CN107974487A

CN107974487A - 一种基于多糖修饰磁珠与分离化学发光中心的核酸增敏检测方法

Info

Publication number: CN107974487A
Application number: CN201711178005.3A
Authority: CN
Inventors: 杨淏文; 李智洋; 何农跃
Original assignee: Nanjing Drum Tower Hospital
Current assignee: Nanjing Drum Tower Hospital
Priority date: 2017-11-23
Filing date: 2017-11-23
Publication date: 2018-05-01

Abstract

本发明公开了一种基于多糖修饰磁珠与分离化学发光中心的核酸增敏检测方法：在磁珠表面修饰适合连接核酸探针的多糖分子；设计用于检测靶核酸片段的功能化探针，将功能化探针修饰于结合有多糖分子的磁珠表面；通过杂交，将靶核酸片段及其发光中心捕获至磁珠表面；磁分离，清洗，即得到已获取发光中心的磁珠；加入兼容型多糖水解复合试剂，通过多糖水解将化学发光中心从磁珠表面分离下来，即得到不含磁珠的化学发光中心溶液；对该溶液进行化学发光检测，即可获取增敏的靶核酸信息。本发明完全克服了磁珠对化学发光信号的遮蔽效应导致的发光信号损失，相比常规的“基于磁珠的核酸化学发光检测方法”，灵敏度提升7倍，能够检测出最少50 fM核酸片段，检测灵敏度极高。

Description

一种基于多糖修饰磁珠与分离化学发光中心的核酸增敏检测方法

技术领域

本发明涉及生化检测和分子诊断领域，尤其涉及一种基于多糖修饰磁珠与分离化学发光中心的核酸增敏检测方法。本发明可应用于涉及超灵敏核酸分子检测的领域。

背景技术

随着纳米技术的迅速发展，纳米材料逐渐被应用到生命科学领域，纳米磁珠(magnetic beads,MBs)因具有分离速度快、效率高、可重复使用、操作简单、易功能化、易实现自动化以及不影响分离物质的活性等特殊的物理化学性质和生物相容性，目前已应用于细胞分离、免疫测定、蛋白质和酶的固定以及核酸检测等方面。

近年来，发光标记类检测方法，如荧光标记、酶标化学发光等已广泛应用于生物分子检测。操作安全，方法简便、快速，具有巨大的潜力，正成为生物分析研究与发展的最重要领域。因此，结合核酸探针杂交技术，通过标记能够产生发光信号的分子而获取靶核酸信息，可实现靶核酸的快速检测与高通量筛查。

目前，已报道各种基于固相杂交与发光标记的核酸检测方法。其基本思路为：在固相载体表面修饰核酸探针，通过捕获标记有发光信号分子的待测特异核酸片段，再检测发光信号，经分析后，即可快速确认靶核酸的特性。

但随着研究深入发现，影响基于磁珠与化学发光标记核酸检测方法灵敏度的一个重要因素为：发光信号会由于磁珠的遮蔽作用而大大减弱——灵敏度降低最高可达90%。但现有技术中仅有荧光检测法采用高温或碱使双链核酸变性解链的方法分离荧光中心，因为荧光中心如荧光素（FAM、TAMRA）等可耐受高温和碱性环境。但化学发光检测法等的发光中心无法通过高温或碱处理的方式达到此目的，因为化学发光中心无法耐受高温和碱性环境，当在高温或碱性环境下发光中心会失活而无法继续进行发光检测。因此，研制出一种通用的基于磁珠与分离化学发光中心的核酸增敏检测方法，能够完全避免磁珠对发光中心产生的遮蔽效应，从而极大地提高化学发光的检测灵敏度，这对于疾病分子诊断、食品微生物监测等具有重大意义。目前，基于从磁珠表面分离化学发光中心的核酸增敏检测方法尚无文献报道。

