TWI669313B - 抗ＦＧＦＲ２抗體及其製造方法、及檢測或測定人類ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ之方法 - Google Patents

抗ＦＧＦＲ２抗體及其製造方法、及檢測或測定人類ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ之方法 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種與纖維母細胞生長因子受體結合之抗體。

Description

抗FGFR2抗體及其製造方法、及檢測或測定人類FGFR2IIIb之方法
本發明係關於新穎的抗體、包含編碼為該抗體具有之胺基酸序列之鹼基序列的核苷酸、插入有該核苷酸之載體、導入有該核苷酸或載體之細胞、包含培養該細胞之步驟的該抗體之製造方法、含有該抗體之醫藥組成物、含有該抗體之診斷用組成物、該抗體之功能性片段、該抗體之修飾體等。
已知纖維母細胞生長因子(FGF)由FGF受體(FGFR)訊息中介，在胚胎形成、組織動態平衡(Homeostasis)及代謝發揮重要作用(非專利文獻1)。於人類，存在22種FGF(FGF1至14、及FGF16至23)及具有酪胺酸激酶區域之4種FGF受體(FGFR1至4：以下總稱為「FGFRs」)。FGFRs，係包括以下部分而構成：由包含2個或3個類免疫球蛋白區域(IgD1至3)構成之配體結合部位的細胞外區、1次膜貫通區、及包含酪胺酸激酶區域之細胞內區。FGFR1、FGFR2及FGFR3，存在稱為IIIb及IIIc的各2個切割變異體(splicing variant)。該等異構體(isoform)於IgD3之後半有約50個胺基酸序列相異，顯示相異之組織分布及配體特異性。一般而言，已知IIIb異構 體係於上皮細胞表現，IIIc係於間葉細胞(Mesenchymal cell)表現。FGFs若與FGFRs結合，FGFRs會二聚體化，且特定之酪胺酸殘基被磷酸化。此現象會促進如FGFR基質2α(FRS2α)之重要適應蛋白的補充，誘導包括MAPK及PI3K/Akt路徑的多數訊息路徑的活化(1)。其結果，FGFs及此等所對應之受體，控制包括生長、分化、運動及生存之廣泛的細胞功能。
FGFRs之異常活化，已知與特定之人類之惡性腫瘤相關(非專利文獻1及2)。尤其，已有以下見解：FGFR2訊息異常與癌症間的關連性，係FGFR2與其配體之過度表現、受體變異或基因放大、及異構體之切換(switching)等。具體而言，據報告：FGFR2之內含子(intron)2內之單一鹼基變異多型(SNP)，與FGFR2之高表現所致之乳癌進行之危險性相關(非專利文獻3及4)。將FGFR2經常性的活化的錯義(missense)變異，在子宮內膜癌、卵巢癌、乳癌、肺癌及胃癌已有報告(非專利文獻2、3及5)。又，FGFR2基因之放大或過度表現，在胃癌及乳癌已有報告(非專利文獻2、3及5)。再者，也已知FGFR2IIIb切換到FGFR2IIIc之類別切換(class switch)會發生於前列腺癌或腎癌的進行中，與預後不良相關(非專利文獻6及7)。
如以上，由於FGFR2過度表現或變異、IIIb切換為IIIc與許多型式之癌症間的關連性，暗示FGFR2可能成為對抗癌症之優良的治療標的。實際上，為了明白腫瘤形成時FGFR2的作用及找出FGFR2作為癌治療標 的的可能性，已有人取得對抗FGFR2之單株抗體，並於前臨床試驗評價抗腫瘤作用(非專利文獻8及9)。任一抗體均顯示具有抑制來自對於FGFR2IIIb之配體的訊息的中和作用，但是，未有人報告ADCC等之效應功能或具有對於IIIc之中和作用的功能抗體。
[先前技術文獻] [非專利文獻]
[非專利文獻1]Eswarakumar,V.P.,et al.,J.Cytokine Growth Factor Rev.,2005年4月刊，16卷(2號)，139至149頁、2005年2月1日電子公布，Review
[非專利文獻2].Turner,N.and Grose,R.,Nat.Rev.Cancer,2010年2月刊，10卷(2號)，116至129頁，Review
[非專利文獻3]Easton,D.F.,et al.,Nature,2007年6月28日刊，447卷(7148號)，1087至1093頁
[非專利文獻4]Hunter DJ,et al.,Nat.Genet.,2007年7月刊，39卷(7號)，870至874頁，2007年5月27日電子公布
[非專利文獻5]Katoh,Y.and Katoh,M.,Int.J.Mol.Med.,2009年3月刊，23卷(3號)，307至311頁，Review
[非專利文獻6]Chaffer,C.L.,et al.,Differentiation,2007年11月刊，75.卷(9號)，831至842頁，2007年8月14日電子公布，Review
[非專利文獻7]Carstens,R.P.,et al.,Oncogene,1997年12月18日刊，15卷(25號)，3059至3065頁
[非專利文獻8]Zhao,W.M.,et al.,Clin.Cancer Res., 201年12月1日刊,16卷(23號),5750至5758頁、2010年7月29日電子公布
[非專利文獻9]Bai, A., et al.,Cancer Res.,2010年10月1日刊,70卷(19號),7630至7639頁,2010年8月13日電子公布
本發明之一課題在於提供對於FGFR2之抗體。
本發明之另一課題，在於提供具有抗癌作用之含有抗FGFR2抗體之醫藥組成物等。
又，本發明之課題，包括：編碼為該抗體具有胺基酸序列之核苷酸、插入有該核苷酸之載體、導入有該核苷酸或載體之細胞、包含培養該細胞之步驟之該抗體之製造方法等。
再者，本發明之另一課題，在於提供使用該抗體之癌症之治療方法。
發明人等為了解決上述課題，努力探討，創製新穎的抗FGFR2抗體，並發現該抗體具有抗癌作用，乃完成本發明。
本發明係關於：
(1)一種抗體或其功能性片段，其係具有抗體依賴性細胞傷害活性且結合於纖維母細胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor：FGFR)。
(2)如(1)之抗體或其功能性片段，其中，該纖維母細胞生長因子受體(FGFR)為人類FGFR。
(3)如(1)或(2)之抗體或其功能性片段，其中，該纖維母細胞生長因子受體(FGFR)為FGFR2。
(4)如(1)至(3)中任一項之抗體或其功能性片段，其係結合於人類纖維母細胞生長因子受體2(人類FGFR2)IIIb及/或人類纖維母細胞生長因子受體2(人類FGFR2)IIIc。
(5)如(1)至(4)中任一項之抗體或其功能性片段，其係結合於人類纖維母細胞生長因子受體2(人類FGFR2)IIIb及人類纖維母細胞生長因子受體(人類FGFR2)IIIc。
(6)如(1)至(5)中任一項之抗體或其功能性片段，其係結合於人類纖維母細胞生長因子受體2具有之類免疫球蛋白區域之一個或二個以上。
(7)如(1)至(6)中任一項之抗體或其功能性片段，其係結合於人類纖維母細胞生長因子受體2具有之類免疫球蛋白區域2。
(8)如(1)至(4)及(6)中任一項之抗體或其功能性片段，其係結合於人類纖維母細胞生長因子受體2具有之類免疫球蛋白區域3。
(9)如(1)至(8)中任一項之抗體或其功能性片段，其對於人類纖維母細胞生長因子受體2(人類FGFR2)IIIb及/或人類纖維母細胞生長因子受體2(人類FGFR2)IIIc具有中和活性。
(10)如(1)至(9)中任一項之抗體或其功能性片段，其對於人類纖維母細胞生長因子受體2(人類FGFR2)IIIb及人類纖維母細胞生長因子受體2(人類FGFR2)IIIc具有中和活性。
(11)如(1)至(10)中任一項之抗體或其功能性片段，其具有抗腫瘤活性。
(12)如(11)之抗體或其功能性片段，其於體內(in vivo)顯示抗腫瘤活性。
(13)如(1)至(4)、(6)、(8)、(9)、(11)及(12)中任一項之抗體或其功能性片段，其係包含重鏈與輕鏈而構成且結合於人類FGFR2；該重鏈係包含CDRH1、CDRH2及CDRH3而構成，該CDRH1含有序列表之序列編號52(第60圖)所示之胺基酸序列或該胺基酸序列中有1個胺基酸被取代而成之胺基酸序列、該CDRH2含有序列表之序列編號53(第61圖)所示之胺基酸序列或該胺基酸序列中有1個胺基酸被取代而成之胺基酸序列、該CDRH3含有序列表之序列編號54(第62圖)所示之胺基酸序列或該胺基酸序列中有1個胺基酸被取代而成之胺基酸序列；該輕鏈係包含CDRL1、CDRL2及CDRL3而構成，該CDRL1含有序列表之序列編號61(第69圖)所示之胺基酸序列或該胺基酸序列中有1個胺基酸被取代而成之胺基酸序列、該CDRL2含有序列表之序列編號62(第70圖)所示之胺基酸序列或該胺基酸序列中有1個胺基酸被取代而成之胺基酸序列、該CDRL3含有序列表之序列編 號63(第71圖)所示之胺基酸序列或該胺基酸序列中有1個胺基酸被取代而成之胺基酸序列。
(14)如(1)至(7)及(9)至(12)中任一項之抗體或其功能性片段，其係包含重鏈與輕鏈而構成且結合於人類FGFR2；該重鏈係包含CDRH1、CDRH2及CDRH3而構成，該CDRH1含有序列表之序列編號55(第63圖)所示之胺基酸序列或該胺基酸序列中有1個胺基酸被取代而成之胺基酸序列、該CDRH2含有序列表之序列編號56(第64圖)所示之胺基酸序列或該胺基酸序列中有1個胺基酸被取代而成之胺基酸序列、該CDRH3含有序列表之序列編號57(第65圖)所示之胺基酸序列或該胺基酸序列中有1個胺基酸被取代而成之胺基酸序列；該輕鏈係包含CDRL1、CDRL2及CDRL3而構成，該CDRL1含有序列表之序列編號64(第72圖)所示之胺基酸序列或該胺基酸序列中有1個胺基酸被取代而成之胺基酸序列、該CDRL2含有序列表之序列編號65(第73圖)所示之胺基酸序列或該胺基酸序列中有1個胺基酸被取代而成之胺基酸序列、該CDRL3含有序列表之序列編號66(第74圖)所示之胺基酸序列或該胺基酸序列中有1個胺基酸被取代而成之胺基酸序列。
(15)如(1)至(7)及(9)至(12)中任一項之抗體或其功能性片段，其係包含重鏈與輕鏈而構成且結合於人類FGFR2；該重鏈係包含CDRH1、CDRH2及CDRH3而構成， 該CDRH1含有序列表之序列編號58(第66圖)所示之胺基酸序列或該胺基酸序列中有1個胺基酸被取代而成之胺基酸序列、該CDRH2含有序列表之序列編號59(第67圖)所示之胺基酸序列或該胺基酸序列中有1個胺基酸被取代而成之胺基酸序列、該CDRH3含有序列表之序列編號60(第68圖)所示之胺基酸序列或該胺基酸序列中有1個胺基酸被取代而成之胺基酸序列；該輕鏈係包含CDRL1、CDRL2及CDRL3而構成，該CDRL1含有序列表之序列編號67(第75圖)所示之胺基酸序列或該胺基酸序列中有1個胺基酸被取代而成之胺基酸序列、該CDRL2含有序列表之序列編號68(第76圖)所示之胺基酸序列或該胺基酸序列中有1個胺基酸被取代而成之胺基酸序列、該CDRL3含有序列表之序列編號69(第77圖)所示之胺基酸序列或該胺基酸序列中有1個胺基酸被取代而成之胺基酸序列。
(16)如(15)之抗體或其功能性片段，其中，CDRH3含有序列表之序列編號60(第68圖)所示之胺基酸序列中有1個胺基酸被取代而成之胺基酸序列。
(17)如(1)至(16)中任一項之抗體或其功能性片段，其中，該抗體為單株抗體。
(18)如(1)至(17)中任一項之抗體或其功能性片段，其中，該抗體為嵌合抗體。
(19)如(1)至(18)中任一項之抗體或其功能性片段，其中，該抗體為人類化抗體。
(20)如(19)之抗體或其功能性片段，其中，該抗體係 選自於下列(i)至(xix)：(i)包含含序列編號73(第81圖)所示之胺基酸序列的輕鏈及含序列編號97(第105圖)所示之胺基酸序列之重鏈而成的人類化抗體(hFR2-14_H19/L1)；(ii)包含含序列編號73(第81圖)所示之胺基酸序列之輕鏈及含序列編號97(第105圖)所示之胺基酸序列之重鏈而成的人類化抗體(hFR2-14_H12/L1)；(iii)包含含序列編號73(第81圖)所示之胺基酸序列之輕鏈及含序列編號89(第97圖)所示之胺基酸序列之重鏈而成的人類化抗體(hFR2-14_H8/L1)；(iv)包含含序列編號73(第81圖)所示之胺基酸序列之輕鏈及含序列編號95(第103圖)所示之胺基酸序列之重鏈而成的人類化抗體(hFR2-14_H11/L1)；(v)包含含序列編號73(第81圖)所示之胺基酸序列之輕鏈及含序列編號83(第91圖)所示之胺基酸序列之重鏈而成的人類化抗體(hFR2-14_H5/L1)；(vi)包含含序列編號73(第81圖)所示之胺基酸序列之輕鏈及含序列編號75(第83圖)所示之胺基酸序列之重鏈而成的人類化抗體(hFR2-14_H1/L1)；(vii)包含含序列編號73(第81圖)所示之胺基酸序列之輕鏈及含序列編號77(第85圖)所示之胺基酸序列之重鏈而成之人類化抗體(hFR2-14_H2/L1)；(viii)包含含序列編號73(第81圖)所示之胺基酸序列之輕鏈及含序列編號79(第87圖)所示之胺基酸序列之重鏈而成之人類化抗體(hFR2-14_H3/L1)； (ix)包含含序列編號73(第81圖)所示之胺基酸序列之輕鏈及含序列編號81(第89圖)所示之胺基酸序列之重鏈而成之人類化抗體(hFR2-14_H4/L1)；(x)包含含序列編號73(第81圖)所示之胺基酸序列之輕鏈及含序列編號85(第93圖)所示之胺基酸序列之重鏈而成之人類化抗體(hFR2-14_H6/L1)；(xi)包含含序列編號73(第81圖)所示之胺基酸序列之輕鏈及含序列編號87(第95圖)所示之胺基酸序列之重鏈而成之人類化抗體(hFR2-14_H7/L1)；(xii)包含含序列編號73(第81圖)所示之胺基酸序列之輕鏈及含序列編號91(第99圖)所示之胺基酸序列之重鏈而成之人類化抗體(hFR2-14_H9/L1)；(xiii)包含含序列編號73(第81圖)所示之胺基酸序列之輕鏈及含序列編號93(第101圖)所示之胺基酸序列之重鏈而成之人類化抗體(hFR2-14_H10/L1)；(xiv)包含含序列編號73(第81圖)所示之胺基酸序列之輕鏈及含序列編號99(第107圖)所示之胺基酸序列之重鏈而成之人類化抗體(hFR2-14_H13/L1)；(xv)包含含序列編號73(第81圖)所示之胺基酸序列之輕鏈及含序列編號101(第109圖)所示之胺基酸序列之重鏈而成之人類化抗體(hFR2-14_H14/L1)；(xvi)包含含序列編號73(第81圖)所示之胺基酸序列之輕鏈及含序列編號103(第111圖)所示之胺基酸序列之重鏈而成之人類化抗體(hFR2-14_H15/L1)；(xvii)包含含序列編號73(第81圖)所示之胺基酸序列之輕鏈及含序列編號105(第113圖)所示之胺基酸序列之重鏈而成之類化抗體(hFR2-14_H16/L1)；(xiii)包含含序列編號73(第81圖)所示之胺基酸序列之輕鏈及含序列編號107(第115圖)所示之胺基酸序列之重鏈而成之人類化抗體(hFR2-14_H17/L1)；及(xix)包含含序列編號73(第81圖)所示之胺基酸序列之輕鏈及含序列編號109(第117圖)所示之胺基酸序列之重鏈而成之人類化抗體(hFR2-14_H18/L1)。
(21)如(1)至(12)中任一項之抗體或其功能性片段，其係包含與如(20)之抗體之重鏈及輕鏈之胺基酸序列各有95%以上為相同之胺基酸序列的重鏈及輕鏈而成，且結合於人類FGFR2。
(22)如(1)至(12)中任一項之抗體或其功能性片段，其係結合於如(13)至(16)及(20)中任一項之抗體所辨識之抗原上之部位。
(23)如(1)至(12)中任一項之抗體或其功能性片段，其係與如(13)至(16)及(20)中任一項之抗體競爭與人類FGFR2之結合。
(24)如(1)至(12)中任一項之抗體或其功能性片段，其係結合於包含序列編號70(第78圖)所示之胺基酸序列中之155號之酪胺酸(Tyr)、157號之蘇胺酸(Thr)、176號之離胺酸(Lys)、181號之丙胺酸(Ala)、182號之甘胺酸(Gly)、183號之甘胺酸(Gly)、184號之天冬醯胺酸(Asn)、185號之脯胺酸(Pro)、186號之甲硫胺酸(Met)、188號之蘇胺酸(Thr)、200號之麩醯胺酸(Gln)、201號之麩胺酸 (Glu)、205號之甘胺酸(Gly)、206號之甘胺酸(Gly)、208號之離胺酸(Lys)、209號之纈胺酸(Val)、210號之精胺酸(Arg)、211號之天冬醯胺酸(Asn)、212號之麩醯胺酸(Gln)、213號之組胺酸(His)、214號之色胺酸(Trp)、及217號之異白胺酸(Ile)之各殘基而構成之人類FGFR2上之抗原決定位。
(25)如(1)至(12)中任一項之抗體或其功能性片段，其與序列編號70(第78圖)所示之胺基酸序列中之155號之酪胺酸(Tyr)、157號之蘇胺酸(Thr)、176號之離胺酸(Lys)、181號之丙胺酸(Ala)、182號之甘胺酸(Gly)、183號之甘胺酸(Gly)、184號之天冬醯胺酸(Asn)、185號之脯胺酸(Pro)、186號之甲硫胺酸(Met)、188號之蘇胺酸(Thr)、200號之麩醯胺酸(Gln)、201號之麩胺酸(Glu)、205號之甘胺酸(Gly)、206號之甘胺酸(Gly)、208號之離胺酸(Lys)、209號之纈胺酸(Val)、210號之精胺酸(Arg)、211號之天冬醯胺酸(Asn)、212號之麩醯胺酸(Gln)、213號之組胺酸(His)、214號之色胺酸(Trp)、及217號之異白胺酸(Ile)之各殘基之間具有交互作用距離。
(26)如(25)之抗體或其功能性片段，其中，該交互作用距離為6埃以下。
(27)如(25)或(26)之抗體或其功能性片段，其中，該交互作用距離為4埃以下。
(28)如(1)至(12)及(21)至(27)中任一項之抗體或其功能性片段，其中，該抗體為人類抗體。
(29)如(1)至(28)中任一項之抗體或其功能性片段， 其抑制FGF對於人類FGFR2之結合。
(30)如(1)至(29)中任一項之抗體或其功能性片段，其具有抗體依賴性細胞傷害活性及/或抗體依賴性細胞媒介吞噬活性。
(31)一種核苷酸，其係下列(i)至(iii)中任一項之核苷酸：(i)包含編碼為如(1)至(30)中任一項之抗體之重鏈或輕鏈之部分或全部胺基酸序列的鹼基序列而成之核苷酸；(ii)由包含編碼為如(1)至(30)中任一項之抗體之重鏈或輕鏈之部分或全部胺基酸序列之鹼基序列的鹼基序列構成之核苷酸；及(iii)由編碼為如(1)至(30)中任一項之抗體之重鏈或輕鏈之部分或全部胺基酸序列的鹼基序列構成。
(32)一種重組載體，其係插入有如(31)之核苷酸。
(33)一種重組細胞，係導入有如(31)之核苷酸或如(32)之重組載體。
(34)一種細胞，其係產生如(1)至(30)中任一項之抗體或其功能性片段。
(35)一種抗體或其功能性片段之製造方法，其係製造如(1)至(30)中任一項之抗體或其功能性片段之方法，包含下列步驟(i)及(ii)：(i)培養如(33)或(34)之細胞；及(ii)從該步驟(i)獲得之培養物回收如(1)至(30)中任一項之抗體或其功能性片段。
(36)如(1)至(12)中任一項之抗體或其功能性片段，其係利用如(35)之方法而獲得。
(37)如(1)至(30)及(36)中任一項之抗體或其功能性片段，其中，重鏈或輕鏈之胺基末端或羧基末端有1至5個胺基酸缺失。
(38)一種修飾體，其係如(1)至(30)、(36)及(37)中任一項之抗體或其功能性片段之修飾體。
(39)如(38)之修飾體，其係糖鏈修飾經調節而成。
(40)如(39)之修飾體，其中，該抗體係選自於如(20)之(i)至(xix)中任一者。
(41)一種醫藥組成物，其係包含如(1)至(30)、(36)及(37)中任一項之抗體或其功能性片段、或如(38)至(40)中任一項之修飾體作為有效成分而成。
(42)如(41)之醫藥組成物，其係抗癌劑。
(43)如(42)之醫藥組成物，其中，該癌為FGFR2陽性。
(44)一種癌檢查用或診斷用之組成物，係包含如(1)至(30)、(36)及(37)中任一項之抗體或其功能性片段、或如(38)至(40)中任一項之修飾體而成。
(45)一種組成物，其係包含具有人類FGFR2IIIb選擇性之抗體或其功能性片段或其修飾體。
(46)如(45)之組成物，其中，該抗體係包含如(13)之含CDRH1至CDRH3之重鏈及含CDRL1至CDRL3之輕鏈而成。
(47)如(46)之組成物，其中，該抗體係包含具有序列 編號12(第20圖)所示之胺基酸序列之重鏈可變區及具有序列編號21(第29圖)所示之胺基酸序列之輕鏈可變區而成。
(48)如(46)或(47)之組成物，其中，該抗體為嵌合抗體或大鼠抗體。
(49)如(45)至(48)中任一項之組成物，其係人類FGFRIIIb之偵測用或測定用。
(50)一種偵測或測定人類FGFRIIIb之方法，其係包含使如(45)至(48)中任一項之組成物與待驗樣本接觸之步驟。
(51)一種偵測或測定人類FGFRIIIc之方法，係包含下列步驟(i)至(iii)：(i)使包含對於人類FGFRIIIb與人類FGFRIIIc選擇性結合之抗體或其功能性片段或其修飾體的組成物接觸待驗樣本，並偵測或測定待驗樣本中之人類FGFRIIIb與人類FGFRIIIc；(ii)使如(45)至(49)中任一項之組成物接觸待驗樣本，並偵測或測定待驗樣本中之人類FGFRIIIb；(iii)將步驟(i)中之偵測或測定之結果與步驟(ii)中之偵測或測定之結果比較、或將步驟(i)中之偵測或測定之結果減去步驟(ii)中之偵測或測定之結果，以獲得待驗樣本中之人類FGFRIIIc之偵測或測定之結果或值。
(52)如(45)至(49)中任一項之組成物或如(50)或(51)之方法，其係人類FGFR 2陽性癌之診斷或檢查用。
(53)一種鑑定方法，係鑑定投予如(41)至(43)中任一 項之醫藥組成物之個體之方法，包含下列步驟(i)至(iii)：(i)使如(44)至(49)中任一項之組成物接觸來自個體之樣本；(ii)偵測或測定該樣本中之人類FGFR2；及(iii)於該樣本中偵測或測定到人類FGFR2的情形，判定該個體為陽性。
(54)如(53)之鑑定方法，其中，該人類FGFR2為人類FGFR2IIIb。
(55)如(53)之鑑定方法，其中，該人類FGFR2為人類FGFR2IIIc及人類FGFR2IIIb。
(56)如(44)至(49)中任一項之組成物，其係使用於如(53)至(55)中任一項之鑑定方法。
(57)如(53)至(55)中任一項之鑑定方法或如(56)之組成物，其中，該個體係罹癌或有罹癌風險。
(58)如(41)至(43)中任一項之醫藥組成物，其係對於由如(53)至(55)中任一項之鑑定方法鑑定為陽性之個體投予。
(59)一種試藥，其係包含如(1)至(30)、(36)及(37)中任一項之抗體或其功能性片段、或如(38)至(40)中任一項之修飾體而成。
(60)一種具有抗腫瘤活性之物質之鑑定方法，係包含下列步驟(i)至(iii)：(i)使待驗物質接觸包含序列編號70(第78圖)所示之胺基酸序列中之155號胺基酸之酪胺酸(Tyr)至217號之異白胺酸(Ile)之蛋白質；(ii)測定或決定該蛋白質中之序列編號70所示之胺基酸序列中之155號之酪胺酸(Tyr)、157號之蘇胺酸(Thr)、176號之離胺酸(Lys)、181號之丙胺酸(Ala)、182號之甘胺酸(Gly)、183號之甘胺酸(Gly)、184號之天冬醯胺酸(Asn)、185號之脯胺酸(Pro)、186號之甲硫胺酸(Met)、188號之蘇胺酸(Thr)、200號之麩醯胺酸(Gln)、201號之麩胺酸(Glu)、205號之甘胺酸(Gly)、206號之甘胺酸(Gly)、208號之離胺酸(Lys)、209號之纈胺酸(Val)、210號之精胺酸(Arg)、211號之天冬醯胺酸(Asn)、212號之麩醯胺酸(Gln)、213號之組胺酸(His)、214號之色胺酸(Trp)、及217號之異白胺酸(Ile)之各殘基與該物質間的距離；及(iii)當各殘基與該物質具有交互作用距離的情形，判定該物質為陽性。
(61)如(60)之具有抗腫瘤活性之物質之鑑定方法，更包含下列步驟(iv)：(iv)測定該物質之抗腫瘤活性。
(62)如(60)或(61)之具有抗腫瘤活性之物質之鑑定方法，其中，該物質為抗體、其功能性片段或其修飾體、或胜肽。
(63)一種具有抗腫瘤活性之物質之製造方法，包含以下步驟：利用包含基因重組、胜肽合成或體外轉譯之步驟製備在如(60)或(61)之步驟(iii)判定為陽性之物質。
第1圖係顯示利用流式細胞計數法驗證大鼠抗FGFR2抗體(FR2-10、FR2-13及FR2-14)對於人類FGFR2之結合活性之圖。縱軸代表由流式細胞計數法測得之平均螢光強度之相對值。
第2圖係顯示利用流式細胞計數法驗證大鼠抗FGFR2抗體(FR2-10、FR2-13及FR2-14)之人類FGFR2結合抗原決定位之圖。縱軸代表由流式細胞計數法測得之平均螢光強度之相對值
第3A圖係顯示利用Elk1轉報告基因分析法(trans-reporter assay)測得之大鼠抗FGFR2抗體(FR2-10、FR2-13及FR2-14)對於人類FGFR2IIIb之訊息中和活性之圖。
第3B圖係顯示利用Elk1轉報告基因分析法測得之大鼠抗FGFR2抗體(FR2-10、FR2-13及FR2-14)對於人類FGFR2IIIc之訊息中和活性之圖。
第4圖係利用西方墨點法顯示大鼠抗FGFR2抗體FR2-10對於FGFR2之訊息抑制作用之圖。驗證了由於對於人類胃癌細胞株SNU-16添加FGF7而誘導之FGFR2、FRS2、ERK之磷酸化，受到大鼠FR2-10抗體添加所抑制。
第5圖係顯示利用Cell-ELISA法驗證人類嵌合化抗FGFR2抗體(cFR2-10、cFR2-13、cFR2-14)對於人類FGFR2之結合活性之圖。
第6A圖係顯示利用Elk1轉報告基因分析法測得之人 類嵌合化抗FGFR2抗體(cFR2-10、cFR2-13、cFR2-14)對於人類FGFR2IIIb之訊息中和活性之圖。
第6B圖係顯示利用Elk1轉報告基因分析法測得之人類嵌合化抗FGFR2抗體(cFR2-10、cFR2-13、cFR2-14)對於人類FGFR2IIIc之訊息中和活性之圖。
第7圖係顯示人類嵌合化抗FGFR2抗體(cFR2-10、cFR2-13、cFR2-14)之ADCC活性之圖。將人類FGFR2IIIb表現293T-lacZ細胞作為標的細胞、人類PBMC作為效應細胞。
第8圖係顯示人類嵌合化抗FGFR2抗體(cFR2-10、cFR2-13、cFR2-14)在人類胃癌細胞株SNU-16移植裸小鼠中之體內抗腫瘤活性之圖。A)係針對cFR2-10抗體、B)係針對cFR2-13抗體、C)係針對cFR2-14抗體之結果。
第9圖顯示相當於大鼠抗FGFR2抗體FR2-10之重鏈之譜帶之N端之胺基酸序列(序列表之序列編號1)。
第10圖顯示相當於大鼠抗FGFR2抗體FR2-10之輕鏈之譜帶之N端之胺基酸序列(序列表之序列編號2)。
第11圖顯示相當於大鼠抗FGFR2抗體FR2-13之重鏈之譜帶之N端之胺基酸序列(序列表之序列編號3)。
第12圖顯示相當於大鼠抗FGFR2抗體FR2-13之輕鏈之譜帶之N端之胺基酸序列(序列表之序列編號4)。
第13圖顯示相當於大鼠抗FGFR2抗體FR2-14重鏈之譜帶之N端之胺基酸序列(序列表之序列編號5)。
第14圖顯示相當於大鼠抗FGFR2抗體FR2-14之輕鏈之譜帶之N端之胺基酸序列(序列表之序列編號6)。
第15圖顯示大鼠重鏈放大用引子(序列表之序列編號7)。
第16圖顯示FR2-10重鏈用之定序引子(序列表之序列編號8)。
第17圖顯示FR2-13重鏈用之定序引子(序列表之序列編號9)。
第18圖顯示FR2-14重鏈用之定序引子(序列表之序列編號10)。
第19圖顯示編碼為大鼠抗FGFR2抗體FR2-10之重鏈可變區之cDNA之鹼基序列(序列表之序列編號11)。
第20圖顯示大鼠抗FGFR2抗體FR2-10之重鏈可變區之胺基酸序列(序列表之序列編號12)。
第21圖顯示編碼為大鼠抗FGFR2抗體FR2-13之重鏈可變區之cDNA之鹼基序列(序列表之序列編號13)。
第22圖顯示大鼠抗FGFR2抗體FR2-13之重鏈可變區之胺基酸序列(序列表之序列編號14)。
第23圖顯示編碼為大鼠抗FGFR2抗體FR2-14之重鏈可變區之cDNA之鹼基序列(序列表之序列編號15)。
第24圖顯示大鼠抗FGFR2抗體FR2-14之重鏈可變區之胺基酸序列(序列表之序列編號16)。
第25圖顯示大鼠輕鏈放大用引子(序列表之序列編號17)。
第26圖顯示大鼠輕鏈用之定序引子(序列表之序列編號18)。
第27圖顯示FR2-10輕鏈用之定序引子(序列表之序 列編號19)。
第28圖顯示編碼為大鼠抗FGFR2抗體FR2-10之輕鏈可變區之cDNA之鹼基序列(序列表之序列編號20)。
第29圖顯示大鼠抗FGFR2抗體FR2-10之輕鏈之可變區之胺基酸序列(序列表之序列編號21)。
第30圖顯示大鼠FR2-13及FR2-14輕鏈放大用引子(序列表之序列編號22)。
第31圖顯示編碼為大鼠抗FGFR2抗體FR2-13之輕鏈可變區之cDNA之鹼基序列(序列表之序列編號23)。
第32圖顯示大鼠抗FGFR2抗體FR2-13之輕鏈之可變區之胺基酸序列(序列表之序列編號24)。
第33圖顯示編碼為大鼠抗FGFR2抗體FR2-14之輕鏈可變區之cDNA之鹼基序列(序列表之序列編號25)。
第34圖顯示大鼠抗FGFR2抗體FR2-14之輕鏈之可變區之胺基酸序列(序列表之序列編號26)。
第35圖顯示包含編碼為人類κ鏈分泌訊息序列及人類κ鏈不變區之胺基酸之DNA序列的DNA片段(序列表之序列編號27)。
第36圖顯示輕鏈表現載體用引子F(序列表之序列編號28)。
第37圖顯示輕鏈表現載體用引子R(序列表之序列編號29)。
第38圖顯示包含編碼為人類重鏈訊息序列及人類IgG1不變區之胺基酸的DNA序列的DNA片段(序列表之序列編號30)。
第39圖顯示人類嵌合化FR2-10(cFR2-10)輕鏈之鹼基序列(序列表之序列編號31)。
第40圖顯示人類嵌合化FR2-10(cFR2-10)輕鏈之胺基酸序列(序列表之序列編號32)。
第41圖顯示人類嵌合化FR2-10輕鏈用引子組F(序列表之序列編號33)。
第42圖顯示人類嵌合化FR2-10輕鏈用引子組R(序列表之序列編號34)。
第43圖顯示人類嵌合化FR2-10(cFR2-10)重鏈之鹼基序列(序列表之序列編號35)。
第44圖顯示人類嵌合化FR2-10(cFR2-10)重鏈之胺基酸序列(序列表之序列編號36)。
第45圖顯示人類嵌合化FR2-10重鏈用引子組F(序列表之序列編號37)。
第46圖顯示人類嵌合化FR2-10重鏈用引子組R(序列表之序列編號38)。
第47圖顯示人類嵌合化FR2-13(cFR2-13)輕鏈之鹼基序列(序列表之序列編號39)。
第48圖顯示人類嵌合化FR2-13(cFR2-13)輕鏈之胺基酸序列(序列表之序列編號40)。
第49圖顯示人類嵌合化FR2-13輕鏈用引子F(序列表之序列編號41)。
第50圖顯示人類嵌合化FR2-13輕鏈用引子R(序列表之序列編號42)。
第51圖顯示人類嵌合化FR2-13(cFR2-13)重鏈之鹼 基序列(序列表之序列編號43)。
第52圖顯示人類嵌合化FR2-13(cFR2-13)重鏈之胺基酸序列(序列表之序列編號44)。
第53圖顯示人類嵌合化FR2-13重鏈用引子F(序列表之序列編號45)。
第54圖顯示人類嵌合化FR2-13重鏈用引子R(序列表之序列編號46)。
第55圖顯示人類嵌合化FR2-14(cFR2-14)輕鏈之鹼基序列(序列表之序列編號47)。
第56圖顯示人類嵌合化FR2-14(cFR2-14)輕鏈之胺基酸序列(序列表之序列編號48)。
第57圖顯示人類嵌合化FR2-14輕鏈用引子(序列表之序列編號49)。
第58圖顯示人類嵌合化FR2-14(cFR2-14)重鏈之鹼基序列(序列表之序列編號50)。
第59圖顯示人類嵌合化FR2-14(cFR2-14)重鏈之胺基酸序列(序列表之序列編號51)。
第60圖顯示大鼠抗FGFR2抗體FR2-10之重鏈CDR1之胺基酸序列(序列表之序列編號52)。
第61圖顯示大鼠抗FGFR2抗體FR2-10之重鏈CDR2之胺基酸序列(序列表之序列編號53)。
第62圖顯示大鼠抗FGFR2抗體FR2-10之重鏈CDR3之胺基酸序列(序列表之序列編號54)。
第63圖顯示大鼠抗FGFR2抗體FR2-13之重鏈CDR1之胺基酸序列(序列表之序列編號55)。
第64圖顯示大鼠抗FGFR2抗體FR2-13之重鏈CDR2之胺基酸序列(序列表之序列編號56)。
第65圖顯示大鼠抗FGFR2抗體FR2-13之重鏈CDR3之胺基酸序列(序列表之序列編號57)。
第66圖顯示大鼠抗FGFR2抗體FR2-14之重鏈CDR1之胺基酸序列(序列表之序列編號58)。
第67圖顯示大鼠抗FGFR2抗體FR2-14之重鏈CDR2之胺基酸序列(序列表之序列編號59)。
第68圖顯示大鼠抗FGFR2抗體FR2-14之重鏈CDR3之胺基酸序列(序列表之序列編號60)。
第69圖顯示大鼠抗FGFR2抗體FR2-10之輕鏈CDR1之胺基酸序列(序列表之序列編號61)。
第70圖顯示大鼠抗FGFR2抗體FR2-10之輕鏈CDR2之胺基酸序列(序列表之序列編號62)。
第71圖顯示大鼠抗FGFR2抗體FR2-10之輕鏈CDR3之胺基酸序列(序列表之序列編號63)。
第72圖顯示大鼠抗FGFR2抗體FR2-13之輕鏈CDR1之胺基酸序列(序列表之序列編號64)。
第73圖顯示大鼠抗FGFR2抗體FR2-13之輕鏈CDR2之胺基酸序列(序列表之序列編號65)。
第74圖顯示大鼠抗FGFR2抗體FR2-13之輕鏈CDR3之胺基酸序列(序列表之序列編號66)。
第75圖顯示大鼠抗FGFR2抗體FR2-14之輕鏈CDR1之胺基酸序列(序列表之序列編號67)。
第76圖顯示大鼠抗FGFR2抗體FR2-14之輕鏈CDR2 之胺基酸序列(序列表之序列編號68)
第77圖顯示大鼠抗FGFR2抗體FR2-14之輕鏈CDR3之胺基酸序列(序列表之序列編號69)
第78圖顯示人類FGFR2IIIb之胺基酸序列(序列表之序列編號70)
第79圖顯示人類FGFR2IIIc之胺基酸序列(序列表之序列編號71)
第80圖顯示hFR2-14_L1之鹼基序列(序列表之序列編號72)
第81圖顯示hFR2-14_L1之胺基酸序列(序列表之序列編號73)
第82圖顯示hFR2-14_H1之鹼基序列(序列表之序列編號74)
第83圖顯示hFR2-14_H1之胺基酸序列(序列表之序列編號75)
第84圖顯示hFR2-14_H2之鹼基序列(序列表之序列編號76)
第85圖顯示hFR2-14_H2之胺基酸序列(序列表之序列編號77)
第86圖顯示hFR2-14_H3之鹼基序列(序列表之序列編號78)
第87圖顯示hFR2-14_H3之胺基酸序列(序列表之序列編號79)
第88圖顯示hFR2-14_H4之鹼基序列(序列表之序列編號80)
第89圖顯示hFR2-14_H4之胺基酸序列(序列表之序列編號81)
第90圖顯示hFR2-14_H5之鹼基序列(序列表之序列編號82)
第91圖顯示hFR2-14_H5之胺基酸序列(序列表之序列編號83)
第92圖顯示hFR2-14_H6之鹼基序列(序列表之序列編號84)
第93圖顯示hFR2-14_H6之胺基酸序列(序列表之序列編號85)
第94圖顯示hFR2-14_H7之鹼基序列(序列表之序列編號86)
第95圖顯示hFR2-14_H7之胺基酸序列(序列表之序列編號87)
第96圖顯示hFR2-14_H8之鹼基序列(序列表之序列編號88)
第97圖顯示hFR2-14_H8之胺基酸序列(序列表之序列編號89)
第98圖顯示hFR2-14_H9之鹼基序列(序列表之序列編號90)
第99圖顯示hFR2-14_H9之胺基酸序列(序列表之序列編號91)
第100圖顯示hFR2-14_H10之鹼基序列(序列表之序列編號92)
第101圖顯示hFR2-14_H10之胺基酸序列(序列表之 序列編號93)
第102圖顯示hFR2-14_H11之鹼基序列(序列表之序列編號94)
第103圖顯示hFR2-14_H11之胺基酸序列(序列表之序列編號95)
第104圖顯示hFR2-14_H12及hFR2-14_H19之鹼基序列(序列表之序列編號96)
第105圖顯示hFR2-14_H12及hFR2-14_H19之胺基酸序列(序列表之序列編號97)
第106圖顯示hFR2-14_H13之鹼基序列(序列表之序列編號98)
第107圖顯示hFR2-14_H13之胺基酸序列(序列表之序列編號99)
第108圖顯示hFR2-14_H14之鹼基序列(序列表之序列編號100)
第109圖顯示hFR2-14_H14之胺基酸序列(序列表之序列編號101)
第110圖顯示hFR2-14_H15之鹼基序列(序列表之序列編號102)
第111圖顯示hFR2-14_H15之胺基酸序列(序列表之序列編號103)
第112圖顯示hFR2-14_H16之鹼基序列(序列表之序列編號104)
第113圖顯示hFR2-14_H16之胺基酸序列(序列表之序列編號105)
第114圖顯示hFR2-14_H17之鹼基序列(序列表之序列編號106)
第115圖顯示hFR2-14_H17之胺基酸序列(序列表之序列編號107)
第116圖顯示hFR2-14_H18之鹼基序列(序列表之序列編號108)
第117圖顯示hFR2-14_H18之胺基酸序列(序列表之序列編號109)
第118圖顯示hFR2-14_H2型重鏈用引子VH3A-F
第119圖顯示hFR2-14_H2型重鏈用引子VH3A-R
第120圖顯示D2放大用引子D23fw
第121圖顯示D2放大用引子D23rv
第122圖顯示利用Biacore測得之4種人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H1~H4/L1)及人類嵌合化抗FGFR2抗體(cFR2-14)對於各人類FGFR2變異蛋白質之結合活性。使各抗體於293F細胞表現、精製並供測定使用。
第123圖顯示利用Biacore測得之15種人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H3/L1及hFR2-14_H5~H18/L1)對於人類FGFR2-IIIc變異蛋白質之結合活性。將各抗體於293F細胞表現而得之培養上清供測定使用。
第124圖顯示利用Cell-ELISA法驗證3種人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H8/L1及hFR2-14_H12/L1)之人類FGFR2選擇性的結合性。
第125A圖顯示5種人類化抗FGFR2抗體之溫譜圖。
第125B圖顯示5種人類化抗FGFR2抗體之溫譜圖。
第125C圖顯示10種人類化抗FGFR2抗體之Tm值。
第126圖顯示針對hFR2-14_H1/L1抗體、hFR2-14_H2/L1抗體、hFR2-14_H3/L1抗體、hFR2-14_H4/L1抗體、hFR2-14_H5/L1抗體、hFR2-14_H8/L1抗體、hFR2-14_H9/L1抗體、hFR2-14_H11/L1抗體、及hFR2-14_H12/L1抗體、hFR2-14_H19/L1抗體之劣化前後檢體與抗原間之KD值。
第127A圖顯示利用Elk1轉報告基因分析法測得之人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H1/L1、hFR2-14_H2/L1、hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H4/L1)及人類嵌合化抗FGFR2抗體(cFR2-14)對於人類FGFR2IIIb之訊息中和活性。
第127B圖顯示利用Elk1轉報告基因分析法測得之人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H1/L1、hFR2-14_H2/L1、hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H4/L1)及人類嵌合化抗FGFR2抗體(cFR2-14)對於人類FGFR2IIIc之訊息中和活性。
第128A圖顯示利用Elk1轉報告基因分析法測得之人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H5/L1、hFR2-14_H6/L1、hFR2-14_H7/L1、hFR2-14_H8/L1)對於人類FGFR2IIIb之訊息中和活性。
第128B圖顯示利用Elk1轉報告基因分析法測得之人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H9/L1、hFR2-14_H10/L1、hFR2-14_H11/L1、hFR2-14_H12/L1、hFR2-14_H13/L1)對於人類FGFR2IIIb之訊息中和活性。
第128C圖顯示利用Elk1轉報告基因分析法測得之人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H14/L1、hFR2-14_H15/L1 、hFR2-14_H16/L1、hFR2-14_H17/L1、hFR2-14_H18/L1)對於人類FGFR2IIIb之訊息中和活性。
第129A圖顯示利用Elk1轉報告基因分析法測得之人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H12/L1、hFR2-14_H19/L1)對於人類FGFR2IIIb之訊息中和活性。
第129B圖顯示利用Elk1轉報告基因分析法測得之人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H12/L1、hFR2-14_H19/L1)對於人類FGFR2IIIc之訊息中和活性。
第130A圖顯示人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H1/L1、hFR2-14_H2/L1)之ADCC活性。係使用人類FGFR2IIIb表現293T-lacZ細胞作為標的細胞、人類PBMC作為效應細胞。
第130B圖顯示人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H4/L1)及人類嵌合化抗FGFR2抗體(cFR2-14)之ADCC活性。使用人類FGFR2IIIb表現293T-lacZ細胞作為標的細胞、人類PBMC作為效應細胞。
第131圖顯示人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H8/L1、hFR2-14_H12/L1之ADCC活性。將人類FGFR2表現NCI-H716細胞作為標的細胞、人類PBMC作為效應細胞。
第132圖顯示人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H12/L1、hFR2-14_H19/L1)之ADCC活性。將人類FGFR2表現A)NCI-H716、B)SNU-16、C)KATOIII細胞作為標的細胞、人類PBMC作為效應細胞。
