CN115326684A - 一种基于阻抗法的磁珠标定的白细胞子分数群计数方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于阻抗法的磁珠标定的白细胞子分数群计数方法，包括步骤1.准备材料。利用采血针收集少量血液加入EDTA抗凝血剂采血管中，滴加溶血剂并进行上下轻微晃动，充分溶解全血中的红细胞，保留白细胞成分，获得细胞溶液；步骤2.制备免疫磁球溶液。向溶解后的采血管中加入事先修饰好的含有CD14抗体的免疫磁球溶液，使其与步骤1中细胞溶液充分混合。抗原抗体的特异性，CD14磁球只会和单核细胞发生结合，获得免疫磁球溶液。本发明摆脱传统光散射技术、血涂片检测等技术的固有弊端与复杂操作，利用抗原抗体特异性结合和电磁信号对靶细胞进行分群计数，确保分类计数结果的准确性。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种基于阻抗法的磁珠标定的白细胞子分数群计数方法。
背景技术
细胞是人体形态结构和生理功能的基本单位，是人体生长发育的基础。对于细胞的分析有助于了解人体一些疾病发生的作用机理和人体内部健康环境状态，其中关于白细胞的研究对于人体炎症特征的指示颇具意义，医生可根据检测后的结果辅助判断病人的病情。
由于细胞的微观体积尺度，利用宏观的检测方法无法对其进行特性的研究。微流控芯片技术凭借其微观结构尺度，与细胞体积相仿，可以方便的实现在微米和亚米尺度下操控细胞，颠覆传统实验室分析方法，其强大的集成能力，包括反应、前处理、检测等实验流程都能够集成到一个微流控系统中完成。
阻抗法检测技术是源于熟知的欧姆定律，即将阻抗的变化在外界电流的作用下可转化成宏观的电压脉冲。为了实现特定细胞的分析，本发明引入免疫磁珠，利用靶细胞的特异性抗体对磁珠进行修饰，使其与靶细胞表面的特异性抗体发生免疫结合，实现特定细胞的标定。所选磁珠具有超顺磁性，只有在外界磁场的激发下才会产生磁性，进而引起巨磁电阻的阻值发生变化，在阻抗法检测下转化为一系列电脉冲。通过对这些脉冲大小的测量可以测定出细胞体积；记录这些脉冲的个数可以得到细胞计数的结果；经过对各种细胞所产生脉冲大小的选择；可以区分不同种类的细胞，并进行后续分析。
本发明将微流体芯片技术和阻抗检测技术相结合，并利用磁珠对细胞进行标定，实现特定细胞的分析和检测，原理简单实用，可实现高通量、高速率、高可靠的细胞分类计数。
现有技术一的技术方案
血涂片细胞分析方法
血涂片细胞分析方式是利用显微镜人工对下拨进行分类计数的基本方法，需要人工将血涂片用细胞免疫染色技术染成特定的颜色，在显微镜观测下记录不同细胞类型的比例。但是如果血涂片制备不良或者染色不佳，例如血膜过厚造成细胞重叠，血膜太薄会导致细胞集中与图片的边缘，这些都会大大增加细胞的鉴别难度，优势甚至会导致错误的诊断。除此之外，需要人工进行全程的操作，过程繁琐、效率不高，会无法避免的引入人工计数的误差。
现有技术一的缺点
(1)血涂片制备要求很高，制备不佳会严重影响计数的准确性。
(2)人工计数效率低下，需要具备专业技能的操作人员，不可避免的引入人工误差。
(3)过程繁琐，需要额外的染色试剂，然后还需很长时间的晾干过程，检测耗时过长。
现有技术二的技术方案
光散射技术
