TW201348257A - 抗ｒｏｂｏ４抗體 - Google Patents

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Abstract

[欲解決之問題]本發明係關於具有抗血管生成活性之抗體。更具體而言，本發明係關於針對ROBO4之抗體及含有該抗體之醫藥組合物。本發明之一個目標係提供具有抗血管生成效應之抗ROBO4抗體、包含該抗體之醫藥組合物或諸如此類、使用該抗體阻抑血管生成之方法等。本發明之另一目標係提供產生該抗體之方法。[解決方案]本發明抗體活化ROBO4之下游信號且具有針對VEGF或bFGF所誘導細胞移行之阻抑活性。本發明抗體在活體內模型中亦展現抗血管生成效應。因此，該問題已解決。

Description

抗ROBO4抗體
本發明係關於具有抗血管生成活性之抗體。更具體而言，本發明係關於針對ROBO4之抗體及含有該抗體之醫藥組合物。
回旋基因同源物(roundabout homolog)4(ROBO4)係分子量為110kDa之蛋白質，其具有單次跨膜結構(非專利文獻1)且已知其可經由結合已知血管生成阻抑劑分裂基因同源物(Slit homolog 2)(Slit 2)來阻抑血管生成(專利文獻1及非專利文獻2)。已報導Slit 2可阻抑藉由血管內皮生長因子(VEGF)促進之HUVEC移行，且亦已報導，對於經ROBO4基因轉染之血管內皮細胞(下文中，血管內皮細胞亦稱作「EC」)，與經空載體轉染之EC相比，Slit 2可阻抑VEGF或bFGF對細胞移行之促進(專利文獻1及非專利文獻2至4)。
此外，已報導，在衍生自野生型小鼠之EC或經對照siRNA轉染之EC中觀察到Slit 2對藉由VEGF促進細胞移行、促進管腔形成或提高滲透性之阻抑效應，但在衍生自剔除ROBO4基因之小鼠之EC或經siRNA轉染以敲低ROBO4基因之EC中未觀察到此效應(專利文獻2及非專利文獻4至6)。此外，已報導，在患有雷射誘導之脈絡膜新血管生成或氧誘導之視網膜病變之小鼠模型中，Slit 2經由ROBO4阻抑血管生成或血管滲透性之提高，該等模型係患有滲出性年齡相關性黃斑點退化或糖尿病性視網膜病變之動物疾病模型(專利文獻2及非專利文獻 4)。
儘管有該等發現，但亦有報導顯示ROBO4不與Slit 2結合(非專利文獻9及專利文獻5)。關於其功能亦有報導，ROBO4參與促進血管生成而非阻抑血管生成，此乃因剔除ROBO4基因之EC之移行或管腔形成受抑制(非專利文獻10及11)。
在臨床實踐中，已報導ROBO4可在肝轉移之瘤內血管中大量表現來自結腸癌、神經節神經膠質瘤、膀胱癌、乳癌、轉移性黑色素瘤、腎癌、肺癌、肝癌或結腸癌(專利文獻3及非專利文獻1、3及7)。此外，已報導ROBO4亦在增生性糖尿病性視網膜病變患者之纖維血管膜之血管中表現(非專利文獻8)。因此，ROBO4在血管內皮細胞、尤其在病理性病況中新形成之血管中之內皮細胞中表現。此可表明病理性血管生成係由ROBO4之大量表現所致，但亦可表明ROBO4之補償性表現可用於阻抑病理性血管生成。
如上所述，ROBO4參與抗血管生成效應。因此，推測針對ROBO4之抗體及其功能性片段可用於治療涉及血管生成之疾病。然而，不確定針對ROBO4之激動性或拮抗性抗體會阻抑抑或促進血管生成。
已知闡述於歐洲專利第1,565,491號(專利文獻4)及WO2008/100805(專利文獻5)中之抗體可作為針對ROBO4之抗體(下文中，稱作「抗ROBO4抗體」)。但該等抗體皆在活體內顯示對血管生成之阻抑或抑制效應。
[引用列表] [專利文獻]
[專利文獻1] WO2004/003163
[專利文獻2] WO2008/073441
[專利文獻3] WO2002/036771
[專利文獻4] 歐洲專利第1,565,491號
[專利文獻5] WO2008/100805
[非專利文獻]
[非專利文獻1] Genomics, 2002，第79卷，第547-552頁
[非專利文獻2] Developmental Biology, 2003，第261卷，第251-267頁
[非專利文獻3] Biochemical and Biophysical Research Communications, 2005，第332卷，第533-541頁
[非專利文獻4] Nature Medicine, 2008，第14期，第448-453頁
[非專利文獻5] Science Translational Medicine, 2010，第2卷，第23ra19頁
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[非專利文獻8] Molecular Vision, 2009，第15卷，第1057-1069頁
[非專利文獻9] The FASEB Journal, 2005，第19卷，第121-123頁
[非專利文獻10] BMC Cell Biology, 2008，第9卷，第61-72頁
[非專利文獻11] The FASEB Journal, 2009，第23卷，第513-522頁
本發明之一個目標係提供針對ROBO4之抗體。
本發明之另一目標係提供含有具有抗血管生成效應之抗ROBO4抗體等之醫藥組合物。
本發明之另一目標係提供產生抗體之方法。
本發明之另一目標係提供使用抗體等阻抑血管生成之方法。
本發明者已實施大量研究以達成該等目標，且因此成功構築檢測ROBO4下游信號之活化之篩選系統。此外，本發明者已使用該篩選系統成功獲得新穎抗ROBO4單株抗體，該抗體活化ROBO4之下游信號，具有在表現ROBO4之EC中抵抗由不同血管生成因子(例如VEGF、bFGF、HGF、PDGF-BB及SDF-1)誘導之細胞移行之阻抑活性，且甚至在活體內模型中展現抗血管生成效應。以此方式，已完成本發明。
具體而言，本發明係關於：(1)具有以下(I)至(III)中所述性質之抗體或其功能性片段：(I)以較佳1×10-8或更低、尤佳5×10-9或更低之KD值結合至ROBO4蛋白質；(II)在活體外在不存在交聯抗體時阻抑或抑制血管內皮細胞移行；及(III)在活體內阻抑或抑制血管生成；(2)如(1)之抗體或其功能性片段，其中該ROBO4蛋白質係人類ROBO4蛋白質；(3)如(1)之抗體或其功能性片段，其中該ROBO4蛋白質係由SEQ ID NO：2之第1至1007號胺基酸之胺基酸序列組成之蛋白質；(4)如(1)之抗體或其功能性片段，其中該ROBO4蛋白質係由SEQ ID NO：2之第46至1007號胺基酸之胺基酸序列組成之蛋白質；(5)如(3)或(4)之抗體或其功能性片段，其中該抗體或其功能性片段結合至由SEQ ID NO：2之第132至209號胺基酸之胺基酸序列組成之位點；(6)如(1)之抗體或其功能性片段，其中該抗體或其功能性片段係單株抗體或其功能性片段；(7)如(1)至(6)中任一項之抗體或其功能性片段，其中該抗體係 由重鏈與輕鏈組成，該重鏈包含：由示於SEQ ID NO：44(圖25)之胺基酸序列組成之CDRH1、由示於SEQ ID NO：46(圖26)之胺基酸序列或由一個胺基酸取代SEQ ID NO：46之胺基酸序列後所衍生之胺基酸序列組成之CDRH2以及由示於SEQ ID NO：48(圖27)之胺基酸序列組成之CDRH3；且該輕鏈包含：由示於SEQ ID NO：50(圖28)之胺基酸序列或由一至三個胺基酸取代SEQ ID NO：50之胺基酸序列後所衍生之胺基酸序列組成之CDRL1、由示於SEQ ID NO：52(圖29)之胺基酸序列組成之CDRL2以及由示於SEQ ID NO：54(圖30)之胺基酸序列組成之CDRL3；(8)如(1)至(7)中任一項之抗體或其功能性片段，其中該抗體係由與輕鏈組成，該重鏈包含：由示於SEQ ID NO：44(圖25)之胺基酸序列組成之CDRH1、由示於SEQ ID NO：46(圖26)之胺基酸序列或示於SEQ ID NO：68(圖44)之胺基酸序列組成之CDRH2以及由示於SEQ ID NO：48(圖27)之胺基酸序列組成之CDRH3；且該輕鏈包含：由示於SEQ ID NO：50(圖28)之胺基酸序列或示於SEQ ID NO：70(圖46)之胺基酸序列組成之CDRL1、由示於SEQ ID NO：52(圖29)之胺基酸序列組成之CDRL2以及由示於SEQ ID NO：54(圖30)之胺基酸序列組成之CDRL3；(9)如(1)至(7)中任一項之抗體或其功能性片段，其中該抗體包含由示於SEQ ID NO：31(圖16)之胺基酸序列組成之重鏈可變區以及由示於SEQ ID NO：33(圖18)之胺基酸序列組成之輕鏈可變區；(10)如(1)至(8)中之任一項之抗體或其功能性片段，其中該抗體包含選自以下a)至d)之任一重鏈可變區及選自e)及f)之輕鏈可變區：a)重鏈(hMAb1-H1型)可變區，其係由示於SEQ ID NO：56(圖32)之第20至137號胺基酸之胺基酸序列組成，b)重鏈(hMAb1-H2型)可變區，其係由示於SEQ ID NO：58(圖 34)之第20至137號胺基酸之胺基酸序列組成，c)重鏈(hMAb1-H3型)可變區，其係由示於SEQ ID NO：60(圖36)之第20至137號胺基酸之胺基酸序列組成，及d)重鏈(hMAb1-H4型)可變區，其係由示於SEQ ID NO：62(圖38)之第20至137號胺基酸之胺基酸序列組成；以及e)輕鏈(hMAb1-L1型)可變區，其係由示於SEQ ID NO：64(圖40)之第21至134號胺基酸之胺基酸序列組成，及f)輕鏈(hMAb1-L2型)可變區，其係由示於SEQ ID NO：66(圖42)之第21至134號胺基酸之胺基酸序列組成；(11)如(1)至(8)中之任一項之抗體或其功能性片段，其中該抗體包含重鏈可變區與輕鏈可變區之以下組合1)至6)中之任一者：1)由示於SEQ ID NO：58(圖34)之第20至137號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈可變區及由示於SEQ ID NO：64(圖40)之第21至134號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈可變區，2)由示於SEQ ID NO：58(圖34)之第20至137號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈可變區及由示於SEQ ID NO：66(圖42)之第21至134號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈可變區，3)由示於SEQ ID NO：62(圖38)之第20至137號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈可變區及由示於SEQ ID NO：66(圖42)之第21至134號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈可變區；4)由示於SEQ ID NO：62(圖38)之第20至137號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈可變區及由示於SEQ ID NO：64(圖40)之第21至134號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈可變區，5)由示於SEQ ID NO：56(圖32)之第20至137號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈可變區及由示於SEQ ID NO：64(圖40)之第21至134號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈可變區，及 6)由示於SEQ ID NO：60(圖36)之第20至137號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈可變區及由示於SEQ ID NO：64(圖40)之第21至134號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈可變區，(12)如(1)至(11)中任一項之抗體或其功能性片段，其中該抗體或其功能性片段係嵌合抗體或其功能性片段；(13)如(1)至(11)中任一項之抗體或其功能性片段，其中該抗體或其功能性片段係人類化抗體或其功能性片段；(14)如(1)至(13)中任一項之抗體或其功能性片段，其中該抗體包含人類IgG1或人類IgG2重鏈恆定區；(15)如(1)至(6)中任一項之抗體或其功能性片段，其中該抗體或其功能性片段結合至由如(7)至(14)之任一抗體識別之抗原上之位點；(16)如(1)至(6)中任一項之抗體或其功能性片段，其中該抗體或其功能性片段與如(7)至(14)之任一抗體競爭結合ROBO4蛋白質；(17)如(1)至(8)中任一項之抗體，其中該抗體包含重鏈與輕鏈之以下組合1)至6)中之任一者：1)由示於SEQ ID NO：58(圖34)之第20至463號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈及由示於SEQ ID NO：64(圖40)之第21至239號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈(H-1140)，2)由示於SEQ ID NO：58(圖34)之第20至463號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈及由示於SEQ ID NO：66(圖42)之第21至239號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈(H-1143)，3)由示於SEQ ID NO：62(圖38)之第20至463號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈及由示於SEQ ID NO：66(圖42)之第21至239號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈(H-2143)；4)由示於SEQ ID NO：62(圖38)之第20至463號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈及由示於SEQ ID NO：64(圖40)之第21至239號胺 基酸之胺基酸序列組成之輕鏈(H-2140)，5)由示於SEQ ID NO：56(圖32)之第20至463號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈及由示於SEQ ID NO：64(圖40)之第21至239號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈(H-1040)，及6)由示於SEQ ID NO：60(圖36)之第20至463號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈及由示於SEQ ID NO：64(圖40)之第21至239號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈(H-2040)，(18)包含如(17)之任一抗體之重鏈之修飾形式之抗體，其中該修飾形式缺少該重鏈之一個至若干個羧基端胺基酸，較佳該重鏈之一個至八個羧基端胺基酸，更佳該重鏈之一個至兩個羧基端胺基酸；(19)如(1)至(6)中任一項之抗體，其中該抗體之胺基酸序列與如(17)之任一抗體有95%或更高一致性；對於人類ROBO4之KD值為1×10-8或更低；在活體外在不存在交聯抗體時阻抑或抑制血管內皮細胞移行；且在活體內阻抑或抑制血管生成；(20)如(15)之抗體或其功能性片段，其中該抗體或其功能性片段係人類抗體或其功能性片段；(21)選自由以下(I)至(III)組成之群之核苷酸序列：(I)包含編碼如(1)至(20)中任一項之抗體中重鏈或輕鏈之部分或完整胺基酸序列之核苷酸序列的核苷酸序列；(II)由包含編碼如(1)至(20)中任一項之抗體中重鏈或輕鏈之部分或完整胺基酸序列之核苷酸序列的核苷酸序列組成之核苷酸序列；及(III)由編碼如(1)至(20)中任一項之抗體中重鏈或輕鏈之部分或完整胺基酸序列之核苷酸序列組成之核苷酸序列；(22)含有如(21)之核苷酸序列之插入物之重組載體；(23)其中經引入含有如(21)之核苷酸序列或如(22)之重組載體之重組細胞； (24)產生如(1)至(20)中任一項之抗體之細胞，其中該細胞較佳係哺乳動物細胞，更佳係CHO細胞且更佳係CHOK1SV；(25)產生如(1)至(20)中任一項之抗體或其功能性片段之方法，其包含以下步驟(I)及(II)：(I)培養如(23)或(24)之細胞；及(II)自步驟(I)獲得之培養物收集如(1)至(20)中任一項之抗體或其功能性片段；(26)藉由如(25)之產生方法產生之抗體或其功能性片段；(27)如(1)至(20)及(26)中任一項之抗體或其功能性片段之修飾形式；(28)包含如(1)至(20)及(26)中任一項之抗體或其功能性片段或如(27)之修飾形式作為活性成份之醫藥組合物；(29)如(28)之醫藥組合物，其中該醫藥組合物係用於治療或預防血管生成性疾病之藥劑；(30)如(28)之醫藥組合物，其中該血管生成性疾病係滲出性年齡相關性黃斑點退化、糖尿病性視網膜病變、黃斑水腫、良性或惡性腫瘤、動脈粥樣硬化、晶狀體後纖維組織增生、血管瘤、慢性發炎、新生血管性眼病、增生性視網膜病變、新生血管性青光眼、角膜組織移植物或其他組織移植物之免疫排斥、類風濕性關節炎、牛皮癬、急性發炎、敗血症或肥胖症；(31)如(28)之醫藥組合物，其中該血管生成性疾病係滲出性年齡相關性黃斑點退化、糖尿病性視網膜病變、黃斑水腫、晶狀體後纖維組織增生、新生血管性眼病、增生性視網膜病變、新生血管性青光眼或角膜組織移植物之免疫排斥；(32)包含如(1)至(20)及(26)中任一項之抗體或其功能性片段或如(27)之修飾形式作為活性成份之血管生成抑制劑； (33)用於治療或預防血管生成性疾病之方法，其包含向有需要之個體投與有效量之如(1)至(20)及(26)中任一項之抗體或其功能性片段或如(27)之修飾形式或如(28)至(31)中任一項之組合物，其中該血管生成性疾病較佳係具有經表現ROBO4蛋白質之個體之血管生成性疾病；及(34)如申請專利範圍第28至31項中任一項之醫藥組合物，其中該組合物係與另一治療劑或預防劑組合使用，其中該藥劑較佳係抗血管生成藥物、抗炎藥物及/或抗癌藥物。
根據本發明，可獲得含有結合ROBO4且具有抗血管生成效應之抗體的用於血管生成性疾病之治療劑或類似藥劑。
[圖1]圖1係顯示在HEK293細胞之人類ROBO4之瞬時表現中針對作為反應元件之NF-κB、GAS、SRE、IL-8啟動子或TCF之報導基因活性存在或不存在變化之圖式。圖式中之誤差棒代表標準偏差(n=3)。
[圖2]圖2係顯示在HEK293細胞之全長人類ROBO4或人類ROBO4之胞內區缺失變體之瞬時表現中IL-8啟動子活性存在或不存在變化之圖式。圖式中之誤差棒代表標準偏差(n=5或10)。
[圖3]圖3係顯示在人類ROBO4轉染之HEK293細胞中由抗ROBO4抗體MAb 1引起之IL-8啟動子活性變化之圖式。圖式中之誤差棒代表標準偏差(n=3)。
[圖4]圖4係顯示在人類ROBO4轉染之HEK293細胞中由抗ROBO4抗體MAb2、MAb3或MAb4引起之IL-8啟動子活性變化之圖式。圖式中之誤差棒代表標準偏差(n=3)。
[圖5]圖5係顯示在VEGF或bFGF存在下由抗ROBO4抗體MAb1引起之HUVEC之移行能力變化之圖式。圖式中之誤差棒代表標準偏差 (n=3或4)。
[圖6]圖6係顯示在bFGF存在下由抗ROBO4抗體MAb2、MAb3或MAb4引起之HUVEC之移行能力變化之圖式。圖式中之誤差棒代表標準偏差(n=4)。
[圖7]圖7係顯示存在或不存在抗ROBO4抗體MAb1針對人類ROBO4、小鼠ROBO4、大鼠ROBO4或食蟹猴ROBO4之結合活性之圖式。
[圖8]圖8係顯示存在或不存在抗ROBO4抗體MAb1針對人類ROBO1、人類ROBO2或人類ROBO3之結合活性之圖式。上方盒顯示關於MAb1之結果，且下方盒顯示關於陽性對照抗體之結果，使用該等陽性對照抗體來確認該等蛋白質在細胞表面上之表現。
[圖9]圖9係顯示存在或不存在抗ROBO4抗體MAb1針對人類ROBO4之胞外區/結構域缺失變體之結合活性之圖式。上方盒顯示關於MAb 1之結果，且下方盒顯示關於抗FLAG抗體之結果，使用該等抗FLAG抗體來確認該等蛋白質在細胞表面上之表現。
[圖10]圖10係顯示在雷射誘導之脈絡膜新血管生成模型中由抗ROBO4抗體MAb 1引起之血管生成之變化之圖式。圖式中之誤差棒代表標準偏差(n=4隻眼)，且■或□顯示每隻眼之結果。
[圖11]圖11係顯示在人類ROBO4轉染之HEK293細胞中由抗ROBO4嵌合抗體cMAb 1-1或cMAb 1-2引起之IL-8啟動子活性變化之圖式。圖式中之誤差棒代表標準偏差(n=3)。
[圖12]圖12係顯示在bFGF存在下由抗ROBO4嵌合抗體cMAb 1-1或cMAb 1-2引起之HUVEC之移行能力變化之圖式。圖式中之誤差棒代表標準偏差(n=4)。
[圖13]圖13顯示編碼全長人類ROBO4之cDNA(SEQ ID NO：1)。
[圖14]圖14顯示人類ROBO4之全長胺基酸序列(SEQ ID NO： 2)。
[圖15]圖15顯示編碼MAb1之重鏈可變區之cDNA之核苷酸序列(SEQ ID NO：30)。
[圖16]圖16顯示MAb1重鏈可變區之胺基酸序列(SEQ ID NO：31)。
[圖17]圖17顯示編碼MAb1之輕鏈可變區之cDNA之核苷酸序列(SEQ ID NO：32)。
[圖18]圖18顯示MAb1輕鏈可變區之胺基酸序列(SEQ ID NO：33)。
[圖19]圖19顯示編碼cMAb1之輕鏈之cDNA之核苷酸序列(SEQ ID NO：37)。
[圖20]圖20顯示cMAb1輕鏈之胺基酸序列(SEQ ID NO：38)。
[圖21]圖21顯示編碼cMAb1-1之重鏈之cDNA之核苷酸序列(SEQ ID NO：39)。
[圖22]圖22顯示cMAb1-1重鏈之胺基酸序列(SEQ ID NO：40)。
[圖23]圖23顯示編碼cMAb1-2之重鏈之cDNA之核苷酸序列(SEQ ID NO：41)。
[圖24]圖24顯示cMAb1-2重鏈之胺基酸序列(SEQ ID NO：42)。
[圖25]圖25顯示MAb1之重鏈CDRH1之胺基酸序列(SEQ ID NO：44)。
[圖26]圖26顯示MAb1之重鏈CDRH2之胺基酸序列(SEQ ID NO：46)。
[圖27]圖27顯示MAb1之重鏈CDRH3之胺基酸序列(SEQ ID NO：48)。
[圖28]圖28顯示MAb1之輕鏈CDRL1之胺基酸序列(SEQ ID NO：50)。
[圖29]圖29顯示MAb1之輕鏈CDRL2之胺基酸序列(SEQ ID NO：52)。
[圖30]圖30顯示MAb1之輕鏈CDRL3之胺基酸序列(SEQ ID NO：54)。
[圖31]圖31顯示編碼hMAb1-H1型重鏈之cDNA之核苷酸序列(SEQ ID NO：55)。
[圖32]圖32顯示hMAb1-H1型重鏈之胺基酸序列(SEQ ID NO：56)。
[圖33]圖33顯示編碼hMAb1-H2型重鏈之cDNA之核苷酸序列(SEQ ID NO：57)。
[圖34]圖34顯示hMAb1-H2型重鏈之胺基酸序列(SEQ ID NO：58)。
[圖35]圖35顯示編碼hMAb1-H3型重鏈之cDNA之核苷酸序列(SEQ ID NO：59)。
[圖36]圖36顯示hMAb1-H3型重鏈之胺基酸序列(SEQ ID NO：60)。
[圖37]圖37顯示編碼hMAb1-H4型重鏈之cDNA之核苷酸序列(SEQ ID NO：61)。
[圖38]圖38顯示hMAb1-H4型重鏈之胺基酸序列(SEQ ID NO：62)。
[圖39]圖39顯示編碼hMAb1-L1型輕鏈之cDNA之核苷酸序列(SEQ ID NO：63)。
[圖40]圖40顯示hMAb1-L1型輕鏈之胺基酸序列(SEQ ID NO：64)。
[圖41]圖41顯示編碼hMAb1-L2型輕鏈之cDNA之核苷酸序列(SEQ ID NO：65)。
[圖42]圖42顯示hMAb1-L2型輕鏈之胺基酸序列(SEQ ID NO：66)。
[圖43]圖43顯示hMAb1-H2型或hMAb1-H4型重鏈之CDRH1之胺基酸序列(SEQ ID NO：67)。
[圖44]圖44顯示hMAb1-H2型或hMAb1-H4型重鏈之CDRH2之胺基酸序列(SEQ ID NO：68)。
[圖45]圖45顯示hMAb1-H2型或hMAb1-H4型重鏈之CDRH3之胺基酸序列(SEQ ID NO：69)。
[圖46]圖46顯示hMAb1-L2型輕鏈之CDRL1之胺基酸序列(SEQ ID NO：70)。
[圖47]圖47顯示hMAb1-L2型輕鏈之CDRL2之胺基酸序列(SEQ ID NO：71)。
[圖48]圖48顯示hMAb1-L2型輕鏈之CDRL3之胺基酸序列(SEQ ID NO：72)。
[圖49]圖49係顯示在人類ROBO4轉染之HEK293細胞中由H-1040、H-1143、H-1140、H-2040、H-2143或H-2140引起之IL-8啟動子活性變化之圖式。
[圖50]圖50係顯示在bFGF存在下由H-1143、H-2140或H-2143引起之HUVEC之移行能力變化之圖式。圖式中之誤差棒代表標準偏差(n=4)。
[圖51]圖51係顯示H-1143之跨物種反應性之圖式。
[圖52]圖52係顯示H-2140之跨物種反應性之圖式。
[圖53]圖53係顯示H-2143之跨物種反應性之圖式。
[圖54]圖54係顯示H-1143、H-2140或H-2143之結合特異性之圖式。
[圖55]圖55係顯示在雷射誘導之脈絡膜新血管生成模型中由H- 2143引起之血管生成之變化之圖式。圖式中之誤差棒代表標準偏差(n=3-4隻眼)。
1. 定義
在本發明中，「基因」意指包含編碼蛋白質之胺基酸之核苷酸序列或其互補股之核苷酸或核苷酸序列。「基因」意欲包括(例如)作為包含編碼蛋白質之胺基酸之核苷酸序列或其互補股之核苷酸序列之多核苷酸、寡核苷酸、DNA、mRNA、cDNA及cRNA。此一基因係單股、雙股或三股或更多股之核苷酸序列，且該「基因」亦意欲包括DNA股與RNA股之締合物(即核糖核苷酸(RNA)與去氧核糖核苷酸(DNA)在一條核苷酸股上之混合物)，且雙股或三股或更多股之核苷酸序列包含此一核苷酸股。本發明「ROBO4基因」之實例可包括包含編碼ROBO4蛋白質之胺基酸序列之核苷酸序列之DNA、mRNA、cDNA及cRNA。
在本發明中，術語「核苷酸」或「核苷酸序列」具有與在「核酸」中相同之含義，且亦意欲包括(例如)DNA、RNA、探針、寡核苷酸、多核苷酸及引物。此一核苷酸序列係單股、雙股或三股或更多股之核苷酸，且「核苷酸」序列亦意欲包括DNA股與RNA股之締合物(即核糖核苷酸(RNA)與去氧核糖核苷酸(DNA)在一條核苷酸股上之混合物)，且兩股或三股或更多股之締合物包含此一核苷酸股。
