> Aritficial <223> Primer sequence <400> 44 tgggcgcgcc gaggtgcagc tggtggagtc tgg 33 <210> 45 <211> 30 <212> DNA <213> Aritficial <223> Primer sequence <400> 45 ggaggcgctc gagacggtga ccgtggtccc 30

Claims (28)

  1. 상이한 가변 영역을 지니는 상이한 동형 단백질 또는 상기 단백질을 생성하는 세포를 포함하는 샘플을 특성화하는 방법으로서, 상기 단백질 또는 이들의 엔코딩 서열의 개별적인 멤버의 상대적인 비율 또는 존재와 관련된 정보를 수득하며, 상기 방법이 하나 이상의 단백질 특성화 기술 및/또는 단백질-엔코딩 서열의 하나 이상의 유전자 분석에 의해 상기 샘플의 부분표본을 분석하는 것을 포함하는, 상이한 가변 영역을 지니는 상이한 동형 단백질 또는 상기 단백질을 생성하는 세포를 포함하는 샘플을 특성화하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 유전자 분석이 RFLP, T-RFLP, 마이크로어레이 분석, 정량적 PCR 및 핵산 서열화로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 샘플이 배양액 중 세포를 포함하는 세포 배양 분획임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 단백질 특성화 기술이 i) 물리-화학적 특성에 따라 단백질을 분리시키는 크로마토그래피 분석, ii) 동형 단백질의 단백질분해 소화물의 분석, iii) "벌크" N-말단 서열화 및 iv) 동형 단백질에 대한 특이적 검출 분자를 이용한 분석으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법
  5. 제 4항에 있어서, 크로마토그래피 분석이 크기 보다는 또 다른 물리-화학적 특성에 기초함을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 4항에 있어서, 개별적인 크로마토그래피 분석이 i) 순전하, ii) 소수성, iii) 등전자점, 및 iv) 친화성으로부터 선택된 물리-화학적 특성에 기초함을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 4항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피 분석이 다차원적 크로마토그래피로서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 4항에 있어서, 동형 단백질의 단백질분해 소화물의 분석을 수행하여 N-말단 마커 펩티드 또는 특징적인 아미노산 측쇄 작용기를 지니는 펩티드를 분리함을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 4항에 있어서, 특이적 검출 분자가 항-유전형 펩티드 또는 항-유전형 항체임을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 항-유전형 펩티드 또는 항-유전형 항체가 폴리클로날 세포주에서 개별적인 단백질 생성 세포를 결정하는데 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1항 또는 제 4항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 세포 배양 상청액으로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 특성화가 상기 샘플에 존재하는 하나 이상의 파수(sentinel) 단백질 또는 파수 핵산 서열의 분석에 기초함을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플을 분석하는데 둘 이상의 분석 기술이 적용됨을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 하나의 분석 기술이 제 4항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 정의된 단백질 특성화 기술이고, 또 다른 분석 기술이 제 2항에 정의된 유전자 분석임을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플을 배양 동안의 상이한 시점에 단일 폴리클로날 세포 배양액으로부터 수득하고, 개별적인 동형 단백질 및/또는 엔코딩 서열의 상대적인 비율을 비교함을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플을 특정 시점에 상이한 폴리클로날 세포 배양액으로부터 수득하고, 개별적인 동형 단백질 및/또는 엔코딩 서열의 상대적인 비율을 비교함을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 가변 영역을 지니는 상이한 동형 단백질이 재조합 단백질임을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 재조합 단백질이 재조합 폴리클로날 단백질을 구성함을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 가변 영역을 지니는 상이한 동형 단백질이 상이한 CDR 영역을 지니는 항체임을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 가변 영역을 지니는 상이한 동형 단백질이 상이한 CDR 영역을 지니는 T 세포 수용체임을 특징으로 하는 방법.
  21. 폴리클로날 세포주에서 개별적인 단백질 생성 세포를 분리 및/또는 결정하기 위한 항-유전형 펩티드 또는 항-유전형 항체의 용도.
  22. 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체의 혼합물로부터 이들의 다양성과 관 련하여 개별적인 항체 분자를 분리하는데 있어서 다차원적 크로마토그래피의 용도.
  23. 폴리클로날 T 세포 수용체 또는 모노클로날 T 세포 수용체의 혼합물로부터 이들의 다양성과 관련하여 개별적인 T 세포 수용체 분자를 분리하는데 있어서 다차원적 크로마토그래피의 용도.
  24. N-말단 글루타민 잔기를 또 다른 아미노산으로 변경하는 것을 포함하여, 재조합 단백질에서 N-말단 글루타민 잔기의 고리화에 의해 야기된 N-말단 전하 이질성을 제거하는 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 변경이 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열의 부위-유도된 돌연변이유발에 의해 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 24항 또는 제 25항에 있어서, 상기 변경이 폴리클로날 단백질의 하나 이상의 개별적인 멤버상에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 24항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 항체 또는 T 세포 수용체임을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 1항 또는 이의 종속항들에 있어서, 순전하에 기초한 크로마토그래피 분석 을 적용하며, 이 때 N-말단 글루타민 잔기의 고리화에 의해 야기된 전하 이질성을 나타내는 단백질을 제 24항 내지 제 27항 중 어느 한 항의 방법에 따라 처리함을 특징으로 하는 방법.
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