CN113652488B - Ctsf在非小细胞肺癌脑转移疗效评价中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子诊断、生物医药领域，具体涉及CTSF在非小细胞肺癌脑转移疗效评价中的应用，所述CTSF降低代表治疗有效果/预后好，所述CTSF升高代表治疗效果差/预后差。优选地，所述治疗效果包括肺癌脑转移患者治疗后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月或更久时间内的治疗效果；所述预后是自确诊肺癌/肺癌脑转移起5个月、10个月、15个月、20个月、25个月、30个月、35个月、40个月、45个月或更久时间的患者情况。

Description

CTSF在非小细胞肺癌脑转移疗效评价中的应用
技术领域
本发明涉及分子诊断、生物医药领域，具体涉及CTSF在非小细胞肺癌脑转移疗效评价中的应用。
背景技术
肺癌是全球范围内高发病率及高死亡率的恶性肿瘤，而易发生远处转移是肺癌高死亡率的主要原因。NSCLC(Non-small cell lung cancer，非小细胞肺癌)约占肺癌总数的85％，30％-50％的NSCLC患者在病程中发生脑转移，50％的脑转移在患者确诊NSCLC时就已经出现，且其中的50-60％是唯一的远处转移器官。由于脑血管与供应大脑的椎动脉、颈动脉丛之间，有大量的血管处于吻合状态，来自肺部的癌细胞可以不经过肺毛细血管网的过滤作用，直接通过上面提到的吻合血管转移到大脑的位置。这就好比开通了快捷通道，肺癌脑转移发生的机会因此比其他的癌种要大一些。脑转移患者的预后差，中位生存期仅为4-6个月。
通常肺癌脑转移的症状表现有：耳鸣、耳聋：这种肺癌脑转移的症状多在打电话时发觉，即一耳能听到，另一耳则听不到；幻嗅：颞叶部肿瘤可在其刺激下出现幻嗅，即可闻到一种并不存在的气味，如烧焦饭或焦橡胶等气味，这是典型的肺癌脑转移的症状；偏瘫或踉跄步态：小脑部病变更具特异性，即患者常在头痛、呕吐、视物障碍之后，肺癌脑转移的症状出现偏瘫或踉跄的醉酒步态；精神异常：位于大脑前部额叶的脑瘤可破坏额叶的精神活动，肺癌脑转移的症状引起兴奋、躁动、忧郁、压抑、遗忘、虚构等精神异常表现；单侧肢体感觉异常或无力：这种肺癌脑转移的症状位于脑半球中部的顶叶，专管感觉，该部位肿瘤常会导致单侧肢体痛、温、震动、形体辨别觉减退或消失。
目前，肺癌脑转移的治疗进入精准医疗时代，随着放疗、靶向治疗、手术技术的进步，肺癌脑转移患者的预后得到明显改善，但是对于每位患者的治疗是否有效还不易评价，因此本领域急需可以判断肺癌脑转移患者的治疗效果的标志物。
发明内容
应用
一方面，本发明提供了检测CTSF表达量的试剂在制备判断肺癌脑转移患者的治疗效果/预后的产品中的应用。
优选地，所述CTSF降低代表治疗有效果/预后好，所述CTSF升高代表治疗效果差/预后差。
优选地，所述治疗效果包括肺癌脑转移患者治疗后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月或更久时间内的治疗效果。
优选地，所述评价治疗效果的结果包括完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、疾病进展(PD)、疾病稳定(SD)，所述结果可以预测未来1个月、2个月或更久的病情发展情况。
优选地，所述预后是自确诊肺癌起5个月、10个月、15个月、20个月、25个月、30个月、35个月、40个月、45个月或更久时间的患者情况。
优选地，所述预后是自确诊肺癌脑转移起5个月、10个月、15个月、20个月、25个月、30个月、35个月、40个月、45个月或更久时间的患者情况。
优选地，所述预后的指标包括客观缓解率(Objective Response Rate，ORR)、生存期、总体存活率(Overall survival rate，Overall survival，OS)、无进展生存期(progression-free survival，PFS)、疾病进展时间(time to progress，TTP)、无病生存期(Disease-free survival，DFS)、治疗失败时间(time to treatment failure，TTF)、应答率(RR)、完全应答(CR)、部分应答(PR)。