在本發明中，術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」具有相同含義。
在本發明中，「抗原」亦按「免疫原」之含義來使用。
在本發明中，「細胞」亦包括衍生自以下之各種細胞：動物個體、繼代培養細胞、原代培養細胞、細胞系、重組細胞及諸如此類。
在本發明中，識別ROBO4蛋白質之抗體亦稱作「抗ROBO4抗 體」。「抗ROBO4抗體」包括抗ROBO4嵌合抗體、抗ROBO4人類化抗體、抗ROBO4人類抗體及諸如此類。
在本發明中，「抗體之功能性片段」意指發揮原始抗體之至少一種功能(例如結合親和性(KD值))之抗體片段。「抗體之功能性片段」之實例可包括(但不限於)Fab、F(ab')2、scFv、Fab'、單鏈免疫球蛋白及諸如此類。抗體之此一功能性片段可藉由用諸如木瓜酶或胃蛋白質酶等酶處理抗體蛋白質之全長分子來獲得，或可為在適當宿主細胞中使用重組基因產生之重組蛋白質。較佳「功能性片段」亦具有原始抗體之至少一種生物活性。
此外，在本發明背景中，編碼重鏈或輕鏈之「部分胺基酸序列」之核苷酸序列係或包括編碼如上文所定義之「抗體之功能性片段」之核苷酸序列。
在本發明中，抗體所結合之「位點」(及抗體所識別之「位點」)意指抗體所結合或識別之抗原上之部分肽或部分構象。在本發明中，此一位點亦稱作表位或抗體結合位點。本發明抗ROBO4抗體所結合或識別之ROBO4蛋白質上之位點之實例可包括ROBO4蛋白質上之部分肽或部分構象。
已知抗體分子之重鏈及輕鏈各自具有三個互補決定區(CDR)。互補決定區亦稱作超變結構域。其位於抗體重鏈及輕鏈之可變區中。該等位點具有極高可變之一級結構且通常在重鏈及輕鏈多肽股之各別一級結構上之三個位置處分離。在本發明中，抗體之互補決定區稱作來自重鏈胺基酸序列胺基端之CDRH1、CDRH2及CDRH3(對於重鏈之互補決定區)以及來自輕鏈胺基酸序列胺基端之CDRL1、CDRL2及CDRL3(對於輕鏈互補決定區)。該等位點在三維結構上彼此靠近，且決定對欲結合抗原之特異性。
在本發明中，「抗體突變體」意指胺基酸序列係藉由胺基酸之取 代、缺失、添加及/或插入(下文中，統稱為「突變」)衍生自原始抗體之胺基酸序列且結合本發明ROBO4蛋白質之多肽。此一抗體突變體中突變胺基酸之數目係1至2、1至3、1至4、1至5、1至6、1至7、1至8、1至9、1至10、1至12、1至15、1至20、1至25、1至30、1至40或1至50。此一抗體突變體亦涵蓋於本發明「抗體」中。
在本發明中，在「1個至若干個」中之術語「若干個」係指2至10，較佳2至8，更佳2。
本發明抗體所發揮之活性或性質之實例可包括生物活性或物理化學性質且尤其可包括各種生物活性、針對抗原或表位之結合活性、在產生或儲存期間之穩定性及熱穩定性。
在本發明中，片語「在嚴格條件下雜交」意指在包括以下之條件下雜交：在65℃下在含有5×SSC之溶液中雜交，之後在65℃下在含有2×SSC-0.1% SDS之水溶液中洗滌20分鐘，在65℃下在含有0.5×SSC-0.1% SDS之水溶液中洗滌20分鐘，且在65℃下在含有0.2×SSC-0.1% SDS之水溶液中洗滌20分鐘；或在與其等效之條件下雜交。SSC意指150mM NaCl-15mM檸檬酸鈉之水溶液，且n×SSC意指具有n倍濃度之SSC。
2. ROBO4蛋白質
在本說明書中，術語「ROBO4」及「ROBO4蛋白質」係按相同含義來使用。
(2-1)性質
本發明ROBO4蛋白質具有以下性質：
(i)ROBO4具有約110kDa之分子量及單次跨膜結構，且係參與血管生成之SLIT 2蛋白質之受體蛋白質。可發現本發明之任何ROBO4蛋白質呈自膜(例如細胞膜)釋放之形式且可呈結合至膜(例如細胞膜)之形式。在此背景中，分子量意指在SDS-PAGE之非還原條件下之表觀 分子量。ROBO4之N-端胞外區含有兩個免疫球蛋白樣結構域(下文中，稱作「Ig樣結構域」)及兩個纖連蛋白質III型結構域，同時其C-端胞內區含有富蛋白質區域。在本說明書中，該兩個免疫球蛋白樣結構域分別稱作來自胺基端之Ig樣結構域1及Ig樣結構域2。人類ROBO4蛋白質係由SEQ ID NO：2之第28至1007號胺基酸之胺基酸序列組成。SEQ ID NO：2之第1至27號胺基酸代表分泌信號；其第28至467號胺基酸代表胞外區；其第46至131號胺基酸代表Ig樣結構域1；其第137至224號胺基酸代表Ig樣結構域2；其第252至340號胺基酸代表纖連蛋白質III型結構域1；其第347至438號胺基酸代表纖連蛋白質III型結構域2；其第468至490號胺基酸代表細胞膜中之區域；且其第491至1007號胺基酸代表胞內區。
(ii)ROBO4具有抗血管生成效應。在本發明中，術語「抗血管生成」意指，該分子自身、與另一因子合作或作為與另一因子之締合物直接或間接阻抑及/或抑制血管生成。抗血管生成效應可以VEGF作為指標用(例如)對血管滲透性之提高、細胞移行促進活性或管腔形成活性之阻抑效應來評估。
(iii)ROBO4包含以下(a)至(e)中任一者所述之胺基酸序列(下文中，稱作「ROBO4胺基酸序列」)，由包含ROBO4胺基酸序列之胺基酸序列組成或由ROBO4胺基酸序列組成：(a)示於SEQ ID NO：2(圖14)之胺基酸序列；(b)對示於SEQ ID NO：2(圖14)之胺基酸序列展現80%或更高、82%或更高、84%或更高、86%或更高、88%或更高、90%或更高、92%或更高、94%或更高、96%o或更高、98%或更高或99%或更高序列一致性且展現抗血管生成效應之多肽之胺基酸序列；(c)包含取代、缺失、添加或插入1至50、1至45、1至40、1至35、1至30、1至25、1至20、1至15、1至10、1至8、1至6、1至5、1至 4、1至3、1或2或1個胺基酸之示於SEQ ID NO：2(圖14)之胺基酸序列且阻抑血管生成之多肽之胺基酸序列；(d)包含缺失第1至45號胺基酸或1至131號胺基酸之胺基酸序列SEQ ID NO：2且阻抑血管生成之多肽之胺基酸序列；及(e)藉由在嚴格條件下雜交至核苷酸序列與編碼示於SEQ ID NO：2(圖14)之胺基酸序列之核苷酸序列互補之核苷酸之核苷酸的核苷酸序列編碼且阻抑血管生成之多肽之胺基酸序列。
ROBO4蛋白質可以由兩個或更多個亞單元構成之同源或異源寡聚締合物之整體或一部分存在。
在個體、組織、體液、細胞、含有ROBO4蛋白質之部分、經純化或部分純化之ROBO4蛋白質製劑或諸如此類中，或在複數個個體、組織、細胞、含有ROBO4蛋白質之部分或ROBO4蛋白質製劑之間，ROBO4蛋白質之胺基酸序列及/或其他性質可既不相同亦不同源。一個個體、組織、體液、細胞、含有ROBO4蛋白質之部分、經純化或部分純化之ROBO4蛋白質製劑或諸如此類可含有複數種類型之胺基酸序列及/或性質有所不同之ROBO4蛋白質。或者，複數個個體、組織、細胞、含有ROBO4蛋白質之部分或ROBO4蛋白質製劑可在ROBO4蛋白質之胺基酸序列及/或其他性質方面有所不同。甚至該等在胺基酸序列及/或性質方面彼此不同之蛋白質皆涵蓋於本發明「ROBO4蛋白質」中，只要其具有上文(i)至(iii)中所述之性質即可。(iv)本發明ROBO4蛋白質可得自脊椎動物、較佳哺乳動物、更佳齧齒類動物(例如小鼠或大鼠)或人類之組織、更佳人類或小鼠之組織、衍生自此一組織之細胞、該等細胞之培養物及諸如此類。此一組織及細胞並未特別受限，只要其含有ROBO4蛋白質即可。其實例可包括關節組織、血液、淋巴、胸腺、脾及衍生自其中任一者之細胞。較佳組織及細胞係衍生自具有血管生成之動物或患者之組織及細胞。然 而，本發明ROBO4蛋白質之來源並不限於上述之彼等，且本發明ROBO4蛋白質亦意欲包括甚至衍生自其他動物物種、其他組織、其他細胞或諸如此類之ROBO4蛋白質，只要其具有上文(i)至(iii)中所述之性質即可。
本發明ROBO4蛋白質可係天然及重組蛋白質中之任一者。ROBO4蛋白質亦意欲包括與另一肽或蛋白質(例如載體或標籤)之融合產物。ROBO4蛋白質亦意欲包括使用化學修飾(包括添加諸如PEG等聚合物)及/或使用生物修飾(包括糖鏈修飾)提供之形式。此外，本發明ROBO4蛋白質意欲包括ROBO4蛋白質片段。具有上文(ii)中所述性質之ROBO4蛋白質片段稱為ROBO4蛋白質之功能性片段。
(2-2)ROBO4基因
本發明ROBO4基因包含在以下(a)至(c)中之任一者闡述之核苷酸序列(下文中，稱作「ROBO4基因序列」)，由包含ROBO4基因序列之核苷酸序列組成或由ROBO4基因序列組成：(a)示於SEQ ID NO：1(圖13)之核苷酸序列；(b)在嚴格條件下雜交至由與示於SEQ ID NO：1(圖13)之核苷酸序列互補之核苷酸序列組成的核苷酸且編碼阻抑血管生成之多肽之胺基酸序列之核苷酸序列；及(c)包含取代、缺失、添加或插入1至150、1至140、1至130、1至120、1至110、1至100、1至90、1至80、1至70、1至60、1至50、1至45、1至40、1至30、1至25、1至20、1至15、1至10、1至8、1至6、1至5、1至4、1至3、1或2或1個鹼基之示於SEQ ID NO：1(圖13)之核苷酸序列且編碼阻抑血管生成之多肽之胺基酸序列的核苷酸序列。
ROBO4基因在患有伴隨血管生成之疾病(例如，增生性糖尿病性視網膜病變)之患者之纖維血管膜之血管或瘤內血管中過表現。另外，ROBO4基因似乎在衍生自患有認為涉及血管生成之疾病(例如滲 出性年齡相關性黃斑點退化、黃斑水腫、動脈粥樣硬化、晶狀體後纖維組織增生、血管瘤、慢性發炎、新生血管性眼病、增生性視網膜病變、新生血管性青光眼、角膜組織移植物或其他組織移植物之免疫排斥、類風濕性關節炎、牛皮癬、急性發炎、敗血症或肥胖症)之患者或衍生自該等疾病之模型動物之組織或血液部分中過表現。
ROBO4基因之表現及表現量可以ROBO4基因轉錄產物及ROBO4蛋白質中之任一者作為指標來分析，且可藉由針對前一指標之RT-PCR、北方墨點(Northern blot)雜交或諸如此類及藉由針對後一指標之免疫分析(例如，酶聯免疫吸附分析；下文中，稱作「ELISA」)或諸如此類來測定。
(2-3)蛋白質之製備
本發明ROBO4蛋白質可自動物組織(包括體液)、衍生自該等組織之細胞或細胞培養物純化或分離，且可藉由基因重組、活體外翻譯、化學合成等來製備。
(2-3-1)天然ROBO4之純化或分離
天然ROBO4蛋白質可自(例如)衍生自患有血管生成性疾病(例如滲出性年齡相關性黃斑點退化、糖尿病性視網膜病變、黃斑水腫、良性或惡性腫瘤、動脈粥樣硬化、晶狀體後纖維組織增生、血管瘤、慢性發炎、新生血管性眼病、增生性視網膜病變、新生血管性青光眼、角膜組織移植物或其他組織移植物之免疫排斥、類風濕性關節炎、牛皮癬、急性發炎、敗血症或肥胖症)之患者或非人類動物之組織(包括體液、細胞等)、衍生自該等組織之細胞或細胞培養物純化或分離。該等非人類動物亦包括該等疾病之模型動物。經受模型製備之動物並未特別受限，只要其係脊椎動物即可。動物較佳係哺乳動物，更佳齧齒類動物(例如小鼠或大鼠)，更佳小鼠或大鼠。該等患者或模型動物之組織及細胞並未特別受限，只要其含有ROBO4蛋白質即可。其實 例可包括關節組織、血液、淋巴、胸腺、脾及衍生自其中任一者之細胞。較佳組織及細胞衍生自具有血管生成或展現類似症狀之患者或模型動物。然而，本發明ROBO4蛋白質之來源並不限於上文所述之彼等，且本發明ROBO4蛋白質可衍生自其他動物物種、其他組織、其他細胞或諸如此類。
自該等組織、細胞、細胞培養物或諸如此類進行之純化或分離可藉由熟習此項技術者熟知之方法之組合(例如分級分離及層析)來實施。該等方法包括(但不限於)鹽析、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析、疏水層析、正相或反相層析及諸如此類。可製備與抗ROBO4單株抗體交聯之親和性凝膠並將其加載至管柱以由此製備用於親和層析之管柱。將含有ROBO4蛋白質之粗製或部分純化部分添加至此一管柱。隨後，用無菌磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)移除非特異性吸附物質，且隨後可向其添加溶析用緩衝溶液以由此選擇性地收集ROBO4蛋白質。含有ROBO4蛋白質之溶液可經受凝膠過濾或緩衝液更換及/或使用諸如Centriprep等濃縮器進行濃縮。
(2-3-2)重組ROBO4蛋白質之製備
本發明ROBO4蛋白質亦可以重組形式來製備。具體而言，用編碼ROBO4蛋白質或ROBO4蛋白質片段之胺基酸序列之基因來轉染宿主細胞，且可自細胞培養物收集ROBO4蛋白質。舉例而言，將ROBO4基因或其片段插入表現載體中。隨後，用所得重組載體轉染原核或真核宿主細胞，且可培育所獲得重組細胞以由此表現ROBO4蛋白質。可使用業內已知之表現模式，例如分泌表現、可溶形式之胞內表現或包涵體方法。同樣，ROBO4蛋白質不僅可表現為與天然蛋白質具有相同胺基端(N-端)及/或羧基端(C-端)之分子，亦可表現為具有分泌信號、胞內定位信號、用於親和純化之標籤或配偶體肽之融合蛋白質。ROBO4蛋白質可藉由適當操作組合(例如(2-3-1)天然ROBO4 蛋白質之純化或分離中所述之分級分離及層析)自該等重組細胞培養物純化或分離。
ROBO4基因或其片段可藉由熟習此項技術者熟知之方法來製備。
其實例可包括：聚合酶鏈式反應(下文中，稱作「PCR」；Saiki,R.K.等人，Science(1988)239，第487-489頁)，其以ROBO4 cDNA表現文庫作為模板，使用一組能特異性擴增序列之引物；逆轉錄PCR(下文中，稱作「RT-PCR」)，其以用於ROBO4表現之mRNA部分作為模板，使用能逆轉錄序列之引物及一組能特異性擴增序列之引物；表現選殖，其使用免疫分析；及cDNA選殖，其使用經純化ROBO4蛋白質之部分胺基酸序列。
(2-3-3)活體外翻譯
本發明ROBO4蛋白質亦可藉由活體外翻譯來製備。此一翻譯方法並未特別受限，只要其係使用無細胞翻譯系統之方法即可，該系統涉及轉錄及翻譯所需的酶、受質及能量物質。其實例可包括使用由Roche Diagnostics製造之快速翻譯系統(RTS)之方法。
(2-3-4)化學合成
本發明ROBO4蛋白質亦可藉由化學合成來製備。化學合成方法之實例可包括固相肽合成方法，例如Fmoc合成及Boc合成方法。
3. 抗ROBO4抗體 (3-1)抗ROBO4抗體之類型
本發明抗體可係單株及多株抗體中之任一者。本發明單株抗體之實例可包括非人類動物源抗體(非人類動物抗體)、人類源抗體(人類抗體)、嵌合抗體及人類化抗體，較佳係嵌合抗體、人類化抗體及人類源抗體(人類抗體)，更佳係人類化抗體及人類源抗體(人類抗體)。
非人類動物抗體之實例可包括衍生自脊椎動物(例如哺乳動物及 鳥類)之抗體。哺乳動物源抗體之實例可包括齧齒類動物源抗體，例如小鼠抗體及大鼠抗體。鳥類源抗體之實例可包括雞抗體。
嵌合抗體之實例可包括(但不限於)包含結合有人類抗體(人類免疫球蛋白)恆定區之非人類動物抗體源可變區之抗體。非人類動物抗體源可變區之實例可包括衍生自下文所述MAb1之重鏈及輕鏈可變區。
人類化抗體之實例可包括(但不限於)移植有非人類動物抗體可變區中之CDR之人類抗體(人類免疫球蛋白可變區)、移植有非人類動物抗體之CDR以及框架區之部分序列之人類抗體以及在該等人類化抗體中之任一者中有人類抗體胺基酸被替代為一個或兩個或更多個非人類動物抗體源胺基酸之抗體。非人類動物抗體可變區中之CDR之實例可包括衍生自下文所述MAb1之重鏈可變區中之CDRH1至3及輕鏈可變區中之CDRL1至3。
人類抗體並未特別受限，只要其係識別本發明抗原之抗體即可。其實例可包括與具有本發明抗體CDR之抗體結合相同位點之人類抗體及與上述MAb1結合ROBO4上之相同位點之人類抗體。
本發明抗體可係由衍生自複數種不同抗體之位點組成之抗體。其實例可包括包含在複數種不同抗體之間交換之重鏈及/或輕鏈之抗體、包含在其之間交換之全長重鏈及/或輕鏈之抗體、包含在其之間交換之可變區或恆定區之抗體以及包含所有或一些在其之間交換之CDR之抗體。嵌合抗體之重鏈及輕鏈可變區可衍生自本發明之不同抗體。人類化抗體之重鏈及輕鏈可變區中之CDRH1至3及CDRL1至3可衍生自兩種或更多種本發明不同抗體。人類抗體之重鏈及輕鏈可變區中之CDRH1至3及CDRL1至3可為兩種或更多種本發明不同抗體所攜載CDR之組合。
本發明單株抗體之同種型並未特別受限，且其實例可包括IgG (例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)、IgM、IgA(例如IgA1及IgA2)、IgD及IgE，且較佳可包括IgG及IgM，更佳為IgG2。單株抗體之同種型及亞類可藉由(例如)歐氏測試(Ouchterlony test)、ELISA、放射性免疫分析(下文中，稱作「RIA」)來測定。可使用市售鑑別用套組(由Bio-Rad Laboratories公司製造之小鼠分型器套組(Mouse Typer Kit)，由AbD Serotec製造之大鼠單株抗體同種型測試套組等)。
(3-2)抗ROBO4抗體之結合特異性
本發明抗體識別ROBO4蛋白質。換言之，本發明抗體結合至ROBO4蛋白質。此一抗體稱作「抗ROBO4抗體」。此外，本發明較佳抗體特異性識別ROBO4蛋白質。換言之，本發明較佳抗體特異性結合至ROBO4蛋白質。此外，本發明更佳抗體特異性結合至ROBO4蛋白質所攜載之Ig樣結構域。此一Ig樣結構域之實例可包括Ig樣結構域1及Ig樣結構域2。本發明更佳抗體識別由SEQ ID NO：2之第132至209號胺基酸之胺基酸序列組成之區域。本發明抗體結合至人類ROBO4蛋白質、猴(較佳食蟹猴)ROBO4蛋白質及兔ROBO4蛋白質，但不結合至小鼠及大鼠ROBO4蛋白質(實例4)-3及實例11)-4中之跨物種反應性)。
在本發明中，「特異性識別」、即「特異性結合」意指不係非特異性吸附之結合。用於測定結合是否為特異性之準則之實例可包括解離常數(下文中，稱作「KD」)。本發明較佳抗體對ROBO4蛋白質之KD值為1×10-5或更低、5×10-6或更低、2×10-6或更低或1×10-6或更低，更佳5×10-7或更低、2×10-7或更低或1×10-7或更低，更佳5×10-8或更低、2×10-8或更低或1×10-8或更低，更佳5×10-9或更低、2×10-9或更低或1×10-9或更低，最佳5×10-10或更低、2×10-10或更低或1×10-10或更低。更具體而言，本發明較佳抗體對ROBO4蛋白質之KD值為2×10-8或更低，更佳1×10-8或更低，更佳5×10-9或更低。
在本發明中，可藉由ELISA、RIA、表面電漿共振(下文中，稱作「SPR」)分析或諸如此類來分析或測定抗體與抗原之結合。用於SPR分析中之設備之實例可包括BIAcore(TM)(由GE Healthcare Bio-Sciences公司製造)、ProteOn(TM)(由Bio-Rad Laboratories公司製造)、SPR-Navi(TM)(由BioNavis Oy有限公司製造)、Spreeta(TM)(由Texas Instruments公司製造)、SPRi-PlexII(TM)(由Horiba有限公司製造)及Autolab SPR(TM)(由Metrohm製造)。可藉由流式細胞術或諸如此類來分析抗體與細胞表面上表現之抗原之結合。
(3-3)抗ROBO4抗體之活體外抗血管生成活性
本發明抗體在活體外在不存在交聯抗體時具有抗血管生成活性。已知某些抗體在活體外在不存在交聯抗體時不展現藥理學活性，但在活體內在不存在交聯抗體時展現藥理學活性(Cancer Cell(2011),19，第101-113頁)。此可能係由於發現白血球在活體內表現具有與交聯抗體相同之功能之Fcγ受體所致(Nature(2008),8，第34-47頁)；因此，即使不存在交聯抗體，抗體亦經由在白血球存在下之交聯展現藥理學活性。然而，在實際生物體中，病灶中白血球之數目在個體之間不同(Cancer Res(2011),71,5670-5677)，從而可能導致在個體之間抗體端視白血球誘導之交聯來展現藥理學活性之不同效應。本發明抗體即使在活體外在不存在交聯抗體時亦展現極佳抗血管生成活性。因此，本發明抗體在活體內亦可獨立於白血球數目具有抗血管生成效應，且因此適用於醫藥。
抗血管生成活性意指阻抑血管內皮細胞生長、移行、管腔形成等之活性。活體外抗血管生成活性可藉由血管滲透性、血管內皮細胞移行或管腔形成測試來評估。
舉例而言，用於該評估之血管滲透性測試可涉及將正常人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)接種至博登細胞移行器(Boyden Chamber)之孔 徑為1μm之上層以形成單層且隨後量測滲過細胞層之FITC標記之聚葡糖或諸如此類之量。滲過細胞層之FITC標記之聚葡糖之量可使用(例如)活體外血管滲透性分析(目錄號ECM640，由Millipore公司製造)來量測。在以5μg/mL或更低之濃度添加之抗體展現阻抑該量之FITC標記之聚葡糖滲過細胞層之效應時，此抗體可被評估為對血管滲透性具有阻抑效應且具有抗血管生成活性。在上述量測條件下，在較佳5μg/mL或更低、更佳1μg/mL或更低、尤佳0.5μg/mL或更低之濃度下，本發明抗體展現針對血管滲透性之阻抑活性。
用於該評估之細胞移行測試可涉及將HUVEC接種至博登細胞移行器之孔徑為3至8μm之上層，將含有內皮細胞移行增強劑(例如VEGF)之培養基添加至下層，及量測移行至下層之細胞數。在抗體展現降低移行HUVEC細胞數之效應時，此抗體可被評估為具有對血管內皮細胞移行阻抑效應且具有抗血管生成活性。移行細胞數可使用(例如)血管內皮細胞移行分析系統(目錄號354143，由BD Biosciences製造)來量測。在上述量測條件下，在較佳5μg/mL或更低、更佳1μg/mL或更低、尤佳0.5μg/mL或更低之濃度下，本發明抗體展現針對細胞移行之阻抑活性。
用於該評估之管腔形成測試可涉及將HUVEC接種至經基質膠塗佈之細胞培養容器中及量測由HUVEC在基質膠上形成之管腔結構之分支點數目、管長度或諸如此類。在抗體展現降低管腔結構之分支點數目或管長度之效應時，此抗體可被評估為具有對管腔形成阻抑效應且具有抗血管生成活性。管腔結構之分支點數目或管長度可使用(例如)血管內皮細胞管形成分析系統(目錄號354149，由BD Biosciences製造)來量測。在上述量測條件下，在較佳5μg/mL或更低、更佳1μg/mL或更低、尤佳0.5μg/mL或更低之濃度下，本發明抗體展現針對管腔形成之阻抑活性。
然而，此一分析系統並不限於該等測試，只要其能分析血管生成及由ROBO4蛋白質誘導之血管生成阻抑即可。
交聯抗體意指結合至本發明抗體之Fc區且作用以交聯兩個或更多個本發明抗體分子之抗體。舉例而言，在本發明抗體之Fc區衍生自小鼠時，交聯抗體係指結合至小鼠Fc區且經由交聯抗體分別與兩個或更多個本發明抗體分子之兩個結合位點之結合締合該兩個本發明抗體分子之抗體。
片語「在不存在交聯抗體時具有抗血管生成活性」意指，在關於血管生成阻抑之評估系統(例如上述評估系統)中，抗體即使不與交聯抗體共存亦展現抗血管生成效應。
就本發明之一種抗體分子而言，片語「在交聯抗體存在下具有抗血管生成活性」意指，在關於血管生成之評估系統(例如上述抗血管生成活性評估系統)中，抗體在不存在交聯抗體時不展現抗血管生成活性，但在與一或多種交聯抗體分子、較佳兩種或更多種交聯抗體分子共存時展現抗血管生成活性。
(3-4)抗ROBO4抗體針對血管生成之活體內阻抑或抑制活性
本發明抗體在活體內阻抑或抑制血管生成。針對血管生成之活體內阻抑或抑制活性可根據標準方法用動物疾病模型來評估。舉例而言，下文實例4)-6中闡述之雷射誘導之脈絡膜新血管生成模型廣泛用作血管生成之疾病模型且可用於以新形成血管之量作為分數之評估中。同樣在患者情形中，例如，在投與本發明抗體之前及之後藉由生檢自腫瘤患者收集腫瘤樣品，且其瘤內血管之血管密度可藉由免疫組織化學分析(IHC)來量測以為新形成血管之量評分。
(3-5)抗ROBO4抗體對下游信號之活化
本發明抗ROBO4抗體可經受使用對ROBO4蛋白質展現一定誘導反應之細胞系或原代培養細胞之評估系統。此一細胞系之實例可包括 小鼠血管內皮細胞系(ATCC編號CRL-2779)。該等原代培養細胞之實例可包括小鼠血管內皮細胞及人類血管內皮細胞。
本發明抗體係針對ROBO4之激動性抗體。具體而言，本發明抗體結合至ROBO4且活化ROBO4之下游信號。因此，本發明抗體之抗血管生成效應可以ROBO4下游信號之活化作為指標來評估。ROBO4下游信號之實例可包括IL-8啟動子活性。IL-8啟動子活性在表現全長人類ROBO4之細胞中與不表現人類ROBO4之細胞相比顯著提高，且在表現胞內結構域缺失之人類ROBO4之細胞中很難觀察到該活性。因此，IL-8啟動子活性之提高證實，檢測到ROBO4信號之活化(實例3)。IL-8啟動子活性可藉由(例如)以下方式來評估：添加抗ROBO4抗體或共添加抗ROBO4抗體及交聯抗體至經具有IL-8啟動子序列插入物及人類ROBO4表現質體之報導基因載體轉染之細胞中，之後測定報導基因活性。
(3-6)抗ROBO4小鼠單株抗體及嵌合抗體
MAb1係藉由實例2中所述方法獲得之抗ROBO4小鼠單株抗體。
編碼MAb1重鏈可變區之cDNA之核苷酸序列顯示於SEQ ID NO：30(圖15)中，且其胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：31(圖16)中。CDRH1之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：44(圖25)中；CDRH2之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：46(圖26)中；且CDRH3之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：48(圖27)中。編碼MAb1輕鏈可變區之cDNA之核苷酸序列顯示於SEQ ID NO：32(圖17)中，且其胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：33(圖18)中。CDRL1之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：50(圖28)中；CDRL2之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：52(圖29)中；且CDRL3之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：54(圖30)中。
本發明抗體突變體較佳展現降低之對蛋白質降解或氧化之敏感性、改良之生物活性、改良之結合至抗原之能力或賦予其之物理化學 或功能性性質或諸如此類。此一抗體突變體之實例可包括具有藉由保守胺基酸取代衍生自原始抗體之胺基酸序列之胺基酸序列之抗體。保守胺基酸取代係發生在胺基酸基團中之關於胺基酸側鏈之取代。
