CN104334724A - 抗-fgfr2抗体 - Google Patents

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Abstract

一种结合成纤维细胞生长因子受体的抗体。

Description

抗-FGFR2抗体
技术领域
本发明涉及一种新颖的抗体、包含编码所述抗体的氨基酸序列的核苷酸序列的核苷酸、具有所述核苷酸的插入物的载体、包含所述核苷酸或所述载体的细胞、包括培养所述细胞的步骤的生产所述抗体的方法、包含所述抗体的药物组合物、包含所述抗体的诊断用组合物、所述抗体的功能片段、所述抗体的修饰形式等。
背景技术
已知成纤维细胞生长因子(FGF)在胚胎发生、组织体内稳态和经由FGF受体(FGFR)信号的代谢中起重要作用(非专利文献1)。在人类中，发现了22种FGF (FGF1至FGF14和FGF16至FGF23)和4种具有酪氨酸激酶结构域的FGF受体(FGFR1至FGFR4；在下文中，被统称为“FGFR”)。这些FGFR各自由以下区域构成：细胞外区域，其包含由2个或3个免疫球蛋白样结构域(IgD1至IgD3)组成的配体结合位点；单次穿过跨膜区域；和细胞内区域，其包含酪氨酸激酶结构域。FGFR1、FGFR2和FGFR3各自具有2种被称作IIIb和IIIc的剪接变体。这些亚型的差别在于在IgD3的后一半中的大约50个氨基酸的序列，并且表现出独特的组织分布和配体特异性。普遍已知的是，IIIb亚型在上皮细胞中表达，而IIIc亚型在间充质细胞中表达。在FGF与FGFR结合以后，这些FGFR二聚化并在它们的特定酪氨酸残基处磷酸化。该现象促进重要的衔接蛋白诸如FGFR底物2α(FRS2α)的募集，并诱导许多信号传递途径(包括MAPK和PI3K/Akt途径)的活化。所以，FGF和它们的对应受体控制宽范围的细胞功能，包括生长、分化、迁移和存活。
已知FGFR的异常活化参与人类中特定类型的恶性肿瘤发展(非专利文献1和2)。具体地，关于FGFR2信号异常与癌症的关联已经做出发现诸如FGFR2和它的配体的过表达、受体突变或基因扩增、和亚型转换。具体地，据报道，在FGFR2基因的内含子2中的单核苷酸多态性(SNP)与由FGFR2的高表达造成的乳腺癌进展风险相关联(非专利文献3和4)。已经报道了在子宫内膜癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌和胃癌中组成性地活化FGFR2的错义突变(非专利文献2、3和5)。并且，已经报道了在胃癌和乳腺癌中的FGFR2基因的扩增或过表达(非专利文献2、3和5)。另外，还已知从FGFR2 IIIb至FGFR2 IIIc的类别转换发生在前列腺癌或肾癌的进展过程中，并且与预后不良相关联(非专利文献6和7)。
如上所述，FGFR2过表达或突变或从IIIb至IIIc的转换与许多癌症类型的关联提示FGFR2作为癌症的优良治疗靶标的可能性。实际上，已经得到了针对FGFR2的单克隆抗体，并且正在临床前试验中评价它们的抗肿瘤作用，以揭示FGFR2在癌发生中的作用和确定FGFR2作为癌症的治疗靶标的可能性(非专利文献8和9)。已经证实所有这些抗体具有抑制从FGFR2 IIIb的配体衍生出的信号传递的中和作用。不幸的是，没有报道对IIIc具有效应物作用诸如ADCC或中和作用的功能性抗体。
引文列表
非专利文献
非专利文献1: Eswarakumar, V.P., 等人, J. Cytokine Growth Factor Rev., 2005年4月, 第16卷(第2期), 第139-149页，于2005年2月1日在线公开，综述
非专利文献2: Turner, N. 和Grose, R., Nat. Rev. Cancer, 2010年2月, 第10卷(第2期), 第116-129页，综述
非专利文献3: Easton, D.F., 等人, Nature, 2007年6月28日, 第447卷(第7148期), 第1087-1093页
非专利文献4: Hunter DJ, 等人, Nat. Genet., 2007年7月, 第39卷(第7期), 第870-874页，于2007年5月27日在线公开
非专利文献5: Katoh, Y. 和Katoh, M., Int. J. Mol. Med., 2009年3月, 第23卷(第3期), 第307-311页，综述
非专利文献6: Chaffer, C.L., 等人, Differentiation, 2007年11月, 第75卷(第9期), 第831-842页，于2007年8月14日在线公开，综述
非专利文献7: Carstens, R.P., 等人, Oncogene, 1997年12月18日, 第15卷(第25期), 第3059-3065页
非专利文献8: Zhao, W.M., 等人, Clin. Cancer Res., 2010年12月1日, 第16卷(第23期), 第5750-5758页，于2010年7月29日在线公开
非专利文献9: Bai, A., 等人, Cancer Res., 2010年10月1日, 第70卷(第19期), 第7630-7639页，于2010年8月13日在线公开。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是，提供一种针对FGFR2的抗体。
本发明的另一个目的是，提供药物组合物等，其包含具有抗癌作用的抗-FGFR2抗体。
本发明的一个替代目的包括编码所述抗体的氨基酸序列的核苷酸、具有所述核苷酸的插入物的载体、包含所述核苷酸或所述载体的细胞、包括培养所述细胞的步骤的生产所述抗体的方法、等。
本发明的另一个替代目的是，提供一种使用所述抗体治疗癌症的方法。
问题的解决方案
本发明的发明人已经进行了努力研究来实现所述目的，并且所以通过开发新颖的抗-FGFR2抗体完成了本发明，并且已经发现所述抗体具有抗癌作用。
本发明涉及：
(1)抗体或其功能片段，它具有抗体依赖性的细胞的细胞毒性活性并且结合成纤维细胞生长因子受体(FGFR)；
(2)根据(1)所述的抗体或其功能片段，其中所述成纤维细胞生长因子受体(FGFR)是人FGFR；
(3)根据(1)或(2)所述的抗体或其功能片段，其中所述成纤维细胞生长因子受体(FGFR)是FGFR2；
(4)根据(1)至(3)中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段结合人成纤维细胞生长因子受体2 (人FGFR2) IIIb和/或人成纤维细胞生长因子受体2 (人FGFR2) IIIc；
(5)根据(1)至(4)中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段结合人成纤维细胞生长因子受体2 (人FGFR2) IIIb和人成纤维细胞生长因子受体(人FGFR2) IIIc；
(6)根据(1)至(5)中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段结合人成纤维细胞生长因子受体2的1个或2个或更多个免疫球蛋白样结构域；
(7)根据(1)至(6)中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段结合人成纤维细胞生长因子受体2的免疫球蛋白样结构域2；
(8)根据(1)至(4)和(6)中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段结合人成纤维细胞生长因子受体2的免疫球蛋白样结构域3；
(9)根据(1)至(8)中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段具有对人成纤维细胞生长因子受体2 (人FGFR2) IIIb和/或人成纤维细胞生长因子受体2 (人FGFR2) IIIc的中和活性；
(10)根据(1)至(9)中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段具有对人成纤维细胞生长因子受体2 (人FGFR2) IIIb和人成纤维细胞生长因子受体2 (人FGFR2) IIIc的中和活性；
(11)根据(1)至(10)中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段具有抗肿瘤活性；
(12)根据(11)所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段表现出体内抗肿瘤活性；
(13)根据(1)至(4)、(6)、(8)、(9)、(11)和(12)中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体由重链和轻链组成并且结合人FGFR2，所述重链包含：CDRH1，其由序列表的SEQ ID NO: 52表示的氨基酸序列(图60)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；CDRH2，其由序列表的SEQ ID NO: 53表示的氨基酸序列(图61)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；和CDRH3，其由序列表的SEQ ID NO: 54表示的氨基酸序列(图62)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；所述轻链包含：CDRL1，其由序列表的SEQ ID NO: 61表示的氨基酸序列(图69)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；CDRL2，其由序列表的SEQ ID NO: 62表示的氨基酸序列(图70)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；和CDRL3，其由序列表的SEQ ID NO: 63表示的氨基酸序列(图71)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；
(14)根据(1)至(7)和(9)至(12)中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体由重链和轻链组成并且结合人FGFR2，所述重链包含：CDRH1，其由序列表的SEQ ID NO: 55表示的氨基酸序列(图63)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；CDRH2，其由序列表的SEQ ID NO: 56表示的氨基酸序列(图64)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；和CDRH3，其由序列表的SEQ ID NO: 57表示的氨基酸序列(图65)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；所述轻链包含：CDRL1，其由序列表的SEQ ID NO: 64表示的氨基酸序列(图72)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；CDRL2，其由序列表的SEQ ID NO: 65表示的氨基酸序列(图73)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；和CDRL3，其由序列表的SEQ ID NO: 66表示的氨基酸序列(图74)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；
(15)根据(1)至(7)和(9)至(12)中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体由重链和轻链组成并且结合人FGFR2，所述重链包含：CDRH1，其由序列表的SEQ ID NO: 58表示的氨基酸序列(图66)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；CDRH2，其由序列表的SEQ ID NO: 59表示的氨基酸序列(图67)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；和CDRH3，其由序列表的SEQ ID NO: 60表示的氨基酸序列(图68)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；所述轻链包含：CDRL1，其由序列表的SEQ ID NO: 67表示的氨基酸序列(图75)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；CDRL2，其由序列表的SEQ ID NO: 68表示的氨基酸序列(图76)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；和CDRL3，其由序列表的SEQ ID NO: 69表示的氨基酸序列(图77)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；
(16)根据(15)所述的抗体或其功能片段，其中所述CDRH3由通过1个或2个氨基酸的取代从序列表的SEQ ID NO: 60表示的氨基酸序列(图68)衍生出的氨基酸序列组成；
(17)根据(1)至(16)中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体是单克隆抗体；
(18)根据(1)至(17)中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体是嵌合抗体；
(19)根据(1)至(18)中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体是人源化抗体；
(20)根据(19)所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体选自下述(i)至(xix)：
(i)一种人源化抗体(hFR2-14_H19/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 97表示的氨基酸序列(图105)的第20-467位氨基酸；
(ii)一种人源化抗体(hFR2-14_H12/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 97表示的氨基酸序列(图105)的第20-467位氨基酸；
(iii)一种人源化抗体(hFR2-14_H8/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 89表示的氨基酸序列(图97)的第20-467位氨基酸；
(iv)一种人源化抗体(hFR2-14_H11/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 95表示的氨基酸序列(图103)的第20-467位氨基酸；
(v)一种人源化抗体(hFR2-14_H5/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 83表示的氨基酸序列(图91)的第20-467位氨基酸；
(vi)一种人源化抗体(hFR2-14_H1/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 75表示的氨基酸序列(图83)的第20-467位氨基酸；
(vii)一种人源化抗体(hFR2-14_H2/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 77表示的氨基酸序列(图85)的第20-467位氨基酸；
(viii)一种人源化抗体(hFR2-14_H3/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 79表示的氨基酸序列(图87)的第20-467位氨基酸；
(ix)一种人源化抗体(hFR2-14_H4/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 81表示的氨基酸序列(图89)的第20-467位氨基酸；
(x)一种人源化抗体(hFR2-14_H6/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 85表示的氨基酸序列(图93)的第20-467位氨基酸；
(xi)一种人源化抗体(hFR2-14_H7/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 87表示的氨基酸序列(图95)的第20-467位氨基酸；
(xii)一种人源化抗体(hFR2-14_H9/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 91表示的氨基酸序列(图99)的第20-467位氨基酸；
(xiii)一种人源化抗体(hFR2-14_H10/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 93表示的氨基酸序列(图101)的第20-467位氨基酸；
(xiv)一种人源化抗体(hFR2-14_H13/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 99表示的氨基酸序列(图107)的第20-467位氨基酸；
(xv)一种人源化抗体(hFR2-14_H14/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 101表示的氨基酸序列(图109)的第20-467位氨基酸；
(xvi)一种人源化抗体(hFR2-14_H15/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 103表示的氨基酸序列(图111)的第20-467位氨基酸；
(xvii)一种人源化抗体(hFR2-14_H16/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 105表示的氨基酸序列(图113)的第20-467位氨基酸；
(xviii)一种人源化抗体(hFR2-14_H17/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 107表示的氨基酸序列(图115)的第20-467位氨基酸；和
(xix)一种人源化抗体(hFR2-14_H18/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 109表示的氨基酸序列(图117)的第20-467位氨基酸；
(21)根据(1)至(12)中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体包含重链和轻链并且结合人FGFR2，所述重链和轻链包含分别与根据(20)的抗体的重链和轻链的氨基酸序列具有95%或更高同一性的氨基酸序列；
(22)根据(1)至(12)中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段结合被根据(13)至(16)和(20)中的任一项所述的抗体识别的抗原上的位点；
(23)根据(1)至(12)中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段与根据(13)至(16)和(20)中的任一项所述的抗体竞争对人FGFR2的结合；
(24)根据(1)至(12)中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段结合人FGFR2上的表位，所述表位由SEQ ID NO: 70 (图78)或SEQ ID NO: 71 (图79)表示的氨基酸序列中的以下氨基酸构成：在残基155处的酪氨酸(Tyr)、在残基157处的苏氨酸(Thr)、在残基176处的赖氨酸(Lys)、在残基181处的丙氨酸(Ala)、在残基182处的甘氨酸(Gly)、在残基183处的甘氨酸(Gly)、在残基184处的天冬酰胺(Asn)、在残基185处的脯氨酸(Pro)、在残基186处的甲硫氨酸(Met)、在残基188处的苏氨酸(Thr)、在残基200处的谷氨酰胺(Gln)、在残基201处的谷氨酸(Glu)、在残基205处的甘氨酸(Gly)、在残基206处的甘氨酸(Gly)、在残基208处的赖氨酸(Lys)、在残基209处的缬氨酸(Val)、在残基210处的精氨酸(Arg)、在残基211处的天冬酰胺(Asn)、在残基212处的谷氨酰胺(Gln)、在残基213处的组氨酸(His)、在残基214处的色氨酸(Trp)和在残基217处的异亮氨酸(Ile)；
(25)根据(1)至(12)中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段与SEQ ID NO: 70 (图78)或SEQ ID NO: 71 (图79)表示的氨基酸序列中的以下氨基酸中的每一个具有相互作用距离：在残基155处的酪氨酸(Tyr)、在残基157处的苏氨酸(Thr)、在残基176处的赖氨酸(Lys)、在残基181处的丙氨酸(Ala)、在残基182处的甘氨酸(Gly)、在残基183处的甘氨酸(Gly)、在残基184处的天冬酰胺(Asn)、在残基185处的脯氨酸(Pro)、在残基186处的甲硫氨酸(Met)、在残基188处的苏氨酸(Thr)、在残基200处的谷氨酰胺(Gln)、在残基201处的谷氨酸(Glu)、在残基205处的甘氨酸(Gly)、在残基206处的甘氨酸(Gly)、在残基208处的赖氨酸(Lys)、在残基209处的缬氨酸(Val)、在残基210处的精氨酸(Arg)、在残基211处的天冬酰胺(Asn)、在残基212处的谷氨酰胺(Gln)、在残基213处的组氨酸(His)、在残基214处的色氨酸(Trp)和在残基217处的异亮氨酸(Ile)；
(26)根据(25)所述的抗体或其功能片段，其中所述相互作用距离是6埃或更短；
(27)根据(25)或(26)所述的抗体或其功能片段，其中所述相互作用距离是4埃或更短；
(28)根据(1)至(12)和(21)至(27)中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体是人抗体；
(29)根据(1)至(28)中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段抑制FGF与人FGFR2的结合；
(30)根据(1)至(29)中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段具有抗体依赖性的细胞的细胞毒性活性和/或抗体依赖性的细胞吞噬活性；
(31)下述(i)至(iii)中的任一项所述的核苷酸：
(i)一种核苷酸，其包含编码根据(1)至(30)中的任一项所述的抗体的重链或轻链的部分或整个氨基酸序列的核苷酸序列；
(ii)一种由以下核苷酸序列组成的核苷酸，所述核苷酸序列包含编码根据(1)至(30)中的任一项所述的抗体的重链或轻链的部分或整个氨基酸序列的核苷酸序列；和
(iii)一种核苷酸，其由编码根据(1)至(30)中的任一项所述的抗体的重链或轻链的部分或整个氨基酸序列的核苷酸序列组成；
(32)一种重组载体，其具有根据(31)所述的核苷酸的插入物；
(33)一种重组细胞，其包含根据(31)所述的核苷酸或根据(32)所述的重组载体；
(34)一种细胞，其生产根据(1)至(30)中的任一项所述的抗体或其功能片段；
(35)一种用于生产根据(1)至(30)中的任一项所述的抗体或其功能片段的方法，所述方法包括下述步骤(i)和(ii)：
(i)培养根据(33)或(34)所述的细胞；和
(ii)从在步骤(i)中得到的培养物回收根据(1)至(30)中的任一项所述的抗体或其功能片段；
(36)通过根据(35)所述的方法得到的根据(1)至(12)中的任一项所述的抗体或其功能片段；
(37)根据(1)至(30)和(36)中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中从所述重链或轻链的氨基端或羧基端删除1-5个氨基酸；
(38)根据(1)至(30)、(36)和(37)中的任一项所述的抗体或其功能片段的修饰形式；
(39)根据(38)所述的修饰形式，其中调节糖链修饰；
(40)根据(39)所述的修饰形式，其中所述抗体选自(20)所述的抗体(i)至(xix)；
(41)一种药物组合物，其包含根据(1)至(30)、(36)和(37)中的任一项所述的抗体或其功能片段或根据(38)至(40)中的任一项所述的修饰形式作为活性成分；
(42)根据(41)所述的药物组合物，其中所述药物组合物是抗癌剂；
(43)根据(42)所述的药物组合物，其中所述癌症是FGFR2-阳性的；
(44)一种用于测试或诊断癌症的组合物，所述组合物包含根据(1)至(30)、(36)和(37)中的任一项所述的抗体或其功能片段或根据(38)至(40)中的任一项所述的修饰形式；
(45)一种组合物，其包含具有人FGFR2 IIIb选择性的抗体或其功能片段，或所述抗体或所述功能片段的修饰形式；
(46)根据(45)所述的组合物，其中所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含根据(13)所述的CDRH1至CDRH3，所述轻链包含根据(13)所述的CDRL1至CDRL3；
(47)根据(46)所述的组合物，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有由SEQ ID NO: 12(图20)表示的氨基酸序列，所述轻链可变区具有由SEQ ID NO: 21(图29)表示的氨基酸序列；
(48)根据(46)或(47)所述的组合物，其中所述抗体是嵌合抗体或大鼠抗体；
(49)根据(45)至(48)中的任一项所述的组合物，其中所述组合物用于检测或测定人FGFR2 IIIb；
(50)一种用于检测或测定人FGFR2 IIIb的方法，所述方法包括下述步骤：使试验样品与根据(45)至(48)中的任一项所述的组合物接触；
(51)一种用于检测或测定人FGFR2 IIIc的方法，所述方法包括下述步骤(i)至(iii)：
(i)使试验样品与组合物接触，所述组合物包含选择性地结合人FGFR2 IIIb和人FGFR2 IIIc的抗体或其功能片段、或所述抗体或所述功能片段的修饰形式，以检测或测定所述试验样品中的人FGFR2 IIIb和人FGFR2 IIIc；
(ii)使所述试验样品与根据(45)至(49)中的任一项所述的组合物接触，以检测或测定所述试验样品中的人FGFR2 IIIb；和
(iii)将步骤(i)中的检测或测定的结果与步骤(ii)中的检测或测定的结果进行对比，或从步骤(i)中的检测或测定的结果减去步骤(ii)中的检测或测定的结果，以得到所述试验样品中的人FGFR2 IIIc的检测或测定结果或值；
(52)根据(44)至(49)中的任一项所述的组合物或根据(50)或(51)所述的方法，其中所述组合物或所述方法用于诊断或试验人FGFR2-阳性的癌症；
(53)一种用于鉴定根据(41)至(43)中的任一项所述的药物组合物的受体个体的方法，所述方法包括下述步骤(i)和(ii)：
(i)使个体衍生的样品与根据(44)至(49)中的任一项所述的组合物接触；和
(ii)当在所述样品中检测出人FGFR2时，确定所述个体是阳性的；
(54)根据(53)所述的方法，其中所述人FGFR2是人FGFR2 IIIb；
(55)根据(53)所述的方法，其中所述人FGFR2是人FGFR2 IIIc和人FGFR2 IIIb；
(56)根据(44)至(49)中的任一项所述的组合物，其中所述组合物用在根据(53)至(55)中的任一项所述的方法中；
(57)根据(53)至(55)中的任一项所述的方法或根据(56)所述的组合物，其中所述个体患有癌症或者处于癌症的风险中；
(58)根据(41)至(43)中的任一项所述的药物组合物，其中将所述药物组合物施用给通过根据(53)至(55)中的任一项所述的方法鉴定为阳性的个体；
(59)一种试剂，其包含根据(1)至(30)、(36)和(37)中的任一项所述的抗体或其功能片段或根据(38)至(40)中的任一项所述的修饰形式；
(60)一种用于鉴定具有抗肿瘤活性的物质的方法，所述方法包括下述步骤(i)至(iii)：
(i)使试验物质与以下蛋白接触，所述蛋白包含SEQ ID NO: 70 (图78)或SEQ ID NO: 71 (图79)表示的氨基酸序列中的氨基酸位置155处的酪氨酸(Tyr)至氨基酸位置217处的异亮氨酸(Ile)；
(ii)测量或确定所述物质与所述蛋白中以下氨基酸中的每一个之间的距离：由SEQ ID NO: 70表示的氨基酸序列中在残基155处的酪氨酸(Tyr)、在残基157处的苏氨酸(Thr)、在残基176处的赖氨酸(Lys)、在残基181处的丙氨酸(Ala)、在残基182处的甘氨酸(Gly)、在残基183处的甘氨酸(Gly)、在残基184处的天冬酰胺(Asn)、在残基185处的脯氨酸(Pro)、在残基186处的甲硫氨酸(Met)、在残基188处的苏氨酸(Thr)、在残基200处的谷氨酰胺(Gln)、在残基201处的谷氨酸(Glu)、在残基205处的甘氨酸(Gly)、在残基206处的甘氨酸(Gly)、在残基208处的赖氨酸(Lys)、在残基209处的缬氨酸(Val)、在残基210处的精氨酸(Arg)、在残基211处的天冬酰胺(Asn)、在残基212处的谷氨酰胺(Gln)、在残基213处的组氨酸(His)、在残基214处的色氨酸(Trp)和在残基217处的异亮氨酸(Ile)；和
(iii)当所述物质与所述残基中的每一个具有相互作用距离时，确定所述物质是阳性的；
(61)根据(60)所述的方法，所述方法进一步包括下述步骤(iv)：
(iv)测定所述物质的抗肿瘤活性；
(62)根据(60)或(61)所述的方法，其中所述物质是抗体或其功能片段、或所述抗体或所述功能片段的修饰形式、或肽；
(63)一种用于生产在根据(60)或(61)所述的步骤(iii)中确定为阳性的物质的方法，所述方法包括：通过包括基因重组、肽合成或体外翻译的步骤，制备所述物质；
(64)根据(41)至(43)和(58)中的任一项所述的药物组合物，所述药物组合物进一步包含其它药物；
(65)根据(1)至(30)、(36)和(37)中的任一项所述的抗体或其功能片段、或根据(38)至(40)中任一项所述的修饰形式，其中所述抗体、所述功能片段或所述修饰形式与其它化合物缀合；和
(66)根据(41)至(43)、(58)和(64)中的任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含根据(65)所述的抗体、功能片段或修饰形式，
等。
发明的有利效果
本发明提供的抗体的应用能够治疗或预防多种癌症以及测试或诊断多种癌症。
附图说明
图1的简图显示了通过流式细胞术试验大鼠抗-FGFR2抗体(FR2-10、FR2-13和FR2-14)对人FGFR2的结合活性的结果。纵轴代表通过流式细胞术测定的平均荧光强度的相对值。
图2的简图显示了通过流式细胞术试验大鼠抗-FGFR2抗体(FR2-10、FR2-13和FR2-14)所结合的人FGFR2上的表位的结果。纵轴代表通过流式细胞术测定的平均荧光强度的相对值。
图3A的简图显示了通过Elk1反式报道基因测定测量的大鼠抗-FGFR2抗体(FR2-10、FR2-13和FR2-14)对人FGFR2 IIIb的信号中和活性。
图3B的简图显示了通过Elk1反式报道基因测定测量的大鼠抗-FGFR2抗体(FR2-10、FR2-13和FR2-14)对人FGFR2 IIIc的信号中和活性。
图4的简图显示了通过蛋白质印迹法测量的大鼠抗-FGFR2抗体FR2-10对FGFR2的信号抑制作用。该简图表明，大鼠FR2-10抗体的添加抑制了由FGF7向人胃癌细胞系SNU-16的添加诱导的FGFR2、FRS2和ERK磷酸化。
图5的简图显示了通过细胞-ELISA试验人嵌合抗-FGFR2抗体(cFR2-10、cFR2-13和cFR2-14)对人FGFR2的结合活性的结果。
图6A的简图显示了通过Elk1反式报道基因测定测得的人嵌合抗-FGFR2抗体(cFR2-10、cFR2-13和cFR2-14)对人FGFR2 IIIb的信号中和活性。
图6B的简图显示了通过Elk1反式报道基因测定测得的人嵌合抗-FGFR2抗体(cFR2-10、cFR2-13和cFR2-14)对人FGFR2 IIIc的信号中和活性。
图7的简图显示了人嵌合抗-FGFR2抗体(cFR2-10、cFR2-13和cFR2-14)的ADCC活性。使用表达人FGFR2 IIIb的293T-lacZ细胞作为靶细胞，并使用人PBMC作为效应细胞。
图8的简图显示了人嵌合抗-FGFR2抗体(cFR2-10、cFR2-13和cFR2-14)对移植人胃癌细胞系SNU-16的裸鼠的体内抗肿瘤活性。图8A)显示了cFR2-10抗体的结果。图8B)显示了cFR2-13抗体的结果。图8C)显示了cFR2-14抗体的结果。
图9显示了与大鼠抗-FGFR2抗体FR2-10的重链对应的带的N-端氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 1)。
图10显示了与大鼠抗-FGFR2抗体FR2-10的轻链对应的带的N-端氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 2)。
图11显示了与大鼠抗-FGFR2抗体FR2-13的重链对应的带的N-端氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 3)。
图12显示了与大鼠抗-FGFR2抗体FR2-13的轻链对应的带的N-端氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 4)。
图13显示了与大鼠抗-FGFR2抗体FR2-14的重链对应的带的N-端氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 5)。
图14显示了与大鼠抗-FGFR2抗体FR2-14的轻链对应的带的N-端氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 6)。
图15显示了用于大鼠重链的基因扩增的引物(序列表的SEQ ID NO: 7)。
图16显示了FR2-10的重链的测序引物(序列表的SEQ ID NO: 8)。
图17显示了FR2-13的重链的测序引物(序列表的SEQ ID NO: 9)。
图18显示了FR2-14的重链的测序引物(序列表的SEQ ID NO: 10)。
图19显示了编码大鼠抗-FGFR2抗体FR2-10的重链可变区的cDNA的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO: 11)。
图20显示了大鼠抗-FGFR2抗体FR2-10的重链可变区的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 12)。
图21显示了编码大鼠抗-FGFR2抗体FR2-13的重链可变区的cDNA的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO: 13)。
图22显示了大鼠抗-FGFR2抗体FR2-13的的重链可变区的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 14)。
图23显示了编码大鼠抗-FGFR2抗体FR2-14的重链可变区的cDNA的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO: 15)。
图24显示了大鼠抗-FGFR2抗体FR2-14的重链可变区的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 16)。
图25显示了用于大鼠轻链的基因扩增的引物(序列表的SEQ ID NO: 17)。
图26显示了大鼠轻链的测序引物(序列表的SEQ ID NO: 18)。
图27显示了FR2-10的轻链的测序引物(序列表的SEQ ID NO: 19)。
图28显示了编码大鼠抗-FGFR2抗体FR2-10的轻链可变区的cDNA的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO: 20)。
图29显示了大鼠抗-FGFR2抗体FR2-10的轻链可变区的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 21)。
图30显示了用于大鼠FR2-13或FR2-14轻链的基因扩增的引物(序列表的SEQ ID NO: 22)。
图31显示了编码大鼠抗-FGFR2抗体FR2-13的轻链可变区的cDNA的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO: 23)。
图32显示了大鼠抗-FGFR2抗体FR2-13的轻链可变区的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 24)。
图33显示了编码大鼠抗-FGFR2抗体FR2-14的轻链可变区的cDNA的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO: 25)。
图34显示了大鼠抗-FGFR2抗体FR2-14的轻链可变区的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 26)。
图35显示了包含编码人κ链分泌信号序列和人κ链恒定区的氨基酸的DNA序列的DNA片段(序列表的SEQ ID NO: 27)。
图36显示了轻链表达载体的引物F (序列表的SEQ ID NO: 28)。
图37显示了轻链表达载体的引物R (序列表的SEQ ID NO: 29)。
图38显示了包含编码人重链信号序列和人IgG1恒定区的氨基酸的DNA序列的DNA片段(序列表的SEQ ID NO: 30)。
图39显示了人嵌合FR2-10 (cFR2-10)的轻链的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO: 31)。在该序列中，第1-60位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟cFR2-10轻链的核苷酸序列中。
图40显示了人嵌合FR2-10 (cFR2-10)的轻链的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 32)。在该序列中，第1-20位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟cFR2-10轻链的氨基酸序列中。
图41显示了人嵌合FR2-10的轻链的引物集合F (序列表的SEQ ID NO: 33)。
图42显示了人嵌合FR2-10的轻链的引物集合R (序列表的SEQ ID NO: 34)。
图43显示了人嵌合FR2-10 (cFR2-10)的重链的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO: 35)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟cFR2-10重链的核苷酸序列中。
图44显示了人嵌合FR2-10 (cFR2-10)的重链的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 36)。在该序列中，第1-19位氨基酸1-19代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟cFR2-10重链的氨基酸序列中。
图45显示了人嵌合FR2-10的重链的引物集合F (序列表的SEQ ID NO: 37)。
图46显示了人嵌合FR2-10的重链的引物集合R (序列表的SEQ ID NO: 38)。
图47显示了人嵌合FR2-13 (cFR2-13)的轻链的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO: 39)。在该序列中，第1-60位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟cFR2-13轻链的核苷酸序列中。
图48显示了人嵌合FR2-13 (cFR2-13)的轻链的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 40)。在该序列中，第1-20位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟cFR2-13轻链的氨基酸序列中。
图49显示了人嵌合FR2-13的轻链的引物F (序列表的SEQ ID NO: 41)。
图50显示了人嵌合FR2-13的轻链的引物R (序列表的SEQ ID NO: 42)。
图51显示了人嵌合FR2-13 (cFR2-13)的重链的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO: 43)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟cFR2-13重链的核苷酸序列中。
图52显示了人嵌合FR2-13 (cFR2-13)的重链的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 44)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟cFR2-13重链的氨基酸序列中。
图53显示了人嵌合FR2-13的重链的引物F (序列表的SEQ ID NO: 45)。
图54显示了人嵌合FR2-13的重链的引物R (序列表的SEQ ID NO: 46)。
图55显示了人嵌合FR2-14 (cFR2-14)的轻链的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO: 47)。在该序列中，第1-60位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟cFR2-14轻链的核苷酸序列中。
图56显示了人嵌合FR2-14 (cFR2-14)的轻链的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 48)。在该序列中，第1-20位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟cFR2-14轻链的氨基酸序列中。
图57显示了人嵌合FR2-14的轻链的引物(序列表的SEQ ID NO: 49)。
图58显示了人嵌合FR2-14 (cFR2-14)的重链的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO: 50)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟cFR2-14重链的核苷酸序列中。
图59显示了人嵌合FR2-14 (cFR2-14)的重链的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 51)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟cFR2-14重链的氨基酸序列中。
图60显示了大鼠抗-FGFR2抗体FR2-10的重链CDR1的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 52)。
图61显示了大鼠抗-FGFR2抗体FR2-10的重链CDR2的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 53)。
图62显示了大鼠抗-FGFR2抗体FR2-10的重链CDR3的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 54)。
图63显示了大鼠抗-FGFR2抗体FR2-13的重链CDR1的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 55)。
图64显示了大鼠抗-FGFR2抗体FR2-13的重链CDR2的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 56)。
图65显示了大鼠抗-FGFR2抗体FR2-13的重链CDR3的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 57)。
图66显示了大鼠抗-FGFR2抗体FR2-14的重链CDR1的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 58)。
图67显示了大鼠抗-FGFR2抗体FR2-14的重链CDR2的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 59)。
图68显示了大鼠抗-FGFR2抗体FR2-14的重链CDR3的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 60)。
图69显示了大鼠抗-FGFR2抗体FR2-10的轻链CDR1的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 61)。
图70显示了大鼠抗-FGFR2抗体FR2-10的轻链CDR2的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 62)。
图71显示了大鼠抗-FGFR2抗体FR2-10的轻链CDR3的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 63)。
图72显示了大鼠抗-FGFR2抗体FR2-13的轻链CDR1的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 64)。
图73显示了大鼠抗-FGFR2抗体FR2-13的轻链CDR2的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 65)。
图74显示了大鼠抗-FGFR2抗体FR2-13的轻链CDR3的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 66)。
图75显示了大鼠抗-FGFR2抗体FR2-14的轻链CDR1的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 67)。
图76显示了大鼠抗-FGFR2抗体FR2-14的轻链CDR2的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 68)。
图77显示了大鼠抗-FGFR2抗体FR2-14的轻链CDR3的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 69)。
图78显示了人FGFR2 IIIb的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 70)。
图79显示了人FGFR2 IIIc的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 71)。
图80显示了hFR2-14_L1的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO: 72)。在该序列中，第1-60位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟轻链hFR2-14_L1的核苷酸序列中。
图81显示了hFR2-14_L1的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 73)。在该序列中，第1-20位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟轻链hFR2-14_L1的氨基酸序列中。
图82显示了hFR2-14_H1的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO: 74)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H1的核苷酸序列中。
图83显示了hFR2-14_H1的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 75)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H1的氨基酸序列中。
图84显示了hFR2-14_H2的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO: 76)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H2的核苷酸序列中。
图85显示了hFR2-14_H2的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 77)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H2的氨基酸序列中。
图86显示了hFR2-14_H3的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO: 78)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H3的核苷酸序列中。
