JP2016175893A - 抗robo4抗体 - Google Patents
抗robo4抗体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2016175893A JP2016175893A JP2016038918A JP2016038918A JP2016175893A JP 2016175893 A JP2016175893 A JP 2016175893A JP 2016038918 A JP2016038918 A JP 2016038918A JP 2016038918 A JP2016038918 A JP 2016038918A JP 2016175893 A JP2016175893 A JP 2016175893A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- seq
- antibody
- acid sequence
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 101000650590 Homo sapiens Roundabout homolog 4 Proteins 0.000 claims abstract description 77
- 102000049707 human ROBO4 Human genes 0.000 claims abstract description 75
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims abstract description 60
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 31
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 20
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 claims abstract description 9
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 384
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 309
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 222
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 171
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 170
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 120
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 87
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 82
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 79
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 63
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 62
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 57
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 49
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 49
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 33
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 32
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 claims description 27
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 16
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 16
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 14
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 12
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 12
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 11
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 claims description 8
- 230000010595 endothelial cell migration Effects 0.000 claims description 8
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 7
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 7
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 7
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 7
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 7
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 6
- VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N (3e)-3-(1h-imidazol-5-ylmethylidene)-1h-indol-2-one Chemical compound O=C1NC2=CC=CC=C2\C1=C/C1=CN=CN1 VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N 0.000 claims description 5
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 claims description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 claims description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims description 3
- 230000009435 amidation Effects 0.000 claims description 2
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 2
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 claims 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 291
- 102100027701 Roundabout homolog 4 Human genes 0.000 abstract description 197
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 87
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 63
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 abstract description 48
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 40
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 abstract description 19
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 abstract description 19
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 abstract description 18
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 abstract description 18
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 abstract description 10
- 108700011893 Slit homolog 2 Proteins 0.000 abstract description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 abstract description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 239
- 101710168584 Roundabout homolog 4 Proteins 0.000 description 209
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 81
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 81
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 74
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 51
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 49
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 46
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 42
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 38
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 38
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 36
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 34
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 33
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 32
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 31
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 31
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 description 31
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 description 31
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 31
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 27
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 26
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 24
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 24
- 239000000047 product Substances 0.000 description 24
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 23
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 23
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 22
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 22
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 22
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 21
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 20
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 18
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 18
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 18
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 18
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 18
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 17
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 17
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 17
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 16
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 16
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 16
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 16
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 16
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 15
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 15
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 15
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 15
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 15
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 15
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 15
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 14
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 14
- 101000650588 Homo sapiens Roundabout homolog 3 Proteins 0.000 description 13
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 13
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 12
- 101000650697 Homo sapiens Roundabout homolog 2 Proteins 0.000 description 12
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 12
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 12
- 208000001344 Macular Edema Diseases 0.000 description 12
- 206010025415 Macular oedema Diseases 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 12
- 201000010230 macular retinal edema Diseases 0.000 description 12
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 11
- 101100145112 Mus musculus Robo4 gene Proteins 0.000 description 11
- 101100145113 Rattus norvegicus Robo4 gene Proteins 0.000 description 11
- 206010038934 Retinopathy proliferative Diseases 0.000 description 11
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 11
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 11
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 11
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 11
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 11
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 11
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 10
- 208000005590 Choroidal Neovascularization Diseases 0.000 description 10
- 206010060823 Choroidal neovascularisation Diseases 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 208000000208 Wet Macular Degeneration Diseases 0.000 description 10
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 10
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 10
- 201000003142 neovascular glaucoma Diseases 0.000 description 10
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 101100075829 Caenorhabditis elegans mab-3 gene Proteins 0.000 description 9
- 101100476210 Caenorhabditis elegans rnt-1 gene Proteins 0.000 description 9
- 101150050515 Robo4 gene Proteins 0.000 description 9
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 9
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 9
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 9
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 9
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 9
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 9
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 8
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 8
- 101100145104 Homo sapiens ROBO1 gene Proteins 0.000 description 8
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 8
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 8
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 8
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 8
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 8
- 208000038016 acute inflammation Diseases 0.000 description 8
- 230000006022 acute inflammation Effects 0.000 description 8
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 8
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 8
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 8
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 8
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 8
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 201000011066 hemangioma Diseases 0.000 description 8
- 102000057872 human ROBO2 Human genes 0.000 description 8
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 8
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 8
- 108700002783 roundabout Proteins 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 7
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 7
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 7
- 230000009471 action Effects 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 7
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000056697 human ROBO3 Human genes 0.000 description 7
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 7
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 7
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 7
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 7
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 6
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 6
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 6
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 6
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 6
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 5
- 108010081589 Becaplermin Proteins 0.000 description 5
- 102100021866 Hepatocyte growth factor Human genes 0.000 description 5
- 101000898034 Homo sapiens Hepatocyte growth factor Proteins 0.000 description 5