第133圖顯示人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H12/L1 、hFR2-14_H19/L1)之ADCP活性。將人類FGFR2表現A)NCI-H716、B)KATOIII作為標的細胞、由人類PBMC分化之巨噬體狀細胞作為效應細胞。
第134A圖顯示人類化抗FGFR2抗體hFR2-14_H1/L1於人類胃癌細胞株SNU-16移植裸小鼠之體內抗腫瘤活性。
第134B圖顯示人類化抗FGFR2抗體hFR2-14_H2/L1於人類胃癌細胞株SNU-16移植裸小鼠之體內抗腫瘤活性。
第134C圖顯示人類化抗FGFR2抗體hFR2-14_H3/L1於人類胃癌細胞株SNU-16移植裸小鼠之體內抗腫瘤活性。
第134D圖顯示人類化抗FGFR2抗體hFR2-14_H4/L1於人類胃癌細胞株SNU-16移植裸小鼠之體內抗腫瘤活性。
第135A圖顯示人類化抗FGFR2抗體hFR2-14_H5/L1於人類胃癌細胞株SNU-16皮下移植模式之體內抗腫瘤活性。
第135B圖顯示人類化抗FGFR2抗體hFR2-14_H8/L1於人類胃癌細胞株SNU-16皮下移植模式之體內抗腫瘤活性。
第135C圖顯示人類化抗FGFR2抗體hFR2-14_H9/L1於人類胃癌細胞株SNU-16皮下移植模式之體內抗腫瘤活性。
第135D圖顯示人類化抗FGFR2抗體hFR2-14_H11/L1 於人類胃癌細胞株SNU-16皮下移植模式之體內抗腫瘤活性。
第135E圖顯示人類化抗FGFR2抗體hFR2-14_H12/L1於人類胃癌細胞株SNU-16皮下移植模式之體內抗腫瘤活性。
第135F圖顯示人類化抗FGFR2抗體hFR2-14_H19/L1在人類胃癌細胞株SNU-16皮下移植模式之體內抗腫瘤活性。
第136圖顯示人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H12/L1、hFR2-14_H19/L1)在人類大腸癌細胞株NCI-H716腫瘤團塊模式之體內抗腫瘤活性。(A)表示hFR2-14_H12/L1之結果、(B)表示hFR2-14_H19/L1之結果。
第137圖顯示人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H12/L1、hFR2-14_H19/L1)於人類大腸癌細胞株NCI-H716-luc腹膜接種模式之體內抗腫瘤活性。(A)表示Luciferase活性之結果、(B)表示存活率之結果。
第138圖顯示FGFR2D2/H3L1Fab複合體之彩帶模型。FGFR2D2以黃色表示、H3L1Fab之H鏈以粉紅色表示、L鏈以淺藍色表示。
第139圖係顯示FGFR2/FGF1與FGFR2D2/H3L1Fab之重疊之圖。
第140圖顯示對於使FGFR各家族分子強制表現之293α細胞團塊，使用大鼠抗體FR2-10實施免疫染色之圖。
第141圖顯示對於A，D)SNU-16、B，E)KATOIII、 及C，F)NCI-H716細胞團塊實施免疫染色之圖。A~C係使用大鼠抗體FR2-10之結果、D~F係使用市售抗體之結果。
第142圖顯示對於A)SNU-16、B)KATOIII、及C)NCI-H716細胞之異種移殖腫瘤樣本，使用大鼠抗體FR2-10實施免疫染色之圖。
第143圖顯示cFR2-10、hFR2-14_H12/L1、及hFR2-14_H19/L1抗體所致之抑制配體FGF7對於FGFR2受體之結合之活性之圖。
[實施發明之形態]
1.定義
本發明中，「基因」意指含有編碼為蛋白質之胺基酸的鹼基序列的核苷酸或其互補鏈，例如：含有編碼為蛋白質之胺基酸的鹼基序列的核苷酸或其互補鏈聚核苷酸、寡核苷酸、DNA、mRNA、cDNA、cRNA等，係包括在「基因」的含意。該基因係單股、雙股或三股以上之核苷酸，且DNA鏈與RNA鏈之組合體、在單股之核苷酸鏈上混有核糖核苷酸(RNA)與去氧核糖核苷酸(DNA)者及含有如此之核苷酸鏈之雙股或三股以上之核苷酸，也包括在「基因」的含意。本發明之「FGFR2基因」，可列舉例如：含有編碼為FGFR2蛋白質之胺基酸序列之鹼基序列的DNA、mRNA、cDNA、cRNA等。
本發明中，「核苷酸」與「核酸」為相同含意，例如：DNA、RNA、探針、寡核苷酸、聚核苷酸、引子等 ，也包括在「核苷酸」的含意。該核苷酸係由單股、雙股或三股以上之鏈構成的核苷酸，且DNA鏈與RNA鏈之組合體、在單股核苷酸鏈上混有核糖核苷酸(RNA)與去氧核糖核苷酸(DNA)者及含有如此之核苷酸鏈的雙股或三股以上之鏈之組合體，也包括在「核苷酸」的含意。
本發明中，「多胜肽」、「胜肽」及「蛋白質」為相同含義。
本發明中，「抗原」有時作為「免疫原」之含意使用。
本發明中，「細胞」也包括來自動物個體之各種細胞、繼代培養細胞、初代培養細胞、細胞株、重組細胞及微生物等。
本發明中，辨識FGFR2、FGFR2IIIb、FGFR2IIIc、FGFR3、FGFRs等的抗體，有時會分別表示記載為「抗FGFR2抗體」、「抗FGFR2IIIb抗體」、「抗FGFR2IIIc抗體」、「抗FGFR3抗體」及「抗FGFRs抗體」等。該抗體，包括嵌合化抗體、人類化抗體、人類抗體等。
本發明中之「抗體之功能性片段」，意指發揮至少部分原本抗體之功能的抗體片段。「抗體之功能性片段」，例如：Fab、F(ab’)2、scFv、Fab’、單股免疫球蛋白等，但不限定於此等。該抗體之功能性片段，可為將抗體蛋白質之全長分子利用木瓜酶、胃蛋白酶等酵素處理而得者，此外，也可為使用重組基因而在適當寄主細胞產生的重組蛋白質。
本發明中，抗體所結合之「部位」，亦即抗體所辨識之「部位」，意指抗體所結合或辨識之抗原上之部分胜肽或部分高次結構。本發明中，該部位也稱為抗原決定位(epitope)、抗體之結合部位。本發明之抗FGFR2抗體所結合或辨識之FGFR2蛋白質上之部位，可列舉FGFR2蛋白質上之部分胜肽或部分高次結構等。
已知抗體分子之重鏈及輕鏈各有3處互補性決定區(CDR：Complemetarity determining region)。互補性決定區，也稱為超可變區(hypervariable domain)，係位於抗體之重鏈及輕鏈之可變區內，一次結構之變異性特別高的部位，於重鏈及輕鏈之多胜肽鏈之一次結構上，通常各分離成3處。本發明中，針對抗體之互補性決定區，重鏈之互補性決定區係從重鏈胺基酸序列之胺基末端側起表示記載為CDRH1、CDRH2、CDRH3，輕鏈之互補性決定區係從輕鏈胺基酸序列之胺基末端側起表示記載為CDRL1、CDRL2、CDRL3。該等部位在立體結構上彼此接近，決定對於結合之抗原的專一性。
本發明中，「抗體變異體」，係指具有原本之抗體所擁有之胺基酸序列中的胺基酸有取代、缺失、附加及/或插入(以下總稱為「變異」)而成的胺基酸序列，且本發明之FGFR2蛋白質所結合之多胜肽。該抗體變異體中，變異胺基酸之數目為1至2個、1至3個、1至4個、1至5個、1至6個、1至7個、1至8個、1至9個、1至10個、1至12個、1至15個、1至20個、1至25個、1至30個、1至40個或1至50個。該抗體變異體也包括在本發明之「抗體」。
本發明中，「1至數個」中之「數個」，係指3至10個。
本發明之抗體發揮之活性、性質，例如：生物學的活性、物理化學的性質等，具體而言，可列舉例如各種生物活性、對於抗原或抗原決定位之結合活性、製造或保存時之安定性、熱安定性等。
本發明中，「於嚴格的條件下進行雜交」，係於含有5×SSC之溶液中於65℃進行雜交，然後於含有2×SSC-0.1%SDS之水溶液中於65℃進行20分鐘、於含有0.5×SSC-0.1%SDS之水溶液中於65℃進行20分鐘、及於含有0.2×SSC-0.1%SDS之水溶液中於65℃進行20分鐘，各自洗滌之條件或以與此為同等之條件進行雜交。SSC，係150mMNaCl-15mM檸檬酸鈉之水溶液，n×SSC代表n倍濃度之SSC。
本發明中，「細胞傷害」係以某種形式對於細胞帶來病理性變化，不僅指直接的外傷，也指DNA之切斷或鹼基之二聚體形成、染色體之切斷、有絲分裂構造之損傷、各種酵素活性之下降等各種細胞之結構或功能上之損傷。
本發明中之「細胞傷害活性」，係指引起上述細胞傷害。
本發明中之「抗體依賴性細胞傷害活性」，係指「antibody dependent cellular cytotoxicity(ADCC)活性」，係NK細胞由抗體中介而傷害腫瘤細胞等標的細 胞的作用活性。
本發明中之「抗體依賴性細胞媒介吞噬活性」，係指「antibody dependent cell phagocytosis(ADCP)活性」，指單核球或巨噬體細胞由抗體中介而吞噬腫瘤細胞等標的細胞之作用活性。也稱為「抗體依賴的吞噬作用活性」。
本發明中之「補體依賴性細胞傷害作用活性」，係指「complement dependent cytotoxicity(CDC)活性」，指補體由抗體中介而傷害腫瘤細胞等標的細胞的作用活性。
本發明中之「癌」與「腫瘤」以相同含意使用。
本發明中之「免疫組織化學(immunohistochemistry：IHC)」，係指偵測組織標本中之抗原的組織學的(組織化學的)方法，與「免疫抗體法」為相同含意，「免疫染色(immunostaining)」亦為相同含意。
2.抗原蛋白質
(2-1)特性
FGFRs係與纖維母細胞生長因子(FGF)結合之受體蛋白質。本發明中，FGFRs係來自脊椎動物，宜為來自哺乳動物，更理想為來自人類。人類FGF及FGFRs，分別分類為22種FGF(FGF1至14、及FGF16至23)、及具有酪胺酸激酶區域之4種FGFR(FGFR1至4)。FGFRs，係由以下構成：包含由2個或3個類免疫球蛋白區域(IgD1至3)構成的配體結合部位之細胞外區、1次膜貫通區、及含酪胺酸 激酶區域之細胞內區。其中，FGFR1、FGFR2及FGFR3，存在稱為IIIb及IIIc之各2個切割變異體。該等異構體，於IgD3之後半有約50個胺基酸的序列不同，顯示相異之組織分布及配體專一性。FGFRs具有如下的活性：(1)與FGF結合；(2)由於該結合使FGFRs二聚體化；(3)由於該二聚體化，造成FGFRs之特定酪胺酸殘基被磷酸化；(4)由於該磷酸化，造成FGFR基質2α(FRS2α)等適應蛋白之補充被促進；(5)對於表現該FGFRs之細胞或組織傳達藉由FGF刺激所致之訊息或活化訊息傳遞。
本發明中之FGFR2蛋白質具有以下性質。
(i)與FGF結合。
FGFR2IIIb蛋白質，通常結合於選自於由FGF1、FGF3、FGF7(KGF)、FGF10，FGF22及FGF23構成之群組中1或2以上，但也可與其他FGF結合，變異型的情形，有時即使是包括在前述群組之FGF也不結合。
FGFR2IIIc蛋白質，通常與選自於由FGF1、FGF2、FGF4、FGF6、FGF9、FGF17、FGF18、FGF21、FGF23構成之群組中之1或2以上結合。也可以與其他FGF結合，變異型之情形，有時即使是前述群組所含之FGF也不結合。
(ii)對於FGFR2表現細胞或組織內傳達FGF刺激所致產生之訊息。
作為由於FGF刺激所致產生之訊息傳遞，不特別限定，例如：FGFR2自磷酸化、FGFR基質之補充及其促進、由此等中介之MAPK，PI3K、Akt、細胞外訊息調節激 酶(ERK)等之訊息路徑之活化等。FGFR基質，可列舉FGFR基質2α(FRS2α)等。
用以評價該訊息傳遞之活化及其抑制的試驗方法，不特別限定，可從周知方法中任意選擇，例如：作為評價ERK訊息傳遞之系，可列舉後述Elk1螢光素酶報告基因分析法。
(iii)本發明中之FGFR2IIIb蛋白質，包含以下(a)至(d)中任一項之胺基酸序列(以下稱為「FGR2IIIb胺基酸序列」)而成，或包含含FGFR2IIIb胺基酸序列之胺基酸序列、或包含FGFR2IIIb胺基酸序列而構成：(a)序列表之序列編號70(第78圖)表示之胺基酸序列；(b)與序列表之序列編號70(第78圖)表示之胺基酸序列有80%以上、82%以上、84%以上、86%以上、88%以上、90%以上、92%以上、94%以上、96%以上、98%以上或99%以上之序列同一性且具有FGF結合活性之多胜肽之胺基酸序列；(c)序列表之序列編號70(第78圖)表示之胺基酸序列中有1至50個、1至45個、1至40個、1至35個、1至30個、1至25個、1至20個、1至15個、1至10個、1至8個、1至6個、1至5個、1至4個、1至3個、1或2個、或1個胺基酸取代、缺失、附加或插入，且有FGF結合活性之多胜肽之胺基酸序列；及(d)由與具有和編碼為序列表之序列編號70(第78圖)表示之胺基酸序列之鹼基序列為互補的鹼基序列的核苷 酸於嚴格的條件下進行雜交之核苷酸具有的鹼基序列編碼，且具有FGF結合活性之多胜肽之胺基酸序列。
(b)至(d)記載任一項之多胜肽，除了有FGF結合活性，也可具有FGFR2具有之其他活性。
本發明中之FGFR2IIIc蛋白質，係包含以下(a)至(d)中任一項之胺基酸序列(以下稱為「FGFR2IIIc胺基酸序列」)而成、或包含含FGFR2IIIc胺基酸序列之胺基酸序列、或包含FGFR2IIIc胺基酸序列：(a)序列表之序列編號71(第79圖)表示之胺基酸序列；(b)與序列表之序列編號71(第79圖)表示之胺基酸序列有80%以上、82%以上、84%以上、86%以上、88%以上、90%以上、92%以上、94%以上、96%以上、98%以上或99%以上之序列同一性且具有FGF結合活性之多胜肽之胺基酸序列；(c)於序列表之序列編號71(第79圖)表示之胺基酸序列有1至50個、1至45個、1至40個、1至35個、1至30個、1至25個、1至20個、1至15個、1至10個、1至8個、1至6個、1至5個、1至4個、1至3個、1或2個、或1個胺基酸取代、缺失、附加或插入且具有FGF結合活性之多胜肽之胺基酸序列；及(d)由與具有和編碼為序列表之序列編號71(第79圖)表示之胺基酸序列之鹼基序列為互補的鹼基序列的核苷酸於嚴格的條件下進行雜交之核苷酸具有的鹼基序列編碼，且具有FGF結合活性之多胜肽之胺基酸序列。
(b)至(d)記載任一項之多胜肽，除了有FGF結合活性，也可具有FGFR2具有之其他活性。
又，作為人類FGFR2IIIb及人類FGFR2IIIc之胺基酸序列，各除了上述(a)至(d)以外，也可列舉就NP_075259及NP_000132公布之胺基酸。
(iv)本發明之FGFR2蛋白質，可由脊椎動物，較佳為由哺乳動物，更理想為由小鼠、大鼠等囓齒類及人類，又更理想為從人類、大鼠或小鼠之表現FGFR2之細胞、組織或癌組織、來自該組織之細胞、該細胞之培養物等獲得。
高表現FGFR2之正常組織，可列舉腦、大腸、甲狀腺、子宮、膽囊、皮膚等。在高表現FGFR2之癌中，有時可見到在胃癌、乳癌等基因放大，及胰臟癌、卵巢癌等過度表現。作為高表現FGFR2IIIb之培養細胞株，可列舉胃癌細胞株、乳癌細胞株等。作為高表現FGFR2IIIb之培養細胞株，可列舉大腸(盲腸)細胞癌。作為高表現FGFR2IIIc之癌組織，可列舉子宮頸癌、非小細胞肺癌等，其中，於子宮頸癌係高表現。
本發明之FGFR2蛋白質，也可為天然型(非重組型)及重組型中任一者。又，與擔體或標籤(tag)等其他胜肽或蛋白質的融合物，也包括在FGFR2蛋白質的含意。再者，包括PEG等聚合物附加之化學修飾、及/或糖鏈修飾的經生物學的修飾者，也包括在FGFR2蛋白質之含意。又，FGFR2蛋白質片段也包括在本發明之FGFR2蛋白質之含意。FGFR2蛋白質片段當中，具備上述(i)及/或 (ii)記載之性質者，稱為FGFR2蛋白質功能性片段。
(2-2)抗原基因
本發明中之FGFR2IIIb基因，係包含以下(a)至(c)中任一鹼基序列(以下稱為「FGFR2基因序列」)而成、或包含含FGFR2基因序列之鹼基序列、或包含FGFR2基因序列：(a)編碼為序列表之序列編號70(第78圖)表示之胺基酸序列的鹼基序列；(b)與包含和編碼為序列表之序列編號70(第78圖)表示之胺基酸序列之鹼基序列為互補的鹼基序列的核苷酸於嚴格的條件下進行雜交且編碼為具有FGF結合活性之多胜肽之胺基酸序列的鹼基序列；及(c)編碼為序列表之序列編號70(第78圖)表示之胺基酸序列中有1至50個、1至45個、1至40個、1至30個、1至25個、1至20個、1至15個、1至10個、1至8個、1至6個、1至5個、1至4個、1至3個、1或2個、或1個鹼基取代、缺失、附加或插入而成之胺基酸序列，且編碼為具有FGF結合活性之多胜肽之胺基酸序列的鹼基序列。
具有由(b)或(c)記載之鹼基序列編碼之胺基酸序列的多胜肽，除了具有FGF結合活性以外，也可具有FGFR2具有之其他活性。
本發明中之FGFR2IIIc基因，係包含以下(a)至(c)中任一鹼基序列(以下稱為「FGFR2基因序列」)而成、或包含含FGFR2基因序列之鹼基序列、或包含FGFR2基因序列：(a)編碼為序列表之序列編號71(第79圖)表示之胺基酸序列的鹼基序列；(b)與包含和編碼為序列表之序列編號71(第79圖)表示之胺基酸序列之鹼基序列為互補的鹼基序列的核苷酸於嚴格的條件下進行雜交且編碼為具有FGF結合活性之多胜肽之胺基酸序列的鹼基序列；及(c)編碼為序列表之序列編號71(第79圖)表示之胺基酸序列中有1至50個、1至45個、1至40個、1至30個、1至25個、1至20個、1至15個、1至10個、1至8個、1至6個、1至5個、1至4個、1至3個、1或2個、或1個鹼基取代、缺失、附加或插入而成之胺基酸序列，且編碼為具有FGF結合活性之多胜肽之胺基酸序列的鹼基序列。
具有由(b)或(c)記載之鹼基序列編碼之胺基酸序列的多胜肽，除了具有FGF結合活性以外，也可具有FGFR2具有之其他活性。
FGFR2基因之表現及表現量之測定，可將FGFR2基因之轉錄產物及FGFR2蛋白質中任一者作為指標，前者可利用RT-PCR法、北方墨點雜交法等，後者可利用酵素結合免疫吸附分析法(Enzyme-linked immuno-sorbent assay：以下稱為「ELISA」)、西方墨點法、免疫組織染色法等之免疫分析法等分別測定。
(2-3)抗原蛋白質之製備
本發明之FGFR2蛋白質，可利用動物組織(包括體液)、來自該組織之細胞或該細胞培養物之精製及單離、基因重組、體外轉譯、化學合成等以製備。
(2-3-1)非重組型FGFR2之精製、單離
非重組型FGFR2蛋白質，可從表現FGFR2之細胞、正常組織或癌組織或來自此等之細胞精製、單離。作為表現FGFR2之正常組織、癌組織、癌細胞，可列舉(2-2)之(iv)記載者，但非重組型FGFR2蛋白質之來源，不限於此等。
從該組織、細胞、細胞培養物等進行精製、單離，可利用將該技術領域中具有通常知識者周知之區分、層析等手法予以組合而進行。該方法包括鹽析、凝膠過濾、離子交換層析、親和性層析、疏水層析、順相或逆相層析等，但不限於此等。親和性層析用之管柱，可藉由製作已將抗FGFR2單株抗體交聯之親和性凝膠並進行填充以製成。於該管柱添加含有FGFR2蛋白質之粗組分(fraction)或部分精製組分，其次利用已滅菌之磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)除去非專一的吸附物後，添加提取用緩衝液，可將FGFR2蛋白質選擇性的回收。含FGFR2蛋白質之溶液，可利用凝膠過濾或Centriprep等濃縮裝置進行緩衝液交換及/或濃縮。
(2-3-2)重組型FGFR2蛋白質之製備
本發明之FGFR2蛋白質，也可製備為重組型。亦即，可將編碼為FGFR2蛋白質或FGFR2蛋白質片段之胺基酸序列的基因導入到寄主細胞，並從該細胞之培養物回收FGFR2蛋白質。例如：若將FGFR2基因或其片段插入到表現載體，其次對於細胞導入該重組載體，將獲得之重組細胞予以溫育，能使細胞表現FGFR2蛋白質。表現 形態，可使用分泌表現、細胞內可溶表現、內含體(inclusion body)等周知形態。又，不僅可表現胺基末端(N端)及/或羧基末端(C端)為與天然型相同之分子，也可表現為分泌訊息、細胞內局部訊息、親和性精製用標籤、與夥伴胜肽(partner peptide)之融合蛋白質的形式。從該重組細胞培養物進行FGFR2蛋白質之精製、單離，可利用適當組合(2-3-1)記載之非重組型FGFR2蛋白質之精製、單離記載之區分、層析等操作以進行。
FGFR2基因或其片段，可由對於該技術領域中具有通常知識者為周知之方法製備。
例如：將從表現FGFR2之細胞或組織等製備的cDNA庫當作模盤，使用能將該序列專一性放大之一組引子，進行聚合酶連鎖反應(以下稱為「PCR」：Saiki，R.K.,et al.,Science(1988)239，p.487-489)；將從表現FGFR2之細胞或組織等製備之mRNA組分作為模盤，使用能將該序列反轉錄之引子及能將該序列專一的放大的一組引子，進行反轉錄PCR(以下稱為「RT-PCR」)；利用免疫分析之表現選殖；利用精製FGFR2蛋白質之部分胺基酸序列之cDNA選殖等。
(2-3-3)體外轉譯
本發明之FGFR2蛋白質，也可利用體外轉譯製備。該轉譯法，只要是利用含有對於轉錄及轉譯為必要之酵素、基質及能量物質的無細胞轉譯系統的方法即可，不特別限定，例如利用ROCHE DIAGNOSTICS公司製之快速細胞外蛋白質合成系統(Rapid Translation System； RTS)之方法。
(2-3-4)化學合成
本發明之FGFR2蛋白質也可利用化學合成製備。化學合成法，例如：Fmoc合成法、Boc合成法等胜肽固相合成法。
3.抗體
(3-1)抗體之分類
本發明之抗體，可為單株抗體及多株抗體任一者。本發明之單株抗體，例如來自非人類動物之抗體(非人類動物抗體)、來自人類之抗體(人類抗體)、嵌合化抗體、人類化抗體等。
非人類動物抗體，可列舉來自哺乳類、鳥類等脊椎動物之抗體等。來自哺乳類之抗體，可列舉小鼠抗體、大鼠抗體等來自囓齒類之抗體等。來自鳥類之抗體，可列舉雞抗體等。作為抗人類FGFR2大鼠單株抗體，可列舉FR2-10、FR2-13、FR2-14等。
作為嵌合化抗體，可列舉來自非人類動物抗體之可變區與人類抗體(人類免疫球蛋白)不變區結合而成的抗體等，但不限於此。作為來自非人類動物抗體之可變區與人類抗體不變區結合而成之嵌合化抗體，可列舉具有來自前述大鼠單株抗體FR2-10、FR2-13或FR2-14之重鏈及輕鏈可變區、及人類重鏈及輕鏈不變區的cFR2-10、cFR2-13、cFR2-14等。
作為人類化抗體，可列舉：將非人類動物抗體之可變區中之CDR移植到人類抗體(人類免疫球蛋白 之可變區)者、除了CDR還將非人類動物抗體之框架區之序列也部分移植到人類抗體者、此等任一來自非人類動物抗體之1個或2個以上之胺基酸取代為人類型之胺基酸者，但不限於此等。非人類動物抗體之可變區中之CDR，可列舉來自前述FR2-10、FR2-13或FR2-14之重鏈可變區中之CDRH1至3及輕鏈可變區中之CDRL1至3。詳如後述。
作為人類抗體，只要是辨識本發明之抗原的抗體即可，不特別限定，可列舉與具有本發明之抗體之CDR之抗體在相同部位結合之人類抗體、與前述FR2-10，FR2-13或FR2-14與FGFR2上在相同部位結合之人類抗體等。
本發明中之抗體，只要具有與FGFR2結合之活性即可，也可為從來自多個不同抗體的部分構成的抗體，例如：在多數不同抗體間交換了重鏈及/或輕鏈者、將重鏈及/或輕鏈之全長交換者、僅交換可變區或僅交換不變區者、將CDR之全部或僅一部分交換者等。嵌合化抗體之重鏈可變區與輕鏈可變區，也可來自不同的本發明之抗體。人類化抗體之重鏈及輕鏈之可變區中之CDRH1至CDRH3及CDRL1至CDRL3，可來自於2種或更多的本發明之抗體。人類抗體之重鏈及輕鏈之可變區中之CDRH1至CDRH3及CDRL1至CDRL3，也可為2種或更多本發明之抗體所擁有之CDR之組合。從來自如此之多數不同抗體而來的部分構成之抗體，也可具有(3-3)至(3-6)記載之1種或2種以上之活性。
本發明之單株抗體之抗體亞型(isotype)不特別限定，例如：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等IgG、IgM、IgA1、IgA2等之IgA、IgD、IgE等，理想為IgG及IgM。單株抗體之亞型及次類，可利用例如：歐氏(Ouchterlony)法、ELISA法、Radio immunoassay(以下稱為「RIA」)法等決定，也可利用市售之鑑定用套組(mouse typer kit：Bio-rad公司製、RAT MONOCLONAL ANTIBODY ISOTYPING TEST KIT：serotec公司等)。
(3-2)抗體之結合專一性
本發明之抗體辨識FGFR2蛋白質。換言之，本發明之抗體係與FGFR2蛋白質結合。該抗體，表示記載為「抗FGFR2抗體」。又，本發明之理想抗體，係專一性的辨識FGFR2蛋白質。換言之，本發明之理想抗體，係與FGFR2蛋白質專一的結合。再者，本發明之更理想抗體，係與FGFR2IIIb蛋白質及/或FGFR2IIIc蛋白質專一的結合，又更理想抗體，係與FGFR2IIIb蛋白質及/或FGFR2IIIc蛋白質具有之類免疫球蛋白區域(以下稱為「類Ig區域」)專一的結合。該類Ig區域可列舉類Ig區域2、類Ig區域3等。
本發明中之「專一的辨識」，亦即「專一的結合」，係指無非專一的吸附的結合。判定結合是否專一的判定基準，例如：解離定數(Dissociation Consitant：以下稱為「KD」)。本發明之理想抗體對於FGFR2蛋白質之KD值為1×10-5以下、5×10-6以下、2×10-6以下或1×10-6以下，更理想為5×10-7以下、2×10-7以下或1×10-7以下， 又更理想為5×10-8以下、2×10-8以下或1×10-8以下，再更理想為5×10-9以下、2×10-9以下或1×10-9以下，最理想為5×10-10以下、2×10-10以下或1×10-10以下。
本發明中，抗原與抗體之結合可利用ELISA法、RIA法、Surface Plasmon Resonance(以下稱為「SPR」)分析法等進行測定或判定。SPR分析使用之設備，可列舉BIAcoreTM(GE health care公司製)、ProteOnTM(BioRad公司製)、SPR-NaviTM(BioNavis公司製)、SpreetaTM(Texas Instruments公司製)、SPRi-PlexIITM(HORIBA公司製)、Autolab SPRTM(Metrohm公司製)等。細胞表面上表現之抗原與抗體間之結合，可利用流式細胞計數法、Cell ELISA法等測定。
(3-3)抗體之抗腫瘤活性
本發明之抗體，具有抗腫瘤活性，且宜於體內具有抗腫瘤活性。本發明中，抗腫瘤活性與抗癌活性為相同含意。
本發明中，抗腫瘤活性，係指抑制腫瘤組織及/或腫瘤細胞之生長、惡性化、浸潤、轉移、腫瘤尺寸增大或重量增加等的活性。
抗腫瘤活性可由定法評價。體內抗腫瘤活性，可藉由使用例如：已移植人類癌組織或癌細胞的非人類動物模式(異種移殖)，來評價對於人類腫瘤之效果。異種移殖使用之非人類動物，可列舉裸小鼠等小鼠、大鼠等。
又，抗腫瘤活性，也可就對於癌細胞之細胞生長的抑制或抑制活性進行評價。
(3-4)抗體之細胞傷害活性
本發明之抗FGFR2抗體，也可具有抗體依賴性細胞傷害(ADCC)活性及/或補體依賴性細胞傷害(CDC)活性及/或抗體依賴性細胞媒介吞噬活性(ADCP)活性。本發明之理想抗體具有ADCC活性，更理想抗體對於FGFR2表現細胞有ADCC活性。ADCC活性、CDC活性及ADCP活性，可由周知方法測定。
ADCC活性之測定，可使用表現目的抗原之細胞(標的細胞)、與殺傷此標的細胞之效應細胞。效應細胞係由Fcγ受體中介而辨識結合於標的細胞之抗體之Fc區。利用從Fcγ受體傳達之訊息，效應細胞將標的細胞殺傷。測定具有來自人類之Fc區的抗體的ADCC活性時，效應細胞係使用人類NK細胞。人類NK細胞，可從人類末梢血液單核球(PMBC)利用周知方法製備。或可將PBMC直接作為效應細胞。
(3-5)抗體對於訊息傳遞之作用
本發明之抗FGFR2抗體具有之生物學的活性及性質，可利用由FGFR2中介之FGF訊息進行評價。就由FGFR2中介之FGF刺激所致之訊息傳遞，不特別限定，例如可舉FGFR2自磷酸化、FGFR基質之補充及其促進、由此等中介之MAPK，PI3K、Akt、細胞外訊息調節激酶(ERK)等訊息路徑之活化等。FGFR基質，可列舉FGFR基質2α(FRS2α)等。用以評價該訊息傳遞之活化及其抑制的試驗方法，不特別限定，可從周知方法任意選擇，例如作為評價ERK訊息傳遞之系，可列舉後述Elk1螢光素酶報 告基因分析法。
又，本發明之理想抗體，對於FGFR2有中和活性，更理想為對於FGFR2IIIb及/或FGFR2IIIc有中和活性。中和活性，係指抑制或妨礙FGFR2之配體所致之FGFR2活化之活性。例如：妨礙FGF依賴性之FGFR2中介性訊息、訊息傳遞等的抗體，可判定為有該中和活性。實施例2之2)-3及實施例11，顯示中和活性測定之例。
(3-6)妨礙抗體之受體-配體間之結合的活性
本發明之理想抗體，係抑制FGFR2與其配體之結合，更理想為抑制FGFR2IIIb及/或FGFRIIIc與FGF之結合。該受體-配體間之結合抑制，可為競爭性抑制及非競爭性抑制。作為對於FGFR2IIIb及FGFR2IIIc之配體，可列舉FGF1、FGF3、FGF7、FGF10、FGF22及FGF23、及FGF1、FGF2、FGF4、FGF6、FGF9、FGF17、FGF18、FGF21及FGF23。
(3-7)單株抗體
本發明提供單株抗體。單株抗體，包括大鼠抗體、小鼠抗體、兔抗體、雞抗體、魚類抗體等之非人類動物來源的單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、此等的功能性片段、此等的修飾體等。其中，作為大鼠單株抗體，例如FR2-10抗體、FR2-13抗體、FR2-14抗體等。
FR2-10，係由實施例1記載之方法獲得之抗人類FGFR2大鼠單株抗體。FR2-10之重鏈可變區之鹼基序列，記載於序列表之序列編號11(第19圖)，胺基酸序列 記載於序列編號12(第20圖)。FR2-10之輕鏈可變區之鹼基序列記載於序列表之序列編號20(第28圖)，胺基酸序列記載於序列編號21(第29圖)。FR2-10之CDRH1之胺基酸序列，記載於序列編號52(第60圖)，CDRH2之胺基酸序列記載於序列編號53(第61圖)，CDRH3之胺基酸序列記載於序列編號54(第62圖)，CDRL1之胺基酸序列記載於序列編號61(第69圖)，CDRL2之胺基酸序列記載於序列編號62(第70圖)，CDRL3之胺基酸序列記載於序列編號63(第71圖)。
FR2-13，係由實施例1記載之方法獲得之抗人類FGFR2大鼠單株抗體。FR2-13之重鏈可變區之鹼基序列，記載於序列表之序列編號13(第21圖)，胺基酸序列記載於序列編號14(第22圖)。FR2-13之輕鏈可變區之鹼基序列記載於序列表之序列編號23(第31圖)，胺基酸序列記載於序列編號24(第32圖)。FR2-13之CDRH1之胺基酸序列記載於序列編號55(第63圖)，CDRH2之胺基酸序列記載於序列編號56(第64圖)，CDRH3之胺基酸序列記載於序列編號57(第65圖)，CDRL1之胺基酸序列記載於序列編號64(第72圖)，CDRL2之胺基酸序列記載於序列編號65(第73圖)，CDRL3之胺基酸序列記載於序列編號66(第74圖)。
FR2-14，係由實施例1記載之方法獲得之抗人類FGFR2大鼠單株抗體。FR2-14之重鏈可變區之鹼基序列，記載於序列表之序列編號15(第23圖)，胺基酸序列記載於序列編號16(第24圖)。FR2-14之輕鏈可變區之鹼 基序列記載於序列表之序列編號25(第33圖)，胺基酸序列記載於序列編號26(第34圖)。FR2-14之CDRH1之胺基酸序列記載於序列編號58(第66圖)，CDRH2之胺基酸序列記載於序列編號59(第67圖)，CDRH3之胺基酸序列記載於序列編號60(第68圖)，CDRL1之胺基酸序列記載於序列編號67(第75圖)，CDRL2之胺基酸序列記載於序列編號68(第76圖)，CDRL3之胺基酸序列記載於序列編號69(第77圖)。
本發明之抗體變異體，理想係對於蛋白質之分解或氧化之敏感性下降、生物活性改善、抗原結合能力改善、或已賦予物理化學的性質或功能的性質等。作為如此之抗體變異體之例，係具有於抗體具有之胺基酸序列進行保守性胺基酸取代而成之胺基酸序列的抗體。保守性胺基酸取代，係對於胺基酸側鏈在有相關連之胺基酸群組內發生之取代。
理想之胺基酸群組如下：酸性群組=天冬胺酸、麩胺酸；鹼性群組=離胺酸、精胺酸、組胺酸；非極性群組=丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸；及非帶電極性家族=甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸。其他理想之胺基酸群組如下：脂肪族羥基群組=絲胺酸及蘇胺酸；含醯胺之群組=天冬醯胺酸及麩醯胺酸；脂肪族群組=丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；及芳香族群組=苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸。該抗體變異體中之胺基酸取代，宜於不使原本抗體具有之抗原結 合活性下降之範圍內進行較佳。
蛋白質中所含之天冬胺酸，容易因異構化而變換為異天冬胺酸，天冬醯胺酸容易因脫醯胺化而變換為天冬醯胺酸。若如此的異構化或脫醯胺化進行，會影響蛋白質之安定性。而，為了避免此異構化或脫醯胺化，可將蛋白質中之天冬胺酸或天冬醯胺酸或與此等相鄰的胺基酸等取代為其他胺基酸。已實施該胺基酸取代之抗體變異體，宜保持原本抗體具有之抗原結合活性較佳。
具有對於本發明之FR2-10、FR2-13或FR2-14具有之胺基酸序列已實施保守的胺基酸取代的胺基酸序列的抗體變異體、及包含具有在FR2-10、FR2-13或FR2-14來源的CDRH1至3及CDRL1至3中任一胺基酸序列已實施保守的胺基酸變異之胺基酸序列的該CDR的小鼠抗體、大鼠抗體、嵌合化抗體、人類化抗體、人類抗體等，也包括在本發明。
包含具有本發明之FR2-10、FR2-13或FR2-14來源的CDRH1至H3及CDRL1至L3中任1個或2個以上之胺基酸序列中，1至數個，宜為1至3個，更宜為1或2個，最宜為1個胺基酸取代為其他胺基酸而成的胺基酸序列的CDRH1至H3及CDRL1至L3的抗體的變異體且與人類FGFR2結合者，包括在本發明之抗體之變異體。
FR2-14之理想變異體，例如：包含具有CDRH3之胺基酸序列中之胺基酸取代為其他胺基酸而成的胺基酸序列的CDRH3的抗體。
FR2-14重鏈CDRH3之胺基酸經取代之理想之變異體，例如：1號之胺基酸即天冬胺酸(序列編號16、第24圖之99號胺基酸)取代為麩胺酸而得之變異體、2號之胺基酸即甘胺酸(序列編號16、第24圖之100號胺基酸)取代為酪胺酸、丙胺酸、色胺酸、纈胺酸、精胺酸、天冬醯胺酸、甲硫胺酸、白胺酸、離胺酸、異白胺酸、組胺酸、苯丙胺酸或麩胺酸而得之變異體等。
本發明中之抗體變異體，也包括在「抗體」。
本發明之抗體之不變區，不特別限定，作為用以治療或預防人類疾病之本發明之抗體，宜使用人類抗體者。人類抗體之重鏈不變區，例如：Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、Cε等。人類抗體之輕鏈不變區，例如：Cκ、Cλ等。
(3-8)嵌合抗體
本發明之抗FGFR2嵌合化抗體或其功能性片段，具有抗腫瘤活性，理想為於體內具有抗腫瘤活性。又，該嵌合化抗體或其功能性片段，宜與FGFR2IIIb蛋白質及/或FGFR2IIIc蛋白質專一的結合，更理想為與此等蛋白質具有之類Ig區域結合。再者，該嵌合化抗體，宜具有ADCC活性及/或ADCP活性。又，本發明之嵌合抗體或其功能性片段，對於FGFR2有中和活性，理想為對於FGFR2IIIb及/或FGFR2IIIc有中和活性，更理想為對於FGFR2IIIb及FGFR2IIIc有中和活性。再者，本發明之嵌合抗體或其功能性片段，理想為抑制FGFR2與其配體之結合。
作為本發明之大鼠-人類嵌合化抗體例示之cFR2-10之輕鏈鹼基序列及胺基酸序列及重鏈鹼基序列及胺基酸序列，各顯示於序列表之序列編號31、32、35及36(第39、40、43及44圖)。同樣，cFR2-13之輕鏈鹼基序列及胺基酸序列及重鏈鹼基序列及胺基酸序列，顯示序列表之序列編號39、40、43及44(第47、48、51及52圖)，cFR2-14之輕鏈鹼基序列及胺基酸序列及重鏈鹼基序列及胺基酸序列，顯示於序列表之序列編號47、48、50及51(第55、56、58及59圖)。
(3-9)抗體之功能性片段
作為本發明之一態樣，提供本發明之抗FGFR2抗體之功能性片段。抗體之功能性片段，係指保持該抗體具有之至少部分功能之片段。作為該抗體之功能，一般可列舉抗原結合活性、調節抗原活性之活性、抗體依賴性細胞障害活性及補體依賴性細胞傷害活性等。本發明之抗FGFR2抗體之功能，例如：FGFR2蛋白質結合活性、ADCC活性、ADCP活性、對於FGFR2之中和活性、體內抗腫瘤活性、抑制FGFR2與其配體結合之活性等。
抗體之功能性片段，只要是保持該抗體具有至少部分活性之該抗體之片段即可，不特別限定，例如：Fab、F(ab’)2、Fv、重鏈及輕鏈之Fv以適當連結子連結而成的單股Fv(scFv)、雙功能抗體(diabodies)、線狀抗體、及由抗體片段形成之多專一性抗體、F(ab’)2於還原條件下處理而得之抗體可變區之一價片段Fab’等，但不限於此等。如保有連結子部分之scFv般，含有本發明之 抗體之片段以外之部分的分子，也包括在本發明之抗體之功能性片段的含意。
抗體蛋白質之胺基末端及/或羧基末端之胺基酸有1至數個或更多缺失且該抗體具有之功能有至少部分保持的分子，也包括在抗體之功能性片段的含意。例如已知哺乳類培養細胞生產之抗體之重鏈之羧基末端之離胺酸殘基係缺失(Journal of Chromatography A,705：129-134(1995))，又，已知同樣，重鏈羧基末端之甘胺酸、離胺酸之2個胺基酸殘基係缺失，且重新將位在羧基末端之脯胺酸殘基予以醯胺化(Analytical Biochemistry,360：75-83(2007))。但是該等重鏈序列之缺失及修飾，不影響抗體之抗原結合能力及效應功能(補體活化或抗體依賴性細胞障害作用等)。如此之抗體之功能性片段之修飾體，包括在本發明之抗體或其功能性片段、或其修飾體(後述)。
本發明之抗體或其功能性片段，也可為至少對於2種不同的抗原具專一性之多專一性抗體。多專一性抗體，不限於與2種不同抗原結合之雙重專一性抗體(bispecific antibody)，對於3種以上不同抗原有專一性之抗體，也包括在本發明之「多專一性抗體」之含意。
本發明之多專一性抗體，可為全長抗體或其功能性片段(例如：F(ab’)2雙重專一性抗體)。雙重專一性抗體，可使2種抗體之重鏈與輕鏈(HL對)結合以製作。又，也可利用將2類以上之產生單株抗體之融合瘤融合，以製作雙重專一性抗體產生融合細胞以獲得(Millstein et al.,Nature(1983)305，p.537-539)。多專一的抗體，可由相同方法製備。
本發明之抗體之一態樣，為單股抗體(以下稱為「scFv」)。scFv，係藉由將抗體之重鏈V區與輕鏈V區以多胜肽之連結子連結而得到(Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,113,Rosenburg 及Moore編，Springer Verlag,New York,p.269-315(1994)、Nature Biotechnology(2005),23,p.1126-1136)。又，也可將2個scFv以多胜肽連結子結合而製成的BiscFv作為雙重專一性抗體使用。又，也可將由3個以上之scFv製得的MultiscFv當作多專一性抗體使用。
本發明中，包括將抗體之重鏈及輕鏈之全長序列以適當連結子連結而得的單股免疫球蛋白(single chain immunoglobulin)(Lee,H-S,et.al.,Molecular Immunology(1999)36,p.61-71；Shirrmann，T.et.al.,mAbs(2010),2,(1)p.1-4)。藉由將如此之單股免疫球蛋白予以二聚體化，可保持與原本為四聚體抗體為類似之結構及活性。又，本發明之抗體，也可為有單一重鏈可變區且無輕鏈序列之抗體。如此的抗體，稱為單域抗體(single domain antibody：sdAb)或奈米體(nanobody)，據報告保持了抗原結合能力(Muyldemans S.et.al.,Protein Eng.(1994)7(9),1129-35,Hamers-Casterman C.et.al.,Nature(1993)363(6428)446-8)。該等抗體，也包括在本發明之抗體之功能性片段的含意。
(3-10)人類化抗體及人類抗體
本發明在其一態樣中，提供人類化抗體或其功能性片段。
本發明之抗FGFR2人類化抗體或其功能性片段，具有抗腫瘤活性，且宜於體內具有抗腫瘤活性。又，該人類化抗體或其功能性片段，宜與FGFR2IIIb蛋白質及/或FGFR2IIIc蛋白質專一的結合，更宜為與此等蛋白質具有之類Ig區域結合。再者，該人類化抗體或其功能性片段宜具有ADCC活性及/或ADCP活性。又，本發明之人類化抗體或其功能性片段，對於FGFR2有中和活性，理想為對於FGFR2IIIb及/或FGFR2IIIc有中和活性，更理想為對於FGFR2IIIb及FGFR2IIIc有中和活性。再者，本發明之人類化抗體或其功能性片段，理想為抑制FGFR2與其配體之結合。
本發明之理想之人類化抗體，例如以下A至C所記載，可列舉具有大鼠FR2-10抗體、大鼠FR2-13抗體或大鼠FR2-14抗體之重鏈之CDRH1至CDRH3及輕鏈之CDRL1至CDRL3的人類化抗體等。
(A.具有大鼠FR2-10抗體之重鏈之CDRH1至CDRH3及輕鏈之CDRL1至CDRL3的人類化抗體)
本發明之抗FGFR2人類化抗體或其功能性片段，例如包含重鏈及輕鏈且辨識本發明之FGFR2蛋白質之人類化抗體或保持該抗體之FGFR2蛋白質結合活性之該抗體之片段、或其變異體等，該重鏈具有包含由序列表之序列編號52(第60圖)所示之胺基酸序列構成之CDRH1、由序列表之序列編號53(第61圖)所示之胺基酸 序列構成之CDRH2及由序列表之序列編號54(第62圖)所示之胺基酸序列構成之CDRH3的可變區，並且，該輕鏈具有包含由序列表之序列編號61(第69圖)所示之胺基酸序列構成之CDRL1、由序列表之序列編號62(第70圖)所示之胺基酸序列構成之CDRL2及由序列表之序列編號63(第71圖)所示之胺基酸序列構成之CDRL3的可變區。
(B.具有大鼠FR2-13抗體之重鏈之CDRH1至CDRH3及輕鏈之CDRL1至CDRL3之人類化抗體)
又，其他抗FGFR2人類化抗體或其功能性片段，例如包含重鏈及輕鏈且辨識本發明之FGFR2蛋白質之人類化抗體或保持該抗體之FGFR2蛋白質結合活性之該抗體之片段、或其變異體等，該重鏈具有包含由序列表之序列編號55(第63圖)所示之胺基酸序列構成之CDRH1、由序列表之序列編號56(第64圖)所示之胺基酸序列構成之CDRH2及由序列表之序列編號57(第65圖)所示之胺基酸序列構成之CDRH3之可變區，並且，該輕鏈具有包含由序列表之序列編號64(第72圖)所示之胺基酸序列構成之CDRL1、由序列表之序列編號65(第73圖)所示之胺基酸序列構成之CDRL2及由序列表之序列編號66(第74圖)所示之胺基酸序列構成之CDRL3之可變區。
(C.具有大鼠FR2-14抗體之重鏈之CDRH1至CDRH3及輕鏈之CDRL1至CDRL3之人類化抗體)