較佳胺基酸基團如下：包括天冬胺酸及麩胺酸之酸性基團；包括離胺酸、精胺酸及組胺酸之鹼性基團；包括丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸及色胺酸之非極性基團；及包括甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及酪胺酸之不帶電極性家族。其他較佳胺基酸基團如下：包括絲胺酸及蘇胺酸之脂肪族羥基；包括天冬醯胺及麩醯胺酸之含醯胺基團；包括丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸之脂肪族基團；及包括苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸之芳香族基團。抗體突變體中之該胺基酸取代之實施較佳不降低原始抗體之抗原結合活性。
具有藉由保守胺基酸取代衍生自本發明MAb1之胺基酸序列之胺基酸序列之抗體突變體以及包含藉由保守胺基酸突變衍生自MAb1源CDRH1至3及CDRL1至3中任一者之胺基酸序列之CDR胺基酸序列之小鼠抗體、大鼠抗體、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體或諸如此類亦涵蓋於本發明中。
本發明抗體之恆定區並未特別受限。較佳地，彼等衍生自人類抗體者用於本發明抗體中以供治療或預防人類之疾病。人類抗體之重鏈恆定區之實例可包括Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2及Cε。人類抗體之輕鏈恆定區之實例可包括CK及Cλ。
編碼例示為本發明小鼠-人類IgG1型嵌合抗體之cMAb1-1之含有分泌信號之輕鏈之核苷酸序列及其胺基酸序列以及編碼其重鏈之核苷酸序列及其胺基酸序列分別顯示於SEQ ID NO：37、38、39及40(圖19、20、21及22)中。同樣，編碼例示為本發明小鼠-人類IgG2型嵌合抗體之cMAb1-2之含有分泌信號之輕鏈之核苷酸序列及其胺基酸序列 以及編碼其重鏈之核苷酸序列及其胺基酸序列分別顯示於SEQ ID NO：37、38、41及42(圖19、20、23及24)中。
(3-7)抗ROBO4抗體之功能性片段
根據一態樣，本發明提供本發明抗ROBO4抗體之功能性片段。抗體之功能性片段意指維持抗體之至少一部分功能之片段或其在下文(3-10)中所述之修飾形式。抗體之該等功能之實例一般可包括抗原結合活性、抗原活性調節活性、抗體依賴性細胞毒性活性及補體依賴性細胞毒性活性。本發明抗ROBO4抗體之功能之實例可包括ROBO4蛋白質結合活性、抗血管生成活性及ROBO4下游信號活化效應。更具體而言，任何具有本發明針對ROBO4之抗體展現之上述活性(3-3)至(3-5)中之所有或一些之功能性片段皆包括在本發明抗體之功能性片段中。
抗體之功能性片段並未特別受限，只要其係維持至少一部分抗體活性之抗體片段或其修飾形式即可。其實例可包括(但不限於)Fab、F(ab')2、Fv、包含經由適當連接體連接之重鏈及輕鏈Fv之單鏈Fv(scFv)、雙鏈抗體、直鏈抗體、自抗體片段形成之多特異性抗體及Fab'(其係藉由在還原性條件下處理F(ab')2獲得之抗體可變區之單價片段)。含有除了本發明抗體片段以外之部分之分子(如在攜載連接體部分之scFv中)亦涵蓋於本發明抗體之功能性片段之含義中。
藉由在胺基端及/或羧基端缺失1個至若干個或更多個胺基酸衍生自抗體蛋白質且維持該抗體之至少一部分功能之分子亦涵蓋於本發明抗體之功能性片段之含義中。
本發明抗體或其功能性片段可為對至少2種類型之不同抗原具有特異性之多特異性抗體。多特異性抗體並不限於結合至2種類型之不同抗原之雙特異性抗體，本發明「多特異性抗體」之含義亦涵蓋對3種或更多種類型之不同抗原具有特異性之抗體。
本發明多特異性抗體可係全長抗體或其功能性片段(例如，雙特異性F(ab')2抗體)。雙特異性抗體亦可藉由結合兩種類型之抗體之重鏈及輕鏈(成對HL)來製備。雙特異性抗體亦可藉由融合兩種或更多種類型之產生單株抗體之融合瘤以製備產生雙特異性抗體之融合細胞來獲得(Millstein等人，Nature(1983)305，第537-539頁)。多特異性抗體亦可藉由與上文相同之方式來製備。
根據一態樣，本發明抗體係單鏈抗體(單鏈Fv；下文中，稱作「scFv」)。scFv係藉由經由多肽連接體連接抗體之重鏈及輕鏈可變區來獲得(Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,113,ed Rosenburg and Moore,Springer Verlag,New York，第269-315頁(1994),Nature Biotechnology(2005),23，第1126-1136頁)。此外，可使用包含兩個經由多肽連接體連接之scFv之雙scFv作為雙特異性抗體。此外，亦可使用包含三個或更多個scFv之多scFv作為多特異性抗體。
本發明包括單鏈免疫球蛋白，其包含經由適當連接體連接之抗體之全長重鏈及輕鏈序列(Lee,H-S等人，Molecular Immunology(1999)36，第61-71頁；Shirrmann,T.等人，mAbs(2010),2,(1)第1-4頁)。此單鏈免疫球蛋白可二聚化，藉以維持與原本為四聚體之抗體類似之結構及活性。同樣，本發明抗體可為具有單一重鏈可變區且不具有輕鏈序列之抗體。此一抗體稱作單結構域抗體(sdAb)或奈米抗體且已報導其可維持結合至抗原之能力(Muyldemans S.等人，Protein Eng.(1994)7(9),1129-35,Hamers-Casterman C.等人，Nature(1993)363(6428)446-8)。該等抗體亦涵蓋於本發明抗體之功能性片段之含義中。
(3-8)抗人類ROBO4人類化抗體(下文中之「抗ROBO4人類化抗體」)
根據一態樣，本發明提供人類化抗體或其功能性片段。本發明 抗ROBO4人類化抗體或其功能性片段具有抗血管生成活性，且較佳在活體內具有抗血管生成活性。較佳地，人類化抗體或其功能性片段特異性結合至ROBO4蛋白質。此外，人類化抗體或其功能性片段係針對ROBO4之激動性抗體且活化其下游信號。此外，在活體外在不存在交聯抗體時，人類化抗體或其功能性片段阻抑或抑制血管內皮細胞移行。
本發明人類化抗體之實例可包括MAb1互補決定區(CDR)經非人類動物抗體之CDR替代之人類源抗體(參見Nature(1986)321，第522-525頁)，及藉由CDR移植方法移植有CDR序列且移植有框架區之一些胺基酸殘基之人類抗體(國際公開案第WO90/07861號)。此外，藉由用其他胺基酸殘基取代每一CDR中之1至3個胺基酸殘基衍生自人類化抗體之變體亦包括在本發明抗體中，只要該變體具有活性(3-3)至(3-5)中之所有或一些即可。
本發明抗ROBO4人類化抗體或其功能性片段之較佳實例可包括由以下組成且識別本發明ROBO4蛋白質之抗體及維持該抗體之ROBO4蛋白質結合活性之抗體部分：具有包含以下之可變區之重鏈：由示於SEQ ID NO：44(圖25)之胺基酸序列組成之CDRH1、由示於SEQ ID NO：46(圖26)之胺基酸序列或藉由取代一個胺基酸衍生自胺基酸序列SEQ ID NO：46之胺基酸序列組成之CDRH2以及由示於SEQ ID NO：48(圖27)之胺基酸序列組成之CDRH3；及具有包含以下之可變區之輕鏈：由示於SEQ ID NO：50(圖28)之胺基酸序列或藉由取代1至3個胺基酸衍生自胺基酸序列SEQ ID NO：50之胺基酸序列組成之CDRL1、由示於SEQ ID NO：52(圖29)之胺基酸序列組成之CDRL2以及由示於SEQ ID NO：54(圖30)之胺基酸序列組成之CDRL3。
CDRH2中之胺基酸取代之實例可包括取代CDRH2中示於SEQ ID NO：46之第4號胺基酸之胺基酸。具體而言，可用麩醯胺酸替代天冬醯胺(即SEQ ID NO：46之第4號胺基酸)。欲被取代之胺基酸並不受限，只要所得抗體具有本發明針對ROBO4之抗體展現之活性(3-3)至(3-5)中之所有或一些即可。
CDRL1中之胺基酸取代之實例可包括取代CDRL1中之任何1至3個、較佳3個示於SEQ ID NO：50之第9、11及13號胺基酸之胺基酸。具體而言，可用選自麩胺酸、離胺酸及白胺酸之胺基酸、較佳分別用麩胺酸、離胺酸及白胺酸替代SEQ ID NO：50之絲胺酸(第9號胺基酸)、甘胺酸(第11號胺基酸)及蘇胺酸(第13號胺基酸)。欲被取代之胺基酸並不受限，只要所得抗體具有本發明針對ROBO4之抗體展現之活性(3-3)至(3-5)中之所有或一些即可。
據報導，肽或蛋白質中之天冬醯胺殘基在一些條件中易於經歷脫醯胺(Gerger等人：The Journal of Biological Chemistry，第262卷，第2期，785-794,1987)，因此上述CDR中之胺基酸替代可提高本發明人類化抗體之穩定性。
具有該等CDRH之更佳人類化抗體之重鏈可變區之實例可包括示於SEQ ID NO：56(圖32)之第20至137號胺基酸之胺基酸序列，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別示於SEQ ID NO：56(圖32)之第50至54號胺基酸、第69至85號胺基酸及第118至126號胺基酸；示於SEQ ID NO：58(圖34)之第20至137號胺基酸之胺基酸序列，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別示於SEQ ID NO：58(圖34)之第50至54號胺基酸、第69至85號胺基酸及第118至126號胺基酸；示於SEQ ID NO：60(圖36)之第20至137號胺基酸之胺基酸序列，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別示於SEQ ID NO：60(圖36)之第50至54號胺基酸、第69至85號胺基酸及第118至126號胺基酸；及示於SEQ ID NO：62(圖38)之第20至137號胺基酸之胺基酸序列，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3示 於SEQ ID NO：60(圖38)之第50至54號胺基酸、第69至85號胺基酸及第118至126號胺基酸。具有該等CDRL之更佳人類化抗體之輕鏈可變區之實例可包括示於SEQ ID NO：64(圖40)之第21至134號胺基酸之胺基酸序列，其中CDRL1、CDRL2及CDRL3分別示於SEQ ID NO：64(圖40)之第44至59號胺基酸、第75至81號胺基酸及第114至122號胺基酸；及示於SEQ ID NO：66(圖42)之第21至134號胺基酸之胺基酸序列，其中CDRL1、CDRL2及CDRL3分別示於SEQ ID NO：66(圖42)之第44至59號胺基酸、第75至81號胺基酸及第114至122號胺基酸。
更佳人類化抗體之重鏈可變區與輕鏈可變區之更佳組合之實例可包括：人類化抗體，其包含由示於SEQ ID NO：58(圖34)之第20至137號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈可變區及由示於SEQ ID NO：64(圖40)之第21至134號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈可變區；人類化抗體，其包含由示於SEQ ID NO：58(圖34)之第20至137號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈可變區及由示於SEQ ID NO：66(圖42)之第21至134號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈可變區；人類化抗體，其包含由示於SEQ ID NO：62(圖38)之第20至137號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈可變區及由示於SEQ ID NO：66(圖42)之第21至134號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈可變區；人類化抗體，其包含由示於SEQ ID NO：62(圖38)之第20至137號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈可變區及由示於SEQ ID NO：64(圖40)之第21至134號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈可變區；人類化抗體，其包含由示於SEQ ID NO：56(圖32)之第20至137號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈可變區及由示於SEQ ID NO：64(圖40)之第21至134號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈可變區；及人類化抗體，其包含由示於SEQ ID NO：60(圖36)之第20至137號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈可變區及由示於SEQ ID NO：64(圖40)之第21至134號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈可變區。
包含重鏈可變區與輕鏈可變區之更佳組合之全長人類化抗體之更佳實例可包括：人類化抗體(H-1140)，其包含由示於SEQ ID NO：58(圖34)之第20至463號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈及由示於SEQ ID NO：64(圖40)之第21至239號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈；人類化抗體(H-1143)，其包含由示於SEQ ID NO：58(圖34)之第20至463號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈及由示於SEQ ID NO：66(圖42)之第21至239號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈；人類化抗體(H-2143)，其包含由示於SEQ ID NO：62(圖38)之第20至463號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈及由示於SEQ ID NO：66(圖42)之第21至239號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈；人類化抗體(H-2140)，其包含由示於SEQ ID NO：62(圖38)之第20至463號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈及由示於SEQ ID NO：64(圖40)之第21至239號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈；人類化抗體(H-1040)，其包含由示於SEQ ID NO：56(圖32)之第20至463號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈及由示於SEQ ID NO：64(圖40)之第21至239號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈；及人類化抗體(H-2040)，其包含由示於SEQ ID NO：60(圖36)之第20至463號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈及由示於SEQ ID NO：64(圖40)之第21至239號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈。
本發明最佳抗體係H-1140、H-1143、H-2140及H-2143。
H-1140具有以下性質：1)特異性結合至人類ROBO4且不特異性結合至ROBO1、ROBO2及ROBO3，2)對人類ROBO4之KD值為3.9nM，3)在40℃下維持對人類ROBO4之親和性達4週，4)抑制由一或多種選自VEGF、bFGF、HGF、PDGF-BB及SDF-1、尤其VEGF或bFGF之血管生成因子誘導之HUVEC移行，5)在活體內抑制血管生成，及6)在基於ISPRI Web之免疫原性篩選(EpiVax公司)中具有低免疫原性。
H-1143具有以下性質：1)特異性結合至人類ROBO4且不特異性結合至ROBO1、ROBO2及ROBO3，2)對人類ROBO4之KD值為3.5nM，3)在40℃下維持對人類ROBO4之親和性達4週，4)抑制由一或多種選自VEGF、bFGF、HGF、PDGF-BB及SDF-1、尤其VEGF及bFGF之血管生成因子誘導之HUVEC移行，5)在活體內抑制血管生成，及6)在EpiScreenTM免疫原性測試(Antitope有限公司)中具有低免疫原性。
H-2140具有以下性質：1)特異性結合至人類ROBO4且不特異性結合至ROBO1、ROBO2及ROBO3，2)對人類ROBO4之KD值為1.8nM，3)在40℃下維持對人類ROBO4之親和性達4週，4)抑制由各種血管生成因子(例如VEGF、bFGF、HGF、PDGF-BB及SDF-1，尤其VEGF及bFGF)誘導之HUVEC移行，5)在活體內抑制血管生成，6)在EpiScreenTM免疫原性測試(Antitope有限公司)中具有低免疫原性。
H-2143具有以下性質：1)特異性結合至人類ROBO4且不特異性結合至ROBO1、ROBO2及ROBO3，2)對人類ROBO4之KD值為1.7nM，3)在40℃下維持對人類ROBO4之親和性達4週，4)抑制由各種血管生成因子(例如VEGF、bFGF、HGF、PDGF-BB及SDF-1，尤其VEGF及bFGF)誘導之HUVEC移行，5)在活體內抑制血管生成，6)在EpiScreenTM免疫原性測試(Antitope有限公司)中具有低免疫原性，及7)在向食蟹猴單次玻璃體內注射(2.75mg/眼)後，臨床體徵、體重、食物消耗、血液學、血液化學、病理學、視網膜電描計術不顯示重大變化。
包含與諸如H-1140、H-1143、H-2143、H-2140、H-1040及H-2040等抗體之胺基酸序列具有95%或更高、較佳97%或更高、更佳99%或更高一致性之胺基酸序列之抗體亦包括在本發明抗體中，只要該抗體具有活性(3-3)至(3-5)中之所有或一些即可。此外，具有胺基 酸序列與包含重鏈可變區與輕鏈可變區之組合之抗體或包含重鏈與輕鏈之組合之抗體之CDR一致之CDR，且具有除了與該等抗體具有95%或更高、較佳97%或更高、更佳99%或更高一致性之CDR胺基酸序列以外之胺基酸序列的抗體亦包括在本發明抗體中，只要該抗體具有活性(3-3)至(3-5)中之所有或一些即可。
(3-9)結合至相同位點之抗體
與本發明所提供抗體「結合至相同位點之抗體」亦包括在本發明抗體中。與某一抗體「結合至相同位點之抗體」意指結合至該抗體所識別抗原分子上之位點的另一抗體。若第二抗體結合至第一抗體所結合抗原分子上之部分肽或部分三維結構，則可確定第一抗體及第二抗體結合至相同位點。此外，即使未確定具體結合位點之肽序列或三維結構，亦可藉由確認第二抗體與第一抗體競爭結合至抗原(即第二抗體干擾第一抗體與抗原之結合)來確定第一抗體及第二抗體結合至相同位點。此外，在第一抗體及第二抗體結合至相同位點且第一抗體具有本發明抗體之一態樣之效應特徵(例如抗血管生成活性)時，第二抗體亦有極高可能性具有與該特徵相同之活性。因此，若第二抗ROBO4抗體結合至第一抗ROBO4抗體所結合之位點，則可確定第一抗體及第二抗體結合至ROBO4蛋白質上之相同位點。此外，可藉由確認第二抗ROBO4抗體與第一抗ROBO4抗體競爭結合至ROBO4蛋白質來確定第一抗體及第二抗體係結合至ROBO4蛋白質上之相同位點之抗體。
結合至本發明MAb1所識別ROBO4蛋白質上之位點之抗體亦包括在本發明中。
抗體結合位點可藉由熟習此項技術者熟知之方法(例如免疫分析)來測定。舉例而言，藉由抗原胺基酸序列之適當C-端或N-端截短來製備一系列肽，且研究抗體對該等肽之反應性以大致測定識別位點。然 後，合成較短肽，且可研究抗體對該等肽之反應性以由此測定結合位點。可使用諸如基因重組或肽合成等技術來製備抗原片段肽。
在抗體結合至或識別抗原之部分構象時，可藉由使用X射線結構分析鑑別抗原上毗鄰抗體之胺基酸殘基來測定抗體之結合位點。
(3-10)抗ROBO4抗體或其功能性片段之修飾形式
本發明提供抗體或其功能性片段之修飾形式。本發明抗體或其功能性片段之修飾形式意指提供有化學或生物修飾之本發明抗體或其功能性片段。化學修飾形式包括胺基酸骨架與化學部分偶聯之形式、具有經化學修飾之N-連接或O-連接碳水化合物鏈之形式及諸如此類。該化學部分或形式可具有毒性或細胞毒性。生物修飾形式包括已經歷翻譯後修飾(例如，N-連接或O-連接糖基化、N-端或C-端處理、脫醯胺、天冬胺酸之異構化或甲硫胺酸之氧化)之形式、藉由使用原核宿主細胞表現含有添加至N-端之甲硫胺酸殘基之形式及諸如此類。此一修飾形式亦意欲包括經標記以允許檢測或分離本發明抗體或抗原之形式，例如酶標記形式、螢光標記形式或親和性標記形式。本發明抗體或其功能性片段之此一修飾形式可用於改良本發明原始抗體或其功能性片段之穩定性或血液滯留，降低抗原性，檢測或分離抗體或抗原等。
化學修飾形式中所含化學部分之實例可包括水溶性聚合物，例如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、聚葡糖及聚乙烯醇。
生物修飾形式之實例可包括藉由酶處理、細胞處理或諸如此類修飾之形式、與藉由基因重組添加之另一肽(例如標籤)融合之形式及自表現內源或外源糖鏈修飾酶之宿主細胞製備之形式。
此一修飾可在抗體或其功能性片段之任意位置或期望位置進行。或者，可在其中一個或兩個或更多個位置進行相同修飾或兩種或 更多種不同修飾。
在本發明中，「抗體片段之修飾形式」亦意欲包括甚至「抗體修飾形式之片段」。
舉例而言，有時，已知所培養哺乳動物細胞產生之抗體在其重鏈中缺少羧基端離胺酸殘基(Journal of Chromatography A,705：129-134(1995))。亦已知有時缺失重鏈之2個羧基端胺基酸殘基(即甘胺酸及離胺酸)且新定位在羧基端之脯胺酸殘基經醯胺化(Analytical Biochemistry,360：75-83(2007))。然而，該等重鏈序列中之該缺少或修飾既不影響抗體結合其抗原之能力亦不影響抗體之效應子功能(補體活化、抗體依賴性細胞毒性等)。因此，具有修飾之抗體及該抗體之功能性片段亦包括在本發明抗體中。此一抗體之實例可包括藉由缺失或缺少重鏈羧基端之1個或2個胺基酸衍生自本發明抗體之缺失突變體，以及具有醯胺化殘基(例如，位於重鏈羧基端位點之醯胺化脯胺酸殘基)之缺失突變體。然而，本發明抗體之缺失突變體並不限於上述類型，只要缺失突變體維持結合至抗原之能力及活性(3-3)至(3-5)中之所有或一些即可。構成本發明抗體之兩條重鏈可由選自由全長重鏈及缺失突變體之重鏈組成之群之任一種類型之重鏈組成，或可由選自該群之任兩種類型之組合組成。缺失變體重鏈之定量比率對(例如)產生本發明抗體之所培養哺乳動物細胞之類型及該等細胞之培養條件敏感。作為本發明抗體之主要組份之該等缺失變體重鏈之實例可包括兩條重鏈，其皆缺少一個羧基端胺基酸殘基。所有該等缺失變體皆涵蓋於本發明之抗體變體、抗體之功能性片段或其修飾形式中。
4. 產生抗體之方法 (4-1)使用融合瘤之方法
為製備本發明抗ROBO4抗體，根據Kohler及Milstein之方法自經ROBO4蛋白質免疫之動物之脾分離產生抗ROBO4抗體之細胞(Kohler 及Milstein,Nature(1975)256，第495-497頁，Kennet,R.編輯，Monoclonal Antibody，第365-367頁，Prenum Press,N.Y.(1980))。將細胞與骨髓瘤細胞融合以由此建立融合瘤，且可自該等融合瘤之培養物獲得單株抗體。
(4-1-1)抗原之製備
用於製備抗ROBO4抗體之抗原可根據(例如)本說明書中之其他段落中所述天然或重組ROBO4蛋白質製備方法來獲得。可由此製備之抗原之實例可包括ROBO4蛋白質或包含具有其至少6個保守胺基酸之部分序列之ROBO4蛋白質片段，及其進一步包含任意胺基酸序列或添加至其之載體之衍生物(下文中，統稱為「ROBO4抗原」)。
重組ROBO4抗原可藉由以下方式來製備：用包含編碼ROBO4抗原之胺基酸序列之核苷酸序列之基因轉染宿主細胞，且自該等細胞之培養物收集抗原。可自(例如)具有血管生成之人類或齧齒類動物組織、衍生自該等組織之細胞或細胞培養物純化或分離天然ROBO4抗原。在來自包含編碼ROBO4抗原之胺基酸序列之核苷酸序列之基因的無細胞活體外翻譯系統中獲得之ROBO4抗原亦包括在本發明「ROBO4抗原」中。
(4-1-2)抗ROBO4單株抗體之產生
單株抗體通常係藉由以下步驟來產生：(a)製備抗原，(b)製備產生抗體之細胞，(c)製備骨髓瘤細胞(下文中，稱作「骨髓瘤」)，(d)融合產生抗體之細胞與骨髓瘤，(e)篩選產生所關注抗體之融合瘤組，及(f)獲得單細胞純系(選殖)。
若需要，此產生方法進一步包括(g)，其係培養融合瘤之步驟、 產生移植融合瘤之動物之步驟等；(h)，其係分析或測定單株抗體之生物活性之步驟等。
下文中，將參照該等步驟詳細闡述製備單株抗體之方法。然而，製備抗體之方法並不限於此，且可使用(例如)除了脾細胞及骨髓瘤以外之產生抗體之細胞。
(a)製備抗原之步驟
可根據上文(2-3)中闡述之ROBO4蛋白質製備方法來製備抗原。
(b)製備產生抗體之細胞之步驟
將在步驟(a)中獲得之抗原與諸如弗氏(Freund's)完全或不完全佐劑或硫酸鋁鉀等佐劑混合，且用所得免疫原對實驗室動物進行免疫。可不加限制地使用業內已知的任何用於融合瘤製備方法中之實驗室動物。具體而言，例如，可使用小鼠、大鼠、山羊、綿羊、牛或馬。自欲與所分離產生抗體之細胞融合之易於獲得之骨髓瘤細胞等角度來看，欲進行免疫之動物較佳係小鼠或大鼠。
實際使用之小鼠及大鼠品系並未特別受限。在小鼠情形中，例如，可使用A、AKR、BALB/c、BALB/cAnNCrj、BDP、BA、CE、C3H、57BL、C57BL、C57L、DBA、FL、HTH、HT1、LP、NZB、NZW、RF、R III、SJL、SWR、WB、129。在大鼠情形中，例如，可使用Wistar、Low、Lewis、Sprague-Dawley、ACl、BN或Fischer。
該等小鼠及大鼠可自實驗室動物培育商/經銷商(例如CLEA Japan公司或Charles River Laboratories Japan公司)獲得。