细胞通过光束时使光线发生散射，并通过光电检测器手机前向散射(FS)和侧向散射(SS)的强度。其中前向散射与细胞大小有关，而侧向散射则取决于颗粒/细胞的密度(即胞浆颗粒数量、细胞膜尺寸)。因此，透过这种方式，根据细胞大小和密度通常可把不同细胞群区分开。光散射技术通常会与鞘流技术结合进行细胞的检测。检测前会将细胞制备成稀释的悬浮缓冲液从进样口加入，由于鞘液的作用，细胞被限制在液流的轴线上，从而通过一个非常小的喷嘴。这种微小的“流液束”使细胞一个接一个地通过激光。细胞/颗粒通过通道时所散射的光线将被多个检测其检测到。
现有技术二的缺点
(1)需要精度很高且造价昂贵的光学仪器，会导致成本的上涨。
(2)鞘流技术增加了系统的复杂度，浪费大量的额外流体。
(3)若鞘流流动状态不理想，会影响检测的精度和稳定性，容易引起误判。
(4)对流路和光路的精密度要求较高，需设计相应庞大的仪器结构。
发明内容
本发明的目的在于解决上述现有技术存在的缺陷，提供一种基于阻抗法的磁珠标定的白细胞子分数群计数方法，摆脱传统光散射技术、血涂片检测等技术的固有弊端与复杂操作，利用抗原抗体特异性结合和电磁信号对靶细胞进行分群计数，确保分类计数结果的准确性。
本发明采用如下技术方案：
一种基于阻抗法的磁珠标定的白细胞子分数群计数方法，包括如下步骤：
步骤1.准备材料
利用采血针收集少量血液加入EDTA抗凝血剂采血管中，滴加溶血剂并进行上下轻微晃动，充分溶解全血中的红细胞，保留白细胞成分，获得细胞溶液；
步骤2.制备免疫磁球溶液
向溶解后的采血管中加入事先修饰好的含有CD14抗体的免疫磁球溶液，使其与步骤1中细胞溶液充分混合；
抗原抗体的特异性，CD14磁球只会和单核细胞发生结合，获得免疫磁球溶液；
步骤3.利用外界磁场，用于细胞计数
免疫磁球为超顺磁性磁球，只有在外界磁场下，磁球才会有磁性，一旦撤去外界磁场，磁性便会立即消失，不会发生细胞团聚，利用外界磁场用于步骤3中的免疫磁球溶液的细胞计数。
进一步的，步骤3具体包括：
利用移液枪取一定体积的步骤2中的免疫磁球溶液，滴加到微流体芯片的加样处，微流体芯片右侧出口处安装有制造负压的蠕动泵，使得入口处的免疫磁球溶液能有以一定的速度缓慢的沿着微流体芯片内微通道进行移动，逐个通过磁铁区域，利用巨磁电阻阻值的改变在片的外围电路中被电流转化为一系列反应细胞运动事件的电压脉冲，以此来对单核细胞进行计数；其他细胞由于没有磁珠绑定，无法影响巨磁电阻的阻值，因此通过巨磁电阻时没有明显的脉冲产生。
进一步的，微流体芯片通道固定处下方放置一块巨磁电阻，具有在外界磁场作用下阻值发生改变的特性，巨磁电阻上方固定一块磁铁，磁铁产生竖直磁场，利用磁场将通过此区域的磁珠磁化，使得磁珠产生磁场来改变下方巨磁电阻的阻值。
另一种基于阻抗法的磁珠标定的白细胞子分数群计数方法，包括如下步骤：
步骤1.准备3份材料
利用采血针收集少量血液加入EDTA抗凝血剂采血管中，滴加溶血剂并进行上下轻微晃动，充分溶解全血中的红细胞，保留白细胞成分，获得3份细胞溶液；
步骤2.制备3份免疫磁球溶液
根据淋巴细胞、单核细胞、粒细胞不同细胞表面不同蛋白，利用对应的抗体官能化磁珠标定细胞溶液，进行特异性抗原抗体结合，制备3份免疫磁球溶液；
步骤3.利用外界磁场，用于细胞计数