- 101001076408 Homo sapiens Interleukin-6 Proteins 0.000 description 5
- 101000868152 Homo sapiens Son of sevenless homolog 1 Proteins 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 102100027488 Roundabout homolog 3 Human genes 0.000 description 5
- 102100027340 Slit homolog 2 protein Human genes 0.000 description 5
- 101150085024 Slit2 gene Proteins 0.000 description 5
- 102100021669 Stromal cell-derived factor 1 Human genes 0.000 description 5
- 101710088580 Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 5
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 5
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 5
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 5
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N monopropylene glycol Natural products CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002997 ophthalmic solution Substances 0.000 description 5
- 229940054534 ophthalmic solution Drugs 0.000 description 5
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 5
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 5
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 4
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 4
- 101000650694 Homo sapiens Roundabout homolog 1 Proteins 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 4
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 4
- 108010052090 Renilla Luciferases Proteins 0.000 description 4
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 4
- 102100027702 Roundabout homolog 1 Human genes 0.000 description 4
- 102100027739 Roundabout homolog 2 Human genes 0.000 description 4
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 4
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 4
- -1 carrier Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 4
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 3
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 3
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 3
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 3
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 3
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 3
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 description 3
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000000795 conjunctiva Anatomy 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000014399 negative regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 3
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 3
- 201000007914 proliferative diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- LSIXBBPOJBJQHN-UHFFFAOYSA-N 2,3-Dimethylbicyclo[2.2.1]hept-2-ene Chemical compound C1CC2C(C)=C(C)C1C2 LSIXBBPOJBJQHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WRMNZCZEMHIOCP-UHFFFAOYSA-N 2-phenylethanol Chemical compound OCCC1=CC=CC=C1 WRMNZCZEMHIOCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UPXRTVAIJMUAQR-UHFFFAOYSA-N 4-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-1-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound C1C(C(O)=O)N(C(=O)OC(C)(C)C)CC1NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 UPXRTVAIJMUAQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 2
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 2
- LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 8-azaguanine Chemical compound NC1=NC(O)=C2NN=NC2=N1 LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005508 8-azaguanine Drugs 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 238000000035 BCA protein assay Methods 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 2
- 239000012739 FreeStyle 293 Expression medium Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016844 Immunoglobulin-like domains Human genes 0.000 description 2
- 108050006430 Immunoglobulin-like domains Proteins 0.000 description 2
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 2
- 241001421711 Mithras Species 0.000 description 2
- 101150046281 NIP4-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 208000034038 Pathologic Neovascularization Diseases 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 description 2
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002583 angiography Methods 0.000 description 2
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N caffeine Chemical compound CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N=CN2C RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 2
- 230000001497 fibrovascular Effects 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000005067 joint tissue Anatomy 0.000 description 2
- 229960004184 ketamine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 2
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 2
- 229960004882 medetomidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- VPNGEIHDPSLNMU-UHFFFAOYSA-N medetomidine hydrochloride Chemical compound Cl.C=1C=CC(C)=C(C)C=1C(C)C1=CNC=N1 VPNGEIHDPSLNMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 229960003733 phenylephrine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- OCYSGIYOVXAGKQ-FVGYRXGTSA-N phenylephrine hydrochloride Chemical compound [H+].[Cl-].CNC[C@H](O)C1=CC=CC(O)=C1 OCYSGIYOVXAGKQ-FVGYRXGTSA-N 0.000 description 2
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 229920006316 polyvinylpyrrolidine Polymers 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XXLWNLKEOWWHDC-UHFFFAOYSA-N 1-(4-chlorophenyl)-n-methylpropan-2-amine Chemical compound CNC(C)CC1=CC=C(Cl)C=C1 XXLWNLKEOWWHDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- BFFPVEVGHKMWLT-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3,7-dihydropurin-6-one;3,7-dihydropurin-6-one Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2.O=C1NC(N)=NC2=C1NC=N2 BFFPVEVGHKMWLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HQFLTUZKIRYQSP-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC=C2N(CC)CSC2=C1 HQFLTUZKIRYQSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 229920001342 Bakelite® Polymers 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- GHXZTYHSJHQHIJ-UHFFFAOYSA-N Chlorhexidine Chemical compound C=1C=C(Cl)C=CC=1NC(N)=NC(N)=NCCCCCCN=C(N)N=C(N)NC1=CC=C(Cl)C=C1 GHXZTYHSJHQHIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- DWGWCWDDNTVOGF-UHFFFAOYSA-N Cl.Cl.Cl.Cl.Cl.Cl Chemical compound Cl.Cl.Cl.Cl.Cl.Cl DWGWCWDDNTVOGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 239000001116 FEMA 4028 Substances 0.000 description 1
- 102000002090 Fibronectin type III Human genes 0.000 description 1
- 108050009401 Fibronectin type III Proteins 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101001052035 Homo sapiens Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- LPHGQDQBBGAPDZ-UHFFFAOYSA-N Isocaffeine Natural products CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N(C)C=N2 LPHGQDQBBGAPDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- 102220470475 L-seryl-tRNA(Sec) kinase_C57L_mutation Human genes 0.000 description 1
- GSDSWSVVBLHKDQ-JTQLQIEISA-N Levofloxacin Chemical compound C([C@@H](N1C2=C(C(C(C(O)=O)=C1)=O)C=C1F)C)OC2=C1N1CCN(C)CC1 GSDSWSVVBLHKDQ-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 206010027480 Metastatic malignant melanoma Diseases 0.000 description 1
- 208000006550 Mydriasis Diseases 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical group CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 229930182474 N-glycoside Natural products 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 241000287462 Phalacrocorax carbo Species 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000004696 Poly ether ether ketone Substances 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- BGDKAVGWHJFAGW-UHFFFAOYSA-N Tropicamide Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(CO)C(=O)N(CC)CC1=CC=NC=C1 BGDKAVGWHJFAGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000002156 adsorbate Substances 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000007801 affinity label Substances 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011126 aluminium potassium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000036592 analgesia Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 229960003589 arginine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- RMTNSIBBWXZNDC-UHFFFAOYSA-N argon;hydrochloride Chemical compound Cl.[Ar] RMTNSIBBWXZNDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NC1=CC=CC=C1N RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JUPQTSLXMOCDHR-UHFFFAOYSA-N benzene-1,4-diol;bis(4-fluorophenyl)methanone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1.C1=CC(F)=CC=C1C(=O)C1=CC=C(F)C=C1 JUPQTSLXMOCDHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960004365 benzoic acid Drugs 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N beta-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N 0.000 description 1
- 235000011175 beta-cyclodextrine Nutrition 0.000 description 1
- 229960004853 betadex Drugs 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007321 biological mechanism Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000004067 bulking agent Substances 0.000 description 1
- 229960001948 caffeine Drugs 0.000 description 1
- VJEONQKOZGKCAK-UHFFFAOYSA-N caffeine Natural products CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1C=CN2C VJEONQKOZGKCAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N calcein am Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O)=C(OC(C)=O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(=O)C)C(OC(C)=O)=C1 BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 229960003260 chlorhexidine Drugs 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 229940107161 cholesterol Drugs 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000001447 compensatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 235000021310 complex sugar Nutrition 0.000 description 1
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000447 dimerizing effect Effects 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FCZCIXQGZOUIDN-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-diethoxyphosphinothioyloxyacetate Chemical compound CCOC(=O)COP(=S)(OCC)OCC FCZCIXQGZOUIDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 238000001400 expression cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000000744 eyelid Anatomy 0.000 description 1
- 235000021050 feed intake Nutrition 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000000893 fibroproliferative effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 description 1
- 229960002163 hydrogen peroxide Drugs 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 229960003376 levofloxacin Drugs 0.000 description 1
- SUIQUYDRLGGZOL-RCWTXCDDSA-N levofloxacin hemihydrate Chemical compound O.C([C@@H](N1C2=C(C(C(C(O)=O)=C1)=O)C=C1F)C)OC2=C1N1CCN(C)CC1.C([C@@H](N1C2=C(C(C(C(O)=O)=C1)=O)C=C1F)C)OC2=C1N1CCN(C)CC1 SUIQUYDRLGGZOL-RCWTXCDDSA-N 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000002796 luminescence method Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000012931 lyophilized formulation Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 208000021039 metastatic melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000000649 photocoagulation Effects 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920002530 polyetherether ketone Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229940068965 polysorbates Drugs 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229940050271 potassium alum Drugs 0.000 description 1
- GRLPQNLYRHEGIJ-UHFFFAOYSA-J potassium aluminium sulfate Chemical compound [Al+3].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O GRLPQNLYRHEGIJ-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 235000010232 propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004405 propyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000006318 protein oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 1