再者，其他抗FGFR2人類化抗體或其功能性片段，例如包含重鏈及輕鏈且辨識本發明之FGFR2蛋白質之人類化抗體或保持該抗體之FGFR2蛋白質結合活性之該抗體之片段、或其變異體等，該重鏈具有包含由序列表之序列編號58(第66圖)所示之胺基酸序列構成之CDRH1、由序列表之序列編號59(第67圖)所示之胺基酸序列構成之CDRH2及由序列表之序列編號60(第68圖)所示之胺基酸序列構成之CDRH3之可變區，並且，該輕鏈具有包含由序列表之序列編號67(第75圖)所示之胺基酸序列構成之CDRL1、由序列表之序列編號68(第76圖)所示之胺基酸序列構成之CDRL2及由序列表之序列編號69(第77圖)所示之胺基酸序列構成之CDRL3之可變區。
本發明之理想之人類化抗體，不限於上述A至C所記載者。更理想之人類化抗體，為人類化FR2-14抗體及其變異體，以下舉例：hFR2-14_H1/L1至hFR2-14_L19/L1，但不限於此等，例如含有包含hFR2-14_H1/L1至hFR2-14_H19/L1中任一人類化抗體之重鏈可變區的重鏈、及包含hFR2-14_H1/L1至hFR2-14_H19/L1中任一人類化抗體之輕鏈可變區的輕鏈而成的抗體，也包括在本發明之較理想之人類化抗體。
hFR2-14_H1/L1係於實施例8獲得之人類化抗體。該抗體之輕鏈之鹼基序列記載於序列編號72(第80圖)，胺基酸序列記載於序列編號73(第81圖)，重鏈之鹼基序列記載於序列編號74(第82圖)，胺基酸序列記載於序列編號75(第83圖)。該抗體對於FGFR2有高結合活性，且有優良的熱安定性、FGFR2配體依賴性之FGFR2訊息中和活性、ADCC活性、及體內抗腫瘤活性(參照實施例)。
hFR2-14_H2/L1係於實施例8獲得之人類化抗體。該抗體之輕鏈之鹼基序列記載於序列編號72(第80圖)，胺基酸序列記載於序列編號73(第81圖)，重鏈之鹼基序列記載於序列編號76(第84圖)，胺基酸序列記載於序列編號77(第85圖)。該抗體對於FGFR2有高結合活性，且有優良的熱安定性、FGFR2配體依賴性之FGFR2訊息中和活性、ADCC活性、及體內抗腫瘤活性(參照實施例)。
hFR2-14_H3/L1係於實施例8獲得之人類化抗體。該抗體之輕鏈之鹼基序列記載於序列編號72(第80圖)，胺基酸序列記載於序列編號73(第81圖)，重鏈之鹼基序列記載於序列編號78(第86圖)，胺基酸序列記載於序列編號79(第87圖)。該抗體對於FGFR2有高結合活性，且有優良的熱安定性、FGFR2配體依賴性之FGFR2訊息中和活性、ADCC活性、及體內抗腫瘤活性(參照實施例)。
hFR2-14_H4/L1係於實施例8獲得之人類化抗體。該抗體之輕鏈之鹼基序列記載於序列編號72(第80圖)，胺基酸序列記載於序列編號73(第81圖)，重鏈之鹼基序列記載於序列編號80(第88圖)，胺基酸序列記載於序列編號81(第89圖)。該抗體對於FGFR2有高結合活性，且有優良的熱安定性、FGFR2配體依賴性之FGFR2訊息中和活性、ADCC活性、及體內抗腫瘤活性(參照實施例)。
hFR2-14_H5/L1係於實施例8獲得之人類化 抗體。該抗體之輕鏈之鹼基序列記載於序列編號72(第80圖)，胺基酸序列記載於序列編號73(第81圖)，重鏈之鹼基序列記載於序列編號82(第90圖)，胺基酸序列記載於序列編號83(第91圖)。該抗體對於FGFR2有高結合活性，且有優良的熱安定性、FGFR2配體依賴性之FGFR2訊息中和活性、及體內抗腫瘤活性，且即使暴露於苛酷的條件仍維持高抗原結合活性(參照實施例)。
hFR2-14_H6/L1係於實施例8獲得之人類化抗體。該抗體之輕鏈之鹼基序列記載於序列編號72(第80圖)，胺基酸序列記載於序列編號73(第81圖)，重鏈之鹼基序列記載於序列編號84(第92圖)，胺基酸序列記載於序列編號85(第93圖)。該抗體對於FGFR2有高結合活性、及FGFR2配體依賴性之FGFR2訊息中和活性(參照實施例)。
hFR2-14_H7/L1係於實施例8獲得之人類化抗體。該抗體之輕鏈之鹼基序列記載於序列編號72(第80圖)，胺基酸序列記載於序列編號73(第81圖)，重鏈之鹼基序列記載於序列編號86(第94圖)，胺基酸序列記載於序列編號87(第95圖)。該抗體對於FGFR2有高結合活性、及FGFR2配體依賴性之FGFR2訊息中和活性(參照實施例)。
hFR2-14_H8/L1係於實施例8獲得之人類化抗體。該抗體之輕鏈之鹼基序列記載於序列編號72(第80圖)，胺基酸序列記載於序列編號73(第81圖)，重鏈之鹼基序列記載於序列編號88(第96圖)，胺基酸序列記載於 序列編號89(第97圖)。該抗體對於FGFR2有高結合活性，且有優良的熱安定性、FGFR2配體依賴性之FGFR2訊息中和活性、ADCC活性、及體內抗腫瘤活性，且即使暴露於苛酷的條件仍維持高抗原結合活性(參照實施例)。
hFR2-14_H9/L1係於實施例8獲得之人類化抗體。該抗體之輕鏈之鹼基序列記載於序列編號72(第80圖)，胺基酸序列記載於序列編號73(第81圖)，重鏈之鹼基序列記載於序列編號90(第98圖)，胺基酸序列記載於序列編號91(第99圖)。該抗體對於FGFR2有高結合活性，且有優良的熱安定性、FGFR2配體依賴性之FGFR2訊息中和活性、及體內抗腫瘤活性(參照實施例)。
hFR2-14_H10/L1係於實施例8獲得之人類化抗體。該抗體之輕鏈之鹼基序列記載於序列編號72(第80圖)，胺基酸序列記載於序列編號73(第81圖)，重鏈之鹼基序列記載於序列編號92(第100圖)，胺基酸序列記載於序列編號93(第101圖)。該抗體對於FGFR2有高結合活性、及FGFR2配體依賴性之FGFR2訊息中和活性(參照實施例)。
hFR2-14_H11/L1係於實施例8獲得之人類化抗體。該抗體之輕鏈之鹼基序列記載於序列編號72(第80圖)，胺基酸序列記載於序列編號73(第81圖)，重鏈之鹼基序列記載於序列編號94(第102圖)，胺基酸序列記載於序列編號95(第103圖)。該抗體對於FGFR2有高結合活性，且有優良的熱安定性、FGFR2配體依賴性之FGFR2訊息中和活性、ADCC活性、及體內抗腫瘤活性，且即使暴 露於苛酷的條件仍維持高抗原結合活性(參照實施例)。
hFR2-14_H12/I1係於實施例8獲得之人類化抗體。該抗體之輕鏈之鹼基序列記載於序列編號72(第80圖)，胺基酸序列記載於序列編號73(第81圖)，重鏈之鹼基序列記載於序列編號96(第104圖)，胺基酸序列記載於序列編號97(第105圖)。該抗體對於FGFR2有高結合活性，且有優良的熱安定性、FGFR2配體依賴性之FGFR2訊息中和活性、ADCC活性、ADCP活性、抑制FGFR2配體與FGFR2結合之活性及體內抗腫瘤活性，且即使暴露於苛酷的條件仍維持高抗原結合活性(參照實施例)。
hFR2-14_H13/L1係於實施例8獲得之人類化抗體。該抗體之輕鏈之鹼基序列記載於序列編號72(第80圖)，胺基酸序列記載於序列編號73(第81圖)，重鏈之鹼基序列記載於序列編號98(第106圖)，胺基酸序列記載於序列編號99(第107圖)。該抗體對於FGFR2有高結合活性、及FGFR2配體依賴性之FGFR2訊息中和活性(參照實施例)。
hFR2-14_H14/L1係於實施例8獲得之人類化抗體。該抗體之輕鏈之鹼基序列記載於序列編號72(第80圖)，胺基酸序列記載於序列編號73(第81圖)，重鏈之鹼基序列記載於序列編號100(第108圖)，胺基酸序列記載於序列編號101(第109圖)。該抗體對於FGFR2有高結合活性、及FGFR2配體依賴性之FGFR2訊息中和活性(參照實施例)。
hFR2-14_H15/L1係於實施例8獲得之人類化 抗體。該抗體之輕鏈之鹼基序列記載於序列編號72(第80圖)，胺基酸序列記載於序列編號73(第81圖)，重鏈之鹼基序列記載於序列編號102(第110圖)，胺基酸序列記載於序列編號103(第111圖)。該抗體對於FGFR2有高結合活性、及FGFR2配體依賴性之FGFR2訊息中和活性(參照實施例)。
hFR2-14_H16/L1係於實施例8獲得之人類化抗體。該抗體之輕鏈之鹼基序列記載於序列編號72(第80圖)，胺基酸序列記載於序列編號73(第81圖)，重鏈之鹼基序列記載於序列編號104(第112圖)，胺基酸序列記載於序列編號105(第113圖)。該抗體對於FGFR2有高結合活性、及FGFR2配體依賴性之FGFR2訊息中和活性(參照實施例)。
hFR2-14_H17/L1係於實施例8獲得之人類化抗體。該抗體之輕鏈之鹼基序列記載於序列編號72(第80圖)，胺基酸序列記載於序列編號73(第81圖)，重鏈之鹼基序列記載於序列編號106(第114圖)，胺基酸序列記載於序列編號107(第115圖)。該抗體對於FGFR2有高結合活性、及FGFR2配體依賴性之FGFR2訊息中和活性(參照實施例)。
hFR2-14_H18/L1係實施例8獲得之人類化抗體。該抗體之輕鏈之鹼基序列記載於序列編號72(第80圖)，胺基酸序列記載於序列編號73(第81圖)，重鏈之鹼基序列記載於序列編號108(第116圖)，胺基酸序列記載於序列編號109(第117圖)。該抗體對於FGFR2有高結合活性 ，且有FGFR2配體依賴性之FGFR2訊息中和活性、ADCC活性、及體內抗腫瘤活性(參照實施例)。
hFR2-14_H19/L1係於實施例9獲得之糖鏈修飾經調節之人類化抗體。該抗體之輕鏈之鹼基序列記載於序列編號72(第80圖)，胺基酸序列記載於序列編號73(第81圖)，重鏈之鹼基序列記載於序列編號96(第104圖)，胺基酸序列記載於序列編號97(第105圖)。該抗體對於FGFR2有高結合活性，且有優良的熱安定性、FGFR2配體依賴性之FGFR2訊息中和活性、ADCC活性、ADCP活性、抑制FGFR2配體與FGFR2結合之活性及體內抗腫瘤活性，且即使暴露於苛酷的條件仍維持高抗原結合活性(參照實施例)。
又，將該等人類化FR2-14抗體對於小鼠投予，結果未觀察到體重減少、其他顯著的毒性。將hFR2-14_H12/L1抗體及fFR2-14_H19/L1抗體對於食蟹獼猴單次投予約150mg/kg經過14日後觀察，未觀察到顯著的臨床情況、血液學的變化、體重減少、其他顯著毒性。如此，本發明之人類化抗體具備作為用以治療或預防疾病之醫藥組成物的優異的安全性。
本發明之較理想之人類化hFR2-14_H1/L1至hFR2-14_H19/L1之中，更理想抗體為hFR2-14_H5/L1、hFR2-14_H11/L1、hFR2-14_H8/L1、hFR2-14_H12/L1及hFR2-14_H19/L1，又更理想抗體為hFR2-14_H12/L1及hFR2-14_H19/L1。
與本發明之大鼠FR2-10、FR-10FR及FR2-14 抗體、嵌合cFR2-10、cFR2-13及cFR2-14抗體、及人類化hFR2-14_H1/L1至hFR2-14_H19/L1抗體中任一者記載之抗體之重鏈及/或輕鏈之胺基酸序列含有80%以上、82%以上、84%以上、86%以上、88%以上、90%以上、92%以上、94%以上、96%以上、98%以上或99%以上之相同胺基酸序列，且結合於FGFR2之抗體或其功能性片段，也包含在本發明。該序列同一性，宜為94%以上，更宜為96%以上，又更宜為98%以上，最宜為99%以上。又，此等抗體，宜具有(3-3)至(3-6)記載之活性中之一種或更多種。
二種胺基酸序列間之同一性或相同性，可使用Blast algorithm version 2.2.2(Altschul,Stephen F.,Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaffer,Jinghui Zhang,Zheng Zhang,Webb Miller,and David J.Lipman(1997),「Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs」,Nucleic Acids Res.25：3389-3402)之預設參數決定。Blast algorithm，也可藉由例如在網路以1334907992153_0存取來使用。
包含本發明之大鼠FR2-10、FR-10FR及FR2-14抗體、嵌合cFR2-10、cFR2-13及cFR2-14抗體、及人類化hFR2-14_H1/L1至hFR2-14_H19/L1抗體中任一者記載之抗體之重鏈及/或輕鏈之胺基酸序列中的1至50個、1至45個、1至40個、1至35個、1至30個、1至25個、1至20個、1至15個、1至10個、1至8個、1至6個、1至5個、1至4個、1至3個、1或2個、或1個胺基酸取代、缺失、 附加或插入而成的胺基酸序列，而且結合於FGFR2之抗體或其功能性片段，也包括於本發明。該胺基酸變異宜為取代，變異胺基酸之個數宜為1至5個，更宜為1至4個，又更宜為1至3個，再更宜為1至2個，最宜為1個。又，此等抗體，宜具有(3-3)至(3-6)記載之活性中之一種或更多種。
包含由與編碼為具有本發明之大鼠FR2-10、FR-10FR及FR2-14抗體、嵌合cFR2-10、cFR2-13及cFR2-14抗體、及人類化hFR2-14_H1/L1至hFR2-14_H19/L1抗體中任一者記載之抗體之重鏈及/或輕鏈之胺基酸序列的鹼基序列為互補的鹼基序列之核苷酸在嚴格的條件下進行雜交之核苷酸所具有之鹼基序列編碼的胺基酸序列，且結合於FGFR2之抗體或其功能性片段，也包含於本發明。此等抗體宜具有(3-3)至(3-6)記載之活性中之一種或更多種。
本發明之另一態樣中，提供人類抗體或其功能性片段。本發明之人類抗體，只要是與FGFR2結合之人類來源的抗體即可，不特別限定，但具有抗腫瘤活性，較佳為於體內具有抗腫瘤活性。又，該人類化抗體或其功能性片段，宜與FGFR2IIIb蛋白質及/或FGFR2IIIc蛋白質專一的結合，更佳為結合於此等蛋白質具有之類Ig區域。再者，該人類化抗體或其功能性片段，宜具有ADCC活性及/或ADCP活性。又，本發明之人類抗體或其功能性片段對於FGFR2有中和活性，宜對於FGFR2IIIb及/或FGFR2IIIc有中和活性，更宜為對於FGFR2IIIb及 FGFR2IIIc有中和活性。再者，本發明之人類化抗體或其功能性片段，宜抑制FGFR2與其配體之結合。
(3-11)與抗原決定位結合之抗體
與本發明提供之抗體係「結合於同一部位之抗體」，也包括在本發明之抗體。與某抗體係「結合於同一部位之抗體」，指在該抗體所辨識之抗原分子上之部位結合之其他抗體。若在第1抗體所結合之抗原分子上之部分胜肽或部分立體結構有第2抗體結合，則可判定第1抗體與第2抗體係結合於同一部位。又，藉由確認第2抗體競爭第1抗體對於抗原之結合，亦即，第2抗體妨礙第1抗體與抗原之結合，即使未決定具體的結合部位之胜肽序列或立體結構，也能判定第1抗體與第2抗體係於同一部位結合。再者，當第1抗體與第2抗體係於同一部位結合且第1抗體具有抗腫瘤活性等本發明之抗體之一態樣的特徵的效果時，第2抗體也具有同樣活性的機率極高。因此，若第2之抗FGFR2抗體結合在第1之抗FGFR2抗體之結合部位，則可判定第1抗體與第2抗體係於FGFR2蛋白質上之同一部位結合。又，若能確認第2之抗FGFR2抗體競爭第1之抗FGFR2抗體對於FGFR2蛋白質之結合，則可判定第1抗體與第2抗體係在FGFR2蛋白質上之同一部位結合之抗體。
與本發明之單株抗體FR2-10、FR2-13或FR2-14所辨識之FGFR2蛋白質上之部位結合的抗體，也包括於本發明。
抗體之結合部位，可利用免疫分析法等該技 術領域中具有通常知識者周知的方法決定。例如製作將抗原之胺基酸序列從C端或N端適當切下而成的一系列胜肽，探討對抗此等胜肽的抗體的反應性，大致決定辨識部位後，再合成短胜肽，並且探討抗體對於此等胜肽的反應性，可決定結合部位。抗原片段胜肽，可使用基因重組、胜肽合成等之技術製備。
抗體係結合於或辨識抗原之部分高次結構的情形，該抗體之結合部位可使用X射線結構分析，將與該抗體相鄰之抗原上之胺基酸殘基予以特定而決定。例如利用使抗體或其片段與抗原或其片段結合並結晶化，並進行結構分析，能夠特定具有與抗體交互作用之距離的抗原上之胺基酸殘基。交互作用距離為8埃以下，較佳為6埃以下，更佳為4埃以下。具有如此之與抗體間之交互作用距離的胺基酸殘基，可能以1或更多個構成抗體之抗原結合部位(抗原決定位)。該胺基酸殘基為2個以上的情形，各胺基酸即使於一次序列上未彼此相鄰亦可。
使大鼠、嵌合或人類化FR2-14抗體之Fab片段與人類FGFRIIIb之D2片段(序列編號70：包含第78圖之胺基酸號碼128至249之胜肽)結合，於1.1至2.1M硫酸銨-0.15MTris鹽酸緩衝液(pH6.5至8.5)之條件下使其結晶化，會獲得為正方晶系且空間群為P41212、結晶之單位晶格為a=b=60.57埃、c=331.2埃的結晶。使用此三維結構座標實施分子取代法，可決定相位(參照實施例15)。
大鼠、嵌合或人類化FR2-14抗體，辨識人類FGFRIIIb上之部分高次結構。該抗體之抗原決定位，係 與人類FGFRIIIb之胺基酸序列(序列編號70：第78圖)中之155號之酪胺酸(Tyr)、157號之蘇胺酸(Thr)、176號之離胺酸(Lys)、181號之丙胺酸(Ala)、182號之甘胺酸(Gly)、183號之甘胺酸(Gly)、184號之天冬醯胺酸(Asn)、185號之脯胺酸(Pro)、186號之甲硫胺酸(Met)、188號之蘇胺酸(Thr)、200號之麩醯胺酸(Gln)、201號之麩胺酸(Glu)、205號之甘胺酸(Gly)、206號之甘胺酸(Gly)、208號之離胺酸(Lys)、209號之纈胺酸(Val)、210號之精胺酸(Arg)、211號之天冬醯胺酸(Asn)、212號之麩醯胺酸(Gln)、213號之組胺酸(His)、214號之色胺酸(Trp)、及217號之異白胺酸(Ile)之各殘基而構成。換言之，該抗體係與人類FGFRIIIb之胺基酸序列(序列編號70：第78圖)中之155號之酪胺酸(Tyr)、157號之蘇胺酸(Thr)、176號之離胺酸(Lys)、181號之丙胺酸(Ala)、182號之甘胺酸(Gly)、183號之甘胺酸(Gly)、184號之天冬醯胺酸(Asn)、185號之脯胺酸(Pro)、186號之甲硫胺酸(Met)、188號之蘇胺酸(Thr)、200號之麩醯胺酸(Gln)、201號之麩胺酸(Glu)、205號之甘胺酸(Gly)、206號之甘胺酸(Gly)、208號之離胺酸(Lys)、209號之纈胺酸(Val)、210號之精胺酸(Arg)、211號之天冬醯胺酸(Asn)、212號之麩醯胺酸(Gln)、213號之組胺酸(His)、214號之色胺酸(Trp)、及217號之異白胺酸(Ile)有交互作用距離。與該抗原決定位結合、或與該胺基酸殘基具有交互作用距離之抗體、其功能性片段或其修飾體，包括在本發明之抗體、其功能性片段或其修飾體。
(3-12)抗體之修飾體
本發明提供抗體或其功能性片段之修飾體。本發明之抗體或其功能性片段之修飾體，係指對於本發明之抗體或其功能性片段施以化學性或生物學性修飾而成者。化學性修飾體，包括對於胺基酸骨架施以化學部分之鍵結、N-鍵結或O-鍵結碳水化物鏈之化學修飾體等。生物學的修飾體，包括：經轉譯後修飾(例如：對於N-鍵結或O-鍵結附加糖鏈、N端或C端之處理、脫醯胺化、天冬胺酸之異構化、甲硫胺酸之氧化)者、使用原核生物寄主細胞使其表現以於N端附加甲硫胺酸殘基者等。又，為了能夠偵測或單離本發明之抗體或抗原而加以標記者，例如：酵素標記體、螢光標記體、親和性標記體，也包括在此修飾物之含意。如此之本發明之抗體或其功能性片段之修飾物，對於原本本發明之抗體或其功能性片段之安定性及血中滯留性之改善、抗原性減低、該抗體或抗原之偵測或單離等有用。
化學的修飾體所含之化學部分，可列舉聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧基甲基纖維素、聚葡糖、聚乙烯醇等水溶性聚合物。
作為生物學的修飾體，可列舉利用酵素處理或細胞處理等施以修飾者、利用基因重組附加了標籤等其他胜肽而得之融合體、及將表現內因性或外來性糖鏈修飾酵素之細胞作為寄主而製備者等。
可藉由調節與本發明之抗體或其功能性片段結合之糖鏈修飾(糖苷化、脫海藻糖化等)而增強抗體依賴性細胞傷害活性。抗體之糖鏈修飾之調節技術，已知 例如：WO99/54342、WO00/61739、WO02/31140等記載，但不限定於此等。本發明之抗體之修飾體，也包括該糖鏈修飾經調節之抗體。
該修飾係可以於抗體或其功能性片段之任意位置、或所望位置實施，也可於1個或2個以上之位置實施相同或2種以上不同的修飾。
本發明中之「抗體片段之修飾體」，也包括「抗體之修飾體之片段」。
本發明中之抗體之修飾體、其功能性片段之修飾體，有時簡單稱為「抗體」、「抗體之功能性片段」。
hFR2-14_H19/L1係於實施例9獲得之糖鏈修飾經調節之人類化抗體。該抗體之輕鏈之鹼基序列記載於序列編號72(第80圖)，胺基酸序列記載於序列編號73(第81圖)，重鏈之鹼基序列記載於序列編號96(第104圖)，胺基酸序列記載於序列編號97(第105圖)。此人類化抗體，也包括在本發明之抗體、本發明之抗體之修飾體。
4.抗體之製造方法
(4-1)使用融合瘤之方法
本發明之抗FGFR2抗體，可藉由由照Kohler與Milstein之方法(Kohler and Milstein,Nature(1975)256,p.495-497、Kennet,R.ed.,Monoclonal Antibody,p.365-367,Prenum Press,N.Y.(1980))，從以FGFR2蛋白質或其可溶型形態免疫之動物之脾臟單離抗FGFR2抗體之產生細胞，使該細胞與骨髓瘤細胞融合以建立融合瘤， 並從該融合瘤之培養物取得單株抗體。
(4-1-1)抗原之製備
用以製作抗FGFR2抗體之抗原，可由本發明之其他部分記載之天然型或重組型之FGFR2蛋白質之製備法等取得。作為以此方式製備之抗原，可列舉包含FGFR2蛋白質或其至少6個連續之部分胺基酸序列的FGFR2蛋白質片段、或在此等有任意之胺基酸序列或擔體附加之衍生物等(以下合稱「FGFR2抗原」)。
重組型FGFR2抗原，可藉由將包含編碼為FGFR2抗原具有之胺基酸序列的鹼基序列的基因導入寄主細胞，並從該細胞之培養物將該抗原回收以製備。該重組型抗原，也可為與免疫球蛋白之Fc區等其他蛋白質之融合蛋白質。又，將包含編碼為FGFR2抗原之胺基酸序列的鹼基序列的基因利用體外(in vitro)轉譯系統於無細胞系獲得之FGFR2抗原，也包括在重組型FGFR2抗原。非重組型FGFR2抗原，可從(2-2)之(iv)記載之表現FGFR之正常組織、癌組織、癌細胞、癌細胞之培養物等精製、單離。
(4-1-2)抗FGFR2單株抗體之製造
單株抗體之製造通常經過如下列步驟。
(a)製備抗原之步驟、(b)製備抗體產生細胞之步驟、(c)製備骨髓腫瘤細胞(以下稱為「骨髓瘤」)之步驟、(d)使抗體產生細胞與骨髓瘤融合之步驟、 (e)挑選產生目的抗體之融合瘤群之步驟、及(f)獲得單一細胞選殖體之步驟(選殖)。
視需要，更加上(g)融合瘤之培養步驟、已移殖融合瘤之動物之飼育步驟等、(h)單株抗體之生物活性之測定步驟、判定步驟等。
以下循上述步驟詳述單株抗體之製作法，但該抗體之製作法不限定於此，例如也可使用脾細胞以外之抗體產生細胞及骨髓瘤。
(a)抗原之精製
由前述(2-3)記載之FGFR2蛋白質之製備法。
(b)製備抗體產生細胞之步驟
將步驟(a)獲得之抗原與佛洛由德之完全或不完全佐劑、或鉀明礬之類的輔助劑混合，作為免疫原對於實驗動物進行免疫。實驗動物，可無問題地使用在周知之融合瘤製作法使用的動物。具體而言，例如可使用小鼠、大鼠、山羊、綿羊、牛、馬等。惟，從取得與摘出之抗體產生細胞融合之骨髓瘤細胞的容易性等觀點而言，將小鼠或大鼠作為被免疫動物較佳。
又，實際使用之小鼠及大鼠之系統不特別限制，為小鼠的情形，例如：A、AKR、BALB/c、BALB/cAnNCrj、BDP、BA、CE、C3H、57BL、C57BL、C57L、DBA、FL、HTH、HT1、LP、NZB、NZW、RF、R III、SJL、SWR、WB、129等，為大鼠之情形，例如可使用Wistar、Low、Lewis、Spraque、Daweley、ACI、BN、Fischer等。
該等小鼠及大鼠可從例如日本Clea、日本Charles River等實驗動物飼育販賣業者取得。
其中，若考慮與後述骨髓瘤細胞間的融合適合性，小鼠特佳為使用BALB/c系統、大鼠特佳為使用Wistar及Low系統作為被免疫動物。
又，考慮抗原之人類與小鼠間的相同性，使用去除自體抗體之活體機制低落的小鼠，亦即自體免疫疾病小鼠亦為較理想。
又，此等小鼠或大鼠免疫時之年齡週數較佳為5至12週大，更佳為6至8週大。
以FGFR2蛋白質進行動物免疫，例如可使用Weir,D.M.,Handbook of Experimental Immunology Vol.I.II.III.,Blackwell Scientific Publications,Oxford(1987)、Kabat,E.A.and Mayer,M.M.,Experimental Immunochemistry,Charles C Thomas Publisher Spigfield,Illinois(1964)等之方法。
抗體價之測定法，例如：RIA法、ELISA法等之免疫分析，但不限定於此等方法。
從經免疫之動物分離之脾臟細胞或淋巴球而來之抗體產生細胞，例如可由Kohler et al.,Nature(1975)256,p.495,；Kohler et al.,Eur.J.Immnol.(1977)6,p.511,；Milstein et al.,Nature(1977),266,p.550,；Walsh,Nature,(1977)266,p.495,)等之周知之方法製備。
脾臟細胞的情形，可採用將脾臟切碎並將細胞以不銹鋼網過濾後，使浮游在EAGLE最小必須培養基 (MEM)等而分離抗體產生細胞的一般方法。
(c)製備骨髓瘤之步驟
細胞融合使用之骨髓瘤細胞，不特別限定，可從周知細胞株適當選用，但考慮從融合細胞選擇融合瘤時之方便性，宜採用選擇過程已經確立之HGPRT(Hipoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase)缺損株，亦即小鼠來源之X63-Ag8(X63)、NS1-ANS/1(NS1)、P3X63-Ag8.U1(P3U1)、X63-Ag8.653(X63.653)、SP2/0-Ag14(SP2/0)、MPC11-45.6TG1.7(45.6TG)、FO、S149/5XXO、BU.1等、大鼠來源之210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3)等、人類來源之U266AR(SKO-007)、GM1500‧GTG-A12(GM1500)、UC729-6、LICR-LOW-HMy2(HMy2)、8226AR/NIP4-1(NP41)等較佳。該等HGPRT缺損株可從例如：American Type Culture Collection(ATCC)等取得。
該等細胞株，係於適當培養基例如8-氮鳥嘌呤培養基[於RPMI-1640培養基中添加麩醯胺酸、2-巰基乙醇、建它黴素、及胎牛血清(以下稱為「FBS」)之培養基，加入了8-氮雜鳥嘌呤的培養基]、Iscove改變Dulbecco培養基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium；以下稱為「IMDM」)、或Dulbecco改變Eagle培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium；以下稱為「DMEM」)進行繼代培養，但於細胞融合之3至4日前以正常培養基[例如含10% FBS之ASF104培養基(AJINOMOTO(股)製)]進行繼代培養，確保於融合當日有2×107以上之細胞數。
(d)使抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合之步 驟
抗體產生細胞與骨髓瘤細胞之融合，可由周知之方法(Weir,D.M.,Handbookof Experimental Immunology Vol.I.II.III.,Blackwell Scientific Publications,Oxford(1987)、Kabat,E.A.and Mayer,M.M.,Experimental Immunochemistry,Charles C Thomas Publisher Spigfield,Illinois(1964)等)，於不使細胞之存活率極度下降的程度的條件下實施。例如可使用於聚乙二醇等高濃度聚合物溶液中使抗體產生細胞與骨髓瘤細胞混合之化學性方法、利用電刺激之物理性方法等。
(e)選擇產生目的抗體之融合瘤群之步驟
由細胞融合而獲得之融合瘤之選擇方法不特別限定，通常使用HAT(次黃嘌呤‧胺基喋呤‧胸苷)選擇法(Kohler et al.,Nature(1975)256，p.495；Milstein et al.,Nature(1977)266，p.550)。此方法在使用於胺基喋呤無法生存之HGPRT缺損株之骨髓瘤細胞獲得融合瘤時為有效。亦即，藉由將未融合細胞及融合瘤以HAT培養基培養，能選擇性地僅使具有對於胺基喋呤之耐性的融合瘤殘存並生長。
(f)獲得單一細胞選殖體之步驟(選殖)
融合瘤之選殖法，例如可使用甲基纖維素法、軟瓊脂糖法、極限稀釋法等周知方法(參照例如：Barbara,B.M.and Stanley,M.S.：Selected Methods in Cellular Immunology,W.H.Freeman and Company，San Francisco(1980))，較佳為極限稀釋法。
(g)融合瘤之培養步驟、已移殖融合瘤之動物之飼育步驟
藉由培養所選擇之融合瘤，能產生單株抗體，但較佳為先選擇理想的融合瘤後供抗體產生。
該融合瘤所產生之單株抗體，可從該融合瘤之培養物回收。又，也可從已導入該單株抗體基因之細胞之培養物，以重組抗體的形式回收。再者，藉由對於同系統之小鼠(例如：上述之BALB/cAnNCrj)、或Nu/Nu小鼠之腹腔內注射融合瘤並且使該融合瘤生長，可從其腹水回收。
(h)單株抗體之生物活性之測定步驟、判定步驟
可因應目的選擇、應用各種生物試驗。
(4-2)細胞免疫法
藉由將表現天然型FGFR2蛋白質之細胞、表現重組型FGFR2蛋白質或其片段的細胞等當作免疫原，可利用前述融合瘤法製備抗FGFR2抗體。
作為表現天然型FGFR2蛋白質之細胞，可列舉表現FGFR2之細胞、表現FGFR2之組織或癌而來之細胞株、可測定到FGFR2IIIb切換為FGFR2IIIc之癌組織來源的細胞株等。於高表現FGFR2之癌，有時會觀察到胃癌、乳癌等基因放大者、及胰臟癌、卵巢癌等過度表現者。作為高表現FGFR2IIIb之培養細胞株，可列舉胃癌細胞株、乳癌細胞株等。作為高表現FGFR2IIIb之培養細胞株，可列舉大腸(盲腸)細胞癌。可觀測到從FGFR2IIIb切 換為FGFR2IIIc之癌組織，可列舉前列腺癌、膀胱癌、乳癌等。作為表現FGFR2IIIc之癌組織，可列舉子宮頸癌、非小細胞肺癌等，其中，於子宮頸癌中為高表現。又，作為高表現FGFR2之正常組織，可列舉腦、大腸、甲狀腺、子宮、膽囊、皮膚等。
表現FGFR2之細胞，係將1×105至1×109個，宜為1×106至1×108個，更宜為0.5至2×107個，又更宜為1×107個用在1次免疫，但是，可因應FGFR2蛋白質之表現量改變供免疫之細胞數。該免疫源，一般係對於腹腔內投予，但也可對於皮內等投予。融合瘤之製作方法，可應用(4-1-2)記載之方法。
(4-3)基因重組
本發明之抗體，也可藉由將包含編碼為其重鏈胺基酸序列之鹼基序列的核苷酸(重鏈核苷酸)及包含編碼為其輕鏈胺基酸序列之鹼基序列的核苷酸(輕鏈核苷酸)、或插入有該重鏈核苷酸之載體及插入有輕鏈核苷酸之載體導入寄主細胞，培養該細胞後從其培養物回收該抗體以製備。也可於一個載體插入重鏈核苷酸及輕鏈核苷酸。
寄主細胞可以使用原核細胞或真核細胞。使用真核細胞作為寄主時，可使用動物細胞、植物細胞、真核微生物。
動物細胞，例如：哺乳類來源之細胞、亦即，猴來源之COS細胞(Gluzman,Y.Cell(1981)23,p.175-182、ATCC CRL-1650)、小鼠纖維母細胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)、小鼠NS0細胞株(ECACC)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞、ATCC CCL-61)、其二氫葉酸還原酵素缺損株(CHOdhfr-：Urlaub,G.and Chasin,L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77,p.4126-4220)、CHOK1SV(Lonza Biologics)、雞等鳥類來源之細胞、昆蟲來源之細胞等。
又，以調節抗體等之蛋白質之糖鏈修飾而改變的細胞，也可當作寄主。例如若使用改變成抗體之Fc區所結合之N-糖苷鍵複合型糖鏈當中的糖鏈還原末端的N-乙醯基葡糖胺上有海藻糖結合之糖鏈減少或消除的CHO細胞來表現抗體等，可製備經脫海藻糖化之抗體(也稱為抗體之修飾體)(WO00/61739號、WO02/31140號等)。
真核微生物，可列舉例如：酵母等。
原核細胞，可列舉例如：大腸菌、枯草菌等。
作為使本發明之抗體(各種動物來源之單株抗體、大鼠抗體、小鼠抗體、嵌合化抗體、人類化抗體、人類抗體等)分泌之訊息胜肽，不限於與該抗體為同種、同型及同次型之抗體之分泌訊息、及該抗體自體之分泌訊息，若為其他型或次型之抗體之分泌訊息、或其他真核生物種或原核生物來源之蛋白質之分泌訊息，可任意選用。
(4-4)人類化抗體之設計法及製備法
作為人類化抗體，可列舉僅將非人類動物抗體之CDR納入人類來源之抗體而得的抗體(參照Nature(1986)321，p.522-525)、利用CDR移植法將CDR之序列及 一部分框架之胺基酸殘基移植到人類抗體而得之抗體(WO90/07861號、US6972323號公報參照)、將此等任一者中之非人類動物抗體中之1個或2個以上之胺基酸取代為人類型之胺基酸的抗體等，但不限於此等。
(4-5)人類抗體之製備法
作為本發明之抗體，可更列舉人類抗體。抗FGFR2人類抗體，係指包含人類來源之抗體之胺基酸序列而構成的抗FGFR2抗體。抗FGFR2人類抗體，可利用使用含有人類抗體之重鏈與輕鏈之基因之具人類基因體DNA片段的人類抗體產生小鼠的方法取得(參照Tomizuka,K.et al.,Nature Genetics(1997)16,p.133-143,；Kuroiwa,Y.et.al.,Nuc.Acids Res.(1998)26,p.3447-3448；Yoshida,H.et.al.,Animal Cell Technology：Basic and Applied Aspects vol.10,p.69-73(Kitagawa,Y.,Matuda,T.and Iijima,S.eds.),Kluwer Academic Publishers,1999.；Tomizuka,K.et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97,p.722-727等。)。
人類抗體產生動物，具體而言，可利用非人類哺乳動物之內在性免疫球蛋白重鏈及輕鏈之基因座已破壞，而代之以經由酵母人工染色體(Yeast artificial chromosome，YAC)載體等將人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈之基因座導入而得之重組動物、藉由將此等動物彼此交配而作出的重組動物中任一者。
又，利用基因重組技術，將編碼為如此之人類抗體之各重鏈及輕鏈的cDNA，較佳為利用含該cDNA之載體將真核細胞轉形，並培養產生基因重組人類單株 抗體之轉形細胞，從培養上清也可獲得該抗體。
在此，寄主例如可使用真核細胞，較佳為CHO細胞、淋巴球或骨髓瘤等之哺乳動物細胞。
又，取得從人類抗體庫選擇之噬菌體展示來源之人類抗體的方法亦為已知(參照Wormstone,I.M.et.al,Investigative Ophthalmology & Visual Science.(2002)43(7),p.2301-2308；Carmen,S.et.al.,Briefings in Functional Genomics and Proteomics(2002),1(2),p.189-203；Siriwardena,D.et.al.,Opthalmology(2002)109(3),p.427-431)。
例如可使用如以下方法：將人類抗體之可變區作為單股抗體(scFv)在噬菌體表面表現，並選擇與抗原結合之噬菌體之噬菌體展示法(Nature Biotechnology(2005),23,(9),p.1105-1116)。
藉由分析利用與抗原結合以選擇之噬菌體之基因，可決定編碼為與抗原結合之人類抗體之可變區的DNA序列。
若解出與抗原結合之scFv之DNA序列，可製作具有該序列之表現載體，並導入適當寄主而使其表現，以取得人類抗體(WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388、Annu.Rev.Immunol(1994)12,p.433-455、Nature Biotechnology(2005)23(9),p.1105-1116)。
(4-6)抗體之功能性片段之製備法
製作單股抗體之方法，於該發明所屬之技術 領域為周知(例如參照美國專利第4,946,778號、美國專利第5,260,203號、美國專利第5,091,513號、美國專利第5,455,030號等)。此scFv中，重鏈可變區與輕鏈可變區可經由不會成為共軛之連結子，較佳為多胜肽連結子而連結(Huston,J.S.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988),85,p.5879-5883)。scFv中之重鏈可變區及輕鏈可變區可來自於同一抗體，也可來自於分別之抗體。
將可變區連結之多胜肽連結子，例如可使用包含12至19個殘基的任意單股胜肽。
編碼為scFv之DNA，可將編碼為前述抗體之重鏈或重鏈可變區之DNA、及編碼為輕鏈或輕鏈可變區之DNA當中，編碼為此等序列中之全部或理想之胺基酸序列的DNA部分當作模盤，使用規定其兩端之引子對以PCR法放大，其次再將編碼為多胜肽連結子部分之DNA、與規定其兩端與各重鏈、輕鏈連結之引子對予以組合以放大而獲得。
使用編碼為scFv之DNA，可由常法製備含該DNA之表現載體、及由該表現載體轉形之寄主細胞，又，可藉由培養其寄主細胞，由常法從該培養物回收該scFv。
其他抗體之功能性片段，也可利用由前述方法取得編碼為該功能性片段之基因並導入細胞，再從該細胞之培養物回收該功能性片段以獲得。
本發明之抗體，也可為多聚化而提高對於抗原之親和性者。作為多聚化之抗體，可為1種抗體，也可 為辨識同一抗原之多數抗原決定位之多數抗體。作為將抗體多聚化之方法，可列舉IgG CH3區域與2個scFv之結合、與鏈黴親和素(streptoavidin)之結合、螺旋-轉-螺旋(helix-turn-helix)模體之導入等。
本發明之抗體，也可為胺基酸序列相異之多數種抗FGFR2抗體之混合物，亦即多株抗體。多株抗體，例如：CDR之部分或全部為不同之多數種抗體之混合物。如此的多株抗體，可將相異之抗體產生細胞混合培養，並從該培養物回收(WO2004/061104號)。又，也可混合分別製備的抗體。再者，多株抗體之一態樣的抗血清，可藉由將動物以理想抗原免疫，由定法從該動物回收血清以製備。
作為抗體之修飾物，也可使用結合有聚乙二醇(PEG)等各種分子的抗體。
本發明之抗體，也可為該等抗體與其他藥劑形成結合物者(Immunoconjugate)。作為如此之抗體，例如該抗體與放射性物質或有藥理作用之化合物結合之物(Nature Biotechnology(2005)23,p.1137-1146)。
(4-7)抗體之精製
獲得之抗體可精製至均勻。抗體之分離、精製，可使用通常蛋白質使用之分離、精製方法。
例如適當選擇、組合層析管柱、過濾、極限過濾、鹽析、透析、製備用聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電點電泳等可將抗體分離、精製(Strategies for Protein Purification and Charcterization：A Laboratoy Course Manual,Daniel R.Marshak et al.eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但不限於此等。
層析，可列舉親和性層析、離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾、逆相層析、吸附層析等。
該等層析可使用HPLC或FPLC等之液相層析儀實施。
親和性層析使用之管柱，可列舉Protein A管柱、Protein G管柱、抗原管柱等。
Protein A管柱，例如：Hyper D(PALL公司製，POROS(Applied Systems公司製)，Sepharose F.F.(GE Healthcare公司製)等。
又，也可使用已固定抗原之擔體，利用對於抗原之結合性將抗體精製。
(4-8)編碼為抗體之基因、重組載體、重組細胞
本發明也提供：編碼為本發明之抗體或其功能性片段或其修飾體之基因(稱為「抗體基因」)、已插入該基因之重組載體、已導入該基因或載體之細胞(稱為「抗體基因導入細胞」)、其他產生本發明之抗體或功能性片段或其修飾體之細胞(稱為「抗體產生細胞」)。
本發明之抗體基因，宜包含以下(a)至(e)中任一者記載之鹼基序列(以下稱為「抗體基因序列」)而成、或包含含抗體基因序列之鹼基序列而成、或包含抗體 基因序列而成：(a)編碼為大鼠FR2-10、FR2-13及FR2-14、嵌合cFR2-10、cFR2-13及cFR2-14、及人類化hFR2-14_H1/L1至hFR2-14_H19/L1中任一者之抗體之重鏈胺基酸序列的鹼基序列與編碼為輕鏈胺基酸序列之鹼基序列之組合；(b)編碼為含大鼠FR2-10、FR2-13及FR2-14、嵌合cFR2-10、cFR2-13及cFR2-14、及人類化hFR2-14_H1/L1至hFR2-14_H19/L1中之任一抗體之CDRH1至CDRH3之重鏈之胺基酸序列的鹼基序列與編碼為含CDRL1至CDRL3之輕鏈之胺基酸序列之鹼基序列之組合；(c)編碼為含大鼠FR2-10、FR2-13及FR2-14、嵌合cFR2-10、cFR2-13及cFR2-14、及人類化hFR2-14_H1/L1至hFR2-14_H19/L1中任一抗體之重鏈可變區之胺基酸序列之重鏈胺基酸序列的鹼基序列與編碼為含輕鏈可變區之胺基酸序列之輕鏈胺基酸序列的鹼基序列之組合；(d)編碼為與包含(a)至(c)中任一項記載之鹼基序列為互補的鹼基序列而成的核苷酸在嚴格的條件下雜交且與FGFR2結合之抗體之胺基酸序列的鹼基序列；及(e)編碼為(a)至(c)中任一項記載之胺基酸序列中有1至50個、1至45個、1至40個、1至30個、1至25個、1至20個、1至15個、1至10個、1至8個、1至6個、1至5個、1至4個、1至3個、1或2個、或1個鹼為取代、缺 失、附加或插入而成的胺基酸序列且編碼為與FGFR2結合之抗體之胺基酸序列的鹼基序列；具有由(d)或(e)記載之鹼基序列編碼之胺基酸序列的抗體，除了有FGFR2結合活性，也可具有上述(3-3)至(3-6)記載之1種或2種以上之活性。
惟，本發明之抗體基因不限於上述(a)至(e)記載者。
本發明，也提供如(4-3)記載之包含培養本發明之抗體基因導入細胞之步驟、及從其培養物回收抗體或其功能性片段或其修飾體之步驟的抗體或其功能性片段或其修飾體之製造方法。由此製造方法獲得之抗體或其功能性片段或其修飾體，也包括在本發明。
5.醫藥組成物
本發明提供含有抗FGFR2抗體或其功能性片段或其修飾體之醫藥組成物。
本發明之醫藥組成物，對於FGFR2或其配體之過度表現或FGFR2之變異或基因放大引起的FGFR2訊息異常或亢進、或FGFR2之異構體之切換造成病發或惡化之各種疾病(以下稱為「FGFR2相關疾病」)，特別是各種癌之治療或預防有用。
成為該治療或預防之對象的癌的病發或惡化之原因，可列舉FGFR2基因之內含子內之單一鹼基取代(SNP)、FGFR2之高表現、使FGFR2結構性活化之錯義變異、FGFR2基因之放大或過度表現、FGFR2IIIb切換為FGFR2IIIc等。
該癌種類，例如：乳癌、子宮內膜癌、卵巢癌、非小細胞肺癌等肺癌、胃癌、前列腺癌、腎癌、肝臟癌、胰臟癌、大腸癌、食道癌、膀胱癌、子宮頸癌、血癌、淋巴瘤、惡性黑色瘤等，宜為表現FGFR2蛋白質的此等癌。
本發明中，疾病之治療或預防，包括該疾病，較佳為表現FGFR2蛋白質之個體中之該疾病之病發之預防、惡化或進展之抑制或妨礙、罹患該疾病之個體呈現之一種或二種以上之症狀減輕、惡化或進展之抑制或緩解、二次性疾病之治療或預防等，但不限定於此等。
本發明之醫藥組成物中，可含有對於治療或預防為有效量之抗FGFR2抗體或該抗體之功能性片段及藥學上可容許之稀釋劑、擔體、可溶化劑、乳化劑、保存劑及/或輔助劑。
「對於治療或預防為有效之量」，係指就特定疾病、投予形態及投予路徑發揮治療或預防效果之量，與「藥理學上為有效之量」含意相同。
本發明之醫藥組成物中，可含有用以改變、維持、保持pH、滲透壓、黏度、透明度、顏色、等張性、無菌性、該組成物或其中所含之抗體之安定性、溶解性、緩釋性、吸收性、滲透性、劑型、強度、性狀、形狀等之物質(以下稱為「製劑用之物質」)。製劑用之物質，只要是藥理學上可容許之物質即可，不特別限定。例如：非毒性或低毒性係製劑用物質宜具備之性質。
製劑用物質，例如以下者，但不限於此等； 甘胺酸、丙胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸等之胺基酸類、抗菌劑、抗壞血酸、硫酸鈉或亞硫酸氫鈉等之抗氧化劑、磷酸、檸檬酸、硼酸緩衝液、碳酸氫鈉、Tris-鹽酸(Tris-Hcl)溶液等之緩衝劑、甘露醇或甘胺酸等之填充劑、乙二胺四乙酸(EDTA)等之螯合劑、咖啡因、聚乙烯基吡咯啶、β-環糊精或羥基丙基-β-環糊精等之錯化劑、葡萄糖、甘露糖或糊精等之增量劑、單糖類、雙糖類或葡萄糖、甘露糖或糊精等之其他碳水化物、著色劑、香味劑、稀釋劑、乳化劑或聚乙烯基吡咯啶等之親水聚合物、低分子量多胜肽、鹽形成相對離子、殺藻胺、苯甲酸、水楊酸、乙汞硫柳酸鈉、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定(Chlorhexidine)、山梨酸或過氧化氫等之防腐劑、甘油、丙二醇或聚乙二醇等之溶劑、甘露醇或山梨醇等之糖醇、懸浮劑、PEG、山梨糖醇酐酯、聚山梨酯20或聚山梨酯80等聚山梨酯、triton(triton)、胺基丁三醇(tromethamine)、卵磷脂或膽固醇等之界面活性劑、蔗糖或山梨醇等之安定化增強劑、氯化鈉、氯化鉀、甘露醇或山梨醇等之彈性增強劑、輸送劑、稀釋劑、賦形劑、及/或藥學上之輔助劑。
該等製劑用物質之添加量，相對於抗FGFR2抗體或其功能性片段或其修飾體之重量，為0.001至1000倍，宜為0.01至100倍，更佳為0.1至10倍。
包含使抗FGFR2抗體或其功能性片段或其修飾體含在微脂體中而得之免疫微脂體、抗體與微脂體結 合成的抗體修飾體(美國專利第6214388號等)的醫藥組成物，也包括於本發明之醫藥組成物。
賦形劑或擔體，通常為液體或固體，只要是注射用水、生理食鹽水、人工腦脊髓液、其他經口投予或非經口投予用之製劑使用的物質即可，不特別限定。生理食鹽水可列舉中性者、含血清白蛋白者等。
緩衝劑，可列舉製備成醫藥組成物之最終pH成為7.0至8.5的Tris緩衝液、同樣製備成為4.0至5.5之乙酸緩衝液、同樣製備成為5.0至8.0之檸檬酸緩衝液、同樣製備成為5.0至8.0之組胺酸緩衝液等。
本發明之醫藥組成物，為固體、液體、懸浮液等。可列舉冷凍乾燥製劑。將冷凍乾燥製劑成型時，可使用蔗糖等之賦形劑。
本發明之醫藥組成物之投予路徑，可為經腸投予、局部投予及非經口投予中任一者，例如：靜脈內投予、動脈內投予、肌肉內投予、皮內投予、皮下投予、腹腔內投予、經皮投予、骨內投予、關節內投予等。
該醫藥組成物之組成，可因應投予方法、抗體之FGFR2蛋白質結合親和性等決定。本發明之抗FGFR2抗體或其功能性片段或其修飾體對FGFR2蛋白質之親和性愈高(KD值愈低)，能以愈少投予量發揮其藥效。
本發明之抗FGFR2抗體之投予量，只要是藥理學上有效之量即可，不限定，可因應個體之種、疾病之種類、症狀、性別、年齡、宿疾、該抗體對於FGFR2 蛋白質結合親和性或其生物活性、其他要素適當決定，通常可將0.01至1000mg/kg，較佳為0.1至100mg/kg於1至180日的期間內投予1次、或1日投予2次或3次以上。
醫藥組成物之形態，可列舉注射劑(包括冷凍乾燥製劑、點滴劑)、栓劑、經鼻型吸收製劑、經皮型吸收製劑、舌下劑、膠囊、錠劑、軟膏劑、顆粒劑、氣溶膠劑、丸劑、散劑、懸浮劑、乳劑、點眼劑、活體埋入型製劑等。
含有抗FGFR2抗體或其功能性片段或其修飾體作為有效成分之醫藥組成物，可以與其他醫藥同時或分別投予。例如：可於投予其他醫藥後投予含有抗FGFR2抗體或該抗體之功能性片段作為有效成分的醫藥組成物、或在投予該醫藥組成物後投予其他醫藥、或同時投予該醫藥組成物與其他醫藥。就其他醫藥而言，可列舉化學療法劑、放射線療法等各種抗癌劑等。
本發明也提供癌等FGFR相關疾病之治療方法或預防方法、用以製備該疾病之治療用或預防用醫藥組成物之本發明之抗體之用途、本發明抗體用於該疾病之治療或預防之用途。本發明也包括含本發明之抗體的治療用或預防用套組。
6.診斷用組成物
本發明提供包含本發明之抗FGFR2抗體或其功能性片段或其修飾體的檢查用或診斷用組成物(以下總稱「診斷用組成物」)。
本發明之診斷用組成物，對於檢查或診斷癌 等FGFR2相關疾病、FGFR2表現為有用。本發明中之檢查或診斷，包括例如：罹患風險之判定或測定、有無罹患之判定、進展或惡化程度之測定、利用抗FGFR2抗體等醫藥組成物所為之藥物治療效果之測定或判定、藥物治療以外之治療效果之測定或判定、復發風險之測定、復發有無之判定等，但只要是檢查或診斷即可，不限於此等。
本發明之診斷用組成物，對於鑑定投予本發明之抗體或其功能性片段或其修飾體、含此等之組成物、含此等之醫藥組成物的個體為有用。
該診斷用組成物，可含有pH緩衝劑、滲透壓調節劑、鹽類、安定化劑、防腐劑、顯色劑、增感劑、抗凝集劑等。
本發明，提供癌等FGFR2相關疾病之檢查方法或診斷方法、用以製備該疾病之診斷用組成物之本發明之抗體之用途、該疾病檢查或診斷用之本發明之抗體之用途。含本發明之抗體之檢查或診斷用套組，也包括在本發明。
作為含有本發明之抗體之檢查或診斷之方法，宜為三明治ELISA，但可利用通常之ELISA法或RIA法、ELISPOT(酶聯免疫斑點；Enzyme-Linked ImmunoSpot)法、點圖(dot plot)法、歐氏二重擴散(Ouchterlony)法、CIE(反向免疫電泳分析；Counter immunoelectrophoresis)法等利用抗體之偵測方法。抗體之標記法，除了生物素以外，也可利用HRP、鹼性磷解酶、FITC等可實施生化分析之標記法。於利用酵素標記之偵測，可使用TMB(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine)、BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)、ρ-NPP(ρ-nitrophenyl phosphate)、OPD(o-Phenylenediamine)、ABTS(3-Ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)、SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate(Thermo Fisher Scientific公司)等發色基質或QuantaBluTM Fluorogenic Peroxidase Substrate(Thermo Fisher Scientific公司)螢光基質，也可使用化學發光基質。本測定，可使用人類或非人類動物來源之試樣，也可使用重組蛋白質等已施有人工處理之試樣。生物個體來源之待測試樣，例如：血液、關節液、腹水、淋巴液、腦脊髓液、組織均質物上清、組織切片等，但不限於此等。
在包含本發明之抗體的檢查或診斷用之三明治ELISA套組中，也可含有FGFR2蛋白質標準液、發色試藥、稀釋用緩衝液、固相用抗體、偵測用抗體、及洗滌液等。作為測定與抗原結合之抗體量的方法，可理想地使用吸光法、螢光法、發光法、RI(Radioisotope)法等，測定可理想地使用吸光盤分析儀、螢光盤分析儀、發光盤分析儀、RI液體閃爍計數器等。
本發明提供對於免疫組織化學(immunohistochemistry：IHC)之分析為有用的抗體、其功能性片段及其修飾體、及含此等之組成物。該組成物也包括在本發明之「診斷用組成物」。
免疫組織化學，只要是使組織切片與抗原結 合之抗體(一次抗體)反應，並偵測與抗原結合之一次抗體的方法即可，不特別限定。
組織切片宜經石蠟處理。將經石蠟處理之組織切片進行脫石蠟處理後，進行抗原賦活處理及非專一的反應抑制處理。作為抗原賦活處理之方法，可列舉加熱處理、利用胰蛋白酶等之酵素處理，宜為加熱處理。加熱處理之條件，通常為溫度90至110℃、pH8至10、處理時間20至60分鐘之範圍較理想。pH之調整，可使用Tris-EDTA緩衝液(例如含有1mM之EDTA的10mM Tris緩衝液)等。作為非專一的反應抑制處理，通常使用將具有與發色使用之酵素為同樣或類似之觸媒活性的內因性酵素予以失活之方法。利用過氧化酶反應使發色的情形，宜預先將組織中存在之內因性過氧化酶以H2O2等抑制較佳。H2O2之溶劑可使用水、甲醇等，H2O2之濃度為0.1至3%，宜為0.3至3%。H2O2溶液中可添加疊氮化鈉。又，也可使用利用血清或酪蛋白進行阻斷之方法作為非專一的反應抑制處理。血清或酪蛋白，可在一次抗體反應之前進行組織的處理，但也可含有於將1次抗體進行稀釋之溶劑中。
一次抗體之反應條件不特別限定，溫度為20至50℃，宜為25至42℃，更宜為37℃。反應時間為5分鐘至一日夜，宜為10分鐘至6小時，更宜為30分鐘至2小時。
一次抗體之偵測，宜使用能可見化且能與一次抗體結合之抗體(二次抗體)。作為二次抗體之可見化 法，可理想地使用以下方法：使過氧化酶或鹼性磷解酶等之酵素與二次抗體結合、或對於二次抗體附加生物素等而使與已結合前述酵素之鏈黴親合素等結合，並且使與此等酵素對應之發色基質反應之方法。作為使酵素與二次抗體結合之方法而言，可列舉使用在糊精聚合物或胺基酸聚合物結合多數前述酵素與二次抗體之試藥的方法(聚合物法)。於使生物素化二次抗體與已標記過氧化酶之鏈黴親合素反應的方法(LSAB法)中，可使用DAB等作為發色基質。
免疫組織化學相關的操作，可以將反應液、反應條件、洗滌次數等程式化並納入免疫裝置，以自動化實施。
本發明之診斷用組成物所含之抗體、其功能性片段或其修飾體，宜為與FGFR2結合之抗體，亦即具有FGFR2選擇性之抗體、其功能性片段或其修飾體，更宜為具有人類FGFR2IIIb選擇性之抗體、其功能性片段或其修飾體。本發明之診斷用組成物之其他態樣中，更理想之抗體、其功能性片段或其修飾體，係對於人類FGFR2IIIb及人類FGFR2IIIc兩者具有選擇性。
作為具有人類FGFR2IIIb選擇性之抗體，可列舉包含含有大鼠FR2-10抗體之重鏈之CDRH1至CDRH3之重鏈與含有輕鏈之CDRL1至CDRL3之重鏈而成的抗體、含有大鼠FR2-10抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區而成之抗體、含有大鼠FR2-10抗體之重鏈及輕鏈而成的抗體等。該抗體可列舉大鼠FR2-10抗體、嵌合cFR2-10抗體、 人類化FR2-10抗體等，但不限於此等。
作為對於人類FGFR2IIIb及人類FGFR2IIIc兩者具有選擇性之抗體，可列舉包含含有大鼠FR2-13抗體之重鏈之CDRH1至CDRH3之重鏈與含有輕鏈之CDRL1至CDRL3之重鏈而成之抗體、包含含有大鼠FR2-14抗體之重鏈之CDRH1至CDRH3之重鏈與含有輕鏈之CDRL1至CDRL3之重鏈而成之抗體、含有大鼠FR2-13抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區而成之抗體、含有大鼠FR2-14抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區而成之抗體、含有大鼠FR2-13抗體之重鏈及輕鏈而成之抗體、含有大鼠FR2-14抗體之重鏈及輕鏈而成之抗體等。作為該抗體，可列舉大鼠FR2-13抗體、嵌合cFR2-13抗體、人類化FR2-13抗體、大鼠FR2-14抗體、嵌合cFR2-14抗體、人類化FR2-14抗體等，但不限定於此等。
本發明之一理想之態樣中，診斷用組成物係FGFR2偵測用或測定用，較理想為人類FGFR2IIIb及/或人類FGFR2IIIc之偵測用或測定用，更理想為人類FGFR2IIIb、或人類FGFR2IIIb及人類FGFR2IIIc之偵測用或測定用。
本發明提供偵測或測定待測樣本中之人類FGFR2IIIb之方法。
又，(i)偵測或測定待測樣本中之人類FGFR2IIIb與人類FGFR2IIIc，(ii)偵測或測定該樣本中之人類FGFR2IIIb，(iii)比較(i)之偵測或測定結果與(ii)之偵測或測定結果，或從(i)之偵測或測定結果減去(ii)之偵 測或測定結果，可藉此偵測或測定該樣本中之人類FGFR2IIIc。該人類FGFR2IIIIc之偵測或測定方法，也包括在本發明。
該等偵測或測定方法，可使用本發明之診斷用組成物。該測定方法及診斷用組成物，作為人類FGFR2陽性癌，較理想為人類FGFR2IIIb及/或人類FGFR2IIIc陽性癌之診斷用或檢查用，也包括於本發明。
鑑定投予本發明醫藥組成物之個體之方法也包括在本發明。該鑑定方法中，偵測或測定來自該個體之樣本中之人類FGFR2，且於該樣本中偵測或測到人類FGFR2時，可判定該個體為陽性。該鑑定方法中，理想的人類FGFR2為人類FGFR2IIIb及/或人類FGFR2IIIc，更理想為人類FGFR2IIIb、或人類FGFR2IIIb及人類FGFR2IIIc。
該方法中，可使用本發明之診斷用組成物。
又，該鑑定方法之一理想態樣中，該個體有時罹癌或有罹癌風險。
再者，本發明之醫藥組成物於其一態樣中，可對於在該鑑定方法判定為陽性之個體投予。
7.試藥
本發明之抗體或其功能性片段或其修飾體，作為試藥也有用。該試藥在上述檢查或診斷用、研究用及其他用途使用。
8.篩選方法
本發明提供具有FGFR2中和活性之物質之鑑 定方法。該方法中，鑑定與本發明之抗體所結合之抗原上之部位結合的物質。例如：使待測物質與人類FGFR2IIIb蛋白質或其片段接觸，其次測定構成大鼠FR2-14抗體、嵌合cFR2-14抗體及人類化hFR2-14_H1/L1至hFR2-14_L19/L1中任一抗體所結合之人類FGFRIIIb上之抗原決定位的胺基酸殘基與該物質間的距離，當各殘基與該物質有交互作用之距離時，可判定該物質為陽性。
該鑑定方法作為具有抗腫瘤活性之物質之鑑定方法也有用。該方法中，也可進一步測定判定為陽性之物質之抗腫瘤活性。
待測物質宜為胜肽或抗體、其功能性片段或其修飾體。
該方法中，判定為陽性之胜肽或抗體、其功能性片段或其修飾體，也可利用基因重組、胜肽合成或體外轉譯進行製備，製造如此之胜肽或抗體等之方法，也包括在本發明。
[實施例]
以下於實施例對於本發明更詳細說明，但本發明不限於此等。
又，下列實施例中，關於基因操作之各操作若未特別明示，係由「分子選殖(Molecular Cloning)」(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.及Maniatis,T.著，Cold Spring Harbor Laboratory Press於1989年發刊)記載之方法及其他的該技術領域中具有通常知識者使用之實驗書記載之 方法實施，或使用市售試藥或套組的情形，係由市售品之指示書實施。
實施例1.大鼠抗人類FGFR2抗體之製作
1)-1 免疫
使用8週大之WKY/Izm雌大鼠(日本SLC公司)及7週大之Crlj：WI雌大鼠(日本Charles River公司)。針對WKY/Izm大鼠，於第0天將混合50μg重組人類FGFR2β(IIIb)/Fc嵌合體(R&D SYSTEM公司製)與Freund‘s完全佐劑(和光純藥公司製)(混合體積比1：2)者，對於大鼠之尾根部投予。於第21天將50μg之重組人類FGFR2β(IIIb)/Fc嵌合體對於大鼠之尾根部投予。於第35天採取大鼠之淋巴結或脾臟，用於融合瘤製作。針對Crlj：WI大鼠，於第0天，將已混合50μg FGFR2β(IIIb)/Fc嵌合體與Freund‘s完全佐劑(混合體積比1：1)者，對於大鼠之皮下或皮內投予。於第7天、第14天及第21天將已混合50μg FGFR2β(IIIb)/Fc嵌合體與Freund‘s不完全佐劑(混合體積比1：1)者對於大鼠之皮下或皮內投予。於第38天，將50μg FGFR2β(IIIb)/Fc嵌合體對於大鼠之尾靜脈內投予，於第42天採取小鼠之淋巴結或脾臟，用於融合瘤製作。
1)-2 融合瘤製作
將淋巴結細胞或脾臟細胞與小鼠骨髓瘤SP2/0-ag14細胞，使用Hybrimune Hybridoma Production System(Cyto Pulse Sciences公司製)進行電細胞融合，以ClonaCell-HY Selection Medium D(StemCell Technologies公司製)稀釋並培養。回收出現之融合瘤群落，以製作單株融合瘤。培養回收的各融合瘤群落，使用獲得之融合瘤培養上清，篩選抗FGFR2抗體產生融合瘤。
1)-3 抗原結合性抗體篩選用表現載體之建構
1)-3-1 人類FGFR2IIIb及FGFR2IIIc表現載體(pcDNA-DEST40-FGFR2IIIb及pcDNA-DEST40-FGFR2IIIc)之建構
將編碼為人類FGFR2IIIb變異蛋白質(異構體2：NP_075259)及人類FGFR2IIIc變異蛋白質(異構體1：NP_000132)之cDNA選殖到pcDNA-DEST40載體，建構表現各變異蛋白質之載體pcDNA-DEST40-FGFR2IIIb及pcDNA-DEST40-FGFR2IIIc。
1)-3-2 類Ig區域缺損FGFR2IIIb表現載體之建構
將表現FGFR2IIIb之全長胺基酸(1-822)中之54-110號區域之缺損體(以下記載為「IgD1缺損體」)、154-246號區域之缺損體(以下記載為「IgD2缺損體」)、263-358號區域之缺損體(以下記載為「IgD3缺損體」)的載體，利用pcDNA-DEST40-FGFR2IIIb為模盤以PCR法構建。
1)-4 利用Cell-ELISA法進行抗體篩選
1)-4-1 Cell-ELISA用抗原基因表現細胞之製備
調整HEK293細胞，使於含10% FBS之DMEM培養基中成為7.5x105細胞/ml。對此使用Lipofectamine 2000 (Life Technologies公司製)，導入pcDNA-DEST40-FGFR2IIIb或作為對照之pcDNA-DEST40，在96-well半區域plate(Corning公司製)各分注50μl，於含10%FBS之DMEM培養基中，於37℃、5%CO2之條件下培養一晚。將獲得之導入細胞保持黏附狀態使用於Cell-ELISA。
1)-4-2 Cell-ELISA
去除實施例1)-4-1製備之表現載體導入HEK293細胞之培養上清後，對於pcDNA-DEST40-FGFR2IIIb或pcDNA-DEST40導入HEK293細胞分別添加融合瘤培養上清，於4℃靜置1小時。將孔中之細胞以含5% FBS之PBS洗滌1次後，添加以含5% FBS之PBS稀釋為500倍之Anti-Rat IgG-Peroxidase antibody produced in rabbit(SIGMA公司製)，於4℃靜置1小時。將孔中細胞以含5% FBS之PBS洗滌5次後，以25μl/孔添加OPD發色液(於OPD溶解液(0.05M檸檬酸3鈉、0.1M磷酸氫2鈉‧12水pH4.5)中分別溶解鄰苯二胺二鹽酸鹽(和光純藥公司製)、H2O2使成為0.4mg/ml、0.6%(v/v))。邊隨時攪拌邊進行發色反應，將1M HCl添加25μl/孔，使發色反應停止後，以盤分析儀(ENVISION：PerkinElmer公司)測定490nm之吸光值。為了選擇產生對於細胞膜表面上表現之FGFR2專一的結合之抗體的融合瘤，與對照之pcDNA-DEST40導入HEK293細胞進行比較，選擇產生比起pcDNA-DEST40-FGFR2IIIb表現載體導入HEK293細胞顯示較高吸光值之培養上清的融合瘤，作為抗FGFR2抗體產生陽性。
1)-5 利用流式細胞計數進行抗體篩選
1)-5-1 流式細胞計數分析用抗原基因表現細胞之製備
將HEK293T細胞接種於225平方cm燒瓶(住友電木公司製)，使成為5×104細胞/cm2，於含10% FBS之DMEM培養基中，於37℃、5% CO2之條件下培養一晚。隔日，將N端IgD1區域已缺損之pcDNA-DEST40-FGFR2IIIb IgD1缺損體與作為對照之pcDNA-DEST40，分別使用Lipofectamine 2000導入HEK293T細胞，於37℃、5% CO2之條件下再培養一晚。次日，將表現載體導入HEK293T細胞以TrypLE Express(Life Technologies公司製)處理，以含10% FBS之DMEM洗滌細胞後，懸浮於含5% FBS之PBS。獲得之細胞懸浮液使用於流式細胞計數分析。
1)-5-2 流式細胞計數分析
利用流式細胞計數法進一步確認於實施例1)-4之Cell-ELISA判定為陽性之融合瘤所產生之抗體對於FGFR2IIIb的結合專一性。將實施例1)-5-1製備之HEK293T細胞懸浮液離心，去除上清後，分別對於pcDNA-DEST40-FGFR2IIIb IgD1缺損體導入HEK293T細胞及pcDNA-DEST40導入HEK293T細胞加入融合瘤培養上清而懸浮，於4℃靜置1小時。以含5% FBS之PBS洗滌2次之後，加入以含5% FBS之PBS稀釋為320倍之Anti-Rat IgG FITC conjugate(SIGMA公司製)並懸浮，於4℃靜置1小時。以含5% FBS之PBS洗滌3次後，再懸浮於含2μg/ml 7-aminoactinomycin D(Molecular Probes公司製)之含5% FBS之PBS，以流式細胞計數器(FC500：BeckmanCoulter公司製)偵測。數據分析係以Flowjo(TreeStar公司製)實施。以閘排除7-aminoactinomycin D陽性之死細胞後，製作活細胞之FITC螢光強度之直方圖。取得產生相對於對照pcDNA-DEST40導入HEK293T細胞之螢光強度直方圖，pcDNA-DEST40-FGFR2IIIb IgD1缺損體導入HEK293T細胞之直方圖往強螢光強度側偏移的樣本的融合瘤，作為抗FGFR2IIIb抗體產生融合瘤。
1)-6 訊息中和作用篩選
為了評價獲得之融合瘤所產生之抗FGFR2抗體之訊息中和作用，以下列方式建構偵測由於配體FGF7刺激所致FGFR2活化而誘導之ERK(細胞外訊息調節激酶)活化的Elk1螢光素酶報告基因分析系，評價取得抗體之作用。
1)-6-1 報告基因分析用載體之建構
首先，建構pFR-LucCP載體。將pFR-Luc(Stratagene #219005)以HindIII切斷後，將末端以T4 DNA聚合酶平滑化後，以BamHI切斷，取出包含5個GAL4結合要素與TATA box之140bp之片段。然後，將pGL4.12[luc2CP](Promega #E6661)以EcoICRI與BglII切斷，進行脫磷酸化後，與前述140bp之片段接合，製作pFR-Luc2CP載體。
1)-6-2 Elk1螢光素酶報告基因分析
使用實施例1)-5選擇之融合瘤培養上清，實施Elk1螢光素酶報告基因分析。對於已將黏合素(integrin)β3表現載體安定轉形到HEK293細胞內而得之細胞株293α，由 使用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司製)之轉形移入程序，於pcDNA-DEST40-FGFR2IIIb、pcDNA-DEST40、pFA2-Elk1(Stratagene公司製)、pFR-Luc2CP、及pGL4.74[hRluc/TK](Promega公司製)進行暫時性同時轉染，接種於白色96孔細胞培養盤(Corning公司製)，於37℃、5% CO2培養一晚。次日去除培養上清，添加以5% FBS-DMEM稀釋為5倍的融合瘤培養上清50μl/well，於37℃、5% CO2培養1小時之後，將係配體之人類FGF7(R&D systems公司製)以終濃度10ng/ml添加到孔中。經過6小時溫育之後，製備細胞溶解物，使用Dual-luciferase報告基因分析系(Promega公司製)，測定螢火蟲螢光素酶活性(專一的訊息)及水母(Renilla)螢光素酶活性(為了標準化之訊息)。為了將各孔之數據標準化，計算螢火蟲/水母比。於FGFR2表現HEK293報告基因細胞中，選擇抑制FGF7所致之配體依賴的報告基因活化直到無配體之值的抗FGFR2抗體產生融合瘤FR2-10、FR2-13、FR2-14。
1)-7 抗體之同型異構物決定
抗FGFR2抗體產生融合瘤FR2-10、FR2-13、FR2-14之同型異構物，由Rat monoclonal isotyping test kit(serotec公司製)決定。其結果，確認FR2-10之同型異構物為IgG2a、κ鏈，FR2-13及FR2-14之同型異構物為IgG1、κ鏈。
1)-8 單株抗體之製備
單株抗體係從融合瘤移植小鼠之腹水(以下稱為「抗體精製原料」)精製。
小鼠腹水係以下列方式製備。首先將7-8週大之BALB/cAJcl-nu/nu(日本SLC公司)以pristane(Sigma公司製)處理，約1-4週後將以PBS洗滌之融合瘤對每隻小鼠以1-2×107細胞的量移植到腹腔內。1-2週後採取腹腔內貯留的腹水，通過0.22μm的濾器進行滅菌，作為抗體精製原料。
抗體以Hitrap MabSelect SuRe(GE Healthcare Bio-Sciences公司製)精製。將抗體精製原料添加到管柱，以PBS洗滌後，以2M Arginine-HCl pH4.0提取。經提取之抗體溶液中和後，緩衝液替換為PBS。經精製之抗體之濃度，係利用提取與POROS G 20μm Column PEEK，4.6mm×50mm，0.83ml(Applied Biosystems公司製)結合之抗體，並測定提取液之吸光值(O.D.280nm)以求出。具體而言，在經以平衡化緩衝液(30.6mM磷酸2氫鈉‧12水、19.5mM磷酸1鉀、0.15M NaCl、pH7.0)平衡化之POROS G 20μm中添加經PBS稀釋之抗體樣本，以平衡化緩衝液洗滌管柱後，將與管柱結合之抗體以溶離液(0.1%(v/v)HCl、0.15M NaCl)提取。測定提取液之吸光值(O.D.280nm)之峰部面積，以次式計算濃度。抗體樣本濃度(mg/ml)=(抗體樣本之峰部面積)/(標準品(人類IgG1)之峰部面積)×標準品之濃度(mg/ml)×樣本之稀釋倍率。又，獲得之抗體所含之內毒素濃度，使用Limulus ES-II Single test WAKO(和光純藥工業295-51030，含對照標準內毒素)與TOXINOMETER(和光純藥工業ET-301、或ET-5000)測定，確認為1EU/mg以下，供以下實驗用。
實施例2.大鼠抗人類FGFR2抗體(FR2-10、FR2-13、FR2-14)之體外評價
2)-1 取得大鼠抗FGFR2抗體(FR2-10、FR2-13、FR2-14)之人類FGFR2選擇性結合性之探討
2)-1-1 人類FGFR1IIIc、人類FGFR3IIIb、人類FGFR3IIIc、及人類FGFR4表現載體之建構
將編碼為人類FGFR1IIIc變異蛋白質(異構體1：NP_075598)、人類FGFR3IIIb變異蛋白質(異構體3：NP_001156685)、人類FGFR3IIIc變異蛋白質(異構體1：NP_000133)、及人類FGFR4蛋白質(異構體1：NP_002002)之cDNA選殖到pcDNA-DEST40載體，建構表現各變異蛋白質之載體pcDNA-DEST40-FGFR1IIIc、pcDNA-DEST40-FGFR3IIIb、pcDNA-DEST40-FGFR3IIIc、及pcDNA-DEST40-FGFR4。
2)-1-2 流式細胞計數分析
將於實施例1)-3-1及2)-1-1建構之各種人類FGFR表現載體由1)-5-1所示之方法導入到HEK293T細胞而得之細胞懸浮液離心，去除上清後，對於各種人類FGFR表現載體導入HEK293T細胞及pcDNA-DEST40導入HEK293T細胞，分別添加含FR2-10、FR2-13、或FR2-14抗體之融合瘤培養上清並懸浮，於4℃靜置1小時。以含5% FBS之PBS洗滌2次後，加入以含5% FBS之PBS稀釋為320倍的Anti-Rat IgG FITC conjugate(SIGMA公司製)並懸浮，於4℃靜置1小時。以含5% FBS之PBS洗滌3次後，再懸浮於含有2μg/ml 7-aminoactinomycin D(Molecular Probes公司 製)之含5% FBS之PBS，以流式細胞計數器(FC500：BeckmanCoulter公司製)偵測。數據分析係以Flowjo(TreeStar公司製)進行。以閘排除7-aminoactinomycin D陽性之死細胞後，製作活細胞之FITC螢光強度之直方圖，並計算平均螢光強度(MFI)。如第1圖所示，顯示：大鼠FR2-10抗體對於人類FGFR2IIIb選擇性結合，大鼠FR2-13及FR2-14抗體對於人類FGFR2IIIb及FGFR2IIIc兩者選擇性結合。
2)-2 取得大鼠抗FGFR2抗體(FR2-10、FR2-13、FR2-14)之抗原決定位之鑑定
使用於FGFR2細胞外區存在之3個類Ig區域各有一處缺失之表現載體，鑑定取得大鼠抗FGFR2抗體所結合之抗原決定位。將於1)-3-2建構之FGFR2IIIb之IgD1、IgD2、IgD3缺損體表現載體由實施例1)-5-1所示方法導入到HEK293T細胞而得之細胞懸浮液離心，去除上清後，分別對於各類Ig區域缺損FGFR2IIIb表現載體導入HEK293T細胞及pcDNA-DEST40導入HEK293T細胞，加入含FR2-10、FR2-13、或FR2-14抗體之融合瘤培養上清，於4℃靜置1小時。以含5% FBS之PBS洗滌2次後，加入經含5% FBS之PBS稀釋為320倍之Anti-Rat IgG FITC conjugate(SIGMA公司製)並懸浮，於4℃靜置1小時。以含5% FBS之PBS洗滌3次後，再懸浮於含2μg/ml 7-aminoactinomycin D(Molecular Probes公司製)之含5% FBS之PBS，以流式細胞計數器(FC500：BeckmanCoulter公司製)偵測。數據分析以Flowjo(TreeStar公司製)進行。 以閘排除7-aminoactinomycin D陽性之死細胞後，製作活細胞之FITC螢光強度之直方圖，計算平均螢光強度(MFI)。如第2圖所示，顯示大鼠FR2-10抗體係與人類FGFR2IIIb之類Ig區域3結合。另一方面，對於人類FGFR2IIIc也顯示結合性之大鼠FR2-13及FR2-14抗體，與人類FGFR2IIIb及FGFR2IIIc，結合於共通之類Ig區域2。
2)-3 取得大鼠抗FGFR2抗體(FR2-10、FR2-13、FR2-14)之訊息中和作用
為了利用Elk1螢光素酶報告基因分析評價取得抗體之訊息中和作用，將實施例1)-3-1建構之pcDNA-DEST40-FGFR2IIIb或pcDNA-DEST40-FGFR2IIIc、及pFA2-Elk1(Stratagene公司製)、pFR-Luc2CP、及pGL4.74[hRluc/TK](Promega公司製)，利用實施例1)-6-2所示方法導入到293α細胞，於37℃、5% CO2培養一晚。次日，去除培養上清後，將經含2% FBS之DMEM稀釋之大鼠FR2-10、FR2-13、或FR2-14抗體一起預溫育1小時，其次，將係配體之人類FGF7(R&D systems公司製)或人類FGF9、peprotech公司製)以終濃度10ng/ml添加到孔。6小時之溫育後，使用Dual-Glo Luciferase Assay System(Promega公司製)測定螢火蟲螢光素酶活性(專一的訊息)及水母螢光素酶活性(用於標準化之訊息)。為了將各孔之數據標準化，計算螢火蟲/水母比。如第3A圖所示，大鼠FR2-10、FR2-13、FR2-14，在FGFR2IIIb表現細胞中，抑制了FGF7所致之配體由賴的報告基因活化。又，如第3B圖所示，在大鼠FR2-13、FR2-14，在FGFR2IIIc表現細胞中，抑制了FGF9所致之配體依賴的報告基因活性。由以上結果可知：該等抗體具有抑制FGFR2之配體所致之活化的作用。
2)-4 取得大鼠抗FGFR2抗體(FR2-10)於人類癌細胞株之FGFR2訊息抑制作用
使用內在的表現FGFR2的胃癌細胞株SNU-16，驗證取得抗體之FGFR2訊息抑制作用。在12孔盤上接種懸浮於0.1%之牛血清白蛋白-RPMI培養基的SNU-16細胞(3×106)，培養隔夜。添加大鼠FR2-10抗體，於37℃溫育1小時後，添加10ng/ml之FGF7(R&D systems公司製)，再溫育10分鐘。其次，使細胞溶於含有complete mini(Roche公司製)及磷解酶抑制劑(Nakarai tesque公司製)之RIPA緩衝液(1% NP-40，0.5% Sodium deoxycholate，0.1% SDS in PBS)。從此細胞溶解液將溶解物離心分離，並使用BCA蛋白質分析(PIERCE公司製)決定蛋白質濃度。將溶解物再懸浮於含DTT之緩衝液中，於99℃改質5分鐘。利用5~20%之凝膠中的SDS-PAGE，分離蛋白質(20μg/道)。在PVDF膜(BioRad公司製)上印漬蛋白質。將此膜於室溫以5%脫脂奶(雪印)-TBS-T(2mM Tris，50mM NaCl，0.1% Tween-20(pH7.4))阻斷1小時後，添加FGFR2、磷酸化FGFR2(p-FGFR2)、FRS2、磷酸化FRS2(p-FRS2)、ERK、磷酸化ERK(p-ERK)抗體，於4℃溫育隔夜。洗滌後，將膜與山葵過氧化酶結合抗兔二次抗體(Amersham)一起溫育。使用ECL plus基質(GE Healthcare)，以X光薄膜將免疫反應性譜帶予以可見化。如第4圖所 示，由於配體FGF7刺激造成FGFR2、FRS2，ERK之磷酸化亢進，該等分子之磷酸化之亢進由大鼠FR2-10抗體之添加濃度依賴性地受抑制。
實施例3.編碼為大鼠抗人類FGFR2抗體(FR2-10、FR2-13、FR2-14)之可變區之cDNA之鹼基序列之決定
3)-1 大鼠FR2-10、FR2-13、及FR2-14之重鏈與輕鏈之N端胺基酸序列之鑑定
為了鑑定大鼠FR2-10、FR2-13、及FR2-14抗體之重鏈與輕鏈之N端胺基酸序列，將實施例1)-8精製而得之大鼠FR2-10、FR2-13、及FR2-14抗體分別以SDS-PAGE分離。從分離後之凝膠，將凝膠中之蛋白質轉印到Sequi-Blot PVDF膜(BIO-RAD公司)，以洗滌緩衝液(25mM NaCl、10mM硼酸鈉緩衝液pH8.0)洗滌後，於染色液(50%甲醇、20%乙酸、0.05%考馬斯亮藍浸泡5分鐘染色後，以90%甲醇脫色。切取在PVDF膜上可見化之相當於各重鏈(移動度較小之譜帶)及輕鏈(移動度較大之譜帶)的譜帶部分，使用Procise cLC蛋白質定序儀Model 492cLC(Applied Biosystems)，利用自動Edman法(參照Edman et al.(1967)Eur.J.Biochem.1，80)，嘗試鑑定各N端胺基酸序列。其結果，相當於FR2-10之重鏈之譜帶之N端之胺基酸序列為EVQLVESGGGLV(序列表之序列編號1：第9圖)，相當於輕鏈之譜帶之N端胺基酸序列，為DIQMTQSPSSLSA(序列表之序列編號2：第10圖)。
相當於FR2-13之重鏈之譜帶之N端之胺基酸 序列，為QVKLL(序列表之序列編號3：第11圖)，相當於輕鏈之譜帶之N端胺基酸序列，為DIQMTQSPASLSASLGE(序列表之序列編號4：第12圖)。
相當於FR2-14之重鏈之譜帶之N端之胺基酸序列，為QVKLL(序列表之序列編號5：第13圖)，相當於輕鏈之譜帶之N端胺基酸序列，為DIQMTQSPASLSASLGE(序列表之序列編號6：第14圖)。
3)-2 從FR2-10、FR2-13、及FR2-14產生融合瘤製備mRNA
為了放大含有FR2-10、FR2-13、及FR2-14之可變區之cDNA，從FR2-10、FR2-13、及FR2-14產生融合瘤，使用mRNA Isolation kit(Roche applied science公司)，分別從各細胞製備mRNA。
3)-3 cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)之合成
cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)之合成，係使用實施例3)-2製備之mRNA之70ng，使用PrimeScript Reverse Transcriptase(TAKARA公司)與SMART RACE cDNA Amplification Kit(CLONTECH公司)實施。
3)-4 利用5’-RACE PCR放大含FR2-10、FR2-13、及FR2-14之重鏈可變區之cDNA及序列決定
FR2-10之重鏈之同型異構物為IgG2a，FR2-13、及FR2-14之同型異構物為IgG1(實施例1)-7)，所以為了將重鏈基因之可變區之cDNA以PCR放大而用的引子，使用UPM(Universal Primer A Mix：附屬於SMART RACE cDNA Amplification Kit)、及具有5’-GAGTTACTTTTGAG AGCAGTTCCAGGAG-3’(RG1R1：序列表之序列編號7：第15圖)之鹼基序列之寡核苷酸。UPM，係使用SMART RACE cDNA Amplification Kit(CLONTECH公司)附屬者，RG1R1係從資料庫之大鼠重鏈(IgG2a及IgG1)之不變區之序列設計。
將該引子之組合、及將實施例3)-3合成之cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)作為模盤，利用5’-RACE PCR將含FR2-10、FR2-13、及FR2-14之重鏈可變區之cDNA分別放大。PCR，使用KOD-Plus-(TOYOBO公司)作為聚合酶，由SMART RACE cDNA Amplification Kit(CLONTECH公司)之手冊，以touchdown PCR程式實施。
將以5’-RACE PCR放大之各含重鏈可變區之cDNA，使用MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN公司)精製後，實施鹼基序列之序列分析。
定序引子，係使用具有5’-GAGTTACTTTTGAGAGCAGTTCCAGGAG-3’(RG1R1：序列表之序列編號7：第15圖)之鹼基序列之寡核苷酸。
再者，由據此序列分析結果，設計針對下列所示各cDNA之互補鏈的定序引子，實施鹼基序列之序列分析。
FR2-10用之定序引子
5’-GGTTCTCCCACTCAGTAATC-3’(10HF：序列表之序列編號8：第16圖)
FR2-13用之定序引子
5’-CATATGATCAGTGTCCTCTC-3’(13HF：序列表 之序列編號9：第17圖)
FR2-14用之定序引子
5’-ATATGATCAGTGTCCTCTCC-3’(14HF：序列表之序列編號10：第18圖)
序列分析，使用基因序列分析裝置(「ABI PRISM 3700 DNA Analyzer；Applied Biosystems」或「Applied Biosystems 3730x1 Analyzer；Applied Biosystems」)實施，定序反應使用GeneAmp 9700(Applied Biosystems公司)。
編碼為已決定之FR2-10、FR2-13、及FR2-14之重鏈可變區的cDNA之鹼基序列、及該可變區之胺基酸序列，各顯示於序列表之序列編號11、13、及15、及序列編號12、14、及16(第19圖、21及23、及第20圖、22及24)。
由鹼基序列決定之FR2-10、FR2-13、及FR2-14之重鏈可變區之胺基酸序列，與實施例3)-1決定之N端胺基酸序列一致。
3)-5 利用5’-RACE PCR放大含FR2-10之輕鏈可變區之cDNA及序列之決定
FR2-10之輕鏈之同型異構物為κ(實施例1)-7)，故作為將輕鏈基因之可變區之cDNA以PCR放大用之引子，使用UPM(Universal Primer A Mix：附屬於SMART RACE cDNA Amplification Kit)及具有5’-TTCATGAGGCACACGACTGAGGCACCTCC-3’(RKR3：序列表之序列編號17：第25圖)之鹼基序列之寡核苷酸。UPM，使用附屬 於SMART RACE cDNA Amplification Kit(CLONTECH公司)者，RKR3係從資料庫之大鼠輕鏈之不變區之序列設計。
利用組合此引子及以實施例3)-3合成之cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)為模盤之5’-RACE PCR，將含FR2-10之輕鏈之可變區之cDNA放大。PCR，係使用KOD-Plus-(TOYOBO公司)作為聚合酶，由SMART RACE cDNA Amplification Kit(CLONTECH公司)之手冊，以TOUCH DOWN PCR程式實施。
使用以5’-RACE PCR放大之各含輕鏈之可變區之cDNA，使用MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN公司)精製後，實施鹼基序列之序列分析。
作為定序引子，使用從資料庫之大鼠輕鏈之不變區之序列設計的具有5’-TCCAGTTGCTAACTGTTCCG-3’(sqRK：序列表之序列編號18：第26圖)之鹼基序列的寡核苷酸。
再者，由據此序列分析結果，設計下列所示針對各cDNA之互補鏈的定序引子，實施鹼基序列之序列分析。
FR2-10用之定序引子
5’-CAGTGGTATCAACGCAGAG-3’(10LF：序列表之序列編號19：第27圖)
序列分析及定序反應由前述方式實施。
編碼為決定之FR2-10之輕鏈之可變區的cDNA之鹼基序列、及該可變區之胺基酸序列，各表示於序列表之 序列編號20、及序列編號21(第28及29圖)。
由鹼基序列決定之FR2-10之輕鏈之可變區之胺基酸序列，與實施例3)-1決定之N端胺基酸序列一致。
3)-6 利用5’-RACE PCR放大含FR2-13、及FR2-14之輕鏈可變區之cDNA及序列之決定
FR2-13、及FR2-14之輕鏈之同型異構物為κ(實施例1)-7)，所以用以將輕鏈基因之可變區之cDNA以PCR放大用的引子，使用UPM(Universal Primer A Mix：附屬於SMART RACE cDNA Amplification Kit)、及具有5’-TACGTGCTGTCTTTGCTGTCCTGATCAG-3’(RKR6：序列表之序列編號22：第30圖)之鹼基序列之寡核苷酸。UPM，使用附屬於SMART RACE cDNA Amplification Kit(CLONTECH公司)者，RKR6係從資料庫之大鼠輕鏈之不變區之序列設計。
利用組合此引子、與將實施例3)-3合成之cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)作為模盤之5’-RACE PCR，將含FR2-13、及FR2-14之輕鏈基因之可變區之cDNA放大。PCR，使用KOD-Plus-(TOYOBO公司)作為聚合酶，由SMART RACE cDNA Amplification Kit(CLONTECH公司)之手冊，以TOUCH DOWN PCR程式實施。
將5’-RACE PCR放大之各含輕鏈之可變區之cDNA使用MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN公司)精製後，使用Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit(INVITROGEN公司)選殖，並實施選殖之含輕鏈之可變區之cDNA之鹼基序列之序列分析。
作為定序引子，使用從資料庫之大鼠輕鏈之不變區之序列設計的具有5’-TTCATGAGGCACACGACTGAGGCACCTCC-3’(RKR3：序列表之序列編號17：第25圖)之鹼基序列之寡核苷酸、及NUP(Nested Universal Primer A：附屬於SMART RACE cDNA Amplification Kit)。
序列分析及定序反應，如前述實施。
編碼為決定之FR2-13、及FR2-14之輕鏈之可變區的cDNA之鹼基序列、及該可變區之胺基酸序列，各顯示於序列表之序列編號23及25(第31及33圖)、及序列編號24及26(第32及34圖)。
由鹼基序列決定之FR2-13及FR2-14之輕鏈之可變區之胺基酸序列，與實施例3)-1決定之N端胺基酸序列一致。
實施例4.人類嵌合化抗FGFR2抗體(cFR2-10、cFR2-13、cFR2-14)之製作
4)-1 嵌合化及人類化輕鏈表現載體pCMA-LK之建構
將質體pcDNA3.3-TOPO/LacZ(INVITROGEN公司)以限制酶XbaI及PmeI消化而得之約5.4kb之片段、與含編碼為序列表之序列編號27(第35圖)所示之人類κ鏈分泌訊息及人類κ鏈不變區的DNA序列之DNA片段，使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(CLONTECH公司)結合，製作成pcDNA3.3/LK。
將pcDNA3.3/LK作為模盤，以下列引子組實 施PCR，將獲得之約3.8kb之片段於磷酸化後進行自接合(self ligation)，以建構於CMV啟動子之下游具有訊息序列、選殖位、及人類κ鏈不變區的嵌合化及人類化輕鏈表現載體pCMA-LK。
引子組
5’-tataccgtcgacctctagctagagcttggc-3’(3.3-F1：序列表之序列編號28：第36圖)
5’-gctatggcagggcctgccgccccgacgttg-3’(3.3-R1：序列表之序列編號29：第37圖)
4)-2 嵌合化及人類化IgG1型重鏈表現載體pCMA-G1之建構
將pCMA-LK以XbaI及PmeI消化而去除κ鏈分泌訊息及人類κ鏈不變區的DNA片段、與含編碼為序列表之序列編號30(第38圖)表示之人類重鏈訊息序列及人類IgG1不變區之胺基酸的DNA序列的DNA片段，使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(CLONTECH公司)結合，建構於CMV啟動子之下游具有訊息序列、選殖位、人類IgG1重鏈不變區之嵌合化及人類化IgG1型重鏈表現載體pCMA-G1。
4)-3 人類嵌合化FR2-10輕鏈表現載體之建構
將實施例3)獲得之含FR2-10輕鏈之可變區的cDNA當作模盤，以KOD-Plus-(TOYOBO公司)及下列引子組將含有編碼為輕鏈之可變區之cDNA的DAN片段放大，使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(CLONTECH公司)插 入將嵌合化及人類化抗體輕鏈表現泛用載體pCMA-LK以限制酶BsiWI切斷之處，以建構人類嵌合化FR2-10輕鏈表現載體。獲得之表現載體命名為「pCMA-LK/cFR2-10」。人類嵌合化FR2-10輕鏈之鹼基序列及該輕鏈之胺基酸序列，各顯示於序列表之序列編號31及32(第39及40圖)。
人類嵌合化FR2-10輕鏈用引子組
5’-atctccggcgcgtacggcgacatccagatgacccagtctccatcttcc-3’(c10-LF：序列表之序列編號33：第41圖)
5’-ggagggggcggccacagcccgttttatttccaacttcgtccctg-3’(c10-LR：序列表之序列編號34：第42圖)
4)-4 人類嵌合化FR2-10重鏈表現載體之建構
將實施例3)獲得之編碼為FR2-10重鏈可變區的cDNA當作模盤，以KOD-Plus-(TOYOBO公司)與下列引子組放大含有編碼為重鏈可變區之cDNA的DNA片段，使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(CLONTECH公司)插入嵌合化及人類化IgG1型重鏈表現載體pCMA-G1以限制酶BlpI切斷之處，以建構人類嵌合化FR2-10重鏈表現載體。獲得之表現載體命名為「pCMA-G1/cFR2-10」。編碼為人類嵌合化FR2-10重鏈之鹼基序列及該重鏈之胺基酸序列，各顯示於序列表之序列編號35及36(第43及44圖)。
人類嵌合化FR2-10重鏈用引子組
5’-ccagatgggtgctgagcgaggtgcagctggtggagtctgggggag gc-3’(c10-HF：序列表之序列編號37：第45圖)
5’-cttggtggaggctgagctgacagtgactgaagttccttgaccccaggc-3’(c10-HR：序列表之序列編號38：第46圖)
4)-5 人類嵌合化FR2-13輕鏈表現載體之建構
將實施例3)獲得之編碼為FR2-13輕鏈之可變區之cDNA當作模盤，以KOD-Plus-(TOYOBO公司)與下列引子組放大含有編碼為輕鏈之可變區之cDNA的DNA片段，使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(CLONTECH公司)插入嵌合化及人類化抗體輕鏈表現泛用載體pCMA-LK以限制酶BsiWI切斷之處，以建構人類嵌合化FR2-13輕鏈表現載體。獲得之表現載體命名為「pCMA-LK/cFR2-13」。編碼為人類嵌合化FR2-13輕鏈之鹼基序列及該輕鏈之胺基酸，各顯示於序列表之序列編號39及40(第47及48圖)。
人類嵌合化FR2-13輕鏈用引子組
5’-atctccggcgcgtacggcgacatccagatgacacagtctccagcttcc-3’(c13-LF：序列表之序列編號41：第49圖)
5’-ggagggggcggccacagcccgtttcagttccagcttggtcccaac-3’(c13-LR：序列表之序列編號42：第50圖)
4)-6 人類嵌合化FR2-13重鏈表現載體之建構
將實施例3)獲得之編碼為FR2-13重鏈可變區之cDNA當作模盤，以KOD-Plus-(TOYOBO公司)與下列引子組放大含有編碼為重鏈可變區之cDNA的DNA片段，使用 In-Fusion Advantage PCR選殖套組(CLONTECH公司)插入嵌合化及人類化IgG1型重鏈表現載體pCMA-G1以限制酶BlpI切斷之處，以建構人類嵌合化FR2-13重鏈表現載體。獲得之表現載體命名為「pCMA-G1/cFR2-13」。編碼為人類嵌合化FR2-13重鏈之鹼基序列及該重鏈之胺基酸序列，各表示於序列表之序列編號43及44(第51及52圖)。
人類嵌合化FR2-13重鏈用引子組
5’-ccagatgggtgctgagccaggttaagctgctgcagtctggggctgag-3’(c13-HF：序列表之序列編號45：第53圖)
5’-cttggtggaggctgagctgacagtgaccagagtgccttggccccag-3’(c13-HR：序列表之序列編號46：第54圖)
4)-7 人類嵌合化FR2-14輕鏈表現載體之建構
將實施例3)獲得之編碼為FR2-14輕鏈之可變區之cDNA當作模盤，以KOD-Plus-(TOYOBO公司)與下列引子組放大含有編碼為輕鏈之可變區之cDNA的DNA片段，使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(CLONTECH公司)插入嵌合及人類化抗體輕鏈表現泛用載體pCMA-LK以限制酶BsiWI切斷之處，以建構人類嵌合化FR2-14輕鏈表現載體。獲得之表現載體命名為「pCMA-LK/cFR2-14」。編碼為人類嵌合化FR2-14輕鏈之鹼基序列及該輕鏈之胺基酸序列，各表示於序列表之序列編號47及48(第55及56圖)。
人類嵌合化FR2-14輕鏈用引子組
5’-atctccggcgcgtacggcgacatccagatgacacagtctccagcttcc-3’(c13-LF：序列表之序列編號41：第49圖)
5’-ggagggggcggccacagcccgtttcagttccagcttggtcccagc-3’(c14-LR：序列表之序列編號49：第57圖)
4)-8 人類嵌合化FR2-14重鏈表現載體之建構
將實施例3)獲得之編碼為FR2-14重鏈可變區之cDNA當作模盤，以KOD-Plus-(TOYOBO公司)與下列引子組放大含有編碼為重鏈可變區之cDNA的DNA片段，使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(CLONTECH公司)插入嵌合化及人類化IgG1型重鏈表現載體pCMA-G1以限制酶BlpI切斷之處，以建構人類嵌合化FR2-14重鏈表現載體。獲得之表現載體命名為「pCMA-G1/cFR2-14」。編碼為人類嵌合化FR2-14重鏈之鹼基序列及該重鏈之胺基酸序列，各表示於序列表之序列編號50及51(第58及59圖)。
人類嵌合化FR2-14重鏈用引子組
5’-ccagatgggtgctgagccaggttaagctgctgcagtctggggctgag-3’(c13-HF：序列表之序列編號45：第53圖)
5’-cttggtggaggctgagctgacagtgaccagagtgccttggccccag-3’(c13-HR：序列表之序列編號46：第54圖)
4)-9 人類嵌合化抗FGFR2抗體之製備
4)-9-1 人類嵌合化抗FGFR2抗體之生產
FreeStyle 293F細胞(INVITROGEN公司)，係由手冊實施繼代、培養。
將對數生長期之1.2×109個FreeStyle 293F細胞(INVITROGEN公司)接種於3L Fernbach Erlenmeyer Flask(CORNING公司)，以FreeStyle293 expression medium(INVITROGEN公司)稀釋，調整為1.0×106細胞/ml後，於37℃、8% CO2培養箱內以90rpm振盪培養1小時。將Polyethyleneimine(Polyscience #24765)3.6mg溶於Opti-Pro SFM培養基(Invitrogen公司)20ml，然後將使用PureLink HiPure Plasmid套組(INVITROGEN公司)製備之H鏈表現載體(0.4mg)及L鏈表現載體(0.8mg)懸浮於20ml之Opti-Pro SFM培養基(INVITROGEN公司)。於Polyethyleneimine/Opti-Pro SFM混合液20ml中，加入表現載體/Opti-Pro SFM混合液20ml，溫和攪拌，再放置5分鐘後，添加到FreeStyle 293F細胞。於37℃、8% CO2培養箱於90rpm振盪培養7日，將獲得之培養上清以Disposable Capsule Filter(ADVANTEC #CCS-045-E1H)過濾。
利用pCMA-G1/cFR2-10與pCMA-LK/cFR2-10之組合取得之人類嵌合化FR2-10命名為「cFR2-10」、利用pCMA-G1/cFR2-13與pCMA-LK/cFR2-13之組合取得之人類嵌合化FR2-13命名為「cFR2-13」、及利用pCMA-G1/cFR2-14與pCMA-LK/cFR2-14之組合取得之人類嵌合化FR2-14命名為「cFR2-14」。
4)-9-2 人類嵌合化抗FGFR2抗體之精製
將上述4)-9-1獲得之培養上清，以rProteinA親和性層析(4-6℃下)與陶瓷羥基磷灰石(室溫下)之2階段步驟精製。rProteinA親和性層析精製後與陶瓷羥基磷灰石精製後之緩衝液取代步驟，於室溫下實施。先將培養上清1100-1200ml加到經PBS平衡化之MabSelectSuRe(GE Healthcare Bioscience公司製、HiTrap管柱：容積1ml×2連結)。培養液完全進入管柱後，以PBS15-30ml洗滌管柱。其次，以2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)提取，收集含抗體之組分。將此組分以脫鹽管柱(GE Healthcare Bioscience公司製、HiTrap Desalting管柱：容積5ml×2連結)，取代為5mM磷酸鈉/50mM MES/20mM NaCl/pH6.5之緩衝液。再將此經取代之抗體溶液，加入經5mM NaPi/50mM MES/20mM NaCl/pH6.5之緩衝液平衡化的陶瓷羥基磷灰石管柱(日本BIORAD、Bio-Scale CHT2-1 Hydroxyapatite Column：容積2ml)。實施利用氯化鈉直線的濃度梯度提取，收集含抗體之組分。將此組分以脫鹽管柱(GE Healthcare Bioscience公司製、HiTrap Desalting管柱：容積5mlx2連結)，取代為CBS(10mM檸檬酸緩衝液/140mM氯化鈉、pH6.0)。最後於Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(截留分子量30K，Sartorius公司，4℃下)濃縮，調整IgG濃度為1.0mg/ml以上，作為精製樣本。
實施例5.人類嵌合化抗FGFR2抗體(cFR2-10、cFR2-13、cFR2-14)之體外活性
5)-1 人類嵌合化抗FGFR2抗體(cFR2-10、cFR2-13、cFR2-14)之抗原結合活性
將293α細胞(實施例1)-6中記載)調整為在含 10% FBS之DMEM培養基為5x105細胞/ml。對其使用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司製)導入pcDNA-DEST40-FGFR2IIIb或pcDNA-DEST40-FGFR2IIIc，各分注100μl到96-well plate(Corning公司製)，於含10% FBS之DMEM培養基中，於37℃、5% CO2之條件下培養一晚。維持獲得之導入細胞為黏附狀態，使用於Cell-ELISA。去除培養上清後，對於pcDNA-DEST40-FGFR2IIIb或pcDNA-DEST40-FGFR2IIIc導入細胞，分別添加cFR2-10、cFR2-13、cFR2-14抗體，使終濃度為2μg/ml，於4℃靜置1小時。將孔中之細胞以含5% FBS之PBS洗滌1次後，加入以含5% FBS之PBS稀釋為500倍之Anti-Human IgG-Peroxidase antibody produced in goat(SIGMA公司製)，於4℃靜置1小時。將孔中之細胞以含5% FBS之PBS洗滌5次後，以100μl/孔添加OPD發色液(OPD溶解液(於0.05M檸檬酸3鈉、0.1M磷酸氫2鈉‧12水pH4.5)分別溶解鄰苯二胺二鹽酸鹽(和光純藥公司製)、H2O2，使成為0.4mg/ml、0.6%(v/v))。邊隨時攪拌邊進行發色反應，以100μl/孔添加1M HCl，使發色反應停止後，以盤分析儀(ARVO：PerkinElmer公司)測定490nm之吸光值。如第5圖所示，cFR2-10抗體對於FGFR2IIIb選擇性結合，cFR2-13及cFR2-14抗體結合於FGFR2IIIb與FGFR2IIIc兩者。
5)-2 人類嵌合化抗FGFR2抗體(cFR2-10、cFR2-13、cFR2-14)之訊息中和作用
為了利用Elk1螢光素酶報告基因分析評價取得抗體之訊息中和作用，將實施例1)-3-1建構之pcDNA-DEST40-FGFR2IIIb或pcDNA-DEST40-FGFR2IIIc，由實施例1)-6-2所示之方法導入到293α細胞，於37℃、5% CO2培養一晚。次日除去培養上清後，與經含2% FBS之DMEM稀釋之cFR2-10、cFR2-13、cFR2-14抗體(終濃度0.05-5μg/ml)一起預溫育1小時，其次將係配體之人類FGF7(R&D systems公司製)或人類FGF9、Peprotech公司製)以終濃度10ng/ml添加到孔中。經過6小時溫育後，製備細胞溶解物，使用Dual-luciferase報告基因分析系(Promega公司製)，測定螢火蟲螢光素酶活性(專一的訊息)及水母螢光素酶活性(為了標準化之訊息)。為了將各孔之數據標準化，計算螢光蟲/水母比。如第6A圖所示，cFR2-10、cFR2-13、cFR2-14，在FGFR2IIIb表現細胞中，抑制了由FGF7所致之配體依賴的報告基因活化。又，如第6B圖所示，cFR2-13、cFR2-14，在FGFR2IIIc表現細胞中，抑制了FGF9所致之配體依賴的報告基因活化。由以上結果可知：該等抗體具有抑制FGFR2之配體所致之活化之作用。
5)-3 人類嵌合化抗FGFR2抗體(cFR2-10、cFR2-13、cFR2-14)之ADCC活性
5)-3-1 標的細胞之製作
藉由將pLenti6/V5-GW/lacZ、及ViraPowerTM Packaging Mix(Invitorogen公司)由附屬的實驗步驟對於293FT細胞(Invitrogen公司)進行轉染，以製作表現β-半乳糖苷酶基因之重組慢病毒。使獲得之重組慢病毒由 ViraPower Lentiviral Expression Systems(Invitrogen公司)之實驗步驟感染293T細胞，並以10μg/ml之Blasticidin(Invitrogen公司)選擇病毒感染細胞，以取得β-半乳糖苷酶之安定表現株。將此安定表現β-半乳糖苷酶之293T細胞，作為標的細胞，測定ADCC活性。
5)-3-2標的細胞之製備
將實施例5)-3-1取得之β-半乳糖苷酶安定表現293T細胞(以下記載為293T-lacZ)，接種於225cm2燒瓶，使在含10% FBS之DMEM培養基中成為1x107細胞/ml。於37℃培養一晚後，將pcDNA-DEST40-FGFR2IIIb使用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司製)導入，於含10% FBS之DMEM培養基中於37℃、5% CO2之條件下培養2日後，使用TrypLExpress(Invitrogen公司製)剝離、回收。以含5% FBS之不含酚紅之RPMI1640(以下簡稱「ADCC用培養基」)洗滌2次，以錐蟲藍(trypan blue)色素排除試驗計測活細胞數，將以ADCC用培養基再懸浮成為1×105細胞/ml者，作為標的細胞使用。
5)-3-3效應細胞之製備
將Uncharacterized Cryopreserved PBMC(Cellular Technology Ltd.公司製)懸浮於含10% FBS不含酚紅之RPMI1640培養基(Invitrogen公司製)，離心後再懸浮，以錐蟲藍(trypan blue)色素排除試驗計測活細胞數。離心後去除培養基，懸浮於ADCC用培養基，製備成活細胞密度為2.3×106細胞/ml，當作效應細胞。
5)-3-4 ADCC分析
將5)-3-2之293T-lacZ細胞以50μl/孔添加到96孔U底微量盤。於其中，以50μl/孔添加使用ADCC用培養基稀釋成終濃度為1~100ng/ml之cFR2-10、cFR2-13、cFR2-14、或人類對照抗體(hIgG)，於4℃靜置1小時。再者，添加5)-3-3之效應細胞75μl，於室溫離心1200rpm×5分鐘後，於37℃、5% CO2之條件下培養一晚。次日，將上清50μl回收到白色盤(Corning公司製)，添加β-Glo分析系(Promega公司製)溶液50μl，並以盤分析儀(ENVISION：PerkinElmer公司製)測定發光量。ADCC活性所致之細胞溶解率，由次式計算。
細胞溶解率(%)=(A-B)/(C-B)×100
A：樣本孔之計數
B：自然放出(抗體、效應細胞非添加孔)計數之平均值(n=3)。抗體添加時與效應細胞添加時，各添加ADCC用培養基50μl、75μl。除此以外與樣本孔進行同樣操作。
C：最大放出(標的細胞以界面活性劑溶解之孔)計數之平均值(n=3)。抗體添加時與效應細胞添加時，各添加ADCC用培養基50μl、75μl。測定時，於含細胞之孔添加175μl之β-Glo分析系溶液並混合，並將其中的100μl分量加到白色盤，實施測定。
如第7圖所示，cFR2-10、cFR2-13及cFR2-14對於FGFR2IIIb表現細胞有ADCC活性。
實施例6.人類嵌合化抗FGFR2抗體(cFR2-10、cFR2-13、cFR2-14)之體內抗腫瘤活性
將5×106cells之人類胃癌株SNU-16(從ATCC購買)以50%MATRIGEL(從日本BD購買)懸浮，移植到裸小鼠(CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj、從日本Charles River購買)之腋窩部皮下。由腫瘤體積分組，於移植之7、11、14、18日後，將人類嵌合化抗FGFR2抗體(cFR2-10、cFR2-13、cFR2-14)以1.5、15mg/kg對於擔癌小鼠之腹腔內投予(n=8)。每週2次使用電子數位卡尺(MITSUTOYO股份有限公司製)測定移植腫瘤之長徑及短徑，由以下所示計算式，計算腫瘤體積。
腫瘤體積(mm3)=1/2×短徑(mm)×短徑(mm)×長徑(mm)
cFR2-10抗體之結果如第8圖-A。最終測定日移植21日後之腫瘤生長抑制率，於1.5mg/kg投予組為55%、15mg/kg投予組為35%。
cFR2-13抗體之結果如第8圖-B。最終測定日移植21日後之腫瘤生長抑制率，於1.5mg/kg投予組為57%、15mg/kg投予組為46%。
cFR2-14抗體之結果如第8圖-C。最終測定日移植21日後之腫瘤生長抑制率，於1.5mg/kg投予組為34%、15mg/kg投予組為53%。
實施例7.人類嵌合化抗FGFR2抗體(cFR2-14)之人類化版(hFR2-14)之設計
7)-1 FR2-14之可變區之分子模型建立
cFR2-14之可變區之分子模型建立，係利用就相同性模型建立而言一般周知之方法(Methods in Enzymology ，203，121-153，(1991))實施。將在Protein Data Bank(Nuc.Acid Res.28，235-242(2000))登載的人類免疫球蛋白之可變區之1次序列(可取得從X射線結晶結構衍生的三維結構)，與在之前決定之FR2-14之可變區比較。就結果，選擇1ZAN，為對於cFR2-14之輕鏈之可變區有最高序列相同性者。又，選擇1CT8，為對於cFR2-14之重鏈可變區有最高序列相同性者。框架區之三維結構，係組合cFR2-14之輕鏈及重鏈所對應之1ZAN及1CT8之座標，而獲得「框架模型」以製作。cFR2-14之CDR，由Thornton et al.(J.Mol.Biol.,263，800-815，(1996))之分類，CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1及CDRH2各分配為簇集11A、7A、10A、10A、10A。CDRH3，係使用H3規則(FEBS letter 399，1-8(1996))分類為k(6)-。其次將針對各CDR之代表構形納入框架模型。
最後，從能量觀點，進行能量計算，以去除為了得到可能為cFR2-14之可變區之分子模型為不利之原子間接觸。上述程序使用市售之蛋白質立體結構預測程式Prime及配座探索程式MacroModel(Schrödinger，LLC)實施。
7)-2 對於人類化FR2-14之胺基酸序列之設計
人類化FR2-14抗體之建構，係利用就CDR嫁接(CDR grafing)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，10029-10033(1989))而言一般周知之方法實施。受體抗體，係基於框架區內之胺基酸相同性選擇。
將cFR2-14之框架區之序列，與抗體之胺基酸序列之Kabat資料庫(Nuc.Acid Res.29，205-206(2001))之所有人類框架比較，結果，FV/IL-2’CL抗體因為針對框架區之72%之序列相同性，選其為受子。將針對FV/IL-2’CL之框架區之胺基酸殘基，與針對cFR2-14之胺基酸殘基排列，鑑定使用不同胺基酸之位置。該等殘基之位置，係使用於前述建構之cFR2-14之三維模型分析，並且在受子上應嫁接之供體殘基，係由Queen et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，10029-10033(1989))提供之基準選擇。
將選出的一些供體殘基移入受體抗體，以下列實施例之記載建構人類化FR2-14序列。
又，將cFR2-14之各CDR中之1至3個胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基而得之CDR改變人類化FR2-14序列，也由以下實施例之記載建構。
7)-3 FR2-14輕鏈之人類化
7)-3-1 hFR2-14_L1型輕鏈：
序列表之序列編號26所示之cFR2-14輕鏈之胺基酸號碼29(丙胺酸)、35(白胺酸)、37(麩胺酸)、38(蘇胺酸)、42(麩胺酸)、62(天冬醯胺酸)、90(麩醯胺酸)、92(絲胺酸)、94(離胺酸)、96(天冬醯胺酸)、100(絲胺酸)、103(纈胺酸)、105(絲胺酸)、107(苯丙胺酸)、121(丙胺酸)、125(白胺酸)、127(白胺酸)、130(丙胺酸)各取代為絲胺酸、纈胺酸、天冬胺酸、精胺酸、蘇胺酸、離胺酸、天冬胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、脯胺酸、 苯丙胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸、蘇胺酸，隨之將設計之人類化FR2-14輕鏈命名為「hFR2-14_L1型輕鏈」。
編碼為hFR2-14_L1型輕鏈之核苷酸序列，記載於序列表之序列編號72。又，hFR2-14_L1型輕鏈之胺基酸序列，記載於序列表之序列編號73。再者，序列編號72及73之序列，也各記載於第80及81圖。
7)-4 FR2-14重鏈之人類化
7)-4-1 hFR2-14_H1型重鏈：
序列表之序列編號16所示之cFR2-14重鏈之胺基酸號碼22(離胺酸)、24(白胺酸)、30(白胺酸)、31(纈胺酸)、39(白胺酸)、43(蘇胺酸)、56(白胺酸)、57(離胺酸)、59(纈胺酸)、62(脯胺酸)、63(絲胺酸)、64(蘇胺酸)、67(異白胺酸)、86(離胺酸)、87(丙胺酸)、94(苯丙胺酸)、95(絲胺酸)、101(天冬胺酸)、106(蘇胺酸)、110(丙胺酸)、114(苯丙胺酸)分別取代為麩醯胺酸、纈胺酸、纈胺酸、離胺酸、纈胺酸、丙胺酸、纈胺酸、精胺酸、丙胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、精胺酸、纈胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、精胺酸、蘇胺酸、酪胺酸，隨之，將設計之人類化FR2-14重鏈命名為「hFR2-14_H1型重鏈」。
編碼為hFR2-14_H1型重鏈之核苷酸序列，記載於序列表之序列編號74。又，hFR2-14_H1型重鏈之胺基酸序列，記載於序列表之序列編號75。再者，序列編號74及75之序列，也各記載於第82及83圖。
7)-4-2 hFR2-14_H2型重鏈：
序列表之序列編號16所示之cFR2-14重鏈之胺基酸號碼22(離胺酸)、24(白胺酸)、30(白胺酸)、31(纈胺酸)、39(白胺酸)、43(蘇胺酸)、56(白胺酸)、57(離胺酸)、59(纈胺酸)、62(脯胺酸)、63(絲胺酸)、64(蘇胺酸)、67(異白胺酸)、86(離胺酸)、87(丙胺酸)、91(纈胺酸)、94(苯丙胺酸)、95(絲胺酸)、101(天冬胺酸)、106(蘇胺酸)、110(丙胺酸)、114(苯丙胺酸)分別取代為麩醯胺酸、纈胺酸、纈胺酸、離胺酸、纈胺酸、丙胺酸、纈胺酸、精胺酸、丙胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、精胺酸、纈胺酸、丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、精胺酸、蘇胺酸、酪胺酸，隨之將設計之人類化FR2-14重鏈命名為「hFR2-14_H2型重鏈」。
編碼為hFR2-14_H2型重鏈之核苷酸序列，記載於序列表之序列編號76。又，hFR2-14_H2型重鏈之胺基酸序列，記載於序列表之序列編號77。再者，序列編號76及77之序列，也各記載於第84及85圖。
7)-4-3 hFR2-14_H3型重鏈：
序列表之序列編號16所示之cFR2-14重鏈之胺基酸號碼22(離胺酸)、24(白胺酸)、30(白胺酸)、31(纈胺酸)、39(白胺酸)、43(蘇胺酸)、56(白胺酸)、57(離胺酸)、59(纈胺酸)、67(異白胺酸)、86(離胺酸)、87(丙胺酸)、94(苯丙胺酸)、95(絲胺酸)、101(天冬胺酸)、106(蘇胺酸)、110(丙胺酸)、114(苯丙胺酸)分別取代為麩醯胺酸、纈胺酸、纈胺酸、離胺酸、纈胺酸、丙胺酸、纈胺酸、 精胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸、精胺酸、纈胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、精胺酸、蘇胺酸、酪胺酸，隨之將設計之人類化FR2-14重鏈命名為「hFR2-14_H3型重鏈」。
編碼為hFR2-14_H3型重鏈之核苷酸序列記載於序列表之序列編號78。又，hFR2-14_H3型重鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號79。再者，序列編號78及79之序列，也各記載於第86及87圖。
7)-4-4 hFR2-14_H4型重鏈：
序列表之序列編號16所示之cFR2-14重鏈之胺基酸號碼22(離胺酸)、24(白胺酸)、30(白胺酸)、31(纈胺酸)、39(白胺酸)、43(蘇胺酸)、56(白胺酸)、57(離胺酸)、59(纈胺酸)、64(蘇胺酸)、67(異白胺酸)、86(離胺酸)、87(丙胺酸)、94(苯丙胺酸)、95(絲胺酸)、101(天冬胺酸)、106(蘇胺酸)、110(丙胺酸)、114(苯丙胺酸)、125(蘇胺酸)各取代為麩醯胺酸、纈胺酸、纈胺酸、離胺酸、纈胺酸、丙胺酸、纈胺酸、精胺酸、丙胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、精胺酸、纈胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、精胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、丙胺酸，隨之將設計之人類化FR2-14重鏈命名為「hFR2-14_H4型重鏈」。
編碼為hFR2-14_H4型重鏈之核苷酸序列，記載於序列表之序列編號80。又，hFR2-14_H4型重鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號81。再者，序列編號80及81之序列也各記載於第88及89圖。
7)-4-5 hFR2-14_H5型重鏈：
序列表之序列編號16所示之cFR2-14重鏈之胺基酸號碼22(離胺酸)、24(白胺酸)、30(白胺酸)、31(纈胺酸)、39(白胺酸)、43(蘇胺酸)、56(白胺酸)、57(離胺酸)、59(纈胺酸)、67(異白胺酸)、86(離胺酸)、87(丙胺酸)、94(苯丙胺酸)、95(絲胺酸)、101(天冬胺酸)、106(蘇胺酸)、110(丙胺酸)、114(苯丙胺酸)、118(天冬胺酸)各取代為麩醯胺酸、纈胺酸、纈胺酸、離胺酸、纈胺酸、丙胺酸、纈胺酸、精胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸、精胺酸、纈胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、精胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、麩胺酸，隨之將設計之人類化FR2-14重鏈命名為「hFR2-14_H5型重鏈」。
編碼為hFR2-14_H5型重鏈之核苷酸序列，記載於序列表之序列編號82。又，hFR2-14_H5型重鏈之胺基酸序列，記載於序列表之序列編號83。再者，序列編號82及83之序列，也各記載於第90及91圖。
7)-4-6 hFR2-14_H6型重鏈：
序列表之序列編號16所示之cFR2-14重鏈之胺基酸號碼22(離胺酸)、24(白胺酸)、30(白胺酸)、31(纈胺酸)、39(白胺酸)、43(蘇胺酸)、56(白胺酸)、57(離胺酸)、59(纈胺酸)、67(異白胺酸)、86(離胺酸)、87(丙胺酸)、94(苯丙胺酸)、95(絲胺酸)、101(天冬胺酸)、106(蘇胺酸)、110(丙胺酸)、114(苯丙胺酸)、119(甘胺酸)分別取代為麩醯胺酸、纈胺酸、纈胺酸、離胺酸、纈胺酸、丙胺酸、纈胺酸、精胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸、精胺酸、纈胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、精胺酸、蘇胺酸、酪 胺酸、丙胺酸，隨之將設計之人類化FR2-14重鏈命名為「hFR2-14_H6型重鏈」。
編碼為hFR2-14_H6型重鏈之核苷酸序列，記載於序列表之序列編號84。又，hFR2-14_H6型重鏈之胺基酸序列，記載於序列表之序列編號85。再者，序列編號84及85之序列，也各記載於第92及93圖。
7)-4-7 hFR2-14_H7型重鏈：
序列表之序列編號16所示之cFR2-14重鏈之胺基酸號碼22(離胺酸)、24(白胺酸)、30(白胺酸)、31(纈胺酸)、39(白胺酸)、43(蘇胺酸)、56(白胺酸)、57(離胺酸)、59(纈胺酸)、67(異白胺酸)、86(離胺酸)、87(丙胺酸)、94(苯丙胺酸)、95(絲胺酸)、101(天冬胺酸)、106(蘇胺酸)、110(丙胺酸)、114(苯丙胺酸)、119(甘胺酸)分別取代為麩醯胺酸、纈胺酸、纈胺酸、離胺酸、纈胺酸、丙胺酸、纈胺酸、精胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸、精胺酸、纈胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、精胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、麩胺酸，隨之將設計之人類化FR2-14重鏈命名為「hFR2-14_H7型重鏈」。
編碼為hFR2-14_H7型重鏈之核苷酸序列，記載於序列表之序列編號86。又，hFR2-14_H7型重鏈之胺基酸序列，記載於序列表之序列編號87。再者，序列編號86及87之序列，也分別記載於第94及95圖。
7)-4-8 hFR2-14_H8型重鏈：
序列表之序列編號16所示之cFR2-14重鏈之胺基酸號碼22(離胺酸)、24(白胺酸)、30(白胺酸)、31(纈胺酸) 、39(白胺酸)、43(蘇胺酸)、56(白胺酸)、57(離胺酸)、59(纈胺酸)、67(異白胺酸)、86(離胺酸)、87(丙胺酸)、94(苯丙胺酸)、95(絲胺酸)、101(天冬胺酸)、106(蘇胺酸)、110(丙胺酸)、114(苯丙胺酸)、119(甘胺酸)分別取代為麩醯胺酸、纈胺酸、纈胺酸、離胺酸、纈胺酸、丙胺酸、纈胺酸、精胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸、精胺酸、纈胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、精胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸，隨之將設計之人類化FR2-14重鏈命名為「hFR2-14_H8型重鏈」。
編碼為hFR2-14_H8型重鏈之核苷酸序列，記載於序列表之序列編號88。又，hFR2-14_H8型重鏈之胺基酸序列，記載於序列表之序列編號89。再者，序列編號88及89之序列，也各記載於第96及97圖。
7)-4-9 hFR2-14_H9型重鏈：
序列表之序列編號16所示之cFR2-14重鏈之胺基酸號碼22(離胺酸)、24(白胺酸)、30(白胺酸)、31(纈胺酸)、39(白胺酸)、43(蘇胺酸)、56(白胺酸)、57(離胺酸)、59(纈胺酸)、67(異白胺酸)、86(離胺酸)、87(丙胺酸)、94(苯丙胺酸)、95(絲胺酸)、101(天冬胺酸)、106(蘇胺酸)、110(丙胺酸)、114(苯丙胺酸)、119(甘胺酸)分別取代為麩醯胺酸、纈胺酸、纈胺酸、離胺酸、纈胺酸、丙胺酸、纈胺酸、精胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸、精胺酸、纈胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、精胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、組胺酸，隨之將設計之人類化FR2-14重鏈命名為「hFR2-14_H9型重鏈」。
編碼為hFR2-14_H9型重鏈之核苷酸序列，記載於序列表之序列編號90。又，hFR2-14_H9型重鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號91。再者，序列編號90及91之序列，也分別記載於第98及99圖。
7)-4-10 hFR2-14_H10型重鏈：
序列表之序列編號16所示之cFR2-14重鏈之胺基酸號碼22(離胺酸)、24(白胺酸)、30(白胺酸)、31(纈胺酸)、39(白胺酸)、43(蘇胺酸)、56(白胺酸)、57(離胺酸)、59(纈胺酸)、67(異白胺酸)、86(離胺酸)、87(丙胺酸)、94(苯丙胺酸)、95(絲胺酸)、101(天冬胺酸)、106(蘇胺酸)、110(丙胺酸)、114(苯丙胺酸)、119(甘胺酸)分別取代為麩醯胺酸、纈胺酸、纈胺酸、離胺酸、纈胺酸、丙胺酸、纈胺酸、精胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸、精胺酸、纈胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、精胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、異白胺酸，隨之將設計之人類化FR2-14重鏈命名為「hFR2-14_H10型重鏈」。
編碼為hFR2-14_H10型重鏈之核苷酸序列記載於序列表之序列編號92。又，hFR2-14_H10型重鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號93。再者，序列編號92及93之序列，也分別記載於第100及101圖。
7)-4-11 hFR2-14_H11型重鏈：
序列表之序列編號16所示之cFR2-14重鏈之胺基酸號碼22(離胺酸)、24(白胺酸)、30(白胺酸)、31(纈胺酸)、39(白胺酸)、43(蘇胺酸)、56(白胺酸)、57(離胺酸)、59(纈胺酸)、67(異白胺酸)、86(離胺酸)、87(丙胺酸)、 94(苯丙胺酸)、95(絲胺酸)、101(天冬胺酸)、106(蘇胺酸)、110(丙胺酸)、114(苯丙胺酸)、119(甘胺酸)分別取代為麩醯胺酸、纈胺酸、纈胺酸、離胺酸、纈胺酸、丙胺酸、纈胺酸、精胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸、精胺酸、纈胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、精胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、離胺酸，隨之將設計之人類化FR2-14重鏈命名為「hFR2-14_H11型重鏈」。
編碼為hFR2-14_H11型重鏈之核苷酸序列記載於序列表之序列編號94。又，hFR2-14_H11型重鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號95。再者，序列編號94及95之序列也分別記載於第102及103圖。
7)-4-12 hFR2-14_H12型重鏈：
序列表之序列編號16所示之cFR2-14重鏈之胺基酸號碼22(離胺酸)、24(白胺酸)、30(白胺酸)、31(纈胺酸)、39(白胺酸)、43(蘇胺酸)、56(白胺酸)、57(離胺酸)、59(纈胺酸)、67(異白胺酸)、86(離胺酸)、87(丙胺酸)、94(苯丙胺酸)、95(絲胺酸)、101(天冬胺酸)、106(蘇胺酸)、110(丙胺酸)、114(苯丙胺酸)、119(甘胺酸)分別取代為麩醯胺酸、纈胺酸、纈胺酸、離胺酸、纈胺酸、丙胺酸、纈胺酸、精胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸、精胺酸、纈胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、精胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、白胺酸，隨之將設計之人類化FR2-14重鏈命名為「hFR2-14_H12型重鏈」。
編碼為hFR2-14_H12型重鏈之核苷酸序列記載於序列表之序列編號96。又，hFR2-14_H12型重鏈之 胺基酸序列記載於序列表之序列編號97。再者，序列編號96及97之序列也分別記載於第104及105圖。
7)-4-13 hFR2-14_H13型重鏈：
序列表之序列編號16所示之cFR2-14重鏈之胺基酸號碼22(離胺酸)、24(白胺酸)、30(白胺酸)、31(纈胺酸)、39(白胺酸)、43(蘇胺酸)、56(白胺酸)、57(離胺酸)、59(纈胺酸)、67(異白胺酸)、86(離胺酸)、87(丙胺酸)、94(苯丙胺酸)、95(絲胺酸)、101(天冬胺酸)、106(蘇胺酸)、110(丙胺酸)、114(苯丙胺酸)、119(甘胺酸)分別取代為麩醯胺酸、纈胺酸、纈胺酸、離胺酸、纈胺酸、丙胺酸、纈胺酸、精胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸、精胺酸、纈胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、精胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸，隨之將設計之人類化FR2-14重鏈命名為「hFR2-14_H13型重鏈」。
編碼為hFR2-14_H13型重鏈之核苷酸序列記載於序列表之序列編號98。又，hFR2-14_H13型重鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號99。再者，序列編號98及99之序列也分別記載於第106及107圖。
7)-4-14 hFR2-14_H14型重鏈：
序列表之序列編號16所示之cFR2-14重鏈之胺基酸號碼22(離胺酸)、24(白胺酸)、30(白胺酸)、31(纈胺酸)、39(白胺酸)、43(蘇胺酸)、56(白胺酸)、57(離胺酸)、59(纈胺酸)、67(異白胺酸)、86(離胺酸)、87(丙胺酸)、94(苯丙胺酸)、95(絲胺酸)、101(天冬胺酸)、106(蘇胺酸)、110(丙胺酸)、114(苯丙胺酸)、119(甘胺酸)分別取代 為麩醯胺酸、纈胺酸、纈胺酸、離胺酸、纈胺酸、丙胺酸、纈胺酸、精胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸、精胺酸、纈胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、精胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、麩醯胺酸，隨之將設計之人類化FR2-14重鏈命名為「hFR2-14_H14型重鏈」。
編碼為hFR2-14_H14型重鏈之核苷酸序列記載於序列表之序列編號100。又，hFR2-14_H14型重鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號101。再者，序列編號100及101之序列也分別記載於第108及109圖。
7)-4-15 hFR2-14_H15型重鏈：
序列表之序列編號16所示之cFR2-14重鏈之胺基酸號碼22(離胺酸)、24(白胺酸)、30(白胺酸)、31(纈胺酸)、39(白胺酸)、43(蘇胺酸)、56(白胺酸)、57(離胺酸)、59(纈胺酸)、67(異白胺酸)、86(離胺酸)、87(丙胺酸)、94(苯丙胺酸)、95(絲胺酸)、101(天冬胺酸)、106(蘇胺酸)、110(丙胺酸)、114(苯丙胺酸)、119(甘胺酸)分別取代為麩醯胺酸、纈胺酸、纈胺酸、離胺酸、纈胺酸、丙胺酸、纈胺酸、精胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸、精胺酸、纈胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、精胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、精胺酸，隨之將設計之人類化FR2-14重鏈命名為「hFR2-14_H15型重鏈」。
編碼為hFR2-14_H15型重鏈之核苷酸序列記載於序列表之序列編號102。又，hFR2-14_H15型重鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號103。再者，序列編號102及103之序列，也分別記載於第110及111圖。
7)-4-16 hFR2-14_H16型重鏈：
序列表之序列編號16所示之cFR2-14重鏈之胺基酸號碼22(離胺酸)、24(白胺酸)、30(白胺酸)、31(纈胺酸)、39(白胺酸)、43(蘇胺酸)、56(白胺酸)、57(離胺酸)、59(纈胺酸)、67(異白胺酸)、86(離胺酸)、87(丙胺酸)、94(苯丙胺酸)、95(絲胺酸)、101(天冬胺酸)、106(蘇胺酸)、110(丙胺酸)、114(苯丙胺酸)、119(甘胺酸)分別取代為麩醯胺酸、纈胺酸、纈胺酸、離胺酸、纈胺酸、丙胺酸、纈胺酸、精胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸、精胺酸、纈胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、精胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、纈胺酸，隨之將設計之人類化FR2-14重鏈命名為「hFR2-14_H16型重鏈」。
編碼為hFR2-14_H16型重鏈之核苷酸序列記載於序列表之序列編號104。又，hFR2-14_H16型重鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號105。再者，序列編號104及105之序列也各記載於第112及113圖。
7)-4-17 hFR2-14_H17型重鏈：
序列表之序列編號16所示之cFR2-14重鏈之胺基酸號碼22(離胺酸)、24(白胺酸)、30(白胺酸)、31(纈胺酸)、39(白胺酸)、43(蘇胺酸)、56(白胺酸)、57(離胺酸)、59(纈胺酸)、67(異白胺酸)、86(離胺酸)、87(丙胺酸)、94(苯丙胺酸)、95(絲胺酸)、101(天冬胺酸)、106(蘇胺酸)、110(丙胺酸)、114(苯丙胺酸)、119(甘胺酸)分別取代為麩醯胺酸、纈胺酸、纈胺酸、離胺酸、纈胺酸、丙胺酸、纈胺酸、精胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸、精胺酸、纈 胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、精胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、色胺酸，隨之將設計之人類化FR2-14重鏈命名為「hFR2-14_H17型重鏈」。
編碼為hFR2-14_H17型重鏈之核苷酸序列記載於序列表之序列編號106。又，hFR2-14_H17型重鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號107。再者，序列編號106及107之序列也分別記載於第114及115圖。
7)-4-18 hFR2-14_H18型重鏈：
序列表之序列編號16所示之cFR2-14重鏈之胺基酸號碼22(離胺酸)、24(白胺酸)、30(白胺酸)、31(纈胺酸)、39(白胺酸)、43(蘇胺酸)、56(白胺酸)、57(離胺酸)、59(纈胺酸)、67(異白胺酸)、86(離胺酸)、87(丙胺酸)、94(苯丙胺酸)、95(絲胺酸)、101(天冬胺酸)、106(蘇胺酸)、110(丙胺酸)、114(苯丙胺酸)、119(甘胺酸)分別取代為麩醯胺酸、纈胺酸、纈胺酸、離胺酸、纈胺酸、丙胺酸、纈胺酸、精胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸、精胺酸、纈胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、精胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、酪胺酸，隨之將設計之人類化FR2-14重鏈命名為「hFR2-14_H18型重鏈」。
編碼為hFR2-14_H18型重鏈之核苷酸序列記載於序列表之序列編號108。又，hFR2-14_H18型重鏈之胺基酸序列記載於序列表之序列編號109。再者，序列編號108及109之序列也各記載於第116及117圖。
實施例8.大鼠抗人類FGFR2抗體FR2-14之人類化抗體(hFR2-14)之取得/表現
8)-1 大鼠抗人類FGFR2抗體FR2-14之人類化抗體(hFR2-14)之輕鏈表現載體之建構
8)-1-1 hFR2-14_L1型輕鏈表現載體之建構
合成包含編碼為序列編號73之胺基酸號碼21至130所示之hFR2-14_L1型輕鏈可變區的基因的DNA(GENEART公司、人工基因合成服務)，將以限制酶BsiWI切出之DNA片段插入嵌合及人類化抗體輕鏈表現泛用載體(pCMA-LK)以限制酶BsiWI切斷之處，以建構hFR2-14_L1型輕鏈表現載體。獲得之表現載體命名為「pCMA-LK/hFR2-14_L1」。
8)-2 大鼠抗人類FGFR2抗體FR2-14之人類化抗體(hFR2-14)之重鏈表現載體之建構
8)-2-1 hFR2-14_H1、hFR2-14_H3、及hFR2-14_H4型重鏈表現載體之建構
合成包含編碼為序列表之序列編號75之胺基酸號碼20至137、序列編號79之胺基酸號碼20至137、及序列編號81之胺基酸號碼20至137所示之hFR2-14_H1、hFR2-14_H3、及hFR2-14_H4型重鏈可變區的基因的DNA(GENEART公司 人工基因合成服務)，將以限制酶BlpI切出之DNA片段插入人類化抗體重鏈表現泛用載體(pCMA-G1)以限制酶BlpI切斷之處，以建構hFR2-14_H1、hFR2-14_H3、及hFR2-14_H4型重鏈表現載體。獲得之表現載體各命名為「pCMA-G1/hFR2-14_H1」、「pCMA-G1/hFR2-14_H3」、及「pCMA-G1/hFR2-14_H4」。
8)-2-2 hFR2-14_H2型重鏈表現載體之建構
將實施例8)-2-1建構之pCMA-G1/hFR2-14_H3當作模盤，使用下列所示之引子組與QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies公司)，建構hFR2-14_H2型重鏈表現載體。獲得之表現載體命名為「pCMA-G1/hFR2-14_H2」。hFR2-14_H2型重鏈之核苷酸序列示於序列表之序列編號76，胺基酸序列示於序列編號77。
引子組
5’-ggcagagtgaccctgaccgccgacaagagcaccagcacc-3’(VH3A-F：序列表之序列編號110)
5’-ggtgctggtgctcttgtcggcggtcagggtcactctgcc-3’(VH3A-R：序列表之序列編號111)
8)-2-3 hFR2-14_H5型重鏈表現載體之建構
將實施例8)-2-1製作之hFR2-14_H4型重鏈表現載體pCMA-G1/hFR2-14_H4當作模盤，使用下列引子組與KOD-Plus-Mutagenesis Kit(TOYOBO公司)導入變異，以建構hFR2-14_H5型重鏈表現載體。獲得之表現載體命名為「pCMA-G1/hFR2-14_H5」。
引子組：
5’-GAGGGCTACGGCGACTGGTTCACATAC-3’(H5-F)
5’-GGTGGCGCAGTAGTACACGGCGGT-3’(H-R此引子於以下為共通)
8)-2-4 hFR2-14_H6型重鏈表現載體之建構
將實施例8)-2-1製作之hFR2-14_H4型重鏈表現載體pCMA-G1/hFR2-14_H4當作模盤，使用下列引子組與KOD-Plus-Mutagenesis Kit(TOYOBO公司)導入變異，以建構hFR2-14_H6型重鏈表現載體。獲得之表現載體命名為「pCMA-G1/hFR2-14_H6」。
引子組：
5’-GACGCCTACGGCGACTGGTTCACATAC-3’(H6-F)
5’-GGTGGCGCAGTAGTACACGGCGGT-3’(H-R)
8)-2-5 hFR2-14_H7型重鏈表現載體之建構
將實施例8)-2-1製作之hFR2-14_H4型重鏈表現載體pCMA-G1/hFR2-14_H4當作模盤，使用下列引子組與KOD-Plus-Mutagenesis Kit(TOYOBO公司)導入變異，以建構hFR2-14_H7型重鏈表現載體。獲得之表現載體命名為「pCMA-G1/hFR2-14_H7」。
引子組：
5’-GACGAGTACGGCGACTGGTTCACATAC-3’(H7-F)
5’-GGTGGCGCAGTAGTACACGGCGGT-3’(H-R)
8)-2-6 hFR2-14_H8型重鏈表現載體之建構
將實施例8)-2-1製作之hFR2-14_H4型重鏈表現載體pCMA-G1/hFR2-14_H4當作模盤，使用下列引子組與KOD-Plus-Mutagenesis Kit(TOYOBO公司)導入變異，以建構hFR2-14_H8型重鏈表現載體。獲得之表現載體命名為「pCMA-G1/hFR2-14_H8」。
引子組：
5’-GACTTCTACGGCGACTGGTTCACATAC-3’(H8-F)
5’-GGTGGCGCAGTAGTACACGGCGGT-3’(H-R)
8)-2-7 hFR2-14_H9型重鏈表現載體之建構
將實施例8)-2-1製作之hFR2-14_H4型重鏈表現載體pCMA-G1/hFR2-14_H4當作模盤，使用下列引子組與KOD-Plus-Mutagenesis Kit(TOYOBO公司)導入變異，以建構hFR2-14_H9型重鏈表現載體。獲得之表現載體命名為「pCMA-G1/hFR2-14_H9」。
引子組：
5’-GACCACTACGGCGACTGGTTCACATAC-3’(H9-F)
5’-GGTGGCGCAGTAGTACACGGCGGT-3’(H-R)
8)-2-8 hFR2-14_H10型重鏈表現載體之建構
將實施例8)-2-1製作之hFR2-14_H4型重鏈表現載體pCMA-G1/hFR2-14_H4當作模盤，使用下列引子組與KOD-Plus-Mutagenesis Kit(TOYOBO公司)導入變異，以建構hFR2-14_H10型重鏈表現載體。獲得之表現載體命名為「pCMA-G1/hFR2-14_H10」。
引子組：
5’-GACATCTACGGCGACTGGTTCACATAC-3’(H10-F)
5’-GGTGGCGCAGTAGTACACGGCGGT-3’(H-R)
8)-2-9 hFR2-14_H11型重鏈表現載體之建構
將實施例8)-2-1製作之hFR2-14_H4型重鏈表現載體 pCMA-G1/hFR2-14_H4當作模盤，使用下列引子組與KOD-Plus-Mutagenesis Kit(TOYOBO公司)導入變異，以建構hFR2-14_H11型重鏈表現載體。獲得之表現載體命名為「pCMA-G1/hFR2-14_H11」。
引子組：
5’-GACAAGTACGGCGACTGGTTCACATAC-3’(H11-F)
5’-GGTGGCGCAGTAGTACACGGCGGT-3’(H-R)
8)-2-10 hFR2-14_-H12型重鏈表現載體之建構
將實施例8)-2-1製作之hFR2-14_H4型重鏈表現載體pCMA-G1/hFR2-14_H4當作模盤，使用下列引子組與KOD-Plus-Mutagenesis Kit(TOYOBO公司)導入變異，以建構hFR2-14_hH12型重鏈表現載體。獲得之表現載體命名為「pCMA-G1/hFR2-14_H12」。
引子組：
5’-GACCTGTACGGCGACTGGTTCACATAC-3’(H12-F)
5’-GGTGGCGCAGTAGTACACGGCGGT-3’(H-R)
8)-2-11 hFR2-14_hH13型重鏈表現載體之建構
將實施例8)-2-1製作之hFR2-14_hH4型重鏈表現載體pCMA-G1/hFR2-14_H4當作模盤，使用下列引子組與KOD-Plus-Mutagenesis Kit(TOYOBO公司)導入變異，以建構hFR2-14_hH13型重鏈表現載體。獲得之表現載體命 名為「pCMA-G1/hFR2-14_H13」。
引子組：
5’-GACATGTACGGCGACTGGTTCACATAC-3’(H13-F)
5’-GGTGGCGCAGTAGTACACGGCGGT-3’(H-R)
8)-2-12 hFR2-14_hH14型重鏈表現載體之建構
將實施例8)-2-1製作之hFR2-14_hH4型重鏈表現載體pCMA-G1/hFR2-14_H4當作模盤，使用下列引子組與KOD-Plus-Mutagenesis Kit(TOYOBO公司)導入變異，以建構hFR2-14_hH14型重鏈表現載體。獲得之表現載體命名為「pCMA-G1/hFR2-14_H14」。
引子組：
5’-GACCAGTACGGCGACTGGTTCACATAC-3’(H14-F)
5’-GGTGGCGCAGTAGTACACGGCGGT-3’(H-R)
8)-2-13 hFR2-14_hH15型重鏈表現載體之建構
將實施例8)-2-1製作之hFR2-14_hH4型重鏈表現載體pCMA-G1/hFR2-14_H4當作模盤，使用下列引子組與KOD-Plus-Mutagenesis Kit(TOYOBO公司)導入變異，以建構hFR2-14_hH15型重鏈表現載體。獲得之表現載體命名為「pCMA-G1/hFR2-14_H15」。
引子組：
5’-GACCGGTACGGCGACTGGTTCACATAC-3’(H15- F)
5’-GGTGGCGCAGTAGTACACGGCGGT-3’(H-R)
8)-2-14 hFR2-14_hH16型重鏈表現載體之建構
將實施例8)-2-1製作之hFR2-14_hH4型重鏈表現載體pCMA-G1/hFR2-14_H4當作模盤，使用下列引子組與KOD-Plus-Mutagenesis Kit(TOYOBO公司)導入變異，以建構hFR2-14_hH16型重鏈表現載體。獲得之表現載體命名為「pCMA-G1/hFR2-14_H16」。
引子組：
5’-GACGTGTACGGCGACTGGTTCACATAC-3’(H16-F)
5’-GGTGGCGCAGTAGTACACGGCGGT-3’(H-R)
8)-2-15 hFR2-14_hH17型重鏈表現載體之建構
將實施例8)-2-1製作之hFR2-14_hH4型重鏈表現載體pCMA-G1/hFR2-14_H4當作模盤，使用下列引子組與KOD-Plus-Mutagenesis Kit(TOYOBO公司)導入變異，以建構hFR2-14_hH17型重鏈表現載體。獲得之表現載體命名為「pCMA-G1/hFR2-14_H17」。
引子組：
5’-GACTGGTACGGCGACTGGTTCACATAC-3’(H17-F)
5’-GGTGGCGCAGTAGTACACGGCGGT-3’(H-R)
8)-2-16 hFR2-14_hH18型重鏈表現載體之 建構
將實施例8)-2-1製作之hFR2-14_hH4型重鏈表現載體pCMA-G1/hFR2-14_H4當作模盤，使用下列引子組與KOD-Plus-Mutagenesis Kit(TOYOBO公司)導入變異，以建構hFR2-14_hH18型重鏈表現載體。獲得之表現載體命名為「pCMA-G1/hFR2-14_H18」。
引子組：
5’-GACTACTACGGCGACTGGTTCACATAC-3’(H18-F)
5’-GGTGGCGCAGTAGTACACGGCGGT-3’(H-R)
8)-3 人類化FR2-14抗體之製備(FreeStyle 293F細胞)
8)-3-1 人類化FR2-14抗體之生產
FreeStyle 293F細胞(INVITROGEN公司)，係由手冊實施繼代、培養。
將對數生長期之1.2×109個FreeStyle 293F細胞(INVITROGEN公司)接種於3L Fernbach Erlenmeyer Flask(CORNING公司)，以FreeStyle293 expression medium(INVITROGEN公司)稀釋，調整為1.0×106細胞/ml後，於37℃、8% CO2培養箱內以90rpm振盪培養1小時。將Polyethyleneimine(Polyscience #24765)3.6mg溶於Opti-Pro SFM培養基(Invitrogen公司)20ml，然後將使用PureLink HiPure Plasmid套組(INVITROGEN公司)製備之H鏈表現載體(0.4mg)及L鏈表現載體(0.8mg)懸浮於20ml之Opti-Pro SFM培養基(INVITROGEN公司)。於 Polyethyleneimine/Opti-Pro SFM混合液20ml中，加入表現載體/Opti-Pro SFM混合液20ml，溫和攪拌，再放置5分鐘後，添加到FreeStyle 293F細胞。於37℃、8% CO2培養箱於90rpm振盪培養7日，將獲得之培養上清以Disposable Capsule Filter(ADVANTEC #CCS-045-E1H)過濾。
將pCMA-G1/hFR2-14_H5、pCMA-G1/hFR2-14_H6、pCMA-G1/hFR2-14_H7、pCMA-G1/hFR2-14_H8、pCMA-G1/hFR2-14_H9、pCMA-G1/hFR2-14_H10、pCMA-G1/hFR2-14_H11、pCMA-G1/hFR2-14_H12、pCMA-G1/hFR2-14_H13、pCMA-G1/hFR2-14_H14、pCMA-G1/hFR2-14_H15、pCMA-G1/hFR2-14_H16、pCMA-G1/hFR2-14_H17、及pCMA-G1/hFR2-14_H18與pCMA-LK/hFR2-14_L1之組合取得之人類化FR2-14抗體，分別命名為「hFR2-14_H5/L1」、「hFR2-14_H6/L1」、「hFR2-14_H7/L1」、「hFR2-14_H8/L1」、「hFR2-14_H9/L1」、「hFR2-14_H10/L1」、「hFR2-14_H11/L1」、「hFR2-14_H12/L1」、「hFR2-14_H13/L1」、「hFR2-14_H14/L1」、「hFR2-14_H15/L1」、「hFR2-14_H16/L1」、「hFR2-14_H17/L1」、及「hFR2-14_H18/L1。
8)-3-2 人類化FR2-14抗體之精製
從上述8)-3-1獲得之培養上清將抗體以rProteinA親和性層析(4-6℃下)與陶瓷羥基磷灰石(室溫下)之2階段步驟精製。rProteinA親和性層析精製後與陶瓷羥基磷灰 石精製後之緩衝液取代步驟，於4至6℃實施。先將培養上清加到經PBS平衡化之MabSelectSuRe(GE Healthcare Bioscience公司製、HiTrap管柱)。培養液完全進入管柱後，以管柱容量2倍以上之PBS洗滌管柱。其次，以2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)提取，收集含抗體之組分。將此組分以透析(Thermo Scientific公司、Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)取代為PBS後，將以5mM磷酸鈉/50mM MES/pH7.0之緩衝液稀釋為5倍之抗體溶液加到經5mM NaPi/50mM MES/30mM NaCl/pH7.0之緩衝液平衡化的陶瓷羥基磷灰石管柱(日本BIORAD、Bio-Scale CHT-Type-I Hydroxyapatite Column)。實施利用氯化鈉直線的濃度梯度提取，收集含抗體之組分。將此組分以透析(Thermo Scientific公司、Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)，取代為HBSor(25mM組胺酸/5%山梨醇、pH6.0)。最後於Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(截留分子量UF10K，Sartorius公司，4℃下)濃縮，調整IgG濃度為25mg/ml以上，作為精製樣本。
實施例9.糖鏈修飾經調節之人類化FR2-14抗體之製備
將包含含有序列編號97(第105圖)表示之胺基酸序列之重鏈及含有序列編號73(第81圖)表示之胺基酸序列之輕鏈而成之人類化抗體，由周知方法將該抗體蛋白質所結合之糖鏈修飾予以脫海藻糖化以製備將獲得之抗體命名為hFR2-14 H19/L1。該修飾體供質量分析，結果海藻糖之峰部為偵測極限以下。本發明中，如hFR2-14 H19/L1般糖鏈修飾經調節之抗體，也稱為「抗體」或「抗體之修飾體」。
實施例10.人類化抗人類FGFR2抗體(hFR2-14)之物性評價
10)-1 人類化抗人類FGFR2抗體(hFR2-14)利用Biacore測定抗原結合活性
抗體與抗原(rhFGFR2alpha(IIIb)Fc chimera或rhFGFR2alpha(IIIc)Fc chimera)間之解離常數測定，係使用Biacore 3000(GE HEALTHCARE BIOSCIENCE(股))，並將使已固定化之抗人類IgG(Fab)抗體捕捉(capture)作為配體之抗體，將抗原作為分析物而測定之捕捉法實施。抗人類IgG(Fab)抗體(Human Fab capture kit、GE HEALTHCARE BIOSCIENCE(股))，係以胺偶聯法以約5000RU共價鍵結於感測晶片CM5(BIAcore，Inc.)。於參考池(cell)也同樣進行固定化。作為電泳緩衝液，使用HBS-EP+(10mM HEPES pH7.4、0.15M NaCl，3mM EDTA、0.05%Surfactant P20)。於已固定抗人類IgG(Fab)抗體之晶片上，就精製抗體，以1μg/mL之抗體溶液之流速10μL/分鐘流過60秒，就含抗體之培養上清，添加60秒後，以流速30μl/分鐘添加抗原之稀釋系列溶液(0.3至500nM)180秒，然後監測300秒之解離相。作為再生溶液，將10mM Gly-HCl pH2.1以流速10μl/分鐘添加60秒，2次。數據分析，使用分析軟體(BIAevaluation software,version 4.1)之Bivalent結合模型，計算結合速度常數kon、解離速度常數koff及解離常數(KD；KD=koff/kon)。
10)-1-1 4種人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H1/L1至hFR2-14_H4/L1)及人類嵌合化抗FGFR2抗體(cFR2-14)之結合活性評價
將4種人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H1/L1至hFR2-14_H4/L1)及人類嵌合化抗FGFR2抗體(cFR2-14)由實施例8)-3及實施例4)-9之方法表現‧精製，並由實施例10)-1所示之方法評價與各人類FGFR2變異蛋白質間的結合活性。Biacore測定結果如第122圖。
10)-1-2 15種人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H3/L1及hFR2-14_H5~H18/L1)之結合活性評價
使用將15種人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H3/L1及hFR2-14_H5~H18/L1)由實施例8)-3之方法表現之培養上清，由實施例10)-1所示之方法評價與FGFR2-IIIc蛋白質間之結合活性。Biacore測定結果如第123圖。
10)-2 人類化抗人類FGFR2抗體(hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H8/L1及hFR2-14_H12/L1)之人類FGFR2選擇性的結合性之探討
10)-2-1 人類FGFR1IIIb表現載體(pcDNA-DEST40-FGFR1IIIb)之建構
將編碼為人類FGFR1IIIb變異蛋白質(於異構體2：NP_056934之1-310號之胺基酸、及359-820號之胺基酸之間已插入FGFR1之IIIb區域：AAB19502之胺基酸序列者)之cDNA選殖到pcDNA-DEST40載體，建構 pcDNA-DEST40-FGFR1IIIb。
10)-2-2 Cell-ELISA
將實施例1)-3-1、2)-1-1、及10)-2-1建構之各種人類FGFR表現載體使用Lipofectamine 2000(Life Technologies公司製)對於293α細胞(實施例1)-6記載)導入，於96孔盤(Corning公司製)各分注100μl，於含10%FBS之DMEM培養基中於37℃、5%CO2之條件下培養一晚。去除培養上清後，添加50μl以含5% FBS之PBS稀釋成3μg/ml的hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H8/L1、hFR2-14_H12/L1的溶液，於4℃靜置1小時。將孔中之細胞以含5% FBS之PBS洗滌2次後，加入以含5% FBS之PBS稀釋2000倍的Anti-human IgG-Peroxidase conjugate antibody produced in goat(SIGMA公司製)，於4℃靜置1小時。將孔中之細胞以含5% FBS之PBS洗滌3次後，以100μl/孔添加OPD發色液(OPD溶解液(0.05M檸檬酸3鈉、0.1M磷酸氫2鈉‧12水pH4.5)溶解鄰苯二胺二鹽酸鹽(和光純藥公司製)、H2O2，使各成為0.4mg/ml、0.6%(v/v))。邊隨時攪拌邊進行發色反應，以100μl/孔添加1M HCl，停止發色反應後，以盤分析儀(ARVO：PerkinElmer公司)測定490nm之吸光值。如第124圖所示，hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H8/L1、hFR2-14_H12/L1抗體對於人類FGFR2IIIb及FGFR2IIIc兩者顯示專一的結合。
10)-3 使用示差掃描熱量計(DSC)測定人類化抗人類FGFR2抗體(hFR2-14)之熱安定性
使用示差掃描熱量計(DSC)實施熱安定性之 測定。樣本以0.5mg/mL之濃度溶於HBSor緩衝液(製成25mM組胺酸(pH6.0)5%山梨醇)，各400μL，作為試樣溶液，用於DSC測定。DSC測定條件設定如下。亦即，定初始溫度為20℃、最終溫度為100℃，升溫速度為200℃/1小時、過濾時間2秒、反饋模式為Low。參照液使用HBSor。全部的DSC測定裝置，使用美國GE HEALTHCARE BIOSCIENCE(股)製VP-Capillary DSC Platform。將從試樣溶液獲得之掃描曲線扣減基線(於試樣池也填充參照溶液而得之掃描曲線)，進行基線校正。然後，使用從各樣本之分子量算得之莫耳濃度，實施濃度之校正。第125A圖及第125B圖顯示各種人類化FGFR2抗體之溫譜圖。若針對各溫譜圖中之最大峰部顯示峰頂之溫度當作熱改質中點Tm，如第125C圖所示，hFR2-14_H1/L1抗體之Tm值為87.6℃、hFR2-14_H2/L1抗體之Tm值為87.2℃、hFR2-14_H3/L1抗體之Tm值為79.5℃、hFR2-14_H4/L1抗體之Tm值為81.6℃、hFR2-14_H5/L1抗體之Tm值為77.2℃、hFR2-14_H8/L1抗體之Tm值為81.0℃、hFR2-14_H9/L1抗體之Tm值為78.8℃、hFR2-14_H11/L1抗體之Tm值為80.3℃、hFR2-14_H12/L1抗體之Tm值為82.2℃、hFR2-14_H19/L1抗體之Tm值為82.2℃。
10)-4 使用Biacore之人類化抗人類FGFR2抗體(hFR2-14)之結合安定性試驗
人類化抗人類FGFR2抗體(hFR2-14)與抗原間之結合安定性，由以下方法評價。
將各種人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H1/L1 至hFR2-14_H5/L1、hFR2-14_H8/L1、hFR2-14_H9/L1、hFR2-14_H11/L1、hFR2-14_H12/L1、hFR2-14_H19/L1)及人類嵌合化抗FGFR2抗體(cFR2-14)，利用實施例8)-3、實施例9)及實施例4)-9之方法表現、精製，以20mg/mL之濃度溶於HBSor緩衝液(製成25mM組胺酸(pH6.0)5%山梨醇)，於40℃加溫4週，製成劣化檢體。就劣化前檢體與劣化後檢體，利用Biacore所為之結合活性測定，由實施例10)-1所示方法實施。Biacore測定結果如第126圖。
實施例11.人類化抗人類FGFR2抗體(hFR2-14)之訊息中和作用
11)-1 人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H1/L1、hFR2-14_H2/L1、hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H4/L1)及人類嵌合化抗FGFR2抗體(cFR2-14)之訊息中和作用
為了利用Elk1螢光素酶報告基因分析評價人類化抗體之訊息中和作用，以實施例1)-6-2所示方法將pcDNA-DEST40-FGFR2IIIb或pcDNA-DEST40-FGFR2IIIc、與pFA2-Elk1(Stratagene公司製)、pFR-Luc2CP、及pGL4.74[hRluc/TK](Promega公司製)對於293α細胞導入，於37℃、5% CO2培養一晚。次日去除培養上清，與經含2% FBS之DMEM稀釋之hFR2-14_H1/L1、hFR2-14_H2/L1、hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H4/L1、或cFR2-14抗體一起預溫育1小時，其次將配體(人類FGF7或人類FGF9、Peprotech公司製)以終濃度10ng/ml添加到孔。經過6小時溫育後，使用Dual-Glo Luciferase Assay System(Promega公司製)，測定螢火蟲螢光素酶活性(專一的訊息)及水母螢光素酶活性(為了標準化之訊息)。為了將各孔之數據標準化，計算螢火蟲/水母比。如第127A圖所示，hFR2-14_H1/L1、hFR2-14_H2/L1、hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H4/L1及cFR2-14，在FGFR2IIIb表現細胞中，抑制了FGF7所致之配體依賴的報告基因活化。又，如第127B圖所示，hFR2-14_H1/L1、hFR2-14_H2/L1、hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H4/L1及cFR2-14，在FGFR2IIIc表現細胞中，抑制了FGF9所致之配體依賴的報告基因活性。由以上結果，可知：該等抗體具有抑制FGFR2之配體所致活化之作用。
11)-2 人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H5/L1、hFR2-14_H6/L1、hFR2-14_H7/L1、hFR2-14_H8/L1、hFR2-14_H9/L1、hFR2-14_H10/L1、hFR2-14_H11/L1、hFR2-14_H12/L1、hFR2-14_H13/L1、hFR2-14_H14/L1、hFR2-14_H15/L1、hFR2-14_H16/L1、hFR2-14_H17/L1、hFR2-14_H18/L1)之訊息中和作用
為了利用Elk1螢光素酶報告基因分析評價人類化抗體之訊息中和作用，由實施例1)-6-2所示方法將pcDNA-DEST40-FGFR2IIIb或pcDNA-DEST40-FGFR2IIIc與、pFA2-Elk1(Stratagene公司製)、pFR-Luc2CP、及pGL4.74[hRluc/TK](Promega公司製)對於293α細胞導入，並於37℃、5% CO2培養一晚。次日去除培養上清後，與經2% FBS之DMEM稀釋之實施例8)-3-1製備之hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H5/L1、hFR2-14_H6/L1、 hFR2-14_H7/L1、hFR2-14_H8/L1、hFR2-14_H9/L1、hFR2-14_H10/L1、hFR2-14_H11/L1、hFR2-14_H12/L1、hFR2-14_H13/L1、hFR2-14_H14/L1、hFR2-14_H15/L1、hFR2-14_H16/L1、hFR2-14_H17/L1、hFR2-14_H18/L1抗體產生293FreeStyle細胞(Invitrogen公司製)培養上清一起預溫育1小時，其次，將配體(人類FGF7、R&D systems公司製)以終濃度10ng/ml添加到孔。經過6小時溫育後，使用Dual-Glo Luciferase Assay System(Promega公司製)，測定螢火蟲螢光素酶活性(專一的訊息)及水母螢光素酶活性(為了標準化之訊息)。為了將各孔之數據標準化，計算螢火蟲/水母比。如第128A圖、第128B圖及第128C圖所示，hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H5/L1、hFR2-14_H6/L1、hFR2-14_H7/L1、hFR2-14_H8/L1、hFR2-14_H9/L1、hFR2-14_H10/L1、hFR2-14_H11/L1、hFR2-14_H12/L1、hFR2-14_H13/L1、hFR2-14_H14/L1、hFR2-14_H15/L1、hFR2-14_H16/L1、hFR2-14_H17/L1、hFR2-14_H18/L1，在FGFR2IIIb表現細胞中，抑制FGF7所致之配體依賴的報告基因活化。
11)-3 人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H12/L1、hFR2-14_H19/L1)之訊息中和作用
為了利用Elk1螢光素酶報告基因分析評價人類化抗體之訊息中和作用，以實施例1)-6-2所示之方法將pcDNA-DEST40-FGFR2IIIb或pcDNA-DEST40-FGFR2IIIc與、pFA2-Elk1(Stratagene公司製)、pFR-Luc2CP、及pGL4.74[hR1uc/TK](Promega公司製)對於293α細胞，並於 37℃、5% CO2培養一晚。次日去除培養上清後，與經含2% FBS之DMEM稀釋之實施例8)及9)製備之hFR2-14_H12/L1、hFR2-14_H19/L1抗體一起預溫育1小時，其次將配體人類FGF7(R&D systems公司製)或人類FGF9、Peprotech公司製)以終濃度10ng/ml添加到孔。經過6小時溫育後，使用Dual-Glo Luciferase Assay System(Promega公司製)，測定螢火蟲螢光素酶活性(專一的訊息)及水母螢光素酶活性(為了標準化之訊息)。為了將各孔之數據標準化，計算螢火蟲/水母比。如第129A圖所示，hFR2-14_H12/L1、hFR2-14_H19/L1，在FGFR2IIIb表現細胞中，抑制了FGF7所致之配體依賴的報告基因活化。又，如第129B圖所示，hFR2-14_H12/L1、hFR2-14_H19/L1，在FGFR2IIIc表現細胞中，抑制了FGF9所致之配體依賴的報告基因活性。由以上結果可知：該等抗體具有抑制FGFR2之配體所致之活化的作用。
實施例12.人類化抗人類FGFR2抗體(hFR2-14)之ADCC活性
12)-1 人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H1/L1、hFR2-14_H2/L1、hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H4/L1)及人類嵌合化抗FGFR2抗體(cFR2-14)對於FGFR2過度表現細胞之ADCC活性
將表現於實施例5)-3-2之方法製備之FGFR2IIIb的293T-lacZ細胞以50μl/孔添加到96孔U底微量盤。於其中，以50μl/孔添加實施例5)-3-2所記載之使用ADCC用培養基稀釋成終濃度為1至100ng/ml的hFR2-14_H1/L1、 hFR2-14_H2/L1、hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H4/L1、cFR2-14或人類IgG，於4℃靜置1小時。再者，添加實施例5)-3-3之效應細胞75μl，於室溫離心1200rpm×5分鐘之後，於37℃、5% CO2之條件下培養一晚。次日，將上清50μl回收到白色盤(Corning公司製)，添加β-Glo分析系(Promega公司製)溶液50μl，以讀取儀(ENVISION：PerkinElmer公司製)測定發光量。ADCC活性所致之細胞溶解率以次式計算。
細胞溶解率(%)=(A-B)/(C-B)×100
A：樣本孔之計數
B：自然放出(抗體、效應細胞非添加孔)計數之平均值(n=3)。抗體添加時與效應細胞添加時，各添加ADCC用培養基50μl、75μl。除此以外與樣本孔進行同樣操作。
C：最大放出(標的細胞以界面活性劑溶解之孔)計數之平均值(n=3)。抗體添加時與效應細胞添加時，各添加ADCC用培養基50μl、75μl。測定時，於含細胞之孔添加175μl之β-Glo分析系溶液並混合，並將其中的100μl分量加到白色盤，實施測定。
如第130A圖及第130B圖所示，hFR2-14_H1/L1、hFR2-14_H2/L1、hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H4/L1、及cFR2-14，對於FGFR2IIIb表現細胞具有ADCC活性。
12)-2 人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H1/L1、hFR2-14_H2/L1、hFR2-14_H3/L1、 hFR2-14_H4/L1)及人類嵌合化抗FGFR2抗體(cFR2-14)對於FGFR2表現癌細胞株之ADCC活性
12)-2-1 標的細胞之製備
將KATOIII、NCI-H716、SNU16細胞以ADCC用培養基洗滌2次，通過細胞濾網(cell strainer)(Becton Dickison公司製)後，以錐蟲藍色素排除試驗計測活細胞數。將再懸浮使成為1×105細胞/ml者當作標的細胞使用。
12)-2-2 PBMC細胞之製備
於20ml Lymphosepar I(免疫生物研究所公司製)緩慢堆疊25ml健康正常人血液後，於室溫離心1500rpm×30分鐘。將位在血漿與LymphoseparI(免疫生物研究所公司製)之中間的細胞層以滴管回收，懸浮於20ml含10% FBS不含酚紅之RPMI1640培養基(Life Technology公司製)。進行1500rpm×5分鐘離心。將上清除去後，添加20ml ADCC用培養基，洗滌2次。以錐蟲藍色素排除試驗計測活細胞數，去除離心後培養基，懸浮於ADCC用培養基，作為效應細胞。
12)-2-3 ADCC活性之評價
將於實施例12)-2-1之方法製備之NCI-H716細胞以50μl/孔添加到96孔U底微量盤。於其中，以50μl/孔添加經ADCC用培養基稀釋成終濃度為1至1000ng/ml的hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H8/L1、hFR2-14_H12/L1或人類IgG，於4℃靜置1小時。再者，添加75μl的實施例12)-2-2之PBMC細胞13.4×106/ml，於室溫進行1200rpm×5分鐘離心之後，於37℃、5% CO2之條件下培養一晚。次日，將 CytoTox96 Non-Radiozctive Cytotoxicity Assay(Promega公司製)套組附屬的10×Lysis Solution以17.5μl/孔添加到標的細胞及僅有培養基之孔，攪拌後，於37℃、5% CO2之條件下靜置45分鐘。於室溫200g進行4分鐘離心後，將上清50μl/孔回收到96孔平底微量盤(Corning公司製)，添加50μl/孔之Substrate Mix，遮光並於室溫靜置30分鐘。再添加50μl/孔之Stop Solution，以盤分析儀(ARVO：PerkinElmer公司製)測定490nm之吸光值。ADCC活性所致之細胞溶解率由次式計算。
細胞毒性(%)=(A-B-C)/(D-C)×100
A：樣本孔之計數
B：從效應細胞之自然放出(從效應細胞孔之培養液孔之校正)計數之平均值(n=3)。
C：從標的細胞之自然放出(從標的細胞孔之培養液孔之校正)計數之平均值(n=3)。
D：最大放出(從以界面活性劑溶解標的細胞的孔至以界面活性劑溶解培養液之孔之校正)計數之平均值(n=3)。
如第131圖所示，hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H8/L1、hFR2-14_H12/L1，對於FGFR2表現癌細胞株NCI-H716細胞有ADCC活性。
12)-3 人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H12/L1、hFR2-14_H19/L1)對於FGFR2表現癌細胞株之ADCC活性
將於實施例12)-2-1之方法製備之KATOIII、 NCI-H716、SNU16細胞以50μl/孔添加到96孔U底微量盤。於其中以50μl/孔添加實施例8)及9)製備之經ADCC用培養基稀釋為終濃度成為1~1000ng/ml的hFR2-14_H12/L1、hFR2-14_H19/L1或人類IgG，於4℃靜置1小時。再者，添加75μl的實施例12)-2-2的效應細胞20×106/ml，於室溫進行1200rpm×5分鐘離心後，於37℃、5% CO2之條件下培養一晚。次日，將CytoTox96 Non-Radiozctive Cytotoxicity Assay(Promega公司製)套組附屬的10×Lysis Solution以17.5μl/孔添加到標的細胞及僅有培養基之孔並攪拌後，於37℃、5% CO2之條件下攪拌45分鐘。於室溫200g進行4分鐘離心後，將上清50μl/孔回收到96孔平底微量盤(Corning公司製)，添加50μl/孔之Substrate Mix，遮光並於室溫靜置30分鐘。再添加50μl/孔之Stop Solution，以盤分析儀(ARVO：PerkinElmer公司製)測定490nm之吸光值。ADCC活性所致之細胞溶解率，由實施例12)-2-3所示之計算方法計算。
如第132圖之A、B、C所示，hFR2-14_H12/L1、hFR2-14_H19/L1，對於FGFR2表現癌細胞株NCI-H716、SNU-16、KATOIII有ADCC活性，且其活性以hFR2-14_H19/L1較高。
實施例13.人類化抗人類FGFR2抗體(hFR2-14)之ADCP活性
13)-1 人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H12/L1、hFR2-14_H19/L1)對於FGFR2表現癌細胞株之ADCP活性
13)-1-1 標的細胞之製備
回收KATOIII及NCI-H716細胞，於PBS洗滌3次後，以錐蟲藍色素排除試驗計測活細胞數。分取1×106細胞，離心後，以PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling(Sigma公司製)附屬之DilluentC 200μl將細胞懸浮。將作為標記溶液之1mM PKH26 Linker以DilluentC稀釋為10μM後，立即將細胞懸浮液與等量之PKH26Linker溶液混合，於室溫靜置5分鐘。添加5ml之含10% FBS之RPMI1640培養基(Life Technology公司製)，洗滌2次後，將再懸浮使成為於5×105細胞/ml者，當作標的細胞。
13)-1-2 PBMC細胞之製備
於20ml Lymphosepar I(免疫生物研究所公司製)緩慢堆疊25ml健康正常人血液後，於室溫離心1500rpm×30分鐘。將位在血漿與LymphoseparI(免疫生物研究所公司製)之中間的細胞層以滴管回收，懸浮於20ml含10% FBS之RPMI1640培養基(Life Technology公司製)。進行1500rpm×5分鐘離心。將上清除去後，添加20ml含10% FBS之RPMI1640培養基(Life Technology公司製)，洗滌2次。以錐蟲藍色素排除試驗計測活細胞數，去除離心後培養基，作為效應細胞。
13)-1-3 效應細胞之製備
將實施例13)-1-2製備之PBMC細胞以RoboSep buffer(STEMCELL公司製)調整成5×107細胞/ml。對於PBMC細胞懸浮液每1ml添加50μl之Human monocyte Enrichment Kit Without CD16 Depletion(STEMCELL公司製)附屬之EasySep human Monocyte enrichment cocktail。於4℃進行10分鐘反應後，對於PBMC細胞懸浮液每1ml添加50μl之EasySep Magnetic Particles。於4℃進行5分鐘反應後，添加2.5ml的RoboSep buffer(STEMCELL公司製)，安置於EasySep Magnet。2分30秒後回收上清，進行1200rpm×5分鐘離心，分取Monocyte組分。添加含10% FBS之RPMI1640培養基(Life Technology公司製)，洗滌1次後，添加含有10ng/ml GM-CSF(PEPROTEC公司製)與10ng/ml M-CSF(PEPROTEC公司製)之含10% FBS的RPMI1640培養基(Life Technology公司製)，接種於浮游用225cm2燒瓶(住友電木公司製)。於37℃、5% CO2之條件下培養14日。於培養期間中，每3~4日更換含10ng/ml GM-CSF(PEPROTEC公司製)與10ng/ml M-CSF(PEPROTEC公司製)之含10% FBS的RPMI1640培養基(Life Technology公司製)。14日後，對於已誘導分化誘導的巨噬體添加0.05%Trypsin-EDTA(Life Technology公司製)，於37℃進行40分鐘反應後剝離。添加含10%FBS之RPMI1640培養基(Life Technology公司製)，洗滌2次後，再懸浮於含有10ng/ml之M-CSF(PEPROTEC公司製)與250U/ml之IFN-γ(PEPROTEC公司製)的含10% FBS的RPMI1640培養基(Life Technology公司製)，使成為5×105細胞/ml，當作效應細胞。
13)-1-4 ADCP活性之評價
將於實施例13)-1-1之方法製備之標的細胞 100μl/孔添加到超低黏附表面96孔U底微量盤(Corning公司製)。於其中以100μl/孔添加經含10% FBS之RPMI1640培養基(Life Technology公司製)稀釋成終濃度為0.5至500ng/ml的實施例8)及9)製備之hFR2-14_H12/L1、hFR2-14-H19/L1、或人類IgG，於4℃靜置30分鐘。於室溫以1200rpm離心5分鐘，將上清除去後，以100μl/孔之含10% FBS之RPMI1640培養基(Life Technology公司製)懸浮。以100μl/孔添加實施例13)-1-3製備之5×105細胞/ml之效應細胞後，於37℃、5% CO2之條件下靜置3小時。於4℃進行1200rpm×5分鐘離心，將上清除去後，以200μl/孔之含5%FBS之PBS洗滌。對於細胞添加45μl/孔之含5%FBS之PBS、5μl/孔之APC human CD11b(Becton Dickison公司製)，於4℃靜置15分鐘。將200μl/孔之含5%FBS之PBS洗滌2次。以200μl/孔之含1%聚甲醛之PBS懸浮，於4℃放置一晚。次日，以流式細胞計數(FACS CantoII：Becton Dickison公司製)測定。數據分析使用Flowjo(TreeSrar公司製)。以FSC(前向散射光)/SSC(側向散射光)展開後，計算成為PE陽性(A)、APC、PE均為陽性(B)的細胞數。APC、PE均成為陽性(B)之細胞，作為巨噬體吞噬標的細胞者。ADCP活性所致之細胞吞噬率以下式計算。
細胞吞噬率(%)=B/(A+B)×100
如第133A圖、第133B圖所示，hFR2-14_H12/L1、hFR2-14_H19/L1對於FGFR2表現癌細胞株NCI-H716、KATOIII有ADCP活性。
實施例14.人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14)之體內抗腫瘤活性
14)-1 人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H1/L1、hFR2-14_H2/L1、hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H4/L1)對於人類胃癌細胞株SNU-16皮下移植模式之體內抗腫瘤活性
將5×106cells之人類胃癌株SNU-16(從ATCC購買)以50%MATRIGEL(從日本BD購買)懸浮，移植到裸小鼠(CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj、從日本Charles River購買)之腋窩部皮下。由腫瘤體積分組，於移植之7、10、14、17、21日後，將人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H1/L1、hFR2-14_H2/L1、hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H4/L1)以1.5、15mg/kg對於擔癌小鼠之腹腔內投予(n=8)。每週2次使用電子數位卡尺(MITSUTOYO股份有限公司製)測定移植腫瘤之長徑及短徑，由以下所示計算式，計算腫瘤體積。
腫瘤體積(mm3)=1/2×短徑(mm)×短徑(mm)×長徑(mm)
hFR2-14_H1/L1抗體之結果如第134A圖。最終測定日移植21日後之腫瘤生長抑制率，於1.5mg/kg投予組為58%、15mg/kg投予組為53%。
hFR2-14_H2/L1抗體之結果如第134B圖。最終測定日移植21日後之腫瘤生長抑制率，於1.5mg/kg投予組為58%、15mg/kg投予組為58%。
hFR2-14_H3/L1抗體之結果如第134C圖。最終測定 日移植21日後之腫瘤生長抑制率，於1.5mg/kg投予組為64%、15mg/kg投予組為41%。
hFR2-14_H4/L1抗體之結果如第134D圖。最終測定日移植21日後之腫瘤生長抑制率，於1.5mg/kg投予組為70%、15mg/kg投予組為39%。
14)-2 人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H5/L1、hFR2-14_H8/L1、hFR2-14_H9/L1、hFR2-14_H11/L1、hFR2-14_H12/L1、hFR2-14_H19/L1)對於人類胃癌細胞株SNU-16皮下移植模式之體內抗腫瘤活性
將5×106cells之人類胃癌株SNU-16(從ATCC購買)以50%MATRIGEL(從日本BD購買)懸浮，移植到裸小鼠(CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj、從日本Charles River購買)之腋窩部皮下。由腫瘤體積分組，於移植之7、10(或11)、14、17(或18)日後，將實施例8)-3製備之(hFR2-14_H5/L1、hFR2-14_H8/L1、hFR2-14_H9/L1、hFR2-14_H11/L1、hFR2-14_H12/L1)或實施例9)製備之人類化抗體(hFR2-14_H19/L1)以2、20mg/kg分別對於擔癌小鼠之腹腔內投予(n=8或9)。每週2次使用電子數位卡尺(MITSUTOYO股份有限公司製)測定移植腫瘤之長徑及短徑，由以下所示計算式，計算腫瘤體積。
腫瘤體積(mm3)=1/2×短徑(mm)×短徑(mm)×長徑(mm)
hFR2-14_H5/L1之結果如第135A圖。最終測定日移植21日後之腫瘤生長抑制率，於2mg/kg投予組為41%、 20mg/kg投予組為51%。
hFR2-14_H8/L1之結果如第135B圖。最終測定日移植21日後之腫瘤生長抑制率，於2mg/kg投予組為30%、20mg/kg投予組為30%。
hFR2-14_H9/L1之結果如第135C圖。最終測定日移植21日後之腫瘤生長抑制率，於2mg/kg投予組為1%、20mg/kg投予組為23%。
hFR2-14_H11/L1之結果如第135D圖。最終測定日移植21日後之腫瘤生長抑制率，於2mg/kg投予組為61%、20mg/kg投予組為42%。
hFR2-14_H12/L1之結果如第135E圖。最終測定日移植21日後之腫瘤生長抑制率，於2mg/kg投予組為36%、20mg/kg投予組為58%。
hFR2-14_H19/L1之結果如第135F圖。最終測定日移植21日後之腫瘤生長抑制率，於2mg/kg投予組為70%、20mg/kg投予組為40%。
14)-3 人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H12/L1、hFR2-14_H19/L1)對於人類大腸癌細胞株NCI-H716團塊移植模式之體內抗腫瘤活性
將人類大腸癌株NCI-H716(從ATCC購買)之腫瘤團塊(5×5×5mm3)移植到裸小鼠(CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj、從日本Charles River購買)之腋窩部皮下。由腫瘤體積分組，於移植當日及移植之3、7、10、14、17、21、24日後，將實施例9)製備之人類化抗體(hFR2-14_H12/L1、hFR2-14_H19/L1)以20mg/kg分別對於擔癌小鼠之腹腔內 投予(n=11)。每週2次使用電子數位卡尺(MITSUTOYO股份有限公司製)測定移植腫瘤之長徑及短徑，由以下所示計算式，計算腫瘤體積。
腫瘤體積(mm3)=1/2×短徑(mm)×短徑(mm)×長徑(mm)
hFR2-14_H12/L1之結果如第136A圖。最終測定日移植28日後之腫瘤生長抑制率為99%。
hFR2-14_H19/L1之結果如第136B圖。最終測定日移植28日後之腫瘤生長抑制率為99%
14)-4 人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H12/L1、hFR2-14_H19/L1)對於人類大腸癌細胞株NCI-H716-luc腹膜接種模式之體內抗腫瘤活性
將3×106cells之Luciferase基因表現細人類大腸癌株NCI-H716-luc(NCI-H716從ATCC購買，將Luciferase基因進行基因導入)以生理食鹽水(從大塚製藥購買)懸浮，移植到NOG小鼠(NOD/Shi-SCID，IL-2Rγ零(null)、從實驗動物中央研究所購買)之腹腔內。移植1日後由體重分組，於移植之1、5、8、12、16、19、26日後將實施例8)及9)製備之人類化抗體(hFR2-14_H12/L1、hFR2-14_H19/L1)以20mg/kg分別對於擔癌小鼠之腹腔內投予(n=11)。記錄小鼠死亡日，計算存活率(%)。移植37日後，將VivoGlo Luciferin(從PROMEGA購買)以150mg/kg對於擔癌小鼠之尾靜脈內投予，於投予10分鐘後使用IVIS(Caliper Lifesciences製)測定擔癌小鼠之Luciferase活性。Luciferase活性 (p/s/cm2/sr)，係使用Living Image(Caliper Lifesciences製)定量。
人類化抗體之腫瘤生長抑制效果表示於第137圖之(A)。移植37日後，以Luciferase活性作為指標之對非投予組之腫瘤生長抑制率，於hFR2-14_H12/L1投予組為98%、hFR2-14_H19/L1投予組為98%。
人類化抗體之延命效果表示於第137圖之(B)。移植93日後之存活率，於非投予組為0%，相對於此，hFR2-14_H12/L1抗體投予組為64%、hFR2-14_H19/L1抗體投予組為91%。
實施例15.人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H3/L1)抗體與FGFR2蛋白質之複合體之X射線結構分析
15)-1 結晶化用FGFR2蛋白質之製備
15)-1-1 結晶化用FGFR2蛋白質表現載體之製作
為了建構表現包含人類FGFR2IIIb、IIIc(第78圖：序列編號70及第79圖：序列編號71)共通部分之胺基酸號碼148-249之胺基酸序列而構成之區(以下記載為「D2」。)的載體，使用D2放大用引子組：D23fw：5’-CTGTTTCAAGGTCCGAGCAATAACAAACGTGCACCGTATTGG-3’(第120圖：序列編號112)及D2rv：5’-CGCAAGCTTGTCGACTCAAACAACATCCAGATGATAGGTATG-3’(第121圖：序列編號113)、之引子組，以包含人類FGFR2(第78圖：序列編號70及第79圖：序列編號71)之胺基酸號碼126-313之載體質體當 作模盤，進行PCR反應。將獲得之PCR產物，使用In-Fusion HD Cloning Kit(TAKARA BIO公司製)導入預先已導入His標籤及HRV3c蛋白酶切斷位之pET24b(+)(Novagen公司製)，(以下簡稱「pET24b(+)-D2」。又，以下及圖中，由「pET24b(+)-D2」表現之重組蛋白質記載為FGFR2D2)。
15)-1-2 結晶化用FGFR2蛋白質(FGFR2D2)之製作
以表現質體pET24b(+)-D2將大腸菌Origami2(DE3)(Novagen公司製)轉形，以已添加25μg/ml之卡納黴素(Wako公司製)、12μg/ml之四環黴素(Wako公司製)的Terrific培養基(FORMEDIUM公司製)50mL於37℃、200rpm進行一晚前培養。將已前培養之溶液50mL加到同樣已添加25μg/ml之卡納黴素及12μg/ml之四環黴素的Terrific培養基1L，於37℃ 250rpm培養1小時後，降低溫度為16℃，添加1mMIPTG以誘導FGFR2D2表現，進行26小時培養。以4500rpm進行30分鐘離心後收集菌體，懸浮於溶有抑制劑雞尾酒(Roche公司製)之結合緩衝液(50mM Tris-鹽酸pH8.0、400mM NaCl、20mM Imidazole)後，於冰上進行超音波震碎。於25000rpm離心20分鐘，回收上清，供填充於HisTrap FF crude管柱(GE HEALTH CARE公司製)。以結合緩衝液洗滌後，以提取緩衝液(50mM Tris-HCl pH8.0、400mM NaCl、500mM Imidazole)進行梯度提取，收集含目的蛋白質之組分。將收集之樣本以緩衝液(50mM Tris-鹽酸pH7.5、0.1mM EDTA)稀釋後， 供HiTrap SP HP，以緩衝液(50mM Tris-鹽酸pH7.5、1M NaCl、0.1mM EDTA)進行梯度提取，收集含目的蛋白質之組分。將獲得之樣本填充於以緩衝液(25mM HEPES pH7.5、300mM NaCl、0.1mM EDTA)平衡好的凝膠過濾管柱(HiLoad 16/600 Superdex 75 pg：GE HEALTH CARE公司製)，收集含目的蛋白質之組分。將獲得之FGFR2D2以AMICON ULTRA-4(MERCK MILLIPORE公司製)濃縮為15mg/mL。
15)-2 人類化抗FGFR2抗體(hFR2-14_H3/L1)之Fab片段之製作
hFR2-14_H3/L1於20mM磷酸10mM EDTA(pH7.0)透析後，以AmiconUltra15 MWCO 10K(MILLIPORE公司製)濃縮為24mg/ml，製備1.9ml製備。添加以20mM磷酸10mM EDTA(pH7.0)製備為0.005mM之Cysteine(Sigma公司製)5.5ml與以20mM磷酸10mM EDTA(pH7.0)稀釋為1/100之木瓜酶(Sigma公司製)0.19ml，於37℃反應18小時。18小時後，添加以20mM磷酸10mM EDTA(pH7.0)溶解成120mM的N-ethylmaleimide(東京化成製)2.53ml，使反應停止。將反應液添加到經PBS平衡的MabSelect SuRe 5ml(GE HEALTH CARE公司製)，回收直接通過未結合之相當於Fab片段的組分18ml。以AmiconUltra15 MWCO 10K(MILLIPORE公司製)濃縮，添加經以50mM Tris-HCl、20mM NaCl(pH7.5)平衡化的Superdex200 16/60(GE HEALTH CARE公司製)，回收相當於Fab片段的組分18ml(以下記載為「H3L1Fab片段」)。
15)-3 H3L1Fab片段與FGFR2D2複合體試樣之製備
對於12.5mg/mL的H3L1Fab片段1mL，混合量為0.5mL之15mg/mL之FGFR2D2，於4℃放置一晚後，添加到經以結合緩衝液(50mM Tris-鹽酸pH8.0、400mM NaCl、20mM Imidazole)平衡化之HisTrap FF crude。以結合緩衝液洗滌之後，以提取緩衝液(50mM Tris-鹽酸pH8.0、400mM NaCl、500mM Imidazole)提取。添加到提取樣本以緩衝液(25mM Tris-HCl pH7.5、50mMNaCl)平衡化的凝膠過濾管柱(HiLoad 16/600 Superdex 200 pg：GE HEALTH CARE公司製)，回收相當於複合體之組分11mL。
15)-4 H3L1Fab片段與FGFR2D2複合體之結晶化與結構分析
將獲得之H3L1Fab與FGFR2D2之複合體濃縮為22mg/mL，用於結晶化。結晶化使用蒸氣擴散法。將在蛋白質溶液0.5至0.7μL加入等量沉澱劑溶液(1.225M硫酸銨、0.15M Tris-鹽酸pH8.5)而得之溶液，容納於裝有0.45mL之沉澱劑溶液的密閉容器，使兩溶液不互相接觸，於20℃靜置。3日後，獲得0.2mm×0.2mm×0.2mm之單晶。
將獲得之結晶浸於已加入30%(v/v)乙二醇的沉澱劑溶液，接著，於-180℃之氮氣流下冷凍。以高能量加速器研究機構放射光科學研究機構的BL5A收集於95K氮氣流下的X射線繞射數據。從獲得之繞射像，使用 軟體HKL2000(HKL公司製)將繞射強度予以數值化，求取結晶結構因子。結晶為正方晶系，空間群為P41212、結晶之單元晶格為a=b=60.57埃、c=331.2埃。
使用獲得之結構因子與FGFR2(PDB碼：從3OJ2抽出相應部分)及Fab(利用以前已進行結晶結構分析之抗體結構)的三維結構座標，實施分子取代法，決定相位。計算使用軟體phaser(CCP4：Collaborative Computational Project No.4)。結晶，於非對稱單元中含有1複合體。
使用軟體refmac5(CCP4)實施結構之精密化，並使用軟體coot實施模型之修正。重複此操作，獲得2.3埃分解能力最終之R值21.8%、freeR值25.8%。模型包括1個複合體而構成，包含：H3L1Fab之L鏈胺基酸殘基1-215、H鏈胺基酸殘基1-221、FGFR2D2之胺基酸殘基150-249、1個硫酸離子、及285個水分子。H3L1Fab之L鏈之C端1個殘基、H鏈之C端4個殘基、含FGFR2D2之His標籤及蛋白酶切斷處之N端20個殘基，電子密度各不明瞭，所以未建構模型。
距決定之H3L1Fab為4埃以內之FGFR2D2之胺基酸殘基如下：Tyr155、Thr157、Lys176、Ala181、Gly182、Gly183、Asn184、Pro185、Met186、Thr188、Gln200、Glu201、Gly205、Gly206、Lys208、Val209、Arg210、Asn211、Gln212、His213、Trp214、Ile217。第138圖中顯示複合體全體之彩帶(ribbon)模型、又第139圖中顯示FGFR2D2/H3L1Fab複合體結構中之D2區重疊 於FGFR2/FGF1之複合體結構(PDB碼：3OJ2)之相應部分的圖。
實施例16.使用大鼠抗FGFR2抗體FR2-10進行之免疫染色
16)-1 免疫染色用樣本之製備
16)-1-1 FGFR家族分子表現細胞株之製備
將293α細胞(實施例1)-6中記載)於含10% FBS之DMEM培養基中製備為6×106細胞/225cm2燒瓶(住友電木公司製)，於37℃、5% CO2培養一晚。使用FuGENE6(ROCHE DIAGNOSTIC公司製)，導入實施例1)-3-1、2)-1-1、及10)-2-1建構之FGFR1IIIb、FGFR1IIIc、FGFR2IIIb、FGFR2IIIc、FGFR3IIIb、FGFR3IIIc、及FGFR4之表現載體、或空載體，亦即，pcDNA-DEST40-FGFR1IIIb、pcDNA-DEST40-FGFR1IIIc、pcDNA-DEST40-FGFR2IIIb、pcDNA-DEST40-FGFR2IIIc、pcDNA-DEST40-FGFR3IIIb、pcDNA-DEST40-FGFR3IIIc、pcDNA-DEST40-FGFR4、及pcDNA-DEST40，於37℃、5%CO2之條件下培養二晚。將獲得之細胞使用TrypLExpress(Life Technology公司製)回收，離心成丸粒後，以PBS洗滌1次，離心並將獲得之丸粒以20%中性緩衝福馬林固定。
16)-1-2 FGFR2表現癌細胞株之製備
分別回收已於10%FBS/RPMI培養的人類胃癌株SNU-16及人類大腸癌株NCI-H716(從ATCC購買)，離心成丸粒後，以20%中性緩衝福馬林固定。回收經10%FBS/DMEM培養之人類胃癌株KATOIII(從ATCC購 買)，離心成丸粒後，以20%中性緩衝福馬林固定。
16)-1-3 FGFR2表現癌細胞株異種移殖模式腫瘤樣本之製作
將5×106細胞之SNU-16以50%MATRIGEL(日本Becton Dickinson股份有限公司製)懸浮，移植到裸小鼠(從CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj、日本Charles River購買)之腋窩部皮下。移植20日後回收腫瘤，以Mildform(和光純藥工業股份有限公司製)固定。
將3×105細胞之KATOIII以100%MATRIGEL(日本Becton Dickinson股份有限公司製)懸浮，移植到SCID小鼠(CB17/lcr-Prkdcsc□d/CrlCrlj、從日本Charles River購買)之腋窩部皮下。移植30日後回收腫瘤，以Mildform(和光純藥工業股份有限公司製)固定。
將2.5×106細胞之NCI-H716以100%MATRIGEL(從日本BD購買)懸浮，移植到裸小鼠(CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj、從日本Charles River購買)之腋窩部皮下。移植21日後回收腫瘤。
16)-2 石蠟包埋、薄切
石蠟包埋、薄切係一般方法，使用之器具或設備不特別限制。
將實施例16)-1-1、16)-1-2製備之細胞回收於15mL管，以1500rpm離心5分鐘，去除上清。於細胞丸粒重疊20%中性緩衝福馬林(和光純藥工業公司製)3mL，於室溫靜置30分鐘以上而固定。之後加入氯仿5mL，立即以1000rpm離心10分鐘，立即去除福馬林層後，回收形成 於福馬林層與氯仿層之間的細胞丸粒。將細胞丸粒放入尼龍網袋，並放入組織標本用匣(cassette)(uni cassette standard、Sakura Finetek Japan股份有限公司製)，將每個匣浸入乙醇，洗去氯仿。將實施例16)-1-3製作之異種移殖組織以Mildform(從和光純藥購買)固定後，修整切出面後放入匣。
細胞丸粒及異種移殖組織，係以通常之方法進行石蠟包埋。
使用自動固定包埋裝置(Tissue-Tek VIP5 junior：Sakura Finetek Japan股份有限公司製)進行脫水、脫脂、石蠟滲透。從自動固定包埋裝置取出匣，移到石蠟包埋團塊製作裝置(Tissue-Tek TEC plus：Sakura Finetek Japan股份有限公司製)之石蠟槽。於安裝在同裝置之包埋皿少量流入已熔解的石蠟，並於此包埋皿之石蠟內，以鎳子取出並放置從石蠟槽拿出的匣容器內、或尼龍網內之細胞丸粒或組織。其次在包埋皿之上乘載作為包埋框的匣，從上方流入熔解石蠟，將包括與細胞或組織成為一體之包埋框的包埋皿放置在冷卻部上進行冷卻。石蠟固化後，從包埋皿取出，作為包埋團塊之形式供薄切。薄切，係將上述製作之包埋團塊以切片機(IVS-410：Sakura Finetek Japan股份有限公司製)薄切為厚度3μm。已薄切之切片貼於防剝離之載玻片(Platina：松浪硝子工業股份有限公司製)。在50℃之石蠟伸展器(Sakura Finetek Japan股份有限公司製)上乾燥一晚，容納於載玻片盒，並保存於乾燥器內。
16)-3 染色
染色，係使用自動染色裝置(DISCOVERY Ultra：Ventana Medical Systems公司製)實施。染色過程之反應溫度為37℃，僅記載非此溫度的情況。各種試藥之添加液量均設為1滴。脫石蠟，係於EZ緩衝液(Ventana Medical Systems公司製)、68℃進行4分鐘溫育，更換液體3次以實施。以EZ緩衝液洗滌。於CCl緩衝液(Ventana Medical Systems公司製)、95℃更換4次液體，共計實施52分鐘。以反應緩衝液(Ventana Medical Systems公司製)洗滌4次。將大鼠抗FGFR2抗體FR2-10及市售抗體Anti-Human K-sam Rabbit IgG Affinity Purify(IBL公司製)分別以DISCOVERY專用抗體稀釋液(Ventana Medical Systems公司製)稀釋為10μg/mL及210μg/mL，反應1小時。以反應緩衝液洗滌4次後，與生物素化山羊抗大鼠IgG(Jackson immuno research公司製)以DISCOVERY專用抗體稀釋液所得之500倍稀釋液及Discovery Universal Secondary Antibody(Ventana Medical Systems公司製)反應32分鐘，以反應緩衝液洗滌2次。與抑制子D(inhibitor-D)(DAB map套組：Ventana Medical Systems公司製)反應8分鐘後，以反應緩衝液洗滌2次。與SA-HRP D(DAB map套組：Ventana Medical Systems公司製)反應16分鐘，以反應緩衝液洗滌2次。與DABD(DAB map套組：Ventana Medical Systems公司製)反應4分鐘後，添加DAB H2O2(DAB map套組：Ventana Medical Systems公司製)，反應8分鐘，以反應緩衝液洗滌2次。與 Copper-D(DAB map套組：Ventana Medical Systems公司製)反應4分鐘，以反應緩衝液洗滌3次。與蘇木素(Haematoxylin)核染色試藥II(Ventana Medical Systems公司製)反應4分鐘，以反應緩衝液洗滌2次。與碳酸鋰試藥(Ventana Medical Systems公司製)反應4分鐘，以反應緩衝液洗滌1次。
將染色完的標本以乙醇進行系列脫水，以二甲苯進行系列透明化後，與封入劑一起密封於蓋玻片。以光學顯微鏡觀察，評價係陽性反應產物之褐色之染色。
如第140圖所示，大鼠抗FGFR2抗體FR2-10，僅對於強制表現FGFR2IIIb之細胞團塊之一部分細胞有非常強染色。其他強制表現細胞、或空載體導入細胞，未認為有陽性染色。因此判斷大鼠抗FGFR2抗體FR2-10，可為FGFR2IIIb之專一的染色。
如第141圖所示，市售FGFR2抗體，對於SNU-16細胞(第141圖-D)、KATOIII細胞(第141圖-E)及NCI-H716細胞(第141圖-F)之團塊，有許多細胞可見到明顯的陽性染色，故確認該等細胞株係表現FGFR2蛋白質。另一方面，大鼠抗FGFR2抗體FR2-10，於SNU-16細胞(第141圖-A)、KATOIII細胞(第141圖-B)有許多細胞可見到明顯的陽性染色，但是NCI-H716細胞(第141圖-C)未認為有陽性染色，代表：NCI-H716細胞未表現FGFR2IIIb蛋白質。
再者，如第142圖所示，大鼠抗FGFR2抗體 FR2-10，於SNU-16細胞(第142圖-A)、KATOIII細胞(第142圖-B)之異種移殖腫瘤，在許多細胞可見到明顯的陽性染色，另一方面，NCI-H716細胞(第142圖-C)異種移殖腫瘤未認為有染色。
實施例17.人類化抗人類FGFR2抗體(hFR2-14)對於配體-受體間之結合的抑制活性
以ELISA偵測FGF7配體與抗原(C端附加His標籤的rhFGFR2alpha(IIIb))間之結合。將rhFGFR2alpha(IIIb)以PBS稀釋為2μg/ml，將100μl添加到96 well Clear Polystyrene High Bind Stripwell Microplate(康寧公司製)，於4℃放置一晚。次日，將溶液以抽氣機除去，以含0.05% Tween-20(BioRad公司製)之PBS洗滌3次後，添加含1% BSA(Sigma公司製)之PBS 200μl，於室溫放置1小時。將溶液除去後，以含0.05% Tween-20之PBS洗滌3次，各添加50μl的以含1% BSA之PBS稀釋為9ng/ml之FGF7、稀釋為300μg/ml之肝素(Sigma公司製)、稀釋為0.3至30μg/ml之實施例4)製備之cFR2-10、實施例8)製備之hFR2-14_H12/L1、實施例9)製備之hFR2-14_H19/L1抗體，於室溫放置2小時。將溶液除去後，以含0.05% Tween-20之PBS洗滌3次，添加100μl之經含1% BSA之PBS稀釋為180倍之生物素化抗FGF-7抗體(Human KGF/FGF-7 DuoSet、R&D公司製)，於室溫放置2小時。將溶液除去後，以含0.05% Tween-20之PBS洗滌3次，添加100μl之經含1% BSA之PBS稀釋200倍的Streptavisin-HRP(Human KGF/FGF-7 DuoSet、R&D公司 製)，遮光並於室溫放置20分鐘。將溶液除去後，以含0.05% Tween-20之PBS洗滌3次，添加100μl等量混合有Reagent A、Reagent B之基質溶液(Substrate Reagent Pack、R&D公司製)，遮光，於室溫放置20分鐘，進行發色反應。添加Stop solution(R&D公司製)50μl使反應停止後，以盤分析儀測定450nm、及570nm之吸光值，求取將450nm之測定值減去570nm之測定值之值。如第143圖，cFR2-10、hFR2-14_H12/L1、hFR2-14_H19/L1抗體，均有抑制配體對受體之結合之活性。
[產業上之可利用性]
藉由使用本發明提供之抗體，能進行各種癌之治療或預防、及各種癌之檢查或診斷。
[無序列表之文字]
序列編號1：與大鼠抗FGFR2抗體FR2-10之重鏈相當之譜帶之N端之胺基酸序列(第9圖)。
序列編號2：與大鼠抗FGFR2抗體FR2-10之輕鏈相當之譜帶之N端之胺基酸序列(第10圖)。
序列編號3：與大鼠抗FGFR2抗體FR2-13之重鏈相當之譜帶之N端之胺基酸序列(第11圖)。
序列編號4：與大鼠抗FGFR2抗體FR2-13之輕鏈相當之譜帶之N端之胺基酸序列(第12圖)。
序列編號5：與大鼠抗FGFR2抗體FR2-14重鏈相當之譜帶之N端之胺基酸序列(第13圖)。
序列編號6：與大鼠抗FGFR2抗體FR2-14之輕鏈相當之譜帶之N端之胺基酸序列(第14圖)。
序列編號7：大鼠重鏈放大用引子(第15圖)。
序列編號8：FR2-10重鏈用之定序引子(第16圖)。
序列編號9：FR2-13重鏈用之定序引子(第17圖)。
序列編號10：FR2-14重鏈用之定序引子(第18圖)。
序列編號11：編碼為大鼠抗FGFR2抗體FR2-10之重鏈可變區之cDNA之鹼基序列(第19圖)。
序列編號12：大鼠抗FGFR2抗體FR2-10之重鏈可變區之胺基酸序列(第20圖)。
序列編號13：編碼為大鼠抗FGFR2抗體FR2-13之重鏈可變區之cDNA之鹼基序列(第21圖)。
序列編號14：大鼠抗FGFR2抗體FR2-13之重鏈可變區之胺基酸序列(第22圖)。
序列編號15：編碼為大鼠抗FGFR2抗體FR2-14之重鏈可變區之cDNA之鹼基序列(第23圖)。
序列編號16：大鼠抗FGFR2抗體FR2-14之重鏈可變區之胺基酸序列(第24圖)。
序列編號17：大鼠輕鏈放大用引子(第25圖)。
序列編號18：大鼠輕鏈用之定序引子(第26圖)。
序列編號19：FR2-10輕鏈用之定序引子(第27圖)。
序列編號20：編碼為大鼠抗FGFR2抗體FR2-10之輕鏈之可變區之cDNA之鹼基序列(第28圖)。
序列編號21：大鼠抗FGFR2抗體FR2-10之輕鏈之可變區之胺基酸序列(第29圖)。
序列編號22：大鼠FR2-13及FR2-14輕鏈放大用引子(第30圖)。
序列編號23：編碼為大鼠抗FGFR2抗體FR2-13之輕鏈之可變區之cDNA之鹼基序列(第31圖)。
序列編號24：大鼠抗FGFR2抗體FR2-13之輕鏈之可變區之胺基酸序列(第32圖)。
序列編號25：編碼為大鼠抗FGFR2抗體FR2-14之輕鏈之可變區之cDNA之鹼基序列(第33圖)。
序列編號26：大鼠抗FGFR2抗體FR2-14之輕鏈之可變區之胺基酸序列(第34圖)。
序列編號27：包含編碼為人類κ鏈分泌訊息序列及人類κ鏈不變區之胺基酸之DNA序列的DNA片段(第35圖)。
序列編號28：輕鏈表現載體用引子F(第36圖)。
序列編號29：輕鏈表現載體用引子R(第37圖)。
序列編號30：包含編碼為人類重鏈訊息序列及人類IgG1不變區之胺基酸之DNA序列的DNA片段(第38圖)。
序列編號31：人類嵌合化FR2-10(cFR2-10)輕鏈之鹼基序列(第39圖)。
序列編號32：人類嵌合化FR2-10(cFR2-10)輕鏈之胺基酸序列(第40圖)。
序列編號33：人類嵌合化FR2-10輕鏈用引子組F(第41圖)。
序列編號34：人類嵌合化FR2-10輕鏈用引子組R(第42圖)。
序列編號35：人類嵌合化FR2-10(cFR2-10)重鏈之鹼 基序列(第43圖)。
序列編號36：人類嵌合化FR2-1O(cFR2-10)重鏈之胺基酸序列(第44圖)。
序列編號37：人類嵌合化FR2-10重鏈用引子組F(第45圖)。
序列編號38：人類嵌合化FR2-10重鏈用引子組R(第46圖)。
序列編號39：人類嵌合化FR2-13(cFR2-13)輕鏈之鹼基序列(第47圖)。
序列編號40：人類嵌合化FR2-13(cFR2-13輕鏈之胺基酸序列(第48圖)。
序列編號41：人類嵌合化FR2-13輕鏈用引子F(第49圖)。
序列編號42：人類嵌合化FR2-13輕鏈用引子R(第50圖)。
序列編號43：人類嵌合化FR2-13(cFR2-13)重鏈之鹼基序列(第51圖)。
序列編號44：人類嵌合化FR2-13(cFR2-13)重鏈之胺基酸序列(第52圖)。
序列編號45：人類嵌合化FR2-13重鏈用引子F(第53圖)。
序列編號46：人類嵌合化FR2-13重鏈用引子R(第54圖)。
序列編號47：人類嵌合化FR2-14(cFR2-14)輕鏈之鹼基序列(第55圖)。
序列編號48：人類嵌合化FR2-14(cFR2-14)輕鏈之胺基酸序列(第56圖)。
序列編號49：人類嵌合化FR2-14輕鏈用引子(第57圖)。
序列編號50：人類嵌合化FR2-14(cFR2-14)重鏈之鹼基序列(第58圖)。
序列編號51：人類嵌合化FR2-14(cFR2-14)重鏈之胺基酸序列(第59圖)。
序列編號52：大鼠抗FGFR2抗體FR2-10之重鏈CDR1之胺基酸序列(第60圖)。
序列編號53：大鼠抗FGFR2抗體FR2-10之重鏈CDR2之胺基酸序列(第61圖)
序列編號54：大鼠抗FGFR2抗體FR2-10之重鏈CDR3之胺基酸序列(第62圖)
序列編號55：大鼠抗FGFR2抗體FR2-13之重鏈CDR1之(第63圖)
序列編號56：大鼠抗FGFR2抗體FR2-13之重鏈CDR2之胺基酸序列(第64圖)
序列編號57：大鼠抗FGFR2抗體FR2-13之重鏈CDR3之胺基酸序列(第65圖)
序列編號58：大鼠抗FGFR2抗體FR2-14之重鏈CDR1之胺基酸序列(第66圖)
序列編號59：大鼠抗FGFR2抗體FR2-14之重鏈CDR2之胺基酸序列(第67圖)
序列編號60：大鼠抗FGFR2抗體FR2-14之重鏈CDR3 之胺基酸序列(第68圖)
序列編號61：大鼠抗FGFR2抗體FR2-10之輕鏈CDR1之胺基酸序列(第69圖)
序列編號62：大鼠抗FGFR2抗體FR2-10之輕鏈CDR2之胺基酸序列(第70圖)
序列編號63：大鼠抗FGFR2抗體FR2-10之輕鏈CDR3之胺基酸序列((第71圖)
序列編號64：大鼠抗FGFR2抗體FR2-13之輕鏈CDR1之胺基酸序列(第72圖)
序列編號65：大鼠抗FGFR2抗體FR2-13之輕鏈CDR2之胺基酸序列(第73圖)
序列編號66：大鼠抗FGFR2抗體FR2-13之輕鏈CDR3之胺基酸序列(第74圖)
序列編號67：大鼠抗FGFR2抗體FR2-14之輕鏈CDR1之胺基酸序列(第75圖)
序列編號68：大鼠抗FGFR2抗體FR2-14之輕鏈CDR2之胺基酸序列(第76圖)
序列編號69：大鼠抗FGFR2抗體FR2-14之輕鏈CDR3之胺基酸序列(第77圖)
序列編號70：人類FGFR2IIIb之胺基酸序列(第78圖)
序列編號71：人類FGFR2IIIc之胺基酸序列(第79圖)
序列編號72：人類化FR2-14輕鏈(hFR2-14_L1)之鹼基序列(第80圖)
序列編號73：人類化FR2-14輕鏈(hFR2-14_L1)之胺基酸序列(第81圖)
序列編號74：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H1)之鹼基序列(第82圖)
序列編號75：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H1)之胺基酸序列(第83圖)
序列編號76：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H2)之鹼基序列(第84圖)
序列編號77：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H2)之胺基酸序列(第85圖)
序列編號78：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H3)之鹼基序列(第86圖)
序列編號79：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H3)之胺基酸序列(第87圖)
序列編號80：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H4)之鹼基序列(第88圖)
序列編號81：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H4)之胺基酸序列(第89圖)
序列編號82：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H5)之鹼基序列(第90圖)
序列編號83：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H5)之胺基酸序列(第91圖)
序列編號84：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H6)之鹼基序列(第92圖)
序列編號85：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H6)之胺基酸序列(第93圖)
序列編號86：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H7)之鹼 基序列(第94圖)
序列編號87：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H7)之胺基酸序列(第95圖)
序列編號88：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H8)之鹼基序列(第96圖)
序列編號89：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H8)之胺基酸序列(第97圖)
序列編號90：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H9)之鹼基序列(第98圖)
序列編號91：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H9)之胺基酸序列(第99圖)
序列編號92：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H10)之鹼基序列(第100圖)
序列編號93：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H10)之胺基酸序列(第101圖)
序列編號94：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H11)之鹼基序列(第102圖)
序列編號95：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H11)之胺基酸序列(第103圖)
序列編號96：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H12及fFR2-14_H19)之鹼基序列(第104圖)
序列編號97：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H12及fFR2-14_H19)之胺基酸序列(第105圖)
序列編號98：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H13)之鹼基序列(第106圖)
序列編號99：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H13)之胺基酸序列(第107圖)
序列編號100：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H14)之鹼基序列(第108圖)
序列編號101：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H14)之胺基酸序列(第109圖)
序列編號102：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H15)之鹼基序列(第110圖)
序列編號103：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H15)之胺基酸序列(第111圖)
序列編號104：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H16)之鹼基序列(第112圖)
序列編號105：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H16)之胺基酸序列(第113圖)
序列編號106：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H17)之鹼基序列(第114圖)
序列編號107：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H17)之胺基酸序列(第115圖)
序列編號108：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H18)之鹼基序列(第116圖)
序列編號109：人類化FR2-14重鏈(hFR2-14_H18)之胺基酸序列(第117圖)
序列編號110：hFR2-14_H2型重鏈用引子VH3A-F(第118圖)。
序列編號111：hFR2-14_H2型重鏈用引子VH3A-R( 第119圖)。
序列編號112：D2放大用引子D23fw(第120圖)
序列編號113：D2放大用引子D23rv(第121圖)
<110> DAIICHI SANYKO CO.,LTD.
<120> 抗FGFR2抗體
<130> FP1320WO
<160> 113
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 1
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 2
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 3
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 4
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 5
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 6
<210> 7
<211> 28
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 7
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<400> 8
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<400> 9
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<400> 10
<210> 11
<211> 366
<212> DNA
<213> 大鼠
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(366)
<400> 11
<210> 12
<211> 122
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 12
<210> 13
<211> 354
<212> DNA
<213> 大鼠
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(354)
<400> 13
<210> 14
<211> 118
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 14
<210> 15
<211> 354
<212> DNA
<213> 大鼠
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(354)
<400> 15
<210> 16
<211> 118
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 16
<210> 17
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成序列
<400> 17
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<400> 18
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 合成序列
<400> 19
<210> 20
<211> 327
<212> DNA
<213> 大鼠
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(327)
<400> 20
<210> 21
<211> 109
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 21
<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> 合成序列
<400> 22
<210> 23
<211> 330
<212> DNA
<213> 大鼠
<220>
<221> CDA
<222> (1)..(330)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(330)
<400> 23
<210> 24
<211> 110
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 24
<210> 25
<211> 330
<212> DNA
<213> 大鼠
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(330)
<400> 25
<210> 26
<211> 110
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 26
<210> 27
<211> 449
<212> DNA
<213> 智人
<400> 27
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> 合成序列
<400> 28
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 合成序列
<400> 29
<210> 30
<211> 1132
<212> DNA
<213> 智人
<400> 30
<210> 31
<211> 702
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(702)
<400> 31
<210> 32
<211> 234
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 32
<210> 33
<211> 48
<212> DNA
<213> 合成序列
<400> 33
<210> 34
<211> 44
<212> DNA
<213> 合成序列
<400> 34
<210> 35
<211> 1413
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1413)
<400> 35
<210> 36
<211> 471
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 36
<210> 37
<211> 47
<212> DNA
<213> 合成序列
<400> 37
<210> 38
<211> 48
<212> DNA
<213> 合成序列
<400> 38
<210> 39
<211> 705
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(705)
<400> 39
<210> 40
<211> 235
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 40
<210> 41
<211> 48
<212> DNA
<213> 合成序列
<400> 41
<210> 42
<211> 45
<212> DNA
<213> 合成序列
<400> 42
<210> 43
<211> 1401
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1401)
<400> 43
<210> 44
<211> 467
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 44
<210> 45
<211> 47
<212> DNA
<213> 合成序列
<400> 45
<210> 46
<211> 46
<212> DNA
<213> 合成序列
<400> 46
<210> 47
<211> 705
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(705)
<400> 47
<210> 48
<211> 235
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 48
<210> 49
<211> 45
<212> DNA
<213> 合成序列
<400> 49
<210> 50
<211> 1401
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1401)
<400> 50
<210> 51
<211> 467
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 51
<210> 52
<211> 5
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 52
<210> 53
<211> 17
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 53
<210> 54
<211> 13
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 54
<210> 55
<211> 5
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 55
<210> 56
<211> 17
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 56
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 57
<210> 58
<211> 5
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 58
<210> 59
<211> 17
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 59
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 60
<210> 61
<211> 11
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 61
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 62
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 63
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 64
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 65
<210> 66
<211> 10
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 66
<210> 67
<211> 11
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 67
<210> 68
<211> 7
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 68
<210> 69
<211> 10
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 69
<210> 70
<211> 822
<212> PRT
<213> 智人
<400> 70
<210> 71
<211> 821
<212> PRT
<213> 智人
<400> 71
<210> 72
<211> 705
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(705)
<400> 72
<210> 73
<211> 235
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 73
<210> 74
<211> 1401
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1401)
<400> 74
<210> 75
<211> 467
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 75
<210> 76
<211> 1401
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1401)
<400> 76
<210> 77
<211> 467
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 77
<210> 78
<211> 1401
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1401)
<400> 78
<210> 79
<211> 467
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 79
<210> 80
<211> 1401
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1401)
<400> 80
<210> 81
<211> 467
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 81
<210> 82
<211> 1401
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1401)
<400> 82
<210> 83
<211> 467
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 83
Pro Gly Lys
465
<210> 84
<211> 1401
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1401)
<400> 84
<210> 85
<211> 467
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 85
<210> 86
<211> 1401
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1401)
<400> 86
<210> 87
<211> 467
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 87
<210> 88
<211> 1401
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1401)
<400> 88
<210> 89
<211> 467
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 89
<210> 90
<211> 1401
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1401)
<400> 90
<210> 91
<211> 467
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 91
<210> 92
<211> 1401
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1401)
<400> 92
<210> 93
<211> 467
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 93
<210> 94
<211> 1401
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1401)
<400> 94
<210> 95
<211> 467
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 95
<210> 96
<211> 1401
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1401)
<400> 96
<210> 97
<211> 467
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 97
<210> 98
<211> 1401
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1401)
<400> 98
<210> 99
<211> 467
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 99
<210> 100
<211> 1401
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1401)
<400> 100
<210> 101
<211> 467
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 101
<210> 102
<211> 1401
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1401)
<400> 102
<210> 103
<211> 467
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 103
<210> 104
<211> 1401
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1401)
<400> 104
<210> 105
<211> 467
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 105
<210> 106
<211> 1401
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1401)
<400> 106
<210> 107
<211> 467
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 107
<210> 108
<211> 1401
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1401)
<400> 108
<210> 109
<211> 467
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 109
<210> 110
<211> 39
<212> DNA
<213> 合成序列
<400> 110
<210> 111
<211> 39
<212> DNA
<213> 合成序列
<400> 111
<210> 112
<211> 39
<212> DNA
<213> 合成序列
<400> 112
<210> 113
<211> 42
<212> DNA
<213> 合成序列
<400> 113

Claims (54)

  1. 一種抗體或其功能性片段，其具有抗體依賴性細胞傷害活性且結合於纖維母細胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor：FGFR)，該抗體或其功能性片段係包含重鏈及輕鏈且結合於人類FGFR2，其中重鏈包含序列表之序列編號52所示的胺基酸序列所構成的CDRH1、序列表之序列編號53所示的胺基酸序列所構成的CDRH2及序列表之序列編號54所示的胺基酸序列所構成的CDRH3；以及輕鏈包含序列表之序列編號61所示的胺基酸序列所構成的CDRL1、序列表之序列編號62所示的胺基酸序列所構成的CDRL2及序列表之序列編號63所示的胺基酸序列所構成的CDRL3；該抗體或其功能性片段係包含重鏈及輕鏈且結合於人類FGFR2，其中重鏈包含序列表之序列編號55所示的胺基酸序列所構成的CDRH1、序列表之序列編號56所示的胺基酸序列所構成的CDRH2及序列表之序列編號57所示的胺基酸序列所構成的CDRH3；以及輕鏈包含序列表之序列編號64所示的胺基酸序列所構成的CDRL1、序列表之序列編號65所示的胺基酸序列所構成的CDRL2及序列表之序列編號66所示的胺基酸序列所構成的CDRL3；或該抗體或其功能性片段係包含重鏈及輕鏈且結合於人類FGFR2，其中重鏈包含序列表之序列編號58所示的胺基酸序列所構成的CDRH1、序列表之序列編號59所示的胺基酸序列所構成的CDRH2及序列表之序列編號60所示的胺基酸序列或者於該胺基酸序列有1個胺基酸取代的胺基酸序列所構成的CDRH3，以及輕鏈包含序列表之序列編號67所示的胺基酸序列所構成的CDRL1、序列表之序列編號68所示的胺基酸序列所構成的CDRL2及序列表之序列編號69所示的胺基酸序列所構成的CDRL3。
  2. 如申請專利範圍第1項之抗體或其功能性片段，其中，該纖維母細胞生長因子受體(FGFR)為人類FGFR。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之抗體或其功能性片段，其中，該纖維母細胞生長因子受體(FGFR)為FGFR2。
  4. 如申請專利範圍第1或2項之抗體或其功能性片段，其係結合於人類纖維母細胞生長因子受體2(人類FGFR2)IIIb及/或人類纖維母細胞生長因子受體2(人類FGFR2)IIIc。
  5. 如申請專利範圍第1或2項之抗體或其功能性片段，其係結合於人類纖維母細胞生長因子受體2(人類FGFR2)IIIb及人類纖維母細胞生長因子受體(人類FGFR2)IIIc。
  6. 如申請專利範圍第1或2項之抗體或其功能性片段，其係結合於人類纖維母細胞生長因子受體2具有之類免疫球蛋白區域之一個或二個以上。
  7. 如申請專利範圍第1或2項之抗體或其功能性片段，其係結合於人類纖維母細胞生長因子受體2具有之類免疫球蛋白區域2。
  8. 如申請專利範圍第1或2項之抗體或其功能性片段，其係結合於人類纖維母細胞生長因子受體2具有之類免疫球蛋白區域3。
  9. 如申請專利範圍第1或2項之抗體或其功能性片段，其對於人類纖維母細胞生長因子受體2(人類FGFR2)IIIb及/或人類纖維母細胞生長因子受體2(人類FGFR2)IIIc具有中和活性。
  10. 如申請專利範圍第1或2項之抗體或其功能性片段，其對於人類纖維母細胞生長因子受體2(人類FGFR2)IIIb及人類纖維母細胞生長因子受體2(人類FGFR2)IIIc具有中和活性。
  11. 如申請專利範圍第1或2項之抗體或其功能性片段，其具有抗腫瘤活性。
  12. 如申請專利範圍第11項之抗體或其功能性片段，其於體內(in vivo)顯示抗腫瘤活性。
  13. 如申請專利範圍第1或2項之抗體或其功能性片段，其中，該抗體為單株抗體。
  14. 如申請專利範圍第1或2項之抗體或其功能性片段，其中，該抗體為嵌合抗體。
  15. 如申請專利範圍第1或2項之抗體或其功能性片段，其中，該抗體為人類化抗體。
  16. 如申請專利範圍第15項之抗體或其功能性片段，其中，該抗體係選自於下列(i)至(xviii)：(i)包含含序列編號73所示之胺基酸序列之胺基酸編號21至235的輕鏈及含序列編號97所示之胺基酸序列之胺基酸編號20至467之重鏈而成的人類化抗體；(ii)包含含序列編號73所示之胺基酸序列之胺基酸編號21至235之輕鏈及含序列編號89所示之胺基酸序列之胺基酸編號20至467之重鏈而成的人類化抗體；(iii)包含含序列編號73所示之胺基酸序列之胺基酸編號21至235之輕鏈及含序列編號95所示之胺基酸序列之胺基酸編號20至467之重鏈而成的人類化抗體；(iv)包含含序列編號73所示之胺基酸序列之胺基酸編號21至235之輕鏈及含序列編號83所示之胺基酸序列之胺基酸編號20至467之重鏈而成的人類化抗體；(v)包含含序列編號73所示之胺基酸序列之胺基酸編號21至235之輕鏈及含序列編號75所示之胺基酸序列之胺基酸編號20至467之重鏈而成的人類化抗體；(vi)包含含序列編號73所示之胺基酸序列之胺基酸編號21至235之輕鏈及含序列編號77所示之胺基酸序列之胺基酸編號20至467之重鏈而成之人類化抗體；(vii)包含含序列編號73所示之胺基酸序列之胺基酸編號21至235之輕鏈及含序列編號79所示之胺基酸序列之胺基酸編號20至467之重鏈而成之人類化抗體；(viii)包含含序列編號73所示之胺基酸序列之胺基酸編號21至235之輕鏈及含序列編號81所示之胺基酸序列之胺基酸編號20至467之重鏈而成之人類化抗體；(ix)包含含序列編號73所示之胺基酸序列之胺基酸編號21至235之輕鏈及含序列編號85所示之胺基酸序列之胺基酸編號20至467之重鏈而成之人類化抗體；(x)包含含序列編號73所示之胺基酸序列之胺基酸編號21至235之輕鏈及含序列編號87所示之胺基酸序列之胺基酸編號20至467之重鏈而成之人類化抗體；(xi)包含含序列編號73所示之胺基酸序列之胺基酸編號21至235之輕鏈及含序列編號91所示之胺基酸序列之胺基酸編號20至467之重鏈而成之人類化抗體；(xii)包含含序列編號73所示之胺基酸序列之胺基酸編號21至235之輕鏈及含序列編號93所示之胺基酸序列之胺基酸編號20至467之重鏈而成之人類化抗體；(xiii)包含含序列編號73所示之胺基酸序列之胺基酸編號21至235之輕鏈及含序列編號99所示之胺基酸序列之胺基酸編號20至467之重鏈而成之人類化抗體；(xiv)包含含序列編號73所示之胺基酸序列之胺基酸編號21至235之輕鏈及含序列編號101所示之胺基酸序列之胺基酸編號20至467之重鏈而成之人類化抗體；(xv)包含含序列編號73所示之胺基酸序列之胺基酸編號21至235之輕鏈及含序列編號103所示之胺基酸序列之胺基酸編號20至467之重鏈而成之人類化抗體；(xvi)包含含序列編號73所示之胺基酸序列之胺基酸編號21至235之輕鏈及含序列編號105所示之胺基酸序列之胺基酸編號20至467之重鏈而成之人類化抗體；(xvii)包含含序列編號73所示之胺基酸序列之胺基酸編號21至235之輕鏈及含序列編號107所示之胺基酸序列之胺基酸編號20至467之重鏈而成之人類化抗體；及(xviii)包含含序列編號73所示之胺基酸序列之胺基酸編號21至235之輕鏈及含序列編號109所示之胺基酸序列之胺基酸編號20至467之重鏈而成之人類化抗體。
  17. 如申請專利範圍第1或2項之抗體或其功能性片段，其係結合於如申請專利範圍第1或16項之抗體所辨識之抗原上之部位。
  18. 如申請專利範圍第1或2項之抗體或其功能性片段，其係與如申請專利範圍第1或16項之抗體競爭與人類FGFR2之結合。
  19. 如申請專利範圍第1或2項之抗體或其功能性片段，其係結合於包含序列編號70所示之胺基酸序列中之155號之酪胺酸(Tyr)、157號之蘇胺酸(Thr)、176號之離胺酸(Lys)、181號之丙胺酸(Ala)、182號之甘胺酸(Gly)、183號之甘胺酸(Gly)、184號之天冬醯胺酸(Asn)、185號之脯胺酸(Pro)、186號之甲硫胺酸(Met)、188號之蘇胺酸(Thr)、200號之麩醯胺酸(Gln)、201號之麩胺酸(Glu)、205號之甘胺酸(Gly)、206號之甘胺酸(Gly)、208號之離胺酸(Lys)、209號之纈胺酸(Val)、210號之精胺酸(Arg)、211號之天冬醯胺酸(Asn)、212號之麩醯胺酸(Gln)、213號之組胺酸(His)、214號之色胺酸(Trp)、及217號之異白胺酸(Ile)之各殘基而構成之人類FGFR2上之抗原決定位。
  20. 如申請專利範圍第1項之抗體或其功能性片段，其與序列編號70所示之胺基酸序列中之155號之酪胺酸(Tyr)、157號之蘇胺酸(Thr)、176號之離胺酸(Lys)、181號之丙胺酸(Ala)、182號之甘胺酸(Gly)、183號之甘胺酸(Gly)、184號之天冬醯胺酸(Asn)、185號之脯胺酸(Pro)、186號之甲硫胺酸(Met)、188號之蘇胺酸(Thr)、200號之麩醯胺酸(Gln)、201號之麩胺酸(Glu)、205號之甘胺酸(Gly)、206號之甘胺酸(Gly)、208號之離胺酸(Lys)、209號之纈胺酸(Val)、210號之精胺酸(Arg)、211號之天冬醯胺酸(Asn)、212號之麩醯胺酸(Gln)、213號之組胺酸(His)、214號之色胺酸(Trp)、及217號之異白胺酸(Ile)之各殘基之間具有交互作用距離。
  21. 如申請專利範圍第20項之抗體或其功能性片段，其中，該交互作用距離為6埃以下。
  22. 如申請專利範圍第20或21項之抗體或其功能性片段，其中，該交互作用距離為4埃以下。
  23. 如申請專利範圍第1或2項之抗體或其功能性片段，其中，該抗體為人類抗體。
  24. 如申請專利範圍第1或2項之抗體或其功能性片段，其抑制FGF對於人類FGFR2之結合。
  25. 如申請專利範圍第1或2項之抗體或其功能性片段，其具有抗體依賴性細胞傷害活性及/或抗體依賴性細胞媒介吞噬活性。
  26. 如申請專利範圍第1或2項之抗體或其功能性片段，其中，重鏈羧基末端有1至5個胺基酸缺失。
  27. 如申請專利範圍第1或2項之抗體或其功能性片段，其係與其他化合物結合(conjugate)者。
  28. 一種核苷酸，其係下列(i)或(ii)之核苷酸：(i)包含編碼為如申請專利範圍第1至27項中任一項之抗體之重鏈或輕鏈之全部胺基酸序列的鹼基序列而成之核苷酸；(ii)由編碼為如申請專利範圍第1至27項中任一項之抗體之重鏈或輕鏈之全部胺基酸序列的鹼基序列構成之核苷酸。
  29. 一種重組載體，其係插入有如申請專利範圍第28項之核苷酸。
  30. 一種重組細胞，係導入有如申請專利範圍第28項之核苷酸或如申請專利範圍第29項之重組載體。
  31. 一種抗體或其功能性片段之製造方法，其係製造如申請專利範圍第1或2項之抗體或其功能性片段之方法，包含下列步驟(i)及(ii)：(i)培養如申請專利範圍第30項之細胞；及(ii)從該步驟(i)獲得之培養物回收如申請專利範圍第1或2項之抗體或其功能性片段。
  32. 如申請專利範圍第1或2項之抗體或其功能性片段，其係利用如申請專利範圍第31項之方法而獲得。
  33. 一種修飾體，其係如申請專利範圍第1至27及32項中任一項之抗體或其功能性片段之修飾體，其中該修飾體為包含選自下列組成的群組之1或2種以上的修飾：對N-鍵結之糖鏈附加、對O-鍵結之糖鏈附加、N末端之處理、C末端之處理、脫醯胺化、天冬胺酸之異構化、甲硫胺酸之氧化、脯胺酸殘基之醯胺化及重鏈或輕鏈之羧基末端中的1至5個胺基酸的缺失。
  34. 如申請專利範圍第33項之修飾體，其係糖鏈修飾經調節而成。
  35. 如申請專利範圍第34項之修飾體，其中，該抗體係選自於如申請專利範圍第16項之(i)至(xix)中任一者。
  36. 如申請專利範圍第33至35中任一項之修飾體，其係與其他化合物結合(conjugate)者。
  37. 一種醫藥組成物，其係包含如申請專利範圍第1至27及32項中任一項之抗體或其功能性片段、或如申請專利範圍第33至36項中任一項之修飾體作為有效成分而成。
  38. 如申請專利範圍第37項之醫藥組成物，其係抗癌劑。
  39. 如申請專利範圍第38項之醫藥組成物，其中，該癌為FGFR2陽性。
  40. 一種癌檢查用或診斷用之組成物，係包含如申請專利範圍第1至27及32項中任一項之抗體或其功能性片段、或如申請專利範圍第33至36項中任一項之修飾體而成。
  41. 一種組成物，其係包含具有人類FGFR2IIIb選擇性之抗體或其功能性片段或其修飾體，其中該組成物係包含：包含重鏈及輕鏈且結合於人類FGFR2之抗體或其功能性片段或其修飾體，其中重鏈包含序列表之序列編號52所示的胺基酸序列所構成的CDRH1、序列表之序列編號53所示的胺基酸序列所構成的CDRH2及序列表之序列編號54所示的胺基酸序列所構成的CDRH3；以及輕鏈包含序列表之序列編號61所示的胺基酸序列經取代而成的胺基酸序列的CDRL1、序列表之序列編號62所示的胺基酸序列所構成的CDRL2及序列表之序列編號63所示的胺基酸序列所構成的CDRL3；包含重鏈及輕鏈結合於人類FGFR2之抗體或其功能性片段或其修飾體，其中重鏈包含序列表之序列編號55所示的胺基酸序列所構成的CDRH1、序列表之序列編號56所示的胺基酸序列所構成的CDRH2及序列表之序列編號57所示的胺基酸序列所構成的CDRH3；以及輕鏈包含序列表之序列編號64所示的胺基酸序列所構成的CDRL1、序列表之序列編號65所示的胺基酸序列所構成的CDRL2及序列表之序列編號66所示的胺基酸序列所構成的CDRL3；或包含重鏈及輕鏈且結合於人類FGFR2之抗體或其功能性片段或其修飾體，其中重鏈包含序列表之序列編號58所示的胺基酸序列所構成的CDRH1、序列表之序列編號59所示的胺基酸序列所構成的CDRH2及序列表之序列編號60所示的胺基酸序列或者於該胺基酸序列有1個胺基酸取代的胺基酸序列所構成的CDRH3，以及輕鏈包含序列表之序列編號67所示的胺基酸序列所構成的CDRL1、序列表之序列編號68所示的胺基酸序列所構成的CDRL2及序列表之序列編號69所示的胺基酸序列所構成的CDRL3。
  42. 如申請專利範圍第41項之組成物，其中，該抗體係含CDRH1至CDRH3之重鏈及含CDRL1至CDRL3之輕鏈而成。
  43. 如申請專利範圍第42項之組成物，其中，該抗體係包含具有序列編號12所示之胺基酸序列之重鏈可變區及具有序列編號21所示之胺基酸序列之輕鏈可變區而成。
  44. 如申請專利範圍第42項之組成物，其中，該抗體為嵌合抗體或大鼠抗體。
  45. 如申請專利範圍第43項之組成物，其中，該抗體為嵌合抗體或大鼠抗體。
  46. 如申請專利範圍第41至44項中任一項之組成物，其係人類FGFR2IIIb之偵測用或測定用。
  47. 如申請專利範圍第40至45項中任一項之組成物，其係人類FGFR2陽性癌之診斷或檢查用。
  48. 一種活體外偵測或測定人類FGFR2IIIb之方法，其係包含使如申請專利範圍第41至44項中任一項之組成物與待驗樣本接觸之步驟。
  49. 一種活體外偵測或測定人類FGFR2IIIc之方法，係包含下列步驟(i)至(iii)：(i)使包含對於人類FGFR2IIIb與人類FGFR2IIIc選擇性結合之抗體或其功能性片段或其修飾體的組成物接觸待驗樣本，並偵測或測定待驗樣本中之人類FGFR2IIIb與人類FGFR2IIIc；(ii)使如申請專利範圍第41至46項中任一項之組成物接觸待驗樣本，並偵測或測定待驗樣本中之人類FGFR2IIIb；(iii)將步驟(i)中之偵測或測定之結果與步驟(ii)中之偵測或測定之結果比較、或將步驟(i)中之偵測或測定之結果減去步驟(ii)中之偵測或測定之結果，以獲得待驗樣本中之人類FGFR2IIIc之偵測或測定之結果或值。
  50. 如申請專利範圍第48或49項之方法，其係人類FGFR2陽性癌之診斷或檢查用。
  51. 一種鑑定方法，係鑑定可投予如申請專利範圍第37至39項中任一項之醫藥組成物之個體之方法，包含下列步驟(i)至(ii)：(i)於活體外使如申請專利範圍第40至46項中任一項之組成物接觸來自個體之樣本的步驟；及(ii)於該樣本中檢測到人類FGFR2的情形，判定該個體為可投予如申請專利範圍第37至39項中任一項之醫藥組成物之個體的步驟。
  52. 如申請專利範圍第51項之鑑定方法，其中，該人類FGFR2為人類FGFR2IIIb。
  53. 如申請專利範圍第51項之鑑定方法，其中，該人類FGFR2為人類FGFR2IIIc及人類FGFR2IIIb。
  54. 如申請專利範圍第51至53項中任一項之鑑定方法，其中，該個體係罹癌或有罹癌風險。
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