图87显示了hFR2-14_H3的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 79)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H3的氨基酸序列中。
图88显示了hFR2-14_H4的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO: 80)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H4的核苷酸序列中。
图89显示了hFR2-14_H4的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 81)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H4的氨基酸序列中。
图90显示了hFR2-14_H5的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO: 82)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H5的核苷酸序列中。
图91显示了hFR2-14_H5的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 83)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H5的氨基酸序列中。
图92显示了hFR2-14_H6的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO: 84)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H6的核苷酸序列中。
图93显示了hFR2-14_H6的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 85)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H6的氨基酸序列中。
图94显示了hFR2-14_H7的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO: 86)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H7的核苷酸序列中。
图95显示了hFR2-14_H7的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 87)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H7的氨基酸序列中。
图96显示了hFR2-14_H8的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO: 88)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H8的核苷酸序列中。
图97显示了hFR2-14_H8的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 89)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H8的氨基酸序列中。
图98显示了hFR2-14_H9的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO: 90)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H9的核苷酸序列中。
图99显示了hFR2-14_H9的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 91)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H9的氨基酸序列中。
图100显示了hFR2-14_H10的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO: 92)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H10的核苷酸序列中。
图101显示了hFR2-14_H10的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 93)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H10的氨基酸序列中。
图102显示了hFR2-14_H11的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO: 94)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H11的核苷酸序列中。
图103显示了hFR2-14_H11的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 95)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H11的氨基酸序列中。
图104显示了hFR2-14_H12或hFR2-14_H19的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO: 96)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H12或hFR2-14_H19的核苷酸序列中。
图105显示了hFR2-14_H12或hFR2-14_H19的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 97)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H12或hFR2-14_H19的氨基酸序列中。
图106显示了hFR2-14_H13的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO: 98)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H13的核苷酸序列中。
图107显示了hFR2-14_H13的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 99)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H13的氨基酸序列中。
图108显示了hFR2-14_H14的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO: 100)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H14的核苷酸序列中。
图109显示了hFR2-14_H14的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 101)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H14的氨基酸序列中。
图110显示了hFR2-14_H15的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO: 102)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H15的核苷酸序列中。
图111显示了hFR2-14_H15的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 103)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H15的氨基酸序列中。
图112显示了hFR2-14_H16的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO: 104)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H16的核苷酸序列中。
图113显示了hFR2-14_H16的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 105)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H16的氨基酸序列中。
图114显示了hFR2-14_H17的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO: 106)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H17的核苷酸序列中。
图115显示了hFR2-14_H17的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 107)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H17的氨基酸序列中。
图116显示了hFR2-14_H18的核苷酸序列(序列表的SEQ ID NO: 108)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H18的核苷酸序列中。
图117显示了hFR2-14_H18的氨基酸序列(序列表的SEQ ID NO: 109)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H18的氨基酸序列中。
图118显示了hFR2-14_H2型重链的引物VH3A-F (序列表的SEQ ID NO: 110)。
图119显示了hFR2-14_H2型重链的引物VH3A-R (序列表的SEQ ID NO: 111)。
图120显示了用于D2的基因扩增的引物D23fw (序列表的SEQ ID NO: 112)。
图121显示了用于D2的基因扩增的引物D23rv (序列表的SEQ ID NO: 113)。
图122的简图显示了使用Biacore测定4种人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H1/L1至hFR2-14_H4/L1)和人嵌合抗-FGFR2抗体(cFR2-14)对每种人FGFR2变体蛋白的结合活性的结果。将每种抗体在293F细胞中表达并纯化用于在测定中使用。
图123的简图显示了使用Biacore测定15种人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H3/L1和hFR2-14_H5/L1至hFR2-14_H18/L1)对人FGFR2 IIIc变体蛋白的结合活性的结果。将每种抗体在293F细胞中表达，并将它的培养物上清液用在测定中。
图124的简图显示了通过细胞-ELISA试验3种人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H8/L1和hFR2-14_H12/L1)的人FGFR2-选择性的结合活性的结果。
图125A的简图显示了5种人源化抗-FGFR2抗体的热分析图。
图125B的简图显示了5种人源化抗-FGFR2抗体的热分析图。
图125C的简图显示了10种人源化抗-FGFR2抗体的Tm值。
图126的简图显示了降解之前和之后hFR2-14_H1/L1、hFR2-14_H2/L1、hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H4/L1、hFR2-14_H5/L1、hFR2-14_H8/L1、hFR2-14_H9/L1、hFR2-14_H11/L1、hFR2-14_H12/L1和hFR2-14_H19/L1抗体分析物对抗原的KD值。
图127A的简图显示了通过Elk1反式报道基因测定测得的人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H1/L1、hFR2-14_H2/L1、hFR2-14_H3/L1和hFR2-14_H4/L1)和人嵌合抗-FGFR2抗体(cFR2-14)对人FGFR2 IIIb的信号中和活性。
图127B的简图显示了通过Elk1反式报道基因测定测得的人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H1/L1、hFR2-14_H2/L1、hFR2-14_H3/L1和hFR2-14_H4/L1)和人嵌合抗-FGFR2抗体(cFR2-14)对人FGFR2 IIIc的信号中和活性。
图128A的简图显示了通过Elk1反式报道基因测定测得的人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H5/L1、hFR2-14_H6/L1、hFR2-14_H7/L1和hFR2-14_H8/L1)对人FGFR2 IIIb的信号中和活性。
图128B的简图显示了通过Elk1反式报道基因测定测得的人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H9/L1、hFR2-14_H10/L1、hFR2-14_H11/L1、hFR2-14_H12/L1和hFR2-14_H13/L1)对人FGFR2 IIIb的信号中和活性。
图128C的简图显示了通过Elk1反式报道基因测定测得的人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H14/L1、hFR2-14_H15/L1、hFR2-14_H16/L1、hFR2-14_H17/L1和hFR2-14_H18/L1)对人FGFR2 IIIb的信号中和活性。
图129A的简图显示了通过Elk1反式报道基因测定测得的人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H12/L1和hFR2-14_H19/L1)对人FGFR2 IIIb的信号中和活性。
图129B的简图显示了通过Elk1反式报道基因测定测得的人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H12/L1和hFR2-14_H19/L1)对人FGFR2 IIIc的信号中和活性。
图130A的简图显示了人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H1/L1和hFR2-14_H2/L1)的ADCC活性。使用表达人FGFR2 IIIb的293T-lacZ细胞作为靶细胞，并使用人PBMC作为效应细胞。
图130B的简图显示了人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H3/L1和hFR2-14_H4/L1)和人嵌合抗-FGFR2抗体(cFR2-14)的ADCC活性。使用表达人FGFR2 IIIb的293T-lacZ细胞作为靶细胞，并使用人PBMC作为效应细胞。
图131的简图显示了人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H8/L1和hFR2-14_H12/L1)的ADCC活性。使用表达人FGFR2的NCI-H716细胞作为靶细胞，并使用人PBMC作为效应细胞。
图132的简图显示了人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H12/L1和hFR2-14_H19/L1)的ADCC活性。使用表达人FGFR2的NCI-H716细胞(图132A))、SNU-16细胞(图132B))或KATO III细胞(图132C))作为靶细胞，并使用人PBMC作为效应细胞。
图133的简图显示了人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H12/L1和hFR2-14_H19/L1)的ADCP活性。使用表达人FGFR2的NCI-H716细胞(图133A))或KATO III细胞(图133B))作为靶细胞，并使用从人PBMC分化出的巨噬细胞样细胞作为效应细胞。
图134A的简图显示了人源化抗-FGFR2抗体hFR2-14_H1/L1对移植人胃癌细胞系SNU-16的裸鼠的体内抗肿瘤活性。
图134B的简图显示了人源化抗-FGFR2抗体hFR2-14_H2/L1对移植人胃癌细胞系SNU-16的裸鼠的体内抗肿瘤活性。
图134C的简图显示了人源化抗-FGFR2抗体hFR2-14_H3/L1对移植人胃癌细胞系SNU-16的裸鼠的体内抗肿瘤活性。
图134D的简图显示了人源化抗-FGFR2抗体hFR2-14_H4/L1对移植人胃癌细胞系SNU-16的裸鼠的体内抗肿瘤活性。
图135A的简图显示了人源化抗-FGFR2抗体hFR2-14_H5/L1对人胃癌细胞系SNU-16皮下移植模型的体内抗肿瘤活性。
图135B的简图显示了人源化抗-FGFR2抗体hFR2-14_H8/L1对人胃癌细胞系SNU-16皮下移植模型的体内抗肿瘤活性。
图135C的简图显示了人源化抗-FGFR2抗体hFR2-14_H9/L1对人胃癌细胞系SNU-16皮下移植模型的体内抗肿瘤活性。
图135D的简图显示了人源化抗-FGFR2抗体hFR2-14_H11/L1对人胃癌细胞系SNU-16皮下移植模型的体内抗肿瘤活性。
图135E的简图显示了人源化抗-FGFR2抗体hFR2-14_H12/L1对人胃癌细胞系SNU-16皮下移植模型的体内抗肿瘤活性。
图135F的简图显示了人源化抗-FGFR2抗体hFR2-14_H19/L1对人胃癌细胞系SNU-16皮下移植模型的体内抗肿瘤活性。
图136的简图显示了人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H12/L1和hFR2-14_H19/L1)对人结直肠癌细胞系NCI-H716肿瘤块模型的体内抗肿瘤活性。图136(A)显示了hFR2-14_H12/L1的结果。图136(B)显示了hFR2-14_H19/L1的结果。
图137的简图显示了人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H12/L1和hFR2-14_H19/L1)对人结直肠癌细胞系NCI-H716-luc腹膜弥散模型的体内抗肿瘤活性。图137(A)显示了表明萤光素酶活性的结果。图137(B)显示了表明存活率的结果。
图138的简图显示了FGFR2D2/H3L1Fab复合物的条带模型。FGFR2D2显示在左下。H3L1Fab的H链(深灰色)显示在中央至右上。H3L1Fab的L链显示在其右边。
图139的简图显示了FGFR2/FGF1和FGFR2D2/H3L1Fab的重叠。FGFRD3 (IgD3)显示在下面中央。FGF1 (深灰色)显示在FGFRD3上方。FGFRD2显示在FGF1上方。H3L1Fab的H链(深灰色)和L链各自显示在FGFRD2的右上方。
图140的简图显示了使用大鼠抗体FR2-10得到的293α细胞(其被迫表达FGFR家族的每个分子)的免疫染色块的结果。
图141的简图显示了SNU-16细胞(图141A和141D)、KATO III细胞(图141B和141E)和NCI-H716细胞(图141C和141F)的免疫染色块的结果。图141A至141C显示了使用大鼠抗体FR2-10得到的结果。图141D至141F显示了使用商购可得抗体得到的结果。
图142的简图显示了使用大鼠抗体FR2-10得到的SNU-16细胞(图142A)、KATO III细胞(图142B)和NCI-H716细胞(图142C)的免疫染色异种移植物肿瘤样品的结果。
图143的简图显示了cFR2-10、hFR2-14_H12/L1和hFR2-14_H19/L1抗体抑制配体FGF7与它的受体FGFR2的结合的活性。
具体实施方式
1. 定义
在本发明中，术语“基因”是指包含编码蛋白的氨基酸的核苷酸序列或它的互补链的核苷酸。“基因”意图包括例如多核苷酸、寡核苷酸、DNA、mRNA、cDNA和cRNA作为包含编码蛋白的氨基酸的核苷酸序列或它的互补链的核苷酸。这样的基因是单链的、双链的或三链的或更多链的核苷酸。“基因”也意图包括DNA和RNA链的结合体、在一个核苷酸链上的核糖核苷酸(RNA)和脱氧核糖核苷酸(DNA)的混合物、和包含这样的核苷酸链的双链的或三链的或更多链的核苷酸。本发明的“FGFR2基因”的例子可以包括包含编码FGFR2蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA、mRNA、cDNA和cRNA。
在本发明中，术语“核苷酸”具有与“核酸”相同的含义，并且也意图包括例如DNA、RNA、探针、寡核苷酸、多核苷酸和引物。这样的核苷酸是单链的、双链的或三链的或更多链的核苷酸。“核苷酸”也意图包括DNA和RNA链的结合体、在一个核苷酸链上的核糖核苷酸(RNA)和脱氧核糖核苷酸(DNA)的混合物、和包含这样的核苷酸链的双链或三链或更多链的结合体。
在本发明中，术语“多肽”、“肽”和“蛋白”具有相同的含义。
在本发明中，术语“抗原”具有与“免疫原”相同的含义。
在本发明中，术语“细胞”也包括，例如，从个别动物衍生出的不同细胞、传代培养的细胞、原代培养的细胞、细胞系、重组细胞和微生物细胞。
在本发明中，识别FGFR2、FGFR2 IIIb、FGFR2 IIIc、FGFR3、FGFR等的抗体分别也被称作“抗-FGFR2抗体”、“抗-FGFR2 IIIb抗体”、“抗-FGFR2 IIIc抗体”、“抗-FGFR3抗体”和“抗-FGFR抗体”。这些抗体包括嵌合抗体、人源化抗体、人抗体等。
在本发明中，术语“抗体的功能片段”是指执行原始抗体发挥的至少一部分功能的抗体片段。“抗体的功能片段”的例子可以包括、但不限于Fab、F(ab')2、scFv、Fab'和单链免疫球蛋白。这样的抗体的功能片段可以通过用酶诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体蛋白的全长分子得到，或可以是使用重组基因在适当的宿主细胞中生产的重组蛋白。
在本发明中，抗体所结合的“位点”，即，抗体所识别的“位点”，是指所述抗体结合或识别的抗原上的部分肽或部分构象。在本发明中，这样的位点也被称作表位或抗体结合位点。在FGFR2蛋白上被本发明的抗-FGFR2抗体结合或识别的位点的例子可以包括在FGFR2蛋白上的部分肽或部分构象。
已知抗体分子的重链和轻链各自具有3个互补性决定区(CDR)。互补性决定区也称为高变结构域。这些区域位于抗体重链和轻链的可变区中。这些位点具有特别高度可变的一级结构，并且经常分离在重链和轻链多肽链各自的一级结构上的3个位置处。在本发明中，抗体的互补性决定区被称作CDRH1、CDRH2和CDRH3(对于重链的互补性决定区，从重链氨基酸序列的氨基端)和CDRL1、CDRL2和CDRL3(对于轻链的互补性决定区，从轻链氨基酸序列的氨基端)。这些位点在三维结构上彼此邻近，并决定要结合的抗原的特异性。
在本发明中，术语“抗体突变体”是指这样的多肽：其具有通过氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入(在下文中，被统称为“突变”)从原始抗体的氨基酸序列衍生出的氨基酸序列，并且结合本发明的FGFR2蛋白。这样的抗体突变体中的突变氨基酸的数目是1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-12、1-15、1-20、1-25、1-30、1-40、或1-50。这样的抗体突变体也被本发明的“抗体”包括。
在本发明中，在“1个至几个”中的术语“几个”表示3-10。
由本发明的抗体发挥的活性或性能的例子可以包括生物活性或物理化学性能，并且可以具体地包括针对抗原或表位的各种生物活性、结合活性、在生产或贮存过程中的稳定性、和热稳定性。
在本发明中，短语“在严谨条件下杂交”是指在包含以下内容的条件下杂交：在含有5×SSC的溶液中在65℃杂交，随后在含有2×SSC-0.1%SDS的水溶液中在65℃洗涤20分钟，在含有0.5×SSC-0.1%SDS的水溶液中在65℃洗涤20分钟，和在含有0.2×SSC-0.1%SDS的水溶液中在65℃洗涤20分钟，或者在与其等同的条件下杂交。SSC是指150mMNaCl-15mM柠檬酸钠的水溶液，并且n×SSC是指具有n倍浓度的SSC。
在本发明中，术语“细胞毒性”表示给细胞带来的一些病理学变化，并且不仅是指直接创伤，而且是指对细胞的每种结构或功能损伤，包括DNA裂解、碱基二聚体的形成、染色体断裂、对有丝分裂器的损伤和不同酶的活性的下降。
在本发明中，术语“细胞毒性活性”是指造成上述细胞毒性的活性。
在本发明中，术语“抗体依赖性的细胞的细胞毒性活性”也称为“ADCC活性”，是指NK细胞经由抗体破坏靶细胞(诸如肿瘤细胞)的作用或活性。
在本发明中，术语“抗体依赖性的细胞吞噬活性”也称为“ADCP活性”，是指单核细胞或巨噬细胞经由抗体吞噬靶细胞(诸如肿瘤细胞)的作用或活性。该活性也被称作“抗体依赖性的吞噬作用或活性”。
在本发明中，术语“补体依赖性的细胞毒性活性”也称为“CDC活性”，是指补体经由抗体破坏靶细胞(诸如肿瘤细胞)的作用或活性。
在本发明中，术语“癌症”具有与“肿瘤”相同的含义。
在本发明中，术语“免疫组织化学(IHC)”是指检测组织制品中的抗原的组织学的(组织化学的)方案。免疫组织化学与“免疫抗体方法”同义，并且具有与“免疫染色”相同的含义。
2. 抗原蛋白
(2-1)性能
FGFR是结合成纤维细胞生长因子(FGF)的受体蛋白。在本发明中，FGFR衍生自脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人类。将人FGF和FGFR分别分类成22种FGF (FGF1至FGF14和FGF16至FGF23)和4种具有酪氨酸激酶结构域的FGFR (FGFR1至FGFR4)。这些FGFR各自由以下区域构成：细胞外区域，其包含由2个或3个免疫球蛋白样结构域(IgD1至IgD3)组成的配体结合位点；单次穿过跨膜区域；和细胞内区域，其包含酪氨酸激酶结构域。在它们中，FGFR1、FGFR2和FGFR3各自具有2种被称作IIIb和IIIc的剪接变体。这些亚型的差别在于在IgD3的后一半中的大约50个氨基酸的序列，并且表现出独特的组织分布和配体特异性。FGFR具有下述活性：(1)结合FGF；(2)该结合会使FGFR二聚化；(3)该二聚化会在FGFR的特定酪氨酸残基处将FGFR磷酸化；(4)该磷酸化会促进衔接蛋白诸如FGFR底物2α(FRS2α)的募集；和(5)这会将FGF刺激产生的信号转导至表达FGFR的细胞或组织或活化信号转导。
根据本发明的FGFR2蛋白具有下述性能：
(i)结合FGF
FGFR2 IIIb蛋白通常结合选自FGF1、FGF3、FGF7 (KGF)、FGF10、FGF22和FGF23的一种或两种或更多种FGF。FGFR2 IIIb蛋白可以结合其它FGF，并且可以不结合在上面组中包括的FGF的突变形式。
FGFR2 IIIc蛋白通常结合选自FGF1、FGF2、FGF4、FGF6、FGF9、FGF17、FGF18、FGF21和FGF23的一种或两种或更多种FGF。FGFR2 IIIc蛋白可以结合其它FGF，并且可以不结合在上面组中包括的FGF的突变形式。
(ii)将由FGF刺激产生的信号转导进表达FGFR2的细胞或组织中
由FGF刺激产生的信号的转导例子可以包括，但是不具体限于，FGFR2自磷酸化、FGFR底物的募集及其促进、和经由这些事件对信号传递途径诸如MAPK、PI3K、Akt和细胞外信号调节的激酶(ERK)途径的活化。FGFR底物的例子可以包括FGFR底物2α(FRS2α)。
用于评价该信号转导的活化及其抑制的试验方法没有特别限制，并且可以从本领域已知的方法任意选择。其例子可以包括用于ERK信号转导的评价系统和在后面描述的Elk1萤光素酶报道基因测定。
(iii)根据本发明的FGFR2 IIIb蛋白包含在下述(a)至(d)中的任一项中描述的氨基酸序列(在下文中，被称作“FGFR2 IIIb氨基酸序列”)，由包含FGFR2 IIIb氨基酸序列的氨基酸序列组成，或由FGFR2 IIIb氨基酸序列组成：
(a)由序列表的SEQ ID NO: 70表示的氨基酸序列(图78)；
(b)一种氨基酸序列，其表现出与由序列表的SEQ ID NO: 70表示的氨基酸序列(图78)的80%或更高、82%或更高、84%或更高、86%或更高、88%或更高、90%或更高、92%或更高、94%或更高、96%或更高、98%或更高、或99%或更高序列同一性，并且由具有FGF结合活性的多肽携带；
(c)一种氨基酸序列，其通过1-50个、1-45个、1-40个、1-35个、1-30个、1-25个、1-20个、1-15个、1-10个、1-8个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1或2或1氨基酸的取代、缺失、添加或插入从由序列表的SEQ ID NO: 70表示的氨基酸序列(图78)衍生出，并且由具有FGF结合活性的多肽携带；和
(d)一种氨基酸序列，其由特定核苷酸的核苷酸序列编码，所述特定核苷酸在严谨条件下与具有编码由序列表的SEQ ID NO: 70表示的氨基酸序列(图78)的核苷酸序列的互补核苷酸序列的核苷酸杂交，并且由具有FGF结合活性的多肽携带。
在(b)至(d)中的任一项中描述的多肽可以具有除了FGF结合活性以外的FGFR2活性。
根据本发明的FGFR2 IIIc蛋白包含在下述(a)至(d)中的任一项中描述的氨基酸序列(在下文中，被称作“FGFR2 IIIc氨基酸序列”)，由包含FGFR2 IIIc氨基酸序列的氨基酸序列组成，或由FGFR2 IIIc氨基酸序列组成：
(a)由序列表的SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列(图79)；
(b)一种氨基酸序列，其表现出与由序列表的SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列(图79)的80%或更高、82%或更高、84%或更高、86%或更高、88%或更高、90%或更高、92%或更高、94%或更高、96%或更高、98%或更高或99%或更高序列同一性，并且由具有FGF结合活性的多肽携带；
(c)一种氨基酸序列，其通过1-50个、1-45个、1-40个、1-35个、1-30个、1-25个、1-20个、1-15个、1-10个、1-8个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1个或2个、或1个氨基酸的取代、缺失、添加或插入从由序列表的SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列(图79)衍生出，并且由具有FGF结合活性的多肽携带；和
(d)一种氨基酸序列，其由特定核苷酸的核苷酸序列编码，所述特定核苷酸在严谨条件下与具有编码由序列表的SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列(图79)的核苷酸序列的互补核苷酸序列的核苷酸杂交，并且由具有FGF结合活性的多肽携带。
在(b)至(d)中的任一项中描述的多肽可以具有除了FGF结合活性以外的FGFR2活性。
人FGFR2 IIIb和人FGFR2 IIIc的氨基酸序列的例子可以分别包括氨基酸(a)至(d)以及在NP_075259和NP_000132下公开的氨基酸。
(iv)本发明的FGFR2蛋白可以得自表达FGFR2的细胞、组织或癌组织、从脊椎动物(优选哺乳动物，更优选啮齿动物诸如小鼠或大鼠和人，甚至更优选人、大鼠或小鼠)的组织、细胞培养物等衍生出的细胞。
高度表达FGFR2的正常组织的例子可以包括脑、大肠、甲状腺、子宫、胆囊和皮肤。在某些高度表达FGFR2的癌症(诸如胃癌和乳腺癌)中发现了基因扩增，而在某些高度表达FGFR2的癌症(诸如胰腺癌和卵巢癌)中发现了过表达。高度表达FGFR2 IIIb的培养细胞系的例子可以包括胃癌细胞系和乳腺癌细胞系。高度表达FGFR2 IIIb的培养细胞系的例子可以包括结肠直肠(盲肠)癌细胞系。表达FGFR2 IIIc的癌组织的例子可以包括具有子宫颈癌和非小细胞肺癌的组织。在这些癌症中，子宫颈癌高度表达FGFR2 IIIc。
本发明的FGFR2蛋白可以是天然的(非重组的)或重组的蛋白。FGFR2蛋白也意图包括与另一种肽或蛋白(诸如载体或标签)的融合产物。FGFR2蛋白进一步意图包括具有化学修饰(包括聚合物诸如PEG的添加)和/或生物修饰(包括糖链修饰)的形式。此外，本发明的FGFR2蛋白意图包括FGFR2蛋白片段。具有上面在(i)和/或(ii)中描述的性能的FGFR2蛋白片段被称作FGFR2蛋白的功能片段。
(2-2)抗原基因
根据本发明的FGFR2 IIIb基因包含在下述(a)至(c)中的任一项中描述的核苷酸序列(在下文中，被称作“FGFR2基因序列”)，由包含FGFR2基因序列的核苷酸序列组成，或由FGFR2基因序列组成：
(a)一种核苷酸序列，其编码由序列表的SEQ ID NO: 70表示的氨基酸序列(图78)；
(b)一种核苷酸序列，其在严谨条件下与由编码序列表的SEQ ID NO: 70表示的氨基酸序列(图78)的核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的核苷酸杂交，并且编码具有FGF结合活性的多肽的氨基酸序列；和
(c)一种核苷酸序列，其编码通过1-50个、1-45个、1-40个、1-30个、1-25个、1-20个、1-15个、1-10个、1-8个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1个或2个、或1个氨基酸的取代、缺失、添加或插入从由序列表的SEQ ID NO: 70表示的氨基酸序列(图78)衍生出的氨基酸序列，并且编码具有FGF结合活性的多肽的氨基酸序列。
具有由核苷酸序列(b)或(c)编码的氨基酸序列的多肽可以具有除了FGF结合活性以外的FGFR2活性。
根据本发明的FGFR2 IIIc基因包含在下述(a)至(c)中的任一项中描述的核苷酸序列(在下文中，被称作“FGFR2基因序列”)，由包含FGFR2基因序列的核苷酸序列组成，或由FGFR2基因序列组成：
(a)一种核苷酸序列，其编码由序列表的SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列(图79)；
(b)一种核苷酸序列，其在严谨条件下与由编码序列表的SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列(图79)的核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的核苷酸杂交，并且编码具有FGF结合活性的多肽的氨基酸序列；和
(c)一种核苷酸序列，其编码通过1-50个、1-45个、1-40个、1-30个、1-25个、1-20个、1-15个、1-10个、1-8个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1个或2个、或1个氨基酸的取代、缺失、添加或插入从由序列表的SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列(图79)衍生出的氨基酸序列，并且编码具有FGF结合活性的多肽的氨基酸序列。
具有由核苷酸序列(b)或(c)编码的氨基酸序列的多肽可以具有除了FGF结合活性以外的FGFR2活性。
用FGFR2基因转录物或FGFR2蛋白作为指标，可以测定FGFR2基因的表达和表达水平。前一指标可以通过RT-PCR、RNA印迹杂交等来确定，而后一指标可以通过例如免疫测定诸如酶联免疫吸附测定(在下文中，被称作“ELISA”)、蛋白质印迹法或免疫组织学染色来确定。
(2-3)抗原蛋白的制备
可以如下制备本发明的FGFR2蛋白：从动物组织(包括体液)、源自组织的细胞、或细胞培养物纯化或分离，基因重组，体外翻译，化学合成，等。
(2-3-1)非重组FGFR2的纯化或分离
从表达FGFR2的细胞、正常组织、或癌组织、或源自癌组织的细胞，可以纯化或分离非重组FGFR2蛋白。表达FGFR2的正常组织、癌组织或癌细胞的例子可以包括在段落(2-2)的(iv)中描述的那些，尽管非重组FGFR2蛋白的来源不限于此。
通过本领域技术人员众所周知的方案的组合，诸如分级分离和色谱法，可以进行从这样的组织、细胞、细胞培养物等的纯化或分离。这样的方案包括、但不限于：盐析、凝胶过滤、离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、正相或反相色谱法等。通过用与抗-FGFR2单克隆抗体交联的亲和凝胶填充柱，可以制备用于亲和色谱法的柱。将粗制的或部分地纯化的含有FGFR2蛋白的级分应用于该柱。随后，用灭菌的磷酸盐缓冲盐水(PBS)除去非特异性地吸附的物质，然后可以向其施加用于洗脱的缓冲溶液，由此选择性地除去FGFR2蛋白。可以对含有FGFR2蛋白的溶液进行凝胶过滤或缓冲液替换和/或浓缩(使用浓缩器诸如Centriprep)。
(2-3-2)重组FGFR2蛋白的制备
还可以以重组形式制备本发明的FGFR2蛋白。具体地，用编码FGFR2蛋白或FGFR2蛋白片段的氨基酸序列的基因转染宿主细胞，并可以从细胞培养物回收FGFR2蛋白。例如，将FGFR2基因或它的片段插入表达载体中。随后，用得到的重组载体转染原核或真核宿主细胞，并可以将得到的重组细胞温育了，由此表达FGFR2蛋白。可以使用本领域已知的表达模式，诸如分泌表达、可溶形式的细胞内表达或包涵体形式的表达。并且，不仅可以将FGFR2蛋白表达为具有与天然FGFR2蛋白相同氨基端(N端)和/或羧基端(C端)的分子，而且可以将其表达为具有分泌信号、细胞内定位信号、亲和纯化标签或配偶肽的融合蛋白。通过适当的方法组合，诸如在(2-3-1)中描述的分级分离和色谱法，可以从这样的重组细胞培养物纯化或分离FGFR2蛋白。
非重组FGFR2蛋白的纯化或分离
通过本领域技术人员众所周知的方法，可以制备FGFR2基因或它的片段。
其例子可以包括：聚合酶链式反应(在下文中，被称作“PCR”；Saiki,R.K.,等人，Science(1988)239,第487-489页)，其中用从表达FGFR2的细胞、组织等制备的cDNA文库作为模板，使用一组能够特异性地扩增序列的引物；反转录PCR (在下文中，被称作”RT-PCR”)，其中用从表达FGFR2的细胞、组织等制备的mRNA级分作为模板，使用能够反转录序列的引物和一组能够特异性地扩增序列的引物；使用免疫测定的表达克隆；和使用纯化的FGFR2蛋白的部分氨基酸序列的cDNA克隆。
(2-3-3)体外翻译
还可以通过体外翻译来制备本发明的FGFR2蛋白。这样的翻译方法没有特别限制，只要该方法采用无细胞翻译系统即可，所述无细胞翻译系统包含转录和翻译必需的酶、底物和能量物质。其例子可以包括使用Roche Diagnostics K.K.制造的Rapid Translation System (RTS)的方法。
(2-3-4)化学合成
还可以通过化学合成来制备本发明的FGFR2蛋白。化学合成方法的例子可以包括固相肽合成方法诸如Fmoc和Boc合成方法。
3. 抗体
(3-1)抗体的分类
本发明的抗体可以是单克隆或多克隆抗体。本发明的单克隆抗体的例子可以包括非人动物衍生的抗体(非人动物抗体)、人衍生的抗体(人抗体)、嵌合抗体和人源化抗体。
非人动物抗体的例子可以包括从脊椎动物诸如哺乳动物和禽类衍生出的抗体。哺乳动物衍生的抗体的例子可以包括啮齿动物衍生的抗体诸如小鼠抗体和大鼠抗体。禽类衍生的抗体的例子可以包括鸡抗体。抗-人FGFR2大鼠单克隆抗体的例子可以包括FR2-10、FR2-13和FR2-14。
嵌合抗体的例子可以包括、但不限于：包含与人抗体(人免疫球蛋白)恒定区结合的非人动物抗体衍生的可变区的抗体。包含与人抗体恒定区结合的非人动物抗体衍生的可变区的嵌合抗体的例子可以包括cFR2-10、cFR2-13和cFR2-14，它们具有从上述的大鼠单克隆抗体FR2-10、FR2-13或FR2-14衍生出的重链和轻链可变区以及人重链和轻链恒定区。
人源化抗体的例子可以包括、但不限于：用非人动物抗体的可变区中的CDR嫁接的人抗体(人免疫球蛋白可变区)，用CDR以及用非人动物抗体的框架区的部分序列嫁接的人抗体，和具有在这些人源化抗体中的任一个中取代一个或两个或更多个非人动物抗体衍生的氨基酸的人抗体氨基酸的抗体。在非人动物抗体的可变区中的CDR的例子可以包括从上述的FR2-10、FR2-13或FR2-14衍生出的重链可变区中的CDRH1至CDRH3以及轻链可变区中的CDRL1至CDRL3。
人抗体没有特别限制，只要所述抗体会识别本发明的抗原。其例子可以包括：结合与具有本发明的抗体的CDR的抗体的情况下相同位点的人抗体，和结合与上述的FR2-10、FR2-13或FR2-14的情况下相同的FGFR2上的位点的人抗体。
根据本发明的抗体可以包含从多个不同抗体衍生出的部分，只要所述抗体具有FGFR2结合活性。这样的抗体的例子可以包括：包含在多个不同抗体之间交换的重链和/或轻链的抗体，包含在多个不同抗体之间交换的全长重链和/或轻链的抗体，包含在多个不同抗体之间交换的可变区或恒定区的抗体，和包含在多个不同抗体之间交换的全部或一些CDR的抗体。嵌合抗体的重链和轻链可变区可以从本发明的不同抗体衍生出。人源化抗体的重链和轻链可变区中的CDRH1至CDRH3和CDRL1至CDRL3可以从本发明的2种或更多种不同抗体衍生出。人抗体的重链和轻链可变区中的CDRH1至CDRH3和CDRL1至CDRL3可以是由本发明的2种或更多种不同抗体携带的CDR的组合。这样的包含从多个不同抗体衍生出的部分的抗体可以具有在段落(3-3)至(3-6)中描述的活性中的一种或两种或更多种。
本发明的单克隆抗体的同种型的例子可以包括、但是不具体限于：IgG诸如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，IgM，IgA诸如IgA1和IgA2，IgD和IgE，并且可以优选地包括IgG和IgM。通过例如Ouchterlony试验、ELISA或放射免疫测定(在下文中，被称作“RIA”)，可以确定单克隆抗体的同种型和亚类。可以使用市售的鉴定用试剂盒(例如，Mouse Typer Kit; Bio-Rad Laboratories, Inc., 和RAT MONOCLONAL ANTIBODY ISOTYPING TEST KIT: AbD Serotec)。
(3-2)抗体的结合特异性
本发明的抗体会识别FGFR2蛋白。换而言之，本发明的抗体会结合FGFR2蛋白。这样的抗体被称作“抗-FGFR2抗体”。优选地，本发明的抗体特异性地识别FGFR2蛋白。换而言之，优选地，本发明的抗体特异性地结合FGFR2蛋白。更优选地，本发明的抗体特异性地结合FGFR2 IIIb蛋白和/或FGFR2 IIIc蛋白。甚至更优选地，本发明的抗体特异性地结合FGFR2 IIIb蛋白和/或FGFR2 IIIc蛋白的免疫球蛋白样结构域(在下文中，被称作“Ig-样结构域”)。这样的Ig-样结构域的例子可以包括Ig-样结构域2和Ig-样结构域3。
在本发明中，“特异性识别”，即，“特异性结合”，是指不是非特异性吸附的结合。用于确定结合是否具有特异性的标准的例子可以包括解离常数(在下文中，被称作“KD”)。优选地，本发明的抗体对FGFR2蛋白具有1×10-5或更低、5×10-6或更低、2×10-6或更低、或1×10-6或更低、更优选地5×10-7或更低、2×10-7或更低、或1×10-7或更低、甚至更优选地5×10-8或更低、2×10-8或更低、或1×10-8或更低、进一步更优选地5×10-9或更低、2×10-9或更低、或1×10-9或更低、最优选地5×10-10或更低、2×10-10或更低、或1×10-10或更低的KD值。
在本发明中，通过ELISA、RIA、表面等离子体共振(在下文中，被称作”SPR”)分析等，可以测定或确定抗体与抗原的结合。在SPR分析中使用的设备的例子可以包括BIAcore(TM)(由GE Healthcare Bio-Sciences Corp.制造)、ProteOn(TM) (由Bio-Rad Laboratories, Inc.制造)、SPR-Navi(TM) (由BioNavis Oy Ltd.制造)、Spreeta(TM) (由Texas Instruments Inc.制造)、SPRi-PlexII(TM) (由Horiba, Ltd. 制造)和Autolab SPR(TM) (由Metrohm Japan Ltd. 制造)。通过流式细胞术、细胞-ELISA等，可以测定抗体与在细胞表面上表达的抗原的结合。
(3-3)抗体的抗肿瘤活性
本发明的抗体具有抗肿瘤活性。优选地，本发明的抗体具有体内抗肿瘤活性。在本发明中，“抗肿瘤活性”具有与“抗癌活性”相同的含义。
在本发明中，抗肿瘤活性是指抑制肿瘤组织和/或肿瘤细胞的生长、恶性转化、侵袭或转移、肿瘤大小或重量的增加等的活性。
根据标准方法，可以评价抗肿瘤活性。可以将体内抗肿瘤活性评价为对人肿瘤的作用，例如，通过使用人癌组织或癌细胞移植的非人动物模型(异种移植物)。用于异种移植物的非人动物的例子可以包括小鼠诸如裸鼠和大鼠。
可替换地，可以将抗肿瘤活性评价为癌细胞生长的遏制或抑制活性。
(3-4)抗体的细胞毒性活性
本发明的抗-FGFR2抗体可以具有抗体依赖性的细胞的细胞毒性的(ADCC)活性和/或补体依赖性的细胞毒性的(CDC)活性和/或抗体依赖性的细胞吞噬(ADCP)活性。优选地，本发明的抗体具有ADCC活性。更优选地，本发明的抗体对表达FGFR2的细胞具有ADCC活性。通过本领域已知的方法，可以测定ADCC活性、CDC活性和ADCP活性。
在ADCC活性测定中使用表达目标抗原的细胞(靶细胞)和能够杀死靶细胞的效应细胞。效应细胞经由Fcγ受体识别与靶细胞结合的抗体的Fc区。效应细胞通过从Fcγ受体转导的信号而杀死靶细胞。在测定具有人衍生的Fc区的抗体的ADCC活性的情况下，使用人NK细胞作为效应细胞。通过本领域已知的方法，可以从人外周血单核细胞(PBMC)制备人NK细胞。可替换地，可以将PBMC直接用作效应细胞。
在ADCP活性测定中使用表达目标抗原的细胞(靶细胞)和能够摄入靶细胞的效应细胞(例如，单核细胞或巨噬细胞)。这些效应细胞可以如下制备：通过本领域已知的方法，诱导单核细胞级分分化成巨噬细胞，其中所述单核细胞级分已经通过本领域已知的方法与人外周血单核细胞(PBMC)分离。
(3-5)抗体对信号转导的影响
通过FGFR2介导的FGF信号，也可以评价本发明的抗-FGFR2抗体的生物活性和性能。FGFR2介导的经由FGF刺激的信号转导的例子可以包括、但是不具体限于FGFR2自磷酸化、FGFR底物的募集及其促进、和经由这些事件对信号传递途径诸如MAPK、PI3K、Akt和细胞外信号调节的激酶(ERK)途径的活化。FGFR底物的例子可以包括FGFR底物2α(FRS2α)。用于评价该信号转导及其抑制的活化的试验方法没有特别限制，并且可以从本领域已知的方法任意选择。其例子可以包括用于ERK信号转导的评价系统和在后面描述的Elk1萤光素酶报道基因测定。
优选地，本发明的抗体也具有对FGFR2的中和活性。更优选地，本发明的抗体具有对FGFR2 IIIb和/或FGFR2 IIIc的中和活性。所述中和活性是指抑制或遏制FGFR2配体对FGFR2的活化的活性。例如，可以证实抑制FGF依赖性的FGFR2介导的信号、信号转导等的抗体具有这样的中和活性。中和活性的示例性测定显示在实施例2和实施例11的2)-3中。
(3-6)抗体抑制受体-配体结合的活性
优选地，本发明的抗体抑制FGFR2与它的配体的结合。更优选地，本发明的抗体抑制FGFR2 IIIb和/或FGFR2 IIIc与FGF的结合。受体-配体结合的这种抑制可以是竞争性抑制和非竞争性抑制中的任一种。FGFR2 IIIb和FGFR2 IIIc的配体的例子分别可以包括FGF1、FGF3、FGF7、FGF10、FGF22和FGF23、以及FGF1、FGF2、FGF4、FGF6、FGF9、FGF17、FGF18、FGF21和FGF23。
(3-7)单克隆抗体
本发明提供了一种单克隆抗体。所述单克隆抗体包括，例如，非人动物衍生的单克隆抗体，诸如大鼠、小鼠、兔、鸡和鱼抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、其功能片段，以及这些抗体或功能片段的修饰形式。在它们中，大鼠单克隆抗体的例子可以包括FR2-10、FR2-13和FR2-14抗体。
FR2-10是通过在实施例1中描述的方法得到的抗-人FGFR2大鼠单克隆抗体。FR2-10的重链可变区的的核苷酸序列描述在序列表的SEQ ID NO: 11 (图19)中，且它的氨基酸序列描述在SEQ ID NO: 12 (图20)中。FR2-10的轻链可变区的的核苷酸序列描述在序列表的SEQ ID NO: 20 (图28)中，且它的氨基酸序列描述在SEQ ID NO: 21 (图29)中。FR2-10的CDRH1的氨基酸序列描述在SEQ ID NO: 52 (图60)中。其CDRH2的氨基酸序列描述在SEQ ID NO: 53 (图61)中。其CDRH3的氨基酸序列描述在SEQ ID NO: 54 (图62)中。其CDRL1的氨基酸序列描述在SEQ ID NO: 61 (图69)中。其CDRL2的氨基酸序列描述在SEQ ID NO: 62 (图70)中。其CDRL3的氨基酸序列描述在SEQ ID NO: 63 (图71)中。