优选地，所述预后是指无进展生存期。
优选地，所述肺癌包括小细胞肺癌(SCLC，mall cell lung cancer)、非小细胞肺癌(NSCLC，Non-small cell lung cancer)。
优选地，所述肺癌是非小细胞肺癌。
优选地，所述非小细胞肺癌包括鳞状细胞癌(鳞癌)、腺癌、大细胞癌。
优选地，所述检测需要采集来自受试者的样品。
优选地，所述样品包括：血液、鼻上皮细胞、组织、尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊髓液、泪液、痰、粘液、淋巴、胞液、腹水、胸膜积液、羊水、膀胱冲洗液和支气管肺泡灌洗液。
优选地，所述血液包括血清、全血、血浆。
优选地，所述样品是血清。
优选地，所述检测表达量的试剂包括检测蛋白表达量和/或mRNA表达量的试剂。
优选地，所述检测蛋白表达量的试剂包括以下方法中使用的试剂：蛋白质印迹(Western Blot法)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、夹心测定、免疫组织化学染色、质谱法、免疫沉淀分析法、补体结合分析法、流式细胞荧光分边技术和蛋白质芯片法。
优选地，所述检测蛋白表达量的试剂包括ELISA方法中使用的试剂。
优选地，所述检测蛋白表达量的试剂包括特异性抗体或其片段，所述特异性抗体可以与CTSF的蛋白特异性结合。
优选地，所述抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。
优选地，所述检测蛋白表达量的试剂还包括二抗，所述二抗能与前述的抗体结合。
优选地，所述特异性抗体或其片段、二抗上可以连接可检测标志物。
如本文中所使用的，术语“可检测的标记”是指，可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何组合物，检测到所述可检测标志物显示就表示蛋白有表达。
在本发明中，特别优选的是，此类标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。这类标记是本领域熟知的，包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、吖啶酯类化合物、磁珠、测热标记物例，如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)、以及生物素。
优选地，所述可检测标志物包括过氧化物酶。
优选地，所述过氧化物酶是辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)。
优选地，所述HRP可以使TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)显色。
优选地，所述检测mRNA表达量的试剂包括以下方法中使用到的试剂：基于PCR的检测方法、Southern杂交方法、Northern杂交方法、点杂交方法、荧光原位杂交方法、DNA微阵列方法、ASO法、高通量测序平台方法。
优选地，所述检测mRNA表达量的试剂包括特异性引物和/或探针。
优选地，所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。优选地，本发明所测定的蛋白表达量是细胞质中的细胞表达量。
产品
另一方面，本发明提供了一种判断肺癌脑转移患者的治疗效果/预后的试剂盒，所述试剂盒包括检测CTSF的表达量的试剂。
优选地，所述试剂盒还包括前述检测mRNA和/或蛋白表达量所使用的仪器。
优选地，所述试剂盒还包括检测其他疾病标志物的试剂和/或仪器。
优选地，所述试剂盒中还可以包括mRNA表达量辅助检测试剂、蛋白表达量辅助检测试剂、mRNA表达量辅助检测仪器、蛋白表达量辅助检测仪器。
优选地，所述mRNA表达量辅助检测试剂包括但不限于：使所述引物对应的扩增子可视化的反应试剂，例如通过琼脂糖凝胶电泳法、酶联凝胶法、化学发光法、原位杂交法、荧光检测法等使扩增子可视化的试剂；RNA提取试剂；逆转录试剂；cDNA扩增试剂；制备标准曲线所用的标准品；阳性对照品；阴性对照品。
优选地，所述蛋白表达量辅助检测试剂包括但不限于：封闭液、抗体稀释液、洗涤缓冲液、显色终止液、制备标准曲线的标准品。
优选地，所述试剂盒包括qPCR试剂盒、ELISA试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫组化检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、电化学发光检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒。
进一步，所述试剂盒还包括容器、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂、溶剂，以及附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对结果进行判断。
另一方面本发明还提供了前述试剂盒在制备判断肺癌脑转移患者的治疗效果/预后的产品中的应用。
方法
另一方面，本发明提供了一种判断肺癌脑转移患者的治疗效果/预后的方法，所述方法包括检测CTSF的表达量的步骤。
优选地，所述方法还包括根据CTSF的表达量判断诊断结果的步骤。
附图说明
图1是质谱数据质控检测的结果图；A.质谱仪的质量精度分布，B.蛋白覆盖度与分子量关系，C.重复样本间蛋白定量RSD(相对标准差)分布箱线图。
图2为蛋白组学筛选候选蛋白的分析结果图；A.蛋白组学鉴定的差异蛋白数量，B.差异蛋白火山图，C：候选蛋白的血清学检测结果。
图3是六位患者治疗过程中的血清中标志物浓度变化，ABCDEF分别代表不同患者。
图4是患者4于治疗第3、5、7月时的脑核磁影像学表现，A.3个月，B.5个月，C.7个月，D.血清中标志物浓度变化。
图5是患者5于治疗第1、3、6、14月时的脑核磁影像学表现，A.1个月，B.3个月，C.6个月，D.14个月，E.血清中标志物浓度变化。
图6是CTSF是组织表达和无进展生存率的相关性分析结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
本发明所使用的仪器和试剂如以下表1、2所示：
表1、本发明所使用的仪器
仪器名称 生产公司 产地
高速冷冻离心机 Beckman Coulter 德国
低速离心机 北京时代北利 中国
医用离心机(手掌式) 江苏新康 中国
-80℃超低温冰箱、 Thermo Scientific 美国
Strata X C18 Phenomenex 美国
色谱柱Agilent 300Extend C18 安捷伦 中国
EASY-nLC 1000超高效液相系统 Thermo Scientific 美国
表2、本发明所使用的试剂
Figure BDA0003262526000000061
Figure BDA0003262526000000071
Figure BDA0003262526000000081
通用方法
实体瘤的疗效评价标准
1.1肿瘤病灶基线的定义
肿瘤病灶基线分为可测量病灶和不可测量病灶，其中可测量病灶：(1)至少有一条可以精确测量的径线的病灶；(2)根据CT或MRI评价，病灶最长直径至少为10mm(2个层厚,层厚5-8mm)；(3)恶性淋巴结：病理学增大且可测量，单个淋巴结CT扫描短径须≥15mm(CT扫描层厚推荐不超过5mm)。基线和随访中，仅测量和随访短径。不可测量病灶：(1)包括小病灶(短轴在10-14.9mm的淋巴结)和真正无法测量的病灶，如胸膜或心包积液、腹水、软脑膜病、累及皮肤或肺的淋巴管炎，以及重现影像技术无法测量的；(2)骨病：骨病为不可测量的疾病，除软组织成份可采用CT或MRI评价外；(3)既往局部治疗：既往放疗病灶(或其它局部治疗的病灶)为不可测量病灶，除非治疗完成后进展。正常部位：(1)囊性病灶：单纯囊肿不应视为恶性病灶，也不应记录为目标病灶或非目标病灶，但囊性转移病灶是可测量病灶；(2)良性结节：短轴＜10mm的结节被视为良性。
1.2疗效评价方式
在基线时必须评价所有疾病部位，并在抗肿瘤治疗前进行。所有累及器官中每个器官最多2个病灶，共观测5个病灶，所有可测量病灶应视为基线目标病灶。记录每个病灶的最长直径，除外病理学淋巴结应记录短轴。基线时所有目标病灶直径(非结节病灶的最长径，结节病灶的最短轴)的总和是试验中进行的评价比较的基础。若两个病灶融合，就测量融合的肿块。如果目标病灶分裂，则使用各部分的总和。如果目标病灶缩小到不能测量，如认为病灶已消失则记录为0mm；反之应默认记录值为5mm。
1.3疗效评价缓解标准
疾病部位评价须采用与基线相同的方法，包括具体扫描方式的一致性。
1、目标病灶
(1)完全缓解(CR)：除结节性疾病外，所有目标病灶完全消失。所有目标结节缩小至正常大小(短轴＜10mm)。所有目标病灶均须评价；
(2)部分缓解(PR)：所有可测量目标病灶的直径总和低于基线≥30％。目标结节总和使用短径，而所有其它目标病灶的总和使用最长直径。所有目标病灶均须评价；
(3)疾病进展(PD)：以整个实验研究过程中所有测量的靶病灶直径之和的最小值为参照，直径和相对增加至少20％(如果基线测量值最小就以基线值为参照)；除此之外，必须满足直径和的绝对值增加至少5mm(出现一个或多个新病灶也视为疾病进展)；
(4)疾病稳定(SD)：靶病灶减小的程度没达到PR，增加的程度也没达到PD水平，介于两者之间，研究时可以直径之和的最小值作为参考。
2、非目标病灶
(1)CR：所有非目标病灶消失或肿瘤标志物水平正常。所有淋巴结大小必须减小至短轴＜10mm；
(2)非CR/非PD：任何非目标病灶持续存在和/或肿瘤标志物水平高于正常上限；
(3)PD：已有病灶明确进展。目标病灶SD或PR时，罕见由于非目标病灶明确增大的进展。
3、新病灶
出现任何新发明确的恶性肿瘤病灶都评价为PD。如果新病灶不明确，例如体积较小，进一步评价会明确病因。如果重复评价明确病灶，那么应在首次评价日期记录进展，在以前未扫描区发现的病灶被认为是新病灶。
蛋白组学测序
(1)细胞分泌液准备
将肺癌高脑转移细胞系PC9-BrM3及其亲代细胞系PC9在添加了10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的1640培养基中培养，培养环境为37℃、5％的CO2。待细胞密度到培养皿面积的85％左右时，弃掉培养基改为无血清的1640培养基继续培养24小时。收集细胞分泌液后在4℃下1000g低速离心5分钟去除细胞，收集上清液。将上清液继续4℃，12000g离心5分钟，收集上清液，目的是去除细胞碎片。高脑转移细胞系PC9-BrM3及其亲代细胞系PC9各收取150ml上清液，平均分成3份每份各50ml于-80℃冰箱冻存。
(2)蛋白提取
首先，将样品从-80℃冰箱中取出，放置在室温环境中将其解冻。等到样本完全解冻后，在4℃，12000g的条件下离心10分钟，去除样本中的固体杂质。然后，将离心后的上清液转移至超滤离心管(millipore)中，在4℃，5000g的条件下离心浓缩，令上清液浓缩至0.5mL。最后，用8M尿素置换一次，并通过BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。
(3)胰酶酶解
首先，从各样品取等量蛋白，加入适量标准蛋白，用裂解液将其体积调整至一致。然后，缓慢加入终浓度20％的三氯乙酸(TCA)，涡旋混匀仪使溶液充分混合，4℃静置沉淀2小时。4500g离心5分钟，弃掉上清液，并用预冷的丙酮洗涤沉淀2-3次。待沉淀物晾干后，加入终浓度200mM的三乙基碳酸氢铵缓冲液(TEAB)重悬沉淀，并通过超声处理将沉淀打散。以1：50(蛋白酶：蛋白，m/m)加入胰蛋白酶，酶解过夜。之后，加入终浓度5mM的二硫苏糖醇(DTT)，在56℃条件下还原30分钟。最后，加入终浓度11mM的碘乙酰胺(IAA)，在室温、避光条件下孵育15分钟。
(4)TMT标记
将胰酶酶解得到的肽段样品溶液用Strata X C18(Phenomenex)除盐后真空冷冻干燥。用浓度为0.5M的TEAB溶解肽段。最后，根据TMT试剂盒的操作说明来标记肽段，操作如下：将标记试剂解冻后用乙腈溶解，与肽段混合后，室温环境孵育2小时，在标记实验后将所有样品的肽段溶液混合成一份，最后进行除盐并真空冷冻干燥。
(5)HPLC分级
选用色谱柱为Agilent 300Extend C18(5μm粒径，4.6mm内径，250mm长)，在高pH值下对肽段进行反相HPLC分级。具体的操作方法为：肽段分级梯度为8％-32％乙腈，pH值为9，60分钟时间分离60个组分，随后肽段合并为14个组分，合并后的组分经真空冷冻干燥后进行后续操作。
(6)液相色谱-质谱联用分析
将肽段用液相色谱流动相A(含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液)溶解后使用EASY-nLC 1000超高效液相系统进行分离。设置液相梯度为：0-20分钟，8％～22％流动相B(含0.1％甲酸和90％乙腈的水溶液)；20-33分钟，22％～35％流动相B；33-37分钟，35％～80％流动相B；37-40分钟，80％流动相B，流速维持在600nL/分钟。肽段经由超高效液相系统分离后被注入NSI离子源中进行电离，然后Q Exactive Plus质谱进行分析。将离子源电压设置为2.2kV，肽段母离子及其二级碎片使用高分辨的Orbitrap进行检测分析。一级质谱扫描范围设置为400-1500m/z，扫描分辨率设置为70,000；二级质谱扫描范围则固定起点为100m/z，二级扫描分辨率设置为17,500。
数据采集模式使用数据依赖型扫描(DDA)程序，即在一级扫描后选择信号强度最高的前20肽段母离子依次进入HCD碰撞池，使用30％的碎裂能量进行碎裂，同样依次进行二级质谱分析。
为了提高质谱的有效利用率，自动增益控制(AGC)设置为5E4，信号阈值设置为63000ions/s，最大注入时间设置为80ms，串联质谱扫描的动态排除时间设置为30秒，以避免母离子的重复扫描。
(7)数据库搜索
二级质谱数据使用Maxquant(v1.5.2.8)进行检索。检索参数设置如下：
1、选择数据库为Homo_sapiens_9606_SP_20191115(20380条序列)；
2、添加了反库，用于计算随机匹配造成的假阳性率(FDR)；
3、加入了常见的污染库，用于消除鉴定结果中污染蛋白的影响；
4、酶切方式设置为Trypsin/P；
5、漏切位点数设为2；
6、肽段最小长度设置为7个氨基酸残基；
7、肽段最大修饰数设为5；
8、First search和Main search的一级母离子质量误差容忍度分别设为20ppm和5ppm，二级碎片离子的质量误差容忍度为0.02Da；
9、将半胱氨酸烷基化设置为固定修饰，可变修饰为甲硫氨酸的氧化，蛋白N端的乙酰化，脱酰胺化(NQ)；
10、定量方法设置为TMT-6plex；
11、蛋白鉴定、PSM鉴定的FDR都设置为1％。
血清及组织样品采集
根据标准操作程序收集患者血清样品，简言之，每位受试者采2ml外周血收集于采血管中，使其凝结30分钟，分离出上层血清，将血清以1,000g/分钟离心15分钟，用EP管收集上层血清，保存在-80℃冰箱中备用。对规律随访的患者每个治疗周期进行一次血清采集，于每次治疗前进行，直至研究结束或出现临床终点。
组织标本于手术切除或穿刺活检时获得，选取样本要求有足够数量的肿瘤细胞，并避开坏死组织。无水甲醛固定，石蜡包埋，于切片机中以3um标准分离组织并固定于防脱载玻片上，恒温鼓风干燥箱中60℃烘片2-3小时。
酶联免疫吸附测定(ELISA)
使用购自Omin.mAbs、Elabscience、武汉华美、上海江莱公司的人CTSF、FBLN1、AKR1B10、CCL20、SAA1、CXCL1、CXCL3、AXL、AKR1C3、CPNE3定量ELISA试剂盒，对候选蛋白的血清浓度进行检测。将置于-80℃的患者血清取出缓慢融化，融化后充分摇晃混匀，将ELISA试剂盒从-4℃冰箱中取出室温后使用。
将50μL/100μL的标准品及按照标准方法采集的患者血清分别添加到预先包备好对应抗体的微量滴定板加样孔中，每份样本重复3次以保证实验结果准确性。设置空白孔，不添加样品及ELISA试剂，其余操作相同。
在37℃恒温摇床内孵育45分钟后弃掉液体，重复洗板4次，每次30秒。将50μL生物素化抗体IgG工作液加入加样孔中(标准品因已预先整合了生物素抗体，因此无需额外添加生物素抗体)，37℃恒温摇床中孵育30分钟℃后弃掉液体，重复洗板4次，每次30秒。在所有加样孔中加入50μL辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，在37℃恒温水浴锅中孵育15分钟后弃掉液体，重复4次洗板，每次30秒。以此向所有孔中加入50μL的TMB显色液A和TMB显色液B，37℃孵育使其和辣根过氧化物酶充分反映，15分钟后立即加入50μl终止液终止反应并观察到颜色变化。在加入终止溶液后15分钟内于酶标仪450nm处测量光密度(OD)，将空白孔OD值设置为零后，确定检测样品的OD值。OD值与蛋白浓度成正比，通过标准曲线的拟合公示来计算样本中蛋白质浓度。