免疫磁球为超顺磁性磁球，只有在外界磁场下，磁球才会有磁性，一旦撤去外界磁场，磁性便会立即消失，不会发生细胞团聚，利用外界磁场用于步骤3中的免疫磁球溶液的细胞计数。
进一步的步骤2具体是：第二份为向溶解后的采血管中加入事先修饰好的含有CD14抗体的免疫磁球溶液，使其与步骤1中细胞溶液充分混合；
抗原抗体的特异性，CD14磁球只会和单核细胞发生结合，获得免疫磁球溶液；
同理，利用淋巴细胞、粒细胞对应的特异性抗原抗体制得对应的免疫球溶液；
步骤3具体是，用移液枪吸取三份同一体积的步骤2中3份细胞溶液，从入口处分别加入三个通道，利用同样的原理(滴加到微流体芯片的加样处，微流体芯片右侧出口处安装有制造负压的蠕动泵，使得入口处的免疫磁球溶液能有以一定的速度缓慢的沿着微流体芯片内微通道进行移动，逐个通过磁铁区域)，利用巨磁电阻阻值的改变在片的外围电路中被电流转化为一系列反应细胞运动事件的电压脉冲。
进一步的，微流体芯片通道固定处下方放置一块巨磁电阻，具有在外界磁场作用下阻值发生改变的特性，巨磁电阻上方固定一块磁铁，磁铁产生竖直磁场，利用磁场将通过此区域的磁珠磁化，使得磁珠产生磁场来改变下方巨磁电阻的阻值。当磁珠的细胞通过磁场区域时会被激发产生磁场，磁珠产生的磁场使得巨磁电阻的阻值发生改变，并在电源作用下转化为电脉冲，依据不同通道发出的脉冲数目，进行计数和细胞分类。本发明的有益效果：
(1)本发明结构设计简单、实用，可获得高吞吐量、高准确性的结果。无需鞘流细胞法、光学散射光检测的复杂结构和实现方式。所需元件成本低廉、又不缺可靠性，操作简单耗时短无需专业技能或额外的医疗器械，具有普适性。
(2)本发明创新的提出细胞计数方法，将免疫学原理和电子检测技术相结合，通过巨磁电阻在磁场条件下发生改变的特性，将微观细胞的测量转化为宏观的电脉冲计数，实现微观到宏观的转变，便于开展相关研究工作。
附图说明
图1为单通道细胞检测过程示意图；
图2(a)、图2(b)均为细胞脉冲产生示意图；
图3为多通道细胞检测过程示意图；
图4为本发明的步骤流程图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
基于阻抗法的磁珠标定的白细胞子分数群计数方法，主要原理是通过细胞表面抗原分子与连接磁珠的特异性单克隆抗体结合，在外加磁场的作用下，激发磁珠产生磁场，改变芯片下方巨磁电阻阻值大小，并在电源的作用下转化为电流脉冲，实现细胞的间接表征和后续的分析计数。
如图1、图4所示，以单核细胞为例，CD14是其表面特异性抗原受体，那么便可在磁珠表面利用相关技术官能化与之对应的抗体，将CD14抗体与磁珠结合形成免疫磁球。利用采血针收集少量血液加入EDTA抗凝血剂采血管中，滴加溶血剂并进行上下轻微晃动，充分溶解全血中的红细胞，保留白细胞成分。随后向溶解后的采血管中加入事先修饰好的含有CD14抗体的免疫磁球溶液，使其与细胞溶液充分混合。由于抗原抗体的特异性结合，CD14磁球只会和单核细胞发生结合。免疫磁球为超顺磁性磁球，因此只有在外界磁场下，磁球才会有磁性，一旦撤去外界磁场，磁性便会立即消失，因此不会发生细胞团聚的现象，便于细胞的准确计数。