发明内容

本发明所要解决的主要技术问题是克服现有的基于磁珠与化学发光中心的核酸检测方法存在的检测灵敏度受限问题，其原因是磁珠对光信号产生遮蔽效应，极大地减弱了发光信号强度。因此，提出一种基于多糖修饰磁珠与分离化学发光中心的核酸增敏检测方法。

本发明的一种基于多糖修饰磁珠与分离化学发光中心的核酸增敏检测方法包括：

1）在磁珠表面修饰适合连接核酸探针的多糖分子；

2）设计用于检测靶核酸片段的功能化探针，将功能化探针修饰于结合有多糖分子的磁珠表面；

3）通过杂交，将标记有化学发光中心的靶核酸片段捕获至磁珠表面；

4）磁分离，清洗，即得到已获取标记有化学发光中心的靶核酸片段的磁珠；

5）加入兼容型多糖水解复合试剂，通过多糖水解反应将化学发光中心从磁珠表面分离下来，即得到不含磁珠的发光中心溶液；

6）对该发光中心溶液进行发光检测，即可获取靶核酸信息。

其中：

步骤1）所述表面修饰包括但不限于在磁珠表面以共价键、非共价键或物理吸附方式修饰功多糖分子。所述多糖分子是能够同时与磁珠及功能化探针以共价键、非共价键或物理吸附的方式结合的多糖。

步骤2）所述功能化探针为能够与多糖分子共价结合或物理吸附，并与靶核酸片段序列互补的寡核苷酸。

步骤3）所述化学发光中心为适用于分子检测的能够产生化学发光信号的分子，包括但不限于碱性磷酸酶及其化学发光底物、辣根过氧化物酶及其化学发光底物。

所述发光中心，其标记靶核酸的方式包括通过靶核酸扩增进行标记、通过报告探针与靶核酸片段杂交进行标记。

步骤5）所述兼容型多糖水解复合试剂包括兼容型缓冲液、多糖水解酶、反应终止液。

步骤5）所述兼容型缓冲液，其成分包括50 mM NaAc, Tris-HCl, 1mM MgCl₂,0.05% Tween 20 pH>8。

步骤5）所述反应终止液，其成分包括：1% TFA, 50 mM Na₂CO₃, pH>8。

步骤5）所述多糖水解反应体系为，多糖酶5 U、兼容型缓冲液占总体积50%、终止液占总体积50%。

步骤5）所述多糖水解反应条件为，温度37 °C、以1000 rpm的转速进行旋转孵育30min。

与现有技术相比，本发明具有以下特点：

多糖作为分子手臂将功能化探针连接于磁珠表面，提高了颗粒悬浮性、减小了空间位阻、增加了探针结合位点以及增加了杂交自由度，从而提高了杂交效率。将对应靶核酸片段的化学发光中心从磁珠表面分离下来进行检测，完全避免了磁珠遮蔽效应，显著提高了发光信号强度。相比常规的“基于磁珠的核酸化学发光检测方法”，灵敏度提升7倍。因此，本发明技术极大地提高了检测灵敏度。

附图说明

图1为一种基于葡聚糖修饰磁珠与葡聚糖水解分离化学发光中心的核酸检测方法流程示意图。

图2为HBV核酸PCR扩增产物电泳图。

图3为HBV核酸的化学发光检测动力曲线。

具体实施方式

以下结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

本发明公布了一种利用磁珠易于磁分离的特性结合杂交以及多糖水解分离化学发光中心的策略，对不含磁珠的发光中心溶液进行发光检测，获取靶核酸信息的方法。在本发明的一个较佳的实例中，以Fe₃O₄@SiO₂磁珠作为载体，在其表面修饰多糖分子，连接上功能化探针，以生物素标记靶核酸片段，通过核酸杂交将带生物素标记的靶核酸片段捕获至磁珠表面，通过与亲和素标记酶孵育使磁珠获取对应靶核酸片段的酶分子，然后利用葡聚糖酶水解葡聚糖将对应靶核酸片段的酶分子从磁珠表面分离下来，最后进行化学发光检测，获取靶核酸信息，方法流程示意图如图1所示。