免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)
于通风橱中将组织切片在重复3次的二甲苯中脱蜡，梯度浓度的乙醇中水化，流水冲洗10分钟；将3％的内源性过氧化物酶阻断剂滴到切片上，37℃水浴锅中孵育15分钟，弃掉液体，将切片于PBS溶液中浸泡清洗，重复5次每次5分钟；提前使用微波炉将柠檬酸钠抗原修复液(10mmol/L，pH6)加热至沸腾，待沸腾后将切片浸泡于抗原修复液中，继续加热20分钟修复抗原，并使其缓慢降至室温；滴加山羊血清进行非特异性结合位点封闭，以覆盖全部组织为准，37℃水浴锅中孵育10分钟，弃掉液体；按照预实验探索的最佳抗体浓度(CTSF1：100；FBLN1 1：300；AKR1B10 1：500)分别滴加购于R&D systems、Santa CruzBiotechnology、Abcam公司的重组抗体，于切片盒中4℃孵育过夜；取出切片缓至室温，弃掉一抗将切片于PBS溶液中浸泡清洗，重复5次每次5分钟；滴加生物素标记山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，37℃水浴锅中孵育30分钟，弃掉液体，将切片于PBS溶液中浸泡清洗，重复5次每次5分钟；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃水浴锅中孵育30分钟，弃掉液体，将切片于PBS溶液中浸泡清洗，重复5次每次5分钟；滴加二氨基联苯胺(DAB)在辣根过氧化物酶催化下充分反映后弃掉液体，并于流水冲洗10分钟；滴加苏木素染色液标记细胞核染色，流水冲洗10分钟；于通风橱中完成梯度浓度乙醇及3次二甲苯脱水后用中性树胶封片；待树胶风干后于正置显微镜下观察切片染色情况。每次免疫组化实验中都包含抗原表达水平不同的组织，以减少操作误差带来的偏倚。由两名独立的病理学家对染色情况进行评估，综合考虑染色强度及染色范围赋分：阴性为0分；弱阳性为1分；阳性为2分；强阳性为3分。将≥2分定义为高表达，<2分定义为低表达。阳性对照在http://www.proteinatlas.org中提供。
统计分析
使用SPSS 23.0软件及RStudio 1.3.1093软件(R语言4.0.3)进行统计分析，GraphPad Prism 8对ELISA数据进行统计分析，P值小于0.05认为具有统计学意义。
应用ANOVA(Analysis of Variance，方差分析)测量实验组与各对照组间候选蛋白的血清表达差异；T检验或方差分析用于评估血清CTSF、FBLN1水平与患者临床变量间的关系；Pearson卡方检验或Fisher精确检验用于评估组织CTSF、FBLN1表达与患者临床变量间的相关性；应用R语言nonrandom软件包进行倾向性得分匹配，random Forest软件包构建随机森林模型。通过敏感性和特异性评估CTSF、FBLN1对非小细胞肺癌脑转移患者的预测价值，并通过ROC曲线分析确定诊断临界值，最佳临界点是通过距离ROC曲线对角线最远点且灵敏度和特异性总和最大来确定的；logistic回归分析用于构建基于生物标志物组的诊断预测模型。
实施例1、分子标志物的筛选
本发明所使用的PC9人肺腺癌细胞系采购自中国科学院上海生科院细胞库，PC9-BrM3肺癌高脑转移细胞系由构建的肺癌高脑转移动物模型中脑转移瘤分离培养获得，构建方法如下：
构建基于动物模型的肺癌高脑转移细胞系：培养稳定表达GFP-荧光素酶融合蛋白(GFP-luciferase)的亲本肺癌细胞株PC9，用氯胺酮(ketamine)和甲苯噻嗪(xylazine)将雌性免疫缺陷BALB-c-nu小鼠麻醉，将转染的肺癌PC9细胞注射入小鼠的左心室使裸鼠形成脑内转移瘤病灶。腹腔注射荧光素酶底物D-Luciferin，通过动物活体成像仪成像观察脑内转移瘤情况。
肺癌脑转移细胞的富集及培养：通过对免疫缺陷小鼠心内注射肺癌细胞系PC9，3周后脑内转移瘤成瘤，分离脑内转移瘤后进行原代培养获取肺癌脑转移细胞系PC9-BrM1，再次对免疫缺陷小鼠按上述方式心内注射PC9-BrM1细胞系，如此重复3次“心内注射-分离脑内转移瘤-原代培养获得肺癌高脑转移细胞系”以富集肺癌细胞脑转移特征，并依次获得肺癌脑转移细胞系PC9-BrM2、PC9-BrM3。
使用通用方法构建蛋白组学数据库，进一步的采集血清及组织样品，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)测量蛋白表达量。
实验结果：
质谱质量控制检测
在图1A质谱仪的质量精度分布中，一级质量误差均在10ppm之内，符合轨道阱质谱的精度，不存在由于质量偏差过大影响蛋白的定性定量分析，其中谱图匹配肽段的得分与质量偏差的分布成负相关。图1B所示每个蛋白对应的肽段数量中，大部分蛋白对应两个以上肽段，有利于增加定量结果的精确度和可信度。图1C所示在三次重复样本之间的RSD(Relative standard deviation，相对标准差)可见波动程度小，重复性良好。
综上，质谱检测数据符合标准。
生物信息学分析结果
蛋白组学用于探究疾病的蛋白谱差异变化分析，已被广泛应用于新型疾病生物标志物或治疗靶点的鉴定。为了筛选肺癌在脑转移过程中特异性改变的蛋白，我们收集了动物来源肺癌高脑转移细胞系PC9-BrM3及其亲代肺腺癌细胞PC9的分泌液并进行高通量定量蛋白组学检测。组学检测结果中共鉴定到3619个蛋白质，其中3183个蛋白可定量。与亲代肺腺癌PC9细胞系相比，使用上调比率倍数(BrM3/PC9)>1.3作为鉴定脑转移亚组细胞系差异蛋白的筛选标准，鉴定出773个上调蛋白以及587个下调蛋白(表3、图2A)。
表3、差异表达蛋白数量统计
Figure BDA0003262526000000161
在这些差异蛋白中，我们初步着眼于以下10种蛋白(图2B)：
1.CTSF(组织蛋白酶F)、
2.FBLN1(衰老关键蛋白1)、
3.AKR1B10(Aldo-keto reductase family 1member B10，醛糖酮还原酶家族1成员B10)、
4.CCL20(C-C motif chemokine 20，CC基序趋化因子20)、
5.SAA1(Serum amyloid A-1，血清淀粉样蛋白A-1)、
6.CXCL1(Growth-regulated alpha，生长调节α)、
7.CXCL3(C-X-C motif chemokine 3，CXC基序趋化因子3)、
8.AXL(Tyrosine-protein kinase receptor UFO，酪氨酸蛋白激酶受体UFO)、
9.AKR1C3(Aldo-keto reductase family 1member C3，Aldo-酮基还原酶家族1成员C3)、
10.CPNE3(Copine-3，钙依赖膜结合蛋白3)。
使用ELISA在队列1中对临床样本的血清候选蛋白表达进行验证，队列1中包括20例LCBM(non-small cell lung cancer brain metastasis，非小细胞肺癌脑转移)患者、20例ALC(advanced non-small cell lung cancer，晚期无远处器官转移非小细胞肺癌)、20例ELC(early-stage non-small cell lung cancer，早期肺癌)患者、20例HG(healthgroup，健康人员)。
图2C所示结果可见，与各对照组相比CTSF、FBLN1和AKR1B10三个候选蛋白在非小细胞肺癌脑转移患者血清中显著上调，表明CTSF、FBLN1和AKR1B10可能是非小细胞肺癌脑转移的潜在诊断标志物。
实施例2、CTSF作为监测非小细胞肺癌脑转移治疗效果的生物标志物
肿瘤标记物不仅应用于疾病的早期诊断，同时广泛应用于肿瘤治疗效果的监测、耐药风险分层及个体化治疗等领域中。为了探究非小细胞肺癌脑转移患者血清CTSF和FBLN1水平的动态变化与治疗效果之间的潜在关联，我们对血清验证队列中204位非小细胞肺癌脑转移患者进行定期随访。
于每个治疗周期抗肿瘤治疗前采集血清样本检测CTSF和FBLN1浓度，每两个治疗周期进行影像学检查评估疗效，同时剔除未能如期进行随访或未能有效评价治疗效果的患者。
CTSF血清水平变化较FBLN1更稳定的反映了患者的治疗效果，结果如图3，所示是六位患者治疗过程中的血清浓度变化，ABCDEF分别代表1-6的六位患者。例如患者1在1-4个月间疗效评价为部分缓解，同时CTSF浓度也显着降低，但血清FBLN1浓度未见明显改变；患者2在1-4个月间疗效评价为疾病进展，CTSF浓度增加了3倍，而FBLN1浓度未见明显增加；患者3在1-6月间疗效评价为部分缓解，CTSF和FBLN1浓度均有明显降低；患者4在5-7月间疗效评价为疾病进展。
图4展示了患者4于治疗第3、5、7月时的脑核磁影像学表现，可见第5月及第7月脑左侧颞叶转移灶较前均明显增大，同时CTSF浓度明显上升，至基线2倍；患者5在1-6月间及第14月疗效评价为部分缓解。
图5展示了患者5于治疗第1、3、6、14月时的脑核磁影像学表现，可见第3、6、14月小脑蚓部转移瘤较前均明显减小，同时CTSF和FBLN1浓度均有明显降低，CTSF的降低相对更为稳定；患者6在1-10月间疗效评价为疾病进展，血清CTSF水平持续升高，而FBLN1水平未见升高。
值得一提的是，血清CTSF水平的变化平均比影像学改变早1-3个月。例如，患者1影像学结果于治疗第10个月时发现了疾病进展，但CTSF水平自第7月开始升高；患者4在治疗第5个月时影像学检测到疾病进展，但血清CTSF在第4个月时已经出现升高；患者6在治疗第8个月时影像学提示疾病进展，CTSF水平于第6月时已经出现高于基线水平的升高。以上数据强烈提示在脑转移患者治疗期间规律检测CTSF的益处，比影像学更早的检测到疾病的进展并及时调整治疗方案。
这些发现表明，血清CTSF水平的改变可用于监测非小细胞肺癌脑转移患者的治疗效果。
实施例3、CTSF作为监测非小细胞肺癌脑转移治疗效果的生物标志物
为了探究CTSF与非小细胞肺癌脑转移患者预后相关性，我们评估了组织验证队列中47例脑转移患者CTSF表达与PFS和OS之间的关系。
截止至研究终点，所有患者均经历了疾病进展，83％(47名患者中的39名)患者出现死亡。中位PFS为6个月，自确诊脑转移起的中位生存期及自确诊肺癌起的中位总生存期分别为22个月和26个月。依据免疫组化染色结果，我们将CTSF强阳性和阳性表达患者归为高表达组，将CTSF弱阳性和阴性表达患者归为低表达组。
与组织CTSF低表达组相比，CTSF高表达组患者确诊肺癌脑转移后的PFS较差(6.7个月；95％CI：4.362-9.116vs 10.9个月；95％CI，8.041-13.792；P＝0.047；图6)。
应用Cox比例风险模型评估CTSF对非小细胞肺癌脑转移患者预后的影响，在调整年龄、性别、吸烟状态及病理类型后，组织CTSF高表达脑转移患者疾病进展的风险是CTSF低表达患者的2.052倍(HR 2.052，95％CI 1.034-4.072，P＝0.04)。
表4、Cox比例风险模型分析脑转移患者预后因子
Figure BDA0003262526000000181
综上所述，CTSF是非小细胞肺癌脑转移患者的独立预后因素(表4)。

Claims (5)

1.检测CTSF表达量的试剂在制备预测非小细胞肺癌脑转移患者的治疗效果或者预测肺癌脑转移患者预后的产品中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测CTSF表达量为检测血清中的CTSF表达量。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测CTSF表达量的试剂为检测蛋白表达量的试剂或检测mRNA表达量的试剂。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测蛋白表达量的试剂选自以下方法中使用的试剂：蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定、放射性免疫测定、夹心测定、免疫组织化学法、质谱法、免疫沉淀分析法、补体结合分析法和蛋白质芯片法。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测mRNA表达量的试剂选自以下方法中使用到的试剂：基于PCR的检测方法、Southern杂交方法、Northern杂交方法、点杂交方法、荧光原位杂交方法、DNA微阵列方法、ASO法、高通量测序平台方法。
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