随后利用移液枪采取一定体积的白细胞溶液滴加到微流体芯片的加样处，在芯片的右侧出口处有一蠕动泵来制造负压，使得入口处的细胞溶液能有以一定的速度缓慢的沿着芯片内微通道进行移动，逐个通过磁铁区域。在芯片通道固定处下方放置一块巨磁电阻，该电阻具有在外界磁场作用下阻值发生改变的特性。在巨磁阻上方固定一块磁铁，磁铁产生竖直磁场，该磁场可以将通过此区域的磁珠磁化，使得磁珠产生磁场来改变下方巨磁电阻的阻值。该阻值的改变在芯片的外围电路中被电流转化为一系列可以反应细胞运动事件的电压脉冲，以此来对单核细胞进行计数，而其他细胞由于没有磁珠绑定无法影响巨磁电阻的阻值，因此这些细胞通过巨磁电阻时没有明显的脉冲产生。
在实现细胞计数功能后，可以对现有芯片的结构进行改进，以达到分群的功能，可以根据淋巴细胞、单核细胞以及粒细胞等不同种类细胞表面不同蛋白，利用与其对应的特异性抗体进行磁珠官能化并结合，根据分群数的需要，将芯片设计拓展成对应通道数，例如三分群的通道。为了防止磁场的串扰，将巨磁阻传感器按照一定的位置间距进行放置，对应位置上方放置磁铁以激化磁珠产生磁场。与单核细胞计数相似，用移液枪吸取三份同一体积的细胞溶液，使用三类细胞不同抗体官能化的磁珠标定细胞溶液，进行特异性抗原抗体结合。将三份细胞溶液从入口处分别加入三个通道，利用同样的原理，当带磁珠的细胞通过磁场区域时会被激化产生磁场，磁珠产生的磁场可使得巨磁电阻的阻值发生改变，并在电源作用下转化为电脉冲。依据不同通道发出的脉冲数目，进行计数和细胞分类。
如若需要进行白细胞的五分类甚至更多，可参考上述同样操作流程，将不同类别细胞进行磁珠结合，便可实现通过磁场和阻抗变化对白细胞进行计数分类。
实施例
为了显著表示有磁珠和没有磁珠芯片所检测出的脉冲差别，本发明做了两组对比实验，一个是不进行磁珠修饰，另一组是利用CD14磁珠对单核细胞进行修饰的实验。如图2(a)所示，在完成红细胞溶解后不加磁珠溶液直接进行芯片入口的加样，并打开右侧蠕动泵的负压驱动，使得细胞溶液通过检测区域所检测的结果。可以看出，图中都是除了一些电路噪声外，没有明显的脉冲电压产生。图2(b)是利用CD14磁珠对单核细胞进行绑定后检测的结果。可以明显的看出有细胞波形产生。CD14在磁铁的激化下产生磁场，继而引发下方巨磁电阻的阻值改变，产生细胞脉冲，同时噪声和信号辨别度很大，可以很容易的区分出细胞事件。后续便可利用技术其对该脉冲进行计数，得到单核细胞的总数目。
本发明不同于传统检测方法的复杂结构和实现方式，提出新型简单实用的检测原理，利用阻抗法结合磁场、免疫等技术进行具体的实现。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (7)
1.一种基于阻抗法的磁珠标定的白细胞子分数群计数方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1.准备材料
利用采血针收集少量血液加入EDTA抗凝血剂采血管中，滴加溶血剂并进行上下轻微晃动，充分溶解全血中的红细胞，保留白细胞成分，获得细胞溶液；
步骤2.制备免疫磁球溶液
向溶解后的采血管中加入事先修饰好的含有CD14抗体的免疫磁球溶液，使其与步骤1中细胞溶液充分混合；
抗原抗体的特异性，CD14磁球只会和单核细胞发生结合，获得免疫磁球溶液；
步骤3.利用外界磁场，用于细胞计数
免疫磁球为超顺磁性磁球，只有在外界磁场下，磁球才会有磁性，一旦撤去外界磁场，磁性便会立即消失，不会发生细胞团聚，利用外界磁场用于步骤3中的免疫磁球溶液的细胞计数。
2.根据权利要求1所述的基于阻抗法的磁珠标定的白细胞子分数群计数方法，其特征在于，步骤3具体包括：
利用移液枪取一定体积的步骤2中的免疫磁球溶液，滴加到微流体芯片的加样处；
微流体芯片右侧出口处安装有制造负压的蠕动泵，使得入口处的免疫磁球溶液能有以一定的速度缓慢的沿着微流体芯片内微通道进行移动，逐个通过磁铁区域；
利用巨磁电阻阻值的改变在片的外围电路中被电流转化为一系列反应细胞运动事件的电压脉冲，以此来对单核细胞进行计数；
其他细胞由于没有磁珠绑定，无法影响巨磁电阻的阻值，因此通过巨磁电阻时没有明显的脉冲产生。
3.根据权利要求1所述的基于阻抗法的磁珠标定的白细胞子分数群计数方法，其特征在于，微流体芯片通道固定处下方放置一块巨磁电阻，巨磁电阻上方固定一块磁铁，磁铁产生竖直磁场，利用磁场将通过此区域的磁珠磁化，使得磁珠产生磁场来改变下方巨磁电阻的阻值。
4.一种基于阻抗法的磁珠标定的白细胞子分数群计数方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1.准备3份材料
利用采血针收集少量血液加入EDTA抗凝血剂采血管中，滴加溶血剂并进行上下轻微晃动，充分溶解全血中的红细胞，保留白细胞成分，获得3份细胞溶液；
步骤2.制备3份免疫磁球溶液
根据淋巴细胞、单核细胞、粒细胞不同细胞表面不同蛋白，利用对应的抗体官能化磁珠标定细胞溶液，进行特异性抗原抗体结合，制备3份免疫磁球溶液；
步骤3.利用外界磁场，用于细胞计数
免疫磁球为超顺磁性磁球，只有在外界磁场下，磁球才会有磁性，一旦撤去外界磁场，磁性便会立即消失，不会发生细胞团聚，利用外界磁场用于步骤3中的免疫磁球溶液的细胞计数。
5.根据权利要求4所述的基于阻抗法的磁珠标定的白细胞子分数群计数方法，其特征在于，步骤2具体是：
第二份为向溶解后的采血管中加入事先修饰好的含有CD14抗体的免疫磁球溶液，使其与步骤1中细胞溶液充分混合；
抗原抗体的特异性，CD14磁球只会和单核细胞发生结合，获得免疫磁球溶液；
同理，利用淋巴细胞、粒细胞对应的特异性抗原抗体制得对应的免疫球溶液。
6.根据权利要求1所述的基于阻抗法的磁珠标定的白细胞子分数群计数方法，其特征在于，步骤3具体是，用移液枪吸取三份同一体积的步骤2中3份细胞溶液，从入口处分别加入三个通道，滴加到微流体芯片的加样处；
微流体芯片右侧出口处安装有制造负压的蠕动泵，使得入口处的免疫磁球溶液能有以一定的速度缓慢的沿着微流体芯片内微通道进行移动，逐个通过磁铁区域；
利用巨磁电阻阻值的改变在片的外围电路中被电流转化为一系列反应细胞运动事件的电压脉冲。
7.根据权利要求4所述的基于阻抗法的磁珠标定的白细胞子分数群计数方法，其特征在于，微流体芯片通道固定处下方放置一块巨磁电阻，巨磁电阻上方固定一块磁铁，磁铁产生竖直磁场，利用磁场将通过此区域的磁珠磁化，使得磁珠产生磁场来改变下方巨磁电阻的阻值；
当磁珠的细胞通过磁场区域时会被激发产生磁场，磁珠产生的磁场使得巨磁电阻的阻值发生改变，并在电源作用下转化为电脉冲，依据不同通道发出的脉冲数目，进行计数和细胞分类。
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