其步骤如下：

1. 在磁珠表面修饰多糖分子：（1）磁珠氨基化修饰：将30 mg Fe₃O₄@SiO₂磁珠磁分离，加入6 mL乙醇/水混合液并超声分散，然后取12 μL氨丙基三乙氧基硅烷（aminopropyltriethoxysilane, APTES）加入上述混合液中，室温振荡搅拌7 h。利用外加磁场将APTES修饰的磁性颗粒分离出来，用乙醇和磷酸盐缓冲溶液（PB, 0.1 M, pH 7.4）分别清洗数次，分散在PB溶液中，备用；（2）多糖修饰磁珠（polysaccharide-modifiedmagnetic beads, PS-MBs）的制备：将氨基化磁珠（10 mg/mL）磁分离，用等体积2-N-吗啉代乙磺酸水合物溶液（2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid hydrate, MES, 25 mM, pH6）清洗数次，磁分离，加入5 mg/mL MES溶液溶解的羧基化多糖溶液至清洗过的磁珠中，混匀后室温旋转孵育30 min，立刻加入冷的用MES溶液溶解的10 mg/mL 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide, EDC）至磁珠混合液中混匀，4°C下旋转孵育2 h以上。磁分离弃上清，用PB溶液清洗数次，分散在PB溶液中，即得到PS-MBs。

2. 设计用于检测靶核酸片段的特异性引物及功能化探针，探针以3’ 端氨基修饰。探针修饰PS-MBs：将PS-MBs（10 mg/mL）用等体积MES溶液清洗数次，磁分离弃上清，加入MES稀释的探针（2 μM）到洗过的PS-MBs中，混匀后室温旋转孵育30 min，立刻加入冷的用MES溶液溶解的EDC（10 mg/mL），至磁珠混合液中混匀，4°C下旋转孵育2 h以上。磁分离弃上清，加入Tris溶液（50 mM, 含0.1% Tween-20, pH 7.4）溶液孵育15 min中和未反应羧基，再用Tris溶液清洗数次，最后分散在PB溶液中，即得到连有特异探针的功能化磁珠。

3. 对靶核酸片段进行PCR扩增：反应体系为10×Buffer 2 μL、Mg²⁺ 1.2 μL、dNTPMix 1μL、上下游引物各1 μL、DNA模板1μL、Taq酶0.5 μL、加入去离子水补足体积至20 μL；反应条件为95°C 5 min、95°C 30 s、60°C 30 s 72°C 30 s，35个循环。

4. 核酸杂交：取30 μL探针修饰磁珠（10 mg/mL）于PCR管，磁分离弃上清，加入杂交液10 μL、靶核酸片段PCR产物1 μL，加去离子水补足体积至20 μL；杂交反应条件为95°C5 min、60°C 10 min；然后磁分离，对磁珠清洗数次，即得到已获取靶核酸片段的磁珠。

5. 化学发光中心标记靶核酸片段：（1）通过PCR扩增进行标记：在步骤3中所述dNTP Mix中加入biotin-11-dUTP，其他同步骤3，然后进行步骤4；（2）通过核酸杂交标记：设计与靶核酸片段序列互补的报告探针，该报告探针末端修饰有化学发光中心；步骤4完成后，进行第二次核酸杂交：将步骤4的杂交产物磁分离，弃上清，加入杂交液10 μL、报告探针溶液1 μL，加入去离子水补足体积至20 μL；杂交反应条件为95°C 5 min、60°C 10 min；然后磁分离，对磁珠清洗数次，即得到已获取带发光中心的靶核酸片段的磁珠。

6. 加入适量兼容型多糖水解复合试剂至已获取捕获靶核酸片段及其发光中心的磁珠悬液中孵育30 min，加入反应终止液，用移液器获取上清液，即得到不含磁珠的发光中心溶液。