- 229960003876 ranibizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 208000037921 secondary disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000003685 thermal hair damage Effects 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- ODLHGICHYURWBS-LKONHMLTSA-N trappsol cyclo Chemical compound CC(O)COC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)COCC(O)C)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1COCC(C)O ODLHGICHYURWBS-LKONHMLTSA-N 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 229960000281 trometamol Drugs 0.000 description 1
- 229960004791 tropicamide Drugs 0.000 description 1
- 229940070684 tropicamide 5 mg/ml Drugs 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 210000004127 vitreous body Anatomy 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 1
- 229940072358 xylocaine Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
- A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/10—Antioedematous agents; Diuretics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/75—Agonist effect on antigen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
Abstract
Description
(1)下記(I)〜(III)記載の性質を有する抗体又はその機能断片:
(I)好適には1x10−8以下のKD値で、特に好適には5x10−9以下のKD値でROBO4蛋白質に結合する、
(II)イン・ビトロにおいて、クロスリンク抗体非存在下で血管内皮細胞遊走を抑制又は阻害する、及び
(III)イン・ビボにおいて、血管新生を抑制又は阻害する、
(2)ROBO4蛋白質が、ヒトROBO4蛋白質である、(1)に記載の抗体又はその機能断片、
(3)ROBO4蛋白質が、配列表の配列番号2のアミノ酸番号1〜1007のアミノ酸配列からなる蛋白質である、(1)に記載の抗体又はその機能断片、
(4)ROBO4蛋白質が、配列表の配列番号2のアミノ酸番号46〜1007のアミノ酸配列からなる蛋白質である、(1)に記載の抗体又はその機能断片、
(5)配列表の配列番号2のアミノ酸番号132〜209のアミノ酸配列からなる部位に結合する、(3)又は(4)に記載の抗体又はその機能断片、
(6)モノクローナル抗体又はその機能断片である、上記(1)に記載の抗体又はその機能断片、
(7)抗体が、配列表の配列番号44(図25)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1、配列表の配列番号46(図26)に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRH2、及び配列表の配列番号48(図27)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖、並びに、配列表の配列番号50(図28)に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1〜3個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRL1、配列表の配列番号52(図29)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2、及び配列表の配列番号54(図30)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖からなる、上記(1)〜(6)のいずれか一つに記載の抗体又はその機能断片、
(8)抗体が、配列表の配列番号44(図25)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1、配列表の配列番号46(図26)に示されるアミノ酸配列又は配列表の配列番号68(図44)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH2、及び配列表の配列番号48(図27)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖、並びに、配列表の配列番号50(図28)に示されるアミノ酸配列又は配列表の配列番号70(図46)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1、配列表の配列番号52(図29)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2、及び配列表の配列番号54(図30)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖からなる、(1)〜(7)のいずれか一つに記載の抗体又はその機能断片、
(9)抗体が、配列表の配列番号31(図16)に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列表の配列番号33(図18)に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、(1)〜(7)のいずれか一つに記載の抗体又はその機能断片、
(10)抗体が、下記a)〜d)より選択されるいずれか一つの重鎖可変領域、及びe)又はf)から選択される軽鎖可変領域を含む、上記(1)〜(8)のいずれか一つに記載の抗体又はその機能断片:
a)配列表の配列番号56(図32)のアミノ酸番号20〜137に示されるアミノ酸配列からなる重鎖(hMAb1−H1タイプ)可変領域、
b)配列表の配列番号58(図34)のアミノ酸番号20〜137に示されるアミノ酸配列からなる重鎖(hMAb1−H2タイプ)可変領域、
c)配列表の配列番号60(図36)のアミノ酸番号20〜137に示されるアミノ酸配列からなる重鎖(hMAb1−H3タイプ)可変領域、及び
d)配列表の配列番号62(図38)のアミノ酸番号20〜137に示されるアミノ酸配列からなる重鎖(hMAb1−H4タイプ)可変領域;並びに
e)配列表の配列番号64(図40)のアミノ酸番号21〜134に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖(hMAb1−L1タイプ)可変領域、及び
f)配列表の配列番号66(図42)のアミノ酸番号21〜134に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖(hMAb1−L2タイプ)可変領域、
(11)抗体が、下記1)〜6)に記載の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の組合せのいずれか一つを含む、上記(1)〜(8)のいずれか一つに記載の抗体又はその機能断片:
1)配列表の配列番号58(図34)のアミノ酸番号20〜137に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列表の配列番号64(図40)のアミノ酸番号21〜134に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
2)配列表の配列番号58(図34)のアミノ酸番号20〜137に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列表の配列番号66(図42)のアミノ酸番号21〜134に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
3)配列表の配列番号62(図38)のアミノ酸番号20〜137に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列表の配列番号66(図42)のアミノ酸番号21〜134に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
4)配列表の配列番号62(図38)のアミノ酸番号20〜137に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列表の配列番号64(図40)のアミノ酸番号21〜134に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
5)配列表の配列番号56(図32)のアミノ酸番号20〜137に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列表の配列番号64(図40)のアミノ酸番号21〜134に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、及び
6)配列表の配列番号60(図36)のアミノ酸番号20〜137に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列表の配列番号64(図40)のアミノ酸番号21〜134に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(12)キメラ抗体又はその機能断片である、上記(1)〜(11)のいずれか一つに記載の抗体又はその機能断片、
(13)ヒト化抗体又はその機能断片である、上記(1)〜(11)のいずれか一つに記載の抗体又はその機能断片、
(14)抗体が、ヒトIgG1又はヒトIgG2の重鎖定常領域を含む、上記(1)〜(13)のいずれか一つに記載の抗体又はその機能断片、
(15)上記(7)〜(14)に記載のいずれか一つの抗体が認識する抗原上の部位に結合する、上記(1)〜(6)のいずれか一つに記載の抗体又はその機能断片、
(16) ROBO4蛋白質への結合に対して、上記(7)〜(14)に記載のいずれか一つの抗体と競合する、(1)〜(6)のいずれか一つに記載の抗体又はその機能断片、
(17)下記1)〜6)に記載の重鎖及び軽鎖の組合せのいずれか一つを含む、上記(1)〜(8)のいずれか一つに記載の抗体:
1)配列表の配列番号58(図34)のアミノ酸番号20〜463に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号64(図40)のアミノ酸番号21〜239に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖(H−1140)、
2)配列表の配列番号58(図34)のアミノ酸番号20〜463に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号66(図42)のアミノ酸番号21〜239に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖(H−1143)、
3)配列表の配列番号62(図38)のアミノ酸番号20〜463に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号66(図42)のアミノ酸番号21〜239に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖(H−2143)、
4)配列表の配列番号62(図38)のアミノ酸番号20〜463に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号64(図40)のアミノ酸番号21〜239に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖(H−2140)、
5)配列表の配列番号56(図32)のアミノ酸番号20〜463に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号64(図40)のアミノ酸番号21〜239に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖(H−1040)、及び
6)配列表の配列番号60(図36)のアミノ酸番号20〜463に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号64(図40)のアミノ酸番号21〜239に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖(H−2040)、
(18)上記(17)に記載のいずれか一つの抗体の重鎖の修飾体を含む抗体であって、該修飾体が、1〜数個の該重鎖のカルボキシル末端側のアミノ酸、好適には、1〜8個の該重鎖のカルボキシル末端側のアミノ酸、より好適には、1〜2個の該重鎖のカルボキシル末端側のアミノ酸を欠失している、抗体、
(19)(17)に記載のいずれか一つの抗体とアミノ酸配列が95%以上同一であり、ヒトROBO4に対して1x10−8以下のKD値を有し、イン・ビトロにおいてクロスリンク抗体非存在下で血管内皮細胞遊走を抑制又は阻害し、且つイン・ビボにおいて血管新生を抑制又は阻害する、(1)〜(6)のいずれか一つに記載の抗体、
(20)ヒト抗体又はその機能断片である、(15)に記載の抗体又はその機能断片、
(21)下記(I)〜(III)からなる群より選択されるヌクレオチド配列:
(I)上記(1)〜(20)のいずれか一つに記載の抗体の重鎖または軽鎖の一部または全部のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチド配列、
(II)上記(1)〜(20)のいずれか一つに記載の抗体の重鎖または軽鎖の一部または全部のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列からなるヌクレオチド配列、及び
(III)上記(1)〜(20)のいずれか一つに記載の抗体の重鎖または軽鎖の一部または全部のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるヌクレオチド配列、
(22)上記(21)記載のヌクレオチド配列が挿入された組換えベクター、
(23)上記(21)記載のヌクレオチド又は上記(22)記載の組換えベクターが導入された組換え細胞、
(24)好適には哺乳動物細胞、より好適にはCHO細胞、より一層好適にはCHOK1SVである、上記(1)〜(20)のいずれか一つに記載の抗体を産生する細胞、
(25)下記の工程(I)及び(II)を含む、上記(1)〜(20)のいずれか一つに記載の抗体又はその機能断片の製造方法:
(I)上記(23)又は(24)記載の細胞を培養する工程;及び
(II)前記工程(I)で得られた培養物から上記(1)〜(20)のいずれか一つに記載の抗体又はその機能断片を回収する工程、
(26)上記(25)に記載の製造方法により製造された抗体又はその機能断片、
(27)上記(1)〜(20)及び(26)のいずれか一つに記載の抗体又はその機能断片の修飾体、
(28)上記(1)〜(20)及び(26)のいずれか一つに記載の抗体もしくはその機能断片、または上記(27)記載の修飾体を有効成分として含んでなる医薬組成物、
(29)血管新生性疾患の治療薬または予防薬である、上記(28)に記載の医薬組成物、
(30)血管新生性疾患が滲出型加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、良性もしくは悪性の腫瘍、アテローム性動脈硬化症、水晶体後部線維増殖症、血管腫、慢性炎症、眼内新生血管疾患、増殖性網膜症、血管新生緑内障、移植角膜組織もしくは他の移植組織の免疫拒絶、関節リウマチ、乾癬、急性炎症、敗血症、又は、肥満症である、上記(28)記載の医薬組成物、
(31)血管新生性疾患が滲出型加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、水晶体後部線維増殖症、眼内新生血管疾患、増殖性網膜症、血管新生緑内障、又は移植角膜組織の免疫拒絶である、上記(28)記載の医薬組成物、
(32)上記(1)〜(20)及び(26)のいずれか一つに記載の抗体もしくはその機能断片、または(27)記載の修飾体を有効成分として含んでなる血管新生阻害剤、
(33)上記(1)〜(20)及び(26)のいずれか一つに記載の抗体もしくはその機能断片又は上記(27)記載の修飾体、又は上記(28)〜(31)のいずれか一つに記載の組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、血管新生性疾患を治療又は予防するための方法であって、好適には、血管新生性疾患が、ROBO4蛋白質の発現を有する個体における血管新生性疾患である、方法、及び
(34)好適には血管新生抑制薬、抗炎症薬及び/又は抗がん薬であるさらなる治療薬又は予防薬と併用される、上記(28)〜(31)のいずれか一つに記載の医薬組成物
に関する。
本発明において、「遺伝子」とは、蛋白質のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチドもしくはヌクレオチド配列、またはその相補鎖を意味し、例えば、蛋白質のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド配列またはその相補鎖であるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、DNA、mRNA、cDNA、cRNA等は「遺伝子」の意味に含まれる。かかる遺伝子は一本鎖、二本鎖又は三本鎖以上のヌクレオチド配列であり、DNA鎖とRNA鎖の会合体、一本のヌクレオチド鎖上にリボヌクレオチド(RNA)とデオキシリボヌクレオチド(DNA)が混在するもの及びそのようなヌクレオチド鎖を含む二本鎖又は三本鎖以上のヌクレオチド配列も「遺伝子」の意味に含まれる。本発明の「ROBO4遺伝子」としては、例えば、ROBO4蛋白質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれるDNA、mRNA、cDNA、cRNA等をあげることができる。
本明細書において、「ROBO4」と「ROBO4蛋白質」は同義で用いている。
本発明のROBO4蛋白質は以下の性質を有する。
(i)ROBO4は分子量約110kDaの1回膜貫通構造を有し、且つ、血管新生に関与するSLIT2蛋白質の受容体蛋白質である。本発明のROBO4蛋白質は、いずれも細胞膜等の膜から遊離した形状で存在し得るが、細胞膜等の膜に結合した形状であってもよい。ここでいう分子量とは、SDS−PAGEにおける非還元状態下での見かけ上の分子量を意味する。ROBO4のN末端側の細胞外領域には、2カ所の免疫グロブリン様ドメイン(以下、「Ig様ドメイン」という)と2カ所のフィブロネクチンタイプIIIドメインが存在し、C末端側の細胞内領域にはプロリンリッチ領域が存在している。本明細書において、これら2カ所の免疫グロブリン様ドメインをそれぞれアミノ末端側からIg様ドメイン1及びIg様ドメイン2という。ヒトROBO4蛋白質は配列表の配列番号2のアミノ酸番号28〜1007のアミノ酸配列からなる。配列表の配列番号2のアミノ酸番号1〜27は分泌シグナルであり、そのアミノ酸番号28〜467は細胞外領域であり、そのアミノ酸番号46〜131はIg様ドメイン1であり、そのアミノ酸番号137〜224はIg様ドメイン2であり、そのアミノ酸番号252〜340はフィブロネクチンタイプIIIドメイン1であり、そのアミノ酸番号347〜438はフィブロネクチンタイプIIIドメイン2であり、そのアミノ酸番号468〜490は細胞膜内領域であり、そのアミノ酸番号491〜1007は細胞内領域である。
(ii)ROBO4は血管新生抑制作用を有する。本発明において「血管新生抑制」とは、分子が単独で、他の因子と共同して、または、他の因子との会合体として、直接に又は間接的に、血管新生を抑制及び/又は阻害することを意味する。血管新生抑制作用は、たとえばVEGFによる血管透過性亢進、細胞遊走促進活性、又は管腔形成活性に対する抑制作用を指標として評価することができる。
(iii)ROBO4は次の(a)〜(e)のいずれか一つに記載のアミノ酸配列(以下、「ROBO4アミノ酸配列」という)を含んでなるか、ROBO4アミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなるか、またはROBO4アミノ酸配列からなる:
(a)配列表の配列番号2(図14)で示されるアミノ酸配列;
(b)配列表の配列番号2(図14)で示されるアミノ酸配列と80%以上、82%以上、84%以上、86%以上、88%以上、90%以上、92%以上、94%以上、96%以上、98%以上又は99%以上の配列同一性を示し且つ血管新生抑制作用を示すポリペプチドのアミノ酸配列;
(c)配列表の配列番号2(図14)で示されるアミノ酸配列において1〜50個、1〜45個、1〜40個、1〜35個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、1〜10個、1〜8個、1〜6個、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1若しくは2個、または1個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入してなるアミノ酸配列を含み、且つ、血管新生を抑制するポリペプチドのアミノ酸配列;
(d)配列表の配列番号2のアミノ酸番号1〜45又は1〜131が欠失してなるアミノ酸配列を含み、且つ、血管新生を抑制するポリペプチドのアミノ酸配列;及び、
(e)配列表の配列番号2(図14)で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチドのヌクレオチド配列によりコードされ、且つ、血管新生を抑制するポリペプチドのアミノ酸配列。
(iv)本発明のROBO4蛋白質は、脊椎動物、好適には哺乳動物、より好適にはマウスもしくはラット等のげっ歯類又はヒト、より一層好適にはヒト又はマウスの組織、かかる組織由来の細胞、かかる細胞の培養物等より得ることができる。かかる組織及び細胞としては、ROBO4蛋白質が存在すれば特に限定されるものではないが、例えば、関節組織、血液、リンパ液、胸腺、脾臓、それらのいずれかに由来する細胞等をあげることができる。好適な組織及び細胞は、血管新生が生じている動物又は患者に由来する組織及び細胞である。ただし、本発明のROBO4蛋白質の由来は、前記のものに限定されず、他の動物種、他の組織、他の細胞等に由来するものであっても、上記(i)〜(iii)記載の性質を具備していれば本発明のROBO4蛋白質の意味に含まれる。
本発明のROBO4遺伝子は、次の(a)〜(c)のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列(以下、「ROBO4遺伝子配列」という)を含んでなるか、ROBO4遺伝子配列を含むヌクレオチド配列からなるか、またはROBO4遺伝子配列からなる:
(a)配列表の配列番号1(図13)で示されるヌクレオチド配列;
(b)配列表の配列番号1(図13)で示されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし且つ血管新生を抑制するポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;及び
(c)配列表の配列番号1(図13)で示されるヌクレオチド配列において1〜150個、1〜140個、1〜130個、1〜120個、1〜110個、1〜100個、1〜90個、1〜80個、1〜70個、1〜60個、1〜50個、1〜45個、1〜40個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、1〜10個、1〜8個、1〜6個、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1若しくは2個、または1個の塩基が置換、欠失、付加または挿入してなるヌクレオチド配列を含み、且つ血管新生を抑制するポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
本発明のROBO4蛋白質は、動物組織(体液を含む)、該組織由来の細胞もしくは該細胞培養物から精製又は単離することができ、遺伝子組換え、イン・ビトロ翻訳、化学合成等により調製することができる。
天然型ROBO4蛋白質は、例えば滲出型加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、良性又は悪性の腫瘍、アテローム性動脈硬化症、水晶体後部線維増殖症、血管腫、慢性炎症、眼内新生血管疾患、増殖性網膜症、血管新生緑内障、移植角膜組織又は他の移植組織の免疫拒絶、関節リウマチ、乾癬、急性炎症、敗血症、肥満等の血管新生性疾患に罹患した患者又は非ヒト動物に由来する組織(体液、細胞等を含む)、かかる組織に由来する細胞、かかる細胞の培養物等より精製又は単離することができる。かかる非ヒト動物には該疾患モデル動物も含まれる。モデルの作製に供する動物としては、脊椎動物であればとくに限定されないが、好適には哺乳動物であり、より好適にはマウスやラット等のげっ歯類であり、より一層好適にはマウスまたはラットである。そのような患者又はモデル動物の組織及び細胞としては、ROBO4蛋白質が存在すれば特に限定されるものではないが、例えば、関節組織、血液、リンパ液、胸腺、脾臓、それらのいずれかに由来する細胞等をあげることができる。好適な組織及び細胞は、血管新生を発症しているか類似の症状を呈している患者又はモデル動物に由来するものである。ただし、本発明のROBO4蛋白質の由来は、前記のものに限定されず、他の動物種、他の組織、他の細胞等に由来するものであってもよい。
本発明のROBO4蛋白質は、組換型としても調製することができる。すなわち、ROBO4蛋白質又はROBO4蛋白質断片のアミノ酸配列をコードする遺伝子を宿主細胞に導入し、かかる細胞の培養物からROBO4蛋白質を回収することができる。例えば、ROBO4遺伝子又はその断片を発現ベクターに挿入し、次いで、原核又は真核の宿主細胞に該組換えベクターを導入して得られる組換え細胞を保温すれば、該細胞にROBO4蛋白質を発現させることができる。発現形態としては、分泌発現、細胞内可溶発現、インクルージョンボディー法など当技術分野において公知の形態を用いることができる。また、アミノ末端(N末)及び/又はカルボキシ末端(C末)が天然型と同一の分子のみならず、分泌シグナル、細胞内局在化シグナル、アフィニティー精製用タグ、又はパートナーペプチドとの融合蛋白質として、ROBO4タンパク質を発現させることもできる。かかる組換え細胞培養物からのROBO4蛋白質の精製又は単離は、(2−3−1)天然型ROBO4蛋白質の精製又は単離に記載の分画、クロマトグラフィー等の操作を適宜組み合わせることにより行うことができる。
