CN113721020B - Ctsf在非小细胞肺癌诊断中的应用 - Google Patents

Ctsf在非小细胞肺癌诊断中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术、生物医药领域，具体涉及CTSF在非小细胞肺癌诊断中的应用。在一种实施方式中，所述CTSF的表达量在患者体内升高，在晚期患者体内进一步升高。

Description

CTSF在非小细胞肺癌诊断中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术、生物医药领域，具体涉及CTSF在非小细胞肺癌诊断中的应用。
背景技术
据统计，我国每年新患癌症的病人约160万，每年因癌症死亡的人数约130万。我国大、中城市居民的许多死亡原因中，癌症是第一位死因，在农村的各项死因中，癌症是第二位死因。对中、老年人来说癌症是多发病、常见病。对早期癌症病人的治疗约有80％-90％以上可以治愈；但是，晚期的癌症病人，在治疗后能生存5年以上的人，就比较少了。早期癌症病人治疗后，不仅提高了生存率，同时也提高了病人的生存质量。癌症病人的死亡率随之也降下来了。众所周知，早期癌症病人的治疗要比晚期癌症病人的治疗节省许多人力、财力和时间。所以我们提倡癌症病人要早期发现、早期诊断、早期治疗。在有条件的地方，定期开展健康检查或防癌普查(初筛)对发现早期癌症是较好的方法。
肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不完全明确，大量资料表明，长期大量吸烟与肺癌的发生有非常密切的关系。已有的研究证明：长期大量吸烟者患肺癌的概率是不吸烟者的10～20倍，开始吸烟的年龄越小，患肺癌的几率越高。此外，吸烟不仅直接影响本人的身体健康，还对周围人群的健康产生不良影响，导致被动吸烟者肺癌患病率明显增加。城市居民肺癌的发病率比农村高，这可能与城市大气污染和烟尘中含有致癌物质有关。因此应该提倡不吸烟，并加强城市环境卫生工作。
肺癌的临床表现比较复杂，症状和体征的有无、轻重以及出现的早晚，取决于肿瘤发生部位、病理类型、有无转移及有无并发症，以及患者的反应程度和耐受性的差异。肺癌早期症状常较轻微，甚至可无任何不适。中央型肺癌症状出现早且重，周围型肺癌症状出现晚且较轻，甚至无症状，常在体检时被发现。肺癌的症状大致分为：局部症状、全身症状、肺外症状、浸润和转移症状。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于早期诊断肺癌的分子标志物。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了检测CTSF表达水平的试剂在制备诊断肺癌的产品中的应用，所述CTSF的表达量在患者体内升高；
在一种实施方式中，所示诊断包括诊断早期肺癌、区分早晚期肺癌。
在一种实施方式中，所述肺癌包括非小细胞肺癌、小细胞肺癌。
在一种实施方式中，所述肺癌是非小细胞肺癌。
优选地，本发明所述早期肺癌是TNM分期中的I-IIIA期。
优选地，本发明所述晚期包括四期无远处靶器官转移，肺癌脑转移、肺癌肝转移、肺癌骨转移。
在一种实施方式中，所述非小细胞肺癌包括鳞状细胞癌(鳞癌)、腺癌、大细胞癌。
在一种实施方式中，所述CTSF的表达量在患者体内升高。
在一种实施方式中，所述产品使用的方法包括但不限于以下方法：免疫检测、原位杂交、RT-PCR、实时定量PCR或芯片检测。
本文所述“免疫检测”，如无特别说明，是指利用免疫学原理，以待测物作为抗原或抗体从而测定样本中待测物质含量的方法。优选地，所述免疫检测包括但不限于：酶联免疫法(酶联免疫吸附法，ELISA)、放射免疫法、荧光免疫法、免疫组织化学法(IHC)、化学发光免疫法、电化学发光免疫法等。
在一种实施方式中，所述免疫检测使用ELISA和/或IHC方法。
在一种实施方式中，所述用免疫检测早期诊断肺癌的产品至少包括与CTSF特异性结合的抗体。
在一种实施方式中，所述用RT-PCR早期诊断肺癌的产品至少包括一对特异扩增CTSF的引物。
在一种实施方式中，所述用实时定量PCR早期诊断肺癌的产品至少包括一对特异扩增CTSF的引物。
在一种实施方式中，所述用原位杂交早期诊断肺癌的产品至少包括与CTSF的核酸序列特异性杂交的探针。
在一种实施方式中，所述产品中还可以包括蛋白实验中可能使用的以下成分：封闭液、抗体稀释液、洗涤缓冲液、显色终止液、制备标准曲线的标准品。
在一种实施方式中，所述产品中还可以包括SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增分子标志物基因和管家基因(内参基因)的引物对；所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包含：PCR酶、PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。
在一种实施方式中，所述产品中还可以包括使所述引物对应的扩增子可视化的反应试剂；RNA提取试剂；逆转录试剂；cDNA扩增试剂；制备标准曲线所用的标准品；阳性对照品；阴性对照品。
在一种实施方式中，所述用芯片早期诊断肺癌的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片至少包括与CTSF特异性结合的抗体，基因芯片至少包括与CTSF的核酸序列特异性杂交的探针。
在一种实施方式中，所述特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述前面所述的标志物的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与前面所述的标志物的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
在一种实施方式中所述特异性抗体可以用放射性同位素、酶、荧光分子、化学发光试剂标记。
在一种实施方式中，针对所述特异性抗体还可以有用放射性同位素、酶、荧光分子、化学发光试剂标记的二抗(第二抗体)。
在一种实施方式中，所述酶标记包括碱性磷酸酶(ALP)标记、辣根过氧化物酶(HRP)标记。
在一种实施方式中，所述探针/探针都可以是市售的产品或者是自行制备的。
在一种实施方式中，所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
本发明所使用基因芯片的检测原理可以是但不限于如下任意一种：
(1)通过对固相表面定位在不同位置的探针-靶特异性亲合反应结合体或杂交体进行光学信号标记，然后经激发产生荧光、化学或生物发光并进行检测；
在一种实施方式中，所述固相的材料可以为玻片、硅片、石英、聚偏二氟乙烯膜、硝酸纤维素膜、磁珠、塑料珠或者酶联免疫的板或条、其他；
(2)通过对标记的或未标记的探针或靶在施加了电压的液相中的移动速度或迁移率进行检测，即电泳技术或由电泳技术与其他技术结合而产生的其他技术；
(3)通过探针、靶或探针-靶络合物以及它们对标记物不同的亲和力，进行色谱技术分析；
(4)利用具有氧化还原性质的分子或分子的部分结构、金属络合物与被定位并固定在固相表面不同位置或电极上的探针、靶或探针-靶络合物结合并在外加适当方式或适当大小的电压作用下，发生氧化还原反应，致使从还原性分子或基团的电子转移到氧化性分子或基团，形成电子流，通过电极传送到检测系统进行测量，所测得的电流强度大小与杂交并被标记的双链核酸的量成正比；
(5)利用双链核酸和单链核酸的导电性能差异，或利用由序列完全互补配对的核酸杂交所形成的双链核酸分子与有错配碱基对存在的双链核酸分子之间在导电性能差异，通过对经由核酸分子传导的电子流大小的测量而对核酸分子由此所反映的其他方面所进行的各种鉴别、检测和考察；
(6)将发生在核酸分子上或由具有氧化还原性质的物质所发生的电子或电荷转移反应或电子流转换成其他可检测或可考察形式的检测技术；
(7)直接或间接以具有氧化还原性物质对探针或靶分子标记，通过标记后可以使标记物接近电极表面而发生电子转移反应从而实现对发生在电极表面的生物或化学反应的检测。
在一种实施方式中，本发明所述的固相表面包括有机材质或无机材质。
在一种实施方式中，本发明所述的固相表面可以是玻璃、金属、塑料等材料及其衍生物；其中玻璃衍生物，具体地，可以是胺基玻片、醛基玻片、环氧基玻片和聚氨基酸包被玻片等。
在一种实施方式中，用于早期诊断肺癌的样本来源包括但不限于血液、鼻上皮细胞、组织、尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊髓液、泪液、痰、粘液、淋巴、胞液、腹水、胸膜积液、羊水、膀胱冲洗液和支气管肺泡灌洗液。
在本发明的具体实施方案中，用于早期诊断肺癌的样本来源是血液和/或组织。
另一方面，本发明提供了一种诊断受试者是否患有肺癌的试剂盒，所述试剂盒包括检测CTSF表达量的试剂。
优选地，所述诊断包括诊断早期肺癌、区分早晚期肺癌。
优选地，所述肺癌是非小细胞肺癌。
优选地，所述早期肺癌是TNM分期中的I-IIIA期。
优选地，所述晚期包括四期无远处靶器官转移，肺癌脑转移、肺癌肝转移、肺癌骨转移。
另一方面，本发明提供了一种诊断肺癌的系统，所述系统包括用于根据CTSF表达量判断受试者是否患病的计算装置；
优选地，所述诊断包括诊断早期肺癌、区分早晚期肺癌；
优选地，所述系统包括用于输入CTSF表达量的输入装置。
在一种实施方式中，所述系统还可以包括用于输出诊断结果的输出装置。
在一种实施方式中，所述系统还可以包括检测mRNA和/或蛋白表达量的检测装置。
在一种实施方式中，所述系统还包括评估结果发送单元，所述评估结果发送单元可以将受试者的评估结果发送到患者或医护人员可以查阅的信息通信终端装置。
在一种实施方式中，所述试剂盒还可以包括检测其他疾病标志物的试剂。
另一方面本发明还提供了前述试剂盒、系统在制备早期诊断肺癌的产品中的应用。
另一方面本发明提供早期诊断受试者是否患有肺癌的方法，所述方法包括检测受试者的CTSF的表达量。
本发明所述的“早期诊断肺癌的方法、系统”的实施可包括手动地、自动地、或它们组合地来执行或完成所选任务。
而且，根据本发明方法、系统的实施方式的实际仪器和设备，可通过硬件、通过软件、或通过固件或通过它们的组合使用操作系统来实施多个所选任务。
附图说明
图1是质谱数据质控检测的结果图；A.质谱仪的质量精度分布，B.蛋白覆盖度与分子量关系，C.重复样本间蛋白定量RSD(相对标准差)分布箱线图。
图2为蛋白组学筛选候选蛋白的分析结果图；A.蛋白组学鉴定的差异蛋白数量，B.差异蛋白火山图，C：候选蛋白的血清学检测结果。
图3是血清验证队列血清学的蛋白表达结果图；A.CTSF，B.FBLN1，C.AKR1B10。
图4为标志物在区分早期肺癌和健康对照中的ROC曲线。
图5为标志物在区分早期肺癌和晚期肺癌中的ROC曲线。
具体的实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
本发明所使用的仪器和试剂如以下表1、2所示：
表1、本发明所使用的仪器
仪器名称 生产公司 产地
高速冷冻离心机 Beckman Coulter 德国
低速离心机 北京时代北利 中国
医用离心机(手掌式) 江苏新康 中国
-80℃超低温冰箱、 Thermo Scientific 美国
Strata X C18 Phenomenex 美国
色谱柱Agilent 300Extend C18 安捷伦 中国
EASY-nLC 1000超高效液相系统 Thermo Scientific 美国
表2、本发明所使用的试剂
Figure GDA0003625666740000071
Figure GDA0003625666740000081
通用方法
蛋白组学测序
(1)细胞分泌液准备
将肺癌高脑转移细胞系PC9-BrM3及其亲代细胞系PC9在添加了10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的1640培养基中培养，培养环境为37℃、5％的CO2。待细胞密度到培养皿面积的85％左右时，弃掉培养基改为无血清的1640培养基继续培养24小时。收集细胞分泌液后在4℃下1000g低速离心5分钟去除细胞，收集上清液。将上清液继续4℃，12000g离心5分钟，收集上清液，目的是去除细胞碎片。高脑转移细胞系PC9-BrM3及其亲代细胞系PC9各收取150ml上清液，平均分成3份每份各50ml于-80℃冰箱冻存。
(2)蛋白提取
首先，将样品从-80℃冰箱中取出，放置在室温环境中将其解冻。等到样本完全解冻后，在4℃，12000g的条件下离心10分钟，去除样本中的固体杂质。然后，将离心后的上清液转移至超滤离心管(millipore)中，在4℃，5000g的条件下离心浓缩，令上清液浓缩至0.5mL。最后，用8M尿素置换一次，并通过BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。
(3)胰酶酶解
首先，从各样品取等量蛋白，加入适量标准蛋白，用裂解液将其体积调整至一致。然后，缓慢加入终浓度20％的三氯乙酸(TCA)，涡旋混匀仪使溶液充分混合，4℃静置沉淀2小时。4500g离心5分钟，弃掉上清液，并用预冷的丙酮洗涤沉淀2-3次。待沉淀物晾干后，加入终浓度200mM的三乙基碳酸氢铵缓冲液(TEAB)重悬沉淀，并通过超声处理将沉淀打散。以1：50(蛋白酶：蛋白，m/m)加入胰蛋白酶，酶解过夜。之后，加入终浓度5mM的二硫苏糖醇(DTT)，在56℃条件下还原30分钟。最后，加入终浓度11mM的碘乙酰胺(IAA)，在室温、避光条件下孵育15分钟。
(4)TMT标记
将胰酶酶解得到的肽段样品溶液用Strata X C18(Phenomenex)除盐后真空冷冻干燥。用浓度为0.5M的TEAB溶解肽段。最后，根据TMT试剂盒的操作说明来标记肽段，操作如下：将标记试剂解冻后用乙腈溶解，与肽段混合后，室温环境孵育2小时，在标记实验后将所有样品的肽段溶液混合成一份，最后进行除盐并真空冷冻干燥。
(5)HPLC分级
选用色谱柱为Agilent 300Extend C18(5μm粒径，4.6mm内径，250mm长)，在高pH值下对肽段进行反相HPLC分级。具体的操作方法为：肽段分级梯度为8％-32％乙腈，pH值为9，60分钟时间分离60个组分，随后肽段合并为14个组分，合并后的组分经真空冷冻干燥后进行后续操作。
(6)液相色谱-质谱联用分析
将肽段用液相色谱流动相A(含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液)溶解后使用EASY-nLC 1000超高效液相系统进行分离。设置液相梯度为：0-20分钟，8％～22％流动相B(含0.1％甲酸和90％乙腈的水溶液)；20-33分钟，22％～35％流动相B；33-37分钟，35％～80％流动相B；37-40分钟，80％流动相B，流速维持在600nL/分钟。肽段经由超高效液相系统分离后被注入NSI离子源中进行电离，然后Q Exactive Plus质谱进行分析。将离子源电压设置为2.2kV，肽段母离子及其二级碎片使用高分辨的Orbitrap进行检测分析。一级质谱扫描范围设置为400-1500m/z，扫描分辨率设置为70,000；二级质谱扫描范围则固定起点为100m/z，二级扫描分辨率设置为17,500。
数据采集模式使用数据依赖型扫描(DDA)程序，即在一级扫描后选择信号强度最高的前20肽段母离子依次进入HCD碰撞池，使用30％的碎裂能量进行碎裂，同样依次进行二级质谱分析。
为了提高质谱的有效利用率，自动增益控制(AGC)设置为5E4，信号阈值设置为63000ions/s，最大注入时间设置为80ms，串联质谱扫描的动态排除时间设置为30秒，以避免母离子的重复扫描。
(7)数据库搜索
二级质谱数据使用Maxquant(v1.5.2.8)进行检索。检索参数设置如下：
1、选择数据库为Homo_sapiens_9606_SP_20191115(20380条序列)；
2、添加了反库，用于计算随机匹配造成的假阳性率(FDR)；
3、加入了常见的污染库，用于消除鉴定结果中污染蛋白的影响；
4、酶切方式设置为Trypsin/P；
5、漏切位点数设为2；
6、肽段最小长度设置为7个氨基酸残基；
7、肽段最大修饰数设为5；
8、First search和Main search的一级母离子质量误差容忍度分别设为20ppm和5ppm，二级碎片离子的质量误差容忍度为0.02Da；
9、将半胱氨酸烷基化设置为固定修饰，可变修饰为甲硫氨酸的氧化，蛋白N端的乙酰化，脱酰胺化(NQ)；
10、定量方法设置为TMT-6plex；
11、蛋白鉴定、PSM鉴定的FDR都设置为1％。
血清及组织样品采集
根据标准操作程序收集患者血清样品，简言之，每位受试者采2ml外周血收集于采血管中，使其凝结30分钟，分离出上层血清，将血清以1,000g/分钟离心15分钟，用EP管收集上层血清，保存在-80℃冰箱中备用。对规律随访的患者每个治疗周期进行一次血清采集，于每次治疗前进行，直至研究结束或出现临床终点。
组织标本于手术切除或穿刺活检时获得，选取样本要求有足够数量的肿瘤细胞，并避开坏死组织。无水甲醛固定，石蜡包埋，于切片机中以3um标准分离组织并固定于防脱载玻片上，恒温鼓风干燥箱中60℃烘片2-3小时。
酶联免疫吸附测定(ELISA)
使用购自Omin.mAbs、Elabscience、武汉华美、上海江莱公司的人CTSF、FBLN1、AKR1B10、CCL20、SAA1、CXCL1、CXCL3、AXL、AKR1C3、CPNE3定量ELISA试剂盒，对候选蛋白的血清浓度进行检测。将置于-80℃的患者血清取出缓慢融化，融化后充分摇晃混匀，将ELISA试剂盒从-4℃冰箱中取出室温后使用。
将50μL/100μL的标准品及按照标准方法采集的患者血清分别添加到预先包备好对应抗体的微量滴定板加样孔中，每份样本重复3次以保证实验结果准确性。设置空白孔，不添加样品及ELISA试剂，其余操作相同。
在37℃恒温摇床内孵育45分钟后弃掉液体，重复洗板4次，每次30秒。将50μL生物素化抗体IgG工作液加入加样孔中(标准品因已预先整合了生物素抗体，因此无需额外添加生物素抗体)，37℃恒温摇床中孵育30分钟℃后弃掉液体，重复洗板4次，每次30秒。在所有加样孔中加入50μL辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，在37℃恒温水浴锅中孵育15分钟后弃掉液体，重复4次洗板，每次30秒。以此向所有孔中加入50μL的TMB显色液A和TMB显色液B，37℃孵育使其和辣根过氧化物酶充分反映，15分钟后立即加入50μl终止液终止反应并观察到颜色变化。在加入终止溶液后15分钟内于酶标仪450nm处测量光密度(OD)，将空白孔OD值设置为零后，确定检测样品的OD值。OD值与蛋白浓度成正比，通过标准曲线的拟合公示来计算样本中蛋白质浓度。
免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)
于通风橱中将组织切片在重复3次的二甲苯中脱蜡，梯度浓度的乙醇中水化，流水冲洗10分钟；将3％的内源性过氧化物酶阻断剂滴到切片上，37℃水浴锅中孵育15分钟，弃掉液体，将切片于PBS溶液中浸泡清洗，重复5次每次5分钟；提前使用微波炉将柠檬酸钠抗原修复液(10 mmol/L，pH6)加热至沸腾，待沸腾后将切片浸泡于抗原修复液中，继续加热20分钟修复抗原，并使其缓慢降至室温；滴加山羊血清进行非特异性结合位点封闭，以覆盖全部组织为准，37℃水浴锅中孵育10分钟，弃掉液体；按照预实验探索的最佳抗体浓度(CTSF1：100；FBLN1 1：300；AKR1B10 1：500)分别滴加购于R&D systems、Santa CruzBiotechnology、Abcam公司的重组抗体，于切片盒中4℃孵育过夜；取出切片缓至室温，弃掉一抗将切片于PBS溶液中浸泡清洗，重复5次每次5分钟；滴加生物素标记山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，37℃水浴锅中孵育30分钟，弃掉液体，将切片于PBS溶液中浸泡清洗，重复5次每次5分钟；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃水浴锅中孵育30分钟，弃掉液体，将切片于PBS溶液中浸泡清洗，重复5次每次5分钟；滴加二氨基联苯胺(DAB)在辣根过氧化物酶催化下充分反映后弃掉液体，并于流水冲洗10分钟；滴加苏木素染色液标记细胞核染色，流水冲洗10分钟；于通风橱中完成梯度浓度乙醇及3次二甲苯脱水后用中性树胶封片；待树胶风干后于正置显微镜下观察切片染色情况。每次免疫组化实验中都包含抗原表达水平不同的组织，以减少操作误差带来的偏倚。由两名独立的病理学家对染色情况进行评估，综合考虑染色强度及染色范围赋分：阴性为0分；弱阳性为1分；阳性为2分；强阳性为3分。将≥2分定义为高表达，<2分定义为低表达。阳性对照在http://www.proteinatlas.org中提供。
统计分析
使用SPSS 23.0软件及RStudio 1.3.1093软件(R语言4.0.3)进行统计分析，GraphPad Prism 8对ELISA数据进行统计分析，P值小于0.05认为具有统计学意义。
应用ANOVA(Analysis of Variance，方差分析)测量实验组与各对照组间候选蛋白的血清表达差异；T检验或方差分析用于评估血清CTSF、FBLN1水平与患者临床变量间的关系；Pearson卡方检验或Fisher精确检验用于评估组织CTSF、FBLN1表达与患者临床变量间的相关性；应用R语言nonrandom软件包进行倾向性得分匹配，random Forest软件包构建随机森林模型。通过敏感性和特异性评估CTSF、FBLN1对非小细胞肺癌脑转移患者的预测价值，并通过ROC曲线分析确定诊断临界值，最佳临界点是通过距离ROC曲线对角线最远点且灵敏度和特异性总和最大来确定的；logistic回归分析用于构建基于生物标志物组的诊断预测模型。
实施例1、分子标志物的筛选
本发明所使用的PC9人肺腺癌细胞系采购自中国科学院上海生科院细胞库，PC9-BrM3肺癌高脑转移细胞系由构建的肺癌高脑转移动物模型中脑转移瘤分离培养获得，构建方法如下：
构建基于动物模型的肺癌高脑转移细胞系：培养稳定表达GFP-荧光素酶融合蛋白(GFP-luciferase)的亲本肺癌细胞株PC9，用氯胺酮(ketamine)和甲苯噻嗪(xylazine)将雌性免疫缺陷BALB-c-nu小鼠麻醉，将转染的肺癌PC9细胞注射入小鼠的左心室使裸鼠形成脑内转移瘤病灶。腹腔注射荧光素酶底物D-Luciferin，通过动物活体成像仪成像观察脑内转移瘤情况。
肺癌脑转移细胞的富集及培养：通过对免疫缺陷小鼠心内注射肺癌细胞系PC9，3周后脑内转移瘤成瘤，分离脑内转移瘤后进行原代培养获取肺癌脑转移细胞系PC9-BrM1，再次对免疫缺陷小鼠按上述方式心内注射PC9-BrM1细胞系，如此重复3次“心内注射-分离脑内转移瘤-原代培养获得肺癌高脑转移细胞系”以富集肺癌细胞脑转移特征，并依次获得肺癌脑转移细胞系PC9-BrM2、PC9-BrM3。
使用通用方法构建蛋白组学数据库，进一步的采集血清及组织样品，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)测量蛋白表达量。
实验结果：
质谱质量控制检测
在图1A质谱仪的质量精度分布中，一级质量误差均在10ppm之内，符合轨道阱质谱的精度，不存在由于质量偏差过大影响蛋白的定性定量分析，其中谱图匹配肽段的得分与质量偏差的分布成负相关。图1B所示每个蛋白对应的肽段数量中，大部分蛋白对应两个以上肽段，有利于增加定量结果的精确度和可信度。图1C所示在三次重复样本之间的RSD(Relative standard deviation，相对标准差)可见波动程度小，重复性良好。
综上，质谱检测数据符合标准。
生物信息学分析结果
蛋白组学用于探究疾病的蛋白谱差异变化分析，已被广泛应用于新型疾病生物标志物或治疗靶点的鉴定。为了筛选肺癌在脑转移过程中特异性改变的蛋白，我们收集了动物来源肺癌高脑转移细胞系PC9-BrM3及其亲代肺腺癌细胞PC9的分泌液并进行高通量定量蛋白组学检测。组学检测结果中共鉴定到3619个蛋白质，其中3183个蛋白可定量。与亲代肺腺癌PC9细胞系相比，使用上调比率倍数(BrM3/PC9)>1.3作为鉴定脑转移亚组细胞系差异蛋白的筛选标准，鉴定出773个上调蛋白以及587个下调蛋白(表3、图2A)。
表3、差异表达蛋白数量统计
Figure GDA0003625666740000141
在这些差异蛋白中，我们初步着眼于以下10种蛋白(图2B)：
1.CTSF(组织蛋白酶F)、
2.FBLN1(衰老关键蛋白1)、
3.AKR1B10(Aldo-keto reductase family 1member B10，醛糖酮还原酶家族1成员B10)、
4.CCL20(C-C motif chemokine 20，CC基序趋化因子20)、
5.SAA1(Serum amyloid A-1，血清淀粉样蛋白A-1)、
6.CXCL1(Growth-regulated alpha，生长调节α)、
7.CXCL3(C-X-C motif chemokine 3，CXC基序趋化因子3)、
8.AXL(Tyrosine-protein kinase receptor UFO，酪氨酸蛋白激酶受体UFO)、
9.AKR1C3(Aldo-keto reductase family 1member C3，Aldo-酮基还原酶家族1成员C3)、
10.CPNE3(Copine-3，钙依赖膜结合蛋白3)。
使用ELISA在队列1中对临床样本的血清候选蛋白表达进行验证，队列1中包括20例LCBM(non-small cell lung cancer brain metastasis，非小细胞肺癌脑转移)患者、20例ALC(advanced non-small cell lung cancer，晚期无远处器官转移非小细胞肺癌)、20例ELC(early-stage non-small cell lung cancer，早期肺癌)患者、20例HG(healthgroup，健康人员)。(根据肺癌的TNM分期，将可行手术治疗的I-IIIA期非小细胞肺癌入组为早期肺癌)
图2C所示结果可见，与各对照组相比CTSF、FBLN1和AKR1B10三个候选蛋白在非小细胞肺癌脑转移患者血清中显著上调，表明CTSF、FBLN1和AKR1B10可能是非小细胞肺癌脑转移的潜在诊断标志物。
实施例2、验证3个潜在标志物对非小细胞肺癌脑转移的诊断价值
研究在血清验证队列2中入组了379例非小细胞肺癌、30例PBT(primary braintumor，原发性脑肿瘤)、50名健康体检人员(HG)进一步验证3个潜在标志物对非小细胞肺癌脑转移的诊断价值。379名非小细胞肺癌患者包括204例非小细胞肺癌脑转移(LCBM)、40例LM(liver metastasis，单器官肝转移)；50例BM(bone metastasis，单器官骨转移)；40例无远处器官转移的晚期非小细胞肺癌(ALC)、45例早期肺癌(ELC)。该队列中各亚组间在年龄、性别及病理分型等方面无显著差异。
图3所示，与各对照组相比，肺癌脑转移患者血清CTSF(图3A)和FBLN1(图3B)水平显著升高(两者均P<0.001)，而AKR1B10(图3C)在各组晚期肺癌组中(LCBM、LM、BM和ALC)均升高(单独比较)，并没有在肺癌脑转移组中特异性升高。
在各对照组之间进行比较时，可见早期肺癌患者血清中CTSF水平较健康组相比显著升高(P＝0.009)，而FBLN1和AKR1B10血清水平在早期肺癌患者和健康组间没有明显差异(P＝0.293，P＝0.05)。与早期肺癌患者相比，晚期非小细胞肺癌患者(LCBM、LM、BM、ALC)血清CTSF和FBLN1水平均显著升高(两者均P<0.001)。
由此可见，CTSF和FBLN1二者在非小细胞肺癌脑转移患者血清中特异性升高，此外CTSF水平随着肺癌的发生和发展过程相应的逐步升高，通过界定不同的临界值(健康人群vs早期肺癌；早期肺癌vs晚期肺癌；脑转移vs其他晚期肺癌)，使其不仅可以用于检测脑转移的发生，同时也可应用在早期肺癌的筛查鉴定中以及肺癌进展状态的评估。
相比之下FBLN1并不能反映早期肺癌的发生，只有在肺癌进展到晚期时才会升高。而当扩大样本量验证时发现AKR1B10并不能在肺癌脑转移患者中稳定且特异的高表达，而是在晚期肺癌中普遍高表达，但也可以一定程度的反映肺癌的进展程度。
综上表明血清CTSF在早期肺癌诊断中的潜在作用。
实施例3、CTSF在早期诊断中的验证
再次使用ROC曲线验证CTSF的诊断准确性：
45例早期肺癌(ELC)vs 50名健康体检人员(HG)的ROC曲线中，AUC:0.709，敏感度：53.3％，特异性：90％，Cut off值：58.42。具体如图4所示。
45例早期肺癌(ELC)vs晚期(四期无远处靶器官转移ALC，肺癌脑转移LCBM、肺癌肝转移LM、肺癌骨转移BM)在ROC分析中，将所有晚期混为一组，和早期肺癌患者比较。ROC曲线中各个标志物的AUC值分别为：CTSF 0.836、CEA 0.849、CA125 0.412、NSE 0.399、SCC0.510、CYFRA21-1 0.376；cut off值、特异性、灵敏度如表4、图5所示。
表4、标志物在区分早晚期肺癌中的应用
cut off 敏感度 特异度
CTSF 54.535 94.30％ 75.0％
CEA 0.835 90.9％ 75.0％
CA125 149.04 14.8％ 99.2％
NSE 20.205 20.5％ 98.9％
SCC 0.925 85.9％ 50.0％
CYFRA211 17.76 14.8％ 99.6％
具体如图5所示：其他常见的肺癌标志物并非都可以做到区分早期肺癌和晚期肺癌，所以本发明所述CFSF的在实践中有更广的应用范围。
以上结果说明CFSF在筛查早期肺癌患者、区分早晚期患者中有良好的诊断准确率，在临床具有较好的应用价值。

Claims (6)

1.检测人血清中CTSF蛋白表达水平的试剂在制备通过早期非小细胞肺癌患者血清中CTSF蛋白表达水平相比健康组升高来诊断早期非小细胞肺癌的产品中的应用，所述早期非小细胞肺癌为TNM分期中的I-IIIA期非小细胞肺癌。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测人血清中CTSF蛋白表达水平的试剂是免疫检测所使用的试剂。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述免疫检测包括但不限于：酶联免疫吸附法、放射免疫法、荧光免疫法、免疫组织化学法、化学发光免疫法、电化学发光免疫法。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述免疫检测是酶联免疫吸附法和/或免疫组织化学法。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述免疫检测所使用的试剂中包括与CTSF特异性结合的抗体。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述免疫检测所使用的试剂中还包括蛋白实验中使用的以下成分中的至少一种：封闭液、抗体稀释液、洗涤缓冲液、显色终止液、制备标准曲线的标准品。
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