FR2-13是通过在实施例1中描述的方法得到的抗-人FGFR2大鼠单克隆抗体。FR2-13的重链可变区的核苷酸序列描述在序列表的SEQ ID NO: 13 (图21)中，且它的氨基酸序列描述在SEQ ID NO: 14 (图22)中。FR2-13的轻链可变区的核苷酸序列描述在序列表的SEQ ID NO: 23 (图31)中，且它的氨基酸序列描述在SEQ ID NO: 24 (图32)中。FR2-13的CDRH1的氨基酸序列描述在SEQ ID NO: 55 (图63)中。其CDRH2的氨基酸序列描述在SEQ ID NO: 56 (图64)中。其CDRH3的氨基酸序列描述在SEQ ID NO: 57 (图65)中。其CDRL1的氨基酸序列描述在SEQ ID NO: 64 (图72)中。其CDRL2的氨基酸序列描述在SEQ ID NO: 65 (图73)中。其CDRL3的氨基酸序列描述在SEQ ID NO: 66 (图74)中。
FR2-14是通过在实施例1中描述的方法得到的抗-人FGFR2大鼠单克隆抗体。FR2-14的重链可变区的核苷酸序列描述在序列表的SEQ ID NO: 15 (图23)中，且它的氨基酸序列描述在SEQ ID NO: 16 (图24)中。FR2-14的轻链可变区的核苷酸序列描述在序列表的SEQ ID NO: 25 (图33)中，且它的氨基酸序列描述在SEQ ID NO: 26 (图34)中。FR2-14的CDRH1的氨基酸序列描述在SEQ ID NO: 58 (图66)中。其CDRH2的氨基酸序列描述在SEQ ID NO: 59 (图67)中。其CDRH3的氨基酸序列描述在SEQ ID NO: 60 (图68)中。其CDRL1的氨基酸序列描述在SEQ ID NO: 67 (图75)中。其CDRL2的氨基酸序列描述在SEQ ID NO: 68 (图76)中。其CDRL3的氨基酸序列描述在SEQ ID NO: 69 (图77)中。
本发明的抗体突变体优选地表现出，例如，降低的对蛋白降解或氧化的敏感性，改善的生物活性、改善的结合抗原的能力、或赋予它的物理化学性能或功能性能。这样的抗体突变体的例子可以包括具有通过保守氨基酸取代从原始抗体的氨基酸序列衍生出的氨基酸序列的抗体。所述保守氨基酸取代是在与氨基酸侧链有关的氨基酸基团中发生的取代。
优选的氨基酸基团如下：酸性基团，包括天冬氨酸和谷氨酸；碱性基团，包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸；非极性基团，包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；和不带电荷的极性家族，包括甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。其它优选的氨基酸基团如下：脂族羟基基团，包括丝氨酸和苏氨酸；含有酰胺的基团，包括天冬酰胺和谷氨酰胺；脂族基团，包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；和芳族基团，包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。优选地，在不降低原始抗体的抗原结合活性的情况下进行抗体突变体中的这样的氨基酸取代。
当在C端侧上与其连接的氨基酸具有小侧链时，蛋白中所含的天冬氨酸通过异构化容易地转化成异天冬氨酸。另一方面，天冬酰胺通过脱酰胺化容易地转化成天冬氨酸，且可以通过异构化进一步转化成异天冬氨酸。这样的异构化或脱酰胺化的进展可以影响蛋白的稳定性。因此，可以用不同的氨基酸取代蛋白中的天冬氨酸或天冬酰胺或例如与其邻近的氨基酸，以便防止这样的异构化或脱酰胺化。优选地，具有这样的氨基酸取代的抗体突变体维持原始抗体的抗原结合活性。
本发明还包括，例如：抗体突变体，其具有通过保守氨基酸取代从本发明的FR2-10、FR2-13或FR2-14的氨基酸序列衍生出的氨基酸序列；和小鼠抗体、大鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，其包含具有这样的氨基酸序列的CDR：在所述氨基酸序列中，保守氨基酸突变发生在从FR2-10、FR2-13或FR2-14衍生出的CDRH1至CDRH3和CDRL1至CDRL3中的任一个的氨基酸序列中。
本发明的抗体的突变体包括结合人FGFR2的抗体突变体，其包含具有特定氨基酸序列的CDRH1至CDRH3和CDRL1至CDRL3，所述特定氨基酸序列源自通过不同氨基酸对1个至几个、优选1-3个、更优选地1个或2个、最优选地1个氨基酸的取代而从本发明的FR2-10、FR2-13或FR2-14衍生出的CDRH1至CDRH3和CDRL1至CDRL3中的任意一个或两个或更多个的氨基酸序列。
FR2-14的突变体的优选例子可以包括这样的抗体：其包含具有特定氨基酸序列的CDRH3，所述特定氨基酸序列通过不同氨基酸对氨基酸的取代而从CDRH3氨基酸序列衍生出。
其中重链CDRH3的氨基酸被取代的、FR2-14的突变体的优选例子可以包括：用谷氨酸取代第一个氨基酸天冬氨酸(在SEQ ID NO: 51 (图59)的位置118处的氨基酸)的突变体；用酪氨酸、丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、精氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、亮氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、组氨酸、苯丙氨酸或谷氨酸取代第二个氨基酸甘氨酸(在SEQ ID NO: 51 (图59)的位置119处的氨基酸)的突变体；和用丙氨酸取代第8个氨基酸苏氨酸的突变体。
抗体突变体还包括具有从多个抗体衍生出的CDRH1至CDRH3和CDRL1至CDRL3的抗体。这样的突变体的例子可以包括，包含从某种抗体衍生出的CDRH3以及从另一种抗体衍生出的CDRH1、CDRH2和CDRL1至CDRL3的抗体突变体。
根据本发明的“抗体”也包括这些抗体突变体。
本发明的抗体的恒定区没有特别限制。优选地，在用于治疗或预防人类疾病的本发明的抗体中，使用从人抗体衍生出的恒定区。人抗体的重链恒定区的例子可以包括Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、C μ、Cδ、Cα1、Cα2和Cε。人抗体的轻链恒定区的例子可以包括Cκ和Cλ。
(3-8)嵌合抗体
本发明的抗-FGFR2嵌合抗体或其功能片段具有抗肿瘤活性。优选地，本发明的抗-FGFR2嵌合抗体或其功能片段具有体内抗肿瘤活性。也优选地，这样的嵌合抗体或其功能片段特异性地结合FGFR2 IIIb蛋白和/或FGFR2 IIIc蛋白。更优选地，所述嵌合抗体或其功能片段结合这些蛋白的Ig-样结构域。优选地，这样的嵌合抗体进一步具有ADCC活性和/或ADCP活性。本发明的嵌合抗体或其功能片段还具有对FGFR2的中和活性。优选地，本发明的嵌合抗体或其功能片段具有对FGFR2 IIIb和/或FGFR2 IIIc的中和活性。更优选地，本发明的嵌合抗体或其功能片段具有对FGFR2 IIIb和FGFR2 IIIc的中和活性。优选地，本发明的嵌合抗体或其功能片段进一步抑制FGFR2与它的配体的结合。
被例举为本发明的大鼠-人嵌合抗体的cFR2-10的轻链的核苷酸序列和氨基酸序列以及其重链的核苷酸序列和氨基酸序列分别显示在序列表的SEQ ID NO: 31、32、35和36 (图39、40、43和44)中。同样地，cFR2-13的轻链的核苷酸序列和氨基酸序列及其重链的核苷酸序列和氨基酸序列分别显示在序列表的SEQ ID NO: 39、40、43和44 (图47、48、51和52)中。cFR2-14的轻链的核苷酸序列和氨基酸序列及其重链的核苷酸序列和氨基酸序列分别显示在序列表的SEQ ID NO: 47、48、50和51 (图55、56、58和59)中。轻链的核苷酸序列中的第1-60位核苷酸和轻链的氨基酸序列中的第1-20位氨基酸分别代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟轻链的核苷酸序列和氨基酸序列中。同样地，重链的核苷酸序列中的第1-57位核苷酸和重链的氨基酸序列中的第1-19位氨基酸分别代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链的核苷酸序列和氨基酸序列中。
(3-9)抗体的功能片段
根据一个方面，本发明提供了本发明的抗-FGFR2抗体的功能片段。所述抗体的功能片段是指维持所述抗体的功能的至少一部分的片段。这样的抗体功能的例子通常可以包括抗原结合活性、调节抗原活性的活性、抗体依赖性的细胞的细胞毒性的(ADCC)活性、和抗体依赖性的细胞吞噬(ADCP)活性。本发明的抗-FGFR2抗体的功能的例子可以包括FGFR2蛋白结合活性、ADCC活性、ADCP活性、对FGFR2的中和活性、体内抗肿瘤活性、和抑制FGFR2与它的配体的结合的活性。
所述抗体的功能片段没有特别限制，只要所述抗体的片段维持所述抗体的活性的至少一部分即可。其例子可以包括、但不限于：Fab、F(ab')2、Fv、包含经由适当接头连接的重链和轻链Fv的单链Fv(scFv)、双体、线性抗体、从抗体片段形成的多特异性抗体和Fab'，所述Fab'是通过在还原条件下处理F(ab')2得到的抗体可变区的单价片段。本发明的抗体的功能片段也意图包括包含本发明的抗体的片段以及其它部分(诸如保留接头部分的scFv)的分子。
在所述抗体的功能片段的含义中也包括这样的分子：其通过删除它的氨基端和/或羧基端处的1个至几个或更多个氨基酸而从抗体蛋白衍生出，并且维持所述抗体的功能的至少一部分。例如，已知由培养的哺乳动物细胞生产的抗体的重链缺少在羧基端处的赖氨酸残基(Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995))。并且，已知这样的抗体的重链缺少在羧基端处的2个氨基酸残基(甘氨酸和赖氨酸)，并且相反具有在羧基端处的酰胺化的脯氨酸残基(Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007))。但是，这些重链序列中的缺失和修饰不会影响抗体的结合抗原或它的效应子功能的能力(补体激活、抗体依赖性的细胞毒性效应等)。所述抗体的功能片段的这样的修饰形式也被本发明的抗体或其功能片段、或所述抗体或功能片段的修饰形式(在下文中描述)包括。
本发明的抗体或其功能片段可以是对至少2类不同抗原具有特异性的多特异性抗体。所述多特异性抗体不限于结合2类不同抗原的双特异性抗体，并且在本发明的“多特异性抗体”的含义中也包括对3类或更多类不同抗原具有特异性的抗体。
本发明的多特异性抗体可以是全长抗体或其功能片段(例如，双特异性的F(ab')2抗体)。还可以通过连接两类抗体的重链和轻链(HL对)来制备所述双特异性抗体。可替换地，可以如下得到双特异性抗体：使生产2类或更多类单克隆抗体的杂交瘤融合，以制备生产双特异性抗体的融合细胞(Millstein等人,Nature(1983)305, 第537-539页)。还可以以与上面相同的方式制备多特异性的抗体。
根据一个方面，本发明的抗体是单链抗体(单链Fv；在下文中，被称作“scFv”)。通过经由多肽接头连接抗体的重链和轻链V区域而得到scFv (Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113, Rosenburg和Moore, 编, Springer Verlag, New York, 第269-315页(1994)；和Nature Biotechnology (2005), 23, 第1126-1136页)。并且，包含经由多肽接头连接的2个scFv的双-scFv可以用作双特异性抗体。可替换地，包含3个或更多个scFv的多-scFv可以用作多特异性抗体。
本发明包括单链免疫球蛋白，其包含经由适当接头连接的抗体的全长重链和轻链序列(Lee, H-S, 等人, Molecular Immunology (1999), 36, 第61-71页；和Shirrmann, T. 等人, mAbs (2010), 2 (1)第1-4页)。这样的单链免疫球蛋白可以二聚化，由此维持与最初为四聚体的抗体类似的结构和活性。并且，本发明的抗体可以是具有单个重链可变区且不具有轻链序列的抗体。已经这样的抗体(被称作单结构域抗体(sdAb)或纳米体(nanobody))会维持结合抗原的能力(Muyldemans S. 等人, Protein Eng. (1994), 7 (9), 1129-35；和Hamers-Casterman C. 等人, Nature (1993), 363 (6428), 446-8)。在根据本发明的抗体的功能片段的含义中也包括这些抗体。
(3-10)人源化抗体和人抗体
根据一个方面，本发明提供了一种人源化抗体或其功能片段。
本发明的抗-FGFR2人源化抗体或其功能片段具有抗肿瘤活性。优选地，本发明的抗-FGFR2人源化抗体或其功能片段具有体内抗肿瘤活性。也优选地，这样的人源化抗体或其功能片段特异性地结合FGFR2 IIIb蛋白和/或FGFR2 IIIc蛋白。更优选地，所述人源化抗体或其功能片段结合这些蛋白的Ig-样结构域。优选地，这样的人源化抗体或其功能片段进一步具有ADCC活性和/或ADCP活性。本发明的人源化抗体或其功能片段还具有对FGFR2的中和活性。优选地，本发明的人源化抗体或其功能片段具有对FGFR2 IIIb和/或FGFR2 IIIc的中和活性。更优选地，本发明的人源化抗体或其功能片段具有对FGFR2 IIIb和FGFR2 IIIc的中和活性。优选地，本发明的人源化抗体或其功能片段进一步抑制FGFR2与它的配体的结合。
本发明的人源化抗体的优选例子可以包括如下面在A至C中所述的具有大鼠FR2-10抗体、大鼠FR2-13抗体或大鼠FR2-14抗体的重链CDRH1至CDRH3和轻链CDRL1至CDRL3的人源化抗体。
(A. 具有大鼠FR2-10抗体的重链CDRH1至CDRH3和轻链CDRL1至CDRL3的人源化抗体)
本发明的抗-FGFR2人源化抗体或其功能片段的例子可以包括由重链和轻链组成并且识别本发明的FGFR2蛋白的人源化抗体，所述重链具有包含以下CDR的可变区：由序列表的SEQ ID NO: 52表示的氨基酸序列(图60)组成的CDRH1，由序列表的SEQ ID NO: 53表示的氨基酸序列(图61)组成的CDRH2，和由序列表的SEQ ID NO: 54表示的氨基酸序列(图62)组成的CDRH3；所述轻链具有包含以下CDR的可变区：由序列表的SEQ ID NO: 61表示的氨基酸序列(图69)组成的CDRL1，由序列表的SEQ ID NO: 62表示的氨基酸序列(图70)组成的CDRL2，和由序列表的SEQ ID NO: 63表示的氨基酸序列(图71)组成的CDRL3；以及维持所述抗体的FGFR2蛋白结合活性的抗体片段；和所述抗体或所述片段的突变体。
(B. 具有大鼠FR2-13抗体的重链CDRH1至CDRH3和轻链CDRL1至CDRL3的人源化抗体)
抗-FGFR2人源化抗体的替代实施例或其功能片段可以包括由重链和轻链组成并且识别本发明的FGFR2蛋白的人源化抗体，所述重链具有包含以下CDR的可变区：由序列表的SEQ ID NO: 55表示的氨基酸序列(图63)组成的CDRH1，由序列表的SEQ ID NO: 56表示的氨基酸序列(图64)组成的CDRH2，和由序列表的SEQ ID NO: 57表示的氨基酸序列(图65)组成的CDRH3；所述轻链具有包含以下CDR的可变区：由序列表的SEQ ID NO: 64表示的氨基酸序列(图72)组成的CDRL1，由序列表的SEQ ID NO: 65表示的氨基酸序列(图73)组成的CDRL2，和由序列表的SEQ ID NO: 66表示的氨基酸序列(图74)组成的CDRL3；以及维持所述抗体的FGFR2蛋白结合活性的抗体片段；和它们的突变体。
(C. 具有大鼠FR2-14抗体的重链CDRH1至CDRH3和轻链CDRL1至CDRL3的人源化抗体)
抗-FGFR2人源化抗体的替代实施例或其功能片段可以包括由重链和轻链组成并且识别本发明的FGFR2蛋白的人源化抗体，所述重链具有包含以下CDR的可变区：由序列表的SEQ ID NO: 58表示的氨基酸序列(图66)组成的CDRH1，由序列表的SEQ ID NO: 59表示的氨基酸序列(图67)组成的CDRH2，和由序列表的SEQ ID NO: 60表示的氨基酸序列(图68)组成的CDRH3；所述轻链具有包含以下CDR的可变区：由序列表的SEQ ID NO: 67表示的氨基酸序列(图75)组成的CDRL1，由序列表的SEQ ID NO: 68表示的氨基酸序列(图76)组成的CDRL2，和由序列表的SEQ ID NO: 69表示的氨基酸序列(图77)组成的CDRL3；以及维持所述抗体的FGFR2蛋白结合活性的抗体片段；和它们的突变体。
优选的本发明的人源化抗体不限于在上面A至C中描述的那些。所述人源化抗体更优选地是人源化FR2-14抗体和它的突变体。其例子包括、但不限于hFR2-14_H1/L1至hFR2-14_H19/L1。更优选的本发明的人源化抗体还包括，例如，包含重链和轻链的抗体，所述重链包含人源化抗体hFR2-14_H1/L1至hFR2-14_H19/L1中的任一个的重链可变区，所述轻链包含人源化抗体hFR2-14_H1/L1至hFR2-14_H19/L1中的任一个的轻链可变区。
hFR2-14_H1/L1是在实施例8中得到的人源化抗体。该抗体的轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 72 (图80)的第61-705位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 73 (图81)的第21-235位氨基酸。该抗体的重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 74 (图82)的第58-1401位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 75 (图83)的第20-467位氨基酸。所述抗体因为它的高Tm值而具有优良的构象稳定性，且具有对FGFR2的高结合活性、FGFR2配体依赖性的FGFR2信号中和活性、ADCC活性和体内抗肿瘤活性(参见实施例)。
hFR2-14_H2/L1是在实施例8中得到的人源化抗体。该抗体的轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 72 (图80)的第61-705位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 73 (图81)的第21-235位氨基酸。该抗体的重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 76 (图84)的第58-1401位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 77 (图85)的第20-467位氨基酸。所述抗体因为它的高Tm值而具有优良的构象稳定性，且具有对FGFR2的高结合活性、FGFR2配体依赖性的FGFR2信号中和活性、ADCC活性和体内抗肿瘤活性(参见实施例)。
hFR2-14_H3/L1是在实施例8中得到的人源化抗体。该抗体的轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 72 (图80)的第61-705位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 73 (图81)的第21-235位氨基酸。该抗体的重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 78 (图86)的第58-1401位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 79 (图87)的第20-467位氨基酸。所述抗体因为它的高Tm值而具有优良的构象稳定性，且具有对FGFR2的高结合活性、FGFR2配体依赖性的FGFR2信号中和活性、ADCC活性和体内抗肿瘤活性(参见实施例)。
hFR2-14_H4/L1是在实施例8中得到的人源化抗体。该抗体的轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 72 (图80)的第61-705位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 73 (图81)的第21-235位氨基酸。该抗体的重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 80 (图88)的第58-1401位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 81 (图89)的第20-467位氨基酸。所述抗体因为它的高Tm值而具有优良的构象稳定性，且具有对FGFR2的高结合活性、FGFR2配体依赖性的FGFR2信号中和活性、ADCC活性和体内抗肿瘤活性(参见实施例)。
hFR2-14_H5/L1是在实施例8中得到的人源化抗体。该抗体的轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 72 (图80)的第61-705位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 73 (图81)的第21-235位氨基酸。该抗体的重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 82 (图90)的第58-1401位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 83 (图91)的第20-467位氨基酸。所述抗体因为它的高Tm值而具有优良的构象稳定性，具有对FGFR2的高结合活性、优良热稳定性、FGFR2配体依赖性的FGFR2信号中和活性和体内抗肿瘤活性，并甚至当暴露于严重状况时维持它的高抗原结合活性(参见实施例)。
hFR2-14_H6/L1是在实施例8中得到的人源化抗体。该抗体的轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 72 (图80)的第61-705位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 73 (图81)的第21-235位氨基酸。该抗体的重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 84 (图92)的第58-1401位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 85 (图93)的第20-467位氨基酸。所述抗体因为它的高Tm值而具有优良的构象稳定性，且具有对FGFR2的高结合活性和FGFR2配体依赖性的FGFR2信号中和活性(参见实施例)。
hFR2-14_H7/L1是在实施例8中得到的人源化抗体。该抗体的轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 72 (图80)的第61-705位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 73 (图81)的第21-235位氨基酸。该抗体的重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 86 (图94)的第58-1401位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 87 (图95)的第20-467位氨基酸。所述抗体因为它的高Tm值而具有优良的构象稳定性，且具有对FGFR2的高结合活性和FGFR2配体依赖性的FGFR2信号中和活性(参见实施例)。
hFR2-14_H8/L1是在实施例8中得到的人源化抗体。该抗体的轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 72 (图80)的第61-705位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 73 (图81)的第21-235位氨基酸。该抗体的重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 88 (图96)的第58-1401位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 89 (图97)的第20-467位氨基酸。所述抗体因为它的高Tm值而具有优良的构象稳定性，具有对FGFR2的高结合活性、优良热稳定性、FGFR2配体依赖性的FGFR2信号中和活性、ADCC活性和体内抗肿瘤活性，并甚至当暴露于严重状况时维持它的高抗原结合活性(参见实施例)。
hFR2-14_H9/L1是在实施例8中得到的人源化抗体。该抗体的轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 72 (图80)的第61-705位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 73 (图81)的第21-235位氨基酸。该抗体的重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 90 (图98)的第58-1401位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 91 (图99)的第20-467位氨基酸。所述抗体因为它的高Tm值而具有优良的构象稳定性，且具有对FGFR2的高结合活性, 优良热稳定性、FGFR2配体依赖性的FGFR2信号中和活性和体内抗肿瘤活性(参见实施例)。
hFR2-14_H10/L1是在实施例8中得到的人源化抗体。该抗体的轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 72 (图80)的第61-705位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 73 (图81)的第21-235位氨基酸。该抗体的重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 92 (图100)的第58-1401位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 93 (图101)的第20-467位氨基酸。所述抗体因为它的高Tm值而具有优良的构象稳定性，且具有对FGFR2的高结合活性和FGFR2配体依赖性的FGFR2信号中和活性(参见实施例)。
hFR2-14_H11/L1是在实施例8中得到的人源化抗体。该抗体的轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 72 (图80)的第61-705位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 73 (图81)的第21-235位氨基酸。该抗体的重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 94 (图102)的第58-1401位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 95 (图103)的第20-467位氨基酸。所述抗体因为它的高Tm值而具有优良的构象稳定性，具有对FGFR2的高结合活性、优良热稳定性、FGFR2配体依赖性的FGFR2信号中和活性、ADCC活性和体内抗肿瘤活性，并甚至当暴露于严重状况时维持它的高抗原结合活性(参见实施例)。
hFR2-14_H12/L1是在实施例8中得到的人源化抗体。该抗体的轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 72 (图80)的第61-705位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 73 (图81)的第21-235位氨基酸。该抗体的重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 96 (图104)的第58-1401位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 97 (图105)的第20-467位氨基酸。所述抗体因为它的高Tm值而具有优良的构象稳定性，具有对FGFR2的高结合活性、优良热稳定性、FGFR2配体依赖性的FGFR2信号中和活性、ADCC活性、ADCP活性、抑制FGFR2配体与FGFR2的结合的活性、和体内抗肿瘤活性，并甚至当暴露于严重状况时维持它的高抗原结合活性(参见实施例)。
hFR2-14_H13/L1是在实施例8中得到的人源化抗体。该抗体的轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 72 (图80)的第61-705位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 73 (图81)的第21-235位氨基酸。该抗体的重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 98 (图106)的第58-1401位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 99 (图107)的第20-467位氨基酸。所述抗体因为它的高Tm值而具有优良的构象稳定性，且具有对FGFR2的高结合活性和FGFR2配体依赖性的FGFR2信号中和活性(参见实施例)。
hFR2-14_H14/L1是在实施例8中得到的人源化抗体。该抗体的轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 72 (图80)的第61-705位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 73 (图81)的第21-235位氨基酸。该抗体的重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 100 (图108)的第58-1401位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 101 (图109)的第20-467位氨基酸。所述抗体因为它的高Tm值而具有优良的构象稳定性，且具有对FGFR2的高结合活性和FGFR2配体依赖性的FGFR2信号中和活性(参见实施例)。
hFR2-14_H15/L1是在实施例8中得到的人源化抗体。该抗体的轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 72 (图80)的第61-705位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 73 (图81)的第21-235位氨基酸。该抗体的重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 102 (图110)的第58-1401位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 103 (图111)的第20-467位氨基酸。所述抗体因为它的高Tm值而具有优良的构象稳定性，且具有对FGFR2的高结合活性和FGFR2配体依赖性的FGFR2信号中和活性(参见实施例)。
hFR2-14_H16/L1是在实施例8中得到的人源化抗体。该抗体的轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 72 (图80)的第61-705位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 73 (图81)的第21-235位氨基酸。该抗体的重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 104 (图112)的第58-1401位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 105 (图113)的第20-467位氨基酸。所述抗体因为它的高Tm值而具有优良的构象稳定性，且具有对FGFR2的高结合活性和FGFR2配体依赖性的FGFR2信号中和活性(参见实施例)。
hFR2-14_H17/L1是在实施例8中得到的人源化抗体。该抗体的轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 72 (图80)的第61-705位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 73 (图81)的第21-235位氨基酸。该抗体的重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 106 (图114)的第58-1401位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 107 (图115)的第20-467位氨基酸。所述抗体因为它的高Tm值而具有优良的构象稳定性，且具有对FGFR2的高结合活性和FGFR2配体依赖性的FGFR2信号中和活性(参见实施例)。
hFR2-14_H18/L1是在实施例8中得到的人源化抗体。该抗体的轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 72 (图80)的第61-705位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 73 (图81)的第21-235位氨基酸。该抗体的重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 108 (图116)的第58-1401位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 109 (图117)的第20-467位氨基酸。所述抗体因为它的高Tm值而具有优良的构象稳定性，且具有对FGFR2的高结合活性、FGFR2配体依赖性的FGFR2信号中和活性、ADCC活性和体内抗肿瘤活性(参见实施例)。
hFR2-14_H19/L1是在实施例9中得到的具有经调节的糖链修饰的人源化抗体。该抗体的轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 72 (图80)的第61-705位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 73 (图81)的第21-235位氨基酸。该抗体的重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 96 (图104)的第58-1401位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 97 (图105)的第20-467位氨基酸。所述抗体因为它的高Tm值而具有优良的构象稳定性，具有对FGFR2的高结合活性、优良热稳定性、FGFR2配体依赖性的FGFR2信号中和活性、ADCC活性、ADCP活性、抑制FGFR2配体与FGFR2的结合的活性和体内抗肿瘤活性，并甚至当暴露于严重状况时维持它的高抗原结合活性(参见实施例)。
当施用给小鼠时，没有发现这些人源化FR2-14抗体会造成重量减轻或其它显著的中毒事件。将hFR2-14_H12/L1抗体和hFR2-14_H19/L1抗体以大约150 mg/kg的单剂量施用给每只食蟹猴，并在14天后观察。结果，没有观察到显著的临床发现、血液学变化、重量减轻或其它显著的中毒事件。因而，本发明的人源化抗体作为用于治疗或预防疾病的药物组合物具有优良的安全性。
在更优选的本发明的人源化抗体hFR2-14_H1/L1至hFR2-14_H19/L1中，所述抗体甚至更优选地是hFR2-14_H5/L1、hFR2-14_H11/L1、hFR2-14_H8/L1、hFR2-14_H12/L1或hFR2-14_H19/L1，进一步更优选地是hFR2-14_H12/L1或hFR2-14_H19/L1。
本发明还包括包含重链或轻链并且结合FGFR2的抗体或其功能片段，所述重链或轻链包含与本发明的大鼠FR2-10、FR-10FR和FR2-14抗体、嵌合cFR2-10、cFR2-13和cFR2-14抗体和人源化的hFR2-14_H1/L1至hFR2-14_H19/L1抗体中的任一个的重链或轻链的氨基酸序列具有80%或更高、82%或更高、84%或更高、86%或更高、88%或更高、90%或更高、92%或更高、94%或更高、96%或更高、98%或更高或99%或更高同一性的氨基酸序列。这样的序列同一性优选地是94%或更高，更优选地是96%或更高，甚至更优选地是98%或更高，最优选地是99%或更高。优选地，这些抗体具有在段落(3-3)至(3-6)中描述的活性中的一种或多种。
使用Blast算法2.2.2版的默认参数(Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, 和David J. Lipman (1997), “Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database programs”, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402)，可以确定两类氨基酸序列之间的同一性或同源性。所述Blast算法也可通过例如对http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/的因特网访问得到。
本发明还包括包含重链或轻链并且结合FGFR2蛋白的抗体或其功能片段，所述重链或轻链包含通过1-50个、1-45个、1-40个、1-35个、1-30个、1-25个、1-20个、1-15个、1-10个、1-8个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1个或2个、或1个氨基酸的取代、缺失、添加或插入从本发明的大鼠FR2-10、FR-10FR和FR2-14抗体、嵌合cFR2-10、cFR2-13和cFR2-14抗体和人源化的hFR2-14_H1/L1至hFR2-14_H19/L1抗体中的任一种的重链或轻链的氨基酸序列衍生出的氨基酸序列。这样的氨基酸突变优选地是取代。突变氨基酸的数目优选地是1-5，更优选地是1-4，甚至更优选地是1-3，进一步更优选地是1或2，最优选地是1。优选地，这些抗体具有在段落(3-3)至(3-6)中描述的活性中的一种或多种。
本发明还包括包含重链或轻链并且结合FGFR2蛋白的抗体或其功能片段，所述重链或轻链包含由特定核苷酸的核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述特定核苷酸在严谨条件下与具有编码本发明的大鼠FR2-10、FR-10FR和FR2-14抗体、嵌合cFR2-10、cFR2-13和cFR2-14抗体和人源化的hFR2-14_H1/L1至hFR2-14_H19/L1抗体中的任一种的重链或轻链的氨基酸序列的核苷酸序列的互补核苷酸序列的核苷酸杂交。优选地，这些抗体具有在段落(3-3)至(3-6)中描述的活性中的一种或多种。
根据一个替代方面，本发明提供了一种人抗体或其功能片段。本发明的人抗体没有特别限制，只要所述抗体源自人类并且结合FGFR2即可。本发明的人抗体或其功能片段具有抗肿瘤活性，优选体内抗肿瘤活性。也优选地，这样的人抗体或其功能片段特异性地结合FGFR2 IIIb蛋白和/或FGFR2 IIIc蛋白。更优选地，所述人抗体或其功能片段结合这些蛋白的Ig-样结构域。优选地，这样的人抗体或其功能片段进一步具有ADCC活性和/或ADCP活性。本发明的人抗体或其功能片段还具有对FGFR2的中和活性。优选地，本发明的人抗体或其功能片段具有对FGFR2 IIIb和/或FGFR2 IIIc的中和活性。更优选地，本发明的人抗体或其功能片段具有对FGFR2 IIIb和FGFR2 IIIc的中和活性。优选地，本发明的人抗体或其功能片段进一步抑制FGFR2与它的配体的结合。
(3-11)结合表位的抗体
在本发明的抗体中也包括“结合与本发明提供的抗体的情况下相同的位点的抗体”。“结合与某种抗体的情况下相同的位点的抗体”是指，结合抗原分子上被所述抗体识别的位点的另一种抗体。如果第二抗体结合抗原分子上被第一抗体结合的部分肽或部分三维结构，那么将第一抗体和第二抗体确定为结合相同位点。可替换地，如下将第一抗体和第二抗体确定为结合相同位点：证实第二抗体与第一抗体竞争对抗原的结合，即，第二抗体干扰第一抗体与抗原的结合，即使没有确定具体结合位点的肽序列或三维结构。当第一抗体和第二抗体结合相同位点并且第一抗体具有本发明的抗体的一个方面特有的作用(诸如抗肿瘤活性)时，第二抗体也具有非常高的具有与其相同活性的可能性。因而，如果第二抗-FGFR2抗体结合被第一抗-FGFR2抗体结合的位点，那么将第一抗体和第二抗体确定为结合FGFR2蛋白上的相同位点。可替换地，如下将第一和第二抗-FGFR2抗体确定为结合FGFR2蛋白上的相同位点：证实第二抗-FGFR2抗体与第一抗-FGFR2抗体竞争对FGFR2蛋白的结合。
本发明还包括这样的抗体：其结合被本发明的单克隆抗体FR2-10、FR2-13或FR2-14识别的FGFR2蛋白上的位点。
通过本领域技术人员众所周知的方法，诸如免疫测定，可以确定抗体结合位点。例如，通过适当地从抗原的C端或N端依次切割抗原的氨基酸序列来制备一系列肽，并研究抗体与它们的反应性，以大致确定识别位点。然后，合成较短的肽，并且可以研究抗体与这些肽的反应性，以由此确定结合位点。使用技术诸如基因重组或肽合成，可以制备抗原片段肽。
当抗体结合或识别抗原的部分构象时，通过使用X-射线结构分析鉴定抗原上与抗体邻近的氨基酸残基，可以确定抗体的结合位点。例如，抗体或它的片段与抗原或它的片段可以彼此结合并结晶，随后进行结构分析以鉴定抗原上与抗体具有相互作用距离的每个氨基酸残基。所述相互作用距离是8埃或更短，优选6埃或更短，更优选4埃或更短。一个或多个这样的与抗体具有相互作用距离的氨基酸残基可以构成抗原上被抗体结合的位点(表位)。2个或更多个这样的氨基酸残基不可以在基本序列上彼此邻近。
大鼠的、嵌合的或人源化的FR2-14抗体的Fab片段与人FGFR2 IIIb的D2片段(由SEQ ID NO: 70 (图78)的第128-249位氨基酸组成的肽)彼此结合，并在包含1.1-2.1 M硫酸铵-0.15 M Tris-HCl缓冲溶液(pH 6.5-8.5)的条件下结晶，以得到四方晶系中的晶体，其具有P41212的空间群以及a = b = 60.57埃和c = 331.2埃的晶胞。使用其三维结构坐标可以进行分子置换方法以确定相位(参见实施例15)。
大鼠的、嵌合的或人源化的FR2-14抗体识别人FGFR2 IIIb上的部分构象。该抗体的表位由人FGFR2 IIIb的氨基酸序列(SEQ ID NO: 70；图78)或人FGFR2 IIIc的氨基酸序列(SEQ ID NO: 71；图79)中的以下氨基酸构成：在残基155处的酪氨酸(Tyr)、在残基157处的苏氨酸(Thr)、在残基176处的赖氨酸(Lys)、在残基181处的丙氨酸(Ala)、在残基182处的甘氨酸(Gly)、在残基183处的甘氨酸(Gly)、在残基184处的天冬酰胺(Asn)、在残基185处的脯氨酸(Pro)、在残基186处的甲硫氨酸(Met)、在残基188处的苏氨酸(Thr)、在残基200处的谷氨酰胺(Gln)、在残基201处的谷氨酸(Glu)、在残基205处的甘氨酸(Gly)、在残基206处的甘氨酸(Gly)、在残基208处的赖氨酸(Lys)、在残基209处的缬氨酸(Val)、在残基210处的精氨酸(Arg)、在残基211处的天冬酰胺(Asn)、在残基212处的谷氨酰胺(Gln)、在残基213处的组氨酸(His)、在残基214处的色氨酸(Trp)和在残基217处的异亮氨酸(Ile)。换而言之，该抗体与人FGFR2 IIIb的氨基酸序列(SEQ ID NO: 70；图78)或人FGFR2 IIIc的氨基酸序列(SEQ ID NO: 71；图79)中的以下氨基酸具有相互作用距离：在残基155处的酪氨酸(Tyr)、在残基157处的苏氨酸(Thr)、在残基176处的赖氨酸(Lys)、在残基181处的丙氨酸(Ala)、在残基182处的甘氨酸(Gly)、在残基183处的甘氨酸(Gly)、在残基184处的天冬酰胺(Asn)、在残基185处的脯氨酸(Pro)、在残基186处的甲硫氨酸(Met)、在残基188处的苏氨酸(Thr)、在残基200处的谷氨酰胺(Gln)、在残基201处的谷氨酸(Glu)、在残基205处的甘氨酸(Gly)、在残基206处的甘氨酸(Gly)、在残基208处的赖氨酸(Lys)、在残基209处的缬氨酸(Val)、在残基210处的精氨酸(Arg)、在残基211处的天冬酰胺(Asn)、在残基212处的谷氨酰胺(Gln)、在残基213处的组氨酸(His)、在残基214处的色氨酸(Trp)和在残基217处的异亮氨酸(Ile)中的每一个。在人FGFR2 IIIc的氨基酸序列中也存在该抗体的表位位点。本发明的抗体或其功能片段、或所述抗体或功能片段的修饰形式也包括：结合该表位或与这些氨基酸残基具有相互作用距离的抗体，其功能片段，或所述抗体或功能片段的修饰形式。
(3-12)抗体的修饰形式
本发明提供了所述抗体或其功能片段的修饰形式。本发明的抗体或其功能片段的修饰形式是指具有化学或生物修饰的本发明的抗体或其功能片段。所述化学修饰形式包括，例如，具有与化学部分缀合的氨基酸骨架的形式，和具有与化学修饰的N-连接的或O-连接的碳水化合物链的形式。所述生物修饰形式包括，例如，已经经历翻译后修饰(例如，N-连接的或O-连接的糖基化、N-端或C-端加工、脱酰胺化、天冬氨酸的异构化、或甲硫氨酸的氧化)的形式，和含有通过使用原核宿主细胞表达而添加至N-端的甲硫氨酸残基的形式。这样的修饰形式也意图包括经过标记以允许检测或分离本发明的抗体或抗原的形式，例如，酶标记的形式、荧光地标记的形式或亲和力标记的形式。本发明的抗体或其功能片段的这样的修饰形式可用于改善本发明的原始抗体或其原始功能片段的稳定性或血液保留、降低抗原性、检测或分离抗体或抗原、等。
在化学修饰形式中含有的化学部分的例子可以包括水溶性的聚合物诸如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲纤维素、葡聚糖和聚乙烯醇。
生物修饰形式的例子可以包括通过酶处理、细胞处理等修饰的形式，与通过基因重组添加的另一种肽(诸如标签)融合的形式，和从表达内源性或外源性糖链修饰酶的宿主细胞制备的形式。
通过调节被抗体或功能片段结合的糖链的修饰(糖基化、去岩藻糖基化等)，可以增强本发明的抗体或其功能片段的抗体依赖性的细胞的细胞毒性活性。例如，已知在WO99/54342、WO00/61739和WO02/31140中描述的方法为这样的调节抗体的糖链修饰的技术，尽管该技术不限于此。本发明的抗体的修饰形式还包括已经发生如此调节的糖链修饰的抗体。
这样的修饰可以在抗体或其功能片段的任意位置或期望位置处进行。可替换地，可以在其中的一个或两个或更多个位置处进行相同的或2种或更多种不同的修饰。
在本发明中，“抗体片段的修饰形式”也意图甚至包括“抗体的修饰形式的片段”。
在本发明中，抗体的修饰形式或其功能片段的修饰形式也被简称为“抗体”或“抗体的功能片段”。
hFR2-14_H19/L1是在实施例9中得到的具有经调节的糖链修饰的人源化抗体。该抗体的轻链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 72 (图80)的第61-705位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 73 (图81)的第21-235位氨基酸。该抗体的重链的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 96 (图104)的第58-1401位核苷酸，且它的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 97 (图105)的第20-467位氨基酸。这样的人源化抗体也被本发明的抗体或本发明的抗体的修饰形式包括。
4. 生产抗体的方法
(4-1)使用杂交瘤的方法
为了制备本发明的抗-FGFR2抗体，根据Kohler和Milstein的方法(Kohler和Milstein, Nature (1975), 256, 第495-497页；和Kennet, R. 编, Monoclonal Antibodies, 第365-367页, Plenum Press, N.Y. (1980))，从用FGFR2蛋白或它的可溶形式免疫的动物的脾分离抗-FGFR2抗体生产细胞。将所述细胞与骨髓瘤细胞融合，由此建立杂交瘤。从这些杂交瘤的培养物可以得到单克隆抗体。
(4-1-1)抗原的制备
根据例如在本说明书的其它段落中描述的制备天然或重组FGFR2蛋白的方法，可以得到用于制备抗-FGFR2抗体的抗原。可以如此制备的抗原的例子可以包括FGFR2蛋白、和FGFR2蛋白片段(其包含具有FGFR2蛋白的至少6个连续氨基酸的部分序列)、和它们的进一步包含向其添加的任意氨基酸序列或载体的衍生物(在下文中，被统称为“FGFR2抗原”)。
可以如下制备重组FGFR2抗原：用包含编码FGFR2抗原的氨基酸序列的核苷酸序列的基因转染宿主细胞，和从细胞培养物回收所述抗原。这样的重组抗原可以是含有另一种蛋白(诸如免疫球蛋白Fc区)的融合蛋白。在重组FGFR2抗原中也包括在无细胞体外翻译系统中从特定基因得到的FGFR2抗原，所述特定基因包含编码FGFR2抗原的氨基酸序列的核苷酸序列。从在段落(2-2)的(iv)中描述的表达FGFR的正常组织、癌组织或癌细胞、癌细胞培养物等，可以纯化或分离非重组FGFR2抗原。