本発明のROBO4蛋白質はイン・ビトロ翻訳によっても調製することができる。かかる翻訳法としては、転写及び翻訳に必要な酵素、基質並びにエネルギー物質を含む無細胞翻訳系を利用した方法であれば特に限定されるものではないが、例えば、ロシュ・ダイアグノスティックス社製のラピッドトランスレーションシステム(RTS)を利用する方法をあげることができる。
本発明のROBO4蛋白質は化学合成によっても調製することができる。化学合成法としては、例えば、Fmoc合成法、Boc合成法などのペプチド固相合成法をあげることができる。
(3−1)抗ROBO4抗体の種類
本発明の抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれであってもよい。本発明のモノクローナル抗体としては、非ヒト動物由来の抗体(非ヒト動物抗体)、ヒト由来の抗体(ヒト抗体)、キメラ抗体、ヒト化抗体等、好適にはキメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト由来の抗体(ヒト抗体)、より好適にはヒト化抗体、及びヒト由来の抗体(ヒト抗体)をあげることができる。
本発明の抗体はROBO4蛋白質を認識する。言い換えれば、本発明の抗体はROBO4蛋白質に結合する。かかる抗体は「抗ROBO4抗体」と表記される。また、本発明の好適な抗体はROBO4蛋白質を特異的に認識する。言い換えれば、本発明の好適な抗体はROBO4蛋白質に特異的に結合する。さらに、本発明のより好適な抗体はROBO4蛋白質の有するIg様ドメインに特異的に結合する。かかるIg様ドメインとしては、Ig様ドメイン1、Ig様ドメイン2を例示することができ、本発明のより好適な抗体は、配列表の配列番号2のアミノ酸番号132〜209のアミノ酸配列からなる領域を認識する。本発明の抗体は、ヒトROBO4蛋白質、サル、好ましくはカニクイザルROBO4蛋白質、及びウサギROBO4蛋白質に結合するが、マウス及びラットROBO4蛋白質には結合しない(実施例4)−3及び実施例11)−4の種交差性)。
本発明の抗体は、イン・ビトロにおいて、クロスリンク抗体非存在下で血管新生抑制活性を有する。イン・ビトロにおいて、クロスリンク抗体非存在下で薬理活性を示さず、イン・ビボにおいて、クロスリンク抗体非存在下で薬理活性を示す抗体が知られている(Cancer Cell(2011),19,p.101−113)。これは、イン・ビボにおいては、クロスリンク抗体と同様の機能を有するFcγ receptorを発現する白血球が存在するため(Nature(2008),8,p.34−47)、クロスリンク抗体がなくても、白血球存在下でクロスリンクが架かり、薬理活性を示すと考えられる。しかし、実際の生体においては、病変部における白血球数は個体により異なるため(Cancer Res(2011),71,5670−5677)、白血球によるクロスリンクに依存し、薬理活性を示す抗体は、個体によって抗体の効果に違いがでてくることが予想される。本発明の抗体は、イン・ビトロにおいてクロスリンク抗体非存在下でも優れた血管新生抑制活性を示すことから、イン・ビボにおいても白血球数に依存しない血管新生抑制作用を有すると考えられ、医薬として好適である。
本発明の抗体はイン・ビボ(in vivo)で、血管新生を抑制又は阻害する。イン・ビボにおける血管新生抑制又は阻害活性は、定法に従って病態モデル動物により評価することができる。例えば、後述の実施例4)−6に記載のレーザー誘発脈絡膜血管新生モデルは血管新生病態モデルとして広く使用されており、新生血管量をスコアとして評価することができる。患者の場合も、例えば、本発明の抗体の投与前後で、腫瘍患者からバイオプシーで腫瘍検体を採取し、腫瘍内血管の血管密度を免疫組織化学解析(IHC)にて測定し、新生血管量をスコア化することが可能である。
本発明の抗ROBO4抗体は、ROBO4蛋白質により何らかの応答が誘発される細胞株あるいは初代培養細胞を用いた評価系に供されてもよい。そのような細胞株としてはマウス血管内皮細胞株(ATCC NO. CRL−2779)等、初代培養細胞としてはマウス血管内皮細胞やヒト血管内皮細胞等をそれぞれ例示することができる。
MAb1は実施例2に記載の方法により得られた抗ROBO4マウスモノクローナル抗体である。
本発明は一つの態様として、本発明の抗ROBO4抗体の機能断片を提供する。抗体の機能断片とは、該抗体の有する機能の少なくとも一部を保持する断片又は(3−10)に後述のその修飾体を意味する。かかる抗体の機能としては、一般的には、抗原結合活性、抗原の活性を調節する活性、抗体依存性細胞障害活性及び補体依存性細胞傷害活性等を挙げることができる。本発明の抗ROBO4抗体の機能としては、例えば、ROBO4蛋白質結合活性、血管新生抑制活性、ROBO4下流シグナル活性化作用等をあげることができる。より具体的には、本発明のROBO4に対する抗体が示す上記(3−3)〜(3−5)記載の活性の全部又は一部を有する限り、本発明の抗体の機能断片に含まれる。
本発明はその一つの態様において、ヒト化抗体又はその機能断片を提供する。本発明の抗ROBO4ヒト化抗体又はその機能断片は、血管新生抑制活性を有し、好適にはイン・ビボ(in vivo)で血管新生抑制活性を有する。また、かかるヒト化抗体又はその機能断片は、好適にはROBO4蛋白質に特異的に結合する。また、かかるヒト化抗体又はその機能断片は、ROBO4のアゴニスト抗体であり、下流シグナルを活性化する。さらに、イン・ビトロにおいて、クロスリンク抗体非存在下で、血管内皮細胞遊走を抑制又は阻害する。
本発明の提供する抗体と「同一の部位に結合する抗体」も本発明の抗体に含まれる。ある抗体と「同一の部位に結合する抗体」とは、該抗体が認識する抗原分子上の部位に結合する他の抗体を意味する。第一抗体が結合する抗原分子上の部分ペプチド又は部分立体構造に第二抗体が結合すれば、第一抗体と第二抗体は同一の部位に結合すると判定することができる。また、第一抗体の抗原に対する結合に対して第二抗体が競合する、すなわち、第二抗体が第一抗体と抗原の結合を妨げることを確認することによって、具体的な結合部位のペプチド配列又は立体構造が決定されていなくても、第一抗体と第二抗体が同一の部位に結合すると判定することができる。さらに、第一抗体と第二抗体が同一の部位に結合し、且つ第一抗体が血管新生抑制活性など本発明の抗体の一つの態様に特徴的な効果を有する場合、第二抗体も同様の活性を有する蓋然性は極めて高い。従って、第一の抗ROBO4抗体の結合する部位に第二の抗ROBO4抗体が結合すれば、第一抗体と第二抗体がROBO4蛋白質上の同一の部位に結合すると判定することができる。また、第一の抗ROBO4抗体のROBO4蛋白質への結合に対して第二の抗ROBO4抗体が競合することを確認できれば、第一抗体と第二抗体がROBO4蛋白質上の同一の部位に結合する抗体と判定することができる。
本発明は、抗体又はその機能断片の修飾体を提供する。本発明の抗体又はその機能断片の修飾体とは、本発明の抗体又はその機能断片に化学的又は生物学的な修飾が施されてなるものを意味する。化学的な修飾体には、アミノ酸骨格への化学部分の結合を有する修飾体、N−結合またはO−結合炭水化物鎖の化学修飾体等が含まれる。かかる化学部分又は修飾体は毒性又は細胞毒性を有し得る。生物学的な修飾体には、翻訳後修飾(例えば、N−結合またはO−結合への糖鎖付加、N末またはC末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化)されたもの、原核生物宿主細胞を用いて発現させることによりN末にメチオニン残基が付加したもの等が含まれる。また、本発明の抗体または抗原の検出または単離を可能にするために標識されたもの、例えば、酵素標識体、蛍光標識体、アフィニティー標識体もかかる修飾体の意味に含まれる。このような本発明の抗体又はその機能断片の修飾体は、元の本発明の抗体又はその機能断片の安定性又は血中滞留性の改善、抗原性の低減、かかる抗体又は抗原の検出又は単離等に有用である。
(4−1)ハイブリドーマを用いる方法
本発明の抗ROBO4抗体は、コーラーとミルスタインの方法(Kohler and Milstein,Nature (1975)256,p.495−497、Kennet,R.ed.,Monoclonal Antibody,p.365−367,Prenum Press,N.Y.(1980))に従って、ROBO4蛋白質で免疫した動物の脾臓より抗ROBO4抗体の産生細胞を単離し、該細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、かかるハイブリドーマの培養物からモノクローナル抗体を取得することにより作製することができる。
抗ROBO4抗体を作製するための抗原は、本明細書の他の段落に記載された天然型または組換え型のROBO4蛋白質の調製法等に従って、取得することができる。そのようにして調製し得る抗原としては、ROBO4蛋白質若しくはその少なくとも6個の連続した部分アミノ酸配列を含むROBO4蛋白質断片、それらに任意のアミノ酸配列や担体がさらに付加された誘導体等(以下、まとめて「ROBO4抗原」とよぶ)を挙げることができる。
モノクローナル抗体の製造は、通常、下記のような工程を経る:
(a)抗原を調製する工程、
(b)抗体産生細胞を調製する工程、
(c)骨髄腫細胞(以下、「ミエローマ」という)を調製する工程、
(d)抗体産生細胞とミエローマとを融合させる工程、
(e)目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群を選別する工程、及び
(f)単一細胞クローンを得る工程(クローニング)。
抗原は、前記(2−3)記載のROBO4蛋白質の調製法に準じて調製することができる。
工程(a)で得られた抗原と、フロインドの完全又は不完全アジュバント、又はカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物は当技術分野において公知のハイブリドーマ作製法に用いられる動物を、これらに限定されることはないが、使用することができる。具体的には、たとえばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等を使用することができる。ただし、摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性等の観点から、マウス又はラットを被免疫動物とするのが好ましい。
細胞融合に用いるミエローマ細胞には特段の限定はなく、当技術分野において公知の細胞株から適宜選択して用いることができるが、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続が確立しているHGPRT(hypoxanthine−guanine phosphoribosyl transferase)欠損株、すなわちマウス由来のX63−Ag8(X63)、NS1−ANS/1(NS1)、P3X63−Ag8.Ul(P3Ul)、X63−Ag8.653(X63.653)、SP2/0−Ag14(SP2/0)、MPC11−45.6TG1.7(45.6TG)、FO、S149/5XXO、BU.1等、ラット由来の210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3)等、又はヒト由来のU266AR(SKO−007)、GM1500・GTG−A12(GM1500)、UC729−6、LICR−LOW−HMy2(HMy2)、8226AR/NIP4−1(NP41)等を用いるのが好ましい。これらのHGPRT欠損株は例えば、American Type Culture Collection (ATCC)等から入手することができる。
抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、当技術分野において公知の方法(Weir,D.M.,Handbookof Experimental Immunology Vol.I.II.III.,Blackwell Scientific Publications,Oxford(1987)、Kabat,E.A.and Mayer,M.M.,Experimental Immunochemistry,Charles C Thomas Publisher Spigfield,Illinois(1964)等)に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件下で実施することができる。例えば、ポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法等を用いることができる。
細胞融合により得られるハイブリドーマの選択方法は特に制限はないが、通常HAT(ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン)選択法(Kohler et al., Nature(1975)256,p.495;Milstein et al.,Nature(1977)266,p.550)が用いられる。この方法は、アミノプテリンの存在下で生存し得ないHGPRT欠損株のミエローマ細胞を用いてハイブリドーマを得る場合に有効である。すなわち、未融合細胞及びハイブリドーマをHAT培地で培養することにより、アミノプテリンに対する耐性を持ち合わせたハイブリドーマのみを選択的に残存させ、かつ増殖させることができる。
ハイブリドーマのクローニング法としては、例えば、メチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法等の当技術分野において公知の方法を用いることができるが(例えば、Barbara, B.M. and Stanley, M.S.:Selected Methods in Cellular Immunology,W.H. Freeman and Company,San Francisco(1980)参照)、好適には限界希釈法である。
選択されたハイブリドーマを培養することにより、モノクローナル抗体を産生することができるが、好適には所望のハイブリドーマをクローニングしてから抗体の産生に供する。
各種生物試験を目的に応じて選択し、適用することができる。
天然型のROBO4蛋白質を発現する細胞、組換え型ROBO4蛋白質またはその断片を発現する細胞等を免疫原として使用することにより、前記のハイブリドーマ法により抗ROBO4抗体を調製することができる。
本発明の抗体は、その重鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド(重鎖ヌクレオチド)及びその軽鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド(軽鎖ヌクレオチド)、又は、かかる重鎖ヌクレオチドが挿入されたベクター及び軽鎖ヌクレオチドが挿入されたベクターを宿主細胞に導入し、該細胞を培養した後その培養物からかかる抗体を回収することにより調製することができる。一つのベクターに重鎖ヌクレオチド及び軽鎖ヌクレオチドが挿入されていてもよい。
ヒト化抗体としては、CDRが非ヒト動物抗体のCDRに置き換えられているヒト由来の抗体(Nature(1986)321,p.522−525参照)、CDR移植法によりCDRの配列に加え一部のフレームワーク領域のアミノ酸残基も移植したヒト抗体(WO90/07861号、US6972323号公報参照)、それらのヒト化抗体のいずれかにおける非ヒト動物抗体由来の1つまたは2つ以上のアミノ酸がヒト抗体アミノ酸で置換されてなる抗体等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
本発明の抗体としては、さらに、ヒト抗体を挙げることができる。抗ROBO4ヒト抗体とは、ヒト由来の抗体のアミノ酸配列からなる抗ROBO4抗体を意味する。抗ROBO4ヒト抗体は、ヒト抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子を含むヒトゲノムDNA断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法(Tomizuka,K.et al.,Nature Genetics(1997)16,p.133−143,; Kuroiwa,Y.et.al.,Nuc.Acids Res.(1998)26,p.3447−3448;Yoshida, H.et.al.,Animal Cell Technology:Basic and Applied Aspects vol.10,p.69−73(Kitagawa, Y.,Matuda,T.and Iijima,S.eds.),Kluwer Academic Publishers,1999.;Tomizuka,K.et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97,p.722−727等を参照。)によって取得することができる。
一本鎖抗体を作製する方法は当技術分野において周知である(例えば、米国特許第4,946,778号、米国特許第5,260,203号、米国特許第5,091,513号、米国特許第5,455,030号等を参照)。このscFvにおいて、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、コンジュゲートを作らないようなリンカー、好ましくはポリペプチドリンカーを介して連結される(Huston,J.S.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988),85,p.5879−5883)。scFvにおける重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、同一の抗体に由来してもよく、別々の抗体に由来してもよい。
得られた抗体は、均一レベルにまで精製することができる。抗体の分離及び精製は通常の蛋白質で使用されている分離及び精製方法を使用すればよい。
本発明は抗ROBO4抗体もしくはその機能断片またはその修飾体を含む医薬組成物を提供する。
本発明は、本発明の抗ROBO4抗体もしくはその機能断片またはその修飾体を含む検査用または診断用組成物(以下、まとめて「診断用組成物」という)を提供する。
1)−1 ヒトROBO4発現ベクターの作製
1)−1−1 全長ヒトROBO4発現ベクターの作製
ヒトROBO4 cDNA(アクセッションNo.BC039602)を含むプラスミド(Open Biosystems社製)からEcoR V及びNot IでヒトROBO4 cDNAを切り出し、これをpCIベクター(Promega社製)のEcoR V/Not I間に組込むことで、全長ヒトROBO4発現ベクター(以下、「pCI−hROBO4」と記す)を作製した。また本ベクターにクローニングされたヒトROBO4遺伝子の配列は配列表の配列番号1に示されている。また、ヒトROBO4のアミノ酸配列は配列表の配列番号2に示されている。
ヒトROBO4細胞外領域ポリペプチド(配列表の配列番号2のアミノ酸番号1〜461に示されるアミノ酸配列からなる、以下「ヒトROBO4−ECD」と略す)をコードするcDNAをプライマーセット:
プライマー1F:
及び、
プライマー1R:
を用いてPCR反応で増幅した。得られたPCR産物をpEF6/V5−His−TOPOベクター(Life Technologies社製)にクローニングした(以下「pEF6−ROBO4−ECD」と略す。また、以下で「pEF6−ROBO4−ECD」によって発現する組換え蛋白質を「rROBO4−ECD」と記す)。
N末端にFLAG−tagが付加された、ヒトROBO4の配列表の配列番号2のアミノ酸番号28〜1007に示されるアミノ酸配列からなる領域(図中で、「hROBO4−28」と記す。)、アミノ酸番号46〜1007に示されるアミノ酸配列からなる領域(図中で、「hROBO4−46」と記す。)、アミノ酸番号132〜1007に示されるアミノ酸配列からなる領域(図中で、「hROBO4−132」と記す。)、アミノ酸番号210〜1007に示されるアミノ酸配列からなる領域(図中で、「hROBO4−210」と記す。)、アミノ酸番号225〜1007に示されるアミノ酸配列からなる領域(図中で、「hROBO4−225」と記す。)、又はアミノ酸番号341〜1007に示されるアミノ酸配列からなる領域(図中で、「hROBO4−341」と記す。)を含む蛋白質が発現するベクターを構築するため、
hROBO4−28増幅用プライマーセット:
プライマー2F:
及び、
プライマー2R:
、
hROBO4−46増幅用プライマーセット:
プライマー3F:
及び、プライマー2R、
hROBO4−132増幅用プライマーセット:
プライマー4F:
及び、プライマー2R、
hROBO4−210増幅用プライマーセット:
プライマー5F:
及び、プライマー2R、
hROBO4−225増幅用プライマーセット:
プライマー6F:
及び、プライマー2R、
hROBO4−341増幅用プライマーセット:
プライマー7F:
及び、プライマー2R、
のそれぞれのプライマーセットを用いてpCI−hROBO4を鋳型にしてPCR反応を行った。得られたPCR産物をpCR4Blunt−TOPOベクター(Life Technologies社製)に組込み、クローニングベクターを作製した。各クローニングベクターからKpn I及び、Nhe Iで各cDNAを切り出し、これをpCIベクターの Kpn I/Nhe I間に組込むことで、N末端FLAG−tag付加型全長ヒトROBO4発現ベクター及び4つのヒトROBO4細胞外領域/ドメイン欠損体発現ベクターを作製した。N末端FLAG−tag付加型全長ヒトROBO4ベクターは、N末端側からROBO4のシグナル配列(配列表の配列番号2のアミノ酸番号1〜27のアミノ酸)+FLAG配列(DYKDDDDK)+ROBO4(配列表の配列番号2のアミノ酸番号28〜1007のアミノ酸)をコードするヌクレオチドからなる。以下、N末端FLAG−tag付加型全長ヒトROBO4を発現するベクターを「pCI−FLAG−hROBO4−28」という。また、ヒトROBO4細胞外領域/ドメイン欠損体発現ベクター、例えば配列表の配列番号2のアミノ酸番号46〜1007からなるROBO4を発現するベクターは、ROBO4のシグナル配列(配列表の配列番号2のアミノ酸番号1〜27のアミノ酸)+FLAG配列(DYKDDDDK)+細胞外領域欠損ROBO4(配列表の配列番号2のアミノ酸番号46〜1007のアミノ酸)をコードするヌクレオチドからなる。該ベクターを「pCI−hROBO4−46」という。同様に、ROBO4の細胞外領域が一部欠損したROBO4をコードするベクターをそれぞれ、「pCI−hROBO4−132」、「pCI−hROBO4−210」、「pCI−hROBO4−225」、「pCI−hROBO4−341」という。
ヒトROBO4の配列表の配列番号2のアミノ酸番号1〜511に示されるアミノ酸配列からなる領域(以下、「hROBO4−ΔC」と記す。)を含む蛋白質が発現するベクターを構築するため、
hROBO4−ΔC用プライマーセット:
プライマー8F:
及び、
プライマー8R:
、
を用いてpCI−hROBO4を鋳型にしてQuikChange XL Site−Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies社製)でヒトROBO4の511番目のアミノ酸をコードするコドンの直後にストップコドンを挿入することで、hROBO4−ΔC発現ベクターを作製した(以下、「pCI−hROBO4−ΔC」と記す)。
Mouse Heart QUICK−Clone cDNA(タカラバイオ社製)を鋳型にプライマーセット:
プライマー9F:
及び、
プライマー9R:
を用いてPCR反応を行い、得られたPCR産物をpCR−BluntII−TOPOベクター(Life Technologies社製)に組込むことで、マウスROBO4 cDNAを含むクローニングベクターを作製した。クローニングベクターから Kpn I及び Not I でマウスROBO4 cDNA を切り出し、これをpCI ベクターの Kpn I/Not I間に組込むことで、マウスROBO4発現ベクターを作製した(以下、「pCI−mROBO4」と記す)。また本ベクターにクローニングされたマウスROBO4遺伝子のORF部分の配列は配列表の配列番号15のヌクレオチド番号7〜3051に示されている。また、マウスROBO4のアミノ酸配列は配列表の配列番号16に示されている。
Rat Spleen QUICK−Clone cDNA (タカラバイオ社製)を鋳型に、プライマーセット:
プライマー10F:
及び、
プライマー10R:
を用いPCR反応を行い、得られたPCR産物をpCR4Blunt−TOPOベクターに組込むことで、ラットROBO4 cDNAを含むクローニングベクターを作製した。クローニングベクターからKpn I及びNot IでラットROBO4 cDNAを切り出し、これをpCIベクターのKpn I/Not I間に組込むことで、ラットROBO4発現ベクターを作製した(以下、「pCI−raROBO4」と記す)。ラットROBO4のcDNAのヌクレオチド配列を配列表の配列番号17に、当該ヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号18に示した。
カニクイザル腎total RNAより合成したcDNAを鋳型にプライマーセット:
プライマー11F:
及び、
プライマー11R:
を用いPCR反応を行った。得られたPCR産物をpCR4Blunt―TOPOベクターに組込むことで、カニクイザルROBO4 cDNA(以下、cynoROBO4−1又はcynoROBO4−2と記す)をそれぞれ含む2種類のクローニングベクターを作製した(以下、それぞれpCR−cynoROBO4−1及びpCR−cynoROBO4−2と記す)。
プライマー12F:
及び、
プライマー12R:
を用いてPCR反応を行った。得られたPCR産物をpCR4Blunt―TOPOベクターに組込むことで、それぞれのカニクイザルROBO4 cDNAを含むクローニングベクターを作製した。クローニングベクターからBamH I及びNot Iで対応するカニクイザルROBO4 cDNAを切り出し、これをpCIベクターのBamH I/Not I間に組込むことで、2種類のカニクイザルROBO4発現ベクターを作製した(以下、それぞれpCI−cynoROBO4−1及びpCI−cynoROBO4−2と記す)。
プライマー13F:
及び、
プライマー12R
を用いてPCR反応を行った。得られたPCR産物をpCR−TOPOベクター(Life Technologies社製)に組込むことで、N末端FLAG−tag付加型カニクイザルROBO4 cDNAを含む各クローニングベクターを作製した。クローニングベクターからKpn I及びNot Iで対応するカニクイザルROBO4 cDNAを切り出し、これをpCIベクターのKpn I/Not I間に組込むことで、N末端FLAG−tag付加型カニクイザルROBO4発現ベクターを作製した(以下、それぞれ「pCI−FLAG−cynoROBO4−1」及び「pCI−FLAG−cynoROBO4−2」と記す)。また、pCI−FLAG−cynoROBO4−1とpCI−FLAG−cynoROBO4−2の各々にクローニングされたカニクイザルROBO4のcDNAのヌクレオチド配列を配列表の配列番号19と21に、各ヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号20と22にそれぞれ示した。