其中，慮及與下文所述骨髓瘤細胞之融合相容性，BALB/c小鼠品系或Wistar及Low大鼠品系係尤佳欲免疫動物。
亦慮及人類與小鼠抗原之間之同源性，亦較佳使用移除自體抗體之生物機制已降低之小鼠，即自身免疫疾病小鼠。
在此背景中，該等小鼠或大鼠在免疫時較佳係5至12週齡，更佳 6至8週齡。
可使用(例如)以下方法用ROBO4蛋白質對動物進行免疫：Weir,D.M.，Handbook of Experimental Immunology第I.II.III.卷，Blackwell Scientific Publications,Oxford(1987)；Kabat,E.A.及Mayer,M.M.,Experimental Immunochemistry,Charles C Thomas Publisher Spigfield,Illinois(1964)。
抗體效價測定方法之實例可包括(但不限於)諸如RIA及ELISA等免疫分析。
衍生自自經免疫動物分離之脾細胞或淋巴球之產生抗體之細胞可根據業內已知之方法來製備，例如以下方法：Kohler等人，Nature(1975)256，第495頁；Kohler等人，Eur.J.Immnol.(1977)6，第511頁；Milstein等人，Nature(1977),266，第550頁；Walsh,Nature,(1977)266，第495頁。
在脾細胞情形中，可採取一般方法，其包括切碎脾，經由不銹鋼網篩過濾細胞，及然後使所得細胞漂浮於伊格爾氏最低必需培養基(Eagle's minimum essential medium，MEM)或諸如此類中以分離產生抗體之細胞。
(c)製備骨髓瘤之步驟
用於細胞融合中之骨髓瘤細胞並未特別受限且可以適合使用之方式選自業內已知之細胞系。慮及自融合細胞選擇融合瘤之便捷性，較佳使用已確立篩選程序之HGPRT(次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶)缺陷系，即小鼠源X63-Ag8(X63)、NS1-ANS/1(NS1)、P3X63-Ag8.U1(P3U1)、X63-Ag8.653(X63.653)、SP2/0-Ag14(SP2/0)、MPC11-45.6TG1.7(45.6TG)、FO、S149/5XXO、BU.1或諸如此類，大鼠源210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3)或諸如此類，或人類源U266AR(SKO-007)、GM1500-GTG-A12(GM1500)、UC729-6、LICR-LOW-HMy2 (HMy2)、8226AR/NIP4-1(NP41)或諸如此類。該等HGPRT缺陷系可得自(例如)美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。
該等細胞系係在適當培養基(例如8-氮雜鳥嘌呤培養基[補充有麩醯胺酸、2-巰基乙醇、慶大黴素(gentamicin)及胎牛血清(下文中，稱作「FCS」)且進一步補充有8-氮雜鳥嘌呤之RPMI-1640培養基]、伊斯考夫改良杜貝克氏培養基(Iscove's modified Dulbecco's medium，下文中，稱作「IMDM」)或杜貝克氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco's modified Eagle medium，下文中，稱作「DMEM」))中繼代培養且在細胞融合之前在正常培養基[例如，ASF104培養基(由Ajinomoto Co.公司製造)，含有10% FCS]中繼代培養3至4天，以在細胞融合當天固定等於或大於2×107個細胞之細胞數。
(d)融合產生抗體之細胞與骨髓瘤細胞之步驟
可根據業內已知之方法(Weir,D.M.,Handbook of Experimental Immunology第I.II.III.卷，Blackwell Scientific Publications,Oxford(1987)；Kabat,E.A.及Mayer,M.M,Experimental Immunochemistry,Charles C Thomas Publisher Spigfield,Illinois(1964)等)在防止細胞活力過度降低之條件下將產生抗體之細胞與骨髓瘤細胞融合。舉例而言，可使用包括在諸如聚乙二醇等聚合物之高濃度溶液中混合產生抗體之細胞與骨髓瘤細胞之化學方法或使用電刺激之物理方法。
(e)篩選產生所關注抗體之融合瘤組之步驟
對於藉由細胞融合獲得之融合瘤之選擇方法並未特別受限，且通常使用HAT(次黃嘌呤-胺基喋呤-胸苷)選擇方法(Kohler等人，Nature(1975)256，第495頁；Milstein等人，Nature(1977)266，第550頁)。此方法使用無法在胺基喋呤存在下存活之HGPRT缺陷性骨髓瘤細胞系有效獲得融合瘤。具體而言，可將未融合細胞及融合瘤在 HAT培養基中培養以由此使得僅抵抗胺基喋呤之融合瘤可選擇性地保留並生長。
(f)獲得單細胞純系(選殖)之步驟
可使用業內已知之方法來選殖融合瘤，例如甲基纖維素、軟瓊脂糖或有限稀釋方法(例如，參見Barbara,B.M.及Stanley,M.S.：Selected Methods in Cellular Immunology,W.H.Freeman and Company,San Francisco(1980))。有限稀釋方法較佳。
(g)培養融合瘤之步驟及產生移植融合瘤之動物之步驟
可培養所選融合瘤以由此產生單株抗體。較佳地，選殖期望融合瘤且隨後進行抗體產生。
可自融合瘤之培養物收集由此融合瘤產生之單株抗體。此外，亦可自經單株抗體基因轉染之細胞之培養物收集重組抗體。此外，可將融合瘤經腹膜內注射至相同品系之小鼠(例如，上述BALB/cAnNCrj)或Nu/Nu小鼠且使其生長。然後，亦可自其腹水收集單株抗體。
(h)分析或測定單株抗體之生物活性之步驟
可根據該目的選擇並施加各種生物學測試。
(4-2)細胞免疫方法
可使用表現天然ROBO4蛋白質之細胞、表現重組ROBO4蛋白質或其片段之細胞或諸如此類作為免疫原以由此藉由上述融合瘤方法製備抗ROBO4抗體。
表現天然ROBO4蛋白質之細胞之實例可包括衍生自患有血管生成性疾病(例如增生性糖尿病性視網膜病變或腫瘤)之患者之細胞及衍生自該等患者之組織之細胞。該等細胞較佳係血管內皮細胞，但並不限於此。該等表現ROBO4蛋白質之細胞係以1×105至1×109個細胞、較佳1×106至1×108個細胞、更佳0.5至2×107個細胞、更佳1×107個細胞之 量用於一次免疫中。進行免疫之細胞數可根據ROBO4蛋白質之表現量來變化。免疫原一般係經腹膜內投與且可經由真皮內途徑或諸如此類來投與。可將闡述於(4-1-2)中之方法施加至融合瘤製備方法。
(4-3)基因重組及宿主細胞
為製備本發明抗體，用包含編碼其重鏈之胺基酸序列之核苷酸序列的核苷酸(重鏈核苷酸)及包含編碼其輕鏈之胺基酸序列之核苷酸序列的核苷酸(輕鏈核苷酸)或用含有重鏈核苷酸插入物之載體及含有輕鏈核苷酸插入物之載體轉染宿主細胞，且隨後進行培養，且可自培養物收集抗體。可將重鏈及輕鏈核苷酸插入一載體中。
可使用原核或真核細胞作為宿主細胞。在使用真核細胞作為宿主時，可使用動物細胞、植物細胞或真核微生物。
動物細胞之實例可包括哺乳動物源細胞，即猴源COS細胞(Gluzman,Y.Cell(1981)23，第175-182頁，ATCC CRL-1650)、小鼠成纖維細胞NIH3T3(ATCC編號CRL-1658)、小鼠NS0細胞系(ECACC)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞，ATCC CCL-61)、其二氫葉酸還原酶缺陷系(CHOdhfr-：Urlaub,G.及Chasin,L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77，第4126-4220頁)、由Lonza Biologics研發之CHOK1SV；衍生自諸如雞等鳥類之細胞及衍生自昆蟲之細胞。
同樣，本發明宿主細胞包括可產生抗體蛋白質之細胞，其中附接至抗體蛋白質之糖鏈之結構經修飾，其中具有該修飾之抗體之生物活性與無該修飾之抗體相比較佳有所增強。本發明該等宿主細胞之實例包括可產生具有結合至抗體Fc區之複雜N-糖苷連接糖鏈之抗體蛋白質的CHO細胞，其中在結合至抗體Fc區之總複雜N-糖苷連接糖鏈之間，其中岩藻糖未結合至糖鏈還原末端中之N-乙醯葡萄糖胺之糖鏈之比率係20%或更高(WO2000/61739、WO2002/31140)。
真核微生物之實例可包括酵母。原核細胞之實例可包括大腸桿 菌(E.coli)及枯草桿菌(Bacillus subtilis)。
較佳使用哺乳動物源細胞，更佳使用CHO細胞，且更佳使用CHOK1SV作為產生本發明抗ROBO4抗體之宿主細胞。
用於分泌本發明抗體(衍生自各種動物物種之單株抗體、大鼠抗體、小鼠抗體、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體等)之信號肽並不限於與抗體具有相同物種、相同類型及相同亞型之抗體分泌信號，或並不限於抗體本身之分泌信號。可選擇並使用與其具有不同類型或亞型之任何抗體分泌信號或衍生自與其不同之真核物種或原核物種之蛋白質之任何分泌信號。
(4-4)設計及製備人類化抗體之方法
人類化抗體之實例可包括(但不限於)CDR經非人類動物抗體之CDR替代之人類源抗體(參見Nature(1986)321，第522-525頁)、藉由CDR移植方法移植有CDR序列且移植有框架區之一些胺基酸殘基之人類抗體(參見WO90/07861及US6972323)以及在該等人類化抗體中之任一者中有人類抗體胺基酸被替代為一個或兩個或更多個非人類動物抗體源胺基酸之抗體。
(4-5)製備人類抗體之方法
本發明抗體之其他實例可包括人類抗體。抗ROBO4人類抗體意指由人類源抗體之胺基酸序列組成之抗ROBO4抗體。抗ROBO4人類抗體可藉由使用攜載包含編碼人類抗體重鏈及輕鏈之基因之人類基因組DNA片段且產生人類抗體之小鼠的方法來獲得(參見Tomizuka,K.等人，Nature Genetics(1997)16，第133-143頁；Kuroiwa,Y.等人，Nuc.Acids Res.(1998)26，第3447-3448頁；Yoshida,H.等人，Animal Cell Technology：Basic and Applied Aspects第10卷，第69-73頁(Kitagawa,Y.、Matuda,T.及Iijima,S.編輯)，Kluwer Academic Publishers,1999.；Tomizuka,K.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97，第 722-727頁等)。
具體而言，該等產生人類抗體之動物可藉由以下方式來製備：斷裂非人類哺乳動物之內源免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因座且經由酵母人工染色體(YAC)載體或諸如此類向其中引入人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因座作為代替。或者，藉由基因重組技術用此一人類抗體之編碼重鏈及輕鏈之cDNA、較佳用包含該等cDNA中之每一者之載體轉化真核細胞，且培養產生重組人類單株抗體之經轉化細胞。此抗體可自培養上清液獲得。
在此背景中，例如，可使用真核細胞、較佳哺乳動物細胞(例如CHO細胞、淋巴球或骨髓瘤)作為宿主。
同樣，已知用於獲得選自人類抗體文庫之噬菌體展示源人類抗體之方法(參見Wormstone,I.M.等人，Investigative Ophthalmology & Visual Science.(2002)43(7)，第2301-2308頁；Carmen,S.等人，Briefings in Functional Genomics and Proteomics(2002),1(2)，第189-203頁；Siriwardena,D.等人，Opthalmology(2002)109(3)，第427-431頁等)。
舉例而言，可使用噬菌體展示方法(Nature Biotechnology(2005),23,(9)，第1105-1116頁)，其涉及使人類抗體之可變區可在噬菌體表面上作為單鏈抗體(scFv)來表現及選擇結合至抗原之噬菌體。
基於噬菌體與抗原之結合選擇之噬菌體可經受基因分析以由此測定編碼結合至抗原之人類抗體之可變區之DNA序列。
若測定結合至抗原之scFv之DNA序列，則製備具有此序列之表現載體且可用該表現載體轉染適當宿主並使其可表現人類抗體(WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、W093/11236、W093/19172、WO95/01438、W095/15388；Annu.Rev.Immunol(1994)12，第433-455頁，Nature Biotechnology(2005)23(9)，第1105- 1116頁)。
(4-6)製備抗體之功能性片段之方法
製備單鏈抗體之方法為業內所熟知(例如，參見美國專利第4,946,778號、第5,260,203號、第5,091,513號及第5,455,030號)。在此scFv中，經由防止重鏈可變區及輕鏈可變區形成偶聯物之連接體、較佳多肽連接體連接重鏈可變區及輕鏈可變區(Huston,J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988),85，第5879-5883頁)。scFv中之重鏈可變區及輕鏈可變區可衍生自相同抗體或可衍生自不同抗體。
舉例而言，使用由12至19個殘基組成之任意單鏈肽作為連接該等可變區之多肽連接體。
為獲得編碼scFv之DNA，在編碼抗體之重鏈或重鏈可變區之DNA及編碼其輕鏈或輕鏈可變區之DNA之序列中，使用編碼完整或期望胺基酸序列之每一DNA部分作為模板且使用側接模板之兩個末端之引物對藉由PCR進行擴增。隨後，將編碼多肽連接體部分之DNA與側接其兩個末端之引物對之組合進一步擴增以將其分別連接至重鏈及輕鏈。
可使用編碼scFv之DNA以由此根據常規方法製備含有該DNA之表現載體及經該表現載體轉化之宿主細胞。另外，培養宿主細胞，且可根據常規方法自培養物收集scFv。
同樣，為獲得抗體之其他功能性片段，根據上述方法獲得編碼每一功能性片段之基因，且用該基因轉染細胞。可自細胞培養物收集所關注功能性片段。
可使本發明抗體多聚化以由此增強其對抗原之親和性。欲多聚化之抗體可係一種類型之抗體或可係複數種分別識別複數種表位或相同抗原之抗體。抗體多聚化方法之實例可包括使兩個scFv結合至IgG CH3結構域，使其結合至抗生蛋白鏈菌素，及引入螺旋-轉角-螺旋基 序。
本發明抗體可係複數種類型之胺基酸序列不同之抗ROBO4抗體之混合物，即多株抗體。多株抗體之實例可包括複數種類型之一部分或全部CDR組不同之抗體之混合物。此一多株抗體可自混合培養之產生不同抗體之細胞之培養物收集(WO2004/061104)。此外，可混合分開製備之抗體。此外，可藉由以下方式來製備抗血清(其係多株抗體之一態樣)：用期望抗原對動物進行免疫且根據標準方法自動物收集血清。
亦可使用與諸如聚乙二醇(PEG)等各種分子偶聯之抗體作為抗體之修飾形式。
本發明抗體可進一步為由該等抗體與其他藥物形成之任一偶聯物(免疫偶聯物)。此一抗體之實例可包括與放射性材料或具有藥理學效應之化合物偶聯之抗體(Nature Biotechnology(2005)23，第1137-1146頁)。
(4-7)抗體之純化
可將所得抗體純化至同質程度。可使用常用蛋白質分離及純化方法來分離並純化抗體。
可藉由適當選擇或組合之方法(例如但不限於層析管柱、過濾器、超濾、鹽析、透析、製備型聚丙烯醯胺凝膠電泳及/或等電聚焦(Strategies for Protein Purification and Charcterization：A Laboratoy Course Manual,Daniel R.Marshak等人編輯，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual.，Harlow及David Lane編輯，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)))來分離並純化抗體。
層析之實例包括親和層析、離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、反相層析及吸附層析。
該等層析方法可使用諸如HPLC或FPLC等液相層析來實施。
用於親和層析之管柱之實例可包括蛋白質A管柱、蛋白質G管柱及抗原管柱。
蛋白質A管柱之實例包括Hyper D(由Pall公司製造)、POROS(由Applied Biosystems公司製造)及Sepharose F.F.(由GE Healthcare Bio-Sciences公司製造)。
同樣，可基於抗體針對抗原之結合活性使用抗原固定載體來純化抗體。
本發明甚至提供編碼本發明抗體或其功能性片段或其修飾形式之基因，含有該基因之插入物之重組載體，經該基因或該載體轉染之細胞，及產生本發明抗體之細胞。
藉由方法(4-1)至(4-6)中之任一者產生之抗體或其功能性片段可包括於本發明中。
5. 醫藥組合物
本發明提供包含抗ROBO4抗體或其功能性片段或其修飾形式之醫藥組合物。
本發明醫藥組合物可用於治療或預防疾病，該疾病在發作、進展及/或惡化過程期間顯示血管生成作為一種病理學發現且可藉由阻抑此血管生成或血管滲透性來改良(下文中，為便捷起見，將此疾病稱作「血管生成性疾病」)。血管生成性疾病之實例可包括滲出性年齡相關性黃斑點退化、糖尿病性視網膜病變、黃斑水腫、良性或惡性腫瘤、動脈粥樣硬化、晶狀體後纖維組織增生、血管瘤、慢性發炎、新生血管性眼病、增生性視網膜病變、新生血管性青光眼、角膜組織移植物或其他組織移植物之免疫排斥、類風濕性關節炎、牛皮癬、急性發炎、敗血症及肥胖症。本發明醫藥組合物可用作治療或預防血管生成性疾病之藥劑，較佳可用於治療或預防滲出性年齡相關性黃斑點 退化、糖尿病性視網膜病變、黃斑水腫、良性或惡性腫瘤、晶狀體後纖維組織增生、新生血管性眼病、增生性視網膜病變、新生血管性青光眼及角膜組織移植物之免疫排斥，更佳可用於治療或預防滲出性年齡相關性黃斑點退化、糖尿病性視網膜病變、黃斑水腫、良性或惡性腫瘤、晶狀體後纖維組織增生、新生血管性眼病、增生性視網膜病變及新生血管性青光眼。
在本發明中，治療及/或治療疾病包括(但不限於)預防疾病、較佳表現ROBO4蛋白質之個體之疾病發作，阻抑或抑制其惡化或進展，減輕患有該疾病之個體展現之一種或兩種或更多種症狀，阻抑或緩和其惡化或進展，治療或預防繼發性疾病及諸如此類。
本發明醫藥組合物可含有治療或預防有效量之抗ROBO4抗體或該抗體之功能性片段及醫藥上可接受之稀釋劑、媒劑、增溶劑、乳化劑、防腐劑及/或添加劑。
「治療或預防有效量」意指藉助特定劑型及投與途徑發揮對特定疾病之治療或預防效應之量。
本發明醫藥組合物可含有用於改變、維持或保持組合物或其中所含抗體之pH、滲透壓、黏度、透明度、顏色、張力、無菌度或穩定性、溶解度、持續釋放、吸附能力、滲透性、劑型、強度、性質、形狀等之材料(下文中，稱作「醫藥材料」)。醫藥材料並未特別受限，只要其係藥理學上可接受之材料即可。舉例而言，該等醫藥材料較佳具有無毒性或低毒性之性質。
醫藥材料之實例可包括(但不限於)以下材料：胺基酸，例如甘胺酸、丙胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸及離胺酸；抗微生物劑；抗氧化劑，例如抗壞血酸、硫酸鈉及亞硫酸氫鈉；緩衝液，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽或硼酸鹽緩衝液、碳酸氫鈉及Tris-HCl溶液；填充劑，例如甘露醇及甘胺酸；螯合劑，例如乙二胺四乙酸 (EDTA)；錯合劑，例如咖啡因、聚乙烯基吡咯啶、β-環糊精及羥丙基-β-環糊精；增積劑，例如葡萄糖、甘露糖及糊精；其他烴，例如單糖、二糖、葡萄糖、甘露糖及糊精；著色劑；矯味藥；稀釋劑；乳化劑；親水聚合物，例如聚乙烯基吡咯啶；低分子量多肽；成鹽性抗衡離子；殺菌劑，例如氯化苄烷銨(benzalkonium chloride)、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞(thimerosal)、苯乙醇、對羥苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸丙酯、氯己定(chlorhexidine)、山梨酸及過氧化氫；溶劑，例如甘油、丙二醇及聚乙二醇；糖醇，例如甘露醇及山梨醇；懸浮劑；表面活性劑，例如PEG、山梨醇酐酯、聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20及聚山梨醇酯80)、曲拉通(triton)、胺基丁三醇(tromethamine)、卵磷脂及膽固醇；穩定性增強劑，例如蔗糖及山梨醇；彈性增強劑，例如氯化鈉、氯化鉀、甘露醇及山梨醇；運輸劑；稀釋劑；賦形劑；及/或醫藥添加劑。
所添加該等醫藥材料之量為抗ROBO4抗體或其功能性片段或其修飾形式之重量之0.001至1000倍、較佳0.01至100倍、更佳0.1至10倍。
含有免疫脂質體(包含囊封於脂質體中之抗ROBO4抗體或其功能性片段或其修飾形式或包含與脂質體偶聯之抗體之經修飾抗體形式(美國專利第6214388號等))之醫藥組合物亦包括在本發明醫藥組合物中。
賦形劑或媒劑並未特別受限，只要其係常用於注射用水、鹽水、人工腦脊髓液及用於經口或非經腸投與之其他製劑之液體或固體材料即可。鹽水之實例可包括中性鹽水及含有血清白蛋白之鹽水。
緩衝液之實例可包括經調節以使醫藥組合物之最終pH達到7.0至8.5之Tris緩衝液、經調節以使其最終pH達到4.0至5.5之乙酸鹽緩衝液、經調節以使其最終pH達到5.0至8.0之檸檬酸鹽緩衝液及經調節以 使其最終pH達到5.0至8.0之組胺酸緩衝液。
本發明醫藥組合物係固體、液體、懸浮液或諸如此類。本發明醫藥組合物之另一實例可包括冷凍乾燥製劑。冷凍乾燥製劑可使用諸如蔗糖等賦形劑來形成。
本發明醫藥組合物之投與途徑可為經腸投與、局部投與及非經腸投與中之任一者，且較佳可根據目標疾病來選擇。其具體實例可包括靜脈內投與、動脈內投與、肌內投與、真皮內投與、皮下投與、腹膜內投與、經皮投與、骨內投與及關節內投與。同樣，眼內投與較佳可用於眼部血管生成性疾病，例如滲出性年齡相關性黃斑點退化、糖尿病性視網膜病變、黃斑水腫、晶狀體後纖維組織增生、新生血管性眼病、增生性視網膜病變、新生血管性青光眼或角膜組織移植物之免疫排斥。
醫藥組合物之配方可根據投與方法、抗體對ROBO4蛋白質之結合親和性等來確定。對ROBO4蛋白質具有較高親和性(較低KD值)之本發明抗ROBO4抗體或其功能性片段或其修飾形式可在較低劑量下發揮其藥物效力。
本發明抗ROBO4抗體之劑量可根據個體之物種、疾病類型、症狀、性別、年齡、既存病況、抗體對ROBO4蛋白質之結合親和性或其生物活性及其他因素來適當地確定。可每天至180天一次或一天兩次或三次或更多次投與通常0.01至1000mg/kg、較佳0.1至100mg/kg之劑量。
醫藥組合物之形式之實例可包括注射劑(包括冷凍乾燥製劑及滴劑)、栓劑、經鼻吸收製劑、經皮吸收製劑、舌下調配物、膠囊、錠劑、軟膏劑、粒劑、氣溶膠、丸劑、粉劑、懸浮液、乳液、眼滴劑及生物植入體調配物。
包含本發明抗ROBO4抗體或其功能性片段或其修飾形式作為活 性成份之醫藥組合物可與另一治療劑或預防劑組合使用。該藥劑之實例包括抗血管生成藥物、抗炎藥物及/或抗癌藥物。舉例而言，將抗血管生成藥物、抗炎藥物及/或抗癌藥物投與個體，且隨後向其投與包含抗ROBO4抗體或該抗體之功能性片段作為活性成份之醫藥組合物。或者，將醫藥組合物投與個體，且隨後向其投與抗血管生成藥物、抗炎藥物及/或抗癌藥物。或者，可將醫藥組合物與抗血管生成藥物、抗炎藥物及/或抗癌藥物同時投與個體。抗血管生成藥物之實例可包括蘭尼單抗(ranibizumab)。
本發明甚至提供用於治療或預防血管生成性疾病之方法，該血管生成性疾病係例如滲出性年齡相關性黃斑點退化、糖尿病性視網膜病變、黃斑水腫、良性或惡性腫瘤、動脈粥樣硬化、晶狀體後纖維組織增生、血管瘤、慢性發炎、新生血管性眼病、增生性視網膜病變、新生血管性青光眼、角膜組織移植物或其他組織移植物之免疫排斥、類風濕性關節炎、牛皮癬、急性發炎、敗血症或肥胖症；本發明抗體用於製備治療或預防該血管生成性疾病之醫藥組合物之用途；及本發明抗體用於治療或預防該血管生成性疾病之用途。用於治療或預防之包含本發明抗體之套組亦包括在本發明中。
6. 診斷用組合物
本發明提供用於檢查或診斷之包含本發明抗ROBO4抗體或其功能性片段或其修飾形式之組合物(下文中，統稱為「診斷用組合物」)。
本發明診斷用組合物可用於檢查或診斷血管生成性疾病，例如滲出性年齡相關性黃斑點退化、糖尿病性視網膜病變、黃斑水腫、良性或惡性腫瘤、動脈粥樣硬化、晶狀體後纖維組織增生、血管瘤、慢性發炎、新生血管性眼病、增生性視網膜病變、新生血管性青光眼、角膜組織移植物或其他組織移植物之免疫排斥、類風濕性關節炎、牛 皮癬、急性發炎、敗血症或肥胖症。本發明診斷用組合物亦可用於檢查或診斷不符合習用診斷準則之早期血管生成或血管生成前期(pre-angiogenesis)症狀、會發展成血管生成之未診斷症狀等。在本發明中，檢查或診斷包括(例如)測定或測試獲得疾病之風險，測定存在或不存在疾病，測試進展或惡化程度，測試或測定使用包含抗ROBO4抗體或諸如此類之醫藥組合物之藥物療法之效應，測試或測定除了藥物療法以外之療法之效應，測試復發風險及測定存在或不存在復發。然而，本發明檢查或診斷並不限於此，只要其係常用檢查或診斷即可。
當在衍生自測試個體之樣品中以與衍生自健康個體之樣品相比為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20倍或更多量、較佳10倍或更多量檢測到ROBO4蛋白質時，可將測試個體診斷為患有血管生成性疾病或診斷為正處於高患病風險中。此外，在ROBO4蛋白質之血清濃度超過特定參考值時，將測試個體診斷為患有血管生成性疾病或可診斷為正處於高患病風險中。參考值通常為0.01至10ng/ml、較佳0.1至1ng/ml、更佳0.1至0.3ng/ml。
此一診斷用組合物可含有pH緩衝液、滲透壓調節劑、鹽、穩定劑、殺菌劑、顯色劑、敏化劑、凝集抑制劑及諸如此類。
本發明甚至提供檢查或診斷諸如以下等血管生成性疾病之方法：滲出性年齡相關性黃斑點退化、糖尿病性視網膜病變、黃斑水腫、良性或惡性腫瘤、動脈粥樣硬化、晶狀體後纖維組織增生、血管瘤、慢性發炎、新生血管性眼病、增生性視網膜病變、新生血管性青光眼、角膜組織移植物或其他組織移植物之免疫排斥、類風濕性關節炎、牛皮癬、急性發炎、敗血症或肥胖症；本發明抗體用於製備用於診斷血管生成性疾病之組合物之用途；及本發明抗體用於檢查或診斷 血管生成性疾病之用途。用於檢查或診斷之包含本發明抗體之套組亦包括在本發明中。