7. 对化学发光中心溶液进行发光检测，获取靶核酸信息。

以下结合实例对本发明作进一步描述：

实施例1：为在磁珠表面修饰羧甲基葡聚糖

1. 磁珠的氨基化修饰：将1 mL Fe₃O₄@SiO₂磁珠悬液（30 mg/mL）磁分离，加入6 mL乙醇/水（99/1）混合液中并超声分散，然后取12 μL氨丙基三乙氧基硅烷（aminopropyltriethoxysilane, APTES）加入上述混合液中，室温振荡搅拌7 h。利用外加磁场将APTES修饰的磁性颗粒分离出来，用乙醇和磷酸盐缓冲溶液（PB, 0.1 M, pH 7.4）分别清洗数次，分散在3 mL PB溶液中，获得氨基化磁珠（aminated MBs, AMBs, 10 mg/mL）。

2. 羧甲基葡聚糖修饰磁珠（carboxymethylated dextran-modified magneticbeads, CMD-MBs）的制备：将氨基化磁珠（10 mg/mL）磁分离，用等体积2-N-吗啉代乙磺酸水合物溶液（2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid hydrate, MES, 25 mM, pH 6）清洗数次，磁分离，加入2 mg/mL MES溶液溶解的羧甲基葡聚糖（CMD）溶液至清洗过的磁珠中，混匀后室温旋转孵育30 min，立刻加入冷的用MES溶液溶解的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide, EDC, 10 mg/mL）至磁珠混合液中混匀，4°C下旋转孵育2 h以上。磁分离弃上清，用PB溶液清洗数次，分散在PB溶液中，即得到CMD-MBs。

3. 通过动态光散射测定磁珠的水和半径可得：CMD-MBs和MBs的平均水和半径分别为657.9 nm和738.5 nm，表明CMD的修饰增加了MBs的水和半径；同时，通过动态光散射测定磁珠的zeta电位可得：AMBs和CMD-MBs的zeta电位分别为+13.7 mV和–12.6 mV，表明AMBs经CMD修饰后，CMD上的羧基使得磁珠表面由正电荷的转变为负电荷。上述实验结果说明CMD成功修饰在磁珠表面。

实施例2：在磁珠表面修饰羧甲基纤维素

1. 磁珠的氨基化修饰：同实施例1中所述磁珠的氨基化修饰的方法。

2. 羧甲基纤维素修饰磁珠（carboxymethylcellulose-modified magneticbeads, CMC-MBs）的制备：将氨基化磁珠（10 mg/mL）磁分离，用等体积2-N-吗啉代乙磺酸水合物溶液（2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid hydrate, MES, 25 mM, pH 6）清洗数次，磁分离，加入1 mg/mL MES溶液溶解的羧甲基纤维素（CMC）溶液至清洗过的磁珠中，混匀后室温旋转孵育40 min，立刻加入冷的用MES溶液溶解的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide, EDC, 10 mg/mL）至磁珠混合液中混匀，4°C下旋转孵育2 h以上。磁分离弃上清，用PB溶液清洗数次，分散在PB溶液中，即得到CMC-MBs。

3. 通过动态光散射测定磁珠的水和半径可得：CMC-MBs和MBs的平均水和半径分别为678.2 nm和765.7 nm，表明CMC的修饰增加了MBs的水和半径；同时，通过动态光散射测定磁珠的zeta电位可得：AMBs和CMC-MBs的zeta电位分别为+14.1 mV和–15.7 mV，表明AMBs经CMC修饰后，CMC上的羧基使得磁珠表面由正电荷的转变为负电荷。上述实验结果说明CMC成功修饰在磁珠表面。

实施例3：以乙肝病毒（Hepatitis B virus, HBV）DNA为对象进行检测

1. 设计一对能够特异扩增HBV X基因序列的引物和与该序列互补配对的功能化探针，探针3’ 端以氨基修饰。引物序列如下： 5’-CCTCTACCGTCCCCTTCTTCA-3’、5’-ACGTGCAGAGGTGAAGCGAAG-3’；探针序列如下：5‘-CACTTCGCTTCACCTCTGCACGTA-(T)₁₅-NH₂-3’。

2. 探针修饰CMD-MBs：将CMD-MBs（10 mg/mL）用等体积MES溶液清洗数次，磁分离弃上清，加入MES稀释的探针（2 μM）到洗过的CMBs中，混匀后室温旋转孵育30 min，立刻加入冷的用MES溶液溶解的EDC（10 mg/mL），至磁珠混合液中混匀，4°C下旋转孵育2 h以上。磁分离弃上清，加入Tris 溶液（50 mM, 含0.1% Tween-20, pH 7.4）孵育15 min中和未反应羧基，再用Tris 溶液清洗数次，最后分散在PB溶液中，即得到连有捕获探针的功能化磁珠。

3. 对靶核酸片段进行PCR扩增：反应体系为10×Buffer 2 μL、Mg²⁺ 1.2 μL、dNTPMix (dATP:dCTP:dGTP:dTTP:biotin-11-dUTP=25:25:25:23:2) 1μL、上下游引物各1 μL、DNA模板1μL、Taq酶0.5 μL、加去离子水补足体积至20 μL；反应条件为95 °C 5 min、95 °C30 s、60 °C 30 s 72 °C 30 s，35个循环。图2为HBV核酸PCR扩增产物电泳图，靶核酸片段条带单一，证明扩增成功。

4. 核酸杂交：取30 μL探针修饰磁珠（10 mg/mL）于PCR管，磁分离，弃上清，加入杂交液10 μL、PCR产物1 μL，加去离子水补足体积至20 μL；杂交反应条件为95°C 5 min、60°C20 min；然后磁分离，对磁珠清洗数次，即得到已获取带发光标记的靶核酸片段的磁珠。

5. 分离化学发光中心：磁珠液磁分离后吸去上清，加入封闭液混匀后室温放置30min，期间不断混匀。磁分离后吸去上清，加入封闭液稀释碱性磷酸酶标记链霉亲和素（alkaline phosphatase labeled streptavidin, ALP-SA），混匀后室温孵育30 min。磁分离后清洗数次，然后加入兼容型缓冲液溶解的多糖酶5 μL，以1000rpm的转速旋转孵育30min，加入20 μL反应终止液，即得到游离的化学发光中心与磁珠的混合液。

6. 化学发光检测：用移液器转移上清液，将上清液与磁珠分开，然后在上清液与磁珠中分别加入0.25 mM化学发光底物3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3’’-羟基)苯-1,2-二氧杂环丁烷磷酸（3-(2’-spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3’’-phosphoryloxy)phenyl-1, 2-dioxetane , AMPPD）。充分混匀后测定化学发光强度值至其稳定，平行测定3次。以未加入葡聚糖酶的发光检测结果作为对照。

化学发光检测结果如图3所示。测得的发光值说明去除磁珠遮蔽效应后，化学发光信号显著提升，相对于未超声对照组提高到7倍左右。能够检测出最少50 fM核酸片段。重复三次实验，结果稳定。即加入葡聚糖酶孵育的化学发光检测获取的HBV核酸信息灵敏度显著高于未加入葡聚糖酶对照组的检测结果。

实施例4：以血清miR-21为对象进行检测

1. 设计与miR-21序列互补配对的功能化捕获探针与报告探针，捕获探针3’ 端以氨基修饰，报告探针5’端以生物素修饰。探针序列如下：5’-CTGATAAGCTA-(T)₁₅-NH₂-3’、5’-Biotin-(T)15-TCAACATCAG-3’。

2. 捕获探针修饰CMC-MBs：将CMC-MBs（5 mg/mL）用等体积MES溶液清洗数次，磁分离弃上清，加入MES稀释的探针（2 μM）到洗过的CMC-MBs中，混匀后室温旋转孵育30 min，立刻加入冷的用MES溶液溶解的EDC（10 mg/mL），至磁珠混合液中混匀，4°C下旋转孵育2 h以上。磁分离，弃上清，加入Tris 溶液（50 mM, 含0.1% Tween-20, pH 7.4）孵育15 min中和未反应羧基，再用Tris 溶液清洗数次，最后分散在PB溶液中，即得到连有捕获探针的功能化磁珠。

3. 第一次核酸杂交：（1）取30 μL捕获探针修饰磁珠（10 mg/mL）于PCR管，磁分离，弃上清，加入杂交液10 μL、PCR产物1 μL，加去离子水补足体积至20 μL；杂交反应条件为95°C 5 min、60°C 20 min；然后磁分离，对磁珠清洗数次，即得到已获取miR-21片段的磁珠。

4. 第二次核酸杂交：磁分离，弃上清，加入杂交液10 μL、报告探针溶液1 μL，加入去离子水补足体积至20 μL；杂交反应条件为95°C 5 min、60°C 10 min；然后磁分离，对磁珠清洗数次，即得到已获取标记有发光中心的miR-21片段的磁珠。

5. 分离化学发光中心：同实施例3所述分离化学发光中心的方法。

6.化学发光检测：同实施例3所述化学发光检测的方法。

化学发光检测结果表明，miR-21检测的有益效果同实施例3，故不赘述。

Claims

1.一种基于多糖修饰磁珠与分离化学发光中心的核酸增敏检测方法，其特征在于该方法包括：

1）在磁珠表面修饰适合连接核酸探针的多糖分子；

5）加入兼容型多糖水解复合试剂，通过多糖水解反应将化学发光中心从磁珠表面分离下来，即得到不含磁珠的发光中心溶液；所述兼容型多糖水解复合试剂包括兼容型缓冲液、多糖酶、反应终止液；

其中，所述兼容型缓冲液，其成分包括50 mM NaAc, Tris-HCl, 1mM MgCl₂, 0.05%Tween 20 pH>8；所述反应终止液，其成分包括：1% TFA, 50 mM Na₂CO₃, pH>8；

6）对该发光中心溶液进行发光检测，即可获取靶核酸信息。

2.根据权利要求1所述的基于多糖修饰磁珠与分离化学发光中心的核酸增敏检测方法，其特征在于，步骤1）所述表面修饰包括但不限于在磁珠表面以共价键、非共价键或物理吸附方式修饰功多糖分子，所述多糖分子是能够同时与磁珠及功能化探针以共价键、非共价键或物理吸附的方式结合的多糖。

3.根据权利要求1所述的基于多糖修饰磁珠与分离化学发光中心的核酸增敏检测方法，其特征在于，步骤2）所述功能化探针为能够与多糖分子共价结合或物理吸附，并与靶核酸片段序列互补的寡核苷酸。

4.根据权利要求1所述的基于多糖修饰磁珠与分离化学发光中心的核酸增敏检测方法，其特征在于，步骤3）所述化学发光中心为适用于分子检测的能够产生化学发光信号的分子，包括但不限于碱性磷酸酶及其化学发光底物、辣根过氧化物酶及其化学发光底物。

5.根据权利要求1所述的基于多糖修饰磁珠与分离化学发光中心的核酸增敏检测方法，其特征在于，所述发光中心，其标记靶核酸的方式包括通过靶核酸扩增进行标记、通过报告探针与靶核酸片段杂交进行标记。

6. 根据权利要求1所述的基于多糖修饰磁珠与分离化学发光中心的核酸增敏检测方法，其特征在于，步骤5）所述多糖水解反应体系为，多糖酶5 U、兼容型缓冲液占总体积50%、终止液占总体积50%。

7. 根据权利要求1所述的基于多糖修饰磁珠与分离化学发光中心的核酸增敏检测方法，其特征在于步骤5）所述多糖水解反应条件为，温度45 °C、以1000 rpm的转速进行旋转孵育30 min。