Human Heart QUICK−Clone cDNA(タカラバイオ社製)を鋳型に、プライマーセット:
プライマー13F:
及び、
プライマー13R:
を用いPCR反応を行い、得られたPCR産物とpDONR221ベクター(Life Technologies社製)とでBP反応を行うことで、ヒトROBO1 cDNAを含むドナーベクターを作製した。
プライマー14F:
及び、
プライマー14R:
を用いPCR反応を行い、得られたPCR産物をpCR4Blunt−TOPOベクターに組込むことで、N末端FLAG−tag付加型ヒトROBO1 cDNAを含むクローニングベクターを作製した。クローニングベクターからNhe I及びNot IでN末端FLAG−tag付加型ヒトROBO1 cDNAを切り出し、これをpCIベクターのNhe I/Not I間に組込むことで、発現ベクターを作製した(以下、「pCI−FLAG−hROBO1」と記す)。N末端FLAG−tag付加型ヒトROBO1のcDNAのヌクレオチド配列を配列表の配列番号23に、当該ヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号24に示した。
Human Lung QUICK−Clone cDNA(タカラバイオ社製)を鋳型に、プライマーセット:
プライマー15F:
及び、
プライマー15R:
を用いPCR反応を行い、得られたPCR産物をpCR4Blunt―TOPOベクターに組込むことで、ヒトROBO2 cDNAを含むクローニングベクターを作製した。クローニングベクターからNot I及びNhe IでヒトROBO2 cDNAを切り出し、これをpCIベクターのNot I/Nhe I間に組込むことで、発現ベクターを作製した(以下、「pCI−hROBO2」と記す)。ヒトROBO2のcDNAのヌクレオチド配列を配列表の配列番号25に、当該ヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号26に示した。
ヒトROBO3/pENTR223.1(Open Biosystems社製)を鋳型に、プライマーセット:
プライマー16F:
及び、
プライマー16R:
を用いPCR反応を行い、得られたPCR産物をpCR4Blunt―TOPOベクターに組込むことで、ヒトROBO3 cDNA を含むクローニングベクターを作製した。クローニングベクターからNot I及びNhe IでヒトROBO3 cDNAを切り出し、これをpCIベクターのNot I/Nhe I間に組込むことで、発現ベクターを作製した(以下、「pCI−hROBO3」と記す)。また本ベクターにクローニングされたヒトROBO3遺伝子のORF部分の配列は配列表の配列番号27のヌクレオチド番号35〜4192に示されている。また、ヒトROBO3のアミノ酸配列は配列表の配列番号28に示されている。
2)−1 抗原蛋白質の調製
rROBO4−ECDを発現させるため、FreeStyle 293−F細胞(Life Technologies社製)にpEF6−ROBO4−ECDを293fectin(Life Technologies社製)を用いてトランスフェクションし、37℃、8% CO2条件下で6日間培養した。培養完了後、遠心分離により培養液を回収し、rROBO4−ECDの精製原料として用いた。得られた培養上清を分子量分画15000の透析チューブを用いて20mM Tris−HCl pH7.5に対して透析し、フィルター濾過(0.45μm)した後、20mM Tris−HCl pH7.5で平衡化されたHiTrap 16/10 Q XL(GE Healthcare Bio−Sciences社製)に添加した。溶出はNaClの段階的溶出(20mM Tris−HCl pH7.5/0.2M NaCl、20mM Tris−HCl pH7.5/1M NaCl)で行った。溶出画分の一部をSDS―ポリアクリルアミドゲル電気泳動(以下「SDS−PAGE」と略す。)で分離後、ゲルにクマシーブリリアントブルー染色(以下「CBB染色」と略す)及びウェスタンブロット法による検出を行い、rROBO4−ECDの含まれる画分を確認した。次にrROBO4−ECDを含む画分を集め、PBSで平衡化されたHiLoad 16/60 Superdex 75pg(GE Healthcare Bio−Sciences社製)に添加した。PBSで溶出し、溶出分画の一部をSDS−PAGEにより分離後、ゲルにCBB染色及びウェスタンブロット法による検出を行い、rROBO4−ECDの含まれる画分を確認した。rROBO4−ECDを含む画分を集め、免疫用抗原及び結合親和性測定時の抗原として使用した。蛋白質濃度はBCA Protein Assay Reagent(Pierce Biotechnology社製)を用いて測定した。
6週齢のBALB/cマウスの雌を使用した。0日目に50μgのrROBO4−ECDとFreund's Complete Adjuvantを混合したものを各マウスの皮下あるいは皮内に投与した。7日目、14日目と21日目に50μgのrROBO4−ECDとFreund's Incomplete Adjuvantを混合したものをマウスの皮下あるいは皮内に投与した。38日目に50μgのrROBO4−ECDをマウスの腹腔内に投与し、42日目にマウスのリンパ節あるいは脾臓を採取しハイブリドーマ作製に用いた。
リンパ節細胞あるいは脾臓細胞とマウスミエローマSP2/0−ag14細胞とをHybrimune Hybridoma Production System(Cyto Pulse Sciences社製)を用いて電気細胞融合し、ClonaCell−HY Selection Medium D(StemCell Technologies社製)に希釈して培養した。出現したハイブリドーマコロニーを回収することでモノクローンハイブリドーマを作製した。回収された各ハイブリドーマコロニーを培養し、得られたハイブリドーマ培養上清を用いて抗ROBO4抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行った。
2)−4−1 Cell−ELISA用抗原遺伝子発現細胞の調製
HEK293細胞を10%FBS含有DMEM培地中7.5×105細胞/mLになるよう調製した。それに対し、Lipofectamine 2000(Life Technologies社製)を用いて、pCI−hROBO4もしくはネガティブコントロールとしてpCI−mockを導入し、96−wellハーフエリアplate(Corning社製)に50μL/wellの濃度で分注し、10%FBS含有DMEM培地中で37℃、5%CO2の条件下で一晩培養した。得られた導入細胞を接着状態のまま、Cell−ELISAに使用した。
HEK293T細胞を1.125×107細胞/フラスコになるよう225cm2フラスコ(住友ベークライト社製)に播種し、10%FBS含有DMEM培地中で37℃、5%CO2の条件下で一晩培養した。翌日、pCI−ROBO4もしくはネガティブコントロールとしてpCI−mockをHEK293T細胞にLipofectamine 2000を用いて導入し、37℃、5%CO2の条件下でさらに一晩培養した。翌日、発現ベクター導入HEK293T細胞をTrypLE Express(Life Technologies社製)で処理し、10%FBS含有DMEMで細胞を洗浄した後、5%FBS含有PBSに懸濁した。得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリー解析に使用した。
2)−4−1で調製した発現ベクター導入HEK293細胞の上清を除去後、pCI−hROBO4導入HEK293細胞とpCI−mock導入HEK293細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を添加し、4℃で1時間静置した。各ウェル中の細胞を5% FBS含有PBSで1回洗浄後、5% FBS含有PBSで500倍に希釈したAnti−Mouse IgG−Peroxidase antibody produced in goat(Sigma−Aldrich社製)を加えて、4℃で1時間静置した。各ウェル中の細胞を5% FBS含有PBSで5回洗浄した後、OPD発色液(OPD溶解液(0.05 M クエン酸3ナトリウム、0.1M リン酸水素2ナトリウム・12水 pH4.5)にo−フェニレンジアミン二塩酸塩(和光純薬社製)、H2O2をそれぞれ0.4mg/mL、0.6%(v/v)になるように溶解)を25μL/ウェルで添加した。時々攪拌しながら発色反応を行い、1M HClを25μL/ウェルを添加して発色反応を停止させた後、プレートリーダー(ENVISION:PerkinElmer社製)で490nmの吸光度を測定した。細胞膜表面上に発現するROBO4に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択するため、ネガティブコントロールのpCI−mock導入HEK293細胞と比較し、pCI−hROBO4導入HEK293細胞の方でより高い吸光度を示す培養上清におけるハイブリドーマを抗ROBO4抗体産生陽性ハイブリドーマとして選択した。
2)−5 Cell−ELISAで陽性と判定された各ハイブリドーマが産生する抗体のROBO4に対する結合をフローサイトメトリー法によりさらに確認した。2)−4−2で調製したHEK293T細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、pCI−hROBO4導入細胞とpCI−mock導入細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を加え、4℃で1時間静置した。細胞を5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、5% FBS含有PBSで1000倍に希釈したAnti−Mouse IgG FITC conjugate(Sigma−Aldrich社製)あるいは5% FBS含有PBSで320倍に希釈したAnti−Rat IgG FITC conjugate(Sigma−Aldrich社製)を加え、4℃で1時間静置した。細胞を5% FBS含有PBSで3回洗浄した後、5% FBS及び2μg/mL 7−aminoactinomycin D(Molecular Probes社製)を含有するPBSに再懸濁し、フローサイトメーター(FC500:BeckmanCoulter社製)で検出を行った。データ解析はFlowjo(TreeStar社製)で行った。7−aminoactinomycin D陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のFITC蛍光強度のヒストグラムを作成した。ネガティブコントロールであるpCI−mock導入293T細胞の蛍光強度ヒストグラムに対しpCI−ROBO4導入HEK293T細胞のヒストグラムが強蛍光強度側にシフトしているサンプルを産生するハイブリドーマを抗ROBO4抗体産生ハイブリドーマとして取得した。取得したハイブリドーマの産生する抗ROBO4抗体を各々MAb1、MAb2、MAb3、及びMAb4とした。
各モノクローナル抗体のアイソタイプは、Mouse monoclonal isotyping kitあるいはRat monoclonal isotyping kit(AbD Serotec社製)により決定された。その結果、IgG1(MAb1、MAb2)、IgG2b(MAb3、MAb4)であった。
各モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養上清(以下「抗体精製原料」という)から精製された。
3)−1 Interleukin−8(IL−8)のプロモーター領域を応答エレメントとしたレポーターベクターの作製
IL−8 プロモーター領域のDNAを鋳型に、プライマーセット:
プライマー17F:
及び、
プライマー17R:
を用いPCR反応を行い、得られたPCR産物をpCR4Blunt―TOPOベクターに組込むことで、IL−8プロモーター領域(−253〜−59)のDNAを含むクローニングベクターを作製した。クローニングベクターからKpn I及びSac IでIL−8プロモーター領域(−253〜−59)のDNAを切り出し、これをpGL4.15ベクター(Promega社製)のKpn I/Sac I間に組込むことで、IL−8プロモーター領域を応答エレメントとしたレポーターベクターを作製した。IL−8プロモーター領域(−253〜−59)のDNAのヌクレオチド配列を配列表の配列番号29に示した。
NF−κB、GAS、ISRE、又はTCFを応答エレメントとしたレポーターベクターは、それぞれpGL4.32[luc2P/NF−κB−RE/Hygro] Vector(Promega社製)、pGAS−TA−Luc Vector(タカラバイオ社製)、pISRE−TA−Luc Vector(タカラバイオ社製)とTOPflash(Millipore社製)を用いた。また、ネガティブコントロールとして、応答配列を含まないpTA−Luc Vector(タカラバイオ社製)を用い、インターナルコントロールとして、pRL−TK Vector(タカラバイオ社製)を用いた。
HEK293細胞を2×104細胞/ウェルの濃度で96ウェルプレート(コラーゲンIコート、旭硝子社製)に播種し、10%FBS含有DMEM培地中で37℃、5%CO2の条件下で一晩培養した。翌日、pCI−ROBO4、pCI−ROBO4−ΔCもしくはネガティブコントロールのpCI−mockと3)−1や3)−2で示したレポーターベクターをそれぞれHEK293細胞にFuGene6 Transfection Reagentを用いて導入し、37℃、5%CO2の条件下でさらに一晩培養した。翌日、Dual―Glo Luciferase Assay System(プロメガ社製)を用いてプレートリーダー(Mithras:Berthold Technologies社製)で各ウェルのホタルルシフェラーゼ活性とウミシイタケルシフェラーゼ活性を発光強度として測定し、次式で各ウェルのレポーター活性を算出した:レポーター活性=ホタルルシフェラーゼ活性由来の発光強度/ウミシイタケルシフェラーゼ活性由来の発光強度。その結果、ネガティブコントロールのpCI−mock導入細胞と比較して、pCI−hROBO4導入細胞でIL−8プロモーター活性のみが上昇した(図1)。また、pCI−hROBO4導入細胞で検出されたIL−8プロモーター活性の上昇は、pCI−hROBO4−ΔC導入細胞(hROBO4の細胞内領域を欠損させた変異体)では大幅に減弱したことから、pCI−hROBO4導入細胞で検出されるIL−8プロモーター活性の上昇に、ROBO4の細胞内領域が必要なことが示された(図2)。よって、pCI−hROBO4導入細胞におけるIL−8のプロモーター活性の上昇は、ROBO4の下流シグナルの活性化を検出していることが示された。
4)−1 MAb1のROBO4の下流シグナル活性化
3)−3で調製したpCI−hROBO4導入細胞もしくはpCI−mock導入細胞を一晩培養し、翌日、各抗ROBO4抗体(MAb1、MAb2、MAb3、又はMAb4)もしくはネガティブコントロールとしてMouse IgG1(R&D systems社製)を、0、0.3125、1.25、5、及び20μg/mLもしくは0、0.25、1、4、及び16μg/mLの濃度で添加し、37℃、5%CO2の条件下で5時間培養した。その後、Dual―Glo Luciferase Assay System(プロメガ社製)を用いてプレートリーダー(Mithras)で各ウェルのホタルルシフェラーゼ活性とウミシイタケルシフェラーゼ活性を発光強度として測定し、次式で各ウェルのレポーター活性を算出した:レポーター活性=ホタルルシフェラーゼ活性由来の発光強度/ウミシイタケルシフェラーゼ活性由来の発光強度。その結果、ネガティブコントロールのmouse IgGはヒトROBO4一過性発現細胞でのIL−8プロモーター活性に影響しなかったが、MAb1はIL−8プロモーター活性を上昇させた(図3)。また、MAb2もMAb1と同様、IL−8プロモーター活性を上昇させたが、MAb3やMAb4はIL−8プロモーター活性を上昇させなかった(図4)。なお、pCI−mock細胞において、MAb1やMAb2はIL−8プロモーター活性を上昇させなかった。これらの結果から、MAb1は、ROBO4の下流シグナルを活性化すること、さらに、全てのROBO4抗体がROBO4の下流シグナルを活性化することはないことが明らかとなった。
HUVEC(KURABO社製)を0.1%BSA含有HuMedia−EB2(KURABO社製)で一晩37℃、5%CO2条件下で培養したあと、0.1%BSA含有HuMedia−EB2で4×105個/mLとなるよう調製した。メンブレンをゼラチンコートしたBD Falconフルオロブロック24マルチウェルインサートシステム(Pore size:8μm)のチャンバー上層に、4×105個/mLの細胞懸濁液を0.25mL添加したあと、チャンバー下層に0.1%BSAと10ng/mLのヒトVEGF165(PeproTech社製)あるいはヒトbFGF(BD Biosciences社製)と2μg/mLのMouse IgG2aあるいは各抗ROBO4抗体(MAb1、MAb2、MAb3、又はMAb4)を含むHuMedia−EB2を添加した。37℃、5%CO2条件下、2〜3時間インキュベーションし、下層へ遊走したHUVECを4μg/mL Calcein−AM(Life Technologies社製)含有HuMedia−EB2で15分間染色した。その後、各ウェルの蛍光強度(励起波長/蛍光波長:485nm/538nm)をプレートリーダー(FlexStation:Molecular Devices社)で測定し、次式で各ウェルの遊走細胞の量を算出した:遊走細胞の量=HUVEC添加ウェルの蛍光強度−HUVEC非添加ウェルの蛍光強度。その結果、MAb1はVEGFあるいはbFGFで誘導されるHUVECの遊走を抑制した(図5)。また、MAb2もMAb1と同様、bFGFで誘導されるHUVECの遊走を抑制したが、MAb3やMAb4は細胞遊走を抑制しなかった(図6)。これらの結果から、抗ROBO4抗体のIL−8プロモーター活性の上昇とHUVECの遊走抑制活性は相関することが示された。
4)−3−1 抗原遺伝子発現細胞の調製
HEK293細胞を1.5×106細胞/dishの濃度で60mm dish(Corning社製)に播種し、10%FBS含有DMEM培地中で37℃、5%CO2の条件下で一晩培養した。翌日、pCI−hROBO4、pCI−mROBO4、pCI−raROBO4、pCI−FLAG−cynoROBO4−1、pCI−FLAG−cynoROBO4−2、pCI−hROBO1、pCI−hROBO2もしくはpCI−hROBO3をHEK293細胞にFuGENE6 Transfection Reagentを用いて導入し、37℃、5%CO2の条件下でさらに一晩培養した。翌日、発現ベクター導入細胞をTrypLE Express(Life Technologies社製)で処理し、5%FBS含有PBSで細胞を洗浄した後、5%FBS含有PBSに懸濁した。得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリー解析に使用した。
4)−3−1で調製した各細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、2×105細胞の発現ベクター導入細胞に対し、MAb1又はネガティブコントロールとして、Mouse IgG2aを10μg/mLの濃度で添加し、生じた懸濁液を4℃で1時間静置した。細胞を5%FBS含有PBSで1回洗浄した後、5%FBS含有PBSで1000倍に希釈したAnti−Mouse IgG FITC conjugateを加え、生じた懸濁液を4℃で1時間静置した。細胞を5%FBS含有PBSで3回洗浄した後、5%FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーター(BD FACSCalibur)で検出を行った。データ解析はFlowjoで行った。FITC蛍光強度のヒストグラムを作成し、ネガティブコントロールであるMouse IgG2aの蛍光強度ヒストグラムに対し、MAb1のヒストグラムが強蛍光強度側にシフトしている場合を、抗体が種交差の形で結合すると判断した。その結果、種交差性の検討では、MAb1は、マウスROBO4やラットROBO4に結合しなかったが、ヒトROBO4とカニクイザルROBO4に結合することが明らかとなった(図7)。
4)−4−1 抗原遺伝子発現細胞の調製
HEK293細胞を1.2×106細胞/dishもしくは1.5×106細胞/dishの濃度で60mm dish(Corning社製)に播種し、10%FBS含有DMEM培地中で37℃、5%CO2の条件下で一晩培養した。翌日、pCI−hROBO4、pCI−FLAG−hROBO1、pCI−hROBO2もしくはpCI−hROBO3をHEK293細胞にFuGENE6 Transfection Reagentを用いて導入し、37℃、5%CO2の条件下でさらに一晩培養した。翌日、発現ベクター導入細胞をTrypLE Express(Life Technologies社製)で処理し、5%FBS含有PBSで細胞を洗浄した後、5%FBS含有PBSに懸濁した。得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリー解析に使用した。
4)−4−1で調製した各細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、2×105細胞の発現ベクター導入細胞に対し、MAb1、ポジティブコントロールとしてHuman ROBO4 Antibody(R&D systems社製)、Monoclonal ANTI−FLAG M2 antibody produced in mouse(Sigma−Aldrich社製)、Human ROBO2 Antibody(R&D systems社製)もしくはMonoclonal Anti−human ROBO3 Antibody(R&D systems社製)、又はネガティブコントロールとして、Mouse IgG1もしくはMouse IgG2aを10μg/mLの濃度で添加し、生じた懸濁液を4℃で1時間静置した。細胞を5%FBS含有PBSで1回洗浄した後、5%FBS含有PBSで1000倍に希釈したAnti−Mouse IgG FITC conjugateを加え、生じた懸濁液を4℃で1時間静置した。細胞を5%FBS含有PBSで3回洗浄した後、5%FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーター(BD FACSCalibur)で検出を行った。データ解析はFlowjoで行った。FITC蛍光強度のヒストグラムを作成し、ネガティブコントロールであるMouse IgG1もしくはMouse IgG2aの蛍光強度ヒストグラムに対し、MAb1のヒストグラムが強蛍光強度側にシフトしている場合を、抗体が特異的に結合すると判断した。その結果、MAb1は、hROBO1、hROBO2あるいはhROBO3には結合せず、hROBO4に特異的に結合することが明らかとなった(図8)。なお、hROBO4、hROBO1、hROBO2、及びhROBO3が細胞膜上に発現していることはポジティブコントロールの抗体を用いて各々確認された(図8)。
4)−5−1 抗原遺伝子発現細胞の調製
HEK293細胞を1.5×106細胞/dishの濃度で60mm dish(Corning社製)に播種し、10%FBS含有DMEM培地中で37℃、5%CO2の条件下で一晩培養した。翌日、pCI−FLAG−hROBO4−28、pCI−FLAG−hROBO4−46、pCI−FLAG−hROBO4−132、pCI−FLAG−hROBO4−210、pCI−FLAG−hROBO4−225、pCI−FLAG−hROBO4−341をHEK293細胞にFuGENE6 Transfection Reagentを用いて導入し、37℃、5%CO2の条件下でさらに一晩培養した。翌日、発現ベクター導入細胞をTrypLE Express(Life Technologies社製)で処理し、5%FBS含有PBSで細胞を洗浄した後、5%FBS含有PBSに懸濁した。得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリー解析に使用した。
4)−5−1で調製した各細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、2×105細胞の発現ベクター導入細胞に対し、MAb1、ポジティブコントロールとしてMonoclonal ANTI−FLAG M2 antibody produced in mouse、又はネガティブコントロールとして、Mouse IgG2aを10μg/mLの濃度で添加し、生じた懸濁液を4℃で1時間静置した。細胞を5%FBS含有PBSで1回洗浄した後、5%FBS含有PBSで1000倍に希釈したAnti−Mouse IgG FITC conjugateを加え、生じた懸濁液を4℃で1時間静置した。細胞を5%FBS含有PBSで3回洗浄した後、5%FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーター(BD FACSCalibur:BD Biosciences社製)で検出を行った。データ解析はFlowjoで行った。FITC蛍光強度のヒストグラムを作成し、ネガティブコントロールであるMouse IgG2aの蛍光強度ヒストグラムに対し、MAb1のヒストグラムが強蛍光強度側にシフトしている場合を、抗体が細胞に結合すると判断した。その結果、MAb1は、pCI−FLAG−hROBO4−28、pCI−FLAG−hROBO4−46もしくはpCI−FLAG−hROBO4−132導入細胞には結合し、pCI−FLAG−hROBO4−210、pCI−FLAG−hROBO4−225もしくはpCI−FLAG−hROBO4−341導入細胞には結合しなかった。したがって、MAb1は、配列表の配列番号2に示される、ヒトROBO4の132〜209番目のアミノ酸配列を認識することが示された(図9)。なお、各細胞内領域/ドメイン欠損体が細胞膜上に発現していることはポジティブコントロールの抗FLAG抗体を用いて確認された(図9)。
4)−6−1 麻酔
各カニクイザルに0.04mg/kgの投与量で塩酸メデトミジン(日本全薬工業社製)を筋注し、その15分後に15mg/kgの投与量で塩酸ケタミン(第一三共社製)を筋注した。
4)−6−1で麻酔した各カニクイザルをモンキーチェアーに保定した。両眼に4%キシロカイン点眼液(アストラゼネカ社製)を点眼し、眼表面を麻酔・鎮痛処置した。5mg/mL トロピカミド・5mg/mL フェニレフリン塩酸塩混合点眼液(参天製薬社製)を点眼し散瞳させ、グリーンレーザー光凝固装置 OcuLight GLx(イリデリック社製)を用いて網膜黄斑部にレーザー照射(照射熱量:350−500mW,照射時間:0.1秒,スポットサイズ:50μm,スポット数:6あるいは9スポット)して熱損傷を加えた。