涉及本發明抗體之檢查或診斷方法較佳係夾心型ELISA。可使用利用抗體之常用檢測方法，例如ELISA、RIA、ELISPOT(酶聯免疫斑點)分析、斑點印跡法、歐氏測試或CIE(對流免疫電泳)。施加至夾心型ELISA分析系統之抗體可為兩種識別ROBO4但不彼此競爭之抗體之任一組合。除了生物素以外，可使用可在生物化學分析中實施之標記方法(例如HRP、鹼性磷酸酶或FITC)作為抗體之標記方法。可在使用酶促標記之檢測中使用發色受質，例如TMB(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)、BCIP(磷酸5-溴-4-氯-3-吲哚基酯)、p-NPP(磷酸對硝基苯基酯)、OPD(鄰苯二胺)、ABTS(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、SuperSignal ELISA Pico化學發光受質(Thermo Fisher Scientific公司)、螢光受質(例如QuantaBlu(TM)螢光團過氧化物酶受質(Thermo Fisher Scientific公司))及化學發光受質。衍生自人類或非人類動物之樣品以及經人工處理之樣品(例如重組蛋白質)可經受此分析。衍生自生物體個體之測試樣品之實例可包括(但不限於)血液、滑液、腹水、淋巴、腦脊髓液及組織勻漿上清液。
用於檢查或診斷之包含本發明抗體之夾心型ELISA套組可含有ROBO4蛋白質標準品溶液、著色劑、稀釋用緩衝溶液、固相用抗體、檢測用抗體及洗滌溶液及諸如此類。結合至抗原之抗體之量較佳可使用諸如吸光度、螢光、發光或RI(放射性同位素)方法等方法來量測。在量測中較佳使用吸光度讀板儀、螢光讀板儀、發光讀板儀、RI液體閃爍計數器或諸如此類。
[實例]
下文中，將參照實例更詳細地闡述本發明。然而，並不意欲將本發明限制於此。
在下文實例中，除非另外指明，否則遺傳改造之每一操作皆係藉由「Molecular Cloning」(Sambrook,J.、Fritsch,E.F.及Maniatis,T.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述之方法或熟習此項技術者使用之其他實驗手冊中所述之方法來實施，或係根據所用市售試劑或套組之說明書來實施。
(實例1)表現載體之製備
1)-1人類ROBO4表現載體之製備
1)-1-1全長人類ROBO4表現載體之製備
用EcoRV及NotI使人類ROBO4 cDNA自包含人類ROBO4 cDNA之質體(由Open Biosystems製造)(登錄號BC039602)裂解且將其納入pCI載體(由Promega公司製造)之EcoRV與NotI之間以製備全長人類ROBO4表現載體(下文中，稱作「pCI-hROBO4」)。在此載體中選殖之人類ROBO4基因之序列顯示於SEQ ID NO：1中。同樣，人類ROBO4之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：2中。
1)-1-2人類ROBO4胞外區表現載體之製備
經由PCR反應使用以下引物組來擴增編碼人類ROBO4胞外區多肽(由示於SEQ ID NO：2之第1至461號胺基酸之胺基酸序列組成；下文中，縮寫為「人類ROBO4-ECD」)之cDNA：引物1F：5'-aaaggtaccaccatgggctctggaggagacagcctcctg-3'及引物1R：5'-aaagatatcctgctccagggtccagggaccatgctcact-3'
將所得PCR產物選殖至pEF6/V5-His-TOPO載體(由Life Technologies公司製造)中(下文中，所得載體縮寫為「pEF6- ROBO4-ECD」；下文中，由「pEF6-ROBO4-ECD」表現之重組蛋白質稱作「rROBO4-ECD」)。
1)-1-3 N-端加FLAG標籤之全長人類ROBO4及人類ROBO4胞外區/結構域缺失變體表現載體之製備
為構築用於表現N-端加FLAG標籤之蛋白質(包含以下區域：由示於人類ROBO4之SEQ ID NO：2之第28至1007號胺基酸之胺基酸序列組成之區域(在圖式中，此區域稱作「hROBO4-28」)、由示於其第46至1007號胺基酸之胺基酸序列組成之區域(在圖式中，此區域稱作「hROBO4-46」)、由示於其第132至1007號胺基酸之胺基酸序列組成之區域(在圖式中，此區域稱作「hROBO4-132」)、由示於其第210至1007號胺基酸之胺基酸序列組成之區域(在圖式中，此區域稱作「hROBO4-210」)、由示於其第225至1007號胺基酸之胺基酸序列組成之區域(在圖式中，此區域稱作「hROBO4-225」)或由示於其第341至1007號胺基酸之胺基酸序列組成之區域(在圖式中，此區域稱作「hROBO4-341」))之載體，以pCI-hROBO4作為模板使用以下每一引物組來實施PCR反應：用於hROBO4-28擴增之引物組：引物2F：5'- 及引物2R：5'-gctagcggagtaatctacaggagaagcaccagccttg-3'，用於hROBO4-46擴增之引物組：引物3F：5'- 及引物2R
用於hROBO4-132擴增之引物組：引物4F：5'- 及引物2R，用於hROBO4-210擴增之引物組：引物5F：5'- 及引物2R，用於hROBO4-225擴增之引物組：引物6F：5'- 及引物2R，用於hROBO4-341擴增之引物組：引物7F：5'- 及引物2R。將所得PCR產物納入pCR4鈍端-TOPO載體(由Life Technologies公司製造)中以製備選殖載體。用KpnI及NheI使相應cDNA裂解離開每一選殖載體且將其納入pCI載體之KpnI與NheI之間以製備N-端加FLAG標籤之全長人類ROBO4表現載體及四種人類ROBO4胞外區/結構域缺失變體表現載體。N-端加FLAG標籤之全長人類 ROBO4載體係由自N-端起編碼ROBO4之信號序列(SEQ ID NO：2之第1至27號胺基酸之胺基酸)+FLAG序列(DYKDDDDK)+ROBO4(SEQ ID NO：2之第28至1007號胺基酸之胺基酸)之核苷酸組成。下文中，用於表現N-端加FLAG標籤之全長人類ROBO4之載體稱作「pCI-FLAG-hROBO4-28」。在人類ROBO4胞外區/結構域缺失變體表現載體中，例如，用於表現由SEQ ID NO：2之第46至1007號胺基酸組成之ROBO4之載體係由編碼ROBO4之信號序列(SEQ ID NO：2之第1至27號胺基酸之胺基酸)+FLAG序列(DYKDDDDK)+胞外區缺失之ROBO4(SEQ ID NO：2之第46至1007號胺基酸之胺基酸)之核苷酸組成。此載體稱作「pCI-hROBO4-46」。同樣，編碼在ROBO4之胞外區中具有部分缺失之ROBO4之載體分別稱作「pCI-hROBO4-132」、「pCI-hROBO4-210」、「pCI-hROBO4-225」及「pCI-hROBO4-341」。
選殖於載體中之編碼加FLAG標籤之全長人類ROBO4或人類ROBO4之每一胞外區/結構域缺失變體之胺基酸序列之核苷酸序列顯示於SEQ ID NO：3、5、7、9、11或13中。同樣，相應加FLAG標籤之全長人類ROBO4或人類ROBO4之胞外區/結構域缺失變體之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：4、6、8、10、12或14中。
1)-1-4人類ROBO4胞內區缺失變體表現載體之製備
為構築用於表現包含由示於人類ROBO4之SEQ ID NO：2之第1至511號胺基酸的胺基酸序列組成之區域(下文中，此區域稱作「hROBO4-△C」)之蛋白質的載體，以pCI-hROBO4作為模板緊鄰編碼人類ROBO4之第511號胺基酸之密碼子後插入終止密碼子，其中使用用於hROBO4-△C之引物組：引物8F：5'-cagatataccagtgaggatgcctgaatcctaaaacacaggatggatc-3'及引物8R：5'-gatccatcctgtgttttaggattcaggcatcctcactggtatatctg-3'，及QuikChange XL定點誘變套組(由Agilent Technologies公司製 造)以製備hROBO4-AC表現載體(下文中，稱作「pCI-hROBO4-△C」)。
1)-2小鼠ROBO4表現載體之製備
以小鼠心臟QUICK-純系cDNA(由Takara Bio公司製造)作為模板使用以下引物組來實施PCR反應：引物9F：5'-ggtaccgccatgggacaaggagaggagccgagagcagccatg-3'及引物9R：5'-gcggccgcggaggaatcaccagccttgggcacagcaccag-3'
將所得PCR產物納入pCR-鈍端II-TOPO載體(由Life Technologies公司製造)中以製備包含小鼠ROBO4 cDNA之選殖載體。用KpnI及NotI使小鼠ROBO4 cDNA裂解離開選殖載體且將其納入pCI載體之KpnI與NotI之間以製備小鼠ROBO4表現載體(下文中，稱作「pCI-mROBO4」)。在此載體中選殖之小鼠ROBO4基因中ORF位點之序列顯示於SEQ ID NO：15之第7至3051號核苷酸中。同樣，小鼠ROBO4之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：16中。
1)-3大鼠ROBO4表現載體之製備以大鼠脾QUICK-純系cDNA(由Takara Bio公司製造)作為模板使用以下引物組實施PCR反應：引物10F：5'-ggtaccgccatgggacaaggagaggagctgagagcagcc-3'及引物10R：5'-gcggccgcggaggaatcaccagccttgggcacaacacc-3'
將所得PCR產物納入pCR4鈍端-TOPO載體中以製備包含大鼠ROBO4 cDNA之選殖載體。用KpnI及NotI使大鼠ROBO4 cDNA裂解離開選殖載體且將其納入pCI載體之Kpnl及NotI之間以製備大鼠ROBO4表現載體(下文中，稱作「pCI-raROBO4」)。大鼠ROBO4 cDNA之核苷酸序列顯示於SEQ ID NO：17中。由此核苷酸序列編碼之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：18中。
1)-4 N-端加FLAG標籤之食蟹猴ROBO4表現載體之製備
以自食蟹猴腎總RNA合成之cDNA作為模板使用以下引物組實施 PCR反應：引物11F：5'-ggtaccgccatgggctctggaggagaaagcctccggg-3'及引物11R：5'-ggagtaatctacaggagaagcaccagccttg-3'
將所得PCR產物納入pCR4鈍端-TOPO載體中以製備兩種類型之包含每一食蟹猴ROBO4 cDNA(下文中，稱作cynoROBO4-1或cynoROBO4-2)之選殖載體(下文中，該等載體分別稱作pCR-cynoROBO4-1及pCR-cynoROBO4-2)。
之後，以pCR-cynoROBO4-1或pCR-cynoROBO4-2作為模板使用以下引物組實施PCR反應：引物12F：5'-ggatccgccatgggctctggaggagaaagcctccg-3'及引物12R：5'-gcggccgctcaggagtaatctacaggagaagcaccagccttg-3'
將所得PCR產物納入pCR4鈍端-TOPO載體中以製備包含每一食蟹猴ROBO4 cDNA之選殖載體。用BamHI及NotI使相應食蟹猴ROBO4 cDNA裂解離開選殖載體且將其納入pCI載體之BamHI及NotI之間以製備兩種類型之食蟹猴ROBO4表現載體(下文中，分別稱作pCI-cynoROBO4-1及pCI-cynoROBO4-2)。
之後，以pCI-cynoROBO4-1或pCI-cynoROBO4-2作為模板使用以下引物組實施PCR反應：引物13F：5'- 及引物12R。
將所得PCR產物納入pCR-TOPO載體(由Life Technologies公司製造)中以製備包含N-端加FLAG標籤之食蟹猴ROBO4 cDNA之每一選殖載體。用KpnI及NotI使相應食蟹猴ROBO4 cDNA裂解離開選殖載體且 將其納入pCI載體之KpnI與NotI之間以製備N-端加FLAG標籤之食蟹猴ROBO4表現載體(下文中，分別稱作「pCI-FLAG-cynoROBO4-1」及「pCI-FLAG-cynoROBO4-2」)。在pCI-FLAG-cynoROBO4-1及pCl-FLAG-cynoROBO4-2之每一者中選殖之食蟹猴ROBO4 cDNA之核苷酸序列分別顯示於SEQ ID NO：19及21中。由每一核苷酸序列編碼之胺基酸序列分別顯示於SEQ ID NO：20及22中。
1)-5 N-端加FLAG標籤之人類ROBO1表現載體之製備
以人類心臟QUICK-純系cDNA(由Takara Bio公司製造)作為模板使用以下引物組實施PCR反應：引物13F：5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcaccatgattgcggagcccgctcacttttacctg-3'及引物13R：5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcgctttcagtttcctctaattcttc-3'
使所得PCR產物及pDONR221載體(由Life Technologies公司製造)經受BP反應以製備包含人類ROBO1 cDNA之供體載體。
之後，以供體載體作為模板使用以下引物組實施PCR反應：引物14F：5'- 及引物14R：5'-gctagctcagctttcagtttcctctaattcttc-3'
將所得PCR產物納入pCR4鈍端-TOPO載體中以製備包含N-端加FLAG標籤之人類ROBO1 cDNA之選殖載體。用NheI及NotI使N-端加FLAG標籤之人類ROBO1 cDNA裂解離開選殖載體且將其納入pCI載體之NheI及NotI之間以製備表現載體(下文中，稱作「pCI-FLAG-hROBO1」)。N-端加FLAG標籤之人類ROBO1 cDNA之核苷酸序列顯示於SEQ ID NO：23中。由此核苷酸序列編碼之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：24中。
1)-6人類ROBO2表現載體之製備
以人類肺QUICK-純系cDNA(由Takara Bio公司製造)作為模板使用以下引物組實施PCR反應：引物15F：5'-gcggccgcatgagtctgctgatgtttacacaactactg-3'及引物15R：5'-gctagcctataattcacctgtaaactgtccttgactgttg-3'
將所得PCR產物納入pCR4鈍端-TOPO載體中以製備包含人類ROBO2 cDNA之選殖載體。用NotI及NheI使人類ROBO2 cDNA裂解離開選殖載體且將其納入pCI載體之NotI與NheI之間以製備表現載體(下文中，稱作「pCI-hROBO2」)。人類ROBO2 cDNA之核苷酸序列顯示於SEQ ID NO：25中。由此核苷酸序列編碼之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：26中。
1)-7人類ROBO3表現載體之製備
以人類ROBO3/pENTR223.1(由Open Biosystems製造)作為模板使用以下引物組實施PCR反應：引物16F：5'-gcggccgcatgctgcgctacctgctgaaaacgctgctg-3'及引物16R：5'-gctagctcatcttggttcctctcggcgtttctgtcc-3'
將所得PCR產物納入pCR4鈍端-TOPO載體中以製備包含人類ROBO3 cDNA之選殖載體。用NotI及NheI使人類ROBO3 cDNA裂解離開選殖載體且將其納入pCI之NotI與NheI之間載體中以製備表現載體(下文中，稱作「pCI-hROBO3」)。在此載體中選殖之人類ROBO3基因中ORF位點之序列顯示於SEQ ID NO：27之第35至4192號核苷酸中。同樣，人類ROBO3之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：28中。
(實例2)單株抗體之製備
2)-1抗原性蛋白質之製備
為表現rROBO4-ECD，用pEF6-ROBO4-ECD使用293fectin(由Life Technologies公司製造)轉染FreeStyle 293-F細胞(由Life Technologies公司製造)且在37℃及8% CO2條件下培養6天。在培養完成後，藉由離心收集培養溶液且將其用作rROBO4-ECD純化原液。將所獲得培養上清液使用截留分子量為15000之透析管針對20mM Tris-HCl(pH 7.5)進行透析，經過濾器(0.45μm)過濾，且隨後將其添加至經20mM Tris-HCl(pH 7.5)平衡之HiTrap 16/10 Q XL(由GE Healthcare Bio-Sciences公司製造)中。用NaCl梯度(20mM Tris-HCl(pH 7.5)/0.2M NaCl,20mM Tris-HCl(pH 7.5)/1M NaCl)進行溶析。藉由SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(下文中，縮寫為「SDS-PAGE」)分離一部分溶析流份。然後，使凝膠經受考馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue)染色(下文中，縮寫為「CBB染色」)且藉由西方墨點法(Western blotting)進行檢測以確認含有rROBO4-ECD之流份。之後，收集含有rROBO4-ECD之流份且將其添加至經PBS平衡之HiLoad 16/60 Superdex 75 pg(由GE Healthcare Bio-Sciences公司製造)中。在用PBS溶析後，藉由SDS-PAGE分離一部分溶析流份。然後，使凝膠經受CBB染色且藉由西方墨點法進行檢測以確認含有rROBO4-ECD之流份。收集含有rROBO4-ECD之流份且將其用作用於免疫之抗原及用於結合親和性分析之抗原。使用BCA蛋白質分析試劑(由Pierce Biotechnology公司製造)量測蛋白質濃度。
2)-2免疫
使用6週齡雌性BALB/c小鼠。在第0天，將50μg rROBO4-ECD與弗氏完全佐劑之混合物皮下或真皮內投與每一小鼠。在第7天、第14天及第21天，將50μg rROBO4-ECD與弗氏不完全佐劑之混合物皮下或真皮內投與小鼠。在第38天，將50μg rROBO4-ECD經腹膜內投與小鼠。在第42天，收集小鼠淋巴結或脾並將其用於融合瘤製備。
2)-3融合瘤製備
使用Hybrimune融合瘤製造系統(由Cyto Pulse Sciences公司製造) 將淋巴結細胞或脾細胞及小鼠骨髓瘤SP2/0-ag14細胞電融合，用ClonaCell-HY選擇培養基D(由StemCell Technologies公司製造)稀釋並培養。收集所呈現的融合瘤群落以製備單株融合瘤。培養所收集之每一融合瘤群落，且在所獲得之融合瘤培養上清液中篩選產生抗ROBO4抗體之融合瘤。
2)-4抗體篩選
2)-4-1用於細胞-ELISA之表現抗原基因之細胞之製備
在含有10% FBS之DMEM培養基中將HEK293細胞調整至7.5×105個細胞/mL。採用脂染胺(Lipofectamine)2000(由Life Technologies公司製造)，以pCI-hROBO4或陰性對照pCI虛擬物轉染細胞，將其以50μL/孔之濃度分配至96孔半面積板(由Corning公司製造)中，且在37℃及5% CO2條件下，在含有10% FBS之DMEM培養基中培養過夜。將所獲得經轉染細胞用於細胞-ELISA中，讓其彼此黏附。
2)-4-2用於流式細胞術分析之表現抗原基因之細胞之製備
將HEK293T細胞以1.125×107個細胞/燒瓶之濃度接種至225cm2燒瓶(由Sumitomo Bakelite有限公司製造)中且在含有10% FBS之DMEM培養基中，在37℃及5% CO2條件下培養過夜。在第二天，採用脂染胺(Lipofectamine)2000，以pCI-ROBO4或陰性對照pCI虛擬物轉染HEK293T細胞，且在37℃及5% CO2條件下再培養過夜。在第二天，用TrypLE Express(由Life Technologies公司製造)處理經表現載體轉染之HEK293T細胞，用含有10% FBS之DMEM洗滌，且隨後使其懸浮於含有5% FBS之PBS中。將所獲得之細胞懸浮液用於流式細胞術分析中。
2)-5細胞-ELISA
在自2)-4-1中製備之經表現載體轉染之HEK293細胞移除上清液後，將融合瘤培養上清液添加至經pCI-hROBO4轉染及經pCI虛擬物轉 染之HEK293細胞中之每一者，且使細胞在4℃下靜置1小時。用含有5% FBS之PBS將每孔中之細胞洗滌一次。然後，將用含有5% FBS之PBS稀釋500倍之在山羊中產生之抗小鼠IgG-過氧化物酶抗體(由Sigma-Aldrich公司製造)添加至其中，且使細胞在4℃下靜置1小時。用含有5% FBS之PBS將每孔中之細胞洗滌5次。然後，將OPD著色溶液(分別以0.4mg/mL及0.6%(v/v)之濃度溶解於OPD溶解溶液(0.05M檸檬酸三鈉、0.1M十二水合磷酸氫二鈉，pH 4.5)中之鄰苯二胺二鹽酸鹽(由Wako Pure Chemical Industries有限公司製造)及H2O2)以25μL/孔之濃度添加至其中。在間歇式攪拌下實施呈色反應且藉由以25μL/孔之濃度添加1M HCl來停止反應。然後，使用讀板儀(ENVISION；由Perkin Elmer公司製造)量測在490nm下之吸光度。為選擇產生特異性結合至在細胞膜表面上表現之ROBO4之抗體之融合瘤，選擇培養上清液中在經pCI-hROBO4轉染之HEK293細胞中展現高於經陰性對照pCI虛擬物轉染之HEK293細胞之吸光度之融合瘤作為抗ROBO4抗體產生呈陽性之融合瘤。
2)-6流式細胞術分析
藉由流式細胞術進一步確認在2)-5細胞-ELISA中確定為陽性之每一融合瘤產生之抗體結合至ROBO4。對在2)-4-2中製備之HEK293T細胞懸浮液進行離心。在移除上清液後，將融合瘤培養上清液添加至經pCI-hROBO4轉染之細胞及經pCI虛擬物轉染之細胞中之每一者，且將所得懸浮液在4℃下靜置1小時。用含有5% FBS之PBS將細胞洗滌兩次。然後，將用含有5% FBS之PBS稀釋1000倍之抗小鼠IgG FITC偶聯物(由Sigma-Aldrich公司製造)或用含有5% FBS之PBS稀釋320倍之抗大鼠IgG FITC偶聯物(由Sigma-Aldrich公司製造)添加至其中，且將所得懸浮液在4℃下靜置1小時。用含有5% FBS之PBS將細胞洗滌三次，然後將其再懸浮於含有5% FBS及2μg/mL 7-胺基放線菌素D(7- aminoactinomycin D，由Molecular Probes製造)之PBS中，且使用流式細胞儀(FC500；由Beckman Coulter公司製造)進行檢測。使用Flowjo(由TreeStar公司製造)分析數據。藉由設門(gating)來排除7-胺基放線菌素D陽性死細胞，且然後製備活細胞之FITC螢光強度之直方圖。獲得產生其中經pCI-ROBO4轉染之HEK293T細胞之直方圖與經陰性對照pCI虛擬物轉染之293T細胞之直方圖相比移動至較強螢光強度區域之樣品之融合瘤作為產生抗ROBO4抗體之融合瘤。將所獲得融合瘤產生之抗ROBO4抗體分別命名為MAb1、MAb2、MAb3及MAb4。
2)-7單株抗體之分型
使用小鼠單株分型套組或大鼠單株分型套組(由AbD Serotec製造)來測定每一單株抗體之同種型。結果係IgG1(MAb1及MAb2)及IgG2b(MAb3及MAb4)。
2)-8單株抗體之製備
自融合瘤培養上清液(下文中，稱作「抗體純化原液」)純化每一單株抗體。
如下製備抗體純化原液：將8×107至9×107個融合瘤接種至1272cm2燒瓶(由Corning公司製造)中且在含有20% Ultra-LoW IgG胎牛血清之融合瘤SFM培養基(由Life Technologies公司製造)中在37℃及5% CO2條件下培養4天，且隨後收集上清液。
使用Hitrap Protein G HP或Hitrap MabSelect SuRe(由GE Healthcare Bio-Sciences公司製造)來純化抗體。對於Hitrap Protein G HP，將抗體純化原液添加至管柱且用結合緩衝液(0.02M磷酸鈉，pH 7.0)洗滌，之後用0.1M甘胺酸(pH 2.7)溶析。與之相比，對於Hitrap MabSelect SuRe，將抗體純化原液添加至管柱且用PBS洗滌，之後用2M精胺酸-HCl(pH 4.0)溶析。中和所溶析抗體溶液，且然後用PBS更換緩衝液。使用BCA蛋白質分析試劑來量測用Hitrap Protein G HP純 化之抗體之濃度。使用小鼠IgG2a(由R&D systems公司製造)作為用於校準曲線之標準品。或者，用Hitrap MabSelect SuRe純化之抗體之濃度係藉由量測結合至POROS G 20μm管柱PEEK(4.6mm×50mm,0.83mL，由Applied Biosystems公司製造)之抗體之溶析物中之吸光度(O.D.280nm)來測定。具體而言，將用PBS稀釋之抗體樣品添加至經平衡緩衝液(30.6mM十二水合磷酸二氫鈉、19.5mM磷酸二氫鉀、0.15M NaCl，pH 7.0)平衡之POROS G 20μm中。用平衡緩衝液洗滌管柱，且然後用溶析劑(0.1%(v/v)HCl,0.15M NaCl)來溶析管柱。量測溶析物中吸光度(O.D.280nm)之峰面積，且根據以下方程計算濃度：抗體樣品濃度(mg/mL)=(抗體樣品之峰面積)/(標準品(人類IgG1)之峰面積)×標準品濃度(mg/mL)×樣品稀釋比率。
(實例3)ROBO4下游信號之活化之檢測
3)-1包含白介素-8(IL-8)啟動子區作為反應元件之報導基因載體之製備
以IL-8啟動子區DNA作為模板使用以下引物組來實施PCR反應：引物17F：5'-ggtaccgataaggaacaaataggaag-3'及引物17R：5'-gagctcagcttgtgtgctctgctgtc-3'
將所得PCR產物納入pCR4鈍端-TOPO載體中以製備包含IL-8啟動子區(-253至-59)DNA之選殖載體。用KpnI及SacI使IL-8啟動子區(-253至-59)DNA裂解離開選殖載體且將其納入pGL4.15載體(由Promega公司製造)之KpnI與SacI之間以製備包含IL-8啟動子區作為反應元件之報導基因載體。IL-8啟動子區(-253至-59)DNA之核苷酸序列顯示於SEQ ID NO：29中。