(4-1-2)抗-FGFR2单克隆抗体的生产
通常通过下述步骤生产单克隆抗体：
(a)制备抗原，
(b)制备抗体生产细胞，
(c)制备骨髓瘤细胞(在下文中，被称作”骨髓瘤”)，
(d)将抗体生产细胞与骨髓瘤融合，
(e)筛选生产目标抗体的杂交瘤集合，和
(f)得到单细胞克隆(克隆化)。
该生产方法进一步包括(g)培养杂交瘤的步骤，饲养杂交瘤移植的动物的步骤，等，和(h)测定或确定单克隆抗体的生物活性的步骤，等，如果必要的话。
在下文中，将参考这些步骤详细描述制备单克隆抗体的方法。但是，制备抗体的方法不限于那些步骤，并且例如，可以使用除了脾细胞和骨髓瘤以外的抗体生产细胞。
(a)抗原的纯化
根据上面在(2-3)中描述的制备FGFR2蛋白的方法，进行该步骤。
(b)制备抗体生产细胞的步骤
将在步骤(a)中得到的抗原与佐剂(诸如完全或不完全弗氏佐剂或硫酸铝钾)混合，并用得到的免疫原免疫实验动物。可以没有限制地使用在本领域已知的杂交瘤制备方法中使用的任何实验动物。具体地，可以使用例如小鼠、大鼠、山羊、绵羊、牛或马。从要与分离的抗体生产细胞等融合的容易得到的骨髓瘤细胞的观点看，要免疫的动物优选地是小鼠或大鼠。
实际使用的小鼠或大鼠的品系没有特别限制。就小鼠而言，可以使用例如A、AKR、BALB/c、BALB/cAnNCrj、BDP、BA、CE、C3H、57BL、C57BL、C57L、DBA、FL、HTH、HT1、LP、NZB、NZW、RF、R III、SJL、SWR、WB或129。就大鼠而言，可以使用例如Wistar、Low、Lewis、Sprague-Dawley、ACI、BN或Fischer。
这些小鼠和大鼠可得自实验动物培育者或销售者，例如，CLEA Japan, Inc.或Charles River Laboratories Japan Inc.。
在那些小鼠和大鼠中，考虑到与下文描述的骨髓瘤细胞的融合相容性，BALB/c小鼠品系或Wistar和Low大鼠品系作为要免疫的动物是特别优选的。
并且，考虑到人和小鼠抗原之间的同源性，也优选地使用这样的小鼠，其除去自身抗体的生物学机制已经被减小，即，自身免疫病小鼠。
在该背景下，这些小鼠或大鼠在免疫接种时优选地是5-12周龄，更优选地是6-8周龄。
使用例如Weir, D.M., Handbook of Experimental Immunology Vol.I.II.III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E.A.和Mayer, M.M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Spigfield, Illinois (1964)描述的方法，可以用FGFR2蛋白免疫动物。
用于确定抗体滴度的方法的例子可以包括、但不限于免疫测定诸如RIA和ELISA。
根据本领域已知的方法，例如，Kohler等人, Nature (1975) 256, 第495页；Kohler等人, Eur.J.Immnol. (1977) 6, 第511页；Milstein等人, Nature (1977), 266, 第550页；Walsh, Nature, (1977) 266, 第495页，可以制备从脾细胞衍生出的抗体生产细胞或从免疫动物分离出的淋巴细胞。
就脾细胞而言，可以采用一般方法，其包括：切碎脾，穿过不锈钢网过滤细胞，然后在Eagle氏最低基础培养基(MEM)等中漂浮得到的细胞，以分离抗体生产细胞。
(c)制备骨髓瘤的步骤
在细胞融合中使用的骨髓瘤细胞没有特别限制，并且从本领域已知的细胞系适当地选择备用。例如，考虑到从融合细胞中选择杂交瘤的便利，优选地使用次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT)-缺陷系，即，小鼠衍生的X63-Ag8 (X63)、NS1-ANS/1 (NS1)、P3X63-Ag8.Ul (P3Ul)、X63-Ag8.653 (X63.653)、SP2/0-Ag14 (SP2/0)、MPC11-45.6TG1.7 (45.6TG)、FO、S149/5XXO或BU.1、rat衍生的210.RSY3.Ag.1.2.3 (Y3)或人衍生的U266AR(SKO-007)、GM1500-GTG-A12(GM1500)、UC729-6、LICR-LOW-HMy2(HMy2)或8226AR/NIP4-1(NP41)，它们的筛选规程已经确定。这些HGPRT-缺陷系可得自，例如，美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。
将这些细胞系在适当的培养基中传代培养，所述培养基是例如：8-氮杂鸟嘌呤培养基[补充了谷氨酰胺、2-巯基乙醇、庆大霉素和胎牛血清(在下文中，被称作“FBS”)并进一步补充了8-氮杂鸟嘌呤的RPMI-1640培养基]，Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基(在下文中，被称作“IMDM”)，或Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(在下文中，被称作“DMEM”)，并在细胞融合之前3-4天在正常培养基[例如，含有10%FBS的ASF104培养基(由Ajinomoto Co., Inc.制造)]中传代培养，以确保在细胞融合当天细胞的数目等于或大于2×107个细胞。
(d)使抗体生产细胞与骨髓瘤细胞融合的步骤
根据本领域已知的任意方法(例如，Weir, D.M., Handbook of Experimental Immunology Vol.I.II.III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E.A.和Mayer, M.M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Spigfield, Illinois (1964))，在防止过度降低细胞生存力的条件下，可以使抗体生产细胞与骨髓瘤细胞融合。例如，可以使用包括在聚合物诸如聚乙二醇的高浓度溶液中将抗体生产细胞与骨髓瘤细胞混合的化学方法，或使用电刺激的物理方法。
(e)筛选生产目标抗体的杂交瘤集合的步骤
从通过细胞融合得到的杂交瘤中进行选择的方法没有特别限制，通常使用次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)选择方法(Kohler等人, Nature (1975) 256, 第495页;Milstein等人, Nature (1977) 266, 第550页)。使用HGPRT-缺陷型骨髓瘤细胞系(其在有氨基蝶呤存在下不可存活)，该方法可有效地得到杂交瘤。具体地，可以在HAT培养基中培养未融合的细胞和杂交瘤，由此仅允许对氨基蝶呤具有抗性的杂交瘤选择性地存活和生长。
(f)得到单细胞克隆的步骤(克隆化)
使用本领域已知的任意方法，例如，甲基纤维素、软琼脂糖或有限稀释方法(参见例如，Barbara, B.M. 和Stanley, M.S.:Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Company, San Francisco (1980))，可以克隆杂交瘤。有限稀释方法是优选的。
(g)培养杂交瘤的步骤和饲养杂交瘤移植的动物的步骤
可以培养选择的杂交瘤，由此生产单克隆抗体。优选地，将期望的杂交瘤克隆，然后进行抗体生产。
可以从杂交瘤的培养物回收由这样的杂交瘤生产的单克隆抗体。并且，可以从用单克隆抗体基因转染的细胞的培养物回收重组抗体。可替换地，可以将杂交瘤腹膜内地注射给相同品系(例如，上述的BALB/cAnNCrj)的小鼠或Nu/Nu小鼠，并使其生长。然后，可以从它们的腹水回收单克隆抗体。
(h)测定或确定单克隆抗体的生物活性的步骤
根据目的，可以选择不同生物学试验并进行应用。
(4-2)细胞免疫接种方法
可以将表达天然FGFR2蛋白的细胞、表达重组FGFR2蛋白或它的片段的细胞等用作免疫原，由此通过上述的杂交瘤方法制备抗-FGFR2抗体。
表达天然FGFR2蛋白的细胞的例子可以包括表达FGFR2的细胞、从表达FGFR2的组织或癌症衍生出的细胞系、和从癌组织(在其中观察到从FGFR2 IIIb至FGFR2 IIIc表达的转换)衍生出的细胞系。高度表达FGFR2的癌症包括：发现具有基因扩增的癌症，诸如胃癌和乳腺癌；和发现具有过表达的癌症，诸如胰腺癌和卵巢癌。高度表达FGFR2 IIIb的培养细胞系的例子可以包括胃癌细胞系和乳腺癌细胞系。高度表达FGFR2 IIIc的培养细胞系的例子可以包括结肠直肠(盲肠)癌细胞系。在其中观察到从FGFR2 IIIb至FGFR2 IIIc表达的转换的癌组织的例子可以包括前列腺癌、膀胱癌和乳腺癌的组织。表达FGFR2 IIIc的癌组织的例子可以包括子宫颈癌和非小细胞肺癌的组织。在这些癌症中，子宫颈癌高度表达FGFR2 IIIc。高度表达FGFR2的正常组织的例子可以包括脑、大肠、甲状腺、子宫、胆囊和皮肤。
以每次免疫接种注射1×105-1×109个细胞、优选地1×106-1×108个细胞、更优选地0.5-2×107个细胞、甚至更优选地1×107个细胞的量使用这些表达FGFR2的细胞。根据FGFR2蛋白的表达水平，可以改变用于免疫接种的细胞的数目。通常腹膜内地施用免疫原，并且可以通过真皮内途径等来施用。通过使用在段落(4-1-2)中描述的方法，可以制备杂交瘤。
(4-3)基因重组
为了制备本发明的抗体，将包含编码其重链的氨基酸序列的核苷酸序列的核苷酸(重链核苷酸)和包含编码其轻链的氨基酸序列的核苷酸序列的核苷酸(轻链核苷酸)、或具有所述重链核苷酸的插入物的载体和具有所述轻链核苷酸的插入物的载体引入宿主细胞中，然后培养所述细胞，并可以从培养物回收抗体。所述重链核苷酸和所述轻链核苷酸可以插入在一个载体中。
原核或真核细胞可以用作宿主细胞。在使用真核宿主细胞的情况下，可以使用动物细胞、植物细胞或真核微生物。
动物细胞的例子可以包括哺乳动物衍生的细胞，即，猴衍生的COS细胞(Gluzman, Y. Cell(1981), 23, 第175-182页, ATCC CRL-1650)、小鼠成纤维细胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)、小鼠NS0细胞系(ECACC)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞, ATCC CCL-61)、其二氢叶酸还原酶缺陷系(CHOdhfr-; Urlaub,G.和Chasin,L.A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1980), 77, 第4126-4220页)、CHOK1SV (Lonza Biologics)、从禽类(诸如鸡)衍生出的细胞、和从昆虫衍生出的细胞。
并且，经修饰以调节蛋白(诸如抗体)的糖链修饰的细胞可以用作宿主。例如，在抗体表达中可以使用这样的CHO细胞：其经过修饰，使得在与抗体的Fc区结合的复合物-型N-糖苷-连接的糖链中，在它们的还原末端处具有与N-乙酰基葡糖胺结合的岩藻糖的糖链被减少或去，由此质荷比去岩藻糖基化抗体(也被称作抗体的修饰形式) (WO00/61739, WO02/31140, 等)。
真核微生物的例子可以包括酵母。
原核细胞的例子可以包括大肠杆菌(E. coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
用于分泌本发明的抗体(从每种动物衍生出的单克隆抗体、大鼠抗体、小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体等)的信号肽不限于与本发明的抗体相同物种、相同类型和相同亚型的抗体的分泌信号，也不限于本发明的抗体自己的分泌信号。可以选择和使用不同类型或其亚型的抗体的任何分泌信号或从其不同真核物种或原核物种衍生出的蛋白的任意分泌信号。
(4-4)设计和制备人源化抗体的方法
人源化抗体的例子可以包括、但不限于：具有用非人动物抗体的CDR替代的CDR的人衍生抗体(参见Nature(1986), 321, 第522-525页)，通过CDR移植用CDR序列和用框架区的一些氨基酸残基移植的人抗体(参见WO90/07861和US6972323)，和在这些人源化抗体中的任一个中具有替换一个或两个或更多个非人动物抗体衍生的氨基酸的人抗体氨基酸的抗体。
(4-5)制备人抗体的方法
本发明的抗体的其它例子可以包括人抗体。抗-FGFR2人抗体是指由人衍生的抗体的氨基酸序列组成的抗-FGFR2抗体。通过使用生产人抗体的小鼠的方法，可以得到抗-FGFR2人抗体，所述小鼠携带包含人抗体重链和轻链基因的人基因组DNA片段(参见例如，Tomizuka, K.等人, Nature Genetics (1997) 16, 第133-143页; Kuroiwa, Y.等人, Nuc.Acids Res. (1998) 26, 第3447-3448页;Yoshida, H.等人, Animal Cell Technology:Basic and Applied Aspects第10卷, 第69-73页(Kitagawa, Y., Matuda, T.和Iijima, S.编), Kluwer Academic Publishers, 1999.; Tomizuka, K.等人, Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2000) 97, 第722-727页)。
具体地，这样的生产人抗体的动物可以是如下得到的任意重组动物：破坏非人哺乳动物的内源性免疫球蛋白重链和轻链基因座，并经由酵母人工染色体(YAC)载体等向其中替代性地引入人免疫球蛋白重链和轻链基因座，以及通过使这些动物杂交而建立的重组动物。
可替换地，通过基因重组技术，可以用分别编码这样的人抗体的重链和轻链的cDNA、优选地用包含所述cDNA的载体转染真核细胞。可以培养经转染的生产重组人单克隆抗体的细胞。该抗体可以得自培养物上清液。
在本文中，例如，真核细胞，优选地哺乳动物细胞诸如CHO细胞、淋巴细胞或骨髓瘤，可以用作宿主。
并且，已知得到选自人抗体文库的、噬菌体展示衍生的人抗体的方法(参见例如，Wormstone, I.M.等人, Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), 第2301-2308页; Carmen, S.等人, Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), 第189-203页; Siriwardena, D.等人, Opthalmology (2002) 109 (3), 第427-431页)。
例如，可以使用噬菌体展示方法(Nature Biotechnology (2005),23,(9), 第1105-1116页)，其包括将人抗体的可变区在噬菌体表面上表达为单链抗体(scFv)，并选择与抗原结合的噬菌体。
可以对基于它的结合抗原的能力而选择出的噬菌体进行基因分析，由此确定编码结合抗原的人抗体的可变区的DNA序列。
如果确定了结合抗原的scFv的DNA序列，可以制备具有该序列的表达载体，并引入适当的宿主中，以允许它们表达人抗体(WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, WO95/15388, Annu.Rev.Immunol (1994) 12, 第433-455页, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), 第1105-1116页)。
(4-6)制备抗体的功能片段的方法
制备单链抗体的方法是本领域众所周知的(参见例如，美国专利号4,946,778、5,260,203、5,091,513和5,455,030)。在该scFv中，经由接头、优选多肽接头连接重链可变区和轻链可变区，所述接头防止它们形成缀合物(Huston,J.S.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988),85, 第5879-5883页)。在scFv中的重链可变区和轻链可变区可以源自相同抗体，或可以源自不同抗体。
例如，将由12-19个残基组成的任意单链肽用作连接这些可变区的多肽接头。
为了得到编码scFv的DNA、或者编码抗体的重链或重链可变区的DNA和编码其轻链或轻链可变区的DNA的序列，使用编码整个或期望氨基酸序列的每个DNA部分作为模板，并使用侧接模板两端的引物对进行PCR扩增。随后，与侧接DNA的两端的引物对组合地进一步扩增编码多肽接头部分的DNA，使得得到的片段可以在它的末端处分别连接至重链和轻链DNA。
可以使用编码scFv的DNA，由此根据常规方法制备含有所述DNA的表达载体和用所述表达载体转化的宿主细胞。另外，可以培养宿主细胞，并可以根据常规方法从培养物回收scFv。
还为了得到抗体的任意其它功能片段，根据上述的方法得到编码功能片段的基因，并将其引入细胞中。可以从细胞培养物回收目标功能片段。
可以使本发明的抗体多聚化，由此增强它对抗原的亲和力。在该情况下，可以使相同类型的抗体多聚化，或可以使分别识别相同抗原的多个表位的多个抗体多聚化。用于使这些抗体多聚化的方法的例子可以包括：2个scFv与IgG CH3结构域的结合，其与链霉亲和素的结合，和螺旋-转角-螺旋基序的引入。
本发明的抗体可以是多类在氨基酸序列中存在差异的抗-FGFR2抗体(即，多克隆抗体)的混合物。多克隆抗体的例子可以包括多类在CDR的一部分或全部中存在差异的抗体的混合物。可以从混合培养的不同抗体生产细胞的培养物回收这样的多克隆抗体(WO2004/061104)。可替换地，可以混合单独制备的抗体。可以如下制备抗血清，其为多克隆抗体的一个方面：根据标准方法，用期望的抗原免疫动物，并从所述动物回收血清。
还可以将用不同分子诸如聚乙二醇(PEG)缀合的抗体用作抗体的修饰形式。
本发明的抗体可以进一步是这些抗体与其它药物(免疫缀合物)形成的缀合物中的任一种。这样的抗体的例子可以包括用放射性物质缀合的抗体或具有药理作用的化合物(Nature Biotechnology(2005), 23, 第1137-1146页)。
(4-7)抗体的纯化
可以将得到的抗体纯化至同质。可以使用有用的蛋白分离和纯化方法来分离和纯化抗体。
通过适当地选择的或组合的方案，例如，色谱柱、过滤器、超滤、盐析、透析、制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳和/或等电聚焦(Strategies for Protein Purification and Characterization:A Laboratory Course Manual, Daniel R.Marshak等人.编, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996);Antibodies:A Laboratory Manual. Harlow和David Lane编, Cold Spring Harbor Laboratory (1988))，可以分离和纯化抗体，尽管分离和纯化方法不限于此。
色谱法的例子包括亲和色谱法、离子交换色谱法、疏水色谱法、凝胶过滤、反相色谱法和吸附色谱法。
使用液相色谱法诸如HPLC或FPLC，可以执行这些色谱法方案。
在亲和色谱法中使用的柱的例子可以包括蛋白A、蛋白G和抗原柱。
蛋白A柱的例子包括Protein A Ceramic HyperD (由Pall Corp.制造)、POROS (由Applied Biosystems, Inc. 制造)和Sepharose F.F. (由GE Healthcare Bio-Sciences Corp.制造)。
并且，使用将抗原固定化的载体，使用抗体对所述抗原的结合活性，可以纯化抗体。
(4-8)编码抗体的核苷酸、重组载体和重组细胞
本发明提供了编码本发明的抗体或其功能片段、或所述抗体或功能片段的修饰形式的核苷酸(在下文中，该核苷酸被称作“抗体基因”)、具有所述基因的插入物的重组载体、包含所述基因或所述载体的细胞(在下文中，该细胞被称作“抗体基因转染的细胞”)、和生产本发明的抗体或其功能片段、或所述抗体或功能片段的修饰形式的细胞(在下文中，该细胞被称作“抗体生产细胞”)。
优选地，本发明的抗体基因包含在下述(a)至(e)中的任一项中描述的核苷酸序列(在下文中，被称作“抗体基因序列”)，由包含所述抗体基因序列的核苷酸序列组成，或由所述抗体基因序列组成：
(a)以下核苷酸序列的组合：编码大鼠FR2-10、FR2-13和FR2-14、嵌合cFR2-10、cFR2-13和cFR2-14和人源化的hFR2-14_H1/L1至hFR2-14_H19/L1抗体中的任一个的重链氨基酸序列的核苷酸序列，和编码其中任一个的轻链氨基酸序列的核苷酸序列；
(b)以下核苷酸序列的组合：编码包含大鼠FR2-10、FR2-13和FR2-14、嵌合cFR2-10、cFR2-13和cFR2-14和人源化的hFR2-14_H1/L1至hFR2-14_H19/L1抗体中的任一个的CDRH1至CDRH3的重链的氨基酸序列的核苷酸序列，和编码包含其中任一个的CDRL1至CDRL3的轻链的氨基酸序列的核苷酸序列；
(c)以下核苷酸序列的组合：编码包含大鼠FR2-10、FR2-13和FR2-14、嵌合cFR2-10、cFR2-13和cFR2-14和人源化的hFR2-14_H1/L1至hFR2-14_H19/L1抗体中的任一个的重链可变区的氨基酸序列的重链氨基酸序列的核苷酸序列，和编码包含其中任一个的轻链可变区的氨基酸序列的轻链氨基酸序列的核苷酸序列；
(d)一种核苷酸序列，其在严谨条件下与由(a)至(c)中的任一个核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的核苷酸杂交，并且编码与FGFR2结合的抗体的氨基酸序列；和
(e)一种核苷酸序列，其编码通过1-50个、1-45个、1-40个、1-30个、1-25个、1-20个、1-15个、1-10个、1-8个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1个或2个、或1个氨基酸的取代、缺失、添加或插入而从(a)至(c)的任一个氨基酸序列衍生出的氨基酸序列，并且编码与FGFR2结合的抗体的氨基酸序列。
除了FGFR2结合活性以外，具有由核苷酸序列(d)或(e)编码的氨基酸序列的抗体可以具有在段落(3-3)至(3-6)中描述的活性中的一种或两种或更多种。
但是，本发明的抗体基因不限于在(a)至(e)中描述的那些。
本发明提供了如在段落(4-3)中描述的生产本发明的抗体或其功能片段、或所述抗体或功能片段的修饰形式的方法，所述方法包括下述步骤：培养本发明的抗体基因转染的细胞，和从培养物回收抗体、功能片段或修饰形式。通过该生产方法得到的所述抗体或其功能片段、或所述抗体或功能片段的修饰形式也被包括在本发明中。
5. 药物组合物
本发明提供了一种药物组合物，其包含抗-FGFR2抗体或其功能片段、或所述抗体或功能片段的修饰形式。
本发明的药物组合物可用于治疗或预防多种疾病，特别是多种癌症，所述疾病由异常的或增加的FGFR2信号(归因于FGFR2或它的配体的过表达或FGFR2突变或基因扩增)或FGFR2的亚型转换引起或加重(在下文中，这些疾病被称作“FGFR2相关疾病”)。
要治疗或预防的这样的癌症的原因的例子可以包括：在FGFR2基因的内含子中的单核苷酸多态性(SNP)，FGFR2的高表达，组成性地活化FGFR2的错义突变，FGFR2基因的扩增或过表达，和从FGFR2 IIIb至FGFR2 IIIc的转换。
这样的癌症类型的例子可以包括乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、胃癌、前列腺癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌、食管癌、膀胱癌、子宫颈癌、血癌、淋巴瘤和恶性黑素瘤。其优选例子可以包括这些表达FGFR2蛋白的癌症。
在本发明中，疾病的治疗或预防包括、但不限于：疾病(优选在表达FGFR2蛋白的个体中的疾病)发作的预防，所述疾病的恶化或进展的遏制或抑制，由患有疾病的个体表现出的一种或两种或更多种征状的减轻，所述征状的恶化或进展的遏制或减轻，继发性疾病的治疗或预防，等。
本发明的药物组合物可以包含治疗或预防有效量的抗-FGFR2抗体或所述抗体的功能片段以及药学上可接受的稀释剂、媒介物、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或添加剂。
“治疗或预防有效量”是指借助于特定剂型和施用途径对特定疾病发挥治疗或预防作用的量，且具有与“药理学有效量”相同的含义。
本发明的药物组合物可以包含用于改变、维持或保留所述组合物或其中所含的抗体的pH、渗透压、粘度、透明性、颜色、张度、无菌度或稳定性、可溶性、持续释放、吸收性、渗透性、剂型、强度、性能、形状等的材料(在下文中，被称作“药用材料”)。所述药用材料没有特别限制，只要所述材料是药理学上可接受的即可。例如，没有毒性或低毒性是这些药用材料优选地具有的性质。
药用材料的例子可以包括、但不限于以下材料：氨基酸诸如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸和赖氨酸；抗微生物剂；抗氧化剂诸如抗坏血酸、硫酸钠和亚硫酸氢钠；缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐或硼酸盐缓冲剂、碳酸氢钠和Tris-HCl溶液；填充剂诸如甘露醇和甘氨酸；螯合剂诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；络合剂诸如咖啡因、聚乙烯基吡咯烷、β-环糊精和羟丙基-β-环糊精；填充剂诸如葡萄糖、甘露糖和糊精；其它烃诸如单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖和糊精；着色剂；矫味剂；稀释剂；乳化剂；亲水聚合物诸如聚乙烯基吡咯烷；低分子量多肽；形成盐的抗衡离子；杀菌剂诸如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸和过氧化氢；溶剂诸如甘油、丙二醇和聚乙二醇；糖醇诸如甘露醇和山梨醇；助悬剂；表面活性剂诸如PEG、脱水山梨糖醇酯、聚山梨酯诸如聚山梨酯20和聚山梨酯80、triton、氨丁三醇、卵磷脂和胆固醇；稳定性增强剂诸如蔗糖和山梨醇；弹性增强剂诸如氯化钠、氯化钾、甘露醇和山梨醇；运输剂；稀释剂；赋形剂；和/或药用添加剂。
添加的这些药用材料的量是抗-FGFR2抗体或其功能片段、或所述抗体或功能片段的修饰形式的重量的0.001-1000倍，优选0.01-100倍，更优选0.1-10倍。
在本发明的药物组合物中还包括免疫脂质体，其包含被包囊在脂质体中的抗-FGFR2抗体或其功能片段、或所述抗体或功能片段的修饰形式，或包含与脂质体缀合的抗体的修饰抗体形式(美国专利号6214388, 等)。
所述赋形剂或媒介物没有特别限制，只要它们是在可注射水、盐水、人工脑脊液和用于口服或胃肠外施用的其它制品中常用的液体或固体材料即可。盐水的例子可以包括中性盐水和含有血清白蛋白的盐水。
缓冲剂的例子可以包括：Tris缓冲剂，其被调节成使所述药物组合物的最终pH达到7.0-8.5；乙酸盐缓冲剂，其被调节成使所述药物组合物的最终pH达到4.0-5.5；柠檬酸盐缓冲剂，其被调节成使所述药物组合物的最终pH达到5.0-8.0；和组氨酸缓冲剂，其被调节成使所述药物组合物的最终pH达到5.0-8.0。
本发明的药物组合物是固体、液体、混悬液等。本发明的药物组合物的另一个例子可以包括冷冻干燥的制品。使用赋形剂诸如蔗糖，可以形成冷冻干燥的制品。
本发明的药物组合物的施用途径可以是肠内施用、局部施用和胃肠外施用中的任一种。其例子可以包括静脉内施用、动脉内施用、肌肉内施用、真皮内施用、皮下施用、腹膜内施用、透皮施用、骨内施用、关节内施用等。
根据施用方法、抗体对FGFR2蛋白的结合亲和力等，可以确定药物组合物的组成。对FGFR2蛋白具有较高亲和力(较低KD值)的本发明的抗-FGFR2抗体或其功能片段、或所述抗体或功能片段的修饰形式可以在较低剂量发挥它的药学效力。
本发明的抗-FGFR2抗体的剂量没有限制，只要所述剂量是药理学有效量即可。根据个体的物种、疾病的类型、征状、性别、年龄、预存病症、抗体对FGFR2蛋白的结合亲和力或它的生物活性、和其它因素，可以适当地确定剂量。可以每天至每180天1次地或者每天2次或3次或更多次地施用经常为0.01-1000mg/kg、优选为0.1-100mg/kg的剂量。
所述药物组合物的形式的例子可以包括注射剂(包括冷冻干燥的制品和滴剂)、栓剂、经鼻吸收制品、透皮吸收制品、舌下制剂、胶囊剂、片剂、软膏剂、颗粒、气雾剂、丸剂、粉剂、混悬液、乳剂、滴眼剂和生物植入物制剂。
可以与其它药物并行地或分开地施用包含抗-FGFR2抗体或其功能片段、或所述抗体或功能片段的修饰形式作为活性成分的药物组合物。例如，可以在施用其它药物之后施用包含抗-FGFR2抗体或其功能片段作为活性成分的药物组合物，或者可以在施用所述药物组合物之后施用其它药物。可替换地，可以并行地施用所述药物组合物和其它药物。其它药物的例子可以包括各种抗癌剂诸如化疗剂和辐射疗法。这些使用方案被统称为“其它药物与本发明的抗体的联合使用”。本发明还包括一种药物组合物，其包含本发明的抗体或其功能片段、或所述抗体或功能片段的修饰形式，并且进一步包含其它药物。
本发明提供了一种用于治疗或预防FGFR相关疾病(诸如癌症)的方法；本发明的抗体用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于治疗或预防疾病；和本发明的抗体用于治疗或预防疾病的用途。本发明还包括包含本发明的抗体的用于治疗或预防的试剂盒。
6. 用于诊断的组合物
本发明提供了一种用于试验或诊断的组合物(在下文中，被称作“用于诊断的组合物”)，其包含本发明的抗-FGFR2抗体或其功能片段、或所述抗体或功能片段的修饰形式。
本发明的用于诊断的组合物可用在FGFR2相关疾病(诸如癌症)或FGFR2表达的试验或诊断中。在本发明中，所述试验或诊断包括，例如，发展疾病的风险的确定或测量，疾病的存在或不存在的确定，疾病的进展或恶化程度的测量，使用包含抗-FGFR2抗体等的药物组合物的药物疗法的作用的测量或确定，除了药物疗法以外的疗法的作用的测量或确定，疾病的复发风险的测量，和疾病的复发的存在或不存在的确定。但是，根据本发明的试验或诊断不限于这些，并且可以使用任意方案。
本发明的用于诊断的组合物可用于鉴定以下物质的受体个体：本发明的抗体或其功能片段，或所述抗体或功能片段的修饰形式，包含它们的组合物，或包含它们的药物组合物。
用于诊断的组合物可以包含pH缓冲剂、渗透调节剂、盐、稳定剂、杀菌剂、显色剂、敏化剂、聚集抑制剂等。
本发明提供了一种用于试验或诊断FGFR2相关疾病(诸如癌症)的方法，本发明的抗体用于制备诊断疾病所用的组合物的用途，和本发明的抗体用于试验或诊断疾病的用途。本发明还包括包含本发明的抗体的用于试验或诊断的试剂盒。
合乎需要的包含本发明的抗体的试验或诊断方法是夹心ELISA。可以使用任何常见的使用抗体的检测方法，诸如ELISA、RIA、酶联免疫斑点(ELISPOT)测定、斑点印迹法、Ouchterlony试验或计数器免疫电泳(CIE)。通过使用生物素的方法，或通过使用标记材料(诸如HRP、碱性磷酸酶或FITC)在生化分析中可以实现的任意其它标记方法，可以标记抗体。生色底物诸如TMB (3, 3', 5, 5'-四甲基联苯胺)、BCIP (磷酸-5-溴-4-氯-3-吲哚酯)、ρ-NPP (磷酸对硝基苯酯)、OPD (邻-苯二胺)、ABTS (3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)和SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher Scientific Inc.)、QuantaBlu(TM) Fluorogenic Peroxidase Substrate (Thermo Fisher Scientific Inc.)和化学发光底物，可以用在使用酶促标记的检测中。可以对从人类或非人动物衍生出的样品以及人工处理过的样品(诸如重组蛋白)进行该测定。从个别生物体衍生出的试验样品的例子可以包括、但不限于：血液、滑液、腹水、淋巴液、脑脊液、组织匀浆物上清液和组织切片。
包含本发明的抗体的用于试验或诊断的夹心ELISA试剂盒可以包含FGFR2蛋白标准品的溶液、染色试剂、用于稀释的缓冲溶液、用于固相的抗体、用于检测的抗体、和洗涤溶液、等。优选地，通过使用方法诸如吸光度、荧光、发光或放射性同位素(RI)方法，可以测量与抗原结合的抗体的量。优选地，在测量中使用吸光度平板读数器、荧光平板读数器、发光平板读数器、RI液体闪烁计数器等。
本发明提供了一种可用于免疫组织化学(IHC)分析的抗体或其功能片段、和所述抗体或功能片段的修饰形式、以及包含它们的组合物。这样的组合物也包括在本发明的“用于诊断的组合物”中。
所述免疫组织化学没有特别限制，只要该方案包括使组织切片与抗原结合抗体(第一抗体)反应和检测与所述抗原结合的第一抗体即可。
优选地，用石蜡处理组织切片。将石蜡处理过的组织切片脱石蜡，随后进行抗原提取处理和非特异性反应抑制处理。用于抗原提取处理的方法的例子可以包括使用胰蛋白酶等的热处理和酶处理。热处理是优选的。热处理通常在包括90-110℃的温度、pH 8-10和20-60分钟的处理时间的优选条件下进行。可以在pH调节中使用Tris-EDTA缓冲溶液(例如，含有1 mM EDTA的10 mM Tris缓冲溶液)等。一种用于灭活内源性酶(其具有在与显色中使用的酶相同或类似的催化活性)的方法经常用作非特异性反应抑制处理。对于通过过氧化物酶反应进行的显色，优选地预先使用H2O2等抑制存在于组织中的内源性过氧化物酶。可以将溶剂诸如水或甲醇用于H2O2。H2O2的浓度是0.1-3%，优选地是0.3-3%。可以给H2O2溶液补充叠氮化钠。并且，使用血清或酪蛋白的阻断方法可以用作非特异性反应抑制处理。可以在第一抗体反应之前用血清或酪蛋白处理组织。可替换地，可以在用于稀释第一抗体的溶剂中含有血清或酪蛋白。
第一抗体的反应条件没有特别限制，并且包括20-50℃、优选地25-42℃、更优选地37℃的温度。反应时间是5分钟至整个夜晚和整个白天，优选10分钟至6小时，更优选30分钟至2小时。
优选地，能够被显影且结合第一抗体的抗体(第二抗体)可以用在第一抗体的检测中。优选地，通过使用包括以下步骤的方法，可以使第二抗体显影：使酶(诸如过氧化物酶或碱性磷酸酶)与第二抗体结合，或并向所述第二抗体添加生物素等，并使与所述酶缀合的链霉亲和素等与其结合，随后与所述酶的相容生色底物反应。包括使酶与第二抗体结合的方法的例子可以包括，使用包含糊精聚合物或氨基酸聚合物(酶和第二抗体的多个分子与其连接)的试剂的方法(聚合物方法)。生色底物(诸如DAB)可以用在包括使生物素化的第二抗体与过氧化物酶标记的链霉亲和素反应的方法中(LSAB方法)。
使用将反应溶液、反应条件、洗涤运行次数等程序化的免疫学设备，可以自动地进行免疫组织化学规程。
在本发明的用于诊断的组合物中包含的所述抗体或其功能片段、或所述抗体或功能片段的修饰形式优选地是与FGFR2结合的抗体，即，具有FGFR2选择性的抗体或其功能片段、或所述抗体或功能片段的修饰形式，更优选具有人FGFR2 IIIb选择性的抗体或其功能片段、或所述抗体或功能片段的修饰形式。更优选地，根据另一个方面，在本发明的用于诊断的组合物中含有的所述抗体或其功能片段、或所述抗体或功能片段的修饰形式此外具有对人FGFR2 IIIb和人FGFR2 IIIc的选择性。
对人FGFR2 IIIb具有选择性的抗体的例子可以包括：包含重链和轻链的抗体，所述重链包含大鼠FR2-10抗体的重链CDRH1至CDRH3，所述轻链包含其轻链CDRL1至CDRL3；包含大鼠FR2-10抗体的重链和轻链可变区的抗体；和包含大鼠FR2-10抗体的重链和轻链的抗体。这样的抗体的例子可以包括、但不限于大鼠FR2-10抗体、嵌合cFR2-10抗体和人源化FR2-10抗体。
对人FGFR2 IIIb和人FGFR2 IIIc具有选择性的抗体的例子可以包括：包含重链和轻链的抗体，所述重链包含大鼠FR2-13抗体的重链CDRH1至CDRH3，所述轻链包含其轻链CDRL1至CDRL3；包含重链和轻链的抗体，所述重链包含大鼠FR2-14抗体的重链CDRH1至CDRH3，所述轻链包含其轻链CDRL1至CDRL3；包含大鼠FR2-13抗体的重链和轻链可变区的抗体；包含大鼠FR2-14抗体的重链和轻链可变区的抗体；包含大鼠FR2-13抗体的重链和轻链的抗体；和包含大鼠FR2-14抗体的重链和轻链的抗体。这样的抗体的例子可以包括、但不限于：大鼠FR2-13抗体、嵌合的cFR2-13抗体、人源化的FR2-13抗体、大鼠FR2-14抗体、嵌合的cFR2-14抗体和人源化的FR2-14抗体。
根据一个优选的方面，将本发明的用于诊断的组合物用于检测或测定FGFR2，更优选地用于检测或测定人FGFR2 IIIb和/或人FGFR2 IIIc，甚至更优选地用于检测或测定人FGFR2 IIIb或人FGFR2 IIIb和人FGFR2 IIIc。
本发明提供了一种用于检测或测定试验样品中的人FGFR2 IIIb的方法。
可替换地，可以如下检测或测定试验样品中的人FGFR2 IIIc：(i)检测或测定所述试验样品中的人FGFR2 IIIb和人FGFR2 IIIc；(ii)检测或测定所述样品中的人FGFR2 IIIb；和(iii)将步骤(i)中的检测或测定的结果与步骤(ii)中的检测或测定的结果进行对比，或从步骤(i)中的检测或测定的结果减去步骤(ii)中的检测或测定的结果。本发明也包括这样的用于检测或测定人FGFR2 IIIc的方法。
本发明的用于诊断的组合物可以用在这些检测或测定方法中。本发明还包括这样的测定方法和用于诊断的组合物，它们意图用于诊断或试验人FGFR2-阳性的癌症，优选人FGFR2 IIIb-和/或人FGFR2 IIIc-阳性的癌症。
本发明还包括一种用于鉴定本发明的药物组合物的受体个体的方法。该鉴定方法包括：测定从所述个体衍生出的样品中的人FGFR2。当在所述样品中检测出人FGFR2时，或当检测出的人FGFR2的量大于在从健康个体衍生出的样品中检测出的人FGFR2的量时，可以确定所述个体是阳性的。在所述鉴定方法中的人FGFR2优选地是人FGFR2 IIIb和/或人FGFR2 IIIc，更优选人FGFR2 IIIb或人FGFR2 IIIb和人FGFR2 IIIc。
本发明的用于诊断的组合物可以用在该方法中。
根据一个优选的方面，所述鉴定方法中的个体具有癌症或处于癌症的风险中。
根据一个方面，可以将本发明的药物组合物施用给通过所述鉴定方法确定为阳性的个体。
7. 试剂
本发明的抗体或其功能片段、或所述抗体或功能片段的修饰形式还可用作试剂。这样的试剂用于如上所述的试验或诊断，用于研究，和用于任意其它用途。
8. 筛选方法
本发明提供了一种用于鉴定具有FGFR2-中和活性的物质的方法。该方法包括：鉴定与抗原上的特定位点结合的物质，本发明的抗体与所述特定位点结合。例如，使试验物与人FGFR2 IIIb蛋白或它的片段接触。随后，测量所述物质与构成人FGFR IIIb上的表位的氨基酸残基之间的距离，大鼠FR2-14抗体、嵌合的cFR2-14抗体和人源化的hFR2-14_H1/L1至hFR2-14_H19/L1抗体中的任一种与所述表位结合。当所述物质与所述残基中的每一个具有相互作用距离时，可以确定所述物质是阳性的。
这样的鉴定方法还可用作一种用于鉴定具有抗肿瘤活性的物质的方法。可以进一步测定通过所述方法证实为阳性的物质的抗肿瘤活性。
所述试验物优选地是肽或抗体或其功能片段、或所述抗体或功能片段的修饰形式。
通过基因重组、肽合成或体外翻译，也可以制备通过所述方法证实为阳性的所述肽或所述抗体或其功能片段、或所述抗体或功能片段的修饰形式。本发明还包括一种用于生产这样的肽或抗体的方法等。
实施例
在下文中，将参考实施例进一步具体地描述本发明。但是，本发明无意限于它们。
除非另外指出，否则根据在“Molecular Cloning”(Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中描述的方法，或在本领域技术人员使用的其它实验手册中描述的方法，或根据指导手册使用市售试剂或试剂盒，进行与在以下实施例中的基因操作有关的规程。
实施例1. 大鼠抗-人FGFR2抗体的制备
1)-1  免疫接种
使用8-周龄雌性WKY/Izm大鼠(Japan SLC, Inc.)和7-周龄雌性Crlj:WI大鼠(Charles River Laboratories Japan Inc.)。在第0天，将50 μg重组人FGFR2β(IIIb)/Fc嵌合体(由R&D Systems, Inc.制造)和弗氏完全佐剂(由Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.制造)的混合物(体积比: 1:2)施用至每只WKY/Izm大鼠的尾巴根部。在第21天，将50 μg重组人FGFR2β(IIIb)/Fc嵌合体施用至每只大鼠的尾巴根部。在第35天，从大鼠收集淋巴结或脾，并用在杂交瘤制备中。在第0天，将50 μg FGFR2β(IIIb)/Fc嵌合体和弗氏完全佐剂的混合物(体积比: 1:1)皮下地或真皮内地施用至每只Crlj:WI大鼠。在第7、14和21天，将50 μg FGFR2β(IIIb)/Fc嵌合体和弗氏不完全佐剂的混合物(体积比: 1:1)皮下地或真皮内地施用至大鼠。在第38天，将50 μg FGFR2β(IIIb)/Fc嵌合体施用进大鼠的尾静脉中。在第42天，从大鼠收集淋巴结或脾，并用在杂交瘤制备中。
1)-2  杂交瘤制备
使用Hybrimune杂交瘤生产系统(由Cyto Pulse Sciences, Inc.制造)，将淋巴结细胞或脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0-ag14细胞电融合。将融合的细胞用ClonaCell-HY Selection Medium D (由StemCell Technologies Inc.制造)稀释并培养。将出现的杂交瘤集落回收，以制备单克隆杂交瘤。将如此回收的每个杂交瘤集落培养，并将得到的杂交瘤培养物上清液用于筛选生产抗-FGFR2抗体的杂交瘤。
1)-3  用于筛选抗原结合抗体的表达载体的构建
1)-3-1    人FGFR2 IIIb和FGFR2 IIIc表达载体(pcDNA-DEST40-FGFR2 IIIb和pcDNA-DEST40-FGFR2 IIIc)的构建
将编码人FGFR2 IIIb变体蛋白(亚型2: NP_075259)和人FGFR2 IIIc变体蛋白(亚型1: NP_000132)的cDNA克隆进pcDNA-DEST40载体中，以构建分别用于表达每种变体蛋白的载体pcDNA-DEST40-FGFR2 IIIb和pcDNA-DEST40-FGFR2 IIIc。
1)-3-2    Ig-样结构域-缺陷型FGFR2 IIIb表达载体的构建
用pcDNA-DEST40-FGFR2 IIIb作为模板，通过PCR法构建用于表达以下突变体的载体：在FGFR2 IIIb的全长氨基酸序列(1-822)中缺失第54-110位氨基酸的区域的突变体(在下文中，被称作“IgD1-缺失突变体”)，在其中缺失第154-246位氨基酸的区域的突变体(在下文中，被称作“IgD2-缺失突变体”)，或在其中缺失第263-358位氨基酸的区域的突变体(在下文中，被称作“IgD3-缺失突变体”)。
1)-4  通过细胞-ELISA进行的抗体筛选
1)-4-1    为细胞-ELISA制备表达抗原基因的细胞
在含有10%FBS的DMEM培养基中，将HEK293细胞调至7.5 x 105个细胞/ml。使用Lipofectamine 2000 (由Life Technologies Corp.制造)，向其中转染pcDNA-DEST40-FGFR2 IIIb或对照pcDNA-DEST40。将得到的细胞以50 μl/孔的量分散至96-孔半区域板(由Corning Inc.制造)，并在含有10%FBS的DMEM培养基中在5%CO2条件下在37℃培养过夜。将得到的转染细胞以附着状态用在细胞-ELISA中。
1)-4-2    细胞-ELISA
从在实施例1)-4-1中制备的表达载体转染的HEK293细胞除去培养物上清液以后，将每份杂交瘤培养物上清液加给pcDNA-DEST40-FGFR2 IIIb-或pcDNA-DEST40-转染的HEK293细胞，并将平板在4℃静置1小时。将孔中的细胞用含有5%FBS的PBS洗涤1次。然后，向其中加入用含有5%FBS的PBS稀释500倍的、在兔中生产的抗-大鼠IgG-过氧化物酶抗体(由Sigma-Aldrich Corp.制造)，并将平板在4℃静置1小时。将孔中的细胞用含有5%FBS的PBS洗涤5次。然后，以25 μl/孔的浓度，向其中加入OPD产色溶液(OPD溶液(分别以0.4 mg/ml和0.6%(v/v)的浓度溶解在0.05 M柠檬酸三钠和0.1 M磷酸氢二钠十二水合物中的邻苯二胺二盐酸盐(由Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.制造)和H2O2，pH 4.5))。在偶尔搅拌下进行显色反应，并通过以25 μl/孔的浓度加入1 M HCl来停止。然后，使用平板读数器(ENVISION; PerkinElmer, Inc.)，在490 nm测量吸光度。为了选择生产抗体(其特异性地结合在细胞膜表面上表达的FGFR2)的杂交瘤，将产生特定培养物上清液的杂交瘤选择为抗-FGFR2抗体生产阳性的杂交瘤，所述特定培养物上清液就pcDNA-DEST40-FGFR2 IIIb表达载体转染的HEK293细胞而言表现出的吸光度高于对照pcDNA-DEST40转染的HEK293细胞。
1)-5  通过流式细胞术的抗体筛选
1)-5-1    用于流式细胞术分析的表达抗原基因的细胞的制备
以5×104个细胞/cm2的密度，将HEK293T细胞接种至225-cm2烧瓶(由Sumitomo Bakelite Co., Ltd.制造)，并在含有10%FBS的DMEM培养基中在5%CO2条件下在37℃培养过夜。在次日，使用Lipofectamine 2000，将缺失N-端IgD1结构域的pcDNA-DEST40-FGFR2 IIIb IgD1-缺失突变体或对照pcDNA-DEST40转染至HEK293T细胞，并将所述细胞在5%CO2条件下在37℃进一步培养过夜。在次日，将表达载体转染的HEK293T细胞用TrypLE Express (由Life Technologies Corp.制造)处理，用含有10%FBS的DMEM洗涤，然后悬浮于含有5%FBS的PBS中。将得到的细胞混悬液用在流式细胞术分析中。
1)-5-2    流式细胞术分析
通过流式细胞术，进一步证实通过实施例1)-4中的细胞-ELISA确定为阳性的每个杂交瘤生产的抗体的FGFR2 IIIb结合特异性。将在实施例1)-5-1中制备的每份HEK293T细胞混悬液离心以除去上清液。然后，将pcDNA-DEST40-FGFR2 IIIb IgD1-缺失突变体转染的HEK293T细胞或pcDNA-DEST40-转染的HEK293T细胞通过加入杂交瘤培养物上清液进行悬浮，并在4℃静置1小时。将所述细胞用含有5%FBS的PBS洗涤2次，然后通过加入用含有5%FBS的PBS稀释320倍的抗-大鼠IgG FITC缀合物(由Sigma-Aldrich Corp.制造)进行悬浮，并在4℃静置1小时。将所述细胞用含有5%FBS的PBS洗涤3次，然后再悬浮于含有5%FBS和2 μg/ml 7-氨基放线菌素D (由Molecular Probes, Inc.制造)的PBS中，随后使用流式细胞计(FC500；由Beckman Coulter Inc.制造)进行检测。使用Flowjo (由Tree Star Inc.制造)分析数据。通过选通除去7-氨基放线菌素D-阳性的死细胞以后，将活细胞的FITC荧光强度绘制成直方图。得到产生特定样品的杂交瘤作为生产抗-FGFR2 IIIb抗体的杂交瘤，与对照pcDNA-DEST40-转染的HEK293T细胞的荧光强度直方图相比，所述特定样品在pcDNA-DEST40-FGFR2 IIIb IgD1-缺失突变体-转染的HEK293T细胞的直方图中表现出向更强荧光强度的迁移。
1)-6  基于信号中和效应的筛选
为了评价每个得到的杂交瘤生产的抗-FGFR2抗体的信号中和效应，通过下述的方法构建Elk1萤光素酶报道基因测定系统，其用于检测经由配体FGF7刺激通过FGFR2活化诱导的ERK (细胞外信号调节的激酶)活化，并将该系统用于评价得到的抗体的效应。
1)-6-1    用于报道基因测定的载体的构建
首先，构建pFR-Luc2CP载体。将pFR-Luc (Stratagene #219005)用HindIII切割，并使用T4 DNA聚合酶平端化，然后用BamHI切割，以分离包含5个GAL4结合元件和TATA框的140-bp片段。接着，将pGL4.12[luc2CP] (Promega #E6661)用EcoICRI和BglII切割，去磷酸化，然后与140-bp片段连接，以制备pFR-Luc2CP载体。
1)-6-2    Elk1萤光素酶报道基因测定
使用在实施例1)-5中选择的每份杂交瘤培养物上清液，进行Elk1萤光素酶报道基因测定。根据转染规程，使用Lipofectamine 2000 (由Invitrogen Corp.制造)，用pcDNA-DEST40-FGFR2 IIIb或pcDNA-DEST40、pFA2-Elk1 (由Stratagene Corp.制造)、pFR-Luc2CP和pGL4.74[hRluc/TK] (由Promega Corp.制造)瞬时共转染细胞系293α，其为用整联蛋白αv和整联蛋白β3表达载体稳定转染的HEK293细胞，并将细胞系293α接种至白色96-孔细胞培养板(由Corning Inc.制造)，并在5%CO2条件下在37℃培养过夜。在次日，将培养物上清液除去，并将用含有5%FBS的DMEM稀释5倍的杂交瘤培养物上清液以50 μl/孔的浓度加入板中。在5%CO2条件下在37℃培养1小时以后，将配体人FGF7(由R&D systems, Inc.制造)以10 ng/ml的终浓度加入每个孔中。温育6小时以后，制备细胞裂解物，并使用双萤光素酶报道基因测定系统(由Promega Corp.制造)测定荧火虫萤光素酶活性(特异性信号)和海紫罗蓝属(Renilla)萤光素酶活性(用于标准化的信号)。计算荧火虫/海紫罗蓝属比率，以标准化每个孔上的数据。选择产生抗-FGFR2抗体的杂交瘤FR2-10、FR2-13和FR2-14，所述抗-FGFR2抗体将配体FGF7依赖性的报道基因活化降低至表达FGFR2的HEK293报道细胞中的无配体水平。
1)-7  抗体的同种型分型
使用大鼠单克隆同种型分型试验试剂盒(由AbD Serotec制造)，将生产抗-FGFR2抗体的杂交瘤FR2-10、FR2-13和FR2-14进行同种型分型。结果，证实它们的同种型是IgG2a和κ链(对于FR2-10)以及IgG1和κ链(对于FR2-13和FR2-14)。
1)-8  单克隆抗体的制备
从杂交瘤移植的小鼠的腹水(在下文中，被称作“抗体纯化材料”)纯化每种单克隆抗体。
如下制备小鼠腹水：首先，将7-8周龄BALB/cAJcl-nu/nu (Japan SLC, Inc.)用姥鲛烷(由Sigma-Aldrich Corp.制造)处理。大约1-4周以后，以1-2×107个细胞/小鼠的量腹膜内地移植每个用PBS洗涤过的杂交瘤。1- 2周以后，将在腹膜内积累的腹水收集，穿过0.22-μm过滤器灭菌，并用作抗体纯化材料。
使用Hitrap MabSelect SuRe (由GE Healthcare Bio-Sciences Corp.制造)纯化每种抗体。将抗体纯化材料应用于柱，然后将柱用PBS洗涤，随后用2 M盐酸精氨酸(pH 4.0)洗脱。将洗脱的抗体溶液中和，然后用PBS进行缓冲液替换。通过洗脱与POROS G 20 μm柱PEEK (4.6 mm×50 mm, 0.83 ml，由Applied Biosystems, Inc.制造)结合的抗体，确定纯化的抗体的浓度，随后测量洗脱液的吸光度(O.D. 280 nm)。具体地，将用PBS稀释的抗体样品应用于用平衡缓冲液(30.6 mM磷酸二氢钠十二水合物、19.5 mM磷酸一钾和0.15 M NaCl，pH 7.0)平衡过的POROS G 20 μm。将柱用平衡缓冲液洗涤，随后使用洗脱液(0.1%(v/v) HCl和0.15 M NaCl)洗脱与柱结合的抗体。测量洗脱液的吸光度(O.D. 280 nm)的峰面积，并根据下述表达式计算浓度：抗体样品浓度(mg/ml) = (抗体样品的峰面积)/(标准品(人IgG1)的峰面积)×标准品的浓度(mg/ml)×样品的稀释比。并且，使用Limulus ES-II Single Test Wako (Wako Pure Chemicals Industries, Ltd. 295-51030；含有对照标准内毒素)和Toxinometer (Wako Pure Chemicals Industries, Ltd. ET-301或ET-5000)，测量在得到的抗体中含有的内毒素的浓度，并证实为1 EU/mg或更低。将该抗体用在后续实验中。
实施例2. 大鼠抗-人FGFR2抗体(FR2-10、FR2-13和FR2-14)的体外评价
2)-1 得到的大鼠抗-FGFR2抗体(FR2-10、FR2-13和FR2-14)对人FGFR2的选择性结合活性的研究
2)-1-1    人FGFR1 IIIc、人FGFR3 IIIb、人FGFR3 IIIc和人FGFR4表达载体的构建
将编码人FGFR1 IIIc变体蛋白(亚型1: NP_075598)、人FGFR3 IIIb变体蛋白(亚型3: NP_001156685)、人FGFR3 IIIc变体蛋白(亚型1: NP_000133)和人FGFR4蛋白(亚型1: NP_002002)的cDNA克隆进pcDNA-DEST40载体中，以分别构建用于表达每种变体蛋白的载体pcDNA-DEST40-FGFR1 IIIc、pcDNA-DEST40-FGFR3 IIIb、pcDNA-DEST40-FGFR3 IIIc和pcDNA-DEST40-FGFR4。
2)-1-2    流式细胞术分析
通过在实施例1)-5-1中所示的方法，将在实施例1)-3-1和2)-1-1中构建的每种人FGFR表达载体转染至HEK293T细胞。将细胞混悬液离心以除去上清液。然后，将这些不同的人FGFR表达载体转染的HEK293T细胞和pcDNA-DEST40-转染的HEK293T细胞分别通过添加含有FR2-10、FR2-13或FR2-14抗体的杂交瘤培养物上清液进行悬浮，并在4℃静置1小时。将所述细胞用含有5%FBS的PBS洗涤2次，然后通过加入用含有5%FBS的PBS稀释320倍的抗-大鼠IgG FITC缀合物(由Sigma-Aldrich Corp.制造)进行悬浮，并在4℃静置1小时。将所述细胞用含有5%FBS的PBS洗涤3次，然后再悬浮于含有5%FBS和2 μg/ml 7-氨基放线菌素D (由Molecular Probes, Inc.制造)的PBS中，随后使用流式细胞计(FC500；由Beckman Coulter Inc.制造)进行检测。使用Flowjo (由Tree Star Inc.制造)分析数据。通过选通除去7-氨基放线菌素D-阳性的死细胞以后，将活细胞的FITC荧光强度绘制成直方图，以计算平均荧光强度(MFI)。如从图1所见，证实了大鼠FR2-10抗体选择性地结合人FGFR2 IIIb，同时证实了大鼠FR2-13和FR2-14抗体选择性地结合人FGFR2 IIIb和FGFR2 IIIc。
2)-2  得到的大鼠抗-FGFR2抗体(FR2-10、FR2-13和FR2-14)的表位的鉴定
使用用于表达突变体(其缺少在FGFR2细胞外区域中存在的3个Ig-样结构域中的任一个)的载体，鉴定被得到的大鼠抗-FGFR2抗体结合的表位。通过实施例1)-5-1中所示的方法，将在实施例1)-3-2中构建的FGFR2 IIIb IgD1、IgD2或IgD3-缺失突变体表达载体转染至HEK293T细胞。将细胞混悬液离心以除去上清液。然后，将这些不同的Ig-样结构域-缺陷型FGFR2 IIIb表达载体转染的HEK293T细胞和pcDNA-DEST40-转染的HEK293T细胞分别通过加入含有FR2-10、FR2-13或FR2-14抗体的杂交瘤培养物上清液进行悬浮，并在4℃静置1小时。将所述细胞用含有5%FBS的PBS洗涤2次，然后通过加入用含有5%FBS的PBS稀释320倍的抗-大鼠IgG FITC缀合物(由Sigma-Aldrich Corp.制造)进行悬浮，并在4℃静置1小时。将所述细胞用含有5%FBS的PBS洗涤3次，然后再悬浮于含有5%FBS和2 μg/ml 7-氨基放线菌素D (由Molecular Probes, Inc.制造)的PBS中，随后使用流式细胞计(FC500；由Beckman Coulter Inc.制造)检测。使用Flowjo (由Tree Star Inc.制造)分析数据。通过选通除去7-氨基放线菌素D-阳性的死细胞以后，将活细胞的FITC荧光强度绘制成直方图，以计算平均荧光强度(MFI)。如从图2所见，证实大鼠FR2-10抗体结合人FGFR2 IIIb的Ig-样结构域3。相反，证实大鼠FR2-13和FR2-14抗体(其也表现出对人FGFR2 IIIc的结合活性)结合人FGFR2 IIIb和FGFR2 IIIc的共有Ig-样结构域2。
2)-3  得到的大鼠抗-FGFR2抗体(FR2-10、FR2-13和FR2-14)的信号中和效应
为了通过Elk1萤光素酶报道基因测定评价所得抗体的信号中和效应，通过实施例1)-6-2中所示的方法，用在实施例1)-3-1中构造的pcDNA-DEST40-FGFR2 IIIb或pcDNA-DEST40-FGFR2 IIIc、pFA2-Elk1 (由Stratagene Corp.制造)、pFR-Luc2CP和pGL4.74[hRluc/TK] (由Promega Corp.制造)共转染293α细胞，并在5%CO2条件下在37℃培养过夜。在次日，除去培养物上清液，然后将细胞与用含有2%FBS的DMEM稀释的大鼠FR2-10、FR2-13或FR2-14抗体一起预温育1小时。随后，将配体人FGF7 (由R&D systems, Inc.制造)或人FGF9 (由PeproTech Inc.制造)以10 ng/ml的终浓度加至每个孔。温育6小时以后，使用Dual-Glo萤光素酶测定系统(由Promega Corp.制造)，测定荧火虫萤光素酶活性(特异性信号)和海紫罗蓝属萤光素酶活性(用于标准化的信号)。计算荧火虫/海紫罗蓝属比率，以标准化每个孔上的数据。如在图3A中所示，大鼠FR2-10、FR2-13和FR2-14抗体抑制表达FGFR2 IIIb的细胞中的配体FGF7依赖性的报道基因活化。如在图3B中所示，大鼠FR2-13和FR2-14抗体抑制表达FGFR2 IIIc的细胞中的配体FGF9依赖性的报道基因活性。这些结果证实，这些抗体具有抑制它的配体对FGFR2的活化的作用。
2)-4  得到的大鼠抗-FGFR2抗体(FR2-10)对人癌细胞系的FGFR2信号抑制作用
使用内源性地表达FGFR2的胃癌细胞系SNU-16，试验了得到的抗体的FGFR2信号抑制作用。将悬浮于含有0.1%牛血清白蛋白的RPMI培养基中的SNU-16细胞(3×106)接种到12-孔板上，并温育过夜。向其中加入大鼠FR2-10抗体，并将细胞在37℃温育1小时。然后，向其中加入10 ng/ml FGF7 (由R&D systems, Inc.制造)，并将细胞进一步温育10分钟。随后，用含有Complete Mini (由Roche Applied Science制造)和磷酸酶抑制剂(由Nacalai Tesque Inc.制造)的RIPA缓冲液(1%NP-40、0.5%脱氧胆酸钠和0.1%的SDS在PBS中的溶液)裂解细胞。将裂解物离心以得到细胞裂解溶液，并使用BCA蛋白测定(由Pierce Biotechnology, Inc.制造)确定蛋白浓度。将裂解物再悬浮于含有DTT的缓冲液中，并在99℃变性5分钟。通过5-20%凝胶上的SDS-PAGE分离蛋白(20 μg/泳道)。将蛋白印迹在PVDF膜(由Bio-Rad Laboratories, Inc.制造)上。将膜用含有5%脱脂奶(MEGMILK SNOW BRAND Co., Ltd.)的TBS-T (2 mM Tris、50 mM NaCl和0.1%吐温-20 (pH 7.4))在室温封闭1小时。然后，向其中加入针对FGFR2、磷酸化的FGFR2 (p-FGFR2)、FRS2、磷酸化的FRS2 (p-FRS2)、ERK或磷酸化的ERK (p-ERK)的抗体，随后在4℃温育过夜。洗涤以后，将膜与辣根过氧化物酶-缀合的抗-兔第二抗体(Amersham Biosciences Corp.)一起温育。使用ECL plus底物(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.)，将免疫反应带用X-射线胶片显影。如在图4中所示，配体FGF7刺激增加FGFR2、FRS2和ERK的磷酸化，而大鼠FR2-10抗体以浓度依赖性的方式抑制这些分子的磷酸化的增加。
实施例3. 编码大鼠抗-人FGFR2抗体(FR2-10、FR2-13和FR2-14)的可变区的cDNA的测序
3)-1  大鼠FR2-10、FR2-13和FR2-14抗体的重链和轻链的N-端氨基酸序列的鉴定
为了鉴定大鼠FR2-10、FR2-13和FR2-14抗体的重链和轻链的N-端氨基酸序列，通过SDS-PAGE分别分离在实施例1)-8中纯化的大鼠FR2-10、FR2-13和FR2-14抗体。分离以后，将凝胶中的每种蛋白从凝胶转移至Sequi-Blot PVDF膜(Bio-Rad Laboratories, Inc.)。将膜用洗涤缓冲液(25 mM NaCl和10 mM硼酸钠缓冲液, pH 8.0)洗涤，然后通过浸入染色溶液(50%甲醇、20%乙酸和0.05%考马斯亮蓝)中保持5分钟进行染色，然后用90%甲醇脱色。将在PVDF膜上显影的、与每种抗体的重链(具有较小迁移率的带)和轻链(具有较大迁移率的带)对应的带切离，并通过自动Edman方法(参见Edman等人(1967) Eur. J. Biochem. 1, 80)使用Procise cLC蛋白测序仪Model 492cLC (Applied Biosystems, Inc.)鉴定它们各自的N-端氨基酸序列。结果，与FR2-10的重链对应的带的N-端氨基酸序列是EVQLVESGGGLV (序列表的SEQ ID NO: 1；图9)，与其轻链对应的带的N-端氨基酸序列是DIQMTQSPSSLSA (序列表的SEQ ID NO: 2；图10)。
与FR2-13的重链对应的带的N-端氨基酸序列是QVKLL (序列表的SEQ ID NO: 3；图11)，与其轻链对应的带的N-端氨基酸序列是DIQMTQSPASLSASLGE (序列表的SEQ ID NO: 4；图12)。
与FR2-14的重链对应的带的N-端氨基酸序列是QVKLL (序列表的SEQ ID NO: 5；图13)，与其轻链对应的带的N-端氨基酸序列是DIQMTQSPASLSASLGE (序列表的SEQ ID NO: 6；图14)。
3)-2  从生产FR2-10、FR2-13、和FR2-14的杂交瘤制备mRNA
为了扩增编码FR2-10、FR2-13和FR2-14的可变区的cDNA，使用mRNA分离试剂盒(Roche Applied Science)从生产FR2-10、FR2-13、和FR2-14的杂交瘤细胞中的每一种制备mRNA。
3)-3  cDNA (5'-RACE-Ready cDNA)的合成
使用70 ng在实施例3)-2中制备的每种mRNA、PrimeScript逆转录酶(Takara Bio Inc.),和SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)，合成cDNA (5'-RACE-Ready cDNA)。
3)-4  编码FR2-10、FR2-13和FR2-14重链可变区的cDNA的5'-RACE PCR扩增和测序
由于FR2-10重链的同种型是IgG2a并且FR2-13和FR2-14重链的同种型是IgG1 (实施例1)-7)，用于PCR扩增每个重链基因的编码可变区的cDNA的引物是具有UPM (通用引物A混合物；连接至SMART RACE cDNA扩增试剂盒)和5'-GAGTTACTTTTGAGAGCAGTTCCAGGAG-3' (RG1R1: 序列表的SEQ ID NO: 7；图15)的核苷酸序列的寡核苷酸。将使用的UPM连接至SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)，而从在数据库中登记的大鼠重链(IgG2a和IgG1)恒定区的序列设计RG1R1。
使用该引物集合和在实施例3)-3中合成的cDNA (5'-RACE-Ready cDNA)作为模板，通过5'-RACE PCR分别扩增编码FR2-10、FR2-13和FR2-14的重链可变区的cDNA。根据SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)的手册，使用聚合酶KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.)，在Touchdown PCR程序上进行该PCR。
使用MinElute PCR纯化试剂盒(Qiagen N.V.)，纯化通过5'-RACE PCR扩增的每个编码重链可变区的cDNA，然后通过测序进行分析。
使用的测序引物是具有核苷酸序列5'-GAGTTACTTTTGAGAGCAGTTCCAGGAG-3' (RG1R1: 序列表的SEQ ID NO: 7；图15)的寡核苷酸。
基于该测序分析的结果，如下所示进一步设计每个cDNA的互补链的测序引物，并用在测序分析中。　
FR2-10的测序引物
 (10HF: 序列表的SEQ ID NO: 8；图16)
FR2-13的测序引物
 (13HF: 序列表的SEQ ID NO: 9；图17)
FR2-14的测序引物
 (14HF: 序列表的SEQ ID NO: 10；图18)。
使用基因序列分析仪(“ABI PRISM 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems, Inc.”或“Applied Biosystems 3730xl Analyzer; Applied Biosystems, Inc.”)进行测序分析。将GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, Inc.)用在测序反应中。
经确定的编码FR2-10、FR2-13和FR2-14的重链可变区的cDNA的核苷酸序列和这些可变区的氨基酸序列分别显示在序列表的SEQ ID NO: 11、13和15以及SEQ ID NO: 12、14和16 (图19、21和23以及图20、22和24)中。
基于它们的核苷酸序列确定的FR2-10、FR2-13和FR2-14重链可变区的氨基酸序列与在实施例3)-1中确定的N-端氨基酸序列一致。
3)-5  编码FR2-10轻链可变区的cDNA的5'-RACE PCR扩增和测序
由于FR2-10轻链的同种型是κ(实施例1)-7)，用于PCR扩增轻链基因的编码可变区的cDNA的引物是具有UPM (通用引物A混合物；连接至SMART RACE cDNA扩增试剂盒)和5'-TTCATGAGGCACACGACTGAGGCACCTCC-3' (RKR3: 序列表的SEQ ID NO: 17；图25)的核苷酸序列的寡核苷酸。将使用的UPM连接至SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)，而从在数据库中登记的大鼠轻链恒定区的序列设计RKR3。
使用该引物集合和在实施例3)-3中合成的cDNA (5'-RACE-Ready cDNA)作为模板，通过5'-RACE PCR扩增编码FR2-10的轻链可变区的cDNA。根据SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)的手册，使用聚合酶KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.)，在Touchdown PCR程序上进行该PCR。使用MinElute PCR纯化试剂盒(Qiagen N.V.)，纯化通过5'-RACE PCR扩增的编码轻链可变区的cDNA，然后通过测序进行分析。
使用的测序引物是具有核苷酸序列5'-TCCAGTTGCTAACTGTTCCG-3' (sqRK: 序列表的SEQ ID NO: 18；图26)的寡核苷酸，所述核苷酸序列从在数据库中登记的大鼠轻链恒定区的序列设计。
基于该测序分析的结果，如下所示进一步设计cDNA的互补链的测序引物，并用在测序分析中。
FR2-10的测序引物
 (10LF: 序列表的SEQ ID NO: 19；图27)。
如上所述进行测序分析和测序反应。
经确定的编码FR2-10的轻链可变区的cDNA的核苷酸序列和该可变区的氨基酸序列分别显示在序列表的SEQ ID NO: 20和SEQ ID NO: 21 (图28和29)中。
基于它的核苷酸序列确定的FR2-10轻链可变区的氨基酸序列与在实施例3)-1中确定的N-端氨基酸序列一致。
3)-6  编码FR2-13和FR2-14轻链可变区的cDNA的5'-RACE PCR扩增和测序
由于FR2-13和FR2-14轻链的同种型是κ(实施例1)-7)，用于PCR扩增每个轻链基因的编码可变区的cDNA的引物是具有UPM (通用引物A混合物；连接至SMART RACE cDNA扩增试剂盒)和5'-TACGTGCTGTCTTTGCTGTCCTGATCAG-3' (RKR6: 序列表的SEQ ID NO: 22；图30)的核苷酸序列的寡核苷酸。将使用的UPM连接至SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)，而从在数据库中登记的大鼠轻链恒定区的序列设计RKR6。
使用该引物集合和在实施例3)-3中合成的cDNA (5'-RACE-Ready cDNA)作为模板，通过5'-RACE PCR分别扩增FR2-13和FR2-14的轻链基因的编码可变区的cDNA。根据SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)的手册，使用聚合酶KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.)，在Touchdown PCR程序上进行该PCR。
使用MinElute PCR纯化试剂盒(Qiagen N.V.)，纯化通过5'-RACE PCR扩增的编码每个轻链可变区的cDNA，然后使用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen Corp.)进行克隆。通过测序，分析克隆的编码轻链可变区的cDNA。
使用的测序引物是具有从在数据库中登记的大鼠轻链恒定区的序列设计的核苷酸序列5'-TTCATGAGGCACACGACTGAGGCACCTCC-3' (RKR3: 序列表的SEQ ID NO: 17；图25)和NUP (嵌套通用引物A: 连接至SMART RACE cDNA扩增试剂盒)的寡核苷酸。
如上所述进行测序分析和测序反应。
经确定的编码FR2-13和FR2-14的轻链可变区的cDNA的核苷酸序列和这些可变区的氨基酸序列分别显示在序列表的SEQ ID NO: 23和25 (图31和33)以及SEQ ID NO: 24和26 (图32和34)中。
基于它们的核苷酸序列确定的FR2-13和FR2-14轻链可变区的氨基酸序列与在实施例3)-1中确定的N-端氨基酸序列一致。
实施例4. 人嵌合抗-FGFR2抗体(cFR2-10、cFR2-13和cFR2-14)的制备
4)-1  嵌合的和人源化的轻链表达载体pCMA-LK的构建
用限制性酶XbaI和PmeI消化质粒pcDNA3.3-TOPO/LacZ (Invitrogen Corp.)。使用In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)，将得到的大约5.4 kb的片段与包含编码人κ链分泌信号和人κ链恒定区的DNA序列(显示在序列表的SEQ ID NO: 27 (图35)中)的DNA片段连接，以制备pcDNA3.3/LK。
使用下示的引物集合，用pcDNA3.3/LK作为模板，进行PCR。将得到的大约3.8 kb的片段磷酸化，然后自我连接以构建嵌合的和人源化的轻链表达载体pCMA-LK，其具有信号序列、克隆位点和在CMV启动子下游的编码人κ链恒定区的核苷酸序列。
引物集合
 (3.3-F1: 序列表的SEQ ID NO: 28；图36)
 (3.3-R1: 序列表的SEQ ID NO: 29；图37)。
4)-2  嵌合的和人源化的IgG1型重链表达载体pCMA-G1的构建
用XbaI和PmeI消化pCMA-LK。使用In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)，将得到的DNA片段(除了编码κ链分泌信号和人κ链恒定区的DNA序列以外)与包含编码人重链信号序列和人IgG1恒定区的氨基酸的DNA序列(显示在序列表的SEQ ID NO: 30 (图38)中)的DNA片段连接，以构建嵌合的和人源化的IgG1型重链表达载体pCMA-G1，其具有信号序列、克隆位点和在CMV启动子下游的编码人IgG1重链恒定区的核苷酸序列。
4)-3  人嵌合FR2-10轻链表达载体的构建
使用作为模板的在实施例3)中得到的编码FR2-10轻链可变区的cDNA、KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.)和下示的引物集合，扩增包含编码轻链可变区的cDNA的DNA片段，并使用In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)插入用于嵌合和人源化抗体轻链表达的通用载体pCMA-LK的限制性酶BsiWI切割的位点中，以构建人嵌合FR2-10轻链表达载体。将得到的表达载体命名为“pCMA-LK/cFR2-10”。人嵌合FR2-10轻链的核苷酸序列和该轻链的氨基酸序列分别显示在序列表的SEQ ID NO: 31和32 (图39和40)中。
人嵌合FR2-10轻链的引物集合
 (c10-LF: 序列表的SEQ ID NO: 33；图41)
 (c10-LR: 序列表的SEQ ID NO: 34；图42)。
4)-4  人嵌合FR2-10重链表达载体的构建
使用作为模板的在实施例3)中得到的编码FR2-10重链可变区的cDNA、KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.)和下示的引物集合，扩增包含编码重链可变区的cDNA的DNA片段，并使用In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)插入嵌合的和人源化的IgG1型重链表达载体pCMA-G1的限制性酶BlpI切割的位点中，以构建人嵌合FR2-10重链表达载体。将得到的表达载体命名为“pCMA-G1/cFR2-10”。编码人嵌合FR2-10重链的核苷酸序列和该重链的氨基酸序列分别显示在序列表的SEQ ID NO: 35和36 (图43和44)中。
人嵌合FR2-10重链的引物集合
 (c10-HF: 序列表的SEQ ID NO: 37；图45)
  (c10-HR: 序列表的SEQ ID NO: 38；图46)。
4)-5       人嵌合FR2-13轻链表达载体的构建
使用作为模板的在实施例3)中得到的编码FR2-13轻链可变区的cDNA、KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.)和下示的引物集合，扩增包含编码轻链可变区的cDNA的DNA片段，并使用In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)插入用于嵌合和人源化抗体轻链表达的通用载体pCMA-LK的限制性酶BsiWI切割的位点中，以构建人嵌合FR2-13轻链表达载体。将得到的表达载体命名为“pCMA-LK/cFR2-13”。编码人嵌合FR2-13轻链的核苷酸序列和该轻链的氨基酸序列分别显示在序列表的SEQ ID NO: 39和40 (图47和48)中。
人嵌合FR2-13轻链的引物集合
 (c13-LF: 序列表的SEQ ID NO: 41；图49)
 (c13-LR: 序列表的SEQ ID NO: 42；图50)。
4)-6  人嵌合FR2-13重链表达载体的构建
使用作为模板的在实施例3)中得到的编码FR2-13重链可变区的cDNA、KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.)和下示的引物集合，扩增包含编码重链可变区的cDNA的DNA片段，并使用In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)插入嵌合的和人源化的IgG1型重链表达载体pCMA-G1的限制性酶BlpI切割的位点中，以构建人嵌合FR2-13重链表达载体。将得到的表达载体命名为“pCMA-G1/cFR2-13”。编码人嵌合FR2-13重链的核苷酸序列和该重链的氨基酸序列分别显示在序列表的SEQ ID NO: 43和44 (图51和52)中。
人嵌合FR2-13重链的引物集合
 (c13-HF: 序列表的SEQ ID NO: 45；图53)
5'-cttggtggaggctgagctgacagtgaccagagtgccttggccccag-3' (c13-HR: 序列表的SEQ ID NO: 46；图54)。
4)-7  人嵌合FR2-14轻链表达载体的构建
使用作为模板的在实施例3)中得到的编码FR2-14轻链可变区的cDNA、KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.)和下示的引物集合，扩增包含编码轻链可变区的cDNA的DNA片段，并使用In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)插入用于嵌合和人源化抗体轻链表达的通用载体pCMA-LK的限制性酶BsiWI切割的位点中，以构建人嵌合FR2-14轻链表达载体。将得到的表达载体命名为“pCMA-LK/cFR2-14”。编码人嵌合FR2-14轻链的核苷酸序列和该轻链的氨基酸序列分别显示在序列表的SEQ ID NO: 47和48 (图55和56)中。
人嵌合FR2-14轻链的引物集合
 (c13-LF: 序列表的SEQ ID NO: 41；图49)
 (c14-LR: 序列表的SEQ ID NO: 49；图57)。
4)-8  人嵌合FR2-14重链表达载体的构建
使用作为模板的在实施例3)中得到的编码FR2-14重链可变区的cDNA、KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.)和下示的引物集合，扩增包含编码重链可变区的cDNA的DNA片段，并使用In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)插入嵌合的和人源化的IgG1型重链表达载体pCMA-G1的限制性酶BlpI切割的位点中，以构建人嵌合FR2-14重链表达载体。将得到的表达载体命名为“pCMA-G1/cFR2-14”。编码人嵌合FR2-14重链的核苷酸序列和该重链的氨基酸序列分别显示在序列表的SEQ ID NO: 50和51 (图58和59)中。
人嵌合FR2-14重链的引物集合
 (c13-HF: 序列表的SEQ ID NO: 45；图53)
 (c13-HR: 序列表的SEQ ID NO: 46；图54)。
4)-9  人嵌合抗-FGFR2抗体的制备
4)-9-1    人嵌合抗-FGFR2抗体的生产
将FreeStyle 293F细胞(Invitrogen Corp.)传代培养，并根据手册进行培养。
将1.2×109个处于对数生长期的FreeStyle 293F细胞(Invitrogen Corp.)接种至3-L Fernbach锥形瓶(Corning Inc.)，通过用FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen Corp.)稀释来调至1.0×106个细胞/ml，然后在8%CO2培养箱中在90 rpm在37℃摇动培养1小时。将3.6 mg聚乙烯亚胺(Polysciences #24765)溶解在20 ml Opti-Pro SFM培养基(Invitrogen Corp.)中。接着，将使用PureLink HiPure质粒试剂盒(Invitrogen Corp.)制备的每种H链表达载体(0.4 mg)和每种L链表达载体(0.8 mg)悬浮于20 ml Opti-Pro SFM培养基(Invitrogen Corp.)中。将20 ml表达载体/Opti-Pro SFM混合溶液加入20 ml聚乙烯亚胺/Opti-Pro SFM混合溶液中，并将混合物轻轻搅拌，放置5分钟，然后加给FreeStyle 293F细胞。将细胞在8%CO2培养箱中在90 rpm在37℃摇动培养7天，并将得到的培养物上清液穿过一次用弃的囊式过滤器(ADVANTEC #CCS-045-E1H)过滤。
将通过pCMA-G1/cFR2-10和pCMA-LK/cFR2-10的组合得到的人嵌合FR2-10抗体命名为“cFR2-10”。将通过pCMA-G1/cFR2-13和pCMA-LK/cFR2-13的组合得到的人嵌合FR2-13抗体命名为“cFR2-13”。将通过pCMA-G1/cFR2-14和pCMA-LK/cFR2-14的组合得到的人嵌合FR2-14抗体命名为“cFR2-14”。
4)-9-2   人嵌合抗-FGFR2抗体的纯化
使用rProtein A亲和色谱法(在4-6℃)和陶瓷羟磷灰石(在室温)，通过2个步骤纯化在实施例4)-9-1中得到的每种培养物上清液。在室温进行rProtein A亲和色谱法纯化以后和陶瓷羟磷灰石纯化以后的缓冲液替换步骤。首先，将1100-1200 ml培养物上清液应用于用PBS平衡过的MabSelect SuRe (由GE Healthcare Bio-Sciences Corp.制造, HiTrap柱；体积1 ml×2连接)。完整培养溶液输入柱中以后，用15-30 ml PBS洗涤柱。接着，通过用2 M盐酸精氨酸溶液(pH 4.0)洗脱，收集含有抗体的级分。使用脱盐柱(由GE Healthcare Bio-Sciences Corp.制造, HiTrap脱盐柱；体积5 ml×2连接)，用5 mM磷酸钠、50 mM MES和20 mM NaCl (pH 6.5)对所述级分进行缓冲液替换。将缓冲液替换过的抗体溶液进一步应用于陶瓷羟磷灰石柱(Bio-Rad Laboratories, Inc., Bio-Scale CHT2-1羟磷灰石柱；体积2 ml)，该柱用5 mM NaPi、50 mM MES和20 mM NaCl (pH 6.5)的缓冲液平衡过。通过使用氯化钠的线性浓度梯度洗脱，收集含有抗体的级分。使用脱盐柱(由GE Healthcare Bio-Sciences Corp.制造, HiTrap脱盐柱；体积5 ml x 2连接)，将所述级分用CBS (10 mM柠檬酸盐缓冲溶液和140 mM氯化钠, pH 6.0)进行缓冲液替换。最后，使用Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN 20 (分子量截止值: 30K, Sartorius Japan K.K.，在4℃)将所述级分浓缩，并调至1.0 mg/ml或更高的IgG浓度，并用作纯化的样品。
实施例5. 人嵌合抗-FGFR2抗体(cFR2-10、cFR2-13和cFR2-14)的体外活性
5)-1  人嵌合抗-FGFR2抗体(cFR2-10、cFR2-13和cFR2-14)的抗原结合活性
在含有10%FBS的DMEM培养基中，将293α细胞(描述在实施例1)-6中)调至5 x 105个细胞/ml。使用Lipofectamine 2000 (由Invitrogen Corp.制造)，向其转染pcDNA-DEST40-FGFR2 IIIb或pcDNA-DEST40-FGFR2 IIIc。将得到的细胞以100 μl/孔的量分配至96-孔板(由Corning Inc.制造)，并在含有10%FBS的DMEM培养基中在5%CO2条件下在37℃培养过夜。将得到的转染细胞以附着状态用在细胞-ELISA中。除去培养物上清液以后，将cFR2-10、cFR2-13或cFR2-14抗体以2 μg/ml的终浓度加给pcDNA-DEST40-FGFR2 IIIb-或pcDNA-DEST40-FGFR2 IIIc转染的细胞，并将平板在4℃静置1小时。将孔中的细胞用含有5%FBS的PBS洗涤1次。然后，向其中加入用含有5%FBS的PBS稀释500倍的在山羊(由Sigma-Aldrich Corp.制造)中生产的抗-人IgG-过氧化物酶抗体，并将平板在4℃静置1小时。将孔中的细胞用含有5%FBS的PBS洗涤5次。然后，以100 μl/孔的浓度，向其中加入OPD产色溶液(OPD溶液(分别以0.4 mg/ml和0.6%(v/v)的浓度溶解在0.05 M柠檬酸三钠和0.1 M磷酸氢二钠十二水合物中的邻苯二胺二盐酸盐(由Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.制造)和H2O2，pH 4.5))。在偶尔搅拌下进行显色反应，并通过以100 μl/孔的浓度加入1 M HCl来停止。然后，使用平板读数器(ARVO; PerkinElmer, Inc.)，在490 nm测量吸光度。如在图5中所示，cFR2-10抗体选择性地结合FGFR2 IIIb，而cFR2-13和cFR2-14抗体结合FGFR2 IIIb和FGFR2 IIIc。
5)-2  人嵌合抗-FGFR2抗体(cFR2-10、cFR2-13和cFR2-14)的信号中和效应
为了通过Elk1萤光素酶报道基因测定评价所得抗体的信号中和效应，通过实施例1)-6-2中所示的方法，用在实施例1)-3-1中构造的pcDNA-DEST40-FGFR2 IIIb或pcDNA-DEST40-FGFR2 IIIc转染293α细胞，并在5%CO2条件下在37℃培养过夜。在次日，除去培养物上清液，然后将细胞与用含有2%FBS的DMEM稀释的cFR2-10、cFR2-13或cFR2-14抗体(终浓度: 0.05-5 μg/ml)一起预温育1小时。随后，将配体人FGF7 (由R&D systems, Inc.制造)或人FGF9 (由PeproTech Inc.制造)以10 ng/ml的终浓度加至每个孔。温育6小时以后，制备细胞裂解物，并使用双萤光素酶报道基因测定系统(由Promega Corp.制造)测定荧火虫萤光素酶活性(特异性信号)和海紫罗蓝属萤光素酶活性(用于标准化的信号)。计算荧火虫/海紫罗蓝属比率，以标准化每个孔上的数据。如在图6A中所示，cFR2-10、cFR2-13和cFR2-14抑制表达FGFR2 IIIb的细胞中的配体FGF7依赖性的报道基因活化。如在图6B中所示，cFR2-13和cFR2-14抑制表达FGFR2 IIIc的细胞中的配体FGF9依赖性的报道基因活化。这些结果证实，这些抗体具有抑制它的配体对FGFR2的活化的作用。
5)-3       人嵌合抗-FGFR2抗体(cFR2-10、cFR2-13和cFR2-14)的ADCC活性
5)-3-1    靶细胞的制备
根据附带的方案，用pLenti6/V5-GW/lacZ和ViraPower(TM) Packaging Mix (Invitrogen Corp.)共转染293FT细胞(Invitrogen Corp.)，以制备表达β-半乳糖苷酶基因的重组慢病毒。根据ViraPower慢病毒表达系统(Invitrogen Corp.)的方案，用得到的重组慢病毒感染293T细胞。使用10 μg/ml杀稻瘟素(Invitrogen Corp.)选择病毒感染的细胞，以得到稳定地表达β-半乳糖苷酶的细胞系。将这些稳定地表达β-半乳糖苷酶的293T细胞用作ADCC活性测定中的靶细胞。
5)-3-2    靶细胞的制备
在含有10%FBS的DMEM培养基中，将在实施例5)-3-1中得到的稳定地表达β-半乳糖苷酶的293T细胞(在下文中，被称作293T-lacZ)以1 x 107个细胞/ml的量接种至225-cm2烧瓶中。在37℃培养过夜后，使用Lipofectamine 2000 (由Invitrogen Corp.制造)，将pcDNA-DEST40-FGFR2 IIIb转染至细胞，并将所述细胞在含有10%FBS的DMEM培养基中在5%CO2条件下在37℃培养2天，然后解离，并使用TrypLE Express (由Invitrogen Corp.制造)从烧瓶回收。将所述细胞用含有5%FBS的不含酚磺酞的RPMI1640(在下文中，被称作“用于ADCC的培养基”)洗涤2次。通过锥虫蓝染料排除试验，计数活细胞的数目。将所述细胞在用于ADCC的培养基中再悬浮至1×105个细胞/ml，并用作靶细胞。
5)-3-3    效应细胞的制备
将未表征的冷冻保存的PBMC (由Cellular Technology Ltd. 制造)悬浮于含有10%FBS的不含酚磺酞的RPMI1640培养基(由Invitrogen Corp.制造)中，离心，然后再悬浮。通过锥虫蓝染料排除试验，计数活细胞的数目。离心以后，除去培养基，并将细胞在用于ADCC的培养基中悬浮和调至2.3×106细胞/ml的活细胞密度，并用作效应细胞。
5)-3-4    ADCC测定
将在实施例5)-3-2中制备的293T-lacZ细胞以50 μl/孔的浓度加入96-孔U形底微量培养板中。以50 μl/孔的浓度向其中加入用用于ADCC的培养基稀释至1-100 ng/ml (终浓度)的cFR2-10、cFR2-13、cFR2-14或人对照抗体(hIgG)，并将平板在4℃静置1小时。以75 μl/孔的浓度，进一步向其中加入在实施例5)-3-3中制备的效应细胞。将平板在1200 rpm在室温离心5分钟，随后在5%CO2条件下在37℃培养过夜。在次日，将50 μl每个孔中的上清液回收进白色平板(由Corning Inc.制造)中。以50 μl/孔的浓度，向其中加入β-Glo测定系统(由Promega Corp.制造)的溶液。使用平板读数器(ENVISION；由PerkinElmer, Inc.制造)，测量发光强度。根据下述表达式，计算通过ADCC活性裂解的细胞的百分比：
裂解的细胞的百分比(%) = (A - B)/(C - B)×100
A：样品孔的计数
B：自发释放(既没有补充抗体也没有补充效应细胞的孔)计数的平均值(n = 3)。执行与样品孔中相同的操作，例外是，分别加入50 μl和75 μl用于ADCC的培养基来替代抗体和效应细胞。　
C：最大释放(含有在表面活性剂中裂解的靶细胞的孔)计数的平均值(n = 3)。分别加入50 μl和75 μl用于ADCC的培养基来替代抗体和效应细胞。对于测定，将175 μlβ-Glo测定系统溶液加入每个含有靶细胞的孔中，并与其混合。将100 μl其等分试样加入白色平板中，以进行测定。
如在图7中所示，cFR2-10、cFR2-13和cFR2-14对表达FGFR2 IIIb的细胞具有ADCC活性。
实施例6：人嵌合抗-FGFR2抗体(cFR2-10、cFR2-13和cFR2-14)的体内抗肿瘤活性
将人胃癌细胞系SNU-16 (购自ATCC)的5×106个细胞悬浮于50%Matrigel (购自Nippon Becton Dickinson Company, Ltd.)中，并皮下移植至每只裸鼠(CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj，购自Charles River Laboratories Japan Inc.)的腋窝区域。根据它们的肿瘤体积，将小鼠分组。移植后7、11、14和18天，将每种人嵌合抗-FGFR2抗体(cFR2-10、cFR2-13或cFR2-14)以1.5或15mg/kg的剂量腹膜内地施用给带有癌症的小鼠(n = 8)。使用电子数字测径器(由Mitsutoyo Corp.制造)，每周2次地测量移植的肿瘤的长轴和短轴。根据下述表达式，计算肿瘤体积：
肿瘤体积(mm3) = 1/2×短轴(mm)×短轴(mm)×长轴(mm)。
cFR2-10抗体的结果显示在图8-A中。在移植后21天(最终测定天)的肿瘤生长抑制百分比为55%(对于1.5 mg/kg施用组)和35%(对于15 mg/kg施用组)。
cFR2-13抗体的结果显示在图8-B中。在移植后21天(最终测定天)的肿瘤生长抑制百分比为57%(对于1.5 mg/kg施用组)和46%(对于15 mg/kg施用组)。
cFR2-14抗体的结果显示在图8-C中。在移植后21天(最终测定天)的肿瘤生长抑制百分比为34%(对于1.5 mg/kg施用组)和53%(对于15 mg/kg施用组)。
实施例7. 人嵌合抗-FGFR2抗体(cFR2-14)的人源化形式(hFR2-14)的设计
7)-1       FR2-14可变区的分子建模
通过通常被称作同源性建模的方法(Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991))，进行cFR2-14可变区的分子建模。将上面确定的FR2-14的可变区与在蛋白数据库中等级的人免疫球蛋白可变区的基本序列(可得到从X-射线晶体结构衍生出的三维结构)进行对比(Nuc.Acid Res.28, 235-242 (2000))。结果，选择1ZAN，因为它与cFR2-14的轻链可变区具有最高序列同源性。并且，选择1CT8，因为它与cFR2-14的重链可变区的最高序列同源性。通过组合与cFR2-14的轻链和重链对应的1ZAN和1CT8的坐标，将框架区的三维结构制备为“框架模型”。根据Thornton等人的分类法(J. Mol. Biol., 263, 800-815, (1996))，将cFR2-14的CDR作为簇11A、7A、10A、10A和10A分别分配给CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1和CDRH2。根据H3规则(FEBS letter, 399, 1-8 (1996))，将它的CDRH3分类进k(6)-。随后，将每个CDR的典型构象整合进框架模型中。
最后，进行用于排除不利原子间接触的能量计算，以便以能量的方式得到cFR2-14可变区的可能分子模型。使用市售的蛋白三维结构预测程序Prime和构象搜索程序MacroModel (Schrodinger, LLC)，进行这些规程。
7)-2  人源化FR2-14的氨基酸序列的设计
通过通常被称作CDR移植的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033(1989))，构建人源化FR2-14抗体。基于框架区中的氨基酸的同源性，选择受体抗体。
将cFR2-14框架区的序列与在抗体氨基酸序列的Kabat数据库(Nuc. Acid Res., 29, 205-206 (2001))中登记的所有人框架的序列进行对比。结果，将FV/IL-2'CL抗体选择为受体，由于它关于框架区的72%序列同源性。将FV/IL-2'CL中的框架区的氨基酸残基与cFR2-14框架区的氨基酸残基比对，以鉴定在二者之间没有匹配的氨基酸的位置。使用上面构建的cFR2-14的三维模型，分析这些残基的位置。然后，根据Queen等人提供的标准(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86, 10029-10033 (1989))，选择要移植到受体上的供体残基。
将一些如此选择的供体残基转移至受体抗体，以构建如在下面实施例中所述的人源化FR2-14序列。
另外，用不同的氨基酸残基取代cFR2-14的每个CDR中的1-3个氨基酸残基，以构建如在下面实施例中所述的含有经修饰的CDR的人源化FR2-14序列。
7)-3  FR2-14轻链的人源化
7)-3-1    hFR2-14_L1型轻链：
通过分别用丝氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、精氨酸、苏氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸替换序列表的SEQ ID NO: 48所示的cFR2-14轻链中以下位置的氨基酸：29 (丙氨酸)、35 (亮氨酸)、37 (谷氨酸)、38 (苏氨酸)、42 (谷氨酸)、62 (天冬酰胺)、90 (谷氨酰胺)、92 (丝氨酸)、94 (赖氨酸)、96 (天冬酰胺)、100 (丝氨酸)、103 (缬氨酸)、105 (丝氨酸)、107 (苯丙氨酸)、121 (丙氨酸)、125 (亮氨酸)、127 (亮氨酸)和130 (丙氨酸)而设计的人源化FR2-14轻链被命名为“hFR2-14_L1型轻链”。
编码hFR2-14_L1型轻链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 72中。第61-705位核苷酸编码通过信号序列的切割而产生的成熟轻链。并且，hFR2-14_L1型轻链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 73中。第21-235位氨基酸代表通过信号序列的切割而产生的成熟轻链。SEQ ID NO: 72和73的序列分别进一步描述在图80和81中。
7)-4  FR2-14重链的人源化
7)-4-1    hFR2-14_H1型重链：
通过分别用谷氨酰胺、缬氨酸、缬氨酸、赖氨酸、缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、精氨酸、苏氨酸和酪氨酸替换序列表的SEQ ID NO: 51所示的cFR2-14重链中以下位置的氨基酸：22 (赖氨酸)、24 (亮氨酸)、30 (亮氨酸)、31 (缬氨酸)、39 (亮氨酸)、43 (苏氨酸)、56 (亮氨酸)、57 (赖氨酸)、59 (缬氨酸)、62 (脯氨酸)、63 (丝氨酸)、64 (苏氨酸)、67 (异亮氨酸)、86 (赖氨酸)、87 (丙氨酸)、94 (苯丙氨酸)、95 (丝氨酸)、101 (天冬氨酸)、106 (苏氨酸)、110 (丙氨酸)和114 (苯丙氨酸)而设计的人源化FR2-14重链被命名为“hFR2-14_H1型重链”。
编码hFR2-14_H1型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 74中。第58-1401位核苷酸编码通过信号序列的切割而产生的成熟重链。并且，hFR2-14_H1型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 75中。第20-467位氨基酸代表通过信号序列的切割而产生的成熟重链。SEQ ID NO: 74和75的序列分别进一步描述在图82和83中。
7)-4-2    hFR2-14_H2型重链：
通过分别用谷氨酰胺、缬氨酸、缬氨酸、赖氨酸、缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、缬氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、精氨酸、苏氨酸和酪氨酸替换序列表的SEQ ID NO: 51所示的cFR2-14重链中以下位置的氨基酸：22 (赖氨酸)、24 (亮氨酸)、30 (亮氨酸)、31 (缬氨酸)、39 (亮氨酸)、43 (苏氨酸)、56 (亮氨酸)、57 (赖氨酸)、59 (缬氨酸)、62 (脯氨酸)、63 (丝氨酸)、64 (苏氨酸)、67 (异亮氨酸)、86 (赖氨酸)、87 (丙氨酸)、91 (缬氨酸)、94 (苯丙氨酸)、95 (丝氨酸)、101 (天冬氨酸)、106 (苏氨酸)、110 (丙氨酸)和114 (苯丙氨酸)而设计的人源化FR2-14重链被命名为“hFR2-14_H2型重链”。
编码hFR2-14_H2型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 76中。第58-1401位核苷酸编码通过信号序列的切割而产生的成熟重链。并且，hFR2-14_H2型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 77中。第20-467位氨基酸代表通过信号序列的切割而产生的成熟重链。SEQ ID NO: 76和77的序列分别进一步描述在图84和85中。
7)-4-3 hFR2-14_H3型重链：
通过分别用谷氨酰胺、缬氨酸、缬氨酸、赖氨酸、缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、精氨酸、苏氨酸和酪氨酸替换序列表的SEQ ID NO: 51所示的cFR2-14重链中以下位置的氨基酸：22 (赖氨酸)、24 (亮氨酸)、30 (亮氨酸)、31 (缬氨酸)、39 (亮氨酸)、43 (苏氨酸)、56 (亮氨酸)、57 (赖氨酸)、59 (缬氨酸)、67 (异亮氨酸)、86 (赖氨酸)、87 (丙氨酸)、94 (苯丙氨酸)、95 (丝氨酸)、101 (天冬氨酸)、106 (苏氨酸)、110 (丙氨酸)和114 (苯丙氨酸)而设计的人源化FR2-14重链被命名为“hFR2-14_H3型重链”。
编码hFR2-14_H3型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 78中。第58-1401位核苷酸编码通过信号序列的切割而产生的成熟重链。并且，hFR2-14_H3型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 79中。第20-467位氨基酸代表通过信号序列的切割而产生的成熟重链。SEQ ID NO: 78和79的序列分别进一步描述在图86和87中。
7)-4-4 hFR2-14_H4型重链：
通过分别用谷氨酰胺、缬氨酸、缬氨酸、赖氨酸、缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、精氨酸、苏氨酸、酪氨酸和丙氨酸替换序列表的SEQ ID NO: 51所示的cFR2-14重链中以下位置的氨基酸：22 (赖氨酸)、24 (亮氨酸)、30 (亮氨酸)、31 (缬氨酸)、39 (亮氨酸)、43 (苏氨酸)、56 (亮氨酸)、57 (赖氨酸)、59 (缬氨酸)、64(苏氨酸)、67 (异亮氨酸)、86 (赖氨酸)、87 (丙氨酸)、94 (苯丙氨酸)、95 (丝氨酸)、101 (天冬氨酸)、106 (苏氨酸)、110 (丙氨酸)、114 (苯丙氨酸)和125 (苏氨酸)而设计的人源化FR2-14重链被命名为“hFR2-14_H4型重链”。
编码hFR2-14_H4型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 80中。第58-1401位核苷酸编码通过信号序列的切割而产生的成熟重链。并且，hFR2-14_H4型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 81中。第20-467位氨基酸代表通过信号序列的切割而产生的成熟重链。SEQ ID NO: 80和81的序列分别进一步描述在图88和89中。
7)-4-5 hFR2-14_H5型重链：
通过分别用谷氨酰胺、缬氨酸、缬氨酸、赖氨酸、缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、精氨酸、苏氨酸、酪氨酸和谷氨酸替换序列表的SEQ ID NO: 51所示的cFR2-14重链中以下位置的氨基酸：22 (赖氨酸)、24 (亮氨酸)、30 (亮氨酸)、31 (缬氨酸)、39 (亮氨酸)、43 (苏氨酸)、56 (亮氨酸)、57 (赖氨酸)、59 (缬氨酸)、67 (异亮氨酸)、86 (赖氨酸)、87 (丙氨酸)、94 (苯丙氨酸)、95 (丝氨酸)、101 (天冬氨酸)、106 (苏氨酸)、110 (丙氨酸)、114 (苯丙氨酸)和118 (天冬氨酸)而设计的人源化FR2-14重链被命名为“hFR2-14_H5型重链”。
编码hFR2-14_H5型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 82中。第58-1401位核苷酸编码通过信号序列的切割而产生的成熟重链。并且，hFR2-14_H5型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 83中。第20-467位氨基酸代表通过信号序列的切割而产生的成熟重链。SEQ ID NO: 82和83的序列分别进一步描述在图90和91中。
7)-4-6 hFR2-14_H6型重链：
通过分别用谷氨酰胺、缬氨酸、缬氨酸、赖氨酸、缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、精氨酸、苏氨酸、酪氨酸和丙氨酸替换序列表的SEQ ID NO: 51所示的cFR2-14重链中以下位置的氨基酸：22 (赖氨酸)、24 (亮氨酸)、30 (亮氨酸)、31 (缬氨酸)、39 (亮氨酸)、43 (苏氨酸)、56 (亮氨酸)、57 (赖氨酸)、59 (缬氨酸)、67 (异亮氨酸)、86 (赖氨酸)、87 (丙氨酸)、94 (苯丙氨酸)、95 (丝氨酸)、101 (天冬氨酸)、106 (苏氨酸)、110 (丙氨酸)、114 (苯丙氨酸)和119 (甘氨酸)而设计的人源化FR2-14重链被命名为“hFR2-14_H6型重链”。
编码hFR2-14_H6型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 84中。第58-1401位核苷酸编码通过信号序列的切割而产生的成熟重链。并且，hFR2-14_H6型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 85中。第20-467位氨基酸代表通过信号序列的切割而产生的成熟重链。SEQ ID NO: 84和85的序列分别进一步描述在图92和93中。
7)-4-7 hFR2-14_H7型重链：
通过分别用谷氨酰胺、缬氨酸、缬氨酸、赖氨酸、缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、精氨酸、苏氨酸、酪氨酸和谷氨酸替换序列表的SEQ ID NO: 51所示的cFR2-14重链中以下位置的氨基酸：22 (赖氨酸)、24 (亮氨酸)、30 (亮氨酸)、31 (缬氨酸)、39 (亮氨酸)、43 (苏氨酸)、56 (亮氨酸)、57 (赖氨酸)、59 (缬氨酸)、67 (异亮氨酸)、86 (赖氨酸)、87 (丙氨酸)、94 (苯丙氨酸)、95 (丝氨酸)、101 (天冬氨酸)、106 (苏氨酸)、110 (丙氨酸)、114 (苯丙氨酸)和119 (甘氨酸)而设计的人源化FR2-14重链被命名为“hFR2-14_H7型重链”。
编码hFR2-14_H7型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 86中。第58-1401位核苷酸编码通过信号序列的切割而产生的成熟重链。并且，hFR2-14_H7型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 87中。第20-467位氨基酸代表通过信号序列的切割而产生的成熟重链。SEQ ID NO: 86和87的序列分别进一步描述在图94和95中。
7)-4-8 hFR2-14_H8型重链：
通过分别用谷氨酰胺、缬氨酸、缬氨酸、赖氨酸、缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、精氨酸、苏氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸替换序列表的SEQ ID NO: 51所示的cFR2-14重链中以下位置的氨基酸：22 (赖氨酸)、24 (亮氨酸)、30 (亮氨酸)、31 (缬氨酸)、39 (亮氨酸)、43 (苏氨酸)、56 (亮氨酸)、57 (赖氨酸)、59 (缬氨酸)、67 (异亮氨酸)、86 (赖氨酸)、87 (丙氨酸)、94 (苯丙氨酸)、95 (丝氨酸)、101 (天冬氨酸)、106 (苏氨酸)、110 (丙氨酸)、114 (苯丙氨酸)和119 (甘氨酸)而设计的人源化FR2-14重链被命名为“hFR2-14_H8型重链”。
编码hFR2-14_H8型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 88中。第58-1401位核苷酸编码通过信号序列的切割而产生的成熟重链。并且，hFR2-14_H8型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 89中。第20-467位氨基酸代表通过信号序列的切割而产生的成熟重链。SEQ ID NO: 88和89的序列分别进一步描述在图96和97中。
7)-4-9 hFR2-14_H9型重链：
通过分别用谷氨酰胺、缬氨酸、缬氨酸、赖氨酸、缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、精氨酸、苏氨酸、酪氨酸和组氨酸替换序列表的SEQ ID NO: 51所示的cFR2-14重链中以下位置的氨基酸：22 (赖氨酸)、24 (亮氨酸)、30 (亮氨酸)、31 (缬氨酸)、39 (亮氨酸)、43 (苏氨酸)、56 (亮氨酸)、57 (赖氨酸)、59 (缬氨酸)、67 (异亮氨酸)、86 (赖氨酸)、87 (丙氨酸)、94 (苯丙氨酸)、95 (丝氨酸)、101 (天冬氨酸)、106 (苏氨酸)、110 (丙氨酸)、114 (苯丙氨酸)和119 (甘氨酸)而设计的人源化FR2-14重链被命名为“hFR2-14_H9型重链”。
编码hFR2-14_H9型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 90中。第58-1401位核苷酸编码通过信号序列的切割而产生的成熟重链。并且，hFR2-14_H9型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 91中。第20-467位氨基酸代表通过信号序列的切割而产生的成熟重链。SEQ ID NO: 90和91的序列分别进一步描述在图98和99中。
7)-4-10 hFR2-14_H10型重链：
通过分别用谷氨酰胺、缬氨酸、缬氨酸、赖氨酸、缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、精氨酸、苏氨酸、酪氨酸和异亮氨酸替换序列表的SEQ ID NO: 51所示的cFR2-14重链中以下位置的氨基酸：22 (赖氨酸)、24 (亮氨酸)、30 (亮氨酸)、31 (缬氨酸)、39 (亮氨酸)、43 (苏氨酸)、56 (亮氨酸)、57 (赖氨酸)、59 (缬氨酸)、67 (异亮氨酸)、86 (赖氨酸)、87 (丙氨酸)、94 (苯丙氨酸)、95 (丝氨酸)、101 (天冬氨酸)、106 (苏氨酸)、110 (丙氨酸)、114 (苯丙氨酸)和119 (甘氨酸)而设计的人源化FR2-14重链被命名为“hFR2-14_H10型重链”。
编码hFR2-14_H10型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 92中。第58-1401位核苷酸编码通过信号序列的切割而产生的成熟重链。并且，hFR2-14_H10型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 93中。第20-467位氨基酸代表通过信号序列的切割而产生的成熟重链。SEQ ID NO: 92和93的序列分别进一步描述在图100和101中。
7)-4-11 hFR2-14_H11型重链：
通过分别用谷氨酰胺、缬氨酸、缬氨酸、赖氨酸、缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、精氨酸、苏氨酸、酪氨酸和赖氨酸替换序列表的SEQ ID NO: 51所示的cFR2-14重链中以下位置的氨基酸：22 (赖氨酸)、24 (亮氨酸)、30 (亮氨酸)、31 (缬氨酸)、39 (亮氨酸)、43 (苏氨酸)、56 (亮氨酸)、57 (赖氨酸)、59 (缬氨酸)、67 (异亮氨酸)、86 (赖氨酸)、87 (丙氨酸)、94 (苯丙氨酸)、95 (丝氨酸)、101 (天冬氨酸)、106 (苏氨酸)、110 (丙氨酸)、114 (苯丙氨酸)和119 (甘氨酸)而设计的人源化FR2-14重链被命名为“hFR2-14_H11型重链”。
编码hFR2-14_H11型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 94中。第58-1401位核苷酸编码通过信号序列的切割而产生的成熟重链。并且，hFR2-14_H11型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 95中。第20-467位氨基酸代表通过信号序列的切割而产生的成熟重链。SEQ ID NO: 94和95的序列分别进一步描述在图102和103中。
7)-4-12 hFR2-14_H12型重链：
通过分别用谷氨酰胺、缬氨酸、缬氨酸、赖氨酸、缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、精氨酸、苏氨酸、酪氨酸和亮氨酸替换序列表的SEQ ID NO: 51所示的cFR2-14重链中以下位置的氨基酸：22 (赖氨酸)、24 (亮氨酸)、30 (亮氨酸)、31 (缬氨酸)、39 (亮氨酸)、43 (苏氨酸)、56 (亮氨酸)、57 (赖氨酸)、59 (缬氨酸)、67 (异亮氨酸)、86 (赖氨酸)、87 (丙氨酸)、94 (苯丙氨酸)、95 (丝氨酸)、101 (天冬氨酸)、106 (苏氨酸)、110 (丙氨酸)、114 (苯丙氨酸)和119 (甘氨酸)而设计的人源化FR2-14重链被命名为“hFR2-14_H12型重链”。
编码hFR2-14_H12型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 96中。第58-1401位核苷酸编码通过信号序列的切割而产生的成熟重链。并且，hFR2-14_H12型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 97中。第20-467位氨基酸代表通过信号序列的切割而产生的成熟重链。SEQ ID NO: 96和97的序列分别进一步描述在图104和105中。
7)-4-13 hFR2-14_H13型重链：
通过分别用谷氨酰胺、缬氨酸、缬氨酸、赖氨酸、缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、精氨酸、苏氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸替换序列表的SEQ ID NO: 51所示的cFR2-14重链中以下位置的氨基酸：22 (赖氨酸)、24 (亮氨酸)、30 (亮氨酸)、31 (缬氨酸)、39 (亮氨酸)、43 (苏氨酸)、56 (亮氨酸)、57 (赖氨酸)、59 (缬氨酸)、67 (异亮氨酸)、86 (赖氨酸)、87 (丙氨酸)、94 (苯丙氨酸)、95 (丝氨酸)、101 (天冬氨酸)、106 (苏氨酸)、110 (丙氨酸)、114 (苯丙氨酸)和119 (甘氨酸)而设计的人源化FR2-14重链被命名为“hFR2-14_H13型重链”。
编码hFR2-14_H13型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 98中。第58-1401位核苷酸编码通过信号序列的切割而产生的成熟重链。并且，hFR2-14_H13型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 99中。第20-467位氨基酸代表通过信号序列的切割而产生的成熟重链。SEQ ID NO: 98和99的序列分别进一步描述在图106和107中。
7)-4-14 hFR2-14_H14型重链：
通过分别用谷氨酰胺、缬氨酸、缬氨酸、赖氨酸、缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、精氨酸、苏氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺替换序列表的SEQ ID NO: 51所示的cFR2-14重链中以下位置的氨基酸：22 (赖氨酸)、24 (亮氨酸)、30 (亮氨酸)、31 (缬氨酸)、39 (亮氨酸)、43 (苏氨酸)、56 (亮氨酸)、57 (赖氨酸)、59 (缬氨酸)、67 (异亮氨酸)、86 (赖氨酸)、87 (丙氨酸)、94 (苯丙氨酸)、95 (丝氨酸)、101 (天冬氨酸)、106 (苏氨酸)、110 (丙氨酸)、114 (苯丙氨酸)和119 (甘氨酸)而设计的人源化FR2-14重链被命名为“hFR2-14_H14型重链”。
编码hFR2-14_H14型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 100中。第58-1401位核苷酸编码通过信号序列的切割而产生的成熟重链。并且，hFR2-14_H14型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 101中。第20-467位氨基酸代表通过信号序列的切割而产生的成熟重链。SEQ ID NO: 100和101的序列分别进一步描述在图108和109中。
7)-4-15 hFR2-14_H15型重链：
通过分别用谷氨酰胺、缬氨酸、缬氨酸、赖氨酸、缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、精氨酸、苏氨酸、酪氨酸和精氨酸替换序列表的SEQ ID NO: 51所示的cFR2-14重链中以下位置的氨基酸：22 (赖氨酸)、24 (亮氨酸)、30 (亮氨酸)、31 (缬氨酸)、39 (亮氨酸)、43 (苏氨酸)、56 (亮氨酸)、57 (赖氨酸)、59 (缬氨酸)、67 (异亮氨酸)、86 (赖氨酸)、87 (丙氨酸)、94 (苯丙氨酸)、95 (丝氨酸)、101 (天冬氨酸)、106 (苏氨酸)、110 (丙氨酸)、114 (苯丙氨酸)和119 (甘氨酸)而设计的人源化FR2-14重链被命名为“hFR2-14_H15型重链”。
编码hFR2-14_H15型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 102中。第58-1401位核苷酸编码通过信号序列的切割而产生的成熟重链。并且，hFR2-14_H15型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 103中。第20-467位氨基酸代表通过信号序列的切割而产生的成熟重链。SEQ ID NO: 102和103的序列分别进一步描述在图110和111中。
7)-4-16 hFR2-14_H16型重链：
通过分别用谷氨酰胺、缬氨酸、缬氨酸、赖氨酸、缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、精氨酸、苏氨酸、酪氨酸和缬氨酸替换序列表的SEQ ID NO: 51所示的cFR2-14重链中以下位置的氨基酸：22 (赖氨酸)、24 (亮氨酸)、30 (亮氨酸)、31 (缬氨酸)、39 (亮氨酸)、43 (苏氨酸)、56 (亮氨酸)、57 (赖氨酸)、59 (缬氨酸)、67 (异亮氨酸)、86 (赖氨酸)、87 (丙氨酸)、94 (苯丙氨酸)、95 (丝氨酸)、101 (天冬氨酸)、106 (苏氨酸)、110 (丙氨酸)、114 (苯丙氨酸)和119 (甘氨酸)而设计的人源化FR2-14重链被命名为“hFR2-14_H16型重链”。
编码hFR2-14_H16型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 104中。第58-1401位核苷酸编码通过信号序列的切割而产生的成熟重链。并且，hFR2-14_H16型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 105中。第20-467位氨基酸代表通过信号序列的切割而产生的成熟重链。SEQ ID NO: 104和105的序列分别进一步描述在图112和113中。
7)-4-17 hFR2-14_H17型重链：
通过分别用谷氨酰胺、缬氨酸、缬氨酸、赖氨酸、缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、精氨酸、苏氨酸、酪氨酸和色氨酸替换序列表的SEQ ID NO: 51所示的cFR2-14重链中以下位置的氨基酸：22 (赖氨酸)、24 (亮氨酸)、30 (亮氨酸)、31 (缬氨酸)、39 (亮氨酸)、43 (苏氨酸)、56 (亮氨酸)、57 (赖氨酸)、59 (缬氨酸)、67 (异亮氨酸)、86 (赖氨酸)、87 (丙氨酸)、94 (苯丙氨酸)、95 (丝氨酸)、101 (天冬氨酸)、106 (苏氨酸)、110 (丙氨酸)、114 (苯丙氨酸)和119 (甘氨酸)而设计的人源化FR2-14重链被命名为“hFR2-14_H17型重链”。
编码hFR2-14_H17型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 106中。第58-1401位核苷酸编码通过信号序列的切割而产生的成熟重链。并且，hFR2-14_H17型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 107中。第20-467位氨基酸代表通过信号序列的切割而产生的成熟重链。SEQ ID NO: 106和107的序列分别进一步描述在图114和115中。
7)-4-18 hFR2-14_H18型重链：
通过分别用谷氨酰胺、缬氨酸、缬氨酸、赖氨酸、缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、精氨酸、苏氨酸、酪氨酸和酪氨酸替换序列表的SEQ ID NO: 51所示的cFR2-14重链中以下位置的氨基酸：22 (赖氨酸)、24 (亮氨酸)、30 (亮氨酸)、31 (缬氨酸)、39 (亮氨酸)、43 (苏氨酸)、56 (亮氨酸)、57 (赖氨酸)、59 (缬氨酸)、67 (异亮氨酸)、86 (赖氨酸)、87 (丙氨酸)、94 (苯丙氨酸)、95 (丝氨酸)、101 (天冬氨酸)、106 (苏氨酸)、110 (丙氨酸)、114 (苯丙氨酸)和119 (甘氨酸)而设计的人源化FR2-14重链被命名为“hFR2-14_H18型重链”。
编码hFR2-14_H18型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 108中。第58-1401位核苷酸编码通过信号序列的切割而产生的成熟重链。并且，hFR2-14_H18型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 109中。第20-467位氨基酸代表通过信号序列的切割而产生的成熟重链。SEQ ID NO: 108和109的序列分别进一步描述在图116和117中。
实施例8. 大鼠抗-人FGFR2抗体FR2-14的人源化抗体(hFR2-14)的获得和表达
8)-1  大鼠抗-人FGFR2抗体FR2-14的人源化抗体(hFR2-14)的轻链表达载体的构建
8)-1-1    hFR2-14_L1型轻链表达载体的构建
合成了包含编码hFR2-14_L1型轻链可变区(其显示在SEQ ID NO: 73的第21-130位氨基酸中)的基因的DNA，并用限制性酶BsiWI切割。将得到的DNA片段插入用于嵌合和人源化抗体轻链表达的通用载体(pCMA-LK)的限制性酶BsiWI切割的位点中，以构建hFR2-14_L1型轻链表达载体。将得到的表达载体命名为“pCMA-LK/hFR2-14_L1”。
8)-2 大鼠抗-人FGFR2抗体FR2-14的人源化抗体(hFR2-14)的重链表达载体的构建
8)-2-1    hFR2-14_H1、hFR2-14_H3和hFR2-14_H4型重链表达载体的构建
合成了包含编码hFR2-14_H1、hFR2-14_H3和hFR2-14_H4型重链可变区(分别显示在序列表中的SEQ ID NO: 75的第20-137位氨基酸、SEQ ID NO: 79的第20-137位氨基酸和SEQ ID NO: 81的第20-137位氨基酸)中的每一个的基因的DNA，并用限制性酶BlpI切割。将得到的DNA片段插入用于人源化抗体重链表达的通用载体(pCMA-G1)的限制性酶BlpI切割的位点，以构建hFR2-14_H1、hFR2-14_H3和hFR2-14_H4型重链表达载体。将得到的表达载体分别命名为“pCMA-G1/hFR2-14_H1”、“pCMA-G1/hFR2-14_H3”和“pCMA-G1/hFR2-14_H4”。
8)-2-2    hFR2-14_H2型重链表达载体的构建
使用作为模板的在实施例8)-2-1中构建的pCMA-G1/hFR2-14_H1、下示的引物集合和QuikChange XL定位诱变试剂盒(Agilent Technologies, Inc.)，构建hFR2-14_H2型重链表达载体。将得到的表达载体命名为“pCMA-G1/hFR2-14_H2”。hFR2-14_H2型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO: 76中，它的氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 77中。
引物集合
 (VH3A-F: 序列表的SEQ ID NO: 110)
 (VH3A-R: 序列表的SEQ ID NO: 111)。
8)-2-3    hFR2-14_H5型重链表达载体的构建
将在实施例8)-2-1中制备的hFR2-14_H3型重链表达载体pCMA-G1/hFR2-14_H3用作模板，并使用下述的引物集合和KOD -Plus- Mutagenesis Kit (Toyobo Co., Ltd.)进行突变，以构建hFR2-14_H5型重链表达载体。将得到的表达载体命名为“pCMA-G1/hFR2-14_H5”。
引物集合：
(H-R，其用作下面的描述中的共同引物)。
8)-2-4    hFR2-14_H6型重链表达载体的构建
将在实施例8)-2-1中制备的hFR2-14_H3型重链表达载体pCMA-G1/hFR2-14_H3用作模板，并使用下述的引物集合和KOD -Plus- Mutagenesis Kit (Toyobo Co., Ltd.)进行突变，以构建hFR2-14_H6型重链表达载体。将得到的表达载体命名为“pCMA-G1/hFR2-14_H6”。
引物集合：
。
8)-2-5    hFR2-14_H7型重链表达载体的构建
将在实施例8)-2-1中制备的hFR2-14_H3型重链表达载体pCMA-G1/hFR2-14_H3用作模板，并使用下述的引物集合和KOD -Plus- Mutagenesis Kit (Toyobo Co., Ltd.)进行突变，以构建hFR2-14_H7型重链表达载体。将得到的表达载体命名为“pCMA-G1/hFR2-14_H7”。
引物集合：
。
8)-2-6    hFR2-14_H8型重链表达载体的构建
将在实施例8)-2-1中制备的hFR2-14_H3型重链表达载体pCMA-G1/hFR2-14_H3用作模板，并使用下述的引物集合和KOD -Plus- Mutagenesis Kit (Toyobo Co., Ltd.)进行突变，以构建hFR2-14_H8型重链表达载体。将得到的表达载体命名为“pCMA-G1/hFR2-14_H8”。
引物集合：
。
8)-2-7    hFR2-14_H9型重链表达载体的构建
将在实施例8)-2-1中制备的hFR2-14_H3型重链表达载体pCMA-G1/hFR2-14_H3用作模板，并使用下述的引物集合和KOD -Plus- Mutagenesis Kit (Toyobo Co., Ltd.)进行突变，以构建hFR2-14_H9型重链表达载体。将得到的表达载体命名为“pCMA-G1/hFR2-14_H9”。
引物集合：
。
8)-2-8    hFR2-14_H10型重链表达载体的构建
将在实施例8)-2-1中制备的hFR2-14_H3型重链表达载体pCMA-G1/hFR2-14_H3用作模板，并使用下述的引物集合和KOD -Plus- Mutagenesis Kit (Toyobo Co., Ltd.)进行突变，以构建hFR2-14_H10型重链表达载体。将得到的表达载体命名为“pCMA-G1/hFR2-14_H10”。
引物集合：
。
8)-2-9    hFR2-14_H11型重链表达载体的构建
将在实施例8)-2-1中制备的hFR2-14_H3型重链表达载体pCMA-G1/hFR2-14_H3用作模板，并使用下述的引物集合和KOD -Plus- Mutagenesis Kit (Toyobo Co., Ltd.)进行突变，以构建hFR2-14_H11型重链表达载体。将得到的表达载体命名为“pCMA-G1/hFR2-14_H11”。
引物集合：
。
8)-2-10  hFR2-14_H12型重链表达载体的构建
将在实施例8)-2-1中制备的hFR2-14_H3型重链表达载体pCMA-G1/hFR2-14_H3用作模板，并使用下述的引物集合和KOD -Plus- Mutagenesis Kit (Toyobo Co., Ltd.)进行突变，以构建hFR2-14_hH12型重链表达载体。将得到的表达载体命名为“pCMA-G1/hFR2-14_H12”。
引物集合：
。
8)-2-11  hFR2-14_hH13型重链表达载体的构建
将在实施例8)-2-1中制备的hFR2-14_hH3型重链表达载体pCMA-G1/hFR2-14_H3用作模板，并使用下述的引物集合和KOD -Plus- Mutagenesis Kit (Toyobo Co., Ltd.)进行突变，以构建hFR2-14_hH13型重链表达载体。将得到的表达载体命名为“pCMA-G1/hFR2-14_H13”。
引物集合：
。
8)-2-12  hFR2-14_hH14型重链表达载体的构建
将在实施例8)-2-1中制备的hFR2-14_hH3型重链表达载体pCMA-G1/hFR2-14_H3用作模板，并使用下述的引物集合和KOD -Plus- Mutagenesis Kit (Toyobo Co., Ltd.)进行突变，以构建hFR2-14_hH14型重链表达载体。将得到的表达载体命名为“pCMA-G1/hFR2-14_H14”。
引物集合：
。
8)-2-13  hFR2-14_hH15型重链表达载体的构建
将在实施例8)-2-1中制备的hFR2-14_hH3型重链表达载体pCMA-G1/hFR2-14_H3用作模板，并使用下述的引物集合和KOD -Plus- Mutagenesis Kit (Toyobo Co., Ltd.)进行突变，以构建hFR2-14_hH15型重链表达载体。将得到的表达载体命名为“pCMA-G1/hFR2-14_H15”。
引物集合：
。
8)-2-14  hFR2-14_hH16型重链表达载体的构建
将在实施例8)-2-1中制备的hFR2-14_hH3型重链表达载体pCMA-G1/hFR2-14_H3用作模板，并使用下述的引物集合和KOD -Plus- Mutagenesis Kit (Toyobo Co., Ltd.)进行突变，以构建hFR2-14_hH16型重链表达载体。将得到的表达载体命名为“pCMA-G1/hFR2-14_H16”。
引物集合：
。
8)-2-15  hFR2-14_hH17型重链表达载体的构建
将在实施例8)-2-1中制备的hFR2-14_hH3型重链表达载体pCMA-G1/hFR2-14_H3用作模板，并使用下述的引物集合和KOD -Plus- Mutagenesis Kit (Toyobo Co., Ltd.)进行突变，以构建hFR2-14_hH17型重链表达载体。将得到的表达载体命名为“pCMA-G1/hFR2-14_H17”。
引物集合：
。
8)-2-16  hFR2-14_hH18型重链表达载体的构建
将在实施例8)-2-1中制备的hFR2-14_hH3型重链表达载体pCMA-G1/hFR2-14_H3用作模板，并使用下述的引物集合和KOD -Plus- Mutagenesis Kit (Toyobo Co., Ltd.)进行突变，以构建hFR2-14_hH18型重链表达载体。将得到的表达载体命名为“pCMA-G1/hFR2-14_H18”。
引物集合：
。
8)-3  人源化FR2-14抗体的制备(FreeStyle 293F细胞)
8)-3-1    人源化FR2-14抗体的生产
将FreeStyle 293F细胞(Invitrogen Corp.)传代培养，并根据手册进行培养。
将1.2×109个处于对数生长期的FreeStyle 293F细胞(Invitrogen Corp.)接种至3-L Fernbach锥形瓶(Corning Inc.)，通过用FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen Corp.)稀释来调至1.0×106个细胞/ mL，然后在8%CO2培养箱中在90 rpm在37℃摇动培养1小时。将3.6 mg聚乙烯亚胺(Polysciences #24765)溶解在20 ml Opti-Pro SFM培养基(Invitrogen Corp.)中。接着，将使用PureLink HiPure质粒试剂盒(Invitrogen Corp.)制备的每种H链表达载体(0.4 mg)和L链表达载体(0.8 mg)悬浮于20 ml Opti-Pro SFM培养基(Invitrogen Corp.)中。将20 ml表达载体/Opti-Pro SFM混合溶液加入20 ml聚乙烯亚胺/Opti-Pro SFM混合溶液中，并将混合物轻轻搅拌，进一步放置5分钟，然后加给FreeStyle 293F细胞。将细胞在8%CO2培养箱中在90 rpm在37℃摇动培养7天，并将得到的培养物上清液穿过一次用弃的囊式过滤器(ADVANTEC #CCS-045-E1H)过滤。
通过pCMA-G1/hFR2-14_H5、pCMA-G1/hFR2-14_H6、pCMA-G1/hFR2-14_H7、pCMA-G1/hFR2-14_H8、pCMA-G1/hFR2-14_H9、pCMA-G1/hFR2-14_H10、pCMA-G1/hFR2-14_H11、pCMA-G1/hFR2-14_H12、pCMA-G1/hFR2-14_H13、pCMA-G1/hFR2-14_H14、pCMA-G1/hFR2-14_H15、pCMA-G1/hFR2-14_H16、pCMA-G1/hFR2-14_H17和pCMA-G1/hFR2-14_H18与pCMA-LK/hFR2-14_L1的组合得到的人源化FR2-14抗体分别被命名为“hFR2-14_H5/L1”、“hFR2-14_H6/L1”、“hFR2-14_H7/L1”、“hFR2-14_H8/L1”、“hFR2-14_H9/L1”、“hFR2-14_H10/L1”、“hFR2-14_H11/L1”、“hFR2-14_H12/L1”、“hFR2-14_H13/L1”、“hFR2-14_H14/L1”、“hFR2-14_H15/L1”、“hFR2-14_H16/L1”、“hFR2-14_H17/L1”和“hFR2-14_H18/L1。
8)-3-2    人源化FR2-14抗体的纯化
使用rProtein A亲和色谱法(在4-6℃)和陶瓷羟磷灰石(在室温)，通过2个步骤从在实施例8)-3-1中得到的培养物上清液纯化每种抗体。在4-6℃进行rProtein A亲和色谱法纯化以后和陶瓷羟磷灰石纯化以后的缓冲液替换步骤。首先，将培养物上清液应用于用PBS平衡过的MabSelect SuRe (由GE Healthcare Bio-Sciences Corp.制造, HiTrap柱)。完整培养溶液输入柱中以后，用至少2倍柱体积的量的PBS洗涤柱。接着，通过用2 M盐酸精氨酸溶液(pH 4.0)洗脱，收集含有抗体的级分。通过透析(Thermo Fisher Scientific Inc., Slide-A-Lyzer透析盒)，将所述级分用PBS进行缓冲液替换，然后用5 mM磷酸钠和50 mM MES (pH 7.0)的缓冲液稀释5倍。将得到抗体溶液应用于陶瓷羟磷灰石柱(Bio-Rad Laboratories, Inc., Bio-Scale CHTType-I羟磷灰石柱)，该柱用5 mM NaPi、50 mM MES和30 mM NaCl (pH 7.0)的缓冲液平衡过。通过使用氯化钠的线性浓度梯度洗脱，收集含有抗体的级分。通过透析(Thermo Fisher Scientific Inc., Slide-A-Lyzer透析盒)，将所述级分用HBSor (25 mM组氨酸和5%山梨醇, pH 6.0)进行缓冲液替换。最后，使用Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN 20 (分子量截止值: UF10K, Sartorius Japan K.K.，在4℃)将所述级分浓缩，并调至25 mg/ml或更高的IgG浓度，并用作纯化的样品。
实施例9. 具有经调节的糖链修饰的人源化FR2-14抗体的制备
根据本领域已知的方法，将包含重链和轻链的人源化抗体去岩藻糖基化，以调节抗体蛋白的糖链修饰，所述重链包含由SEQ ID NO: 97表示的氨基酸序列(图105)的第20-467位氨基酸，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸。将得到的抗体命名为hFR2-14_H19/L1。对该修饰形式进行质谱法。结果，含有岩藻糖的H链的峰等于或低于检测限。在本发明中，具有经调节的糖链修饰的抗体，诸如hFR2-14_H19/L1，也被称作“抗体”或“抗体的修饰形式”。
实施例10. 人源化抗-人FGFR2抗体(hFR2-14)的物理性质评价
10)-1      人源化抗-人FGFR2抗体(hFR2-14)的抗原结合活性的Biacore测定
通过捕获方法，使用Biacore 3000 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.)测定抗体对抗原(rhFGFR2α(IIIb) Fc嵌合体或rhFGFR2α(IIIc) Fc嵌合体)的解离常数，所述捕获方法包括：将作为配体的抗体捕获在固定化的抗-人IgG(Fab)抗体上，并测定作为分析物的抗原。通过胺偶联方法将大约5000 RU的抗-人IgG(Fab)抗体(人Fab捕获试剂盒, GE Healthcare Bio-Sciences Corp.)共价地结合至传感器芯片CM5 (BIAcore, Inc.)。类似地，将该抗体固定化到参比细胞上。使用的运行缓冲液是HBS-EP+ (10 mM HEPES (pH 7.4), 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA,和0.05%表面活性剂P20)。以10 μL/min的流速，将1 μg/mL的纯化抗体的抗体溶液加到抗-人IgG(Fab)抗体固定化的芯片上保持60秒，或者加入含有抗体的培养物上清液保持60秒。然后，以30 μl/min的流速，向其中加入抗原的系列稀释物(0.3-500 nM)保持180秒。随后，监测解离相300秒。以10 μl/min的流速向其中加入10 mM Gly-HCl (pH 2.1) 2次作为再生溶液保持60秒。使用分析软件(BIAevaluation软件，4.1版)的Bivalent结合模型分析数据，以计算结合速率常数kon、解离速率常数koff和解离常数(KD; KD = koff/kon)。
10)-1-1       4种人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H1/L1至hFR2-14_H4/L1)和人嵌合抗-FGFR2抗体(cFR2-14)的结合活性评价
通过实施例8)-3和4)-9的方法，表达和纯化4种人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H1/L1至hFR2-14_H4/L1)和人嵌合抗-FGFR2抗体(cFR2-14)，并通过在实施例10)-1中所示的方法，评价它们对每种人FGFR2变体蛋白的结合活性。Biacore测定结果显示在图122中。
10)-1-2       15种人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H3/L1和hFR2-14_H5/L1至hFR2-14_H18/L1)的结合活性评价
通过实施例8)-3的方法，表达15种人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H3/L1和hFR2-14_H5/L1至hFR2-14_H18/L1)，并通过实施例10)-1中所示的方法，将含有每种抗体的培养物上清液用于评价对FGFR2 IIIc蛋白的结合活性。Biacore测定结果显示在图123中。
10)-2      人源化抗-人FGFR2抗体(hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H8/L1和hFR2-14_H12/L1)对人FGFR2的选择性结合活性的研究
10)-2-1  人FGFR1 IIIb表达载体(pcDNA-DEST40-FGFR1 IIIb)的构建
将编码人FGFR1 IIIb变体蛋白(包含在亚型2 (NP_056934)的位置1-310的氨基酸序列和位置359-820的氨基酸序列之间的、FGFR1 IIIb结构域(AAB19502)的氨基酸序列的蛋白)的cDNA克隆进pcDNA-DEST40载体中，以构建pcDNA-DEST40-FGFR1 IIIb。
10)-2-2  细胞-ELISA
使用Lipofectamine 2000 (由Life Technologies Corp.制造)，将在实施例1)-3-1、2)-1-1和10)-2-1中构建的不同人FGFR表达载体分别转染至293α细胞(描述在实施例1)-6中)。将得到的细胞以100 μl/孔的量分配至96-孔板(由Corning Inc.制造)，并在含有10%FBS的DMEM培养基中在5%CO2条件下在37℃培养过夜。除去培养物上清液以后，将用含有5%FBS的PBS稀释至3 μg/ml的hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H8/L1或hFR2-14_H12/L1的溶液以50 μl/孔的浓度加入平板中，并将平板在4℃静置1小时。将孔中的细胞用含有5%FBS的PBS洗涤2次。然后，向其中加入用含有5%FBS的PBS稀释2000倍的、在山羊中生产的抗-人IgG-过氧化物酶缀合物抗体(由Sigma-Aldrich Corp.制造)，并将平板在4℃静置1小时。将孔中的细胞用含有5%FBS的PBS洗涤3次。然后，以100 μl/孔的浓度，向其中加入OPD产色溶液(OPD溶液(分别以0.4 mg/ml和0.6%(v/v)的浓度溶解在0.05 M柠檬酸三钠和0.1 M磷酸氢二钠十二水合物中的邻苯二胺二盐酸盐(由Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.制造)和H2O2，pH 4.5))。在偶尔搅拌下进行显色反应，并通过以100 μl/孔的浓度加入1 M HCl来停止。然后，使用平板读数器(ARVO; PerkinElmer, Inc.)，在490 nm测量吸光度。如从图124所见，证实hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H8/L1和hFR2-14_H12/L1抗体特异性地结合人FGFR2 IIIb和FGFR2 IIIc。
10)-3      使用示差扫描量热法(DSC)对人源化抗-人FGFR2抗体(hFR2-14)的热稳定性测定
使用示差扫描量热法(DSC)测定热稳定性。将每个样品以0.5 mg/mL的浓度溶解在HBSor缓冲溶液(制备成含有25 mM组氨酸(pH 6.0)和5%山梨醇)中，并将400 μL样品溶液用在DSC测定中。如下设定DSC测定条件：20℃的最初温度；100℃的最终温度；200℃/小时的升温速率；2秒的过滤时间；和低(Low)的反馈模式。使用的参比溶液是HBSor。在所有实验中将GE Healthcare Bio-Sciences Corp. (USA)制造的VP-Capillary DSC Platform用作DSC测定设备。通过从得自样品溶液的扫描曲线减去基线(得自也装入样品池中的参比溶液的扫描曲线)，进行基线校正。接着，使用从每个样品的分子量计算出的摩尔浓度，进行浓度校准。图125A和125B显示了不同人源化FGFR2抗体的热分析图。将热变性中点Tm定义为每个热分析图中的最大峰表现出峰顶时的温度。如在图125C中所示，hFR2-14_H1/L1抗体具有87.6℃的Tm值。hFR2-14_H2/L1抗体具有87.2℃的Tm值。hFR2-14_H3/L1抗体具有79.5℃的Tm值。hFR2-14_H4/L1抗体具有81.6℃的Tm值。hFR2-14_H5/L1抗体具有77.2℃的Tm值。hFR2-14_H8/L1抗体具有81.0℃的Tm值。hFR2-14_H9/L1抗体具有78.8℃的Tm值。hFR2-14_H11/L1抗体具有80.3℃的Tm值。hFR2-14_H12/L1抗体具有82.2℃的Tm值。hFR2-14_H19/L1抗体具有82.2℃的Tm值。
10)-4      使用Biacore的人源化抗-人FGFR2抗体(hFR2-14)的结合稳定性试验
通过下述的方法，评价人源化抗-人FGFR2抗体(hFR2-14)的抗原结合稳定性。
通过实施例8)-3、9)和4)-9的方法，表达和纯化不同的人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H1/L1至hFR2-14_H5/L1、hFR2-14_H8/L1、hFR2-14_H9/L1、hFR2-14_H11/L1、hFR2-14_H12/L1和hFR2-14_H19/L1)和人嵌合抗-FGFR2抗体(cFR2-14)，并将每种以20 mg/mL的浓度溶解在HBSor缓冲溶液(制备成含有25 mM组氨酸(pH 6.0)和5%山梨醇)中。将溶液加热至40℃保持4周，以制备降解的分析物。通过实施例10)-1所示的方法，使用Biacore测定分析物在降解之前和之后的结合活性。Biacore测定结果显示在图126中。
实施例11. 人源化抗-人FGFR2抗体(hFR2-14)的信号中和效应
11)-1      人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H1/L1、hFR2-14_H2/L1、hFR2-14_H3/L1和hFR2-14_H4/L1)和人嵌合抗-FGFR2抗体(cFR2-14)的信号中和效应
为了通过Elk1萤光素酶报道基因测定评价人源化抗体的信号中和效应，通过实施例1)-6-2中所示的方法，用pcDNA-DEST40-FGFR2 IIIb或pcDNA-DEST40-FGFR2 IIIc、pFA2-Elk1 (由Stratagene Corp.制造)、pFR-Luc2CP和pGL4.74[hRluc/TK] (由Promega Corp.制造)共转染293α细胞，并在5%CO2条件下在37℃培养过夜。在次日，除去培养物上清液，然后将细胞与用含有2%FBS的DMEM稀释的hFR2-14_H1/L1、hFR2-14_H2/L1、hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H4/L1或cFR2-14抗体一起预温育1小时。随后，将配体(人FGF7或人FGF9，由PeproTech Inc.制造)以10 ng/ml的终浓度加至每个孔。温育6小时以后，使用Dual-Glo萤光素酶测定系统(由Promega Corp.制造)，测定荧火虫萤光素酶活性(特异性信号)和海紫罗蓝属萤光素酶活性(用于标准化的信号)。计算荧火虫/海紫罗蓝属比率，以标准化每个孔上的数据。如在图127A中所示，hFR2-14_H1/L1、hFR2-14_H2/L1、hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H4/L1和cFR2-14抑制表达FGFR2 IIIb的细胞中的配体FGF7依赖性的报道基因活化。如在图127B中所示，hFR2-14_H1/L1、hFR2-14_H2/L1、hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H4/L1和cFR2-14抑制表达FGFR2 IIIc的细胞中的配体FGF9依赖性的报道基因活性。这些结果证实，这些抗体具有抑制它的配体对FGFR2的活化的作用。
11)-2     人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H5/L1、hFR2-14_H6/L1、hFR2-14_H7/L1、hFR2-14_H8/L1、hFR2-14_H9/L1、hFR2-14_H10/L1、hFR2-14_H11/L1、hFR2-14_H12/L1、hFR2-14_H13/L1、hFR2-14_H14/L1、hFR2-14_H15/L1、hFR2-14_H16/L1、hFR2-14_H17/L1和hFR2-14_H18/L1)的信号中和效应
为了通过Elk1萤光素酶报道基因测定评价人源化抗体的信号中和效应，通过实施例1)-6-2所示的方法，用pcDNA-DEST40-FGFR2 IIIb或pcDNA-DEST40-FGFR2 IIIc、pFA2-Elk1 (由Stratagene Corp.制造)、pFR-Luc2CP和pGL4.74[hRluc/TK] (由Promega Corp.制造)共转染293α细胞，并在5%CO2条件下在37℃培养过夜。在次日，除去培养物上清液，然后将细胞与用含有2%FBS的DMEM稀释的生产抗体hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H5/L1、hFR2-14_H6/L1、hFR2-14_H7/L1、hFR2-14_H8/L1、hFR2-14_H9/L1、hFR2-14_H10/L1、hFR2-14_H11/L1、hFR2-14_H12/L1、hFR2-14_H13/L1、hFR2-14_H14/L1、hFR2-14_H15/L1、hFR2-14_H16/L1、hFR2-14_H17/L1和hFR2-14_H18/L1的293 FreeStyle细胞(由Invitrogen Corp.制造) (在实施例8)-3-1中制备)的培养物上清液一起预温育1小时。随后，将配体(人FGF7，R&D systems, Inc.制造)以10 ng/ml的终浓度加至每个孔。温育6小时以后，使用Dual-Glo萤光素酶测定系统(由Promega Corp.制造)测定荧火虫萤光素酶活性(特异性信号)和海紫罗蓝属萤光素酶活性(用于标准化的信号)。计算荧火虫/海紫罗蓝属比率，以标准化每个孔上的数据。如在图128A中所示，128B和128C、hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H5/L1、hFR2-14_H6/L1、hFR2-14_H7/L1、hFR2-14_H8/L1、hFR2-14_H9/L1、hFR2-14_H10/L1、hFR2-14_H11/L1、hFR2-14_H12/L1、hFR2-14_H13/L1、hFR2-14_H14/L1、hFR2-14_H15/L1、hFR2-14_H16/L1、hFR2-14_H17/L1和hFR2-14_H18/L1抑制表达FGFR2 IIIb的细胞中的配体FGF7依赖性的报道基因活化。
11)-3      人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H12/L1和hFR2-14_H19/L1)的信号中和效应
为了通过Elk1萤光素酶报道基因测定评价人源化抗体的信号中和效应，通过实施例1)-6-2所示的方法用pcDNA-DEST40-FGFR2 IIIb或pcDNA-DEST40-FGFR2 IIIc、pFA2-Elk1 (由Stratagene Corp.制造)、pFR-Luc2CP和pGL4.74[hRluc/TK] (由Promega Corp.制造)共转染293α细胞，并在5%CO2条件下在37℃培养过夜。在次日，除去培养物上清液，然后将细胞与用含有2%FBS的DMEM稀释的hFR2-14_H12/L1或hFR2-14_H19/L1抗体(在实施例8)和9)中制备)一起预温育1小时。随后，将配体人FGF7 (由R&D systems, Inc.制造)或人FGF9 (由PeproTech Inc.制造)以10 ng/ml的终浓度加至每个孔。温育6小时以后，使用Dual-Glo萤光素酶测定系统(由Promega Corp.制造)测定荧火虫萤光素酶活性(特异性信号)和海紫罗蓝属萤光素酶活性(用于标准化的信号)。计算荧火虫/海紫罗蓝属比率，以标准化每个孔上的数据。如在图129A中所示，hFR2-14_H12/L1和hFR2-14_H19/L1抑制表达FGFR2 IIIb的细胞中的配体FGF7依赖性的报道基因活化。如在图129B中所示，hFR2-14_H12/L1和hFR2-14_H19/L1抑制表达FGFR2 IIIc的细胞中的配体FGF9依赖性的报道基因活性。这些结果证实，这些抗体具有抑制它的配体对FGFR2的活化的作用。
实施例12. 人源化抗-人FGFR2抗体(hFR2-14)的ADCC活性
12)-1      人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H1/L1、hFR2-14_H2/L1、hFR2-14_H3/L1和hFR2-14_H4/L1)和人嵌合抗-FGFR2抗体(cFR2-14)对过表达FGFR2的细胞的ADCC活性
将通过实施例5)-3-2的方法制备的表达FGFR2 IIIb的293T-lacZ细胞以50 μl/孔的浓度加给96-孔U形底微量培养板。以50 μl/孔的浓度向其中加入用实施例5)-3-2中描述的用于ADCC的培养基稀释至1-100 ng/ml (终浓度)的hFR2-14_H1/L1、hFR2-14_H2/L1、hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H4/L1、cFR2-14或人IgG，并将平板在4℃静置1小时。以75 μl/孔的浓度进一步向其中加入实施例5)-3-3的效应细胞。将平板在1200 rpm在室温离心5分钟，随后在5%CO2条件下在37℃培养过夜。在次日，将50 μl每个孔中的上清液回收进白色平板(由Corning Inc.制造)中。以50 μl/孔的浓度向其中加入β-Glo测定系统(由Promega Corp.制造)的溶液。使用平板读数器(ENVISION；由PerkinElmer, Inc.制造)测量发光强度。根据下述表达式，计算通过ADCC活性裂解的细胞的百分比：
裂解的细胞的百分比(%) = (A - B)/(C - B)×100
A：样品孔的计数
B：自发释放(既没有补充抗体也没有补充效应细胞的孔)计数的平均值(n = 3)。执行与样品孔中相同的操作，例外是，分别加入50 μl和75 μl用于ADCC的培养基来替代抗体和效应细胞。　
C：最大释放(含有在表面活性剂中裂解的靶细胞的孔)计数的平均值(n = 3)。分别加入50 μl和75 μl用于ADCC的培养基来替代抗体和效应细胞。对于测定，将175 μlβ-Glo测定系统溶液加入每个含有靶细胞的孔中，并与其混合。将100 μl其等分试样加入白色平板中，以进行测定。
如在图130A和130B中所示，hFR2-14_H1/L1、hFR2-14_H2/L1、hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H4/L1和cFR2-14对表达FGFR2 IIIb的细胞具有ADCC活性。
12)-2      人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H8/L1和hFR2-14_H12/L1)对表达FGFR2的癌细胞系的ADCC活性
12)-2-1  靶细胞的制备
将KATO III、NCI-H716或SNU16细胞用用于ADCC的培养基洗涤2次，并穿过细胞过滤网(由Becton Dickinson and Company制造)。然后，通过锥虫蓝染料排除试验，计数活细胞的数目。将所述细胞再悬浮至1×105细胞/ml，并用作靶细胞。
12)-2-2  PBMC细胞的制备
将25 ml健康人血液在20 ml Lymphosepar I (由Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd.制造)上逐渐分层，随后在1500 rpm在室温离心30分钟。将位于血浆和Lymphosepar I (由Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd.制造)之间的细胞层用滴管回收，并悬浮于20 ml含有10%FBS的不含酚磺酞的RPMI1640培养基(由Life Technologies Corp.制造)中。将混悬液在1500 rpm离心5分钟。除去上清液以后，将细胞通过加入20 ml用于ADCC的培养基洗涤2次。通过锥虫蓝染料排除试验，计数活细胞的数目。离心以后，除去培养基，并将细胞悬浮于用于ADCC的培养基中，并用作效应细胞。
12)-2-3       ADCC活性的评价
将通过实施例12)-2-1的方法制备的NCI-H716细胞以50 μl/孔的浓度加入96-孔U形底微量培养板中。以50 μl/孔的浓度向其中加入用用于ADCC的培养基稀释至1-1000 ng/ml (终浓度)的hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H8/L1、hFR2-14_H12/L1或人IgG，并将平板在4℃静置1小时。以75 μl/孔的浓度进一步向其中加入实施例12)-2-2的PBMC细胞(13.4×106个细胞/ml)。将平板在1200 rpm在室温离心5分钟，随后在5%CO2条件下在37℃培养过夜。在次日，以17.5 μl/孔的浓度，将CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (由Promega Corp.制造)试剂盒附带的10×裂解溶液加入仅含有靶细胞和培养基的孔中，并搅拌，然后将平板在5%CO2条件下在37℃静置45分钟。在200 g在室温离心4分钟以后，将50 μl每个孔中的上清液回收进96-孔平底微量培养板(由Corning Inc.制造)中。以50 μl/孔的浓度向其中加入底物混合物，并将平板在室温避光静置30分钟。以50 μl/孔的浓度进一步向其中加入停止溶液。使用平板读数器(ARVO；由PerkinElmer, Inc.制造)，在490 nm测量吸光度。根据下述表达式，计算通过ADCC活性裂解的细胞的百分比：
细胞毒性(%) = (A - B - C)/(D - C)×100
A：样品孔的计数
B：来自效应细胞的自发释放(从含有效应细胞的孔校正含有培养溶液的孔)计数的平均值(n = 3)。　
C：来自靶细胞的自发释放(从含有靶细胞的孔校正含有培养溶液的孔)计数的平均值(n = 3)。　
D：最大释放(从含有在表面活性剂中裂解的靶细胞的孔校正含有在表面活性剂中裂解的培养溶液的孔)计数的平均值(n = 3)。
如在图131中所示，hFR2-14_H3/L1、hFR2-14_H8/L1和hFR2-14_H12/L1对表达FGFR2的癌细胞系NCI-H716细胞具有ADCC活性。
12)-3      人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H12/L1和hFR2-14_H19/L1)对表达FGFR2的癌细胞系的ADCC活性
将通过实施例12)-2-1的方法制备的KATO III、NCI-H716或SNU16细胞以50 μl/孔的浓度加入96-孔U形底微量培养板中。以50 μl/孔的浓度向其中加入用用于ADCC的培养基稀释至1-1000 ng/ml (终浓度)的hFR2-14_H12/L1或hFR2-14_H19/L1 (在实施例8)和9)中制备)或人IgG，并将平板在4℃静置1小时。以75 μl/孔的浓度进一步向其中加入实施例12)-2-2的效应细胞(20×106个细胞/ml)。将平板在1200 rpm在室温离心5分钟，随后在5%CO2条件下在37℃培养过夜。在次日，以17.5 μl/孔的浓度，将CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (由Promega Corp.制造)试剂盒附带的10×裂解溶液加入仅含有靶细胞和培养基的孔中，并搅拌，然后将平板在5%CO2条件下在37℃静置45分钟。在200 g在室温离心4分钟以后，将50 μl每个孔中的上清液回收进96-孔平底微量培养板(由Corning Inc.制造)中。以50 μl/孔的浓度向其中加入底物混合物，并将平板在室温避光静置30分钟。以50 μl/孔的浓度进一步向其中加入停止溶液。使用平板读数器(ARVO；由PerkinElmer, Inc.制造)，在490 nm测量吸光度。根据在实施例12)-2-3中所示的计算方法，计算通过ADCC活性实现的裂解的细胞的百分比。
如在图132A、132B和132C中所示，hFR2-14_H12/L1和hFR2-14_H19/L1对表达FGFR2的癌细胞系NCI-H716、SNU-16和KATO III具有ADCC活性，并且证实该活性在hFR2-14_H19/L1中较高。
实施例13. 人源化抗-人FGFR2抗体(hFR2-14)的ADCP活性
13)-1      人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H12/L1和hFR2-14_H19/L1)对表达FGFR2的癌细胞系的ADCP活性
13)-1-1  靶细胞的制备
将KATO III或NCI-H716细胞回收，并用PBS洗涤3次。然后，通过锥虫蓝染料排除试验，计数活细胞的数目。将1×106个细胞分离，离心，然后悬浮于200 μl用于一般细胞膜标记的PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit (由Sigma-Aldrich Corp.制造)附带的稀释剂C中。将1 mM PKH26 Linker用稀释剂C稀释至10 μM作为标记溶液。此后，立即将细胞混悬液与等体积的PKH26 Linker溶液混合，并将混合物在室温静置5分钟。将所述细胞通过加入5 ml含有10%FBS的RPMI1640培养基(由Life Technologies Corp.制造)来洗涤2次，然后再悬浮至5×105细胞/ml，并用作靶细胞。
13)-1-2  PBMC细胞的制备
将25 ml健康人血液在20 ml Lymphosepar I (由Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd.制造)上逐渐分层，随后在1500 rpm在室温离心30分钟。将位于血浆和Lymphosepar I (由Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd.制造)之间的细胞层用滴管回收，并悬浮于20 ml含有10%FBS的RPMI1640培养基(由Life Technologies Corp.制造)中。将混悬液在1500 rpm离心5分钟。除去上清液以后，将细胞通过加入20 ml含有10%FBS的RPMI1640培养基(由Life Technologies Corp.制造)洗涤2次。通过锥虫蓝染料排除试验，计数活细胞的数目。将得到的细胞用作效应细胞。
13)-1-3  效应细胞的制备
将在实施例13)-1-2中制备的PBMC细胞用RoboSep缓冲液(由StemCell Technologies Inc.制造)调至5×107个细胞/ml。每ml PBMC细胞混悬液加入50 μl没有CD16除去的人单核细胞富集试剂盒(Human monocyte Enrichment Kit Without CD16 Depletion，由StemCell Technologies Inc.制造)附带的EasySep人单核细胞富集混合液。在4℃反应10分钟以后，每ml PBMC细胞混悬液加入50 μl EasySepMagnetic Particles。在4℃反应5分钟以后，向其中加入RoboSep缓冲液(由StemCell Technologies Inc.制造)至2.5 ml，并将反应混合物加载至EasySep Magnet。2分钟30秒以后，回收上清液，然后在1200 rpm离心5分钟以分离单核细胞级分。通过加入含有10%FBS的RPMI1640培养基(由Life Technologies Corp.制造)，将所述级分洗涤1次。然后，向其中加入含有10%FBS、10 ng/ml GM-CSF (由PeproTech Inc.制造)和10 ng/ml M-CSF (由PeproTech Inc.制造)的RPMI1640培养基(由Life Technologies Corp.制造)，并将混合物接种至用于悬浮培养的225-cm2烧瓶(由Sumitomo Bakelite Co., Ltd.制造)。将细胞在5%CO2条件下在37℃培养14天。在培养期中，每3-4天用含有10%FBS、10 ng/ml GM-CSF (由PeproTech Inc.制造)和10 ng/ml M-CSF (由PeproTech Inc.制造)的RPMI1640培养基(由Life Technologies Corp.制造)替换培养基。14天以后，将0.05%胰蛋白酶-EDTA (由Life Technologies Corp.制造)加给通过诱导由其分化出的巨噬细胞。在37℃反应40分钟以后，从烧瓶解离细胞。将所述细胞通过加入含有10%FBS的RPMI1640培养基(由Life Technologies Corp.制造)来洗涤2次，然后在含有10%FBS、10 ng/ml M-CSF (由PeproTech Inc.制造)和250 U/ml IFN-γ(由PeproTech Inc.制造)的RPMI1640培养基(由Life Technologies Corp.制造)中再悬浮至5×105细胞/ml，并用作效应细胞。
13)-1-4       ADCP活性的评价
将通过实施例13)-1-1的方法制备的靶细胞以100 μl/孔的浓度加入Ultra-Low Attachment 96-孔U形底微量培养板(由Corning Inc.制造)中。以100 μl/孔的浓度向其中加入用含有10%FBS的RPMI1640培养基(由Life Technologies Corp.制造)稀释至0.5-500 ng/ml (终浓度)的hFR2-14_H12/L1或hFR2-14_H19/L1 (在实施例8)和9)中制备)或人IgG，并将平板在4℃静置30分钟。在1200 rpm在室温离心5分钟并除去上清液以后，将细胞悬浮于100 μl/孔的含有10%FBS的RPMI1640培养基(由Life Technologies Corp.制造)中。以100 μl/孔的浓度向其中加入在实施例13)-1-3中制备的效应细胞(5×105细胞/ml)，然后将平板在5%CO2条件下在37℃静置3小时。在1200 rpm在4℃离心5分钟并除去上清液以后，将细胞用200 μl/孔的含有5%FBS的PBS洗涤。将45 μl/孔的含有5%FBS的PBS和5 μl/孔的APC人CD11b (由Becton Dickinson and Company制造)加给细胞，并将平板在4℃静置15分钟。将所述细胞用200 μl/孔的含有5%FBS的PBS洗涤2次。将细胞悬浮于200 μl/孔的含有1%低聚甲醛的PBS中，并将平板在4℃静置过夜。在次日，通过流式细胞术(FACS Canto II；由Becton Dickinson and Company制造)测定细胞。使用Flowjo (由Tree Star Inc.制造)分析数据。在FSC (前向散射)/SSC (边散射)显影以后，计算PE-阳性细胞的数目(A)以及APC和PE二者都为阳性的细胞的数目(B)。APC和PE二者都为阳性的细胞(B)是指，巨噬细胞摄入靶细胞。根据下述表达式计算通过ADCP活性吞噬的细胞的百分比：
吞噬的细胞的百分比(%) = B/(A + B)×100
如在图133A和133B中所示，hFR2-14_H12/L1和hFR2-14_H19/L1对表达FGFR2的癌细胞系NCI-H716和KATO III具有ADCP活性。
实施例14. 人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14)的体内抗肿瘤活性
14)-1人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H1/L1、hFR2-14_H2/L1、hFR2-14_H3/L1和hFR2-14_H4/L1)对人胃癌细胞系SNU-16-皮下移植模型的体内抗肿瘤活性
将人胃癌细胞系SNU-16(购自ATCC)的5×106个细胞悬浮于50%Matrigel (购自Nippon Becton Dickinson Company, Ltd.)中，并皮下移植至每只裸鼠(CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj，购自Charles River Laboratories Japan Inc.)的腋窝区域。根据它们的肿瘤体积，将小鼠分组。移植后7、10、14、17和21天，将在实施例8)-3中制备的每种人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H1/L1、hFR2-14_H2/L1、hFR2-14_H3/L1或hFR2-14_H4/L1)以1.5或15mg/kg的剂量腹膜内地施用给带有癌症的小鼠(n = 8)。使用电子数字测径器(由Mitsutoyo Corp.制造)，每周2次地测量移植的肿瘤的长轴和短轴。根据下述表达式，计算肿瘤体积：
肿瘤体积(mm3) = 1/2×短轴(mm)×短轴(mm)×长轴(mm)。
hFR2-14_H1/L1抗体的结果显示在图134A中。在移植后21天(最终测定天)的肿瘤生长抑制百分比为58%(对于1.5 mg/kg施用组)和53%(对于15 mg/kg施用组)。
hFR2-14_H2/L1抗体的结果显示在图134B中。在移植后21天(最终测定天)的肿瘤生长抑制百分比为58%(对于1.5 mg/kg施用组)和58%(对于15 mg/kg施用组)。
hFR2-14_H3/L1抗体的结果显示在图134C中。在移植后21天(最终测定天)的肿瘤生长抑制百分比为64%(对于1.5 mg/kg施用组)和41%(对于15 mg/kg施用组)。
hFR2-14_H4/L1抗体的结果显示在图134D中。在移植后21天(最终测定天)的肿瘤生长抑制百分比为70%(对于1.5 mg/kg施用组)和39%(对于15 mg/kg施用组)。
14)-2           人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H5/L1、hFR2-14_H8/L1、hFR2-14_H9/L1、hFR2-14_H11/L1、hFR2-14_H12/L1和hFR2-14_H19/L1)对人胃癌细胞系SNU-16-皮下移植模型的体内抗肿瘤活性
将人胃癌细胞系SNU-16(购自ATCC)的5×106个细胞悬浮于50%Matrigel (购自Nippon Becton Dickinson Company, Ltd.)中，并皮下移植至每只裸鼠(CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj，购自Charles River Laboratories Japan Inc.)的腋窝区域。根据它们的肿瘤体积，将小鼠分组。移植后7、10 (或11)、14和17 (或18)天，将在实施例8)-3中制备的每种人源化抗体(hFR2-14_H5/L1、hFR2-14_H8/L1、hFR2-14_H9/L1、hFR2-14_H11/L1或hFR2-14_H12/L1)或在实施例9)中制备的人源化抗体(hFR2-14_H19/L1)以2或20mg/kg的剂量腹膜内地施用给带有癌症的小鼠(n = 8或9)。使用电子数字测径器(由Mitsutoyo Corp.制造)，每周2次地测量移植的肿瘤的长轴和短轴。根据下述表达式，计算肿瘤体积：
肿瘤体积(mm3) = 1/2×短轴(mm)×短轴(mm)×长轴(mm)。
hFR2-14_H5/L1的结果显示在图135A中。在移植后21天(最终测定天)的肿瘤生长抑制百分比为41%(对于2 mg/kg施用组)和51%(对于20 mg/kg施用组)。
hFR2-14_H8/L1的结果显示在图135B中。在移植后21天(最终测定天)的肿瘤生长抑制百分比为30%(对于2 mg/kg施用组)和30%(对于20 mg/kg施用组)。
hFR2-14_H9/L1的结果显示在图135C中。在移植后21天(最终测定天)的肿瘤生长抑制百分比为1%(对于2 mg/kg施用组)和23%(对于20 mg/kg施用组)。
hFR2-14_H11/L1的结果显示在图135D中。在移植后21天(最终测定天)的肿瘤生长抑制百分比为61%(对于2 mg/kg施用组)和42%(对于20 mg/kg施用组)。
hFR2-14_H12/L1的结果显示在图135E中。在移植后21天(最终测定天)的肿瘤生长抑制百分比为36%(对于2 mg/kg施用组)和58%(对于20 mg/kg施用组)。
hFR2-14_H19/L1的结果显示在图135F中。在移植后21天(最终测定天)的肿瘤生长抑制百分比为70%(对于2 mg/kg施用组)和40%(对于20 mg/kg施用组)。
14)-3      人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H12/L1和hFR2-14_H19/L1)对人结直肠癌细胞系NCI-H716块移植模型的体内抗肿瘤活性
将人结直肠癌细胞系NCI-H716 (购自ATCC)的肿瘤块(5 x 5 x 5 mm3)皮下移植至每只裸鼠(CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj，购自Charles River Laboratories Japan Inc.)的腋窝区域。在移植当天和移植后3、7、10、14、17、21和24天，将在实施例8)或9)中制备的每种人源化抗体(hFR2-14_H12/L1或hFR2-14_H19/L1)以20mg/kg的剂量腹膜内地施用给带有癌症的小鼠(n = 11)。使用电子数字测径器(由Mitsutoyo Corp.制造)，每周2次地测量移植的肿瘤的长轴和短轴。根据下述表达式，计算肿瘤体积：
肿瘤体积(mm3) = 1/2×短轴(mm)×短轴(mm)×长轴(mm)。
hFR2-14_H12/L1的结果显示在图136A中。在移植后28天(最终测定天)的肿瘤生长抑制百分比为99%。
hFR2-14_H19/L1的结果显示在图136B中。在移植后28天(最终测定天)的肿瘤生长抑制百分比为99%。
14)-4     人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H12/L1和hFR2-14_H19/L1)对人结直肠癌细胞系NCI-H716-luc-腹膜弥散模型的体内抗肿瘤活性
将表达萤光素酶基因的人结直肠癌细胞系NCI-H716-luc (用萤光素酶基因转染的NCI-H716 (购自ATCC))的3×106细胞悬浮于盐水(购自Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.)中，并腹膜内地移植至每只NOG小鼠(NOD/Shi-SCID,IL-2Rγnull，购自Central Institute for Experimental Animals)。移植后1天，根据它们的重量将小鼠分组。移植后1、5、8、12、16、19和26天，将在实施例8)和9)中制备的每种人源化抗体(hFR2-14_H12/L1或hFR2-14_H19/L1)以20mg/kg的剂量腹膜内地施用给带有癌症的小鼠(n = 11)。记录小鼠的死亡日期，并计算存活率(%)。移植后37天，将VivoGlo Luciferin (购自Promega Corp.)以150 mg/kg的剂量施用至带有癌症的小鼠的尾静脉。施用后10分钟，使用IVIS (制造者为Caliper, A PerkinElmer Company)测定带有癌症的小鼠的萤光素酶活性。使用Living Image (制造者为Caliper, A PerkinElmer Company)，定量萤光素酶活性(p/s/cm2/sr)。
图137(A)显示了人源化抗体的肿瘤生长抑制作用。以萤光素酶活性作为指标，相对于未施用组的肿瘤生长抑制百分比在移植后37天为98%(对于hFR2-14_H12/L1施用组)和98%(对于hFR2-14_H19/L1施用组)。
图137(B)显示了人源化抗体的寿命延长作用。未施用组在移植后93天的存活率为0%，而hFR2-14_H12/L1抗体施用组的存活率为64%，且hFR2-14_H19/L1抗体施用组的存活率为91%。
实施例15. 人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H3/L1)和FGFR2蛋白的复合物的X-射线结构分析
15)-1      用于结晶的FGFR2蛋白的制备
15)-1-1  用于结晶的FGFR2蛋白表达载体的制备
为了构建用于表达由人FGFR2 IIIb和IIIc的共同部分中的第148-249位氨基酸(图78; SEQ ID NO: 70和图79; SEQ ID NO: 71)的氨基酸序列组成的区域(在下文中，该区域被称作“D2”)的载体，使用下示的引物集合和作为模板的包含人FGFR2的第126-313位氨基酸(图78; SEQ ID NO: 70和图79; SEQ ID NO: 71)的载体质粒进行PCR反应。
用于D2的基因扩增的引物集合：
 (图120; SEQ ID NO: 112)，和
 (图121; SEQ ID NO: 113)。
使用In-Fusion HD克隆试剂盒(由Takara Bio Inc.制造) (在下文中，得到的载体被称作“pET24b(+)-D2”，且在下文中和在附图中，由“pET24b(+)-D2”表达的重组蛋白被称作FGFR2D2)，将得到的PCR产物插入最初含有编码His标签和HRV3c蛋白酶切割位点的核苷酸序列的pET24b(+) (由Merck KGaA (Novagen)制造)中。
15)-1-2  用于结晶的FGFR2蛋白(FGFR2D2)的制备
将大肠杆菌Origami 2 (DE3) (由Merck KGaA (Novagen)制造)用表达质粒pET24b(+)-D2转化，并在50 mL Terrific培养基(由ForMedium Ltd.制造)中在200 rpm在37℃预培养过夜，所述Terrific培养基补充了25 μg/ml卡那霉素(由Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.制造)和12 μg/ml四环素(由Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.制造)。将50 mL预培养的溶液加入1 L也补充了25 μg/ml卡那霉素和12 μg/ml四环素的Terrific培养基中，并在250 rpm在37℃培养1小时。然后，将温度降低至16℃，并通过加入1 mM IPTG来诱导FGFR2D2的表达，随后培养26小时。通过在4500 rpm离心30分钟来收集细菌细胞，悬浮于结合缓冲液(50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、400 mM NaCl和20 mM咪唑)(其含有溶解在其中的抑制剂混合液(由Roche Applied Science制造))中，然后在冰上声处理。在25000 rpm离心20分钟以后，将上清液回收并应用于HisTrap FF粗制物柱(由GE Healthcare Bio-Sciences Corp.制造)。将柱用结合缓冲液洗涤，随后用洗脱缓冲液(50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、400 mM NaCl和500 mM咪唑)进行梯度洗脱，以收集含有目标蛋白的级分。将收集的样品用缓冲液(50 mM Tris-HCl (pH 7.5)和0.1 mM EDTA)稀释，然后应用于HiTrap SP HP，随后用缓冲液(50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、1 M NaCl和0.1 mM EDTA)进行梯度洗脱，以收集含有目标蛋白的级分。将得到的样品应用于用缓冲液(25 mM HEPES (pH 7.5)、300 mM NaCl和0.1 mMEDTA)平衡的凝胶过滤柱(HiLoad 16/600 Superdex 75 pg；由GE Healthcare Bio-Sciences Corp.制造)，以收集含有目标蛋白的级分。使用Amicon Ultra-4 (由Merck Millipore制造)，将得到的FGFR2D2浓缩至15 mg/mL。
15)-2           人源化抗-FGFR2抗体(hFR2-14_H3/L1)的Fab片段的制备
将hFR2-14_H3/L1在20 mM磷酸盐和10 mM EDTA (pH 7.0)中透析，然后使用Amicon Ultra-15 MWCO 10K (由Merck Millipore制造)浓缩至24 mg/ml，以制备1.9 ml浓缩物。将5.5 ml半胱氨酸(由Sigma-Aldrich Corp.制造)用20 mM磷酸盐和10 mM EDTA (pH 7.0)调至0.005 mM，并向浓缩物中加入用20 mM磷酸盐和10 mM EDTA (pH 7.0) 1/100稀释的0.19 ml木瓜蛋白酶(由Sigma-Aldrich Corp.制造)，并在37℃反应18小时。18小时以后，通过加入2.53 ml以120 mM的浓度溶解在20 mM磷酸盐和10 mM EDTA (pH 7.0)中的N-乙基马来酰亚胺(由Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.制造)来停止反应。将反应溶液应用于用PBS平衡过的MabSelect SuRe 5 ml (由GE Healthcare Bio-Sciences Corp.制造)，以回收18 ml与Fab片段对应的穿流液级分。将该级分用Amicon Ultra-15 MWCO 10K (由Merck Millipore制造)浓缩，并应用于用50 mM Tris-HCl和20 mM NaCl (pH 7.5)平衡过的Superdex 200 16/60 (由GE Healthcare Bio-Sciences Corp.制造)，以回收18 ml与Fab片段对应的级分(在下文中，得到的片段被称作“H3L1Fab片段”)。
15)-3     H3L1Fab片段/FGFR2D2复合物样品的制备
将0.5mL 15 mg/mL FGFR2D2与1 mL 12.5 mg/mL H3L1Fab片段混合，并将混合物在4℃静置过夜，然后应用于用结合缓冲液(50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、400 mM NaCl和20 mM咪唑)平衡过的HisTrap FF粗制物。将柱用结合缓冲液洗涤，随后用洗脱缓冲液(50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、400 mM NaCl和500 mM咪唑)洗脱。将洗脱的样品应用于用缓冲液(25 mM Tris-HCl (pH 7.5)和50 mM NaCl)平衡过的凝胶过滤柱(HiLoad 16/600Superdex 200 pg；由GE Healthcare Bio-Sciences Corp.制造)，以回收11 mL与复合物对应的级分。
15)-4     H3L1Fab片段/FGFR2D2复合物的结晶和结构分析
将得到的H3L1Fab和FGFR2D2的复合物浓缩至22 mg/mL，并用在结晶中。将蒸汽扩散方法用于结晶。向0.5-0.7 μL蛋白溶液中，加入等量的沉淀剂溶液(1.225 M硫酸铵和0.15 M Tris-HCl, pH 8.5)，并将得到的溶液放在含有0.45 mL沉淀剂溶液的密闭容器中，使得这些溶液不彼此接触。将容器在20℃静置。3天以后，得到0.2 mm×0.2 mm×0.2 mm单晶。
将得到的晶体浸入补充了30%(v/v)乙二醇的沉淀剂溶液中，并随后在-180℃的氮气流下冷冻。使用Photon Factory, Institute of Materials Structure Science, High Energy Accelerator Research Organization的BL5A，在95 K的氮气流下收集X-射线衍射数据。使用软件HKL2000 (由HKL Research Inc.制造)，从得到的衍射图像数字化衍射强度，以确定晶体结构因子。所述晶体是在具有P41212的空间群和a = b = 60.57埃且c = 331.2埃的晶胞的四方晶系中。
使用得到的结构因子以及FGFR2 (从PDB代码3OJ2提取有关的部分)和Fab (利用以前进行晶体结构分析的抗体结构)的三维结构坐标进行分子置换方法，以确定相。在计算中使用软件phaser (CCP4: Collaborative Computational Project No. 4)。所述晶体各自含有在不对称单元中的1个复合物。
使用软件refmac5 (CCP4)进行结构精化，并使用软件coot进行模型校正。重复进行该操作，以得到21.8%的最终R因子和25.8%的游离R因子，分辨率为2.3埃。该模型由1个复合物组成，并且含有H3L1Fab L链的氨基酸残基1-215、H3L1Fab H链的氨基酸残基1-221、FGFR2D2的氨基酸残基150-249、1个硫酸根离子和285个水分子。在该模型中没有包括H3L1Fab L链的C-端1个残基、H3L1Fab H链的C-端4个残基和构成FGFR2D2的His标签和蛋白酶切割位点的N-端20个残基，这是因为它们的模糊电荷密度。
经确定的距离H3L1Fab在4埃以内的FGFR2D2的氨基酸残基如下：Tyr155、Thr157、Lys176、Ala181、Gly182、Gly183、Asn184、Pro185、Met186、Thr188、Gln200、Glu201、Gly205、Gly206、Lys208、Val209、Arg210、Asn211、Gln212、His213、Trp214和Ile217。图138显示了整个复合物的条带模型。图139显示的简图显示了FGFR2D2/H3L1Fab复合物中的D2区域在FGFR2/FGF1复合物结构(PDB代码: 3OJ2)的对应区域上的重叠。
实施例16. 使用大鼠抗-FGFR2抗体FR2-10的免疫染色
16)-1     用于免疫染色的样品的制备
16)-1-1  表达FGFR家族的每种分子的细胞系的制备
将293α细胞(描述在实施例1)-6中)在含有10%FBS的DMEM培养基中调至6×106个细胞/225-cm2烧瓶(由Sumitomo Bakelite Co., Ltd.制造)，并在5%CO2条件下在37℃培养过夜。使用FuGENE 6 (由Roche Diagnostics K.K.制造)，用在实施例1)-3-1、2)-1-1和10)-2-1中构建的FGFR1 IIIb、FGFR1 IIIc、FGFR2 IIIb、FGFR2 IIIc、FGFR3 IIIb、FGFR3 IIIc或FGFR4表达载体，或空载体，即pcDNA-DEST40-FGFR1 IIIb、pcDNA-DEST40-FGFR1 IIIc、pcDNA-DEST40-FGFR2 IIIb、pcDNA-DEST40-FGFR2 IIIc、pcDNA-DEST40-FGFR3 IIIb、pcDNA-DEST40-FGFR3 IIIc、pcDNA-DEST40-FGFR4或pcDNA-DEST40，转染细胞，并在5%CO2条件下在37℃培养2夜。将得到的细胞使用TrypLE Express (由Life Technologies Corp.制造)回收，并离心以得到沉淀物，然后将所述沉淀物用PBS洗涤1次并离心。将得到的沉淀物在20%中性缓冲的福尔马林中固定。
16)-1-2  表达FGFR2的癌细胞系的制备
将在含有10%FBS的RPMI中培养的人胃癌细胞系SNU-16和人结直肠癌细胞系NCI-H716 (购自ATCC)各自回收并离心以得到沉淀物，然后将所述沉淀物在20%中性缓冲的福尔马林中固定。将在含有10%FBS的DMEM中培养的人胃癌细胞系KATO III (购自ATCC)回收并离心以得到沉淀物，然后将所述沉淀物在20%中性缓冲的福尔马林中固定。
16)-1-3  表达FGFR2的癌细胞系异种移植物模型的肿瘤样品的制备
将5×106个SNU-16细胞悬浮于50%Matrigel (由Nippon Becton Dickinson Company, Ltd.制造)中，并皮下移植至每只裸鼠(CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj，购自Charles River Laboratories Japan Inc.)的腋窝区域。移植后20天，将肿瘤回收并在Mildform (由Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.制造)中固定。
将3×105个KATO III细胞悬浮于100%Matrigel (由Nippon Becton Dickinson Company, Ltd.制造)中，并皮下移植至每只SCID小鼠(CB17/lcr-Prkdcscid/CrlCrlj，购自Charles River Laboratories Japan Inc.)的腋窝区域。移植后30天，将肿瘤回收并在Mildform (由Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.制造)中固定。
将2.5×106个NCI-H716细胞悬浮于100%Matrigel (由Nippon Becton Dickinson Company, Ltd.制造)中，并皮下移植至每只裸鼠(CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj，购自Charles River Laboratories Japan Inc.)的腋窝区域。移植后21天，回收肿瘤。
16)-2           石蜡包埋和切片
石蜡包埋和切片是普通方案，并且可以没有特别限制地使用任何工具或器械。
将在实施例16)-1-1和16)-1-2中制备的每个细胞系的细胞回收进15-mL试管中，并在1500 rpm离心5分钟以除去上清液。将3 mL 20%中性缓冲的福尔马林(由Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.制造)在细胞沉淀物上分层，并在室温静置30分钟或更久进行固定。然后，向其中加入5 mL氯仿。此后，立即将试管在1000 rpm离心10分钟，并立即除去福尔马林层。然后，回收在福尔马林层和氯仿层之间形成的细胞沉淀物。将细胞沉淀物放在尼龙网袋中，然后将其放在用于组织制备的盒(Unicassette Standard，Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.制造)中。将细胞沉淀物与该盒一起浸入乙醇中以洗掉氯仿。将在实施例16)-1-3中制备的每个异种移植物组织在Mildform (购自Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.)中固定，然后在切断部分处修整，并放在盒中。
通过常规方法，将细胞沉淀物和异种移植物组织进行石蜡包埋。使用自动化固定和包埋设备(Tissue-Tek VIP5 Jr.；Sakura Finetek Japan Co., Ltd.制造)，进行脱水、去脂质化和石蜡浸渍。将该盒从自动化固定和包埋设备取出，并转移至石蜡包埋的块制备设备(Tissue-Tek TEC Plus；Sakura Finetek Japan Co., Ltd.制造)的石蜡浴。将少量熔化的石蜡注射进加载至该设备的包埋盘中。用镊子将细胞沉淀物或组织与从石蜡浴取出的盒容器或尼龙网分离，并加载进该包埋盘中的石蜡中。随后，将盒作为包埋框放在包埋盘上，并将熔化的石蜡倒在盒内的细胞沉淀物或组织上面。将含有与细胞或组织成为一体的包埋框的包埋盘放在冷却装置中并冷却。石蜡固化以后，将包埋的块从包埋盘取出并进行切片。使用切片机(IVS-410；Sakura Finetek Japan Co., Ltd.制造)，通过将这样制备的包埋块切成3 μm厚度的切片进行切片。将如此得到的每个切片应用于抗剥离载玻片(铂；由Matsunami Glass Ind., Ltd.制造)。将载玻片在石蜡伸张器(由Sakura Finetek Japan Co., Ltd. 制造)上在50℃干燥过夜，堆积在载玻片盒中，并在干燥器中储存。
16)-3     染色
使用自动化染色设备(Discovery Ultra；由Ventana Medical Systems, Inc. 制造)，将每个样品染色。除非另外指出，否则将染色过程中的反应温度设定至37℃。将加入的各种试剂的量都设定至1滴。使用新鲜EZ缓冲液(由Ventana Medical Systems, Inc.制造)，通过3个温育运行(每个包括68℃保持4分钟)将样品脱石蜡。用EZ缓冲液洗涤样品。使用新鲜CC1缓冲液(由Ventana Medical Systems, Inc.制造)，通过4个运行(每个包括95℃)进行细胞调节(共52分钟)。将样品用反应缓冲液(由Ventana Medical Systems, Inc.制造)洗涤4次。将大鼠抗-FGFR2抗体FR2-10和商购可得的抗体Anti-Human K-sam Rabbit IgG Affinity Purify (由IBL Co., Ltd.制造)用专用于Discovery (由Ventana Medical Systems, Inc.制造)的抗体稀释剂分别稀释至10 μg/mL和210 μg/mL，并与样品反应1小时。用反应缓冲液洗涤4次以后，使生物素化的山羊抗-大鼠IgG (由Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.制造)的溶液(用专用于Discovery和Discovery Universal Secondary Antibody (由Ventana Medical Systems, Inc.制造)的抗体稀释剂稀释500倍)与其反应32分钟。将样品用反应缓冲液洗涤2次。使抑制剂D (DAB Map试剂盒；由Ventana Medical Systems, Inc.制造)与其反应8分钟，然后将样品用反应缓冲液洗涤2次。使SA-HRP D (DAB Map试剂盒；由Ventana Medical Systems, Inc.制造)与其反应16分钟，并将样品用反应缓冲液洗涤2次。使DAB D (DAB Map试剂盒；由Ventana Medical Systems, Inc.制造)与其反应4分钟。然后，向其中加入DAB H2O2 (DAB Map试剂盒；由Ventana Medical Systems, Inc.制造)，随后反应8分钟。将样品用反应缓冲液洗涤2次。使Copper-D (DAB Map试剂盒；由Ventana Medical Systems, Inc.制造)与其反应4分钟，并将样品用反应缓冲液洗涤3次。使苏木精核染色试剂II (由Ventana Medical Systems, Inc.制造)与其反应4分钟，并将样品用反应缓冲液洗涤2次。使碳酸锂试剂(由Ventana Medical Systems, Inc.制造)与其反应4分钟，并将样品用反应缓冲液洗涤1次。
将完全染色的制品用乙醇系列脱水，用二甲苯系列清洁，然后与固定剂一起在玻璃盖片上固定。在光学显微镜下观察制品，并评价代表阳性反应产物的棕色染色。
如在图140中所示，大鼠抗-FGFR2抗体FR2-10仅在被迫表达FGFR2 IIIb的细胞的块中的一些细胞上表现出非常强的染色。在其它被迫表达细胞或空载体转染的细胞中没有观察到阳性染色。因而，结论是，大鼠抗-FGFR2抗体FR2-10能够将FGFR2 IIIb特异性地染色。
如在图141中所示，市售的抗-FGFR2抗体在SNU-16细胞(图141-D)、KATO III细胞(图141-E)和NCI-H716细胞(图141-F)的块中的许多细胞上表现出清楚的阳性染色，从而证实这些细胞系表达FGFR2蛋白。另一方面，大鼠抗-FGFR2抗体FR2-10在SNU-16细胞(图141-A)和KATO III细胞(图141-B)的块中的许多细胞上表现出清楚的阳性染色，但是没有在NCI-H716细胞上表现出阳性染色(图141-C)，从而证实NCI-H716细胞不表达FGFR2 IIIb蛋白。
如在图142中所示，大鼠抗-FGFR2抗体FR2-10在源自SNU-16细胞(图142-A)和KATO III细胞(图142-B)的异种移植物肿瘤中的许多细胞上表现出清楚的阳性染色，但是没有在源自NCI-H716细胞的异种移植物肿瘤上表现出染色(图142-C)。
实施例17. 人源化抗-人FGFR2抗体(hFR2-14)对配体-受体结合的抑制活性
通过ELISA，检测配体FGF7与抗原(C-端His-标记的rhFGFR2α(IIIb))的结合。将rhFGFR2α(IIIb)用PBS稀释至2 μg/ml，并以100 μl/孔的浓度加入96孔Clear Polystyrene High Bind Stripwell Microplate (由Corning Inc.制造)，并将平板在4℃静置过夜。在次日，使用抽吸器除去溶液，并将孔中的内容物用含有0.05%吐温-20 (由Bio-Rad Laboratories, Inc.制造)的PBS洗涤3次。然后，以200 μl/孔的浓度向其中加入含有1%BSA (由Sigma-Aldrich Corp.制造)的PBS，并将平板在室温静置1小时。除去溶液以后，将孔中的内容物用含有0.05%吐温-20的PBS洗涤3次。分别以50 μl/孔的浓度向其中加入用含有1%BSA的PBS稀释至9 ng/ml的FGF7、稀释至300 μg/ml的肝素(由Sigma-Aldrich Corp.制造)、以及稀释至0.3-30 μg/ml的cFR2-10 (在实施例4中制备))、hFR2-14_H12/L1 (在实施例8中制备))或hFR2-14_H19/L1抗体(在实施例9中制备))，并将平板在室温静置2小时。除去溶液以后，将孔中的内容物用含有0.05%吐温-20的PBS洗涤3次。以100 μl/孔的浓度向其中加入用含有1%BSA的PBS稀释180倍的生物素化的抗-FGF-7抗体(Human KGF/FGF-7 DuoSet，R&D Systems, Inc.制造)，并将平板在室温静置2小时。除去溶液以后，将孔中的内容物用含有0.05%吐温-20的PBS洗涤3次。以100 μl/孔的浓度向其中加入用含有1%BSA的PBS稀释200倍的链霉亲和素-HRP (Human KGF/FGF-7 DuoSet，R&D Systems, Inc.制造)，并将平板在室温避光静置20分钟。除去溶液以后，将孔中的内容物用含有0.05%吐温-20的PBS洗涤3次。以100 μl/孔的浓度向其中加入含有等量混合的试剂A和试剂B的底物溶液(Substrate Reagent Pack，R&D Systems, Inc.制造)，并将平板在室温避光静置20分钟进行显色反应。通过以50 μl/孔的浓度加入停止溶液(由R&D Systems, Inc.制造)，停止反应。然后，使用平板读数器在450 nm和570 nm测量吸光度。从在450 nm的测量值减去在570 nm的测量值，以确定值。如在图143中所示，cFR2-10、hFR2-14_H12/L1和hFR2-14_H19/L1抗体都具有抑制配体与受体的结合的活性。
工业实用性
本发明提供的抗体的应用能够治疗或预防多种癌症以及测试或诊断多种癌症。
序列表自由正文
SEQ ID NO: 1: 与大鼠抗-FGFR2抗体FR2-10的重链对应的带的N-端氨基酸序列(图9)。
SEQ ID NO: 2: 与大鼠抗-FGFR2抗体FR2-10的轻链对应的带的N-端氨基酸序列(图10)。
SEQ ID NO: 3: 与大鼠抗-FGFR2抗体FR2-13的重链对应的带的N-端氨基酸序列(图11)。
SEQ ID NO: 4: 与大鼠抗-FGFR2抗体FR2-13的轻链对应的带的N-端氨基酸序列(图12)。
SEQ ID NO: 5: 与大鼠抗-FGFR2抗体FR2-14的重链对应的带的N-端氨基酸序列(图13)。
SEQ ID NO: 6: 与大鼠抗-FGFR2抗体FR2-14的轻链对应的带的N-端氨基酸序列(图14)。
SEQ ID NO: 7:用于大鼠重链的基因扩增的引物(图15)。
SEQ ID NO: 8: FR2-10的重链的测序引物(图16)。
SEQ ID NO: 9: FR2-13的重链的测序引物(图17)。
SEQ ID NO: 10: FR2-14的重链的测序引物(图18)。
SEQ ID NO: 11: 编码大鼠抗-FGFR2抗体FR2-10的重链可变区的cDNA的核苷酸序列(图19)。
SEQ ID NO: 12: 大鼠抗-FGFR2抗体FR2-10的重链可变区的氨基酸序列(图20)。
SEQ ID NO: 13: 编码大鼠抗-FGFR2抗体FR2-13的重链可变区的cDNA的核苷酸序列(图21)。
SEQ ID NO: 14: 大鼠抗-FGFR2抗体FR2-13的重链可变区的氨基酸序列(图22)。
SEQ ID NO: 15: 编码大鼠抗-FGFR2抗体FR2-14的重链可变区的cDNA的核苷酸序列(图23)。
SEQ ID NO: 16: 大鼠抗-FGFR2抗体FR2-14的重链可变区的氨基酸序列(图24)。
SEQ ID NO: 17: 用于大鼠轻链的基因扩增的引物(图25)。
SEQ ID NO: 18: 大鼠轻链的测序引物(图26)。
SEQ ID NO: 19: FR2-10的轻链的测序引物(图27)。
SEQ ID NO: 20: 编码大鼠抗-FGFR2抗体FR2-10的轻链可变区的cDNA的核苷酸序列(图28)。
SEQ ID NO: 21: 大鼠抗-FGFR2抗体FR2-10的轻链可变区的氨基酸序列(图29)。
SEQ ID NO: 22: 用于大鼠FR2-13或FR2-14轻链的基因扩增的引物(图30)。
SEQ ID NO: 23: 编码大鼠抗-FGFR2抗体FR2-13的轻链可变区的cDNA的核苷酸序列(图31)。
SEQ ID NO: 24: 大鼠抗-FGFR2抗体FR2-13的轻链可变区的氨基酸序列(图32)。
SEQ ID NO: 25: 编码大鼠抗-FGFR2抗体FR2-14的轻链可变区的cDNA的核苷酸序列(图33)。
SEQ ID NO: 26: 大鼠抗-FGFR2抗体FR2-14的轻链可变区的氨基酸序列(图34)。
SEQ ID NO: 27: 包含编码人κ链分泌信号序列和人κ链恒定区的氨基酸的DNA序列的DNA片段(图35)。
SEQ ID NO: 28: 轻链表达载体的引物F (图36)。
SEQ ID NO: 29: 轻链表达载体的引物R (图37)。
SEQ ID NO: 30: 包含编码人重链信号序列和人IgG1恒定区的氨基酸的DNA序列的DNA片段(图38)。
SEQ ID NO: 31: 人嵌合FR2-10 (cFR2-10)的轻链的核苷酸序列(图39)。在该序列中，第1-60位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟cFR2-10轻链的核苷酸序列中。
SEQ ID NO: 32: 人嵌合FR2-10 (cFR2-10)的轻链的氨基酸序列(图40)。在该序列中，第1-20位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟cFR2-10轻链的氨基酸序列中。
SEQ ID NO: 33: 人嵌合FR2-10的轻链的引物集合F (图41)。
SEQ ID NO: 34: 人嵌合FR2-10的轻链的引物集合R (图42)。
SEQ ID NO: 35: 人嵌合FR2-10 (cFR2-10)的重链的核苷酸序列(图43)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟cFR2-10重链的核苷酸序列中。
SEQ ID NO: 36:人嵌合FR2-10 (cFR2-10)的重链的氨基酸序列(图44)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟cFR2-10重链的氨基酸序列中。
SEQ ID NO: 37: 人嵌合FR2-10的重链的引物集合F (图45)。
SEQ ID NO: 38: 人嵌合FR2-10的重链的引物集合R (图46)。
SEQ ID NO: 39: 人嵌合FR2-13 (cFR2-13)的轻链的核苷酸序列(图47)。在该序列中，第1-60位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟cFR2-13轻链的核苷酸序列中。
SEQ ID NO: 40: 人嵌合FR2-13 (cFR2-13)的轻链的氨基酸序列(图48)。在该序列中，第1-20位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟cFR2-13轻链的氨基酸序列中。
SEQ ID NO: 41: 人嵌合FR2-13的轻链的引物F (图49)。
SEQ ID NO: 42: 人嵌合FR2-13的轻链的引物R (图50)。
SEQ ID NO: 43: 人嵌合FR2-13 (cFR2-13)的重链的核苷酸序列(图51)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟cFR2-13重链的核苷酸序列中。
SEQ ID NO: 44: 人嵌合FR2-13 (cFR2-13)的重链的氨基酸序列(图52)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟cFR2-13重链的氨基酸序列中。
SEQ ID NO: 45:人嵌合FR2-13的重链的引物F (图53)。
SEQ ID NO: 46: 人嵌合FR2-13的重链的引物R (图54)。
SEQ ID NO: 47: 人嵌合FR2-14 (cFR2-14)的轻链的核苷酸序列(图55)。在该序列中，第1-60位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟cFR2-14轻链的核苷酸序列中。
SEQ ID NO: 48: 人嵌合FR2-14 (cFR2-14)的轻链的氨基酸序列(图56)。在该序列中，第1-20位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟cFR2-14轻链的氨基酸序列中。
SEQ ID NO: 49: 人嵌合FR2-14的轻链的引物(图57)。
SEQ ID NO: 50: 人嵌合FR2-14 (cFR2-14)的重链的核苷酸序列(图58)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟cFR2-14重链的核苷酸序列中。
SEQ ID NO: 51: 人嵌合FR2-14 (cFR2-14)的重链的氨基酸序列(图59)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟cFR2-14重链的氨基酸序列中。
SEQ ID NO: 52: 大鼠抗-FGFR2抗体FR2-10的重链CDR1的氨基酸序列(图60)。
SEQ ID NO: 53: 大鼠抗-FGFR2抗体FR2-10的重链CDR2的氨基酸序列(图61)。
SEQ ID NO: 54: 大鼠抗-FGFR2抗体FR2-10的重链CDR3的氨基酸序列(图62)。
SEQ ID NO: 55: 大鼠抗-FGFR2抗体FR2-13的重链CDR1的氨基酸序列(图63)。
SEQ ID NO: 56: 大鼠抗-FGFR2抗体FR2-13的重链CDR2的氨基酸序列(图64)。
SEQ ID NO: 57: 大鼠抗-FGFR2抗体FR2-13的重链CDR3的氨基酸序列(图65)。
SEQ ID NO: 58: 大鼠抗-FGFR2抗体FR2-14的重链CDR1的氨基酸序列(图66)。
SEQ ID NO: 59: 大鼠抗-FGFR2抗体FR2-14的重链CDR2的氨基酸序列(图67)。
SEQ ID NO: 60: 大鼠抗-FGFR2抗体FR2-14的重链CDR3的氨基酸序列(图68)。
SEQ ID NO: 61: 大鼠抗-FGFR2抗体FR2-10的轻链CDR1的氨基酸序列(图69)。
SEQ ID NO: 62: 大鼠抗-FGFR2抗体FR2-10的轻链CDR2的氨基酸序列(图70)。
SEQ ID NO: 63: 大鼠抗-FGFR2抗体FR2-10的轻链CDR3的氨基酸序列(图71)。
SEQ ID NO: 64: 大鼠抗-FGFR2抗体FR2-13的轻链CDR1的氨基酸序列(图72)。
SEQ ID NO: 65: 大鼠抗-FGFR2抗体FR2-13的轻链CDR2的氨基酸序列(图73)。
SEQ ID NO: 66: 大鼠抗-FGFR2抗体FR2-13的轻链CDR3的氨基酸序列(图74)。
SEQ ID NO: 67: 大鼠抗-FGFR2抗体FR2-14的轻链CDR1的氨基酸序列(图75)。
SEQ ID NO: 68: 大鼠抗-FGFR2抗体FR2-14的轻链CDR2的氨基酸序列(图76)。
SEQ ID NO: 69: 大鼠抗-FGFR2抗体FR2-14的轻链CDR3的氨基酸序列(图77)。
SEQ ID NO: 70: 人FGFR2 IIIb的氨基酸序列(图78)。
SEQ ID NO: 71: 人FGFR2 IIIc的氨基酸序列(图79)。
SEQ ID NO: 72: 人源化FR2-14轻链(hFR2-14_L1)的核苷酸序列(图80)。在该序列中，第1-60位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟的轻链hFR2-14_L1的核苷酸序列中。
SEQ ID NO: 73: 人源化FR2-14轻链(hFR2-14_L1)的氨基酸序列(图81)。在该序列中，第1-20位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟的轻链hFR2-14_L1的氨基酸序列中。
SEQ ID NO: 74: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H1)的核苷酸序列(图82)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H1的核苷酸序列中。
SEQ ID NO: 75: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H1)的氨基酸序列(图83)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H1的氨基酸序列中。
SEQ ID NO: 76: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H2)的核苷酸序列(图84)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H2的核苷酸序列中。
SEQ ID NO: 77: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H2)的氨基酸序列(图85)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H2的氨基酸序列中。
SEQ ID NO: 78: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H3)的核苷酸序列(图86)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H3的核苷酸序列中。
SEQ ID NO: 79: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H3)的氨基酸序列(图87)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H3的氨基酸序列中。
SEQ ID NO: 80: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H4)的核苷酸序列(图88)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H4的核苷酸序列中。
SEQ ID NO: 81: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H4)的氨基酸序列(图89)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H4的氨基酸序列中。
SEQ ID NO: 82: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H5)的核苷酸序列(图90)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H5的核苷酸序列中。
SEQ ID NO: 83: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H5)的氨基酸序列(图91)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H5的氨基酸序列中。
SEQ ID NO: 84: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H6)的核苷酸序列(图92)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H6的核苷酸序列中。
SEQ ID NO: 85: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H6)的氨基酸序列(图93)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H6的氨基酸序列中。
SEQ ID NO: 86: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H7)的核苷酸序列(图94)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H7的核苷酸序列中。
SEQ ID NO: 87: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H7)的氨基酸序列(图95)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H7的氨基酸序列中。
SEQ ID NO: 88: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H8)的核苷酸序列(图96)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H8的核苷酸序列中。
SEQ ID NO: 89: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H8)的氨基酸序列(图97)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H8的氨基酸序列中。
SEQ ID NO: 90: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H9)的核苷酸序列(图98)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H9的核苷酸序列中。
SEQ ID NO: 91: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H9)的氨基酸序列(图99)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H9的氨基酸序列中。
SEQ ID NO: 92: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H10)的核苷酸序列(图100)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H10的核苷酸序列中。
SEQ ID NO: 93: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H10)的氨基酸序列(图101)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H10的氨基酸序列中。
SEQ ID NO: 94: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H11)的核苷酸序列(图102)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H11的核苷酸序列中。
SEQ ID NO: 95: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H11)的氨基酸序列(图103)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H11的氨基酸序列中。
SEQ ID NO: 96: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H12或hFR2-14_H19)的核苷酸序列(图104)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H12或hFR2-14_H19的核苷酸序列中。
SEQ ID NO: 97: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H12或hFR2-14_H19)的氨基酸序列(图105)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H12或hFR2-14_H19的氨基酸序列中。
SEQ ID NO: 98: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H13)的核苷酸序列(图106)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H13的核苷酸序列中。
SEQ ID NO: 99: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H13)的氨基酸序列(图107)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H13的氨基酸序列中。
SEQ ID NO: 100: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H14)的核苷酸序列(图108)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H14的核苷酸序列中。
SEQ ID NO: 101: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H14)的氨基酸序列(图109)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H14的氨基酸序列中。
SEQ ID NO: 102: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H15)的核苷酸序列(图110)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H15的核苷酸序列中。
SEQ ID NO: 103: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H15)的氨基酸序列(图111)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H15的氨基酸序列中。
SEQ ID NO: 104: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H16)的核苷酸序列(图112)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H16的核苷酸序列中。
SEQ ID NO: 105: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H16)的氨基酸序列(图113)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H16的氨基酸序列中。
SEQ ID NO: 106: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H17)的核苷酸序列(图114)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H17的核苷酸序列中。
SEQ ID NO: 107: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H17)的氨基酸序列(图115)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H17的氨基酸序列中。
SEQ ID NO: 108: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H18)的核苷酸序列(图116)。在该序列中，第1-57位核苷酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H18的核苷酸序列中。
SEQ ID NO: 109: 人源化FR2-14重链(hFR2-14_H18)的氨基酸序列(图117)。在该序列中，第1-19位氨基酸代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链hFR2-14_H18的氨基酸序列中。
SEQ ID NO: 110: hFR2-14_H2型重链的引物VH3A-F (图118)。
SEQ ID NO: 111: hFR2-14_H2型重链的引物VH3A-R (图119)。
SEQ ID NO: 112: 用于D2的基因扩增的引物D23fw (图120)。
SEQ ID NO: 113: 用于D2的基因扩增的引物D23rv (图121)。

Claims (66)

1.一种具有抗体依赖性的细胞的细胞毒性活性并且结合成纤维细胞生长因子受体(FGFR)的抗体或其功能片段。
2.根据权利要求1所述的抗体或其功能片段，其中所述成纤维细胞生长因子受体(FGFR)是人FGFR。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其功能片段，其中所述成纤维细胞生长因子受体(FGFR)是FGFR2。
4.根据权利要求1-3中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段结合人成纤维细胞生长因子受体2 (人FGFR2) IIIb和/或人成纤维细胞生长因子受体2 (人FGFR2) IIIc。
5.根据权利要求1-4中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段结合人成纤维细胞生长因子受体2 (人FGFR2) IIIb和人成纤维细胞生长因子受体2 (人FGFR2) IIIc。
6.根据权利要求1-5中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段结合人成纤维细胞生长因子受体2的1个或2个或更多个免疫球蛋白样结构域。
7.根据权利要求1-6中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段结合人成纤维细胞生长因子受体2的免疫球蛋白样结构域2。
8.根据权利要求1-4和6中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段结合人成纤维细胞生长因子受体2的免疫球蛋白样结构域3。
9.根据权利要求1-8中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段具有对人成纤维细胞生长因子受体2 (人FGFR2) IIIb和/或人成纤维细胞生长因子受体2 (人FGFR2) IIIc的中和活性。
10.根据权利要求1-9中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段具有对人成纤维细胞生长因子受体2 (人FGFR2) IIIb和人成纤维细胞生长因子受体2 (人FGFR2) IIIc的中和活性。
11.根据权利要求1-10中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段具有抗肿瘤活性。
12.根据权利要求11所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段表现出体内抗肿瘤活性。
13.根据权利要求1-4、6、8、9、11和12中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体由重链和轻链组成并且结合人FGFR2，所述重链包含：CDRH1，其由序列表的SEQ ID NO: 52表示的氨基酸序列(图60)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；CDRH2，其由序列表的SEQ ID NO: 53表示的氨基酸序列(图61)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；和CDRH3，其由序列表的SEQ ID NO: 54表示的氨基酸序列(图62)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；所述轻链包含：CDRL1，其由序列表的SEQ ID NO: 61表示的氨基酸序列(图69)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；CDRL2，其由序列表的SEQ ID NO: 62表示的氨基酸序列(图70)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；和CDRL3，其由序列表的SEQ ID NO: 63表示的氨基酸序列(图71)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成。
14.根据权利要求1-7和9-12中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体由重链和轻链组成并且结合人FGFR2，所述重链包含：CDRH1，其由序列表的SEQ ID NO: 55表示的氨基酸序列(图63)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；CDRH2，其由序列表的SEQ ID NO: 56表示的氨基酸序列(图64)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；和CDRH3，其由序列表的SEQ ID NO: 57表示的氨基酸序列(图65)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；所述轻链包含：CDRL1，其由序列表的SEQ ID NO: 64表示的氨基酸序列(图72)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；CDRL2，其由序列表的SEQ ID NO: 65表示的氨基酸序列(图73)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；和CDRL3，其由序列表的SEQ ID NO: 66表示的氨基酸序列(图74)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成。
15.根据权利要求1-7和9-12中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体由重链和轻链组成并且结合人FGFR2，所述重链包含：CDRH1，其由序列表的SEQ ID NO: 58表示的氨基酸序列(图66)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；CDRH2，其由序列表的SEQ ID NO: 59表示的氨基酸序列(图67)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；和CDRH3，其由序列表的SEQ ID NO: 60表示的氨基酸序列(图68)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；所述轻链包含：CDRL1，其由序列表的SEQ ID NO: 67表示的氨基酸序列(图75)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；CDRL2，其由序列表的SEQ ID NO: 68表示的氨基酸序列(图76)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成；和CDRL3，其由序列表的SEQ ID NO: 69表示的氨基酸序列(图77)或通过1个或2个氨基酸的取代从所述氨基酸序列衍生出的氨基酸序列组成。
16.根据权利要求15所述的抗体或其功能片段，其中所述CDRH3由通过1个或2个氨基酸的取代从序列表的SEQ ID NO: 60表示的氨基酸序列(图68)衍生出的氨基酸序列组成。
17.根据权利要求1-16中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体是单克隆抗体。
18.根据权利要求1-17中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体是嵌合抗体。
19.根据权利要求1-18中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体是人源化抗体。
20.根据权利要求19所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体选自下述(i)至(xix)：
(i)一种人源化抗体(hFR2-14_H19/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 97表示的氨基酸序列(图105)的第20-467位氨基酸；
(ii)一种人源化抗体(hFR2-14_H12/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 97表示的氨基酸序列(图105)的第20-467位氨基酸；
(iii)一种人源化抗体(hFR2-14_H8/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 89表示的氨基酸序列(图97)的第20-467位氨基酸；
(iv)一种人源化抗体(hFR2-14_H11/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 95表示的氨基酸序列(图103)的第20-467位氨基酸；
(v)一种人源化抗体(hFR2-14_H5/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 83表示的氨基酸序列(图91)的第20-467位氨基酸；
(vi)一种人源化抗体(hFR2-14_H1/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 75表示的氨基酸序列(图83)的第20-467位氨基酸；
(vii)一种人源化抗体(hFR2-14_H2/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 77表示的氨基酸序列(图85)的第20-467位氨基酸；
(viii)一种人源化抗体(hFR2-14_H3/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 79表示的氨基酸序列(图87)的第20-467位氨基酸；
(ix)一种人源化抗体(hFR2-14_H4/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 81表示的氨基酸序列(图89)的第20-467位氨基酸；
(x)一种人源化抗体(hFR2-14_H6/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 85表示的氨基酸序列(图93)的第20-467位氨基酸；
(xi)一种人源化抗体(hFR2-14_H7/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 87表示的氨基酸序列(图95)的第20-467位氨基酸；
(xii)一种人源化抗体(hFR2-14_H9/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 91表示的氨基酸序列(图99)的第20-467位氨基酸；
(xiii)一种人源化抗体(hFR2-14_H10/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 93表示的氨基酸序列(图101)的第20-467位氨基酸；
(xiv)一种人源化抗体(hFR2-14_H13/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 99表示的氨基酸序列(图107)的第20-467位氨基酸；
(xv)一种人源化抗体(hFR2-14_H14/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 101表示的氨基酸序列(图109)的第20-467位氨基酸；
(xvi)一种人源化抗体(hFR2-14_H15/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 103表示的氨基酸序列(图111)的第20-467位氨基酸；
(xvii)一种人源化抗体(hFR2-14_H16/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 105表示的氨基酸序列(图113)的第20-467位氨基酸；
(xviii)一种人源化抗体(hFR2-14_H17/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 107表示的氨基酸序列(图115)的第20-467位氨基酸；和
(xix)一种人源化抗体(hFR2-14_H18/L1)，其包含轻链和重链，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列(图81)的第21-235位氨基酸，所述重链包含由SEQ ID NO: 109表示的氨基酸序列(图117)的第20-467位氨基酸。
21.根据权利要求1-12中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体包含重链和轻链并且结合人FGFR2，所述重链和轻链包含分别与根据权利要求20所述的抗体的重链和轻链的氨基酸序列具有95%或更高同一性的氨基酸序列。
22.根据权利要求1-12中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段结合被根据权利要求13-16和20中的任一项所述的抗体识别的抗原上的位点。
23.根据权利要求1-12中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段与根据权利要求13-16和20中的任一项所述的抗体竞争对人FGFR2的结合。
24.根据权利要求1-12中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段结合人FGFR2上的表位，所述表位由SEQ ID NO: 70 (图78)表示的氨基酸序列中的以下氨基酸构成：在残基155处的酪氨酸(Tyr)、在残基157处的苏氨酸(Thr)、在残基176处的赖氨酸(Lys)、在残基181处的丙氨酸(Ala)、在残基182处的甘氨酸(Gly)、在残基183处的甘氨酸(Gly)、在残基184处的天冬酰胺(Asn)、在残基185处的脯氨酸(Pro)、在残基186处的甲硫氨酸(Met)、在残基188处的苏氨酸(Thr)、在残基200处的谷氨酰胺(Gln)、在残基201处的谷氨酸(Glu)、在残基205处的甘氨酸(Gly)、在残基206处的甘氨酸(Gly)、在残基208处的赖氨酸(Lys)、在残基209处的缬氨酸(Val)、在残基210处的精氨酸(Arg)、在残基211处的天冬酰胺(Asn)、在残基212处的谷氨酰胺(Gln)、在残基213处的组氨酸(His)、在残基214处的色氨酸(Trp)和在残基217处的异亮氨酸(Ile)。
25.根据权利要求1-12中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段与由SEQ ID NO: 70 (图78)表示的氨基酸序列中的以下氨基酸中的每一个具有相互作用距离：在残基155处的酪氨酸(Tyr)、在残基157处的苏氨酸(Thr)、在残基176处的赖氨酸(Lys)、在残基181处的丙氨酸(Ala)、在残基182处的甘氨酸(Gly)、在残基183处的甘氨酸(Gly)、在残基184处的天冬酰胺(Asn)、在残基185处的脯氨酸(Pro)、在残基186处的甲硫氨酸(Met)、在残基188处的苏氨酸(Thr)、在残基200处的谷氨酰胺(Gln)、在残基201处的谷氨酸(Glu)、在残基205处的甘氨酸(Gly)、在残基206处的甘氨酸(Gly)、在残基208处的赖氨酸(Lys)、在残基209处的缬氨酸(Val)、在残基210处的精氨酸(Arg)、在残基211处的天冬酰胺(Asn)、在残基212处的谷氨酰胺(Gln)、在残基213处的组氨酸(His)、在残基214处的色氨酸(Trp)和在残基217处的异亮氨酸(Ile)。
26.根据权利要求25所述的抗体或其功能片段，其中所述相互作用距离是6埃或更短。
27.根据权利要求25或26所述的抗体或其功能片段，其中所述相互作用距离是4埃或更短。
28.根据权利要求1-12和21-27中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体是人抗体。
29.根据权利要求1-28中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段抑制FGF与人FGFR2的结合。
30.根据权利要求1-29中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段具有抗体依赖性的细胞的细胞毒性活性和/或抗体依赖性的细胞吞噬活性。
31.下述(i)至(iii)中的任一项所述的核苷酸：
(i)一种核苷酸，其包含编码根据权利要求1-30中的任一项所述的抗体的重链或轻链的部分或整个氨基酸序列的核苷酸序列；
(ii)一种由以下核苷酸序列组成的核苷酸，所述核苷酸序列包含编码根据权利要求1-30中的任一项所述的抗体的重链或轻链的部分或整个氨基酸序列的核苷酸序列；和
(iii)一种核苷酸，其由编码根据权利要求1-30中的任一项所述的抗体的重链或轻链的部分或整个氨基酸序列的核苷酸序列组成。
32.一种重组载体，其具有根据权利要求31所述的核苷酸的插入物。
33.一种重组细胞，其包含根据权利要求31所述的核苷酸或根据权利要求32所述的重组载体。
34.一种细胞，其生产根据权利要求1-30中的任一项所述的抗体或其功能片段。
35.一种用于生产根据权利要求1-30中的任一项所述的抗体或其功能片段的方法，所述方法包括下述步骤(i)和(ii)：
(i)培养根据权利要求33或34所述的细胞；和
(ii)从在步骤(i)中得到的培养物回收根据权利要求1-30中的任一项所述的抗体或其功能片段。
36.根据权利要求1-12中的任一项所述的抗体或其功能片段，其是通过根据权利要求35所述的方法得到的。
37.根据权利要求1-30和36中的任一项所述的抗体或其功能片段，其中从所述重链或轻链的氨基端或羧基端删除1-5个氨基酸。
38.根据权利要求1-30、36和37中的任一项所述的抗体或其功能片段的修饰形式。
39.根据权利要求38所述的修饰形式，其中糖链修饰受到调节。
40.根据权利要求39所述的修饰形式，其中所述抗体选自权利要求20的抗体(i)至(xix)。
41.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-30、36和37中的任一项所述的抗体或其功能片段或根据权利要求38-40中的任一项所述的修饰形式作为活性成分。
42.根据权利要求41所述的药物组合物，其中所述药物组合物是抗癌剂。
43.根据权利要求42所述的药物组合物，其中所述癌症是FGFR2-阳性的。
44.一种用于测试或诊断癌症的组合物，所述组合物包含根据权利要求1-30、36和37中的任一项所述的抗体或其功能片段或根据权利要求38-40中的任一项所述的修饰形式。
45.一种组合物，其包含具有人FGFR2 IIIb选择性的抗体或其功能片段，或所述抗体或功能片段的修饰形式。
46.根据权利要求45所述的组合物，其中所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含根据权利要求13所述的CDRH1至CDRH3，所述轻链包含根据权利要求13所述的CDRL1至CDRL3。
47.根据权利要求46所述的组合物，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有由SEQ ID NO: 12 (图20)表示的氨基酸序列，所述轻链可变区具有由SEQ ID NO: 21 (图29)表示的氨基酸序列。
48.根据权利要求46或47所述的组合物，其中所述抗体是嵌合抗体或大鼠抗体。
49.根据权利要求45-48中的任一项所述的组合物，其中所述组合物用于检测或测定人FGFR2 IIIb。
50.一种用于检测或测定人FGFR2 IIIb的方法，所述方法包括下述步骤：使试验样品与根据权利要求45-48中的任一项所述的组合物接触。
51.一种用于检测或测定人FGFR2 IIIc的方法，所述方法包括下述步骤(i)至(iii)：
(i)使试验样品与以下组合物接触，所述组合物包含选择性地结合人FGFR2 IIIb和人FGFR2 IIIc的抗体或其功能片段，或所述抗体或功能片段的修饰形式，以检测或测定所述试验样品中的人FGFR2 IIIb和人FGFR2 IIIc；
(ii)使所述试验样品与根据权利要求45-49中的任一项所述的组合物接触，以检测或测定所述试验样品中的人FGFR2 IIIb；和
(iii)将步骤(i)中的检测或测定的结果与步骤(ii)中的检测或测定的结果进行对比，或从步骤(i)中的检测或测定的结果减去步骤(ii)中的检测或测定的结果，以得到所述试验样品中的人FGFR2 IIIc的检测或测定结果或值。
52.根据权利要求44-49中的任一项所述的组合物或根据权利要求50或51所述的方法，其中所述组合物或所述方法用于诊断或测试人FGFR2-阳性的癌症。
53.一种用于鉴定根据权利要求41-43中的任一项所述的药物组合物的受体个体的方法，所述方法包括下述步骤(i)和(iii)：
(i)使个体衍生的样品与根据权利要求44-49中的任一项所述的组合物接触；和
(ii)当在所述样品中检测出人FGFR2时，确定所述个体是阳性的。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述人FGFR2是人FGFR2 IIIb。
55.根据权利要求53所述的方法，其中所述人FGFR2是人FGFR2 IIIc和人FGFR2 IIIb。
56.根据权利要求44-49中的任一项所述的组合物，其中所述组合物用在根据权利要求53-55中的任一项所述的方法中。
57.根据权利要求53-55中的任一项所述的方法或根据权利要求56所述的组合物，其中所述个体患有癌症或者处于癌症的风险中。
58.根据权利要求41-43中的任一项所述的药物组合物，其中将所述药物组合物施用给通过根据权利要求53-55中的任一项所述的方法鉴定为阳性的个体。
59.一种试剂，其包含根据权利要求1-30、36和37中的任一项所述的抗体或其功能片段或根据权利要求38-40中的任一项所述的修饰形式。
60.一种用于鉴定具有抗肿瘤活性的物质的方法，所述方法包括下述步骤(i)至(iii)：
(i)使试验物质与以下蛋白接触，所述蛋白包含由SEQ ID NO: 70 (图78)表示的氨基酸序列中的氨基酸位置155处的酪氨酸(Tyr)至氨基酸位置217处的异亮氨酸(Ile)；
(ii)测量或确定所述物质与所述蛋白中由SEQ ID NO: 70表示的氨基酸序列中的以下氨基酸中的每一个之间的距离：在残基155处的酪氨酸(Tyr)、在残基157处的苏氨酸(Thr)、在残基176处的赖氨酸(Lys)、在残基181处的丙氨酸(Ala)、在残基182处的甘氨酸(Gly)、在残基183处的甘氨酸(Gly)、在残基184处的天冬酰胺(Asn)、在残基185处的脯氨酸(Pro)、在残基186处的甲硫氨酸(Met)、在残基188处的苏氨酸(Thr)、在残基200处的谷氨酰胺(Gln)、在残基201处的谷氨酸(Glu)、在残基205处的甘氨酸(Gly)、在残基206处的甘氨酸(Gly)、在残基208处的赖氨酸(Lys)、在残基209处的缬氨酸(Val)、在残基210处的精氨酸(Arg)、在残基211处的天冬酰胺(Asn)、在残基212处的谷氨酰胺(Gln)、在残基213处的组氨酸(His)、在残基214处的色氨酸(Trp)和在残基217处的异亮氨酸(Ile)；和
(iii)当所述物质与所述残基中的每一个具有相互作用距离时，确定所述物质是阳性的。
61.根据权利要求60所述的方法，所述方法进一步包括下述步骤(iv)：
(iv)测定所述物质的抗肿瘤活性。
62.根据权利要求60或61所述的方法，其中所述物质是抗体或其功能片段，或所述抗体或功能片段的修饰形式，或肽。
63.一种用于生产在根据权利要求60或61所述的步骤(iii)中确定为阳性的物质的方法，所述方法包括：通过包括基因重组、肽合成或体外翻译的步骤，制备所述物质。
64.根据权利要求41-43和58中的任一项所述的药物组合物，所述药物组合物进一步包含其它药物。
65.根据权利要求1-30、36和37中的任一项所述的抗体或其功能片段，或根据权利要求38-40中任一项所述的修饰形式，其中所述抗体、所述功能片段或所述修饰形式与其它化合物缀合。
66.根据权利要求41-43、58和64中的任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含根据权利要求65所述的抗体、功能片段或修饰形式。
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