モデル作製後7日目に Vehicleあるいは13.2mg/mL MAb1 50μLを、33Gナノパスニードルを結膜より硝子体内に刺入し、PE20ポリエチレンチューブを介して100μLハミルトンシリンジを用いて2分間かけて注入した。試験は各群4眼で実施した。投与終了後、0.5%レボフロキサシン水和物点眼液(参天製薬社製)を点眼した。
モデル作製後7日目、14日目、21日目に、麻酔下、ハイブリット眼底カメラCX−1(キャノン社製)により眼底通常撮影した。その後、10%フルオレセインを0.1mL/kgの投与量で静注した。フルオレセイン静注後、1分毎に最大6分後まで蛍光血管造影撮影を行った。画像データを保存し、画像解析装置(WinRoof、三谷商事社製)にてフルオレセイン滞留部の面積を算出した:新生血管量は次式で算出した。新生血管量=モデル作製後21日目のフルオレセイン滞留部の面積−モデル作製後7日目のフルオレセイン滞留部の面積。Vehicle投与群とMAb1投与群の新生血管量を比較した結果、MAb1投与群の4眼中1眼ではVehicle群の新生血管量と差異は認められなかったものの、3眼では新生血管量の減少が認められた。すなわち、MAb1の投与によって、レーザー誘導脈絡膜血管新生が抑制された(図10)。
5)−1 MAb1の重鎖および軽鎖のN末端アミノ酸配列の決定
MAb1の重鎖および軽鎖のN末端アミノ酸配列を決定するために、実施例2)−8で精製したMAb1をSDS−PAGEで分離した。分離後のゲルからSequi−Blot PVDF膜(Bio−Rad社製)にゲル中のタンパク質を転写し、次に洗浄バッファー(25mM NaCl、10mM ホウ酸ナトリウムバッファー pH8.0)で洗浄した後、染色液(50% メタノール、20% 酢酸、0.05% クマシーブリリアントブルー)に5分間浸して染色してから、90% メタノールで脱色した。PVDF膜上で可視化された重鎖(移動度が小さい方のバンド)および軽鎖(移動度が大きい方のバンド)に相当するバンド部分を切りとった。Procise cLC プロテインシーケンサー Model 492cLC (Applied Biosystems社製)を用いて、自動エドマン法(Edman et al. (1967) Eur. J. Biochem. 1, 80参照)によりそれぞれのN末端アミノ酸配列を同定した。その結果、MAb1の重鎖に相当するバンドのN末端のアミノ酸配列は、
であり、軽鎖に相当するバンドのN末端アミノ酸配列は、
であった。
MAb1の重鎖及び軽鎖をコードするcDNAをクローニングするため、MAb1産生ハイブリドーマよりmRNA Isolation kit(Roche applied science社製)を用いてmRNAを調製した。
MAb1の重鎖及び軽鎖のアイソタイプがそれぞれγ1とκであること(実施例2)−7)、5−1)で決定した重鎖および軽鎖のN末端アミノ酸配列、及びカバトらにより作成された抗体のアミノ酸配列データベース(Strausberg,R.L., et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99. 16899−16903、及びKabat, E. A., et al.(1991) in Sequences of Proteins of Immunological Interest Vol. I及びII, U.S. Department of Health and Human Services参照)を参考にして、抗体遺伝子翻訳領域の5'末端配列と終止コドンを含む3'末端配列にそれぞれハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーをいくつか合成し、5)−2で調製したmRNAとTaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV)(タカラバイオ社製)を用いて重鎖、及び軽鎖をコードするcDNAを増幅したところ、下記のプライマーセットで抗体の重鎖、及び軽鎖をコードするcDNAを増幅することができた。
重鎖用プライマーセット
LYHF6:
G1EVR1:
軽鎖用プライマーセット
MK19EIF1:
KEVR1:
6)−1 発現ベクターpCMA−LK、pCMA−G1、及びpCMA−G2の作製
6)−1−1 キメラ及びヒト化軽鎖発現ベクターpCMA−LKの構築
プラスミドpcDNA3.3−TOPO/LacZ(Invitrogen社製)を制限酵素XbaI及びPmeIで消化して得られる約5.4kbのフラグメントと、ヒトκ鎖分泌シグナル及びヒトκ鎖定常領域をコードするDNA配列(配列番号34)を含むDNA断片をIn−Fusion Advantage PCRクローニングキット(Clontech社製)を用いて結合して、pcDNA3.3/LKを作製した。
プライマーセット
3.3−F1:
3.3−R1:
pCMA−LKをXbaI及びPmeIで消化してκ鎖分泌シグナル及びヒトκ鎖定常領域をコードする配列を取り除いたDNA断片と、ヒト重鎖シグナル配列及びヒトIgG1定常領域のアミノ酸をコードするDNA配列(配列番号35)を含むDNA断片をIn−Fusion Advantage PCRクローニングキット(Clontech社製)を用いて結合して、CMVプロモーターの下流にシグナル配列コード配列、クローニングサイト、及びヒトIgG1重鎖定常領域コード配列をもつキメラ及びヒト化IgG1タイプ重鎖発現ベクターpCMA−G1を構築した。
pCMA−LKをXbaI及びPmeIで消化してκ鎖分泌シグナル及びヒトκ鎖定常領域をコードする配列を取り除いたDNA断片と、ヒト重鎖シグナル配列及びヒトIgG2定常領域のアミノ酸をコードするDNA配列(配列番号36)を含むDNA断片をIn−Fusion Advantage PCRクローニングキット(Clontech社製)を用いて結合して、CMVプロモーターの下流にシグナル配列コード配列、クローニングサイト、及びヒトIgG2重鎖定常領域コード配列をもつキメラ及びヒト化IgG2タイプ重鎖発現ベクターpCMA−G2を構築した。
MAb1の軽鎖の可変領域をコードするcDNAをテンプレートとして、KOD−Plus−(TOYOBO社製)と下記のプライマーセットで軽鎖の可変領域をコードするcDNAを含む部分を増幅し、キメラ及びヒト化抗体軽鎖発現汎用ベクター pCMA−LKを制限酵素BsiWIで切断した箇所にIn−Fusion Advantage PCRクローニングキット(Clontech社製)を用いて挿入することにより、MAb1キメラタイプ軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−LK/MAb1L」と命名した。MAb1キメラタイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列を配列表の配列番号37に示し、アミノ酸配列を配列番号38に示した。配列表の配列番号37のヌクレオチド番号1〜60はシグナル配列、61〜402は可変領域、403〜717は定常領域をコードするヌクレオチド配列であり、配列番号38のアミノ酸番号1〜20はシグナル配列、21〜134は可変領域、135〜239は定常領域のアミノ酸である。
軽鎖用プライマーセット
MAb1LF:
MAb1LR:
MAb1の重鎖の可変領域をコードするcDNAをテンプレートとして、KOD−Plus−(TOYOBO社製)と下記のプライマーセットで重鎖の可変領域をコードするcDNAを含む部分を増幅し、キメラ及びヒト化IgG1タイプ重鎖発現ベクター pCMA−G1を制限酵素BsiWIで切断した箇所にIn−Fusion Advantage PCRクローニングキット(Clontech社製)を用いて挿入することにより、MAb1キメラIgG1タイプ重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G1/MAb1H」と命名した。MAb1キメラIgG1タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列を配列表の配列番号39に示し、アミノ酸配列を配列番号40に示した。配列表の配列番号39のヌクレオチド番号1〜57はシグナル配列、58〜411は可変領域、412〜1401は定常領域をコードするヌクレオチド配列であり、配列番号40のアミノ酸番号1〜19はシグナル配列、20〜137は可変領域、138〜467は定常領域のアミノ酸配列である。
IgG1タイプ重鎖用プライマーセット
MAb1HF:
MAb1H1R:
MAb1の重鎖の可変領域をコードするcDNAをテンプレートとして、KOD−Plus−(TOYOBO社製)と下記のプライマーセットで重鎖の可変領域をコードするcDNAを含む部分を増幅し、キメラ及びヒト化IgG2タイプ重鎖発現ベクター pCMA−G2を制限酵素BsiWIで切断した箇所にIn−Fusion Advantage PCRクローニングキット(Clontech社製)を用いて挿入することにより、MAb1キメラIgG2タイプ重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G2/MAb1」と命名した。MAb1キメラIgG2タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列を配列表の配列番号41に示し、アミノ酸配列を配列番号42に示した。
IgG2タイプ重鎖用プライマーセット
MAb1HF:
MAb12R:
7)−1 IgG1タイプキメラMAb1抗体及びIgG2タイプキメラMAb1抗体の生産
FreeStyle 293F細胞(Invitrogen社製)はマニュアルに従い、継代及び培養をおこなった。対数増殖期の1.2×109個のFreeStyle 293F細胞(Invitrogen社製)を3L Fernbach Erlenmeyer Flask(Corning社製)に播種し、FreeStyle293 expression medium (Invitrogen社製)で1.0×106細胞/mLに希釈したのちに、37℃、8%CO2インキュベーター内で、90rpmで一時間振とう培養した。Polyethyleneimine(Polyscience社製 #24765)3.6mgをOpti−Pro SFM培地(Invitrogen社製)20mLに溶解し、次にPureLink HiPure Plasmidキット(Invitrogen社製)を用いて調製したH鎖発現ベクター(0.4mg)及びL鎖発現ベクター(0.8mg)を20mLのOpti−Pro SFM培地(Invitrogen社製)に懸濁した。Polyethyleneimine/Opti−Pro SFM混合液20mLに、発現ベクター/Opti−Pro SFM混合液20mLを加え穏やかに攪拌し、さらに5分間放置した後にFreeStyle 293F細胞に添加した。細胞を37℃、8%CO2インキュベーターで7日間、90rpmで振とう培養して得られた培養上清をDisposable Capsule Filter (Advantec社製 #CCS−045−E1H)でろ過した。
上記7−1)で得られた培養上清を、rProteinAアフィニティークロマトグラフィー(4−6℃下)で精製した。rProteinAアフィニティークロマトグラフィー精製後のバッファー置換工程は室温下で実施した。最初に、培養上清1100−1200mlを、PBSで平衡化したMabSelectSuRe(GE Healthcare Bioscience社製、HiTrapカラム:容積1mL×2連結)にアプライした。培養液がカラムに全て入ったのち、PBSでカラムを洗浄した。次に2Mアルギニン塩酸塩溶液(pH4.0)で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分のバッファーを脱塩カラム(GE Healthcare Bioscience社製、HiTrap Desaltingカラム:容積5mL×2連結)でPBSへ置換を行った。最後に、当該画分をCentrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分画分子量30K,Sartorius社製,4℃下)にてIgG濃度を20.0mg/mL以上に濃縮し精製サンプルとした。
7)−3−1 ROBO4の下流シグナル活性化
この試験を4)−1の方法に従って実施した。ただし、ネガティブコントロールとして、Human IgG(Sigma−Aldrich社製)を用いた。また、Human IgG、cMAb1−1、又はcMAb1−2は最終濃度が0.313μg/mLになるように培地に添加した。その結果、ネガティブコントロールのHuman IgGはヒトROBO4一過性発現細胞でのIL−8プロモーター活性に影響しなかったが、cMAb1−1及びcMAb1−2はIL−8プロモーター活性を上昇させた(図11)。これらの結果から、cMAb1−1あるいはcMAb1−2は、MAb1と同様に、ROBO4の下流シグナルを活性化することが明らかとなった。
この試験を4)−2の方法に従って実施した。ただし、ネガティブコントロールとして、Human IgGを用いた。また、Human IgG、cMAb1−1、又はcMAb1−2は最終濃度が0.5μg/mLになるように培地に添加した。その結果、cMAb1−1又はcMAb1−2はbFGFで誘導されるHUVECの遊走を抑制した(図12)。これらの結果から、cMAb1−1あるいはcMAb1−2は、MAb1と同様に、HUVECの遊走を抑制することが明らかとなった。
8)−1 MAb1のヒト化バージョンの設計
8)−1−1 MAb1の可変領域の分子モデリング
MAb1の可変領域の分子モデリングは、相同性モデリングとして一般的に公知の方法(Methods in Enzymology,203,121−153,(1991))によって実行された。Protein Data Bank(Nuc.Acid Res.35,D301−D303(2007))に登録されるヒト免疫グロブリンの可変領域の1次配列(X線結晶構造から誘導される三次元構造が入手可能である)を、上で決定されたMAb1の可変領域と比較した。結果として、3FFDが、MAb1の重鎖の可変領域に対してフレームワーク中に欠損がある抗体の中で、最も高い配列相同性を有するとして選択された。また、1T66が、MAb1の軽鎖の可変領域に対して最も高い配列相同性を有するとして選択された。フレームワーク領域の三次元構造は、MAb1の重鎖及び軽鎖に対応する3FFD及び1T66座標を組み合わせて、「フレームワークモデル」を得ることによって作製された。MAb1のCDRは、Thornton et al.(J.Mol.Biol.,263,800−815,(1996))の分類に従って、CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1及びCDRH2は、それぞれクラスター16A、7A、9A、10A、および10Bに割り当てられた。CDRH3は、H3ルール(FEBS letter 399,1−8(1996))を使用して、k(7)Bに分類された。次いで、それぞれのCDRについての代表的なコンホメーションがフレームワークモデルに組み込まれた。
各ヒト化MAb1抗体(hMAb1)の構築を、CDRグラフティング(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029−10033(1989))として一般的に公知の方法によって行った。アクセプター抗体は、フレームワーク領域内のアミノ酸相同性に基づいて2通り選択された。MAb1のフレームワーク領域の配列を、抗体のアミノ酸配列のKabatデータベース(Nuc.Acid Res.29,205−206(2001))の全てのヒトフレームワークと比較し、結果として、B3抗体がフレームワーク領域についての83%の配列相同性に起因して、アクセプターとして選択された。B3についてのフレームワーク領域のアミノ酸残基を、MAb1についてのアミノ酸残基と整列させ、異なるアミノ酸が使用される位置を同定した。これらの残基の位置は、上で構築されたMAb1の三次元モデルを使用して分析され、そしてアクセプター上にグラフティングされるべきドナー残基が、Queen et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029−10033(1989))によって与えられる基準によって選択された。選択されたいくつかのドナー残基をアクセプター抗体に移入することによって、ヒト化MAb1配列を以下の実施例に記載されるように構築した。また、hMAb1の各CDR中の1〜3個のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したhMAb1変異体についても以下の実施例に記載されるように構築した。
8)−2−1 hMAb1−H1タイプ重鎖:
配列表の配列番号42に示されるcMAb1−2重鎖のアミノ酸番号32(リジン)をグルタミンに、アミノ酸番号38(リジン)をアルギニンに、アミノ酸番号59(スレオニン)をアラニンに、アミノ酸番号61(グルタミン酸)をグリシンに、アミノ酸番号63(アルギニン)をグリシンに、アミノ酸番号95(グルタミン酸)をリジンに、アミノ酸番号103(セリン)をアスパラギンに、アミノ酸番号107(セリン)をアラニンに、アミノ酸番号112(メチオニン)をバリンに、アミノ酸番号114(フェニルアラニン)をチロシンに、アミノ酸番号129(ヒスチジン)をグルタミンに、アミノ酸番号132(スレオニン)をロイシンに、及びアミノ酸番号133(ロイシン)をバリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化MAb1重鎖を「hMAb1−H1タイプ重鎖」と命名した。
配列表の配列番号42に示されるcMAb1−2重鎖のアミノ酸番号32(リジン)をグルタミンに、アミノ酸番号38(リジン)をアルギニンに、アミノ酸番号59(スレオニン)をアラニンに、アミノ酸番号61(グルタミン酸)をグリシンに、アミノ酸番号63(アルギニン)をグリシンに、アミノ酸番号72(アスパラギン)をグルタミンに、アミノ酸番号95(グルタミン酸)をリジンに、アミノ酸番号103(セリン)をアスパラギンに、アミノ酸番号107(セリン)をアラニンに、アミノ酸番号112(メチオニン)をバリンに、アミノ酸番号114(フェニルアラニン)をチロシンに、アミノ酸番号129(ヒスチジン)をグルタミンに、アミノ酸番号132(スレオニン)をロイシンに、アミノ酸番号133(ロイシン)をバリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化MAb1重鎖を「hMAb1−H2タイプ重鎖」と命名した。
配列表の配列番号42に示されるcMAb1−2重鎖のアミノ酸番号32(リジン)をグルタミンに、アミノ酸番号38(リジン)をアルギニンに、アミノ酸番号59(スレオニン)をアラニンに、アミノ酸番号61(グルタミン酸)をグリシンに、アミノ酸番号95(グルタミン酸)をリジンに、アミノ酸番号103(セリン)をアスパラギンに、アミノ酸番号107(セリン)をアラニンに、アミノ酸番号112(メチオニン)をバリンに、アミノ酸番号114(フェニルアラニン)をチロシンに、アミノ酸番号129(ヒスチジン)をグルタミンに、アミノ酸番号132(スレオニン)をロイシンに、アミノ酸番号133(ロイシン)をバリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化MAb1重鎖を「hMAb1−H3タイプ重鎖」と命名した。
配列表の配列番号42に示されるcMAb1−2重鎖のアミノ酸番号32(リジン)をグルタミンに、アミノ酸番号38(リジン)をアルギニンに、アミノ酸番号59(スレオニン)をアラニンに、アミノ酸番号61(グルタミン酸)をグリシンに、アミノ酸番号72(アスパラギン)をグルタミンに、アミノ酸番号95(グルタミン酸)をリジンに、アミノ酸番号103(セリン)をアスパラギンに、アミノ酸番号107(セリン)をアラニンに、アミノ酸番号112(メチオニン)をバリンに、アミノ酸番号114(フェニルアラニン)をチロシンに、アミノ酸番号129(ヒスチジン)をグルタミンに、アミノ酸番号132(スレオニン)をロイシンに、アミノ酸番号133(ロイシン)をバリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化MAb1重鎖を「hMAb1−H4タイプ重鎖」と命名した。
8)−3−1 hMAb1−L1タイプ軽鎖:
配列表の配列番号38に示されるcMAb1軽鎖のアミノ酸番号22(アラニン)をイソロイシンに、アミノ酸番号27(スレオニン)をセリンに、アミノ酸番号34(セリン)をスレオニンに、アミノ酸番号37(アスパラギン酸)をグルタミン酸に、アミノ酸番号38(グルタミン)をプロリンに、アミノ酸番号62(フェニルアラニン)をロイシンに、アミノ酸番号84(ロイシン)をプロリンに、アミノ酸番号108(フェニルアラニン)をバリンに、アミノ酸番号112(フェニルアラニン)をチロシンに、アミノ酸番号125(グリシン)をプロリンに、アミノ酸番号129(ロイシン)をバリンに、アミノ酸番号130(グルタミン酸)をアスパラギン酸に、アミノ酸番号134(アラニン)をスレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化MAb1軽鎖を「hMAb1−L1タイプ軽鎖」と命名した。
配列表の配列番号38に示されるcMAb1軽鎖のアミノ酸番号22(アラニン)をイソロイシンに、アミノ酸番号27(スレオニン)をセリンに、アミノ酸番号34(セリン)をスレオニンに、アミノ酸番号37(アスパラギン酸)をグルタミン酸に、アミノ酸番号38(グルタミン)をプロリンに、アミノ酸番号52(セリン)をグルタミン酸に、アミノ酸番号54(グリシン)をリジンに、アミノ酸番号56(スレオニン)をロイシンに、アミノ酸番号62(フェニルアラニン)をロイシンに、アミノ酸番号84(ロイシン)をプロリンに、アミノ酸番号108(フェニルアラニン)をバリンに、アミノ酸番号112(フェニルアラニン)をチロシンに、アミノ酸番号125(グリシン)をプロリンに、アミノ酸番号129(ロイシン)をバリンに、アミノ酸番号130(グルタミン酸)をアスパラギン酸に、アミノ酸番号134(アラニン)をスレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化MAb1軽鎖を「hMAb1−L2タイプ軽鎖」と命名した。
9)−1 ヒト化MAb1の重鎖発現ベクターの構築
9)−1−1 hMAb1−H1タイプ重鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号56のアミノ酸番号20〜137に示される、hMAb1−H1タイプ重鎖可変領域をコードする遺伝子を含むDNAを合成し(GeneArt社 人工遺伝子合成サービス)、制限酵素BlpIで切り出されるDNA断片を、キメラ及びヒト化IgG2タイプ重鎖発現ベクター(pCMA−G2)を制限酵素BlpIで切断した箇所に挿入することにより、hMAb1−H1タイプ重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G2/hMAb1−H1」と命名した。hMAb1−H1タイプ重鎖のヌクレオチド配列を配列表の配列番号55に示した。
9)−1−1で構築したpCMA−G2/hMAb1−H1をテンプレートとして、下記に示す下記に示すプライマーセットとQuikChange XL Site−Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies社製)を用いて、hMAb1−H2タイプ重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G1/hMAb1−H2」と命名した。hMAb1−H2タイプ重鎖のヌクレオチド配列を配列表の配列番号57に示し、アミノ酸配列を配列番号58に示した。
プライマーセット
H−N53Q−F:
H−N53Q−R:
配列表の配列番号60のアミノ酸番号20〜137に示される、hMAb1−H3タイプ重鎖可変領域をコードする遺伝子を含むDNAを合成し(GeneArt社 人工遺伝子合成サービス)、制限酵素BlpIで切り出されるDNA断片を、キメラ及びヒト化IgG2タイプ重鎖発現ベクター(pCMA−G2)を制限酵素BlpIで切断した箇所に挿入することにより、hMAb1−H3タイプ重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G2/hMAb1−H3」と命名した。hMAb1−H3タイプ重鎖のヌクレオチド配列を配列表の配列番号59に示した。
9)−1−3で構築したpCMA−G2/hMAb1−H3をテンプレートとして、下記に示すプライマーセットとQuikChange XL Site−Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies社製)を用いて、hMAb1−H4タイプ重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G1/hMAb1−H4」と命名した。hMAb1−H4タイプ重鎖のヌクレオチド配列を配列表の配列番号61に示し、アミノ酸配列を配列番号62に示した。
プライマーセット
H−N53Q−F:
H−N53Q−R:
9)−2−1 hMAb1−L1タイプ軽鎖発現ベクターの構築
配列番号64のアミノ酸番号21〜134に示されるhMAb1−L1タイプ軽鎖可変領域をコードする遺伝子を含むDNAを合成し(GENEART社、人工遺伝子合成サービス)、制限酵素BsiWIで切り出されるDNA断片を、キメラ及びヒト化抗体軽鎖発現汎用ベクター(pCMA−LK)を制限酵素BsiWIで切断した箇所に挿入することにより、hMAb1−L1タイプ軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−LK/hMAb1−L1」と命名した。hMAb1−L1タイプ軽鎖のヌクレオチド配列を配列表の配列番号63に示した。
9)−2−1で構築したpCMA−LK/hMAb1−L1をテンプレートとして、KOD−Plus−(TOYOBO社製)とプライマーセットA及びBの各々を用いてPCRを行うことにより得られたDNA断片を、プライマーセットCを用いたOverlap Extension PCRにより結合することにより、hMAb1−L2タイプ軽鎖をコードする遺伝子を含むDNAを作製し、制限酵素XbaIと制限酵素PmeIで切り出されるDNA断片を、キメラ及びヒト化抗体軽鎖発現汎用ベクター(pCMA−LK)を制限酵素XbaIと制限酵素PmeIで切断した箇所に挿入することにより、hMAb1−L2タイプ軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−LK/hMAb1−L2」と命名した。hMAb1−L2タイプ軽鎖のヌクレオチド配列を配列表の配列番号65に示し、アミノ酸配列を配列番号66に示した。
プライマーセットA
L inf−F:
L−EKL−R:
プライマーセットB