3)-2包含核因子-κB(NF-κB)、干擾素γ活化序列(GAS)、干擾素刺激反應元件(ISRE)、轉染級T細胞因子(TCF)作為反應元件之報導基因載體
分別使用pGL4.32[luc2P/NF-KB-RE/Hygro]載體(由Promega公司製造)、pGAS-TA-Luc載體(由Takara Bio公司製造)、pISRE-TA-Luc載體(由Takara Bio公司製造)及TOPflash(由Millipore公司製造)作為包含NF-κB、GAS、ISRE或TCF作為反應元件之報導基因載體。或者，使用無反應序列pTA-Luc載體(由Takara Bio公司製造)作為陰性對照。使用pRL-TK載體(由Takara Bio公司製造)作為內部對照。
3)-3對在瞬時表現人類ROBO4之細胞中變化之信號之分析
將HEK293細胞以2×104個細胞/孔之濃度接種至96孔板(經膠原I塗佈；由Asahi Glass有限公司製造)中且在含有10% FBS之DMEM培養基中在37℃及5% CO2條件下培養過夜。在第二天，使用FuGene6轉染試劑用pCI-ROBO4、pCI-ROBO4-△C或陰性對照pCI虛擬物以及3)-1及3)-2中展示之每一報導基因載體轉染HEK293細胞，且在37℃及5% CO2條件下再培養過夜。在第二天，在讀板儀(Mithras；由Berthold Technologies GmbH & Co,KG製造)中使用Dual-Glo螢光素酶分析系統(由Promega公司製造)以發光強度測定每一孔之螢火蟲螢光素酶及海腎螢光素酶(Renilla luciferase)活性，且根據以下方程來計算每孔之報導基因活性：報導基因活性=螢火蟲螢光素酶活性源發光強度/海腎螢光素酶活性源發光強度。作為結果，在經pCI-hROBO4轉染之細胞中，與經陰性對照pCI虛擬物轉染之細胞相比，僅IL-8啟動子活性有所提高(圖1)。此外，在經pCI-hROBO4轉染之細胞中檢測到之此IL-8啟動子活性之提高在經pCI-hROBO4-△C(hROBO4之胞內區缺失突變體)轉染之細胞中顯著減弱，從而證實，在經pCI-hROBO4轉染之細胞中檢測到之IL-8啟動子活性之提高需要ROBO4之胞內區(圖2)。因此，經pCI-hROBO4轉染之細胞中IL-8啟動子活性之提高證實，檢測到ROBO4下游信號之活化。
(實例4)MAb1之性質
4)-1 MAb1對ROBO4下游信號之活化
將在3)-3中製備之經pCI-hROBO4轉染之細胞或經pCI虛擬物轉染之細胞培養過夜。在第二天，以0、0.3125、1.25、5及20μg/mL或0、0.25、1、4及16μg/mL之濃度向其中添加每一抗ROBO4抗體(MAb1、MAb2、MAb3或MAb4)或陰性對照小鼠IgG1(由R&D systems公司製造)，且將細胞在37℃及5% CO2條件下培養5小時。然後，在讀板儀(Mithras)中使用Dual-Glo螢光素酶分析系統(由Promega公司製造)以發光強度測定每孔之螢火蟲螢光素酶及海腎螢光素酶活性，且根據以下方程計算每孔之報導基因活性：報導基因活性=螢火蟲螢光素酶活性源發光強度/海腎螢光素酶活性源發光強度。作為結果，陰性對照小鼠IgG不影響瞬時表現人類ROBO4之細胞中之IL-8啟動子活性，而MAb1提高IL-8啟動子活性(圖3)。如在MAb1中，MAb2亦提高IL-8啟動子活性，而MAb3或MAb4不提高IL-8啟動子活性(圖4)。在pCI虛擬物細胞中，MAb1或MAb2不提高IL-8啟動子活性。該等結果證實，MAb1活化ROBO4之下游信號且並非所有針對ROBO4之抗體皆活化ROBO4之下游信號。
在交聯抗體(Fc片段特異性AffiPure山羊抗小鼠IgG，目錄號115-005-071,Jackson ImmunoResearch，兩種針對MAb3或MAb4中之一種分子之交聯抗體分子)存在下針對啟動子活性評估已確認不提高ROBO4下游信號之活性之MAb3及MAb4。作為結果，對於兩種抗體皆觀察到啟動子活性之提高。
4)-2 HUVEC移行測試
在37℃及5% CO2條件下將HUVEC(由KURABO INDUSTRIES有限公司製造)在含有0.1% BSA之HuMedia-EB2(由KURABO INDUSTRIES有限公司製造)中培養過夜，且然後用含有0.1% BSA之HuMedia-EB2調節至4×105個細胞/mL。將0.25mL濃度為4×105個細胞 /mL之細胞懸浮液添加至具有明膠塗佈膜之BD Falcon FluoroBlok 24多孔插入物系統(孔徑：8μm)中之室之上層中。然後，將含有0.1% BSA及10ng/mL人類VEGF165(由PeproTech公司製造)或人類bFGF(BD Biosciences)及2μg/mL小鼠IgG2a或每一抗ROBO4抗體(MAb1、MAb2、MAb3或MAb4)之HuMedia-EB2添加至該室之下層中。在37℃及5% CO2條件下培育2至3小時後，用含有4μg/mL鈣黃綠素-AM(由Life Technologies公司製造)之HuMedia-EB2將移行至下層之HUVEC染色15分鐘。然後，使用讀板儀(FlexStation；Molecular Devices,LLC)量測每孔之螢光強度(激發波長/螢光波長：485nm/538nm)，且根據以下方程計算每孔中移行細胞之量：移行細胞之量=補充HUVEC之孔之螢光強度-未補充HUVEC之孔之螢光強度。作為結果，MAb1阻抑藉由VEGF或bFGF誘導之HUVEC移行(圖5)。如在MAb1中，MAb2亦阻抑藉由bFGF誘導之HUVEC移行，而MAb3或MAb4不阻抑細胞移行(圖6)。該等結果證實，抗ROBO4抗體對IL-8啟動子活性之提高與針對HUVEC移行之阻抑活性相關聯。
4)-3跨物種反應性
4)-3-1表現抗原基因之細胞之製備
將HEK293細胞以1.5×106個細胞/培養皿之濃度接種至60mm培養皿(由Corning公司製造)中，且在37℃及5% CO2條件下在含有10% FBS之DMEM培養基中培養過夜。在第二天，使用FuGENE6轉染試劑用pCI-hROBO4、pCI-mROBO4、pCI-raROBO4、pCI-FLAG-cynoROBO4-1、pCI-FLAG-cynoROBO4-2、pCI-hROBO1、pCI-hROBO2或pCI-hROBO3轉染HEK293細胞，且在37℃及5% CO2條件下再培養過夜。在第二天，用TrypLE Express(由Life Technologies公司製造)處理經表現載體轉染之細胞，用含有5% FBS之PBS洗滌，且然後將其懸浮於含有5% FBS之PBS中。將所獲得細胞懸浮液用於流式細 胞術分析中。
4)-3-2流式細胞術分析
將在4)-3-l中製備之1一細胞懸浮液離心並移除上清液。然後，將MAb1或陰性對照小鼠IgG2a以10μg/mL之濃度添加至2×105個經表現載體轉染之細胞，且將所得懸浮液在4℃下靜置1小時。用含有5% FBS之PBS將細胞洗滌一次。然後，向其中添加用含有5% FBS之PBS稀釋1000倍之抗小鼠IgG FITC偶聯物，且將所得懸浮液在4℃下靜置1小時。用含有5% FBS之PBS將細胞洗滌三次，然後使其再懸浮於含有5% FBS之PBS中，且使用流式細胞儀(BD FACSCalibur)進行檢測。使用Flowjo分析數據。製備FITC螢光強度之直方圖。在MAb1之直方圖與陰性對照小鼠IgG2a之直方圖相比移動至較強螢光強度區域時，確定抗體係以跨物種方式結合。跨物種反應性研究之結果證實，MAb1不結合至小鼠ROBO4或大鼠ROBO4，但結合至人類ROBO4及食蟹猴ROBO4(圖7)。
4)-4結合特異性
4)-4-1表現抗原基因之細胞之製備
將HEK293細胞以1.2×106個細胞/培養皿或1.5×106個細胞/培養皿之濃度接種至60mm培養皿(由Corning公司製造)中且在含有10% FBS之DMEM培養基中在37℃及5% CO2條件下培養過夜。在第二天，使用FuGENE6轉染試劑用pCI-hROBO4、pCI-FLAG-hROBO1、pCI-hROBO2或pCI-hROBO3轉染HEK293細胞，且在37℃及5% CO2條件下再培養過夜。在第二天，用TrypLE Express(由Life Technologies公司製造)處理經表現載體轉染之細胞，用含有5% FBS之PBS洗滌，且然後將其懸浮於含有5% FBS之PBS中。將所獲得細胞懸浮液用於流式細胞術分析中。
4)-4-2流式細胞術分析
將在4)-4-1中製備之每一細胞懸浮液離心並移除上清液。然後，將MAb 1、陽性對照人類ROBO4抗體(由R&D systems公司製造)、在小鼠中產生之單株抗FLAG M2抗體(由Sigma-Aldrich公司製造)、人類ROBO2抗體(由R&D systems公司製造)或單株抗人類ROBO3抗體(由R&D systems公司製造)或陰性對照小鼠IgG1或小鼠IgG2a以10μg/mL之濃度添加至2×105個經表現載體轉染之細胞，且將所得懸浮液在4℃下靜置1小時。用含有5% FBS之PBS將細胞洗滌一次。然後，向其中添加用含有5% FBS之PBS稀釋1000倍之抗小鼠IgG FITC偶聯物，且將所得懸浮液在4℃下靜置1小時。用含有5% FBS之PBS將細胞洗滌三次，然後使其再懸浮於含有5% FBS之PBS中，且使用流式細胞儀(BD FACSCalibur)進行檢測。使用Flowjo分析數據。製備FITC螢光強度之直方圖。在MAb1之直方圖與陰性對照小鼠IgG1或小鼠IgG2a之直方圖相比移動至較強螢光強度區域時，確定抗體係以特異性方式結合。結果證實，MAb1不結合至hROBO1、hROBO2或hROBO3且特異性結合至hROBO4(圖8)。在此背景中，使用陽性對照抗體確認hROBO4、hROBO1、hROBO2及hROBO3各自在細胞膜上表現(圖8)。
4)-5表位測定
4)-5-1表現抗原基因之細胞之製備
將HEK293細胞以1.5×106個細胞/培養皿之濃度接種至60mm培養皿(由Corning公司製造)中，且在37℃及5% CO2條件下在含有10% FBS之DMEM培養基中培養過夜。在第二天，使用FuGENE6轉染試劑用pCI-FLAG-hROBO4-28、pCI-FLAG-hROBO4-46、pCI-FLAG-hROBO4-132、pCI-FLAG-hROBO4-210、pCI-FLAG-hROBO4-225、pCI-FLAG-hROBO4-341轉染HEK293細胞，且在37℃及5% CO2條件下再培養過夜。在第二天，用TrypLE Express(由Life Technologies公司製造)處理經表現載體轉染之細胞，用含有5% FBS之PBS洗滌，且然 後將其懸浮於含有5% FBS之PBS中。將所獲得細胞懸浮液用於流式細胞術分析中。
4)-5-2流式細胞術分析
將在4)-5-1中製備之每一細胞懸浮液離心並移除上清液。然後，將MAb1、在小鼠中產生之陽性對照單株抗FLAG M2抗體或陰性對照小鼠IgG2a以10μg/mL之濃度添加至2×105個經表現載體轉染之細胞，且將所得懸浮液在4℃下靜置1小時。用含有5% FBS之PBS將細胞洗滌一次。然後，向其中添加用含有5% FBS之PBS稀釋1000倍之抗小鼠IgG FITC偶聯物，且將所得懸浮液在4℃下靜置1小時。用含有5% FBS之PBS將細胞洗滌三次，然後將其再懸浮於含有5% FBS之PBS中，且使用流式細胞儀(BD FACSCalibur；BD Biosciences)進行檢測。使用Flowjo分析數據。製備FITC螢光強度之直方圖。在MAb1之直方圖與陰性對照小鼠IgG2a之直方圖相比移動至較強螢光強度區域時，確定抗體結合至細胞。結果證實，MAb1結合至經pCI-FLAG-hROBO4-28轉染之細胞、經pCI-FLAG-hROBO4-46轉染之細胞或經pCI-FLAG-hROBO4-132轉染之細胞，且不結合至經pCI-FLAG-hROBO4-210轉染之細胞、經pCI-FLAG-hROBO4-225轉染之細胞或經pCI-FLAG-hROBO4-341轉染之細胞。因此，顯示MAb1可識別SEQ ID NO：2中所顯示人類ROBO4中132至209號之胺基酸序列(圖9)。在此背景中，使用陽性對照抗FLAG抗體確認每一胞內區/結構域缺失變體可在細胞膜上表現(圖9)。
4)-6在具有雷射誘導之脈絡膜新血管生成之猴模型中之藥物效力評估
4)-6-1麻醉
將鹽酸酶托咪定(Medetomidine hydrochloride，由Nippon Zenyaku Kogyo有限公司製造)以0.04mg/kg之劑量肌內注射至食蟹猴。在15分 鐘後，將鹽酸氯胺酮(ketamine hydrochloride，由Daiichi Sankyo有限公司製造)以15mg/kg之劑量肌內注射至其中。
4)-6-2模型製備
將在4)-6-1中麻醉之每一食蟹猴保持在猴椅中。將4%木卡因(Xylocaine)眼滴劑(由AstraZeneca plc製造)施加至兩隻眼以供眼表面之麻醉/鎮痛處理。將5mg/mL托吡卡胺(tropicamide)-5mg/mL鹽酸去氧腎上腺素混合物眼滴劑(由Santen Pharmaceutical有限公司製造)施加至眼以供瞳孔散大。使用綠色雷射光凝固儀OcuLight GLx(由Iridex公司製造)藉由雷射輻照(所輻照熱量：350-500mW，輻照時間：0.1秒，斑點大小：50μm，斑點數：6或9個斑點)以熱學方式破壞視網膜斑區。
4)-6-3測試物質之投與
在第7天在模型製備後，將33G Nanopass針自結膜插入玻璃體，且經2分鐘使用100μL漢密爾頓式注射器(Hamilton syringe)經由PE20聚乙烯管將50μL媒劑或13.2mg/mL MAb1注入其中。對每個包括4隻眼之組實施測試。在投與完成後，將0.5%(levofloxacin hydrate)左氧氟沙星水合物眼滴劑(由Santen Pharmaceutical有限公司製造)施加至眼。
4)-6-4藥物效力評估
在第7天、第14天及第21天在模型製備後，藉由常規方法使用混合式眼底相機CX-1(由Canon公司製造)在麻醉下對眼底照相。然後，將10%螢光素以0.1mL/Kg之劑量靜脈內注入其中。在靜脈內注射螢光素完成後，每1分鐘至長達6分鐘後實施螢光血管攝影術。儲存影像數據，且使用影像分析儀(WinRoof，由Mitani公司製造)計算螢光素累積位點之面積。根據以下方程計算新形成血管之量：新形成血管之量=在第21天在模型製備後螢光素累積位點之面積-在第7天在模型製 備後螢光素累積位點之面積。作為在媒劑投與組與MAb1投與組之間比較新形成血管之量之結果，確認在MAb1投與組之四隻眼中有三隻眼的新形成血管之量減少，但確認在另一隻眼與媒劑組之間新形成血管之量無差異。此意味著，投與MAb1阻抑雷射誘導之脈絡膜新血管生成(圖10)。
(實例5)MAb1 cDNA之選殖及測序
5)-1 MAb1重鏈及輕鏈之N-端胺基酸序列之測定
為測定MAb1重鏈及輕鏈之N-端胺基酸序列，藉由SDS-PAGE分離在實例2)-8中純化之MAb1。將凝膠中由此分離之蛋白質自凝膠轉移至Sequi-Blot PVDF膜(Bio-Rad Laboratories公司)，繼而用洗滌緩衝液(25mM NaCl、10mM硼酸鈉緩衝液，pH 8.0)洗滌，然後藉由在染色溶液(50%甲醇、20%乙酸、0.05%考馬斯亮藍)中浸漬5分鐘進行染色，且隨後用90%甲醇脫色。使在PVDF膜上可視化之對應於重鏈(具有較小遷移率之帶)及輕鏈(具有較大遷移率之帶)之帶部分裂解離開。根據自動Edman方法(參見Edman等人，(1967)Eur.J.Biochem.1,80)使用Procise cLC蛋白質測序儀492cLC型(Applied Biosystems公司)來鑑別其各別N-端胺基酸序列。作為結果，對應於MAb1重鏈之帶之N-端胺基酸序列係EVQLVESGGGLVKPGGSLKL，且對應於輕鏈之帶之N-端胺基酸序列係DAVMTQTPLSLPVSL。
5)-2來自產生MAb1之融合瘤之mRNA之製備
為選殖MAb1之編碼重鏈及編碼輕鏈之cDNA，使用mRNA分離套組(Roche Applied Science)自產生MAb1之融合瘤製備mRNA。
5)-3 MAb1 cDNA之選殖及測序
參照分別基於MAb1重鏈及輕鏈之γ1及κ同種型測定之重鏈及輕鏈之N-端胺基酸序列(實例2)-7及5)-1)以及由Kabat等人製備之抗體胺 基酸序列數據庫來合成若干種分別與抗體基因編碼區之5'端序列及其含有終止密碼子之3'端序列雜交之寡核苷酸引物(參見Strausberg,R.L.等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99.16899-16903；及Kabat,E.A.等人(1991)，Sequences of Proteins of Immunological Interest第I及II卷，U.S.Department of Health and Human Services)。使用在5)-2中製備之mRNA及TaKaRa一步式RNA PCR套組(AMY)(Takara Bio公司)擴增編碼重鏈及編碼輕鏈之cDNA。作為結果，使用以下引物組成功擴增抗體之編碼重鏈及編碼輕鏈之cDNA：用於重鏈之引物組
LYHF6：5'-cctcaccatgaactttgg-3'
G1EVR1：5'-aagatatcttatttaccaggagagtgggagag-3'
用於輕鏈之引物組
MK19EIF1：5'-aagaattcatgaagttgcctgttagg-3'
KEVR1：5'-aagatatcttaacactcattcctgttgaagct-3'
使用pEF6/V5-His TOPO TA表現套組(Invitrogen公司)分開選殖藉由PCR擴增之重鏈及輕鏈cDNA。使用基因測序儀(「ABI PRISM 3700 DNA分析儀；Applied Biosystems」或「Applied Biosystems 3730x1分析儀；Applied Biosystems」)測定編碼重鏈及輕鏈之各別可變區之經選殖cDNA的核苷酸序列。測序反應係使用GeneAmp 9700(Applied Biosystems公司)來實施。
編碼MAb1重鏈可變區之cDNA之所測定核苷酸序列顯示於SEQ ID NO：30中，且其胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：31中。編碼小鼠抗體MAb1輕鏈可變區之cDNA之核苷酸序列顯示於SEQ ID NO：32中，且其胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：33中。
(實例6)嵌合MAb1(cMAb1)之製備
6)-1表現載體pCMA-LK、pCMA-G1及pCMA-G2之製備
6)-1-1嵌合及人類化輕鏈表現載體pCMA-LK之構築
用限制酶XbaI及PmeI消化質體pcDNA3.3-TOPO/LacZ(Invitrogen公司)，且使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(Clontech Laboratories公司)將所獲得約5.4kb之片段連接至包含編碼人類κ鏈分泌信號及人類κ鏈恆定區之DNA序列(SEQ ID NO：34)之DNA片段以製備pcDNA3.3/LK。
PCR係以pcDNA3.3/LK作為模板使用下文所顯示引物組來實施。使所獲得約3.8kb之片段磷酸化且隨後自連接以自pcDNA3.3/LK構築嵌合及人類化輕鏈表現載體pCMA-LK，其具有編碼信號序列之序列、選殖位點及CMV啟動子下游之編碼人類κ鏈恆定區之序列。
引物組
3.3-F1：5'-tataccgtcgacctctagctagagcttggc-3'
3.3-R1：5'-gctatggcagggcctgccgccccgacgttg-3'
6)-1-2嵌合及人類化IgG1型重鏈表現載體pCMA-G1之構築
用XbaI及PmeI消化pCMA-LK以移除編碼κ鏈分泌信號及人類κ鏈恆定區之序列。使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(Clontech Laboratories公司)將所得DNA片段連接至包含編碼人類重鏈信號序列及人類IgG1恆定區之胺基酸序列之DNA序列(SEQ ID NO：35)之DNA片段，以構築嵌合及人類化IgG1型重鏈表現載體pCMA-G1，其具有編碼信號序列之序列、選殖位點及CMV啟動子下游之編碼人類IgG1重鏈恆定區之序列。
6)-1-3嵌合及人類化IgG2型重鏈表現載體pCMA-G2之構築
用XbaI及PmeI消化pCMA-LK以移除編碼κ鏈分泌信號及人類κ鏈恆定區之序列。使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(Clontech Laboratories公司)將所得DNA片段連接至包含編碼人類重鏈信號序列及人類IgG2恆定區之胺基酸之DNA序列(SEQ ID NO：36)之DNA片段 以構築嵌合及人類化IgG2型重鏈表現載體pCMA-G2，其具有編碼信號序列之序列、選殖位點及CMV啟動子下游之編碼人類IgG2重鏈恆定區之序列。
6)-2嵌合MAb1輕鏈表現載體之構築
以編碼MAb1輕鏈可變區之cDNA作為模板使用KOD-Plus-(TOYOBO有限公司)及下文所顯示引物組擴增包含編碼輕鏈可變區之cDNA之位點，且使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(Clontech Laboratories公司)將其插入用於嵌合及人類化抗體輕鏈表現之通用載體pCMA-LK之限制酶BsiWI裂解位點中，以構築嵌合MAb1輕鏈表現載體。將所獲得表現載體命名為「pCMA-LK/MAb1L」。編碼嵌合MAb1輕鏈之核苷酸序列顯示於SEQ ID NO：37中，且其胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：38中。SEQ ID NO：37之第1至60號核苷酸代表編碼信號序列之核苷酸序列。其第61至402號核苷酸代表編碼可變區之核苷酸序列。其第403至717號核苷酸代表編碼恆定區之核苷酸序列。SEQ ID NO：38之第1至20號胺基酸代表信號序列之胺基酸。其第21至134號胺基酸代表可變區之胺基酸。第135至239號胺基酸代表恆定區之胺基酸。
用於輕鏈之引物組
MAb1 LF：5'-tctccggcgcgtacggcgatgctgtgatgacccaaactccactctcc-3'
MAb1 LR：5'-ggagggggcggccacagcccgtttgatttccagcttggtgcctcc-3'
6)-3嵌合MAb1 IgG1型重鏈表現載體之構築
以編碼MAb1重鏈可變區之cDNA作為模板使用KOD-Plus-(TOYOBO有限公司)及下文所顯示引物組擴增包含編碼重鏈可變區之cDNA之位點，且使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(Clontech Laboratories公司)將其插入嵌合及人類化IgG1型重鏈表現載體pCMA-G1之限制酶BsiWI裂解位點中，以構築嵌合MAb1 IgG1型重鏈表現載 體。將所獲得表現載體命名為「pCMA-G1/MAb1 H」。編碼嵌合MAb1 IgG1型重鏈之核苷酸序列顯示於SEQ ID NO：39中，且其胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：40中。SEQ ID NO：39之第1至57號核苷酸代表編碼信號序列之核苷酸序列。其第58至411號核苷酸代表編碼可變區之核苷酸序列。其第412至1401號核苷酸代表編碼恆定區之核苷酸序列。SEQ ID NO：40之第1至19號胺基酸代表信號序列之胺基酸序列。其第20至137號胺基酸代表可變區之胺基酸序列。第138至467號胺基酸代表恆定區之胺基酸序列。
用於IgG1型重鏈之引物組
MAb1 HF：5'-cagatgggtgctgagcgaagtgcagctggtggagtctgggggag-3'
MAb1 H1R：5'-ttggtggaggctgagctgactgtgagagtggtgccgtggccccag-3'
6)-4嵌合MAb1 IgG2型重鏈表現載體之構築
以編碼MAb1重鏈可變區之cDNA作為模板使用KOD-Plus-(TOYOBO有限公司)及下文所顯示引物組擴增包含編碼重鏈可變區之cDNA之位點，且使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(Clontech Laboratories公司)將其插入嵌合及人類化IgG2型重鏈表現載體pCMA-G2之限制酶BsiWI裂解位點，以構築嵌合MAb1 IgG2型重鏈表現載體。將所獲得表現載體命名為「pCMA- G2/MAb1」。編碼嵌合MAb1 IgG2型重鏈之核苷酸序列顯示於SEQ ID NO：41中，且其胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：42中。
用於IgG2型重鏈之引物組
MAb1 HF：5'-cagatgggtgctgagcgaagtgcagctggtggagtctgggggag-3'
MAb1 2R：5'-ttggtgctggctgagctgactgtgagagtggtgccgtggccccag-3'
(實例7)IgG1型嵌合MAb1抗體及IgG2型嵌合MAb1抗體之製備
7)-1 IgG1型嵌合MAb1抗體及IgG2型嵌合MAb1抗體之產生
根據手冊對FreeStyle 293-F細胞(Invitrogen公司)進行繼代培養及 培養。將1.2×109個細胞之處於對數生長期之FreeStyle 293-F細胞(Invitrogen公司)接種至3 L Fernbach Erlenmeyer燒瓶(Corning公司)，用FreeStyle 293表現培養基(Invitrogen公司)稀釋至1.0×106個細胞/mL，且隨後在8% CO2培育器中在90rpm及37℃下振盪培養1小時。將3.6mg聚乙烯亞胺(Polysciences公司，編號24765)溶解於20mL Opti-Pro SFM培養基(Invitrogen公司)中。之後，將使用PureLink HiPure質體套組(Invitrogen公司)製備之H鏈表現載體(0.4mg)及L鏈表現載體(0.8mg)懸浮於20mL Opti-Pro SFM培養基(Invitrogen公司)中。將20mL表現載體/Opti-Pro SFM混合物溶液添加至20mL聚乙烯亞胺/Opti-Pro SFM混合物溶液中，且逐漸攪拌混合物，再使其靜置5分鐘，且隨後將其添加至FreeStyle 293-F細胞。將細胞在8% CO2培育器中在90rpm及37℃下振盪培養7天，且經由可棄式膠囊過濾器(Advantec，編號CCS-045-E1H)過濾所獲得培養上清液。
將藉由pCMA-G1/MAb1 H與pCMA-LK/MAb1 L之間之組合及pCMA-G2/MAb1 H與pCMA-LK/MAb1 L之間之組合獲得之IgG1型及IgG2型嵌合MAb1抗體分別縮寫為「cMAb1-1」及「cMAb1-2」。術語「cMAb1」意指IgG1型及IgG2型嵌合MAb1抗體二者。
7)-2 cMAb1-1及cMAb1-2之純化
藉由rProtein A親和層析(在4-6℃下)純化上文在7-1)中獲得之培養上清液。在rProtein A親和層析純化後在室溫下實施緩衝液更換步驟。首先，將1100至1200ml培養上清液施加至用PBS平衡之MabSelect SuRe(由GE Healthcare Bio-Sciences公司製造，HiTrap管柱；體積1mL×2，經連接)中。將全培養溶液置於管柱中，且隨後用PBS洗滌管柱。之後，用2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH 4.0)實施溶析以收集含有抗體之流份。使用去鹽管柱(由GE Healthcare Bio-Sciences公司製造，HiTrap去鹽管柱；體積5mL×2，經連接)以PBS更換此流份中 之緩衝液。最後，用離心UF過濾器裝置VIVASPIN20(截留分子量：30K，Sartorius，在4℃下)將該流份濃縮至IgG濃度為20.0mg/mL或更高且將其用作純化樣品。
7)-3 cMAb1-1及cMAb1-2之性質
7)-3-1 ROBO4下游信號之活化
根據4)-1之方法實施此測試，只是：使用人類IgG(由Sigma-Aldrich公司製造)作為陰性對照；且將人類IgG、cMAb1-1或cMAb1-2以0.313μg/mL之最終濃度添加至培養基。作為結果，陰性對照人類IgG不影響瞬時表現人類ROBO4之細胞中之IL-8啟動子活性，而cMAb1-1及cMAb1-2提高IL-8啟動子活性(圖11)。該等結果證實，cMAb1-1或cMAb1-2如在MAb1中一般活化RQBQ4之下游信號。
7)-3-2 HUVEC移行測試
根據4)-2之方法實施此測試，只是：使用人類IgG作為陰性對照；且將人類IgG、cMAb1-1或cMAb1-2以0.5μg/mL之最終濃度添加至培養基。作為結果，cMAb1-1或cMAb1-2阻抑藉由bFGF誘導之HUVEC移行(圖12)。該等結果證實，cMAb1-1或cMAb1-2如在MAb1中一般阻抑HUVEC移行。
(實例8)小鼠抗人類ROBO4單株抗體MAb1之人類化抗體之設計
8)-1 MAb1之人類化形式之設計
8)-1-1 MAb1可變區之分子建模
MAb1可變區之分子建模係藉由眾所周知之同源性建模方法(Methods in Enzymology,203,121-153,(1991))來實施。將在蛋白質數據庫(Nuc.Acid Res.35,D301-D303(2007))註冊之人類免疫球蛋白可變區之一級序列(可以自x射線晶體結構推導之三維結構來獲得)與由此測定之MAb1可變區之一級序列進行比較。作為結果，選擇3FFD，此乃因在框架缺陷抗體中其對MAb1重鏈可變區具有最高序列同源 性。同樣，選擇1T66，此乃因其對MAb1輕鏈可變區具有最高序列同源性。框架區之三維結構係藉由自對應於MAb1重鏈及輕鏈之3FFD及1T66之坐標組合獲得「框架模型」來製備。如對於MAb1之CDR一般，根據Thornton等人之分類(J.Mol.Biol.,263,800-815,(1996))將CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1及CDRH2分別指定至簇16A、7A、9A、10A及10B。使用H3規則(FEBS letter 399,1-8(1996))將CDRH3歸類為k(7)B。隨後，將每一CDR之典型構象納入框架模型中。
最後，實施能量計算以供排除不利的原子間接觸，以獲得在能量方面可能係MAb1可變區之分子模型。該等程序係使用市售蛋白質三維結構預測程式Prime及坐標搜尋程式MacroModel(Schrodinger,LLC)來實施。
8)-1-2人類化MAb1胺基酸序列之設計
藉由眾所周知之CDR移植方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033(1989))來構築每一人類化MAb1抗體(hMAb1)。基於框架區中胺基酸之同源性選擇兩種不同受體抗體。將MAb1框架區之序列與Kabat抗體胺基酸序列數據庫(Nuc.Acid Res.29,205-206(2001))中之所有人類框架進行比較。作為結果，選擇B3抗體作為受體，此內因其對框架區具有83%序列同源性。將B3框架區之胺基酸殘基與MAb1之胺基酸殘基進行比對，以鑑別所用不同胺基酸之位置。使用上文構築之MAb1之三維模型來分析該等殘基之位置。然後，根據Queen等人提出之準則(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033(1989))來選擇欲移植至受體上之供體殘基。將一些所選供體殘基整合至受體抗體中以構築人類化MAb1之序列，如下文實例中所述。同樣，hMAb1變體係藉由用其他胺基酸殘基取代hMAb1之每一CDR中之1至3個胺基酸殘基來構築，如下文實例中所述。
8)-2 cMAb1重鏈之人類化
8)-2-1 hMAb1-H1型重鏈：將藉由以下來設計之人類化MAb1重鏈命名為「hMAb1-H1型重鏈」：在示於SEQ ID NO：42之cMAb1-2重鏈中用麩醯胺酸替代第32號胺基酸(離胺酸)、用精胺酸替代第38號胺基酸(離胺酸)、用丙胺酸替代第59號胺基酸(蘇胺酸)、用甘胺酸替代第61號胺基酸(麩胺酸)、用甘胺酸替代第63號胺基酸(精胺酸)、用離胺酸替代第95號胺基酸(麩胺酸)、用天冬醯胺替代第103號胺基酸(絲胺酸)、用丙胺酸替代第107號胺基酸(絲胺酸)、用纈胺酸替代第112號胺基酸(甲硫胺酸)、用酪胺酸替代第114號胺基酸(苯丙胺酸)、用麩醯胺酸替代第129號胺基酸(組胺酸)、用白胺酸替代第132號胺基酸(蘇胺酸)及用纈胺酸替代第133號胺基酸(白胺酸)。
hMAb1-H1型重鏈之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：56中。在胺基酸序列SEQ ID NO：56中由胺基酸殘基1至19組成之序列、由胺基酸殘基20至137組成之序列及由胺基酸殘基138至463組成之序列分別對應於信號序列、重鏈可變區及重鏈恆定區。在胺基酸序列SEQ ID NO：56中由胺基酸殘基50至54組成之序列、由胺基酸殘基69至85組成之序列及由胺基酸殘基118至126組成之序列分別對應於CDRH1序列、CDRH2序列及CDRH3序列。在核苷酸序列SEQ ID NO：55中編碼胺基酸序列SEQ ID NO：56之核苷酸序列顯示於SEQ ID NO：55中。由核苷酸1至57組成之序列、由核苷酸58至411組成之序列及由核苷酸412至1389組成之序列分別編碼信號序列、重鏈可變區序列及重鏈恆定區序列。核苷酸序列SEQ ID NO：55及胺基酸序列SEQ ID NO：56亦分別顯示於圖31及32中。
8)-2-2 hMAb1-H2型重鏈：將藉由以下來設計之人類化MAb1重鏈命名為「hMAb1-H2型重 鏈」：在示於SEQ ID NO：42之cMAb1-2重鏈中用麩醯胺酸替代第32號胺基酸(離胺酸)、用精胺酸替代第38號胺基酸(離胺酸)、用丙胺酸替代第59號胺基酸(蘇胺酸)、用甘胺酸替代第61號胺基酸(麩胺酸)、用甘胺酸替代第63號胺基酸(精胺酸)、用麩醯胺酸替代第72號胺基酸(天冬醯胺)、用離胺酸替代第95號胺基酸(麩胺酸)、用天冬醯胺替代第103號胺基酸(絲胺酸)、用丙胺酸替代第107號胺基酸(絲胺酸)、用纈胺酸替代第112號胺基酸(甲硫胺酸)、用酪胺酸替代第114號胺基酸(苯丙胺酸)、用麩醯胺酸替代第129號胺基酸(組胺酸)、用白胺酸替代第132號胺基酸(蘇胺酸)及用纈胺酸替代第133號胺基酸(白胺酸)。
hMAb1-H2型重鏈之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：58中。在胺基酸序列SEQ ID NO：58中由胺基酸殘基1至19組成之序列、由胺基酸殘基20至137組成之序列及由胺基酸殘基138至463組成之序列分別對應於信號序列、重鏈可變區及重鏈恆定區。在胺基酸序列SEQ ID NO：58中由胺基酸殘基50至54組成之序列、由胺基酸殘基69至85組成之序列及由胺基酸殘基118至126組成之序列分別對應於CDRH1序列、CDRH2序列及CDRH3序列。編碼胺基酸序列SEQ ID NO：58之核苷酸序列顯示於SEQ ID NO：57中。在核苷酸序列SEQ ID NO：57中由核苷酸1至57組成之序列、由核苷酸58至411組成之序列及由核苷酸412至1389組成之序列分別編碼信號序列、重鏈可變區序列及重鏈恆定區序列。核苷酸序列SEQ ID NO：57及胺基酸序列SEQ ID NO：58亦分別顯示於圖33及34中。
8)-2-3 hMAb1-H3型重鏈：將藉由以下來設計之人類化MAb1重鏈命名為「hMAb1-H3型重鏈」：在示於SEQ ID NO：42之cMAb1-2重鏈中用麩醯胺酸替代第32號胺基酸(離胺酸)、用精胺酸替代第38號胺基酸(離胺酸)、用丙胺酸替代第59號胺基酸(蘇胺酸)、用甘胺酸替代第61號胺基酸(麩胺酸)、用 離胺酸替代第95號胺基酸(麩胺酸)、用天冬醯胺替代第103號胺基酸(絲胺酸)、用丙胺酸替代第107號胺基酸(絲胺酸)、用纈胺酸替代第112號胺基酸(甲硫胺酸)、用酪胺酸替代第114號胺基酸(苯丙胺酸)、用麩醯胺酸替代第129號胺基酸(組胺酸)、用白胺酸替代第132號胺基酸(蘇胺酸)及用纈胺酸替代第133號胺基酸(白胺酸)。
hMAb1-H3型重鏈之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：60中。在胺基酸序列SEQ ID NO：60中由胺基酸殘基1至19組成之序列、由胺基酸殘基20至137組成之序列及由胺基酸殘基138至463組成之序列分別對應於信號序列、重鏈可變區及重鏈恆定區。在胺基酸序列SEQ ID NO：60中由胺基酸殘基50至54組成之序列、由胺基酸殘基69至85組成之序列及由胺基酸殘基118至126組成之序列分別對應於CDRH1序列、CDRH2序列及CDRH3序列。編碼胺基酸序列SEQ ID NO：60之核苷酸序列顯示於SEQ ID NO：59中。在核苷酸序列SEQ ID NO：59中由核苷酸1至57組成之序列、由核苷酸58至411組成之序列及由核苷酸412至1389組成之序列分別編碼信號序列、重鏈可變區序列及重鏈恆定區序列。核苷酸序列SEQ ID NO：59及胺基酸序列SEQ ID NO：60亦分別顯示於圖35及36中。
8)-2-4 hMAb1-H4型重鏈：將藉由以下來設計之人類化MAb1重鏈命名為「hMAb1-H4型重鏈」：在示於SEQ ID NO：42之cMAb1-2重鏈中用麩醯胺酸替代第32號胺基酸(離胺酸)、用精胺酸替代第38號胺基酸(離胺酸)、用丙胺酸替代第59號胺基酸(蘇胺酸)、用甘胺酸替代第61號胺基酸(麩胺酸)、用麩醯胺酸替代第72號胺基酸(天冬醯胺)、用離胺酸替代第95號胺基酸(麩胺酸)、用天冬醯胺替代第103號胺基酸(絲胺酸)、用丙胺酸替代第107號胺基酸(絲胺酸)、用纈胺酸替代第112號胺基酸(甲硫胺酸)、用酪胺酸替代第114號胺基酸(苯丙胺酸)、用麩醯胺酸替代第129號胺基 酸(組胺酸)、用白胺酸替代第132號胺基酸(蘇胺酸)及用纈胺酸替代第133號胺基酸(白胺酸)。
hMAb1-H4型重鏈之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：62中。在胺基酸序列SEQ ID NO：62中由胺基酸殘基1至19組成之序列、由胺基酸殘基20至137組成之序列及由胺基酸殘基138至463組成之序列分別對應於信號序列、重鏈可變區及重鏈恆定區。在胺基酸序列SEQ ID NO：62中由胺基酸殘基50至54組成之序列、由胺基酸殘基69至85組成之序列及由胺基酸殘基118至126組成之序列分別對應於CDRH1序列、CDRH2序列及CDRH3序列。編碼胺基酸序列SEQ ID NO：62之核苷酸序列顯示於SEQ ID NO：61中。在核苷酸序列SEQ ID NO：61中由核苷酸1至57組成之序列、由核苷酸58至411組成之序列及由核苷酸412至1389組成之序列分別編碼信號序列、重鏈可變區序列及重鏈恆定區序列。核苷酸序列SEQ ID NO：61及胺基酸序列SEQ ID NO：62亦分別顯示於圖37及38中。
8)-3 MAb1輕鏈之人類化
8)-3-1 hMAb1-L1型輕鏈：藉由以下來設計之人類化MAb1輕鏈命名為「hMAb1-L1型輕鏈」：在示於SEQ ID NO：38之cMAb1輕鏈中用異白胺酸替代第22號胺基酸(丙胺酸)、用絲胺酸替代第27號胺基酸(蘇胺酸)、用蘇胺酸替代第34號胺基酸(絲胺酸)、用麩胺酸替代第37號胺基酸(天冬胺酸)、用脯胺酸替代第38號胺基酸(麩醯胺酸)、用白胺酸替代第62號胺基酸(苯丙胺酸)、用脯胺酸替代第84號胺基酸(白胺酸)、用纈胺酸替代第108號胺基酸(苯丙胺酸)、用酪胺酸替代第112號胺基酸(苯丙胺酸)、用脯胺酸替代第125號胺基酸(甘胺酸)、用纈胺酸替代第129號胺基酸(白胺酸)、用天冬胺酸替代第130號胺基酸(麩胺酸)及用蘇胺酸替代第134號胺基酸(丙胺酸)。
hMAb1-L1型輕鏈之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：64中。在胺基酸序列SEQ ID NO：64中由胺基酸殘基1至20組成之序列、由胺基酸殘基21至134組成之序列及由胺基酸殘基135至239組成之序列分別對應於信號序列、輕鏈可變區及輕鏈恆定區。在胺基酸序列SEQ ID NO：64中由胺基酸殘基44至59組成之序列、由胺基酸殘基75至81組成之序列及由胺基酸殘基114至122組成之序列分別對應於CDRL1序列、CDRL2序列及CDRL3序列。編碼胺基酸序列SEQ ID NO：64之核苷酸序列顯示於SEQ ID NO：63中。在核苷酸序列SEQ ID NO：63中由核苷酸1至60組成之序列、由核苷酸61至402組成之序列及由核苷酸403至717組成之序列分別編碼信號序列、輕鏈可變區序列及輕鏈恆定區序列。核苷酸序列SEQ ID NO：63及胺基酸序列SEQ ID NO：64亦分別顯示於圖39及40中。
8)-3-2 hMAb1-L2型輕鏈：藉由以下來設計之人類化MAb1輕鏈命名為「hMAb1-L2型輕鏈」：在示於SEQ ID NO：38之cMAb1輕鏈中用異白胺酸替代第22號胺基酸(丙胺酸)、用絲胺酸替代第27號胺基酸(蘇胺酸)、用蘇胺酸替代第34號胺基酸(絲胺酸)、用麩胺酸替代第37號胺基酸(天冬胺酸)、用脯胺酸替代第38號胺基酸(麩醯胺酸)、用麩胺酸替代第52號胺基酸(絲胺酸)、用離胺酸替代第54號胺基酸(甘胺酸)、用白胺酸替代第56號胺基酸(蘇胺酸)、用白胺酸替代第62號胺基酸(苯丙胺酸)、用脯胺酸替代第84號胺基酸(白胺酸)、用纈胺酸替代第108號胺基酸(苯丙胺酸)、用酪胺酸替代第112號胺基酸(苯丙胺酸)、用脯胺酸替代第125號胺基酸(甘胺酸)、用纈胺酸替代第129號胺基酸(白胺酸)、用天冬胺酸替代第130號胺基酸(麩胺酸)及用蘇胺酸替代第134號胺基酸(丙胺酸)。
hMAb1-L2型輕鏈之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：66中。在胺基酸序列SEQ ID NO：66中由胺基酸殘基1至20組成之序列、由胺基酸殘 基21至134組成之序列及由胺基酸殘基135至239組成之序列分別對應於信號序列、輕鏈可變區及輕鏈恆定區。在胺基酸序列SEQ ID NO：66中由胺基酸殘基44至59組成之序列、由胺基酸殘基75至81組成之序列及由胺基酸殘基114至122組成之序列分別對應於CDRL1序列、CDRL2序列及CDRL3序列。編碼胺基酸序列SEQ ID NO：66之核苷酸序列顯示於SEQ ID NO：65中。在核苷酸序列SEQ ID NO：65中由核苷酸1至60組成之序列、由核苷酸61至402組成之序列及由核苷酸403至717組成之序列分別編碼信號序列、輕鏈可變區序列及輕鏈恆定區序列。核苷酸序列SEQ ID NO：65及胺基酸序列SEQ ID NO：66亦分別顯示於圖41及42中。
(實例9)人類化MAb1之製備
9)-1人類化MAb1重鏈表現載體之構築
9)-1-1 hMAb1-H1型重鏈表現載體之構築
合成包含編碼示於SEQ ID NO：56之第20至137號胺基酸之hMAb1-H1型重鏈可變區之基因的DNA(GeneArt人工基因合成服務)且用限制酶BlpI裂解。將所獲得DNA片段插入嵌合及人類化IgG2型重鏈表現載體(pCMA-G2)之限制酶BlpI裂解位點以構築hMAb1-H1型重鏈表現載體。將所獲得表現載體命名為「pCMA-G2/hMAb1-H1」。hMAb1-H1型重鏈之核苷酸序列顯示於SEQ ID NO：55中。
9)-1-2 hMAb1-H2型重鏈表現載體之構築
hMAb1-H2型重鏈表現載體係以在9)-1-1中構築之pCMA-G2/hMAb1-H1作為模板使用下文所顯示引物組及QuikChange XL定點誘變套組(Agilent Technologies公司)來構築。將所獲得表現載體命名為「pCMA-G1/hMAb1-H2」。hMAb1-H2型重鏈之核苷酸序列顯示於SEQ ID NO：57中，且其胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：58中。
引物組： H-N53Q-F：5'-gggtggcaaccatcagccaaggcggcacctacacctac-3'
H-N53Q-R：5'-gtaggtgtaggtgccgccttggctgatggttgccaccc-3'
9)-1-3 hMAb1-H3型重鏈表現載體之構築
合成包含編碼示於SEQ ID NO：60之第20至137號胺基酸之hMAb1-H3型重鏈可變區之基因的DNA(GeneArt人工基因合成服務)且用限制酶BlpI裂解。將所獲得DNA片段插入嵌合及人類化IgG2型重鏈表現載體(pCMA-G2)之限制酶BlpI裂解位點中以構築hMAb1-H3型重鏈表現載體。將所獲得表現載體命名為「pCMA-G2/hMAb1-H3」。hMAb1-H3型重鏈之核苷酸序列顯示於SEQ ID NO：59中。
9)-1-4 hMAb1-H4型重鏈表現載體之構築
hMAb1-H4型重鏈表現載體係以在9)-1-3中構築之pCMA-G2/hMAb1-H3作為模板使用下文所顯示引物組及QuikChange XL定點誘變套組(Agilent Technologies公司)來構築。將所獲得表現載體命名為「pCMA-G1/hMAb1-H4」。hMAb1-H4型重鏈之核苷酸序列顯示於SEQ ID NO：61中，且其胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：62中。
引物組：H-N53Q-F：5'-gggtggcaaccatcagccaaggcggcacctacacctac-3'
H-N53Q-R：5'-gtaggtgtaggtgccgccttggctgatggttgccaccc-3'
9)-2人類化MAb1輕鏈表現載體之構築
9)-2-1 hMAb1-L1型輕鏈表現載體之構築
合成包含編碼示於SEQ ID NO：64之第21至134號胺基酸之hMAb1-L1型輕鏈可變區之基因的DNA(GeneArt人工基因合成服務)且用限制酶BsiWI裂解。將所獲得DNA片段插入用於嵌合及人類化抗體輕鏈表現之通用載體(pCMA-LK)之限制酶BsiWI裂解位點以構築hMAb1-L1型輕鏈表現載體。將所獲得表現載體命名為「pCMA-LK/hMAb1-L1」。hMAb1-L1型輕鏈之核苷酸序列顯示於SEQ ID NO： 63中。
9)-2-2 hMAb1-L2型輕鏈表現載體之構築
藉由PCR以在9)-2-1中構築之pCMA-LK/hMAb1-L1作為模板使用KOD-Plus-(TOYOBO有限公司)及引物組A及B中之每一者來獲得DNA片段，且藉由重疊擴增PCR使用引物組C來連接以製備包含編碼hMAb1-L2型輕鏈之基因之DNA。用限制酶XbaI及PmeI裂解此DNA以獲得DNA片段，然後將該片段插入用於嵌合及人類化抗體輕鏈表現之通用載體(pCMA-LK)之限制酶XbaI/PmeI裂解位點中以構築hMAb1-L2型輕鏈表現載體。將所獲得表現載體命名為「pCMA-LK/hMAb1-L2」。hMAb1-L2型輕鏈之核苷酸序列顯示於SEQ ID NO：65中，且其胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：66中。
引物組A
L inf-F：5'-gcctccggactctagagccaccatggtgctgcagacccaggtgttc-3'
L-EKL-R：5'-caggtacaggttcttgttctcgttttccaggctctggctgcttctgcagc-3'
引物組B
L-EKL-F：5'-gaaaacgagaacaagaacctgtacctgaactggtatctgcagaagcccg-3'
L inf-R：5'-tagcctcccccgtttaaacgggcccctaacactcccccctg-3'
引物組C
L inf-F：5'-gcctccggactctagagccaccatggtgctgcagacccaggtgttc-3'
L inf-R：5'-tagcctcccccgtttaaacgggcccctaacactcccccctg-3'
(實例10)人類化MAb1之製備
10-7-1)人類化MAb1之產生
根據手冊對FreeStyle 293-F細胞(Invitrogen公司)進行繼代培養及培養。
將1.2×109個細胞之處於對數生長期之FreeStyle 293-F細胞(Invitrogen公司)接種至3 L Fernbach Erlenmeyer燒瓶(Corning公司)， 用FreeStyle 293表現培養基(Invitrogen公司)稀釋至1.0×106個細胞/mL，且隨後在8% CO2培育器中在90rpm及37℃下振盪培養1小時。將3.6mg聚乙烯亞胺(Polysciences公司，編號24765)溶解於20mL Opti-Pro SFM培養基(Invitrogen公司)中。之後，將使用PureLink HiPure質體套組(Invitrogen公司)製備之H鏈表現載體(0.4mg)及L鏈表現載體(0.8mg)懸浮於20mL Opti-Pro SFM培養基(Invitrogen公司)中。將20mL表現載體/Opti-Pro SFM混合物溶液添加至20mL聚乙烯亞胺/Opti-Pro SFM混合物溶液中，且逐漸攪拌混合物，再使其靜置5分鐘，且隨後將其添加至FreeStyle 293-F細胞。將細胞在8% CO2培育器中在90rpm及37℃下振盪培養7天，且經由可棄式膠囊過濾器(Advantec，編號CCS-045-E1H)過濾所獲得培養上清液，且以與7)-2中相同之方式進行純化。
將藉由pCMA-G2/hMAb1-H1與pCMA-LK/hMAb1-L1之間之組合獲得之人類化MAb1抗體命名為「H-1040」。將藉由pCMA-G2/hMAb1-H2與pCMA-LK/hMAb1-L1之間之組合獲得之人類化MAb1抗體命名為「H-1140」。將藉由pCMA-G2/hMAb1-H2與pCMA-LK/hMAb1-L2之間之組合獲得之人類化MAb1抗體命名為「H-1143」。將藉由pCMA-G2/hMAb1-H3與pCMA-LK/hMAb1-L1之間之組合獲得之人類化MAb1抗體命名為「H-2040」。將藉由pCMA-G2/hMAb1-H4與pCMA-LK/hMAb1-L1之間之組合獲得之人類化MAb1抗體命名為「H-2140」。將藉由pCMA-G2/hMAb1-H4與pCMA-LK/hMAb1-L2之間之組合獲得之人類化MAb1抗體命名為「H-2143」。
(實例11)抗ROBO4人類化抗體之性質
11)-1結合親和性
以經固定抗體作為配體且以抗原作為分析物使用Biacore 3000(由GE Healthcare Bio-Sciences公司製造)來測定每一抗體與rROBO4- ECD之間之解離常數。經由藉由胺偶合方法固定在感測晶片CM5(由GE Healthcare Bio-Sciences公司製造)上之抗人類IgG抗體(由GE Healthcare Bio-Sciences公司製造)結合約80 RU之抗體。所用運行緩衝液係含有0.05%表面活性劑P20之PBS。將抗原之連續稀釋溶液(0.1-200nM)以30μL/min之流速經300秒添加至結合抗體之晶片上。隨後，將解離期監測300秒。以10μL/min之流速經30秒向其中添加3M MgCl2作為再生溶液。使用分析軟體(BIA評估軟體，4.1版)之1：1結合模型來分析數據以計算締合速率常數kon、解離速率常數koff及解離常數(KD；KD=koff/kon)。作為結果，KD值為0.41nM(對於H-1040)、3.5nM(對於H-1143)、3.9nM(對於H-1140)、0.40nM(對於H-2040)、1.7nM(對於H-2143)及1.8nM(對於H-2140)。
11)-2 ROBO4下游信號之活化
根據4)-1之方法實施此測試，只是：使用人類IgG作為陰性對照；且將人類IgG、H-1040、H-1140、H-1143、H-2040、H-2140、H-2143或cMAb1-2以0.63μg/mL之最終濃度添加至培養基。作為結果，陰性對照人類IgG不影響瞬時表現人類ROBO4之細胞中之IL-8啟動子活性，而所有抗ROBO4人類化抗體在等於cMAb1-2之濃度下皆提高IL-8啟動子活性(圖49)。該等結果證實，所有抗ROBO4人類化抗體如在MAb1中一般活化ROBO4之下游信號。
11)-3 HUVEC移行測試
根據4)-2之方法實施此測試，只是：使用人類IgG作為陰性對照；將人類IgG、H-1143、H-2140或H-2143以0.5μg/mL之最終濃度添加至培養基；且使用讀板儀(EnVision：Perkin Elmer公司)量測每孔之螢光強度(激發波長/螢光波長：485nm/538nm)。作為結果，H-1143、H-2140或H-2143阻抑藉由bFGF誘導之HUVEC移行(圖50)。另外，H-1140顯示針對HUVEC移行之阻抑活性。該等結果證實，H- 1140、H-1143、H-2140或H-2143阻抑HUVEC移行。
11)-4跨物種反應性
11)-4-1表現抗原基因之細胞之製備
根據4)-3-1之方法來製備細胞。
11)-4-2流式細胞術分析
根據4)-3-2之方法實施此測試，只是：使用人類IgG作為陰性對照；使用Fcγ片段特異性FITC-AffiniPure山羊抗人類IgG(由Jackson ImmunoResearch Laboratories公司製造)作為二級抗體；且使用流式細胞儀(FC500；由Beckman Coulter公司製造)作為檢測器。作為結果，H-1143、H-2140或H-2143不結合至小鼠ROBO4或大鼠ROBO4，但顯示其結合至人類ROBO4及食蟹猴ROBO4，如在親代抗體MAb1中一般(圖51、52及53)。另外，H-1140顯示與H-1143、H-2140及H-2143相同之結果。
11)-5 H-1140,H-1143,H-2140或H-2143之結合特異性
11)-5-1表現抗原基因之細胞之製備
根據4)-4-1之方法來製備細胞，只是使用pCI-FLAG-hROBO4-28作為人類ROBO4表現載體。
11)-5-2流式細胞術分析
根據4)-4-2之方法實施此測試，只是：使用人類IgG或小鼠IgG2A作為陰性對照；使用針對小鼠IgG之螢光素偶聯之山羊IgG部分(由Cappel Laboratories公司製造)或Fcγ片段特異性FITC-AffiniPure山羊抗人類IgG作為二級抗體；且使用流式細胞儀(FC500)作為檢測器。作為結果，H-1143、H-2140或H-2143不結合至hROBO1、hROBO2或hROBO3，但顯示其特異性結合至hROBO4，如在親代抗體MAb1中一般(圖54)。另外，H-1140顯示與H-1143、H-2140及H-2143相同之結果。在此背景中，使用陽性對照抗體確認hROBO4、hROBO1、 hROBO2及hROBO3各自在細胞膜上表現(圖54)。
11)-6在具有雷射誘導之脈絡膜新血管生成之猴模型中之藥物效力評估
11)-6-1麻醉
將鹽酸酶托咪定以0.08mg/kg之劑量肌內注射至每一食蟹猴。在15分鐘後，將鹽酸氯胺酮以15mg/kg之劑量肌內注射至其中。
11)-6-2模型製備
將在11)-6-1中麻醉之每一食蟹猴以仰位保持在不銹鋼手術臺上。將5mg/mL托吡卡胺-5mg/mL鹽酸去氧腎上腺素混合物眼滴劑施加至眼以供瞳孔散大。使用綠色雷射光凝固儀OcuLight GLx藉由雷射輻照(所輻照熱量：500mW，輻照時間：0.1秒，斑點大小：50μm，斑點數：9個斑點)以熱學方式破壞視網膜斑區。在該手術後，將可樂必妥(Cravit)眼滴劑逐滴添加至經手術眼中。
11)-6-3測試物質之投與
在第7天在模型製備後，麻醉每一食蟹猴且然後將其以仰位保持在不銹鋼手術臺上。然後，將用無菌純化水稀釋4倍之PA IODO眼科及眼洗滌溶液(Nitten Pharmaceutical有限公司)施加至眼以對外眼進行消毒。將33G針自結膜插入玻璃體，且將鹽水或0.05mL調節至1.1mg/0.05mL之H-2143使用1mL注射器注入其中。在投與完成後，使用拭子將用於眼及耳之Rinderon-A軟膏劑施加至結膜，且藉由眼之開閉使其散佈在整個眼表面上。
11)-6-4藥物效力評估
在第7天、第14天及第21天在模型製備後，藉由常規方法使用混合式眼底相機CX-1在麻醉下對眼底照相。然後，將螢光素以0.05mL/Kg之劑量靜脈內注入其中。在靜脈內注射螢光素完成後，每1分鐘至長達10分鐘後實施螢光血管攝影術，且儲存影像數據。根據Zahn G等人之方法(Zahn G等人，Arch.Ophthalmol.2009127：1329-1335)，自影像數據基於每一雷射輻照之螢光素累積位點之螢光強度以1至5級量表歸類嚴重性。然後，按百分比計算所有雷射輻照位點中嚴重性歸類對應於4級及5級之位點之比率，以評估脈絡膜新血管生成。作為在鹽水投與組與H-2143投與組之間比較脈絡膜新血管生成之結果，在鹽水投與組中4級及5級之比率自模型製備起隨著時間推移有所增加，而在H-2143投與組中未觀察到該增加。此意味著，投與H-2143阻抑雷射誘導之脈絡膜新血管生成(圖55)。
[工業適用性]
本發明提供之抗體之用途使得能治療或預防血管生成性疾病(例如滲出性年齡相關性黃斑點退化、糖尿病性視網膜病變、黃斑水腫、良性或惡性腫瘤、動脈粥樣硬化、晶狀體後纖維組織增生、血管瘤、慢性發炎、新生血管性眼病、增生性視網膜病變、新生血管性青光眼、角膜組織移植物或其他組織移植物之免疫排斥、類風濕性關節炎、牛皮癬、急性發炎、敗血症或肥胖症)，及檢查或診斷該血管生成性疾病。
[序列表之非關鍵詞文字]
SEQ ID NO：1：全長人類ROBO4 cDNA之核苷酸序列(圖13)
SEQ ID NO：2：人類ROBO4之胺基酸序列(圖14)
SEQ ID NO：3：編碼N-端加FLAG標籤之全長人類ROBO4之胺基酸序列的核苷酸序列
SEQ ID NO：4：N-端加FLAG標籤之全長人類ROBO4之胺基酸序列
SEQ ID NO：5：編碼由SEQ ID NO：2之第46至1007號胺基酸之胺基酸序列組成的N-端加FLAG標籤之人類ROBO4之胞外區/結構域缺失變體之胺基酸序列的核苷酸序列
SEQ ID NO：6：由SEQ ID NO：2之第46至1007號胺基酸之胺基酸 序列組成的N-端加FLAG標籤之人類ROBO4之胞外區/結構域缺失變體之胺基酸序列
SEQ ID NO：7：編碼由SEQ ID NO：2之第132至1007號胺基酸之胺基酸序列組成的N-端加FLAG標籤之人類ROBO4之胞外區/結構域缺失變體之胺基酸序列的核苷酸序列
SEQ ID NO：8：由SEQ ID NO：2之第132至1007號胺基酸之胺基酸序列組成的N-端加FLAG標籤之人類ROBO4之胞外區/結構域缺失變體之胺基酸序列
SEQ ID NO：9：編碼由SEQ ID NO：2之第210至1007號胺基酸之胺基酸序列組成的N-端加FLAG標籤之人類ROBO4之胞外區/結構域缺失變體之胺基酸序列的核苷酸序列
SEQ ID NO：10：由SEQ ID NO：2之第210至1007號胺基酸之胺基酸序列組成的N-端加FLAG標籤之人類ROBO4之胞外區/結構域缺失變體之胺基酸序列
SEQ ID NO：11：編碼由SEQ ID NO：2之第225至1007號胺基酸之胺基酸序列組成的N-端加FLAG標籤之人類ROBO4之胞外區/結構域缺失變體之胺基酸序列的核苷酸序列
SEQ ID NO：12：由SEQ ID NO：2之第225至1007號胺基酸之胺基酸序列組成的N-端加FLAG標籤之人類ROBO4之胞外區/結構域缺失變體之胺基酸序列
SEQ ID NO：13：編碼由SEQ ID NO：2之第341至1007號胺基酸之胺基酸序列組成的N-端加FLAG標籤之人類ROBO4之胞外區/結構域缺失變體之胺基酸序列的核苷酸序列
SEQ ID NO：14：由SEQ ID NO：2之第341至1007號胺基酸之胺基酸序列組成的N-端加FLAG標籤之人類ROBO4之胞外區/結構域缺失變體之胺基酸序列
SEQ ID NO：15：小鼠ROBO4 cDNA之核苷酸序列
SEQ ID NO：16：小鼠ROBO4之胺基酸序列
SEQ ID NO：17：大鼠ROBO4 cDNA之核苷酸序列
SEQ ID NO：18：大鼠ROBO4之胺基酸序列
SEQ ID NO：19：猴ROBO4 cDNA1之核苷酸序列
SEQ ID NO：20：猴ROBO4胺基酸序列1
SEQ ID NO：21：猴ROBO4 cDNA2之核苷酸序列
SEQ ID NO：22：猴ROBO4胺基酸序列2
SEQ ID NO：23：人類ROBO1 cDNA之核苷酸序列
SEQ ID NO：24：人類ROBO1之胺基酸序列
SEQ ID NO：25：人類ROBO2 cDNA之核苷酸序列
SEQ ID NO：26：人類ROBO2之胺基酸序列
SEQ ID NO：27：人類ROBO3 cDNA之核苷酸序列
SEQ ID NO：28：人類ROBO4之胺基酸序列
SEQ ID NO：29：IL-8啟動子區之核苷酸序列
SEQ ID NO：30：編碼MAb1重鏈可變區之cDNA之核苷酸序列(圖15)
SEQ ID NO：31：MAb1重鏈可變區之胺基酸序列(圖16)
SEQ ID NO：32：編碼MAb1輕鏈可變區之cDNA之核苷酸序列(圖17)
SEQ ID NO：33：MAb1輕鏈可變區之胺基酸序列(圖18)
SEQ ID NO：34：包含編碼人類κ鏈分泌信號及人類κ鏈恆定區之胺基酸之cDNA之核苷酸序列
SEQ ID NO：35：包含編碼人類重鏈信號序列及人類IgG1恆定區之胺基酸之cDNA之核苷酸序列
SEQ ID NO：36：包含編碼人類重鏈信號序列及人類IgG2恆定區 之胺基酸之cDNA之核苷酸序列
SEQ ID NO：37：編碼cMAb1輕鏈之cDNA之核苷酸序列(圖19)
SEQ ID NO：38：cMAb1輕鏈之胺基酸序列(圖20)
SEQ ID NO：39：編碼cMAb1-1重鏈之cDNA之核苷酸序列(圖21)
SEQ ID NO：40：cMAb1-1重鏈之胺基酸序列(圖22)
SEQ ID NO：41：編碼cMAb1-2重鏈之cDNA之核苷酸序列(圖23)
SEQ ID NO：42：cMAb1-2重鏈之胺基酸序列(圖24)
SEQ ID NO：43：編碼MAb1重鏈CDRH1之胺基酸序列之核苷酸序列
SEQ ID NO：44：MAb1重鏈CDRH1之胺基酸序列(圖25)
SEQ ID NO：45：編碼MAb1重鏈CDRH2之胺基酸序列之核苷酸序列
SEQ ID NO：46：MAb1重鏈CDRH2之胺基酸序列(圖26)
SEQ ID NO：47：編碼MAb1重鏈CDRH3之胺基酸序列之核苷酸序列
SEQ ID NO：48：MAb1重鏈CDRH3之胺基酸序列(圖27)
SEQ ID NO：49：編碼MAb1輕鏈CDRL1之胺基酸序列之核苷酸序列
SEQ ID NO：50：MAb1輕鏈CDRL1之胺基酸序列(圖28)
SEQ ID NO：51：編碼MAb1輕鏈CDRL2之胺基酸序列之核苷酸序列
SEQ ID NO：52：MAb1輕鏈CDRL2之胺基酸序列(圖29)
SEQ ID NO：53：編碼MAb1輕鏈CDRL3之胺基酸序列之核苷酸序列
SEQ ID NO：54：MAb1輕鏈CDRL3之胺基酸序列(圖30)
SEQ ID NO：55：編碼hMAb1-H1型重鏈之cDNA之核苷酸序列(圖31)
SEQ ID NO：56：hMAb1-H1型重鏈之胺基酸序列(圖32)
SEQ ID NO：57：編碼hMAb1-H2型重鏈之cDNA之核苷酸序列(圖33)
SEQ ID NO：58：hMAb1-H2型重鏈之胺基酸序列(圖34)
SEQ ID NO：59：編碼hMAb1-H3型重鏈之cDNA之核苷酸序列(圖35)
SEQ ID NO：60：hMAb1-H3型重鏈之胺基酸序列(圖36)
SEQ ID NO：61：編碼hMAb1-H4型重鏈之cDNA之核苷酸序列(圖37)
SEQ ID NO：62：hMAb1-H4型重鏈之胺基酸序列(圖38)
SEQ ID NO：63：編碼hMAb1-L1型輕鏈之cDNA之核苷酸序列(圖39)
SEQ ID NO：64：hMAb1-L1型重鏈之胺基酸序列(圖40)
SEQ ID NO：65：編碼hMAb1-L2型重鏈之cDNA之核苷酸序列(圖41)
SEQ ID NO：66：hMAb1-L2型重鏈之胺基酸序列(圖42)
SEQ ID NO：67：hMAb1-H2型或hMAb1-H4型重鏈之CDRH1(圖43)
SEQ ID NO：68：hMAb1-H2型或hMAb1-H4型重鏈之CDRH2(圖44)
SEQ ID NO：69：hMAb1-H2型或hMAb1-H4型重鏈之CDRH3(圖45)
SEQ ID NO：70：hMAb1-L2型輕鏈之CDRL1(圖46)
SEQ ID NO：71：hMAb1-L2型輕鏈之CDRL2(圖47)
SEQ ID NO：72：hMAb1-L2型輕鏈之CDRL3(圖48)
<110> 日商第一三共股份有限公司
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<210> 58
<211> 463
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hMAb1-T2H aa
<400> 58
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<211> 1389
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hMAb1-T3H na
<400> 59
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<211> 463
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hMAb1-T3H aa
<400> 60
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<211> 1389
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> hMAb1-T4H na
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<212> PRT
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2-2
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<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 69
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1-2
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<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 71
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 72

Claims (34)

  1. 一種具有以下(I)至(III)中所述之性質之抗體或其功能性片段，(I)以1×10-8或更低之KD值結合至ROBO4蛋白質；(II)在活體外，在不存在交聯抗體時，可阻抑或抑制血管內皮細胞移行；及(III)在活體內阻抑或抑制血管生成。
  2. 如請求項1之抗體或其功能性片段，其中該ROBO4蛋白質係人類ROBO4蛋白質。
  3. 如請求項1之抗體或其功能性片段，其中該ROBO4蛋白質係由SEQ ID NO：2之第1至1007號胺基酸之胺基酸序列組成之蛋白質。
  4. 如請求項1之抗體或其功能性片段，其中該ROBO4蛋白質係由SEQ ID NO：2之第46至1007號胺基酸之胺基酸序列組成之蛋白質。
  5. 如請求項3或4之抗體或其功能性片段，其中該抗體或其功能性片段結合至由SEQ ID NO：2之第132至209號胺基酸之胺基酸序列組成之位點。
  6. 如請求項1之抗體或其功能性片段，其中該抗體或其功能性片段係單株抗體或其功能性片段。
  7. 如請求項1至6中任一項之抗體或其功能性片段，其中該抗體係由重鏈與輕鏈組成，該重鏈包含：由示於SEQ ID NO：44(圖25)之胺基酸序列組成之CDRH1、由示於SEQ ID NO：46(圖26)之胺基酸序列或由一個胺基酸取代SEQ ID NO：46之胺基酸序列後所衍生之胺基酸序列組成之CDRH2以及由示於SEQ ID NO：48(圖27)之胺基酸序列組成之CDRH3；且該輕鏈包含：由示於SEQ ID NO：50(圖28)之胺基酸序列或由一至三個胺基酸取代SEQ ID NO：50之胺基酸序列後所衍生之胺基酸序列組成之CDRL1、由示於SEQ ID NO：52(圖29)之胺基酸序列組成之CDRL2以及由示於SEQ ID NO：54(圖30)之胺基酸序列組成之CDRL3。
  8. 如請求項1至7中任一項之抗體或其功能性片段，其中該抗體係由重鏈與輕鏈組成，該重鏈包含：由示於SEQ ID NO：44(圖25)之胺基酸序列組成之CDRH1、由示於SEQ ID NO：46(圖26)之胺基酸序列或示於SEQ ID NO：68(圖44)之胺基酸序列組成之CDRH2以及由示於SEQ ID NO：48(圖27)之胺基酸序列組成之CDRH3；且該輕鏈包含：由示於SEQ ID NO：50(圖28)之胺基酸序列或示於SEQ ID NO：70(圖46)之胺基酸序列組成之CDRL1、由示於SEQ ID NO：52(圖29)之胺基酸序列組成之CDRL2以及由示於SEQ ID NO：54(圖30)之胺基酸序列組成之CDRL3。
  9. 如請求項1至7中任一項之抗體或其功能性片段，其中該抗體包含由示於SEQ ID NO：31(圖16)之胺基酸序列組成之重鏈可變區以及由示於SEQ ID NO：33(圖18)之胺基酸序列組成之輕鏈可變區。
  10. 如請求項1至8中任一項之抗體或其功能性片段，其中該抗體包含選自以下a)至d)之任一重鏈可變區及選自e)及f)之輕鏈可變區：a)重鏈(hMAb1-H1型)可變區，其係由示於SEQ ID NO：56(圖32)之第20至137號胺基酸之胺基酸序列組成，b)重鏈(hMAb1-H2型)可變區，其係由示於SEQ ID NO：58(圖34)之第20至137號胺基酸之胺基酸序列組成，c)重鏈(hMAb1-H3型)可變區，其係由示於SEQ ID NO：60(圖36)之第20至137號胺基酸之胺基酸序列組成，及 d)重鏈(hMAb1-H4型)可變區，其係由示於SEQ ID NO：62(圖38)之第20至137號胺基酸之胺基酸序列組成；及e)輕鏈(hMAb1-L1型)可變區，其係由示於SEQ ID NO：64(圖40)之第21至134號胺基酸之胺基酸序列組成，及f)輕鏈(hMAb1-L2型)可變區，其係由示於SEQ ID NO：66(圖42)之第21至134號胺基酸之胺基酸序列組成。
  11. 如請求項1至8中任一項之抗體或其功能性片段，其中該抗體包含以下重鏈可變區與輕鏈可變區之組合1)至6)中之任一者：1)由示於SEQ ID NO：58(圖34)之第20至137號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈可變區及由示於SEQ ID NO：64(圖40)之第21至134號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈可變區，2)由示於SEQ ID NO：58(圖34)之第20至137號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈可變區及由示於SEQ ID NO：66(圖42)之第21至134號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈可變區，3)由示於SEQ ID NO：62(圖38)之第20至137號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈可變區及由示於SEQ ID NO：66(圖42)之第21至134號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈可變區，4)由示於SEQ ID NO：62(圖38)之第20至137號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈可變區及由示於SEQ ID NO：64(圖40)之第21至134號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈可變區，5)由示於SEQ ID NO：56(圖32)之第20至137號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈可變區及由示於SEQ ID NO：64(圖40)之第21至134號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈可變區，及6)由示於SEQ ID NO：60(圖36)之第20至137號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈可變區及由示於SEQ ID NO：64(圖40)之第21至134號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈可變區。
  12. 如請求項1至11中任一項之抗體或其功能性片段，其中該抗體或其功能性片段係嵌合抗體或其功能性片段。
  13. 如請求項1至11中任一項之抗體或其功能性片段，其中該抗體或其功能性片段係人類化抗體或其功能性片段。
  14. 如請求項1至13中任一項之抗體或其功能性片段，其中該抗體包含人類IgG1或人類IgG2重鏈恆定區。
  15. 如請求項1至6中任一項之抗體或其功能性片段，其中該抗體或其功能性片段結合至由如請求項7至14之抗體所識別之抗原上之位點。
  16. 如請求項1至6中任一項之抗體或其功能性片段，其中該抗體或其功能性片段與如請求項7至14之任一抗體競爭結合至ROBO4蛋白質。
  17. 如請求項1至8中任一項之抗體，其中該抗體包含以下重鏈與輕鏈之組合1)至6)中之任一者：1)由示於SEQ ID NO：58(圖34)之第20至463號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈及由示於SEQ ID NO：64(圖40)之第21至239號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈(H-1140)，2)由示於SEQ ID NO：58(圖34)之第20至463號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈及由示於SEQ ID NO：66(圖42)之第21至239號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈(H-1143)，3)由示於SEQ ID NO：62(圖38)之第20至463號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈及由示於SEQ ID NO：66(圖42)之第21至239號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈(H-2143)，4)由示於SEQ ID NO：62(圖38)之第20至463號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈及由示於SEQ ID NO：64(圖40)之第21至239號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈(H-2140)， 5)由示於SEQ ID NO：56(圖32)之第20至463號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈及由示於SEQ ID NO：64(圖40)之第21至239號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈(H-1040)，及6)由示於SEQ ID NO：60(圖36)之第20至463號胺基酸之胺基酸序列組成之重鏈及由示於SEQ ID NO：64(圖40)之第21至239號胺基酸之胺基酸序列組成之輕鏈(H-2040)。
  18. 一種抗體，其包含如請求項17之任一抗體之重鏈之修飾形式，其中該修飾形式缺少該重鏈之一個至若干個羧基端胺基酸。
  19. 如請求項1至6中任一項之抗體，其中該抗體之胺基酸序列與如請求項17之任一抗體具有95%或更高一致性；對於人類ROBO4之KD值為1×10-8或更低；在活體外，在不存在交聯抗體時，可阻抑或抑制血管內皮細胞移行；且在活體內阻抑或抑制血管生成。
  20. 如請求項15之抗體或其功能性片段，其中該抗體或其功能性片段係人類抗體或其功能性片段。
  21. 一種核苷酸序列，其選自由以下(I)至(III)組成之群：(I)包含編碼如請求項1至20中任一項之抗體中重鏈或輕鏈之部分或完整胺基酸序列之核苷酸序列的核苷酸序列，(II)由包含編碼如請求項1至20中任一項之抗體中重鏈或輕鏈之部分或完整胺基酸序列之核苷酸序列的核苷酸序列組成的核苷酸序列，及(III)由編碼如請求項1至20中任一項之抗體中重鏈或輕鏈之部分或完整胺基酸序列之核苷酸序列組成的核苷酸序列。
  22. 一種重組載體，其含有如請求項21之核苷酸序列之插入物。
  23. 一種重組細胞，其含有引入其中之如請求項21之核苷酸序列或如請求項22之重組載體。
  24. 一種細胞，其產生如請求項1至20中任一項之抗體。
  25. 一種產生如請求項1至20中任一項之抗體或其功能性片段之方法，其包含以下步驟(I)及(II)：(I)培養如請求項23或24之細胞；及(II)自在該步驟(I)中獲得之培養物收集如請求項1至20中任一項之抗體或其功能性片段。
  26. 一種抗體或其功能性片段，其係藉由如請求項25之製造方法產生。
  27. 一種如請求項1至20及26中任一項之抗體或其功能性片段之修飾形式。
  28. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至20及26中任一項之抗體或其功能性片段或如請求項27之修飾形式作為活性成份。
  29. 如請求項28之醫藥組合物，其中該醫藥組合物係用於治療或預防血管生成性疾病。
  30. 如請求項29之所使用醫藥組合物，其中該血管生成性疾病係滲出性年齡相關性黃斑點退化、糖尿病性視網膜病變、黃斑水腫、良性或惡性腫瘤、動脈粥樣硬化、晶狀體後纖維組織增生、血管瘤、慢性發炎、新生血管性眼病、增生性視網膜病變、新生血管性青光眼、角膜組織移植物或其他組織移植物之免疫排斥、類風濕性關節炎、牛皮癬、急性發炎、敗血症或肥胖症。
  31. 如請求項29之所使用醫藥組合物，其中該血管生成性疾病係滲出性年齡相關性黃斑點退化、糖尿病性視網膜病變、黃斑水腫、晶狀體後纖維組織增生、新生血管性眼病、增生性視網膜病變、新生血管性青光眼或角膜組織移植物之免疫排斥。
  32. 一種血管生成抑制劑，其包含如請求項1至20及26中任一項之抗體或其功能性片段或如請求項27之修飾形式作為活性成份。
  33. 一種用於治療或預防血管生成性疾病之方法，其包含向有需要之個體投與有效量之如請求項1至20及26中任一項之抗體或其功能性片段或如請求項27之修飾形式或如請求項28至31中任一項之組合物。
  34. 如請求項28至31中任一項之醫藥組合物，其中該組合物係與另一治療劑或預防劑組合使用。
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