L−EKL−F:
L inf−R:
プライマーセットC
L inf−F:
L inf−R:
10−7−1)ヒト化MAb1の生産
FreeStyle 293F細胞(Invitrogen社製)はマニュアルに従い、継代及び培養をおこなった。
11)−1 結合親和性
各抗体とrROBO4−ECDの解離定数は、Biacore 3000(GE Healthcare Bioscience社製)を使用し、抗体をリガンドとして固定化し、抗原をアナライトとして測定した。抗体は、アミンカップリング法にてセンサーチップCM5(GE Healthcare Bioscience社製)へ固定化した抗ヒトIgG抗体(GE Healthcare Bioscience社製)を介し、約80RUを結合させた。ランニングバッファーとして0.05%Surfactant P20含有PBSを用いた。抗体を結合したチップ上に、抗原の希釈系列溶液(0.1−200nM)を流速30μL/分で300秒間添加し、引き続き300秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、3M MgCl2を流速10μL/分で30秒間添加した。データの解析には、分析ソフトウェア(BIAevaluation Software, version 4.1)の1:1結合モデルを用いて、結合速度定数kon、解離速度定数koff及び解離定数(KD;KD=koff/kon)を算出した。その結果、KD値はH−1040が0.41nM、H−1143が3.5nM、H−1140が3.9nM、H−2040が0.40nM、H−2143が1.7nM、H−2140が1.8nMであった。
この試験を4)−1の方法に従って実施した。ただし、ネガティブコントロールとして、Human IgGを用いた。また、Human IgG、H−1040、H−1140、H−1143、H−2040、H−2140、H−2143又はcMAb1−2は最終濃度が0.63μg/mLになるように培地に添加した。その結果、ネガティブコントロールのHuman IgGはヒトROBO4一過性発現細胞でのIL−8プロモーター活性に影響しなかったが、いずれのヒト化抗ROBO4抗体もcMAb1−2と同等の水準でIL−8プロモーター活性を上昇させた(図49)。これらの結果から、いずれのヒト化抗ROBO4抗体も、MAb1と同様に、ROBO4の下流シグナルを活性化することが明らかとなった。
この試験を4)−2の方法に従って実施した。ただし、ネガティブコントロールとして、human IgGを用いた。また、Human IgG、H−1143、H−2140又はH−2143は最終濃度が0.5μg/mLになるように培地に添加した。各ウェルの蛍光強度(励起波長/蛍光波長:485nm/538nm)はプレートリーダー(EnVision:PerkinElmer社製)で測定した。その結果、H−1143、H−2140又はH−2143はbFGFで誘導されるHUVECの遊走を抑制した(図50)。さらに、H−1140もHUVEC遊走に対して抑制活性を示した。これらの結果から、H−1140、H−1143、H−2140あるいはH−2143は、HUVECの遊走を抑制することが明らかとなった。
11)−4−1 抗原遺伝子発現細胞の調製
細胞を4)−3−1の方法に従って調製した。
この試験を4)−3−2の方法に従って実施した。ただし、ネガティブコントロールとして、human IgGを用い、二次抗体は、FITC−AffiniPure Goat Anti−Human IgG,Fcγ Fragment Specific(Jackson ImmunoResearch社製)を用いた。また、検出機器は、フローサイトメーター(FC500:Beckman Coulter社製)を用いた。その結果、H−1143、H−2140又はH−2143は、親抗体のMAb1と同様、マウスROBO4とラットROBO4に結合しなかったが、ヒトROBO4とカニクイザルROBO4に結合することが明らかとなった(図51、図52、および図53)。さらに、H−1140はH−1143、H−2140およびH2143と同様の結果を示した。
11)−5−1 抗原遺伝子発現細胞の調製
細胞を4)−4−1の方法に従って調製した。ただし、ヒトROBO4発現ベクターは、pCI−FLAG−hROBO4−28を用いた。
この試験を4)−4−2の方法に従って実施した。ただし、ネガティブコントロールとして、human IgGあるいはMouse IgG2aを用い、二次抗体は、Fluorescein−conjugated goat IgG fraction to mouse IgG(Cappel社製)もしくはFITC−AffiniPure Goat Anti−Human IgG,Fcγ Fragment Specificを用いた。また、検出機器は、フローサイトメーター(FC500)を用いた。その結果、H−1143,H−2140,H−2143は、親抗体のMAb1と同様、hROBO1、hROBO2あるいはhROBO3には結合せず、hROBO4に特異的に結合することが明らかとなった(図54)。さらに、H−1140はH−1143、H−2140及びH−2143と同様の結果を示した。なお、hROBO4、hROBO1、hROBO2、及びhROBO3が細胞膜上に発現していることはポジティブコントロールの抗体を用いてそれぞれ確認された(図54)。
11)−6−1 麻酔
各カニクイザルに0.08mg/kgの投与量で塩酸メデトミジンを筋注し、その15分後に15mg/kgの投与量で塩酸ケタミンを筋注した。
11)−6−1で麻酔した各カニクイザルをステンレス手術台上に仰臥位に保定し、5mg/mL トロピカミド 5mg/mL フェニレフリン塩酸塩混合点眼液を点眼し散瞳させ、グリーンレーザー光凝固装置 OcuLight GLxを用いて網膜黄斑部にレーザー照射(照射熱量:500mW,照射時間:0.1秒,スポットサイズ:50μm,スポット数:9スポット)して熱損傷を加えた。術後はクラビット点眼液を術眼に滴下した。
モデル作製後7日目に、各カニクイザルを麻酔後、ステンレス手術台上に仰臥位に保定した。その後、滅菌精製水で4倍希釈したPA・ヨード点眼液(日本点眼薬研究所社製)を点眼して外眼部を殺菌し、33G針を結膜より硝子体内に刺入し、1mLシリンジにて生理食塩水もしくは1.1mg/0.05mLに調製したH−2143を0.05mL 注入した。投与後は眼・耳科用リンデロンA軟膏を滅菌綿棒にて結膜に塗布し、瞼を開閉させて眼表面全体に行き渡らせた。
モデル作製後7日目、14日目、および21日目に、麻酔下、ハイブリット眼底カメラCX−1を用いて通常の方法により眼底を撮影した。その後、フルオレセインを0.05mL/kgの投与量で静注した。フルオレセイン静注後、1分毎に最大10分後まで蛍光血管造影撮影を行い、画像データとして保存した。画像データから、Zahn Gらの方法(Zahn G et.al Arch.Ophthalmol.2009 127:1329−1335)に従って、それぞれのレーザー照射部位のフルオレセイン滞留部の蛍光強度の強さに基づきグレード1から5のスケールで重症度分類を行った。その後、全レーザー照射部位における重症度分類の中でグレード4と5の重症度分類に相当する割合をパーセントで算出し、脈絡膜血管新生を評価した。Saline投与群とH−2143投与群の脈絡膜血管新生を比較した結果、Saline投与群では、モデル作製後の時間経過と共に、グレード4と5の割合が増加したのに対し、H−2143投与群ではその増加が認められなかった。すなわち、H−2143の投与によって、レーザー誘導脈絡膜血管新生が抑制された(図55)。
配列番号2;ヒトROBO4のアミノ酸配列(図14)
配列番号3:N末端FLAG−tag付加型全長ヒトROBO4のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
配列番号4:N末端FLAG−tag付加型全長ヒトROBO4のアミノ酸配列
配列番号5:配列番号2のアミノ酸番号46〜1007のアミノ酸配列からなる、N末端FLAG−tag付加型ヒトROBO4細胞外領域/ドメイン欠損体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
配列番号6:配列番号2のアミノ酸番号46〜1007のアミノ酸配列からなる、N末端FLAG−tag付加型ヒトROBO4細胞外領域/ドメイン欠損体のアミノ酸配列
配列番号7:配列番号2のアミノ酸番号132〜1007のアミノ酸配列からなる、N末端FLAG−tag付加型ヒトROBO4細胞外領域/ドメイン欠損体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
配列番号8:配列番号2のアミノ酸番号132番〜1007のアミノ酸配列からなる、N末端FLAG−tag付加型ヒトROBO4細胞外領域/ドメイン欠損体のアミノ酸配列
配列番号9:配列番号2のアミノ酸番号210〜1007のアミノ酸配列からなる、N末端FLAG−tag付加型ヒトROBO4細胞外領域ド/メイン欠損体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
配列番号10:配列番号2のアミノ酸番号210〜1007のアミノ酸配列からなる、N末端FLAG−tag付加型ヒトROBO4細胞外領域/ドメイン欠損体のアミノ酸配列
配列番号11:配列番号2のアミノ酸番号225〜1007のアミノ酸配列からなる、N末端FLAG−tag付加型ヒトROBO4細胞外領域/ドメイン欠損体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
配列番号12:配列番号2のアミノ酸番号225〜1007のアミノ酸配列からなる、N末端FLAG−tag付加型ヒトROBO4細胞外領域/ドメイン欠損体のアミノ酸配列
配列番号13:配列番号2のアミノ酸番号341〜1007のアミノ酸配列からなるN末端FLAG−tag付加型ヒトROBO4細胞外領域/ドメイン欠損体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
配列番号14:配列番号2のアミノ酸番号341〜1007のアミノ酸配列からなる、N末端FLAG−tag付加型ヒトROBO4細胞外領域/ドメイン欠損体のアミノ酸配列
配列番号15:マウスROBO4cDNAのヌクレオチド配列
配列番号16:マウスROBO4アミノ酸配列
配列番号17:ラットROBO4cDNAのヌクレオチド配列
配列番号18:ラットROBO4アミノ酸配列
配列番号19:サルROBO4cDNA1のヌクレオチド配列
配列番号20:サルROBO4アミノ酸配列1
配列番号21:サルROBO4cDNA2のヌクレオチド配列
配列番号22:サルROBO4アミノ酸配列2
配列番号23:ヒトROBO1cDNAのヌクレオチド配列
配列番号24:ヒトROBO1アミノ酸配列
配列番号25:ヒトROBO2cDNAのヌクレオチド配列
配列番号26:ヒトROBO2アミノ酸配列
配列番号27:ヒトROBO3cDNAのヌクレオチド配列
配列番号28:ヒトROBO4アミノ酸配列
配列番号29:IL−8プロモーター領域のヌクレオチド配列
配列番号30:MAb1重鎖可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列(図15)
配列番号31:MAb1重鎖可変領域のアミノ酸配列(図16)
配列番号32:MAb1軽鎖可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列(図17)
配列番号33:MAb1軽鎖可変領域のアミノ酸配列(図18)
配列番号34:ヒトκ鎖分泌シグナル及びヒトκ鎖定常領域のアミノ酸をコードするcDNAを含むヌクレオチド配列
配列番号35:ヒト重鎖シグナル配列及びヒトIgG1定常領域のアミノ酸をコードするcDNAを含むヌクレオチド配列
配列番号36:ヒト重鎖シグナル配列及びヒトIgG2定常領域のアミノ酸をコードするcDNAを含むヌクレオチド配列
配列番号37:cMAb1軽鎖をコードするcDNAのヌクレオチド配列(図19)
配列番号38:cMAb1軽鎖のアミノ酸配列(図20)
配列番号39:cMAb1−1重鎖をコードするcDNAのヌクレオチド配列(図21)
配列番号40:cMAb1−1重鎖のアミノ酸配列(図22)
配列番号41:cMAb1−2重鎖をコードするcDNAのヌクレオチド配列(図23)
配列番号42:cMAb1−2重鎖のアミノ酸配列(図24)
配列番号43:MAb1重鎖CDRH1のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
配列番号44:MAb1重鎖CDRH1のアミノ酸配列(図25)
配列番号45:MAb1重鎖CDRH2のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
配列番号46:MAb1重鎖CDRH2のアミノ酸配列(図26)
配列番号47:MAb1重鎖CDRH3のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
配列番号48:MAb1重鎖CDRH3のアミノ酸配列(図27)
配列番号49:MAb1軽鎖CDRL1のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
配列番号50:MAb1軽鎖CDRL1のアミノ酸配列(図28)
配列番号51:MAb1軽鎖CDRL2のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
配列番号52:MAb1軽鎖CDRL2のアミノ酸配列(図29)
配列番号53:MAb1軽鎖CDRL3のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
配列番号54:MAb1軽鎖CDRL3のアミノ酸配列(図30)
配列番号55:hMAb1−H1タイプ重鎖をコードするcDNAのヌクレオチド配列(図31)
配列番号56:hMAb1−H1タイプ重鎖のアミノ酸配列(図32)
配列番号57:hMAb1−H2タイプ重鎖をコードするcDNAのヌクレオチド配列(図33)
配列番号58:hMAb1−H2タイプ重鎖のアミノ酸配列(図34)
配列番号59:hMAb1−H3タイプ重鎖をコードするcDNAのヌクレオチド配列(図35)
配列番号60:hMAb1−H3タイプ重鎖のアミノ酸配列(図36)
配列番号61:hMAb1−H4タイプ重鎖をコードするcDNAのヌクレオチド配列(図37)
配列番号62:hMAb1−H4タイプ重鎖のアミノ酸配列(図38)
配列番号63:hMAb1−L1タイプ軽鎖をコードするcDNAのヌクレオチド配列(図39)
配列番号64:hMAb1−L1タイプ重鎖のアミノ酸配列(図40)
配列番号65:hMAb1−L2タイプ重鎖をコードするcDNAのヌクレオチド配列(図41)
配列番号66:hMAb1−L2タイプ重鎖のアミノ酸配列(図42)
配列番号67:hMAb1−H2又はhMAb1−H4タイプ重鎖のCDRH1(図43)
配列番号68:hMAb1−H2又はhMAb1−H4タイプ重鎖のCDRH2(図44)
配列番号69:hMAb1−H2又はhMAb1−H4タイプ重鎖のCDRH3(図45)
配列番号70:hMAb1−L2タイプ軽鎖のCDRL1(図46)
配列番号71:hMAb1−L2タイプ軽鎖のCDRL2(図47)
配列番号72:hMAb1−L2タイプ軽鎖のCDRL3(図48)
Claims (23)
- 下記(I)〜(III)記載の性質を有する抗体又はその抗原結合断片:
(I)1×10−8M以下のKD値でヒトROBO4蛋白質に結合する、
(II)イン・ビトロにおいて、クロスリンク抗体非存在下で血管内皮細胞遊走を抑制又は阻害する、及び
(III)イン・ビボにおいて、血管新生を抑制又は阻害する。 - ヒトROBO4蛋白質が、配列表の配列番号2のアミノ酸番号1〜1007のアミノ酸配列からなる蛋白質である、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- ヒトROBO4蛋白質が、配列表の配列番号2のアミノ酸番号46〜1007のアミノ酸配列からなる蛋白質である、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 配列表の配列番号2のアミノ酸番号132〜209のアミノ酸配列からなる部位に結合する、請求項2又は3に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 下記(i)〜(v)に記載の抗体が認識する抗原上の部位に結合する、請求項1〜5のいずれか一つに記載の抗体又はその抗原結合断片、
(i) 配列表の配列番号44(図25)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1、配列表の配列番号46(図26)に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRH2、及び配列表の配列番号48(図27)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖、並びに、配列表の配列番号50(図28)に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1〜3個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRL1、配列表の配列番号52(図29)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2、及び配列表の配列番号54(図30)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖からなる抗体、
(ii) 配列表の配列番号44(図25)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1、配列表の配列番号46(図26)に示されるアミノ酸配列又は配列表の配列番号68(図44)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH2、及び配列表の配列番号48(図27)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖、並びに、配列表の配列番号50(図28)に示されるアミノ酸配列又は配列表の配列番号70(図46)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1、配列表の配列番号52(図29)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2、及び配列表の配列番号54(図30)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖からなる抗体、
(iii) 配列表の配列番号31(図16)に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列表の配列番号33(図18)に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗体、
(iv) 下記a)〜d)より選択されるいずれか一つの重鎖可変領域、及びe)及びf)から選択される軽鎖可変領域を含む、抗体:
a)配列表の配列番号56(図32)のアミノ酸番号20〜137に示されるアミノ酸配列からなる重鎖(hMAb1−H1タイプ)可変領域、
b)配列表の配列番号58(図34)のアミノ酸番号20〜137に示されるアミノ酸配列からなる重鎖(hMAb1−H2タイプ)可変領域、
c)配列表の配列番号60(図36)のアミノ酸番号20〜137に示されるアミノ酸配列からなる重鎖(hMAb1−H3タイプ)可変領域、及び
d)配列表の配列番号62(図38)のアミノ酸番号20〜137に示されるアミノ酸配列からなる重鎖(hMAb1−H4タイプ)可変領域、
並びに
e)配列表の配列番号64(図40)のアミノ酸番号21〜134に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖(hMAb1−L1タイプ)可変領域、及び
f)配列表の配列番号66(図42)のアミノ酸番号21〜134に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖(hMAb1−L2タイプ)可変領域、
(v) 下記1)〜6)に記載の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の組合せのいずれか一つを含む、抗体:
1)配列表の配列番号58(図34)のアミノ酸番号20〜137に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列表の配列番号64(図40)のアミノ酸番号21〜134に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
2)配列表の配列番号58(図34)のアミノ酸番号20〜137に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列表の配列番号66(図42)のアミノ酸番号21〜134に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
3)配列表の配列番号62(図38)のアミノ酸番号20〜137に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列表の配列番号66(図42)のアミノ酸番号21〜134に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域
4)配列表の配列番号62(図38)のアミノ酸番号20〜137に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列表の配列番号64(図40)のアミノ酸番号21〜134に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
5)配列表の配列番号56(図32)のアミノ酸番号20〜137に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列表の配列番号64(図40)のアミノ酸番号21〜134に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、並びに
6)配列表の配列番号60(図36)のアミノ酸番号20〜137に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列表の配列番号64(図40)のアミノ酸番号21〜134に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域。 - ヒトROBO4蛋白質への結合に対して、下記(i)〜(v)のいずれか一つの抗体と競合する、請求項1〜5のいずれか一つに記載の抗体又はその抗原結合断片、
(i) 配列表の配列番号44(図25)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1、配列表の配列番号46(図26)に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRH2、及び配列表の配列番号48(図27)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖、並びに、配列表の配列番号50(図28)に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1〜3個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRL1、配列表の配列番号52(図29)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2、及び配列表の配列番号54(図30)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖からなる抗体、
(ii) 配列表の配列番号44(図25)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1、配列表の配列番号46(図26)に示されるアミノ酸配列又は配列表の配列番号68(図44)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH2、及び配列表の配列番号48(図27)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖、並びに、配列表の配列番号50(図28)に示されるアミノ酸配列又は配列表の配列番号70(図46)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1、配列表の配列番号52(図29)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2、及び配列表の配列番号54(図30)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖からなる抗体、
(iii) 配列表の配列番号31(図16)に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列表の配列番号33(図18)に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗体、
(iv) 下記a)〜d)より選択されるいずれか一つの重鎖可変領域、及びe)及びf)から選択される軽鎖可変領域を含む、抗体:
a)配列表の配列番号56(図32)のアミノ酸番号20〜137に示されるアミノ酸配列からなる重鎖(hMAb1−H1タイプ)可変領域、
b)配列表の配列番号58(図34)のアミノ酸番号20〜137に示されるアミノ酸配列からなる重鎖(hMAb1−H2タイプ)可変領域、
c)配列表の配列番号60(図36)のアミノ酸番号20〜137に示されるアミノ酸配列からなる重鎖(hMAb1−H3タイプ)可変領域、及び
d)配列表の配列番号62(図38)のアミノ酸番号20〜137に示されるアミノ酸配列からなる重鎖(hMAb1−H4タイプ)可変領域、
並びに
e)配列表の配列番号64(図40)のアミノ酸番号21〜134に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖(hMAb1−L1タイプ)可変領域、及び
f)配列表の配列番号66(図42)のアミノ酸番号21〜134に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖(hMAb1−L2タイプ)可変領域、
(v) 下記1)〜6)に記載の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の組合せのいずれか一つを含む、抗体:
1)配列表の配列番号58(図34)のアミノ酸番号20〜137に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列表の配列番号64(図40)のアミノ酸番号21〜134に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
2)配列表の配列番号58(図34)のアミノ酸番号20〜137に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列表の配列番号66(図42)のアミノ酸番号21〜134に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
3)配列表の配列番号62(図38)のアミノ酸番号20〜137に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列表の配列番号66(図42)のアミノ酸番号21〜134に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域
4)配列表の配列番号62(図38)のアミノ酸番号20〜137に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列表の配列番号64(図40)のアミノ酸番号21〜134に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
5)配列表の配列番号56(図32)のアミノ酸番号20〜137に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列表の配列番号64(図40)のアミノ酸番号21〜134に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、並びに
6)配列表の配列番号60(図36)のアミノ酸番号20〜137に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列表の配列番号64(図40)のアミノ酸番号21〜134に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域。 - キメラ抗体又はその抗原結合断片である、請求項1〜7のいずれか一つに記載の抗体又はその抗原結合断片。
- ヒト化抗体又はその抗原結合断片である、請求項1〜7のいずれか一つに記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 抗体が、ヒトIgG1又はヒトIgG2の重鎖定常領域を含む、請求項1〜9のいずれか一つに記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 下記いずれか一つの抗体とアミノ酸配列が95%以上同一であり、ヒトROBO4に対して1×10−8M以下のKD値を有し、イン・ビトロにおいてクロスリンク抗体非存在下で血管内皮細胞遊走を抑制又は阻害し、且つイン・ビボにおいて血管新生を抑制又は阻害する、請求項1〜5のいずれか一つに記載の抗体、
下記1)〜6)に記載の重鎖及び軽鎖の組合せのいずれか一つを含む、抗体:
1)配列表の配列番号58(図34)のアミノ酸番号20〜463に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号64(図40)のアミノ酸番号21〜239に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖(H−1140)、
2)配列表の配列番号58(図34)のアミノ酸番号20〜463に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号66(図42)のアミノ酸番号21〜239に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖(H−1143)、
3)配列表の配列番号62(図38)のアミノ酸番号20〜463に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号66(図42)のアミノ酸番号21〜239に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖(H−2143)、
4)配列表の配列番号62(図38)のアミノ酸番号20〜463に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号64(図40)のアミノ酸番号21〜239に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖(H−2140)、
5)配列表の配列番号56(図32)のアミノ酸番号20〜463に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号64(図40)のアミノ酸番号21〜239に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖(H−1040)、並びに
6)配列表の配列番号60(図36)のアミノ酸番号20〜463に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号64(図40)のアミノ酸番号21〜239に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖(H−2040)。 - ヒト抗体又はその抗原結合断片である、請求項6に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 下記(I)〜(III)からなる群より選択される核酸:
(I)請求項1〜12のいずれか一つに記載の抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸、
(II)請求項1〜12のいずれか一つに記載の抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列からなる核酸、及び
(III)請求項1〜12のいずれか一つに記載の抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなる核酸。 - 請求項13記載の核酸が挿入された組換えベクター。
- 請求項13記載の核酸又は請求項14記載の組換えベクターが導入された組換え細胞。
- 請求項1〜12のいずれか一つに記載の抗体を産生する細胞。
- 下記の工程(I)及び(II)を含む、請求項1〜12のいずれか一つに記載の抗体又はその抗原結合断片の製造方法:
(I)請求項15又は16記載の細胞を培養する工程;及び
(II)前記工程(I)で得られた培養物から請求項1〜12のいずれか一つに記載の抗体又はその抗原結合断片を回収する工程。 - 請求項17に記載の製造方法により製造された抗体又はその抗原結合断片。
- N−結合への糖鎖付加、O−結合への糖鎖付加、N末のプロセッシング、C末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、プロリン残基のアミド化及びカルボキシル末端において1つ又は2つのアミノ酸が欠失した重鎖からなる群より選択される1又は2以上の修飾を含む、請求項1〜12及び18のいずれか一つに記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 請求項1〜12、18及び19のいずれか一つに記載の抗体もしくはその抗原結合断片を有効成分として含んでなる医薬組成物。
- 血管新生性疾患の治療または予防で使用するためのものである、請求項20に記載の医薬組成物。
- 請求項1〜12、18及び19のいずれか一つに記載の抗体もしくはその抗原結合断片を有効成分として含んでなる血管新生阻害剤。
- さらなる治療薬または予防薬と併用される、請求項20又は21に記載の医薬組成物。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012103929A JP2013230115A (ja) | 2012-04-27 | 2012-04-27 | 抗robo4抗体 |
JP2012103929 | 2012-04-27 | ||
JP2013011042 | 2013-01-24 | ||
JP2013011042A JP2014141434A (ja) | 2013-01-24 | 2013-01-24 | 抗robo4抗体 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015507659A Division JP5897205B2 (ja) | 2012-04-27 | 2013-04-26 | 抗robo4抗体 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2016175893A true JP2016175893A (ja) | 2016-10-06 |
JP6267733B2 JP6267733B2 (ja) | 2018-01-24 |
Family
ID=48670623
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015507659A Active JP5897205B2 (ja) | 2012-04-27 | 2013-04-26 | 抗robo4抗体 |
JP2016038918A Active JP6267733B2 (ja) | 2012-04-27 | 2016-03-01 | 抗robo4抗体 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015507659A Active JP5897205B2 (ja) | 2012-04-27 | 2013-04-26 | 抗robo4抗体 |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9683040B2 (ja) |
EP (1) | EP2841457B1 (ja) |
JP (2) | JP5897205B2 (ja) |
KR (2) | KR20190020838A (ja) |
CN (1) | CN104768973B (ja) |
AU (1) | AU2013254313B2 (ja) |
BR (1) | BR112014026649A2 (ja) |
CA (1) | CA2868074A1 (ja) |
CO (1) | CO7111295A2 (ja) |
DK (1) | DK2841457T3 (ja) |
ES (1) | ES2733434T3 (ja) |
HK (1) | HK1207093A1 (ja) |
IN (1) | IN2014DN07799A (ja) |
MX (1) | MX356749B (ja) |
MY (1) | MY166821A (ja) |
NZ (1) | NZ629291A (ja) |
PH (1) | PH12014502382B1 (ja) |
PL (1) | PL2841457T3 (ja) |
RU (1) | RU2682451C2 (ja) |
SG (1) | SG11201405718QA (ja) |
TW (1) | TWI606065B (ja) |
WO (1) | WO2013160879A1 (ja) |
ZA (1) | ZA201406235B (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20210070643A (ko) | 2019-12-05 | 2021-06-15 | 김명배 | 자체 발전 웨어러블 다리 |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104768973B (zh) * | 2012-04-27 | 2019-01-22 | 第一三共株式会社 | 抗robo4抗体 |
IL258322B2 (en) | 2015-09-24 | 2023-10-01 | Daiichi Sankyo Co Ltd | Antibodies against GARP, nucleotides encoding them, and vectors, cells and preparations containing them, methods for their preparation and uses thereof |
US20190300607A1 (en) * | 2016-10-12 | 2019-10-03 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Composition containing anti-robo4 antibody and other agents |
WO2023156437A1 (en) | 2022-02-16 | 2023-08-24 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Anti-robo4 human monoclonal antibodies and uses thereof for the treatment of cancer |
CN117384290B (zh) * | 2023-12-11 | 2024-04-09 | 苏州因特药物研发有限公司 | 人源robo1结合分子及其应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006524485A (ja) * | 2002-11-20 | 2006-11-02 | キャンサー・リサーチ・テクノロジー・リミテッド | 抗体、ポリペプチドおよびその使用 |
JP2010518115A (ja) * | 2007-02-09 | 2010-05-27 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 抗Robo4抗体およびそれらのための使用 |
JP5897205B2 (ja) * | 2012-04-27 | 2016-03-30 | 第一三共株式会社 | 抗robo4抗体 |
Family Cites Families (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5260203A (en) | 1986-09-02 | 1993-11-09 | Enzon, Inc. | Single polypeptide chain binding molecules |
US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
US5091513A (en) | 1987-05-21 | 1992-02-25 | Creative Biomolecules, Inc. | Biosynthetic antibody binding sites |
IL162181A (en) | 1988-12-28 | 2006-04-10 | Pdl Biopharma Inc | A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same |
AU665190B2 (en) | 1990-07-10 | 1995-12-21 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
WO1993006213A1 (en) | 1991-09-23 | 1993-04-01 | Medical Research Council | Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach |
ATE463573T1 (de) | 1991-12-02 | 2010-04-15 | Medimmune Ltd | Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken |
EP0656941B1 (en) | 1992-03-24 | 2005-06-01 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
GB9313509D0 (en) | 1993-06-30 | 1993-08-11 | Medical Res Council | Chemisynthetic libraries |
CA2177367A1 (en) | 1993-12-03 | 1995-06-08 | Andrew David Griffiths | Recombinant binding proteins and peptides |
US6214388B1 (en) | 1994-11-09 | 2001-04-10 | The Regents Of The University Of California | Immunoliposomes that optimize internalization into target cells |
US6972323B1 (en) | 1997-04-01 | 2005-12-06 | Sankyo Company, Limited | Anti-Fas antibodies |
ES2571230T3 (es) | 1999-04-09 | 2016-05-24 | Kyowa Hakko Kirin Co Ltd | Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional |
EP2314686B2 (en) | 2000-10-06 | 2023-06-21 | Kyowa Kirin Co., Ltd. | Cells producing antibody compositions |
EP1790728B1 (en) * | 2000-11-06 | 2010-09-08 | Cancer Research Technology Limited | Imaging, diagnosis and treatment of disease |
JP4583638B2 (ja) * | 2001-03-15 | 2010-11-17 | 独立行政法人科学技術振興機構 | アセチルリジン認識モノクローナル抗体及びその製造方法 |
CA2490713A1 (en) | 2002-06-27 | 2004-01-08 | University Of Utah Research Foundation | Methods and compositions for manipulating the guided navigation of endothelial tubes during angiogenesis |
BRPI0406678A (pt) | 2003-01-07 | 2005-12-20 | Symphogen As | Método para produzir proteìnas policlonais recombinantes |
EP2104509A4 (en) | 2006-12-11 | 2010-03-24 | Univ Utah Res Found | COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF PATHOLOGICAL ANGIOGENESIS AND VASCULAR PERMEABILITY |
TWI480050B (zh) * | 2009-02-10 | 2015-04-11 | Daiichi Sankyo Co Ltd | 抗-mst1r抗體及其用途 |
-
2013
- 2013-04-26 CN CN201380019999.8A patent/CN104768973B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2013-04-26 BR BR112014026649A patent/BR112014026649A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2013-04-26 SG SG11201405718QA patent/SG11201405718QA/en unknown
- 2013-04-26 MX MX2014012351A patent/MX356749B/es active IP Right Grant
- 2013-04-26 NZ NZ629291A patent/NZ629291A/en not_active IP Right Cessation
- 2013-04-26 EP EP13730645.2A patent/EP2841457B1/en active Active
- 2013-04-26 IN IN7799DEN2014 patent/IN2014DN07799A/en unknown
- 2013-04-26 WO PCT/IB2013/053312 patent/WO2013160879A1/en active Application Filing
- 2013-04-26 KR KR1020197004552A patent/KR20190020838A/ko not_active Application Discontinuation
- 2013-04-26 KR KR1020147029492A patent/KR101950898B1/ko active IP Right Grant
- 2013-04-26 DK DK13730645.2T patent/DK2841457T3/da active
- 2013-04-26 ES ES13730645T patent/ES2733434T3/es active Active
- 2013-04-26 US US14/397,210 patent/US9683040B2/en active Active
- 2013-04-26 CA CA2868074A patent/CA2868074A1/en not_active Abandoned
- 2013-04-26 AU AU2013254313A patent/AU2013254313B2/en not_active Ceased
- 2013-04-26 TW TW102115219A patent/TWI606065B/zh not_active IP Right Cessation
- 2013-04-26 PL PL13730645T patent/PL2841457T3/pl unknown
- 2013-04-26 JP JP2015507659A patent/JP5897205B2/ja active Active
- 2013-04-26 RU RU2014147616A patent/RU2682451C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2013-04-26 MY MYPI2014703067A patent/MY166821A/en unknown
-
2014
- 2014-08-25 ZA ZA2014/06235A patent/ZA201406235B/en unknown
- 2014-10-24 PH PH12014502382A patent/PH12014502382B1/en unknown
- 2014-10-27 CO CO14236457A patent/CO7111295A2/es unknown
-
2015
- 2015-08-10 HK HK15107712.5A patent/HK1207093A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2015-12-11 US US14/966,292 patent/US9562096B2/en active Active
-
2016
- 2016-03-01 JP JP2016038918A patent/JP6267733B2/ja active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006524485A (ja) * | 2002-11-20 | 2006-11-02 | キャンサー・リサーチ・テクノロジー・リミテッド | 抗体、ポリペプチドおよびその使用 |
JP2010518115A (ja) * | 2007-02-09 | 2010-05-27 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 抗Robo4抗体およびそれらのための使用 |
JP5897205B2 (ja) * | 2012-04-27 | 2016-03-30 | 第一三共株式会社 | 抗robo4抗体 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
DEVELOPMENTAL CELL, vol. Vol.20, JPN6015036588, 2011, pages 33 - 46 * |
EXPERIMENTAL RESEARCH, vol. 318, no. 4, JPN6015036590, February 2012 (2012-02-01), pages 371 - 378 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20210070643A (ko) | 2019-12-05 | 2021-06-15 | 김명배 | 자체 발전 웨어러블 다리 |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6267733B2 (ja) | 抗robo4抗体 | |
JP6188681B2 (ja) | 抗fgfr2抗体 | |
JP5688433B2 (ja) | 抗epha2抗体 | |
CN118126180A (zh) | 抗cd3抗体和包含所述抗体的分子 | |
JP2019151635A (ja) | 抗fgfr2抗体と他剤の組合せ | |
WO2018070390A1 (ja) | 抗robo4抗体と他剤を含む組成物 | |
WO2019022187A1 (ja) | 抗cd147抗体 | |
WO2016171107A1 (ja) | Fgfr2の検出 | |
JP2013230115A (ja) | 抗robo4抗体 | |
JP2014141434A (ja) | 抗robo4抗体 | |
JP7384668B2 (ja) | 細胞傷害性t細胞枯渇用組成物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170417 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20170615 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170714 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20171204 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6267733 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |