KR20180133406A - 자동화된 네스티드 재조합효소 중합효소 증폭 - Google Patents

자동화된 네스티드 재조합효소 중합효소 증폭 Download PDF

Info

Publication number
KR20180133406A
KR20180133406A KR1020187028595A KR20187028595A KR20180133406A KR 20180133406 A KR20180133406 A KR 20180133406A KR 1020187028595 A KR1020187028595 A KR 1020187028595A KR 20187028595 A KR20187028595 A KR 20187028595A KR 20180133406 A KR20180133406 A KR 20180133406A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleic acid
reaction chamber
sample
amplification
acid amplification
Prior art date
Application number
KR1020187028595A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102473905B1 (ko
Inventor
머레이 존 화이트
니얼 에이. 아르메스
올라프 피펜버그
올리버 닌트위치
캐서린 진 그린우드
Original Assignee
알레레 샌디에고, 인크
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 알레레 샌디에고, 인크 filed Critical 알레레 샌디에고, 인크
Priority to KR1020227042058A priority Critical patent/KR20220167397A/ko
Publication of KR20180133406A publication Critical patent/KR20180133406A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102473905B1 publication Critical patent/KR102473905B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502715—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by interfacing components, e.g. fluidic, electrical, optical or mechanical interfaces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/04—Exchange or ejection of cartridges, containers or reservoirs
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/10—Integrating sample preparation and analysis in single entity, e.g. lab-on-a-chip concept
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/16—Reagents, handling or storing thereof
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/04—Closures and closing means
    • B01L2300/041—Connecting closures to device or container
    • B01L2300/043—Hinged closures
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0645—Electrodes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0654—Lenses; Optical fibres
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0864—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices comprising only one inlet and multiple receiving wells, e.g. for separation, splitting
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0887—Laminated structure
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/50—Other enzymatic activities
    • C12Q2521/507—Recombinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2549/00—Reactions characterised by the features used to influence the efficiency or specificity
    • C12Q2549/10—Reactions characterised by the features used to influence the efficiency or specificity the purpose being that of reducing false positive or false negative signals
    • C12Q2549/119—Reactions characterised by the features used to influence the efficiency or specificity the purpose being that of reducing false positive or false negative signals using nested primers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
    • C12Q2565/629—Detection means characterised by use of a special device being a microfluidic device

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)

Abstract

샘플 모듈, 미세유체 핵산 증폭 디바이스, 및 샘플 모듈을 통해 핵산 증폭 디바이스에 전달된 샘플에 대해 완전 자동화된 네스티드 재조합효소 중합효소 증폭(RPA)을 촉진시키기 위한 분석기를 포함한 독감 검정 시스템. 본 검정은 샘플을 미세유체 디바이스에 제공하고, 샘플에서 표적 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 것을 포함한다. 표적 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 것은 샘플에 대해 제1 증폭 라운드를 수행하여 제1 증폭 산물을 수득하고, 제1 증폭 산물에 대해 제2 증폭 라운드를 수행하여 제2 증폭 산물을 수득하는 것을 포함한다. 제2 증폭 산물은 제1 증폭 라운드 동안 생성된 제1 증폭 산물 내에 완전히 함유된 더 작은 서열을 포함한다.

Description

자동화된 네스티드 재조합효소 중합효소 증폭
관련 출원에 대한 상호참조문헌
본 출원은 2016년 3월 4일자로 출원된 발명의 명칭이 "AUTOMATED NESTED RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION"인 미국 특허 출원 제62/303,934호의 이익을 주장하며, 이러한 문헌은 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
정부 지분의 진술
본 발명은 미국 보건복지부에 의해 수여된 HHSO100201400011C로 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
기술분야
본 발명은 독감 검정 시스템, 및 보다 특히, 샘플 모듈, 미세유체 핵산 증폭 디바이스, 및 샘플 모듈을 통해 핵산 증폭 디바이스로 전달되는 샘플에 대한 완전 자동화된 네스티드(fully automated nested) 재조합효소 중합효소 증폭(recombinase polymerase amplification: RPA)을 촉진하기 위한 분석기를 포함하는 시스템에 관한 것이다.
미량 수준의 폴리뉴클레오타이드 서열의 검출은 병원체 및 유전 질병을 검출하고 특정 감염 또는 유전자형에 대한 치료 요법을 조정하는 것을 돕는 데 중요한 역할을 할 수 있다. 특정 등온 핵산 증폭 방법은 수분 내에 미량 수준에서 매우 높은 그리고 검출 가능한 수준으로 표적 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭할 수 있다. 이러한 등온 방법, 예를 들어, 재조합효소 중합효소 증폭(RPA) 또는 닉킹 및 확장 증폭 반응(Nicking and Extension Amplification Reaction: NEAR)은 사용자가 미량의 특정 서열을 검출할 수 있게 하여, 현장현시 검사(point-of-care testing)를 용이하게 하고 진단의 접근성 및 속도를 증가시킬 수 있다.
본 명세서에 개시된 핵산 증폭 디바이스는 1차 반응 챔버 및 2차 반응 챔버를 검출 챔버에 상호 연결시키는 미세유체 채널의 어레이(array)를 포함하도록 구성된다. 통합된 펌프 모듈이 또한, 적절한 시간에 디바이스를 통해 액체의 선택적 이동을 가능하도록 제공된다. 1차 반응 챔버가 제공되는데, 여기서, 제1 RPA 라운드가 일어나며, 이는 고려되는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열의 증폭을 야기시킨다. 제1 RPA 라운드 이후에, 샘플 액체는 특정 RPA 프라이머와 조합되고, 2차 반응 챔버로 이동된다. 제2 증폭 동안에, 주 반응 산물 내에 완전히 함유된 서열은 제2 반응 산물을 형성하기 위해 증폭된다. 그 후에, 제2 반응 산물의 검출이 수행된다. 검출은 광학적 또는 전기화학적 수단을 이용하여 달성될 수 있다.
제1 RPA 라운드로부터의 산물 혼합물은 복수의 스트림으로 분리될 수 있고, 시약 저장소로 통과될 수 있으며, 여기서, 산물 혼합물은, 복수의 2차 반응 챔버로 진입하기 전에, 동일하거나 상이한 RPA 프라이머와 조합된다. 이러한 방식으로, 핵산 증폭 디바이스는 고려되는 하나 초과의 표적(예를 들어, 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스)을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, 2차 반응 챔버 중 하나는 대조군으로서 사용될 수 있다.
제1의 일반적인 양태는 샘플을 미세유체 디바이스에 제공하고, 샘플에서 표적 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 것을 포함한다. 표적 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 것은 샘플에 대해 제1 증폭 라운드를 수행하여 제1 증폭 산물을 수득하고, 제1 증폭 산물에 대해 제2 증폭 라운드를 수행하여 제2 증폭 산물을 수득하는 것을 포함한다. 제2 증폭 산물은 제1 증폭 라운드 동안 생성된 제1 증폭 산물 내에 완전히 함유된 더 작은 서열을 포함한다.
제1의 일반적인 양태의 실행예는 하기 특징들 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 실행예는 제2 증폭 산물을 검출하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 증폭 산물을 검출하는 것은 제2 증폭 산물을 형광단(fluorophore) 및 소광제(quencher)에 연결된 제1 올리고뉴클레오타이드로 표지하여 표지된 제2 산물을 수득하고, 표지된 제2 증폭 산물로부터 소광제를 절단하고, 형광단으로부터의 신호를 광학적으로 검출하는 것을 포함하며, 여기서, 검출 가능한 신호는 제2 증폭 산물의 존재를 나타낸다. 소광제를 절단하는 것은 뉴클레아제를 사용하여 수행될 수 있다. 뉴클레아제는 이중-가닥 DNA를 표적화할 수 있다. 일부 경우에, 뉴클레아제는 폼아미도피리민-DNA 글리코실라제이다.
일부 실시형태에서, 제2 증폭 산물을 검출하는 것은 제2 증폭 산물을 레독스 모이어티에 연결된 제1 올리고뉴클레오타이드로 표지하여 표지된 제2 증폭 산물을 수득하고, 표지된 제2 증폭 산물로부터 레독스 모이어티를 절단하고, 절단된 레독스 모이어티로부터의 신호를 전기화학적으로 검출하는 것을 포함하며, 여기서, 검출 가능한 신호는 제2 증폭 산물의 존재를 나타낸다. 레독스 모이어티는 통상적으로, 페노티아진, 페녹사진, 페로센, 페리시아나이드, 루테늄(III), 오스뮴(II), 안트라퀴논, 페나진, 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 레독스 모이어티를 절단하는 것은 뉴클레아제를 사용하여 수행될 수 있다. 뉴클레아제는 이중-가닥 DNA를 표적화할 수 있다. 일부 경우에, 뉴클레아제는 폼아미도피리민-DNA 글리코실라제이다.
일부 실행예는 제2 증폭 산물에 대해 제3 증폭 라운드를 수행하여 제3 증폭 산물을 수득하고, 제3 증폭 산물을 검출하는 것을 포함하며, 여기서, 제3 증폭 산물은 제2 증폭 라운드 동안 생성된 제2 증폭 산물 내에 완전히 함유된 더 작은 서열을 포함한다.
샘플은 동물로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, 샘플은 동물의 혈액, 가래, 점액, 타액, 눈물, 또는 소변으로부터 얻어질 수 있다. 일부 경우에, 샘플은 인간으로부터 얻어진다.
표적 핵산은 표적 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산은 동물 병원체로부터 얻어진다. 동물 병원체는 단일-가닥 DNA 바이러스, 이중-가닥 DNA 바이러스, 또는 단일-가닥 RNA 바이러스일 수 있다. 동물 병원체는 박테리아일 수 있다. 표적 핵산은 이중-가닥 DNA, 단일-가닥 DNA, 또는 RNA일 수 있다. 일부 경우에, 표적 핵산은 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 바이러스 DNA, 미토콘드리아 DNA, cDNA, 합성 이중-가닥 DNA 및 합성 단일-가닥 DNA로 이루어진 군으로부터 선택된다. 표적 핵산은 바이러스 DNA 또는 바이러스 RNA일 수 있다. 특정 경우에, 동물 병원체는 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스이다.
일부 실행예에서, 샘플에서 둘 이상의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열이 증폭된다. 일례에서, 인플루엔자 A 유전자 서열을 포함하는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 인플루엔자 B 유전자 서열을 포함하는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열이 증폭된다.
일부 실행예에서, 둘 이상의 제2 증폭 산물이 검출된다. 특정 실행예에서, 인플루엔자 A 유전자 서열을 포함하는 제2 증폭 산물, 및 인플루엔자 B 유전자 서열을 포함하는 제2 증폭 산물이 검출된다.
제2의 일반적인 양태에서, 진단 카드(diagnostic card)는 카드 바디(card body)를 포함한다. 카드 바디는 1차 반응 챔버, 하나 이상의 2차 반응 챔버, 1차 반응 챔버에 샘플 유체를 공급하기 위한 통로, 하나 이상의 2차 반응 챔버와 유체 연결된 하나 이상의 검출 챔버, 및 각 검출 챔버와 결합된 검출 모듈을 포함한다. 1차 반응 챔버는 제1 증폭 산물을 형성하기 위해 반응 챔버에서 샘플 유체에 대해 제1 핵산 증폭을 수행하도록 구성된다. 각 2차 반응 챔버는 제2 증폭 산물을 형성하기 위해 제1 증폭 산물에 대해 제2 핵 증폭을 수행하도록 구성된다.
제2의 일반적인 양태의 실해예는 하기 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 검출 모듈은 광학 모듈, 예를 들어, 형광 검출기이다. 형광 검출기는 하나 이상의 검출 챔버로 조명광을 유도하기 위한 단일 광 파이프, 및 각 검출 챔버로부터의 반사된 광을 수용하기 위한 별개의 광 파이프를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 검출 모듈은 전극 모듈이다. 검출 모듈은 각 검출 챔버에 대한 전극에서 종결하는 직렬의 전도성 트랙을 포함할 수 있다. 디바이스는 미세유체 카드 전반에 걸쳐 액체의 위치를 검출하기 위한 추가적인 전도성 트랙 및 전극을 포함할 수 있다.
일부 실행예에서, 증폭은 재조합효소 중합효소 증폭(RPA) 반응을 포함한다.
일부 실행예에서, 진단 카드는 혼합 수단, 펌프, 및 샘플 모듈에 연결시키기 위한 연결 포트를 포함한다. 1차 반응 챔버는 가열기에 연결될 수 있다. 1차 반응 챔버는 혼합 수단을 포함하거나 혼합 수단에 연결될 수 있다. 일부 경우에, 1차 반응 챔버는 시약을 포함한다. 시약은 RPA 시약을 포함할 수 있다. RPA 시약은 냉동 건조될 수 있다.
일부 실행예에서, 각 2차 반응 챔버는 시약을 포함한다. 시약은 RPA 시약을 포함할 수 있다. RPA 시약은 냉동 건조될 수 있다.
일부 실행예에서, 샘플 유체는 동물로부터 얻어진 샘플이다. 샘플은 동물의 혈액, 가래, 점액, 타액, 눈물, 또는 소변으로부터 얻어질 수 있다. 일부 경우에, 샘플 유체는 인간으로부터 얻어진 샘플이다. 샘플 유체는 표적 핵산을 포함할 수 있다. 표적 핵산은 동물 병원체로부터 얻어질 수 있다. 동물 병원체는 단일-가닥 DNA 바이러스, 이중-가닥 DNA 바이러스, 또는 단일-가닥 RNA 바이러스일 수 있다. 일부 경우에, 동물 병원체는 박테리아이다. 표적 핵산은 이중-가닥 DNA, 단일-가닥 DNA, 또는 RNA일 수 있다. 특정 경우에, 표적 핵산은 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 바이러스 DNA, 미토콘드리아 DNA, cDNA, 합성 이중-가닥 DNA 및 합성 단일-가닥 DNA로 이루어진 군으로부터 선택된다. 표적 핵산은 바이러스 DNA 또는 바이러스 RNA일 수 있다. 동물 병원체는 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스일 수 있다.
일부 실행예에서, 제2 증폭 산물은 진단 카드에 샘플 유체의 전달 후 30분 이하, 15분 이하, 10분 이하, 또는 5분 이하에 생성된다. 진단 카드는 통상적으로 1회용이다.
일부 실행예에서, 진단 카드는 추가적인 반응 챔버를 포함하며, 각각은 추가적인 증폭된 산물을 형성하기 위해 추가적인 핵산 증폭 반응 라운드를 수행하도록 구성되며, 이에 따라, 각 연속적인 n+1 증폭 라운드로부터의 증폭 산물이 이전 n번째 라운드의 증폭 산물 내에 완전히 함유된 더 작은 서열이다.
제3의 일반적인 양태는 제2의 일반적인 양태의 진단 카드를 수용하도록 구성된 판독기를 포함한다. 판독기는 2차 반응 챔버에서 제2 증폭된 산물의 존재를 검출하도록 구성된 검출기를 포함한다.
제4의 일반적인 양태는 핵산 증폭 디바이스를 포함한다. 핵산 증폭 디바이스는 제1 유입구 포트 및 제1 유출구 포트에 유체 흐름 가능하게 연결된 1차 반응 챔버, 제2 유입구 포트 및 제2 유출구 포트에 유체 흐름 가능하게 연결된 2차 반응 챔버, 검출 챔버, 제1 펌프, 제2 펌프, 및 제3 펌프를 포함한다. 제1 유입구 포트는 제1 펌프를 통해 1차 반응 챔버에 유체 흐름 가능하게 연결되며, 제1 유출구 포트는 1차 반응 챔버에 유체 흐름 가능하게 연결된다. 1차 반응 챔버는 제2 펌프를 통해 2차 반응 챔버에 유체 흐름 가능하게 연결되며, 제2 유출구 포트는 2차 반응 챔버에 유체 흐름 가능하게 연결된다. 제2 유입구 포트는 제3 펌프를 통해 2차 반응 챔버에 유체 흐름 가능하게 연결된다.
제4의 일반적인 양태의 실행예는 하기 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 실행예에서, 핵산 증폭 디바이스는 미세유체 디바이스이다. 1차 반응 챔버는 통상적으로, 시약을 포함한다. 일부 경우에, 1차 반응 챔버는 촉매를 포함한다. 촉매는 마그네슘을 포함할 수 있다.
일부 실행예에서, 핵산 증폭 디바이스눈 사약 저장소를 포함하며, 제2 펌프 및 제3 펌프는 제1 시약 저장소를 통해 각 2차 반응 챔버에 유체 흐름 가능하게 연결된다. 제2 펌프 및 제3 펌프는 제1 시약 저장소 및 제2 시약 저장소를 통해 각 2차 반응 챔버에 유체 흐름 가능하게 연결될 수 있다. 일부 경우에, 제1 시약 저장소 및 제2 시약 저장소는 연속적으로 존재한다. 제1 시약 저장소는 올리고머를 포함할 수 있다. 제2 시약 저장소는 마그네슘을 포함할 수 있다.
일부 실행예에서, 각 2차 반응 챔버는 검출 챔버이다. 각 검출 챔버의 일부는 광학적으로 투명할 수 있다. 일부 경우에, 전극은 각 검출 챔버에 연결된다. 일례에서, 3개의 전극이 각 검출 챔버에 연결된다.
일부 실행예에서, 핵산 증폭 디바이스는 유체 검출 영역을 포함한다. 제1 펌프 및 1차 반응 챔버는 제1 검출 영역을 통해 연결될 수 있다. 제2 펌프 및 2차 반응 챔버는 제2 검출 영역을 통해 연결될 수 있다. 제3 펌프 및 2차 반응 챔버는 제3 검출 영역을 통해 연결될 수 있다. 제3 펌프 및 1차 반응 챔버는 제4 검출 영역을 통해 연결될 수 있다. 일부 경우에, 각 검출 영역의 일부는 광학적으로 투명하다. 흐름 검출 챔버는 각 검출 영역에 연결될 수 있다.
일부 실행예에서, 핵산 증폭 디바이스는 1차 반응 챔버에 연결된 가열기를 포함한다. 1차 반응 챔버는 교반기를 포함할 수 있다. 특정 실행예에서, 제1 펌프는 제1 유입구 포트를 통해 1차 반응 챔버에 핵산 증폭 디바이스로 전달된 샘플을 제공하도록 구성된다. 제2 펌프 및 제3 펌프는 반응물 혼합물을 수득하기 위해 제2 유입구 포트를 통해 핵산 증폭 디바이스 바디로 전달된 시약을 1차 반응 챔버로부터의 산물과 조합하도록 구성될 수 있다. 제2 펌프 및 제3 펌프는 각 2차 반응 챔버에 반응물 혼합물의 일부를 제공하도록 구성될 수 있다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 하기 상세한 설명 및 도면으로부터, 그리고, 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1A 내지 도 1D는 샘플 모듈을 통해 핵산 증폭 디바이스로 전달된 샘플에 대한 완전 자동화된 네스티드 RPA를 수행하기 위한 시스템의 부품을 도시한 것이다.
도 2A 내지 도 2E는 도 1에 도시된 시스템에 대한 대안적인 작업흐름(workflow)을 도시한 것이다.
도 3A 및 도 3B는 샘플 모듈의 수용기 모듈 부분의 사시도를 도시한 것이다.
도 4A 및 도 4B는 샘플 모듈의 이송 모듈 부분의 사시도를 도시한 것이다.
도 5A 내지 도 5G는 연결된 수용기 모듈 및 이송 모듈을 갖는 샘플 모듈에 샘플을 제공하기 위한 작업흐름을 도시한 것이다.
도 6A 내지 도 6H는 별도의 수용기 모듈 및 이송 모듈을 갖는 샘플 모듈에 샘플을 제공하기 위한 작업흐름을 도시한 것이다.
도 7은 힌지(hinged) 샘플 모듈의 사시도를 도시한 것이다.
도 8A 및 도 8B는 대안적인 샘플 모듈의 도면을 도시한 것이다.
도 9A 내지 도 9E는 도 8A 및 도 8B에 도시된 샘플 모듈에 샘플을 제공하기 위한 작업흐름을 도시한 것이다.
도 10은 광학 프로브의 검출을 위한 미세유체 핵산 증폭 디바이스의 분해도를 도시한 것이다.
도 11은 도 10에 도시된 미세유체 핵산 증폭 디바이스의 작업 부품을 도시한 것이다.
도 12는 전기화학적 프로브의 검출을 위한 미세유체 핵산 증폭 디바이스의 분해도를 도시한 것이다.
도 13은 도 12에 도시된 미세유체 핵산 증폭 디바이스의 중간 층의 상부 투시도를 도시한 것이다.
도 14는 도 12에 도시된 미세유체 핵산 증폭 디바이스의 센서 층을 통한 상부 투시도를 도시한 것이다.
도 15는 분석기에 삽입된 핵산 증폭 디바이스의 사시도를 도시한 것이다.
도 16은 광학 분석기의 투시도를 도시한 것이다.
도 17은 도 16에 도시된 광학 분석기에서 광 파이프의 상세도를 도시한 것이다.
도 18A 내지 도 18C는 도 16에 도시된 광학 분석기에 대해 기술된 여기 및 방출 좌표 시스템을 도시한 것이다.
도 19a 내지 도 19d는 본 명세서에 기술된 바와 같은 네스티드 RPA 증폭의 결과를 도시한 것이다.
도 1A 내지 도 1D는 미세유체 핵산 증폭 디바이스에 제공된 샘플에 대한 완전 자동화된 네스티드 RPA를 수행하기 위한 시스템(100)의 부품을 도시한 것이다. 도 1A는 샘플 모듈(102)을 도시한 것으로서, 이는 수용기 모듈(104) 및 이송 모듈(106)을 포함한다. 도 1B는 미세유체 핵산 증폭 디바이스(110)를 도시한 것이다. 도 1C에 도시된 바와 같이, 샘플 모듈(102) 및 핵산 증폭 디바이스(108)는 핵산 증폭 어셈블리(110)를 형성하기 위해 연결된다. 도 1D는 샘플 모듈(102)로부터 핵산 증폭 디바이스(108)에 제공된 샘플에 표적 핵산의 존재를 평가하기 위한 분석기(112)에 삽입된 핵산 증폭 어셈블리(110)를 포함하는, 시스템(100)을 도시한 것이다.
시스템(100)은 샘플 모듈(102)의 수용기 모듈(104)에 제공된 샘플에 표적 핵산의 존재를 평가하기 위해 사용된다. 핵산 증폭 디바이스(108)뿐만 아니라, 샘플 모듈(102)의 수용기 모듈(104) 및 이송 모듈(106)은 제1 RPA 라운드를 수행하고 이후에, 샘플에 존재하는 경우에 표적 핵산을 증폭시키기 위한 제2 RPA 라운드를 수행하기 위해 요구되는 시약을 함유한다. 샘플 모듈(102) 및 핵산 증폭 디바이스(108)의 연결은 샘플 모듈과 핵산 증폭 디바이스 사이의 유체 경로를 생성시켜서, 핵산 증폭 디바이스에 RPA 반응 혼합물의 전달을 가능하게 한다. 일부 경우에, 시스템(100)은 샘플에 둘 이상의 표적 핵산의 존재를 평가하기 위해 사용된다. 일례에서, 시스템(100)은 샘플에 플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스의 존재를 평가하기 위해 사용된다. 특정 경우에, 샘플 모듈(102) 및 핵산 증폭 디바이스(108)는 제3 이상의 네스티드 RPA 라운드를 수행하도록 구성된다.
도 2A 내지 도 2E는 시스템(100)에 대한 대안적인 작업흐름을 도시한 것이다. 도 2A에 도시된 바와 같이, 핵산 증폭 디바이스(108)가 분석기(112) 내에 삽입된다. 도 2B에서, 샘플 모듈(102)은 분석기에서 핵산 증폭 디바이스(108) 쪽으로 진행된다. 분석기(112) 인터페이스 상에서 정합 특징부(registration feature)는 연결 전에 샘플 모듈(102)을 2차원으로 구속하여, 샘플 모듈 및 핵산 증폭 디바이스(108)가 결합되어 샘플 모듈에서 핵산 증폭 디바이스로 또는 그 역으로도 유체를 진행시킬 수 있는 통로를 형성할 수 있게 한다. 도 2C는 분석기(112)에서 핵산 증폭 어셈블리(110)를 도시한 것이다. 핵산 증폭 디바이스(108)에 샘플 모듈(102)의 연결은 샘플 모듈에서 핵산 증폭 디바이스로의 반응물의 흐름을 개시할 수 있고, 이에 의해 샘플에 표적 핵산의 존재의 평가를 개시할 수 있다. 평가가 완료된 직후에, 분석기(112)에서 정합 특징부는 핵산 증폭 어셈블리(110)를 배출하기 위해 맞물려질 수 있다. 도 2E는 분석기(112)로부터 배출 후 핵산 증폭 어셈블리(110)를 도시한 것이다. 핵산 증폭 어셈블리(110)는 분석기(112)로부터 배출 후 폐기될 수 있다.
도 3A 및 도 3B는 샘플 모듈(102)의 수용기 모듈(104)의 일 실시형태의 사시도를 도시한 것이다. 도 3A는 샘플을 수용하거나 시약을 함유하거나, 둘 모두를 위한 챔버(300)를 갖는 수용기 모듈(104)의 사시도를 도시한 것이다. 수용기 모듈(104)은 또한, 이송 모듈(106)과 수용기 모듈을 정렬하기 위한 정합 특징부(302)를 포함한다. 도 3B는 도 3A와 대향하는 사시도를 도시한 것이며, 이는 챔버(300)의 하단(304)의 외관(exterior view)을 도시한 것이다.
도 4A 및 도 4B는 수용기 모듈(104)과 결합하도록 구성된 이송 모듈(106)의 일 실시형태의 사시도를 도시한 것이다. 도 4A는 챔버(400)를 갖는 이송 모듈(106)의 사시도를 도시한 것이며, 각 챔버는 유입구 포트(402) 및 유출구 포트(404)를 갖는다. 이송 모듈(106)은 또한, 수용기 모듈(104)를 이송 모듈과 정렬하기 위한 정합 특징부(406)를 포함한다. 도 4B는 도 4A의 반대 사시도를 도시한 것이며, 이는 하단(408)뿐만 아니라, 챔버(400)의 유입구 포트(402) 및 유출구 포트(404)의 외관을 도시한 것이다.
도 5A 내지 도 5G는 연결된 수용기 모듈(502) 및 이송 모듈(504)을 갖는 샘플 모듈(500)에 샘플을 제공하기 위한 작업흐름을 도시한 것이다. 도 5A에 도시된 바와 같이, 샘플 모듈(500)은 시일링된 파우치(506)에 제공될 수 있다, 시일링된 파우치(506)는 호일 파우치일 수 있다. 도 5B는 파우치(506)로부터 제거 후 샘플 모듈(500)을 도시한 것이며, 힌지(508)는 수용기 모듈(502) 및 이송 모듈(504) 상에 각각 밀봉 시일(510 및 512)을 노출시키기 위해 개방하였다.
도 5C에 도시된 바와 같이, 시일(510)은 샘플 챔버(514) 및 블랭크 챔버(516)를 노출시키기 위해 수용기 모듈(502)로부터 제거될 수 있다. 샘플 챔버(514) 및 블랭크 챔버(516)는 통상적으로, 액체 매질, 예를 들어, 완충액일 수 있다. 샘플(예를 들어, 바디 유체)은 디바이스(518)(예를 들어, 면봉)를 통해 샘플 챔버(514)로 전달되어, 샘플 챔버(514)에서 샘플을 액체 매질에 도입하는 것을 포함한다. 블랭크 챔버(516)는 블랭크 챔버에서 샘플의 삽입을 막기 이하여, 폐색 구성요소(occluding element)(520)로 덮혀질 수 있다. 가스킷(522 및 524)은 샘플이 샘플 챔버(514)에 증착된 후에 수용기 모듈(502)과 이송 모듈(504) 사이에 시일 형성을 증진시키기 위해, 각각 샘플 챔버(514) 및 블랭크 챔버(516)의 외부 주변에 정위될 수 있다. 수용기 모듈(502) 상의 정합 특징부(526)는 이송 모듈(504) 상의 상응하는 정합 특징부와 결합하도록 구성된다.
도 5D 및 도 5E에 도시된 바와 같이, 시일(512)은 샘플 챔버(528) 및 블랭크 챔버(530)를 노출시키기 위해 이송 모듈(504)로부터 제거될 수 있다. 보유 구성요소(retaining element)(532 및 534)는 샘플 챔버, 블랭크 챔버, 또는 둘 모두에서 고체 시약을 보유하기 위해 각각 샘플 챔버(528) 및 블랭크 챔버(530)에 정위될 수 있다. 일례에서, 보유 구성요소(532)는 샘플 챔버(528)에서 시약 펠렛을 보유한다. 시약 펠렛은 RPA 반응을 위한 올리고머를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 펠렛은 동결 건조된 펠렛이다. 블랭크 챔버(530)에는 고체 시약이 존재하지 않을 수 있다. 보유 구성요소(532 및 534)는 통상적으로 개구, 예를 들어, 공극을 규정한다. 일부 경우에, 보유 구성요소(532 및 534)는 프릿(frit)이다. 프릿은 수용기 모듈(502)에서 이송 모듈(504)로의 유체의 이송을 촉진시키도록 선택될 수 있다. 일례에서, 보유 구성요소(532 및 534)는 친수성 프릿이다. 이송 모듈(504)은 수용기 모듈(502)의 정합 특징부(526)와 결합하도록 구성된 정합 특징부(536)를 포함한다.
도 5F에 도시된 바와 같이, 시일(512)이 이송 모듈(504)로부터 제거된 후에, 이송 모듈은 힌지(508)를 중심으로 회전될 수 있고, 수용기 모듈(502)에 고정될 수 있으며, 보유 구성요소(532 및 534)는 샘플 챔버(528) 및 블랭크 챔버(530)에 각각 존재하는 시약을 보유한다. 도 5G에 도시된 바와 같이, 수용기 모듈(502) 및 이송 모듈(504)이 함께 가압될 때, 정합 특징부(526 및 536)는 잠금방식으로 맞물려지고, 가스킷(522)은 샘플 챔버(514 및 528)를 함께 시일링하며, 가스킷(524)은 블랭크 챔버(516 및 530)를 함께 시일링한다. 샘플 모듈(502)이 수용기 모듈(502) 위에 이송 모듈(504)로 도시된 바와 같이 배향될 때, 역전이 일어나기 전에, 샘플 챔버(514) 및 블랭크 챔버(516)에서의 액체 매질은 수용기 모듈에 잔류하고, 이송 모듈(504)에서 각각 샘플 챔버(528) 및 블랭크 챔버(530) 쪽으로 흐르지 않는다. 정합 특징부(526 및 536)는 샘플 모듈(500)이 의도되지 않게 개방되지 않도록, 수용기 모듈(502) 및 이송 모듈(504)을 비가역적으로 시일링하도록 구성될 수 있다.
핵산 증폭 디바이스에 샘플 모듈(500)을 연결시키기 전에, 샘플 모듈은 수용기 모듈(502)에서의 액체 매질의 이송 모듈(504) 쪽으로의 이동을 야기시키기 위해 역전되며, 이에 의해 수화된 반응 혼합물을 형성하기 위해 이송 모듈에서 고체 시약을 수화시킨다. 일례에서, 이송 모듈에서 냉동 건조된 RPA 시약은 수화된 반응 혼합물을 형성하기 위해 수화된다.
도 6A 내지 도 6H는 별개의 수용기 모듈(602) 및 이송 모듈(604)을 갖는 샘플 모듈(600)에 샘플을 제공하기 위한 대안적인 작업흐름을 도시한 것이다. 도 6A에 도시된 바와 같이, 수용기 모듈(602) 및 이송 모듈(604)은 각각 별개의 시일링된 파우치(606, 606')에 제공될 수 있다. 시일링된 파우치(606)는 호일 파우치일 수 있다.
도 6B는 시일 파우치(606')로부터 제거된 이송 모듈(604)을 도시한 것이다. 이송 모듈(604)은 시일(612)로 시일링된다. 도 6C는 파우치(606)로부터 제거된 수용기 모듈(602)을 도시한 것이다. 수용기 모듈(602)은 시일(610)로 시일링된다. 도 6D에 도시된 바와 같이, 수용기 모듈(602)로부터 시일(610)을 제거한 후에, 샘플 챔버(614) 및 블랭크 챔버(616)가 노출된다. 샘플 챔버(614) 및 블랭크 챔버(616)는 통상적으로, 액체 매질, 예를 들어, 완충 용액을 포함한다. 샘플(예를 들어, 체액)은 디바이스(618)(예를 들어, 면봉)를 통해 샘플 챔버(614)로 전달될 수 있으며, 이에 의해 샘플 챔버에서의 액체 매질에 샘플을 도입할 수 있다. 블랭크 챔버(616)는 블랭크 챔버에 샘플의 삽입을 방지하기 위해 폐색 구성요소(620)로 덮혀질 수 있다. 가스킷(622 및 624)은 수용기 모듈(602)과 이송 모듈(604) 사이에 시일 형성을 증진시키기 위해 샘플 챔버(614) 및 블랭크 챔버(616)의 외부 둘레에 정위될 수 있다. 수용기 모듈(602) 상의 정합 특징부(626)는 이송 모듈(604) 상의 상응하는 정합 특징부와 일치하도록 구성된다.
도 6E에 도시된 바와 같이, 시일(612)은 이송 모듈(604)로부터 제거될 수 있다. 이송 모듈(604)로부터 시일(612)을 제거하여 샘플 챔버 및 블랭크 챔버(미도시됨)를 노출시킨다. 보유 구성요소(미도시됨)는 샘플 챔버, 블랭크 챔버, 또는 둘 모두에 고체 시약을 보유하기 위해, 각각 샘플 챔버 및 블랭크 챔버에 정위될 수 있다. 일례에서, 고체 시약은 RPA 반응을 위한 올리고머를 포함한다. 일부 경우에, 고체 시약은 냉동 건조된 펠렛이다. 블랭크 챔버에는 고체 시약이 존재하지 않을 수 있다. 보유 구성요소는 통상적으로, 개구, 예를 들어, 공극을 규정한다. 일부 경우에, 보유 구성요소는 프릿이다. 프릿은 수용기 모듈(602)에서 이송 모듈(604)로의 유체의 전달을 촉진시키도록 선택될 수 있다. 일례에서, 보유 구성요소는 친수성 프릿이다. 이송 모듈(602)은 수용기 모듈(602)의 정합 특징부(626)와 일치시키도록 구성된 정합 특징부(636)를 포함한다.
도 6F에 도시된 바와 같이, 이송 모듈(604)로부터 시일(612)이 제거된 후에, 이송 모듈은 정합 특징부(626 및 636)를 정렬하기 위해 역전될 수 있다. 이러한 역위 동안, 이송 모듈(604)에서의 유지 요소는 이송 모듈의 샘플 챔버 및 블랭크 챔버에 존재하는 시약을 유지한다. 도 6G에 도시된 바와 같이, 수용기 모듈(602) 및 이송 모듈(604)이 함께 가압될 때, 정합 특징부(626 및 636)는 잠금방식으로 맞물려지고, 가스킷(622)은 수용기의 샘플 챔버 및 이송 모듈을 함께 시일링하며, 가스킷(624)은 수용기의 블랭크 챔버 및 이송 모듈을 함께 시일링한다. 도 6G에 도시된 바와 같이, 수용기 모듈(602) 위의 이송 모듈(604)과 관련하여, 샘플 챔버(614) 및 블랭크 챔버(616)에서의 액체 매질은 수용기 모듈에 잔류하고, 이송 모듈에서 각각 샘플 챔버 및 블랭크 챔버 쪽으로 흐르지 않는다. 정합 특징부(626 및 636)는 도 6H에 도시된 바와 같이, 샘플 모듈(600)이 의도되지 않게 개방되지 않도록, 수용기 모듈(602) 및 이송 모듈(604)을 비가역적으로 시일링하도록 구성될 수 있다.
핵산 증폭 디바이스에 샘플 모듈(600)을 연결시키기 전에, 샘플 모듈은 수용기 모듈(602)에서의 액체 매질의 이송 모듈(604) 쪽으로의 이동을 야기시키도록 역전될 수 있고, 이에 의해 고체 시약을 이송 모듈에서 수화시켜 수화된 반응 혼합물을 형성한다. 일례에서, 이송 모듈에서 냉동 건조된 RPA 시약은 수화된 반응 혼합물을 형성하기 위해 수화된다.
도 7은 샘플 모듈(500)의 사시도이다. 이송 모듈(500)은 핵산 증폭 디바이스에 연결되도록 구성된 이송 모듈의 일부를 덮는 시일(700)과 패키징될 수 있다. 시일(700)은 유입구 포트(702 및 704) 및 유출구 포트(706 및 708)의 개구를 덮기 위해 불투명한 표면을 제공하는 호일 시일일 수 있다. 시일(700)은 역전 시에 샘플 모듈(500)에 수화된 반응 혼합물을 보유할 수 있다. 일부 경우에, 시일(700)은 샘플 모듈(500)로부터 제거되며, 핵산 증폭 디바이스는 샘플 디바이스에 연결되며, 샘플 모듈(500)은 먼저 핵산 증폭 디바이스에 시일링된 후에 역전된다. 유입구 포트(702 및 704) 및 유출구 포트(706 및 708)는 핵산 증폭 디바이스 내에 삽입되도록 구성된 테이퍼링된 단부(예를 들어, 낮은 프로파일 루어 커넥터(luer connector))를 가질 수 있다. 일부 경우에, 가스킷(710, 712, 714, 및 716)은 핵산 증폭 디바이스와 기밀 시일을 형성하기 위해, 유입구 포트(702, 704, 706, 및 708) 상에 각각 정위될 수 있다.
도 8A 및 도 8B는 샘플 모듈의 대안적인 실시형태를 도시한 것이다. 도 8A는 수용기 모듈(802) 및 이송 모듈(804)을 포함하는 샘플 모듈(800)의 사시도이다. 도 8B는 샘플 모듈(800)의 사시 단면도이다. 도 8B에 도시된 바와 같이, 수용기 모듈(802)은 개구(808)를 갖는 샘플 챔버(806)를 규정한다. 샘플 챔버(806)는 액체 매질(810)을 보유한다. 액체 매질(810)은 완충 용액일 수 있다. 수용기 모듈(802)은 유입구 포트(812) 및 유출구 포트(814)를 포함한다. 수용기 모듈(802)은 또한, 이송 모듈(804)의 정합 특징부를 맞물리도록 구성된 정합 특징부(816)를 포함한다.
이송 모듈(804)은 연장부(820)를 가지고 수용기 모듈(802)의 샘플 챔버(806)를 수용하도록 구성된 개구(822)를 규정하는 하우징(818)을 포함한다. 램(ram)(824)은 하우징에 정위되며, 연장부(820)는 램의 아암(826)에 정위된다. 아암(826)은 스프링(828) 내에서 정위되며, 스프링은 릴리스 캐치(830)와 함께 로딩된 위치에서 유지된다. 다공성 구성요소(832)는 램(824)과 개구(822) 사이에 정위된다. 다공성 구성요소(832)는 고체 시약(예를 들어, 냉동 건조된 RPA 시약)을 함유한다. 정합 특징부(834)는 수용기 모듈(802)의 정합 특징부(816)와 맞물리도록 구성되며, 가스킷(836)은 수용기 모듈과 이송 모듈(804) 사이에 시일을 형성한다. 도시된 바와 같이, 수용기 모듈(802)은 이송 모듈(804)의 개구(822)에 놓여진다. 정합 특징부(816 및 834)는 가스킷(836)을 통해 수용기 모듈(802) 및 이송 모듈(804)을 시일링하기 위해 잠금방식으로 맞물려진다. 정합 특징부(816 및 834)는 샘플 모듈(800)이 의도되지 않게 개방되지 않도록, 수용기 모듈(802) 및 이송 모듈(804)을 비가역적으로 시일링하도록 구성될 수 있다.
도 9A 내지 도 9E는 샘플 모듈(800)에 샘플을 제공하기 위한 작업흐름을 도시한 것이다. 도 9A에서, 시일(900)은 수용기 모듈(802)로부터 제거된다. 도 9B에서, 샘플은 개구(808)를 통해 수용기 모듈(802)의 샘플 챔버(806)에서의 액체 매질(810)에 제공된다. 도 9C에서, 이송 모듈(804)은 정합 특징부(816 및 834)를 잠금방식으로 맞물리게 하기 위해 수용기 모듈(802) 쪽으로 진행된다. 수용기 모듈(802)이 가스킷(836)을 통해 이송 모듈(804)에 시일링된 후에, 도 9D에 도시된 바와 같이, 스프링-로딩된 램(824)을 방출시키기 위해 힘이 릴리스 캐치(830)에 가해질 수 있다. 방출한 스프링-로딩된 램(824)은 개구(822)를 통해 다공성 구성요소(832)를 진행되고, 이에 따라, 다공성 구성요소에서의 고체 시약은 수용기 모듈(802)의 액체 매질(810) 중에서 수화된다. 도 9E는 액체 매질(810) 내로 고체 시약 다공성 구성요소(832)를 가압시킨, 수용기 모듈(802)에 받쳐진 램(824)을 갖는 시일링된 샘플 모듈(800)을 도시한 것이다. 시일링된 샘플 모듈(800)은 수용기 모듈(802)에 제공된 샘플에 표적 핵산의 존재를 평가하기 위해 핵산 증폭 디바이스에 연결될 수 있다.
도 10은 광학적 검출을 위한 핵산 증폭 디바이스(1000)의 분해도를 도시한 것이다. 핵산 증폭 디바이스(1000)은 상부층(1002), 중간층(1004), 및 베이스층(1006)을 포함하는 라미네이션된 미세유체 디바이스이다. 베이스층(1006)은 한 개가 넘는 부품을 포함할 수 있다. 도시된 바와 같이, 베이스층(1006)은 2개의 부품(1008 및 1010)을 포함한다.
중간층(1004)은 유입구 포트(1012 및 1014) 및 유출구 포트(1016 및 1018)를 포함하는데, 이는 각각 샘플 모듈의 유출구 포트 및 유입구 포트에 연결된다. 중간층(1004)은 통상적으로, 시약, 예를 들어, RPA 시약을 포함한다. 도 10에 도시된 바와 같이, 1차 반응 챔버(1020)는 고체 시약(1022)(예를 들어, 마그네슘 아세테이트 형태의 Mg2 +)을 포함한다. 중간층(1004)은 시약 저장소(1024 및 1026)를 포함하는데, 이는 고체 시약(1028 및 1030)을 함유한다. 일례에서, 고체 시약(1028)은 건조된(예를 들어, 냉동 건조된) 올리고머를 포함하며, 고체 시약(1030)은 Mg2 +(예를 들어, 마그네슘 아세테이트 형태)를 포함한다. 2차 반응 챔버(1032)는 또한 검출 챔버로서 기능할 수 있으며, 여기서, 표적 핵산은 분석기에 의해 광학적 신호를 통해 검출된다. 2차 반응 챔버(1032)는 광학적으로 투명한 덮개를 가지며, 이에 따라, 형광단 및 소광제가 엑소뉴클레아제를 통해 분리될 때 발생된 형광 신호가 핵산 증폭 디바이스가 삽입되도록 구성된 분석기에서 광학 센서에 의해 검출될 수 있게 한다. 정합 특징부(1036)는 분석기에서 핵산 증폭 디바이스(1000)의 정렬을 가능하게 한다.
중간층(1004)은 또한, 흐름 검출 챔버(1034)를 포함할 수 있으며, 각각은 액체의 흐름을 검출하기 위해 유체의 존재가 분석기에 의해 광학적으로 모니터링되는 투명한 덮개를 갖는다. 핵산 증폭 디바이스(1000)를 수용하도록 구성된 분석기는 구성된 각 흐름 검출 챔버 쪽으로 검출된 광원을 포함한다. 분석기는 각 흐름 검출 챔버에서 액체의 존재를(예를 들어, 광산란을 통해) 검출하도록 구성된다. 흐름 검출 챔버에서 액체의 검출은 다양한 작업(예를 들어, 펌핑의 개시 또는 중지)을 촉발시킬 수 있으며, 분석기에서 제어기는 흐름 검출 챔버에서의 액체의 검출을 기초로 하여 다양한 파라미터(예를 들어, 펌핑 시간, 반응 시간, 혼합 시간, 흐름 시간)를 실행하도록 구성되며, 이에 따라, 시약이 사전 결정된 부피로 제공되고, 사전 결정된 시간 동안 반응하게 한다.
핵산 증폭 디바이스(1000)는 펌프 및 미세유체 경로와 같은, 도 10에 도시되지 않은 추가적인 특징을 포함할 수 있다. 펌프들 중 하나 이상은 연동 펌프 또는 시린지 펌프일 수 있다. 펌프는 필요한 경우 분취액을 계량하는, 광학 분석기에서 광학 센서에 의해 검출된 흐름 검출 챔버를 통한 유체의 경과 시간 또는 흐름을 기초로 하여 샘플 모듈 및 1차 반응 챔버(1020)에서 2차 반응 챔버(1032) 쪽으로 시약을 선택적으로 유도한다.
샘플 모듈을 갖는 핵산 증폭 디바이스(1000)의 작동은 도 11에 대해 기술된다. 샘플 모듈이 핵산 증폭 디바이스(1000)에 연결될 때, 샘플 모듈의 유출구 포트는 핵산 증폭 디바이스의 유입구 포트(1012 및 1014)에 연결되며, 샘플 모듈의 유입구 포트는 핵산 증폭 디바이스의 유출구 포트(1016 및 1018)에 연결된다. 샘플 모듈에서의 시약은 샘플 모듈의 유출구 포트를 통해 핵산 증폭 디바이스(1000)의 유입구 포트(1012 및 1014) 내로 흐르며, 핵산 증폭 모듈로부터 옮겨진 유체(예를 들어, 가스, 액체, 또는 둘 모두)는 핵산 증폭 모듈의 유출구 포트(1016 및 1018)를 통해 샘플 모듈의 유입구 포트 내로 흐른다.
더 상세히, 샘플 및 완충제는 이송 모듈의 샘플 챔버에서 RPA 시약(예를 들어, 건조된 올리고머)을 수화시키기 위해 수용기 모듈의 샘플 챔버로부터 유출구 포트를 통해 그리고 유입구 포트(1012) 내로 흐른다. 제1 펌프(1040)는 이러한 1차 반응 혼합물을 제1 흐름 검출 챔버(1042)를 통해 진행시킨다.
흐름 검출 챔버로부터, 1차 반응 혼합물은 제1 펌프 내로, 혼합 챔버(1044)를 통해, 제2 흐름 검출 챔버(1046)로, 그리고 1차 반응 챔버(1020) 내로 인출된다. 1차 반응 챔버(1020)는 RPA 시약(1022)(예를 들어, 마그네슘 아세테이트 형태의 Mg2 +)을 포함하고, 가열기 및 혼합기에 연결된다. 혼합기는 자성 혼합기(1048)로서 존재할 수 있다. 충분한 혼합 시간 후에, 제1 펌프(1040)는 1차 반응 챔버(1020)에서 형성된 생성물을 제3 흐름 검출 챔버(1050)로 진행시킨다. 제3 흐름 검출 챔버(1050)로부터, 공기 및 1차 반응 챔버로부터의 1차 RPA 반응의 생성물의 일부는 유출구 포트(1016)를 통해 샘플 모듈 쪽으로 흐른다.
제1 반응 챔버(1020)로부터의 생성물의 분취액은 제2 펌프(1054)에 의해 션트(shunt)(1052)로부터 끌어당겨지고, 제4 흐름 검출 챔버(1056) 쪽으로 흐른다. 제3 펌프(1058)는 이송 모듈의 블랭크 챔버로부터 이송 모듈의 유출구 포트를 통해 핵산 증폭 디바이스(1000)의 유입구 포트(1014) 내로 및 제5 흐름 검출 챔버(1060)를 통해 2차 RPA 반응을 위한 시약(예를 들어, 완충제)을 끌어당긴다. 제4 흐름 검출 챔버(1056) 및 제5 흐름 검출 챔버(1060)는 Y 접합부(1062)에서 만나서, 2차 RPA 용액을 위한 시약과 제1 RPA 용액으로부터의 선택된 양의 생성물을 혼합한다. 이러한 혼합물은 제1 시리즈의 혼합 구성요소(1064) 및 제2 시리즈의 혼합 구성요소(1066)를 통해 제2 펌프(1054) 및 제3 펌프(1058)에 의해 펌핑된다. 혼합 구성요소(1066)를 통해 진행한 후에, 혼합물은 반응 혼합물의 4개의 스트림을 수득하기 위해 접합부(1068)에서 분기되고 접합부(1070)에서 다시 분기된다. 각 스트림은 시약(1028)(예를 들어, 마그네슘 아세테이트 형태의 Mg2 +)과 반응 혼합물을 혼합하도록 구성된 혼합 실린더(1072)를 갖는 제1 시약 저장소(1024)를 통해 흐른다. 제1 시약 저장소(1024)로부터, 각 혼합물은 시약(1030)을 함유한 제2 시약 저장소(1026)를 통해 흐른다. 제2 시약 저장소(1026)에서의 시약(1030)은 동일하거나 상이할 수 있다. 일례에서, 시약(1030) 중 적어도 2개는 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스와 같은, 고려되는 특정 표적을 위한 상이한 RPA 프라이머를 포함한다.
제2 시약 저장소(1026)로부터, 제3 펌프(1058)는 혼합물을 혼합 구성요소(1074)를 통해 그리고 2차 반응 챔버(1032) 내로 유도한다. 2차 증폭은 2차 반응 챔버(1032)에서 일어난다. 2차 반응 챔버(1032)는 또한, 검출 챔버로서 기능할 수 있다. 핵산 증폭 디바이스(1000)에서, 2차 반응 챔버(1032)는 광학적으로 투명한 덮개를 가지며, 이에 따라 형광단 및 소광제가 엑소뉴클레아제를 통해 분리될 때 발생된 형광 신호가 도 15 내지 도 18에 대해 기술된 분석기와 같은, 핵산 증폭 디바이스가 삽입되도록 구성된 분석기에서 광학적으로 검출될 수 있다.
도 12는 전기화학적 검출을 위한 핵산 증폭 디바이스(1200)의 분해도를 도시한 것이다. 핵산 증폭 디바이스(1200)는 센서 층(1201), 상부층(1202), 중간층(1204), 및 베이스층(1006)을 포함하는 라미네이션된 미세유체 디바이스이다. 베이스층(1206)은 하나 초과의 구성성분을 포함할 수 있다. 도시된 바와 같이, 베이스층(1206)은 2개의 구성성분(1208 및 1210)을 포함한다.
중간층(1204)은 유입구 포트(1212 및 1214) 및 유출구 포트(1216 및 1218)를 포함하는데, 이는 각각 샘플 모듈의 유출구 포트 및 유입구 포트에 연결된다. 중간층(1204)은 통상적으로, 시약, 예를 들어, RPA 시약을 포함한다. 도 12에 도시된 바와 같이, 1차 반응 챔버(1220)는 고체 시약(1222)(예를 들어, 마그네슘 아세테이트 형태의 Mg2 +)을 포함한다. 교반기(1223)는 고체 시약(1222)에 임베딩될 수 있다. 일례에서, 교반기는 자기 퍽(magnetic puck)이다. 2차 반응 챔버(1232)는 또한, 검출 챔버로서 기능할 수 있으며, 이는 상부층(1202)에서 개구(1225)는 반응 챔버에서의 액체를 센서층(1201)의 밑면 상에서 전극과 접촉할 수 있게 한다. 중간층(1204)은 또한, 흐름 검출 챔버(1234)를 포함할 수 있으며, 여기서, 유체의 존재는 상부층(1202)의 개구 위에 중첩된 센서 층(1201)에서의 전극에 의해 전기적으로 모니터링되며, 이에 따라, 흐름 검출 챔버를 통해 흐르는 액체가 전극과 접촉하게 한다. 정합 특징부(1236)는 분석기에 핵산 증폭 디바이스(1200)의 정렬을 가능하게 한다.
핵산 증폭 디바이스(1200)는 도 12에 도시되지 않은 추가적인 특징, 예를 들어, 펌프 및 미세유체 통로를 포함할 수 있다. 펌프들 중 하나 이상은 연동 펌프 또는 시린지 펌프일 수 있다. 펌프는 필요한 경우에 분취액을 계량하는, 전기 분석기에서 센서에 의해 검출된 흐름 검출 챔버를 통한 유체의 경과 시간 또는 흐름을 기초로 하여, 시약을 샘플 모듈 및 1차 반응 챔버(1220)로부터 2차 반응 챔버(1232) 쪽으로 선택적으로 유도할 수 있다.
샘플 모듈을 갖는 핵산 증폭 디바이스(1200)의 작동은 중간층의 상단 투시도를 도시한 도 13에 대해 기술된다. 샘플 모듈이 핵산 증폭 디바이스(1200)에 연결될 때, 샘플 모듈의 유출구 포트는 핵산 증폭 디바이스의 유입구 포트(1212 및 1214)에 연결되며, 샘플 모듈의 유입구 포트는 핵산 증폭 디바이스의 유출구 포트(1216 및 1218)에 연결된다. 샘플 모듈에서의 시약은 샘플 모듈의 유출구 포트를 통해 핵산 증폭 디바이스(1200)의 유입구 포트(1212 및 1214) 내로 흐르며, 핵산 증폭 모듈로부터 옮겨진 유체(예를 들어, 가스, 액체, 또는 둘 모두)는 핵산 증폭 모듈의 유출구 포트(1216 및 1218)를 통해 샘플 모듈의 유입구 포트 내로 흐른다.
더 상세히, 샘플 및 완충제는 이송 모듈의 샘플 챔버에서 RPA 시약(예를 들어, 건조된 올리고머)을 수화시키기 위해 수용기 모듈의 샘플 챔버에서 유출구 포트를 통해 유입구 포트(1212)로 흐른다. 제1 펌프(1240)는 이러한 1차 반응 혼합물을 제1 흐름 검출 챔버(1242)를 통해 제1 펌프로, 혼합 챔버(1244)를 통해, 제2 흐름 검출 챔버(1246)로, 그리고 1차 반응 챔버(1220) 내로 전진한다. 1차 반응 챔버(1220)는 RPA 시약(1222)(예를 들어, 마그네슘 아세테이트 형태의 Mg2 +)을 포함하고, 가열기 및 혼합기에 연결된다. 혼합기는 자성 혼합기(1248)로서 존재할 수 있다. 충분한 혼합 시간 후에, 제1 펌프(1240)는 1차 반응 챔버(1220)에서 형성된 생성물을 제3 흐름 검출 챔버(1250)로 진행시킨다. 제3 흐름 검출 챔버(1250)로부터, 공기, 및 1차 반응 챔버로부터의 1차 RPA의 생성물의 일부는 유출구 포트(1216)를 통해 샘플 모듈 쪽으로 흐른다.
제1 반응 챔버(1220)로부터의 산물의 분취액은 제2 펌프(1254)에 의해 션트(1252)에서 꺼내지고, 제4 흐름 검출 챔버(1256) 쪽으로 흐른다. 제3 펌프(1258)는 제2 RPA 반응을 위한 시약(예를 들어, 완충제)를 이송 모듈의 블랭크 챔버로부터 이송 모듈의 유출구 포트를 통해 핵산 증폭 디바이스(1200)의 유입구 포트(1214) 내로 및 제5 흐름 검출 챔버(1260)를 통해 당겨진다. 제4 흐름 검출 챔버(1256) 및 제5 흐름 검출 챔버(1260)는 Y 접합부(1262)에서 만나며, 제1 RPA 산물로부터의 선택된 양의 산물을 제2 RPA 반응을 위한 시약과 혼합한다. 이러한 혼합물은 제2 펌프(1254) 및 제3 펌프(1258)에 의해 제1 시리즈의 혼합 요소(1264) 및 제2 시리즈의 혼합 요소(1266)를 통해 펌핑된다. 혼합 요소(1266)를 통해 진행한 후에, 혼합물은 접합부(1268)에서 분기되고, 다시 접합부(1270)에서 분기되어 반응 혼합물의 4개의 스트림을 수득한다. 각 스트림은 반응 혼합물을 시약(1228)(예를 들어, 마그네슘 아세테이트 형태의 Mg2+)과 혼합하도록 구성된 혼합 실린더(1272)를 구비한 제1 시약 저장소(1224)를 통해 흐른다. 제1 시약 저장소(1224)로부터, 각 혼합물은 시약(1230)을 함유한 제2 시약 저장소(1226)를 통해 흐른다. 제2 시약 저장소(1226)에서의 시약(1230)은 동일하거나 상이할 수 있다. 일례에서, 시약(1230)의 적어도 2개는 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스와 같은 고려되는 특정 표적에 대한 상이한 RPA 프라이머를 포함한다.
제2 시약 저장소(1226)로부터, 제3 펌프(1258)는 혼합 요소(1274)를 통해 그리고 2차 반응 챔버(1232) 내로 혼합물을 유도한다. 제2 증폭은 2차 반응 챔버(1232)에서 일어난다. 2차 반응 챔버(1232)는 또한, 검출 챔버로서 기능할 수 있다. 핵산 증폭 디바이스(1200)에서, 2차 반응 챔버(1232)에서의 액체는 센서 층(1201)의 밑면 상에서 전극과 접촉하며, 이에 따라, 레독스 활성 화합물로 라벨링된 RPA 프로브로부터 절단된, 미국일련번호 제62/300,242호에 기술된 바와 같이, 레독스 활성 화합물의 산화로부터 얻어진 구성된 분석기에 의해 검출되도록 하며, 여기서, 전자가 핵산 증폭 디바이스가 삽입된다.
도 14는 상부층(1202) 및 중간층(1204)에서 개구와 중첩된 센서 층(1201)에 전극을 갖는 핵산 증폭 디바이스(1200)의 상부 투시도를 도시한 것이다. 전극은 유동 센서 검출기(1246, 1250, 1256, 및 1260) 및 반응 챔버(1232)에서 액체와 접촉하도록 센서 층(1201)의 밑면 상에 정위된다. 일례에서, 분석기와 전기적으로 소통하는 단자에 감지 전극을 전기적으로 연결하는, 감지 전극뿐만 아니라 전도성 트랙은 센서 층 상에 제1 전도성 층을 배치시킴으로써 형성될 수 있다. 다른 예에서, 제1 전도성 층은 센서 층 상에 제2 전도성 층 위에 배치될 수 있다. 전극은 전도성 층을 마스킹하고 노출된 영역 위에 유전체 층을 배치시킴으로써 절연될 수 있다. 일례에서, 제1 전도성 물질은 탄소를 포함한다. 다른 예에서, 제2 전도성 물질은 은을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "배치하는(disposing)"은 프린팅 방법, 예를 들어, 스크린 프린팅을 포함한다. 은 층이 탄소 층 아래에 증착될 때, 얻어진 전도성 트랙은 통상적으로, 단지 탄소만을 사용하여 형성된 전도성 트랙과 비교할 때 다 낮은 저항을 갖는다. 두 예 모두에서, 전기화학적 측정은 탄소 표면 상에서 수행된다.
유동 센서 검출기(1246 및 1250)는 각각 2개의 액체 감지 전극에 전기적으로 연결된다. 유동 센서 검출기(1246)에 대하여, 액체 감지 전극(1400 및 1402)은 배선(1404 및 1406)에 전기적으로 연결되는데, 이는 각각 접속부(1408 및 1410)에 전기적으로 연결된다. 유동 센서 검출기(1256 및 1260)는 각각 4개의 액체 감지 전극에 전기적으로 연결된다. 유동 센서 검출기(1260)에 대하여, 액체 감지 전극(1412 및 1414)은 배선(1420 및 1422)에 전기적으로 연결되는데, 이는 각각 접속부(1428 및 1430)에 전기적으로 연결되며, 전극(1416 및 1418)은 배선(1424 및 1426)에 전기적으로 연결되며, 이는 각각 접속부(1432 및 1434)에 전기적으로 연결된다. 각 검출 챔버(1232)는 기준 전극(1436), 작업 전극(1438), 및 반대 전극(1440)을 포함하는 4개의 측정 전극에 연결되며, 각 전극은 배선을 통해 접속부에 전기적으로 연결된다. 배선은 전도성 물질(예를 들어, 은)을 포함하는 전도성 트레이스일 수 있다. 접속부는 분석기에서 단자들을 맞물리도록 구성된다.
액체 감지 전극은 전도도의 원리로 작동한다. 즉, 전압은 단자를 가로질러 인가되며, 유체가 개개 챔버 내에서 감지 전극과 접촉할 때, 전류는 액체를 통해 진행하며, 분석기는 전류의 흐름을 검출한다. 측정 전극에 대하여, 전위는 반대 전극과 작업 전극 사이에 인가되며, 기준 전극은 인가된 전위가 예상되는 바와 같도록 작동한다. 전류측정 모드에서 작동할 때, 전류는 작업 전극과 접촉하는 전기활성 종의 농도에 비례하여 흐른다(표적 종의 산화 또는 환원이 특정 전위에서 일어나는 지의 여부에 따라 전자가 효과적으로 수용되거나 공여됨). 시차 펄스 전압전류법 모드에서, 전위는 하나의 전압에서 다른 전압으로 스위핑되고, 얻어진 전류는 기록되어 전기활성 종의 산화 또는 환원의 결과로서 피크 및/또는 트로프(trough)를 일으킨다.
도 15는 분석기(1504)에 삽입된 핵산 증폭 디바이스(1502)를 포함하는, 핵산 증폭 시스템(1500)을 도시한 것이다. 핵산 증폭 디바이스(1502) 및 분석기는 RPA 산물의 광학적 또는 전기화학적 검출을 위해 구성될 수 있다. 일부 경우에, 분석기에 핵산 증폭 디바이스의 삽입은 핵산 증폭 디바이스에 제공된 샘플에 표적 핵산의 존재의 평가를 개시한다. 다른 경우에, 핵산 증폭 디바이스에 샘플 모듈을 후속하여 연결하여 샘플에 표적 핵산의 존재의 평가를 개시한다. 또 다른 경우에, 핵산 증폭 디바이스에 제공된 샘플에 표적 핵산의 존재의 평가는 핵산 증폭 디바이스의 삽입 또는 분석기 내에 어셈블리 후 사용자에 의해 개시된다.
도 16에 도시된 바와 같이, 핵산 증폭 디바이스(1502) 및 분석기(1504)는 RPA 산물의 광학적 검출을 위해 구성된다. 특히, 분석기(1504)는 핵산 증폭 디바이스(1502)의 검출 챔버에서 RPA 산물에 연결된 형광 프로브로부터의 형광을 검출하도록 구성된다. 분석기(1504)는 광원, 각 광원에 대응하는 여기광 가이드(1600), 각 방출광 가이드에 대응하는 방출광 가이드(1602), 및 광검출기를 포함한다. 광원은 통상적으로, LED 방출 피크와 표적 형광 라벨의 흡광 간에 양호한 매칭을 달성하도록 선택된 발광 다이오드(LED)이다. 분석기(1504)는 단일 광 방출 필터를 이용하여 다수의 반응 셀로부터의 형광 측정을 가능하도록 기울어진 기하학적 구조를 도입한다.
도 17은 도 16의 일부의 확대도를 도시한 것이다. 도 17에 도시된 바와 같이, 분석기(1504)는 핵산 증폭 디바이스(1502)에서 4개의 검출 챔버(1700)로부터 형광 측정을 가능하게 하는 4개의 광원을 포함한다. 여기광 가이드(1600)는 광을 광원에서 검출 챔버(1700)로 유도하며, 방출광 가이드(1602)는 형광 방출을 검출 챔버에서 광학 필터를 통해 공통의 광다이오드로 유도한다. 4개의 광원의 시분할 멀티플렉싱(time division multiplexing)에 의해 4개의 측정 채널들 간에 판별이 제공된다. 각 여기광 가이드(1600)는 입사광을 광원들 중 하나에서 표적으로 입사광과 면 간의 각도가 30° 내지 60°(예를 들어, 40°) 범위이게 하는 면에 유도하도록 구성되며, 각 방출광 가이드(1602)는 방출된 광 간의 각도가 40° 내지 60°(예를 들어, 30°)이도록, 방출된 광을 표적에서 광검출기로 유도하도록 구성된다. 분석기(1504)는 통상적으로 각 광원에 대응하는 제1 렌즈 및 제2 렌즈를 포함하며, 각 대응하는 여기광 가이드는 제1 렌즈를 통해 투과된 광을 이의 대응하는 광원으로부터 그리고 전체 내부 반사를 통해 조준하고 조준된 광을 제2 렌즈 쪽으로 소정 각도로 유도하도록 구성된다.
도 18A 내지 도 18C는 분석기(1504)의 기울어진 기하학적 구조를 도시한 것이다. 도 18A 내지 도 18C에 도시된 각도는 일례로서, 설명의 용이성을 위해 선택된 것이다. 그러나, 이러한 각도는 분석기(1500)의 실시형태에서 변경될 수 있다. 도 18A에 도시된 바와 같이, 회전축은 반응 챔버(1700)의 중심을 연결하는 라인에 대해 45° 배향된다. 이러한 구성은 여기광 가이드와 방출광 가이드 사이의 위치 충돌(positional clash)을 회피하는 것을 용이하게 한다. 도 18B는 수직의 검출 챔버 표면(y축 둘레의 x면에서 회전됨)에 대해 30°에서의 여기 광학축을 도시한 것이다. 도 18C는 수직의 검출 챔버 표면(직각 회전축에 대해, 즉, yz면 및 x축에서 회전됨)에 대해 40°에서의 방출 광학축을 도시한 것이다. 회전 중심은 정상 액체 표면 위치 아래이다(예를 들어, 0.1 내지 1 mm 아래). 기울어진 각도의 다른 조합은 하기 표 1에 나열되어 있다. 여기광 가이드 및 방출광 가이드에서 최대 구부러진 각도는 통상적으로 45° 이하이다.
Figure pct00001
분석기(1504)는 광원 및 광검출기에 작동 가능하게 연결된 제어기를 포함한다. 제어기는 광원에 의한 입사광의 생성을 개시하고, 검출 챔버로부터 방출된 광의 수집을 개시한다. 분석기(1504)는 통상적으로, 방출광 가이드와 광검출기 사이에 작동 가능하게 정위된 단일 광검출기 및 단일 방출 필터를 포함한다. 그러나, 일부 실시형태에서, 하나 이상의 추가적인 광검출기, 방출 필터, 또는 둘 모두가 존재할 수 있다.
본원의 디바이스 및 방법이 재조합효소 중합효소 증폭(RPA) 기술의 적용으로서 기술되었지만, 표적 핵산을 증폭 및 검출하기 위한 다른 등온 기술은 또한, 본 명세서에 기술된 디바이스에서, 예를 들어, 니킹 및 확장 증폭 반응(Nicking and Extension Amplification Reaction: NEAR) 기술에서 실행될 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 RPA 증폭 산물의 RPA 증폭 및 검출 방법은 미국특허번호 제7,399,590호; 제8,580,507호; 제7,270,981호; 제7,399,590호; 제7,666,598호; 제7,435,561호; 제9,469,867호; 제9,057,097호; 제8,071,308호; 제8,637,253호; 및 제8,062,850호에 상세히 기술된다. NEAR 방법은 미국특허출원공개번호 제2009/0081670호 및 제2009/0017453호에 기술되어 있다. 상기 참조문헌 각각은 전문이 참고로 본 명세서에 포함되고 본 개시내용의 일부로 여겨진다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, RPA는 주형 이중-가닥 핵산에서 동족 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 쌍을 이룰 수 있는, 재조합효소로서 공지된 효소를 이용한다. RPA는 듀플렉스 DNA에 주형과 함께 2개의 프라이머를 삽입하기 위한 재조합효소, DNA의 변위된 가닥을 안정화시키고 프라이머가 변위되는 것을 방지하기 위한 단일 가닥 DNA-결합 단백질, 및 주형 DNA에 결합된 프라이머를 연장하기 위한 가닥-변위 중합효소를 포함한다. 이러한 방식으로, DNA 합성은 주형 이중-가닥 핵산에서 규정된 포인트로 유도된다. 2개 이상의 서열-특이적(예를 들어, 유전자-특이적) 프라이머를 사용하여, 주형이 존재하는 경우에 지수 증폭 반응이 개시된다. 반응은 빠르게 진행하고, 주형 핵산의 몇 개의 복사체(copy)로부터 수분 내에 검출 가능한 증폭된 산물 수준까지 주형 이중-가닥 핵산 내에 존재하는 서열의 특정 증폭을 야기시킨다. RPA 과정은 생리학적 온도(예를 들어, 37 내지 42℃) 하 등온 조건 하에서 진행한다. RPA 방법은 예를 들어, US 7,270,981호; US 7,399,590호; US 7,666,598호; US 7,435,561호; US 2009/0029421호; 및 WO 2010/141940호에 개시되며, 이러한 문헌 모두는 본 명세서에 참고로 포함된다.
RPA는 세포 DNA 복제 및 복구 기계의 구성성분을 도입하고, 특정 군집제(crowding agent)의 존재 하에서 달성된 높은 수준의 재조합 활성을 유지하는 재조합효소 로딩 및 언로딩 둘 모두의 적절한 속도를 갖는 '동적' 재조합 환경을 확립한다. RPA는 PCR의 민감도, 특이성 및 대부분의 다른 특징을 조합시키지만, 열순환에 대한 필요성이 없고 오프-온도 설정에 대한 탁월한 속도 및 견고함을 갖는다는 장점을 갖는다. RPA는 적어도 부분적으로, 열안정성 균등물, 단일-가닥 DNA 결합 단백질과 같은 부속 단백질 없이 불량한 조절, 또는 이들의 조합에 대한 필요성으로 인하여 다른 과정에 의해 미개발된 공지된 복구 엔도뉴클레아제와 같은 매우 다양한 핵산 가공 효소의 잠재적인 이용으로부터 유리하다.
간단하게, RPA는 하기 단계를 포함한다. 첫번째로, 재조합효소제는 제1 뉴클레오단백질 프라이머 및 제2 뉴클레오단백질 프라이머를 형성하기 위해 제1 핵산 및 제2 핵산과 접촉된다. 두번째로, 제1 뉴클레오단백질 프라이머 및 제2 뉴클레오단백질 프라이머는 제1 가닥의 제1 부분에서 제1 이중 가닥 구조를 형성하고 제2 가닥의 제1 부분에 이중 가닥 구조를 형성하기 위해 이중 가닥 표적 서열과 접촉되며, 이에 따라, 상기 제1 핵산 프라이머 및 상기 제2 핵산 프라이머의 3' 단부가 제공된 주형 DNA 분자 상에서 서로를 향하여 배향된다. 셋째로, 상기 제1 뉴클레오단백질 프라이머 및 제2 뉴클레오단백질 프라이머의 3' 단부는 제1 및 제2 이중 가닥 핵산 및 핵산의 제1 및 제2 변위된 가닥을 발생시키기 위해 DNA 중합효소에 의해 확장된다. 제2 단계 및 제3 단계는 요망되는 증폭도에 달성될 때까지 반복된다.
본 개시내용은 또한, 미세유체 카트리지 또는 디바이스 내에 네스티드 RPA를 수행하는 방법을 제공한다. 네스티드 RPA에서, 핵산의 제1 영역은 제1 증폭된 영역을 형성하기 위해 RPA에 의해 증폭된다. 이후에, 제1 증폭된 영역 내에 완전히 포함된 핵산의 제2 영역은 제2 증폭된 영역을 형성하기 위해 RPA를 사용하여 증폭된다. 이러한 과정은 여러 번 반복될 수 있다. 예를 들어, 제2 영역 내에 완전히 포함된, 핵산의 제3 영역은 RPA에 의해 제2 증폭된 영역으로부터 증폭될 수 있다.
본 명세서에 개시된 RPA 시약은 표적 핵산 서열을 증폭하는 한 세트의 프라이머를 함유할 수 있다. 프라이머는 표적 핵산 서열에 대해 상보적이거나 하나 이상의 위치에서 표적 핵산 서열과는 상이한 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 하나 이상의 위치에서 표적 핵산 서열과는 상이한 프라이머를 갖는 RPA의 증폭 산물은 하나 이상의 위치에서 표적 서열과는 상이할 수 있다. 본 명세서에 기술된 RPA 반응의 증폭 산물은 표적 절단 서열을 포함할 수 있다.
RPA 프라이머 세트는 표적 핵산 서열을 증폭시키거나 하나 이상의 위치에서 표적 핵산 서열과는 상이한 서열을 도입할 수 있다. 이러한 도입된 서열은 표적 절단 서열로 이루어질 수 있다. 제1 프라이머는 표적 핵산 서열에 대해 상보적일 수 있다. 제2 프라이머는 표적 핵산 서열에 대해 상보적인 제1 부분 및 하나 이상의 위치에서 표적 핵산 서열과는 상이한 제2 부분을 포함할 수 있다. 2개의 프라이머가 핵산 서열을 증폭시킬 때, 제2 프라이머는 증폭된 산물 내에 하나 이상의 상이한 위치를 도입한다. 이러한 증폭된 영역은 하나 이상의 위치에서 표적 핵산 서열과는 상이하고, 표적 절단 서열로 이루어질 수 있다.
본 명세서에 개시된 RPA 조성물은 재조합효소를 함유하며, 이는 원핵 생물, 바이러스 또는 진행 생물 기원으로 비롯될 수 있다. 예시적인 재조합효소는 RecA 및 UvsX(예를 들어, 임의의 종으로부터 얻어진 RecA 단백질 또는 UvsX 단백질), 및 이들의 단편 또는 돌연변이, 및 이들의 조합을 포함한다. RecA 및 UvsX 단백질은 임의의 종으로부터 얻어질 수 있다. RecA 및 UvsX 단편 또는 돌연변이 단백질은 또한, 이용 가능한 RecA 및 UvsS 단백질 및 핵산 서열, 및 분자 생물학 기술을 이용하여 생성될 수 있다(예를 들어, 미국특허번호 제8,071,308호에 기술된 UvsX의 돌연변이 형태 참조). 예시적인 UvsX 단백질은 미오비리다에 파지(myoviridae phage), 예를 들어, T4, T2, T6, Rb69, Aeh1, KVP40, 아시네토박터 파지(Acinetobacter phage) 133, 아에로모나스 파지(Aeromonas phage) 65, 시아노파지(cyanophage) P-SSM2, 시아노파지 PSSM4, 시아노파지 S-PM2, Rb14, Rb32, 아에로모나스 파지 25, 비브리오 파지(Vibrio phage) nt-1, phi-1, Rb16, Rb43, 파지 31, 파지 44RR2.8t, Rb49, 파지 Rb3, 및 파지 LZ2로부터 유래된 단백질을 포함한다. 추가적인 예시적 재조합효소 단백질은 아르카에박테리아 RADA 및 RADB 단백질 및 진행 생물(예를 들어, 식물, 포유류 및 진균) Rad51 단백질(예를 들어, RAD51, RAD51B, RAD51C, RAD51D, DMC1, XRCC2, XRCC3, 및 recA)을 포함한다(예를 들어, 문헌[Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103:10328-10333, 2006] 참조).
본 개시내용의 임의의 과정에서, 재조합효소(예를 들어, UvsX)는 돌연변이 또는 혼성 재조합효소일 수 있다. 일부 실시형태에서, 돌연변이 UvsX는 Rb69 UvsX 아미노산 서열에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 Rb69 UvsX이며, 여기서, 돌연변이는 (a) 위치 64에서 히스티딘이 아닌 아미노산, 위치 64에 세린, C-말단에 하나 이상의 글루탐산 잔기의 추가, C-말단에 하나 이상의 아스파르트산 잔기의 추가, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 돌연변이체 UvsX는 T6 UvsX 아미노산 서열에서 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 T6 UvsX이며, 여기서, 돌연변이는 (a) 위치 66에 히스티딘이 아닌 아미노산; (b) 위치 66에 세린; (c) C-말단에 하나 이상의 글루탐산 잔기의 추가; (d) C-말단에 하나 이상의 아스파르트산 잔기의 추가; 및 (e) 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 혼성 재조합효소 단백질이 사용되는 경우에, 혼성 단백질은, 예를 들어, 상이한 UvsX 종으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 영역을 포함하는 UvsX 단백질일 수 있다. 영역은 예를 들어, UvsX의 DNA-결합 루프-2 영역일 수 있다.
본 명세서에 개시된 DNA 중합효소는 진핵생물 또는 원핵생물 중합효소일 수 있다. 진핵생물 중합효소의 예는 pol-알파, pol-베타, pol-델타, pol-엡실론, 및 이들의 돌연변이체 또는 단편, 또는 이들의 조합을 포함한다. 원핵생물 중합효소의 예는 대장균 DNA 중합효소 I(예를 들어, Klenow 단편), 박테리오파지 T4 gp43 DNA 중합효소, 바실러스 스테아로테로모필루스 중합효소 I 큰 단편, Phi-29 DNA 중합효소, T7 DNA 중합효소, 바실러스 수브틸리스(Bacillus subtilis) Pol I, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) Pol I, 대장균 DNA 중합효소 I, 대장균 DNA 중합효소 II, 대장균 DNA 중합효소 III, 대장균 DNA 중합효소 IV, 대장균 DNA 중합효소 V, 및 이들의 돌연변이체 또는 단편, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA 중합효소는 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성이 부족하다. 일부 실시형태에서, DNA 중합효소는 가닥-변위 성질, 예를 들어, 부류 pol I 또는 pol V의 원핵생물 중합효소의 큰 단편을 갖는다.
추가적으로, 하나 이상의 단일-가닥 DNA 결합 단백질은 반응에서 진행 중인 다양한 교환 반응 동안에 핵산을 안정화시키기 위해 사용될 수 있다. 하나 이상의 단일-가닥 DNA 결합 단백질은 임의의 종으로부터, 예를 들어, 원핵생물, 바이러스 또는 진핵생물 종으로부터 유래되거나 얻어질 수 있다. 비-제한적인 예시적인 단일-가닥 DNA 결합 단백질은 대장균 SSB 및 미오비리다에 파지, 예를 들어, T4, T2, T6, Rb69, Aeh1, KVP40, 아시네토박터 파지 133, 아에로모나스 파지 65, 시아노파지 P-SSM2, 시아노파지 PSSM4, 시아노파지 S-PM2, Rb14, Rb32, 아에로모나스 파지 25, 비브리오 파지 nt-1, phi-1, Rb16, Rb43, 파지 31, 파지 44RR2.8t, Rb49, 파지 Rb3, 및 파지 LZ2로부터 유래된 단백질을 포함한다. 단일-가닥 DNA 결합 단백질의 추가적인 예는 A. 데니트리피칸스(denitrificans) Alide_2047, 버크홀데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) BthaB_33951, 프레보텔라 알렌스(Prevotella pallens) HMPREF9144_0124, 및 진핵생물 단일-가닥 DNA 결합 단백질 복제 단백질 A를 포함한다.
이러한 개시내용의 임의의 RPA 과정은 군집제의 존재 하에서 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 군집제는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 옥사이드 폴리비닐 알코올, 폴리스티렌, Ficoll, 덱스트란, 폴리(비닐피롤리돈)(PVP), Triton-X, 및 알부민 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 군집제는 200,000 달톤 미만의 분자량을 갖는다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 조성물은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)(예를 들어, 15,000 내지 20,000 달톤의 분자량을 갖는 PEG1450, PEG3000, PEG8000, PEG10000, PEG14000, PEG15000, PEG20000, PEG250000, PEG30000, PEG35000, PEG40000, PEG 화합물, 또는 이들의 조합), 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, Triton-X, 및 Ficoll로 이루어진 군으로부터 선택된 군집제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 군집제는 반응 혼합물에, 반응 혼합물의 1 내지 15 중량% 또는 부피%의 농도로, 예를 들어, 1.0%, 1.5%, 2.0%, 2.5%, 3.0%, 3.5%, 4.0%, 4.5%, 5.0%, 5.5%, 6.0%, 6.5%, 7.0%, 7.5%, 8.0%, 8.5%, 9.0%, 9.5%, 10.0%, 10.5%, 11.0%, 11.5%, 12.0%, 12.5%, 13.0%, 13.5%, 14.0% 14.5% 및 15.0%로부터 선택된 임의의 2개의 농도 수치들 사이의 농도에 존재한다.
재조합효소 로딩 단백질이 사용되는 경우에, 재조합효소 로딩 단백질은 원핵생물, 바이러스 또는 진핵생물 기원일 수 있다. 예시적인 재조합효소 로딩 단백질은 대장균 RecO, 대장균 RecR, UvsY, 및 이들의 돌연변이체 또는 단편, 또는 이들의 조합을 포함한다. 예시적인 UvsY 단백질은 미오비리다에 파지, 예를 들어, T4, T2, T6, Rb69, Aeh1, KVP40, 아시네토박터 파지 133, 아에로모나스 파지 65, 시아노파지 P-SSM2, 시아노파지 PSSM4, 시아노파지 S-PM2, Rb14, Rb32, 아에로모나스 파지 25, 비브리오 파지 nt-1, phi-1, Rb16, Rb43, 파지 31, 파지 44RR2.8t, Rb49, 파지 Rb3, 및 파지 LZ2로부터 유래된 단백질을 포함한다. 본 개시내용의 임의의 과정에서, 재조합 로딩제는 미오비리다에 파지로부터 유래될 수 있다. 미오비리다에 파지는 예를 들어, T4, T2, T6, Rb69, Aeh1, KVP40, 아시네토박터 파지 133, 아에로모나스 파지 65, 시아노파지 P-SSM2, 시아노파지 PSSM4, 시아노파지 S-PM2, Rb14, Rb32, 아에로모나스 파지 25, 비브리오 파지 nt-1, phi-1, Rb16, Rb43, 파지 31, 파지 44RR2.8t, Rb49, 파지 Rb3, 또는 파지 LZ2일 수 있다.
본 방법에서 사용하는 데 적합한 증폭 방법은 증폭 동안 폴리뉴클레오타이드를 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드를 변경시키기에 충분한 온도로 처리하지 않으면서 수행된 증폭 방법을 포함한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드의 증폭은 증폭 동안 폴리뉴클레오타이드를 약 90℃, 약 80℃, 약 70℃ 또는 약 60℃ 초과하는 온도로 처리하지 않으면서 수행될 수 있다. 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드의 증폭은 증폭 동안 폴리뉴클레오타이드를 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드를 변성시키기에 충분한 조건으로 처리하지 않으면서 수행된다. 예를 들어, 증폭은 증폭 동안 폴리뉴클레오타이드를 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드를 변성시키기에 충분한 물리적, 화학적, 또는 열적 조건으로 처리하지 않으면서 수행될 수 있다.
본 발명에서 사용하는 데 적합한 증폭 방법은 먼저 폴리뉴클레오타이드를 샘플에 존재하는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드를 변성시키기에 충분한 온도로 처리하지 않으면서 수행된 증폭 방법을 포함한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드의 증폭은 먼저 폴리뉴클레오타이드를 약 90℃, 약 80℃, 약 70℃, 약 60℃, 또는 약 55℃를 초과하는 온도로 처리하지 않으면서 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 이의 앰플리콘은 먼저 뉴클레오타이드를 이러한 과도한 온도로 처리하지 않으면서 검출된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드의 증폭은 먼저 폴리뉴클레오타이드를 샘플에 존재하는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드를 변성시키기에 충분한 조건으로 처리하지 않으면서 수행된다. 예를 들어, 증폭은 먼저 폴리뉴클레오타이드를 샘플에 존재하는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드를 변성시키기에 충분한 물리적, 화학적, 또는 열적 조건으로 처리하지 않으면서 수행될 수 있다.
본 발명에서 사용하는 데 적합한 증폭 방법은 증폭을 수행하기에 충분한 시약을 폴리뉴클레오타이드와 조합하는 단계로 시작하여 증폭이 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 앰플리콘의 정성적 또는 정량적 결정을 허용하기에 충분한 양까지 진행될 때 종결되는 총 시간(T)에 수행되는 증폭 방법을 포함한다. 임의의 이러한 실시형태에서, 총 시간(T)은 약 45분 이하, 약 30분 이하, 약 20분 이하, 또는 약 15분 이하일 수 있다.
폴리뉴클레오타이드의 증폭은 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드를 적어도 약 106배, 적어도 약 107배, 적어도 약 108배, 적어도 약 109배, 적어도 약 1010배, 적어도 약 1011배, 또는 적어도 약 1012배까지 증폭시키는 것을 포함한다. 이러한 증폭은 시간 T 내에 수행될 수 있다.
본 방법에서 사용하기에 적합한 증폭 방법은 당업자에게 공지된 "실시간" 또는 "정량적" 폴리뉴클레오타이드 증폭 방법을 포함한다. 이러한 방법은, 반응이 진행함에 따라 실시간으로 각 증폭 사이클 후에 폴리뉴클레오타이드 증폭 산물의 축적을 검출하여, 증폭 동력학의 결정을 가능하게 한다. 실시간 방법은, 증폭된 산물의 특정 문턱값 농도에 도달하는 시간(예를 들어, 사이클 횟수)이 직접적으로 표적 뉴클레오타이드의 초기 카피 수에 관한 것이기 때문에 정량적이다. 일부 실시형태에 따르면, 증폭 반응은 본 명세서에 기술된 올리고뉴클레오타이드 프로브를 이용하여 전기화학적 검출에 의해 모니터링된다.
실시예
실시예 1: 네스티드 RPA 증폭
도 19a 내지 도 19d는 본 명세서에 기술된 바와 같이 미세유체 카드 상에서 네스티드 RPA를 수행하는 방법을 이용하여 수행된 분석 결과를 나탄내다. 결과는, 상이한 공지된 표적을 갖는 샘플들을 구별하는 네스티드 RPA 검정의 능력을 나타낸다. 샘플을 인플루엔자 양성 및 인플루엔자 음성 샘플 물질의 상업적 공급업체로부터 획득되었다. 일련의 측정을 총 90개의 샘플을 사용하여 수행하였다. 30개의 샘플은 인플루엔자 A(Inf A)에 대해 양성인 것으로 공지되어 있으며, 10개의 샘플은 인플루엔자 B(Inf B)에 대해 양성인 것으로 공지되어 있으며, 50개의 샘플은 인플루엔자 A 또는 B가 존재하지 않는 것으로 알려졌다(음성). 각 샘플을 단일 검정 디바이스에 적용하고, 측정을 검정 카드 상에서 4개의 검출 챔버 각각으로부터 획득하였다.
도 19a 내지 도 19d에 도시된 실험 각각에서, 반응 산물의 검출을 형광 표지된 프로브를 이용하여 수행하였다. 표지된 프로브로 RPA 시약의 검출은 이전에 기술되어 있고, 통상적으로, 존재하는 경우에, 증폭된 표적의 검출을 위한 검출 가능한 수준을 갖는 적어도 하나의 프로브를 포함한다. 프로브는 형광단(flour) 및 소광제를 포함할 수 있는데, 이는 프로브가 존재하는 경우에 증폭 반응 산물에서, 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열에 혼성화할 때 뉴클레아제에 의한 절단 후에 분리된다. 유사한 결과(제시 생략)는 샘플이 전기화학적으로 표지된 프로브를 이용하여 시험되었을 때, 샘플이 인플루엔자 A 양성, 인플루엔자 B 양성 또는 음성 대조군 인지의 확인에 대해 90개의 샘플로 얻었다.
형광 및 전기화학적 프로브 측정 둘 모두의 조합된 결과는 표 2a 내지 표 2d에 도시되어 있다. 각 표는 인플루엔자 샘플 물질의 공급업체에 의해 수행된 표준 상업적 qPCR 검정을 이용하여 이루어진 비교 측정을 포함한다. qPCR을 샘플 물질의 상업적 공급업체에 의해 샘플 획득 포인트를 수행하였으며, 이의 결과를 사용하여 샘플을, 양성 또는 음성으로서, 뿐만 아니라, fluA 또는 fluB로서 분류하였으며; 분류된 샘플을 저장하고, 바이러스 이송 배지(viral transport medium: VTM)에서 공급하였다. RPA의 성능에 대한 VTM의 명백한 검출이 존재하였다.
표 2A. 인플루엔자 A 샘플의 형광 검출
Figure pct00002
표 2B. 인플루엔자 B 샘플의 형광 검출
Figure pct00003
표 2C. 인플루엔자 A 샘플의 전기화학적 검출
Figure pct00004
표 2D. 인플루엔자 B 샘플의 전기화학적 검출
Figure pct00005
인플루엔자 A의 핵산 서열이 매해 종종 변하는 것으로 알려져 있기 때문에, 인플루엔자 A에 대해 양성인 샘플을 동정하는 가능성을 최대화하기 위해 상이한 뉴클레오타이드 영역으로 향하는 2개의 상이한 프라이머 및 프로브 세트를 도입하기 위해 RPA 검정을 개발하였다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 RPA 검정에서 사용되는 프라이머 및 프로브는 하기에서 서열번호 1 내지 서열번호 21로서 나열된다. 제1 라운드의 네스티드 증폭 동안, 1차 프라이머 서열을 사용하여 1차 증폭을 수행하기 위해 1차 반응 챔버에서 전체샘플과 접촉하였다. 이후에 fluA 또는 fluB가 환자 샘플에 존재할 때마다 신호를 발생시키도록 InfA PA, InfA PB2, InfB PA 및 IC를 사용하여 개개 표적 종을 특이적으로 증폭시키기 위해 1차 증폭 산물을 사용하여 개별 2차 반응 챔버 내에 제2 프라이머 및 프로브와 접촉시켰다. 프로브가 형광 측정을 위해 사용되었을 때, 이러한 것은 뉴클레아제 엑소뉴클레아제 III(Exo)에 의해 절단되도록 디자인되었으며, 전기화학을 위해 사용되는 프로브는 뉴클레아제 8-옥소구아닌 DNA 글리코실라제(fpg)와 함께 사용하기 위해 디자인되었다. 적합한 전기화학적 프로브의 예는 2017년 2월 24일에 출원된 공동 계류 중인 출원 PCT/US2017/019446호에 기술되어 있으며, 이러한 문헌은 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
InfA[PA] 1차 증폭 프라이머
>FluAPAR111
TGCATGTGTGAGGAAGGAGTTGAACCAAG*A (서열번호 1)
>FluAPAF523
AAATTGCTTCTCATTGTTCAGGCACTTAGGG*A (서열번호 2)
InfA[PB2] 1차 증폭 프라이머
>FluAPB2F201
GAACTGAGTAACCTTGCAAARGGGGAAAAGG*C (서열번호 3)
>FluAPB2F218
GAACTGAGTAACCTTGCAAAAGGGGAAAAAG*C (서열번호 4)
>FluAPB2R103
AYTAATTGATGGCCATCCGAATTCTTTTGGTCGCT*G (서열번호 5)
InfB[PA] 1차 증폭 프라이머
>FluBPAF44
AAGGATTGGCTGATGATTACTTTTGGAAAAAGAAA*G (서열번호 6)
>FluBPAR42
TAATTCAGCCTGAAGTTCTGTGAGTCTGCTTAG*C (서열번호 7)
Xcon 1차 증폭 프라이머
>XConF7
AATCATGAACCTCATGGCATCTTCCCTCGCCGC*C (서열번호 8)
>XConR6
ACAATGCAATCATATGCTTCTGCTATGTTAAGC*G (서열번호 9)
InfA[PA] 2차 증폭 프라이머
>FLUPAF507ii
AACCTGGGACCTTTGATCTTGGGGGGCTATAT*G (서열번호 10)
>FLUAPAR106ii
ATGTGTTAGGAAGGAGTTGAACCAAGAAGCAT*T (서열번호 11)
InfA[PA] 엑소 프로브
>FluAPAExoP12dFAM F= dT-FAM, H= THF (비염기성 부위 모방체), Q= dT-BHQ-1, 3'=블록 C3스페이서
GAACCAAGATGCATTRAGCAAAACCCAGGGAFHAQTAATCAGGCACTC (서열번호 12)
InfA[PB2] 2차 증폭 프라이머
>FluAPB2F403
AATGTGCTAATYGGGCAAGGAGACGTGGTGTTG*G (서열번호 13)
>FluAPB2R703
GGCCATCCGAATTCTTTTGGTCGCTGTCTGG*C (서열번호 14)
InfA[PB2] 엑소 프로브
>FluAPB2ExoP2 F= dT-FAM, H= THF (비염기성 부위 모방체), Q= dT-BHQ-1, 3'=블록 C3스페이서
CGAATTCTTTTGGTCGCTGTCTGGCTGTCAGTAAGFHQGCTAGAGTCCCG (서열번호 15)
InfB[PA] 2차 증폭 프라이머
>MSFBPA_F6+1-2
GGAAAAAGAAAGAAAAGCTGGGAAATAGCATG*G (서열번호 16)
>MSFBPA_R6+1
GCTTAGCACTCTCCCTTTCCCTTCCTCATCCAAT*G (서열번호 17)
InfB[PA] 엑소 프로브
>MSFBPAx1 F= dT-FAM, H= THF (비염기성 부위 모방체), Q= dT-BHQ-1, 3'=블록 C3스페이서
ACTGATGATATTCAGCTACAATCAAGACFAHQCGTTAAGTAATGAA (서열번호 18)
Xcon 2차 증폭 프라이머
>XConR13
TTCCAGTCAGTCCTAGTCAGAAACGGTCCTTAGAC*G (서열번호 19)
>APOBEXTF
GCCAGGTTTATAGCACACTTGTCACCTA*C (서열번호 20)
Xcon 엑소 프로브
>APOB1FAM F= dT-FAM, H= THF (비염기성 부위 모방체), Q= dT-BHQ-1, 3'=블록 C3스페이서
GCCAGGTTTATAGCACACTTGTCACCTACAQTHCFGATTGGTGGACTCT (서열번호 21)
도 19a는 90개의 샘플이 InfA PA RPA 프라이머 및 프로브에 노출되었을 때 얻어진 결과를 나타낸 것이다. 결과는 InfA PA 프라이머가 30개의 InfA 양성 샘플로부터 24개를 검출함을 나타내며, InfB 또는 음성 샘플이 InfA PA 프라이머와의 반응을 나타내지 못하였다. 도 19b는 InfA PB2 프라이머 및 프로브에 노출될 때 모든 InfA 샘플이 양성 반응을 제공함을 나타내며, InfB 및 음성 샘플이 InfA PB2 프라이머 및 프로브와의 어떠한 반응도 나타내지 않았다. 도 19c는 InfB 샘플 모두가 InfB PA 프라이머 및 프로브에 노출되지 않을 때 양성 반응을 제공하고, InFa 또는 음성 대조군 샘플이 어떠한 반응도 제공하지 않음을 나타낸다. 도 19d는 음성 대조군 프라이머(Xcon) 및 프로브가 사용되었을 때, 샘플이 양의신호를 나타내지 않음을 나타낸다.
도 19a 내지 도 19d 각각에서, 점선은 기준선 문턱값을 나타내며, 이는 최대 음의 값 보다 높은 3회 표준 편차로서 결정되었다. 데이터는 InfA PA 및 InfA PB2 영역에 대한 프로브 및 RPA 프라이머의 조합된 사용이 인플루엔자 A 양성 샘플의 100% 동정을 야기시킴을 나타내며, 이는 상이한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 인플루엔자 바이러스의 존재를 성공적으로 결정하는 본 명세서에 기술된 검정 포맷의 능력을 나타낸다.
다른 실시형태
본 발명의 다수의 실시형태가 기술되었다. 그럼에도 불구하고, 다양한 변형이 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있는 것으로 이해될 것이다. 이에 따라, 다른 실시형태는 하기 청구범위 내에 속한다.

Claims (85)

  1. 방법으로서,
    샘플을 미세유체 디바이스(microfluidic device)에 제공하는 단계; 및
    상기 샘플에서 표적 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 단계를 포함하되, 상기 증폭은,
    상기 샘플에 대해 제1 증폭 라운드를 수행하여 제1 증폭 산물을 수득하고;
    상기 제1 증폭 산물에 대해 제2 증폭 라운드를 수행하여 제2 증폭 산물을 수득하는 것을 포함하며, 상기 제2 증폭 산물은 상기 제1 증폭 라운드 동안 생성된 상기 제1 증폭 산물 내에 완전하게 함유된 더 작은 서열을 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제2 증폭 산물을 검출하는 것을 더 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 제2 증폭 산물의 검출은,
    상기 제2 증폭 산물을 형광단 및 소광제(quencher)에 연결된 제1 올리고뉴클레오타이드로 표지하여 표지된 제2 산물을 수득하고;
    상기 표지된 제2 증폭 산물로부터 상기 소광제를 절단하며; 그리고
    상기 형광단으로부터의 신호를 광학적으로 검출하는 것을 포함하되, 검출 가능한 신호는 상기 제2 증폭 산물의 존재를 나타내는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 소광제를 절단하는 것은 뉴클레아제를 사용하여 수행되는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 뉴클레아제는 이중-가닥 DNA를 표적화하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 뉴클레아제는 폼아미도피리민-DNA 글리코실라제인, 방법.
  7. 제2항에 있어서, 상기 제2 증폭 산물의 검출은,
    상기 제2 증폭 산물을 레독스 모이어티(redox moiety)에 연결된 제1 올리고뉴클레오타이드로 표지하여 표지된 제2 증폭 산물을 수득하고;
    상기 표지된 제2 증폭 산물로부터 상기 레독스 모이어티를 절단하며;
    상기 절단된 레독스 모이어티로부터의 신호를 전기화학적으로 검출하는 것을 포함하되, 검출 가능한 신호는 상기 제2 증폭 산물의 존재를 나타내는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 레독스 모이어티는 페노티아진, 페녹사진, 페로센, 페리시아나이드, 루테늄(III), 오스뮴(II), 안트라퀴논, 페나진, 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 레독스 모이어티를 절단하는 것은 뉴클레아제를 사용하여 수행되는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 뉴클레아제는 이중-가닥 DNA를 표적화하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 뉴클레아제는 폼아미도피리민-DNA 글리코실라제인, 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 제2 증폭 산물에 대해 제3 증폭 라운드를 수행하여 제3 증폭 산물을 수득하는 단계; 및
    상기 제3 증폭 산물을 검출하는 단계를 더 포함하되, 상기 제3 증폭 산물은 상기 제2 증폭 라운드 동안 생성된 상기 제2 증폭 산물 내에 완전히 함유된 더 작은 서열을 포함하는, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 샘플은 동물로부터 얻어진 것인, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 동물로부터 얻어진 상기 샘플은 상기 동물의 혈액, 가래, 점액, 타액, 눈물 또는 소변으로부터 얻어진 것인, 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 샘플은 인간으로부터 얻어진 것인, 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 표적 폴리뉴클레오타이드 서열은 표적 핵산에 포함되어 있는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 표적 핵산은 동물 병원체로부터 얻어진 것인, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 동물 병원체는 단일-가닥 DNA 바이러스, 이중-가닥 DNA 바이러스, 또는 단일-가닥 RNA 바이러스인, 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 동물 병원체는 박테리아인, 방법.
  20. 제16항에 있어서, 상기 표적 핵산은 이중-가닥 DNA, 단일-가닥 DNA, 또는 RNA인, 방법.
  21. 제16항에 있어서, 상기 표적 핵산은 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 바이러스 DNA, 미토콘드리아 DNA, cDNA, 합성 이중-가닥 DNA 및 합성 단일-가닥 DNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  22. 제16항에 있어서, 상기 표적 핵산은 바이러스 DNA 또는 바이러스 RNA인, 방법.
  23. 제17항에 있어서, 상기 동물 병원체는 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스인, 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 샘플에서 둘 이상의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열이 증폭되는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 인플루엔자 A 유전자 서열을 포함하는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 인플루엔자 B 유전자 서열을 포함하는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열이 증폭되는, 방법.
  26. 제2항에 있어서, 둘 이상의 제2 증폭 산물이 검출되는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 인플루엔자 A 유전자 서열을 포함하는 제2 증폭 산물, 및 인플루엔자 B 유전자 서열을 포함하는 제2 증폭 산물이 검출되는, 방법.
  28. 진단 카드(diagnostic card)로서,
    (i) 제1 증폭 산물을 형성하기 위해 반응 챔버에서 샘플 유체에 대해 제1 핵산 증폭을 수행하도록 구성된 1차 반응 챔버; 및 (ii) 하나 이상의 2차 반응 챔버로서, 각각의 2차 반응 챔버가 제2 증폭 산물을 형성하기 위해 제1 증폭 산물에 대해 제2 핵 증폭을 수행하도록 구성된, 상기 2차 반응 챔버를 포함하는 카드 바디(card body);
    상기 1차 반응 챔버에 상기 샘플 유체를 공급하기 위한 통로;
    상기 하나 이상의 2차 반응 챔버와 유체 연결된 하나 이상의 검출 챔버; 및
    각 검출 챔버와 결합된 검출 모듈을 포함하는, 진단 카드.
  29. 제28항에 있어서, 상기 검출 모듈은 광학 모듈인, 진단 카드.
  30. 제28항에 있어서, 상기 검출 모듈은 형광 검출기인, 진단 카드.
  31. 제30항에 있어서, 상기 형광 검출기는 상기 하나 이상의 검출 챔버로 조명광을 유도하기 위한 단일 광 파이프(light pipe), 및 각 검출 챔버로부터 반사된 광을 수용하기 위한 별개의 광 파이프를 포함하는, 진단 카드.
  32. 제28항에 있어서, 상기 검출 모듈은 전극 모듈인, 진단 카드.
  33. 제32항에 있어서, 상기 검출 모듈은 각 검출 챔버에 대한 전극에서 종결되는 직렬의 전도성 트랙을 포함하는, 진단 카드.
  34. 제32항에 있어서, 상기 디바이스는 상기 미세유체 카드 전반에 걸쳐 액체의 위치를 검출하기 위한 추가적인 전도성 트랙 및 전극을 포함하는, 진단 카드.
  35. 제28항에 있어서, 상기 증폭은 재조합효소 중합효소 증폭(recombinase polymerase amplification: RPA) 반응을 포함하는, 진단 카드.
  36. 제28항에 있어서, 혼합 수단, 펌프, 및 샘플 모듈에 연결시키기 위한 연결 포트를 더 포함하는, 진단 카드.
  37. 제28항에 있어서, 상기 1차 반응 챔버는 가열기에 연결된 진단 카드.
  38. 제28항에 있어서, 상기 1차 반응 챔버는 혼합 수단을 포함하거나, 혼합 수단에 연결된 진단 카드.
  39. 제28항에 있어서, 각 2차 반응 챔버는 시약을 포함하는, 진단 카드.
  40. 제39항에 있어서, 상기 시약은 RPA 시약을 포함하는, 진단 카드.
  41. 제40항에 있어서, 상기 RPA 시약은 냉동 건조된 진단 카드.
  42. 제28항에 있어서, 상기 1차 반응 챔버는 시약을 포함하는, 진단 카드.
  43. 제42항에 있어서, 상기 시약은 RPA 시약을 포함하는, 진단 카드.
  44. 제43항에 있어서, 상기 RPA 시약은 냉동 건조된 진단 카드.
  45. 제28항에 있어서, 상기 샘플 유체는 동물로부터 얻어진 샘플인, 진단 카드.
  46. 제45항에 있어서, 동물로부터 얻어진 상기 샘플은 동물의 혈액, 가래, 점액, 타액, 눈물, 또는 소변으로부터 얻어진 것인, 진단 카드.
  47. 제45항에 있어서, 상기 샘플 유체는 인간으로부터 얻어진 샘플인, 진단 카드.
  48. 제28항에 있어서, 상기 샘플 유체는 표적 핵산을 포함하는, 진단 카드.
  49. 제48항에 있어서, 상기 표적 핵산은 동물 병원체로부터 얻어진 것인, 진단 카드.
  50. 제49항에 있어서, 상기 동물 병원체는 단일-가닥 DNA 바이러스, 이중-가닥 DNA 바이러스, 또는 단일-가닥 RNA 바이러스인, 진단 카드.
  51. 제49항에 있어서, 상기 동물 병원체는 박테리아인, 진단 카드.
  52. 제48항에 있어서, 상기 표적 핵산은 이중-가닥 DNA, 단일-가닥 DNA, 또는 RNA인, 진단 카드.
  53. 제48항에 있어서, 상기 표적 핵산은 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 바이러스 DNA, 미토콘드리아 DNA, cDNA, 합성 이중-가닥 DNA 및 합성 단일-가닥 DNA로 이루어진 군으로부터 선택되는, 진단 카드.
  54. 제48항에 있어서, 상기 표적 핵산은 바이러스 DNA 또는 바이러스 RNA인, 진단 카드.
  55. 제49항에 있어서, 상기 동물 병원체는 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스인, 진단 카드.
  56. 제28항에 있어서, 상기 제2 증폭 산물은 상기 진단 카드에 상기 샘플 유체의 전달 후 30분 이하, 15분 이하, 10분 이하, 또는 5분 이하에 생성되는, 진단 카드.
  57. 제28항에 있어서, 상기 진단 카드는 1회용인, 진단 카드.
  58. 제28항에 있어서, 각 연속적인 n+1 증폭 라운드로부터의 증폭 산물이 이전 n번째 라운드의 증폭 산물 내에 완전히 함유된 더 작은 서열이도록, 각각 추가적인 증폭된 산물을 형성하기 위해 추가적인 핵산 증폭 반응 라운드를 수행하도록 구성된, 추가적인 반응 챔버를 더 포함하는, 진단 카드.
  59. 제28항의 진단 카드를 수용하도록 구성된 판독기로서, 상기 2차 반응 챔버에서 상기 제2 증폭된 산물의 존재를 검출하도록 구성된 검출기를 포함하는, 판독기.
  60. 핵산 증폭 디바이스로서,
    제1 유입구 포트 및 제1 유출구 포트에 유체 흐름 가능하게 연결된 1차 반응 챔버;
    제2 유입구 포트 및 제2 유출구 포트에 유체 흐름 가능하게 연결된 2차 반응 챔버;
    검출 챔버;
    제1 펌프로서, 상기 제1 유입구 포트가 제1 펌프를 통해 상기 1차 반응 챔버에 유체 흐름 가능하게 연결되고 상기 제1 유출구 포트가 상기 1차 반응 챔버에 유체 흐름 가능하게 연결된, 상기 제1 펌프;
    제2 펌프로서, 상기 1차 반응 챔버는 제2 펌프를 통해 상기 2차 반응 챔버에 유체 흐름 가능하게 연결되고 상기 제2 유출구 포트가 상기 2차 반응 챔버에 유체 흐름 가능하게 연결된, 상기 제2 펌프;
    제3 펌프로서, 상기 제2 유입구 포트가 상기 제3 펌프를 통해 상기 2차 반응 챔버에 유체 흐름 가능하게 연결된, 상기 제3 펌프를 포함하는, 핵산 증폭 디바이스.
  61. 제60항에 있어서, 상기 핵산 증폭 디바이스는 미세유체 디바이스인, 핵산 증폭 디바이스.
  62. 제60항에 있어서, 상기 1차 반응 챔버는 시약을 포함하는, 핵산 증폭 디바이스.
  63. 제62항에 있어서, 상기 1차 반응 챔버는 촉매를 포함하는, 핵산 증폭 디바이스.
  64. 제63항에 있어서, 상기 촉매는 마그네슘을 포함하는, 핵산 증폭 디바이스.
  65. 제60항에 있어서, 시약 저장소를 더 포함하되, 상기 제2 펌프 및 상기 제3 펌프는 제1 시약 저장소를 통해 각 2차 반응 챔버에 유체 흐름 가능하게 연결된, 핵산 증폭 디바이스.
  66. 제60항에 있어서, 상기 제2 펌프 및 상기 제3 펌프는 제1 시약 저장소 및 제2 시약 저장소를 통해 각 2차 반응 챔버에 유체 흐름 가능하게 연결된, 핵산 증폭 디바이스.
  67. 제66항에 있어서, 상기 제1 시약 저장소 및 상기 제2 시약 저장소는 직렬로 존재하는, 핵산 증폭 디바이스.
  68. 제67항에 있어서, 상기 제1 시약 저장소는 올리고머를 포함하는, 핵산 증폭 디바이스.
  69. 제67항에 있어서, 상기 제2 시약 저장소는 마그네슘을 포함하는, 핵산 증폭 디바이스.
  70. 제66항에 있어서, 각 2차 반응 챔버는 검출 챔버인, 핵산 증폭 디바이스.
  71. 제70항에 있어서, 각 검출 챔버의 일부가 광학적으로 투명한, 핵산 증폭 디바이스.
  72. 제70항에 있어서, 각 검출 챔버에 연결된 전극을 더 포함하는, 핵산 증폭 디바이스.
  73. 제72항에 있어서, 3개의 전극이 각 검출 챔버에 연결된, 핵산 증폭 디바이스.
  74. 제60항에 있어서, 유체 검출 영역을 더 포함하는, 핵산 증폭 디바이스.
  75. 제74항에 있어서, 상기 제1 펌프 및 상기 1차 반응 챔버는 제1 검출 영역을 통해 연결된, 핵산 증폭 디바이스.
  76. 제74항에 있어서, 상기 제2 펌프 및 상기 2차 반응 챔버는 제2 검출 영역을 통해 연결된, 핵산 증폭 디바이스.
  77. 제74항에 있어서, 상기 제3 펌프 및 상기 2차 반응 챔버는 제3 검출 영역을 통해 연결된, 핵산 증폭 디바이스.
  78. 제74항에 있어서, 상기 제3 펌프 및 상기 1차 반응 챔버는 제4 검출 영역을 통해 연결된, 핵산 증폭 디바이스.
  79. 제74항에 있어서, 각 검출 영역의 일부가 광학적으로 투명한, 핵산 증폭 디바이스.
  80. 제74항에 있어서, 각 검출 영역에 연결된 흐름 검출 챔버를 더 포함하는, 핵산 증폭 디바이스.
  81. 제60항에 있어서, 상기 1차 반응 챔버에 연결된 가열기를 더 포함하는, 핵산 증폭 디바이스.
  82. 제60항에 있어서, 상기 1차 반응 챔버는 교반기를 포함하는, 핵산 증폭 디바이스.
  83. 제60항에 있어서, 상기 제1 펌프는 상기 핵산 증폭 디바이스로 전달된 샘플을 상기 제1 유입구 포트를 통해 상기 1차 반응 챔버에 제공하도록 구성된, 핵산 증폭 디바이스.
  84. 제60항에 있어서, 상기 제2 펌프 및 제3 펌프가 반응물 혼합물을 수득하기 위해 상기 제2 유입구 포트를 통해 상기 핵산 증폭 디바이스 바디로 전달된 시약을 상기 1차 반응 챔버로부터의 산물과 조합하도록 구성된, 핵산 증폭 디바이스.
  85. 제84항에 있어서, 상기 제2 펌프 및 제3 펌프가 상기 2차 반응 챔버 각각에 상기 반응물 혼합물의 일부를 제공하도록 구성된, 핵산 증폭 디바이스.
KR1020187028595A 2016-03-04 2017-03-03 자동화된 네스티드 재조합효소 중합효소 증폭 KR102473905B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020227042058A KR20220167397A (ko) 2016-03-04 2017-03-03 자동화된 네스티드 재조합효소 중합효소 증폭

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662303934P 2016-03-04 2016-03-04
US62/303,934 2016-03-04
PCT/US2017/020782 WO2017152122A2 (en) 2016-03-04 2017-03-03 Automated nested recombinase polymerase amplification

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227042058A Division KR20220167397A (ko) 2016-03-04 2017-03-03 자동화된 네스티드 재조합효소 중합효소 증폭

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180133406A true KR20180133406A (ko) 2018-12-14
KR102473905B1 KR102473905B1 (ko) 2022-12-06

Family

ID=59744470

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187028595A KR102473905B1 (ko) 2016-03-04 2017-03-03 자동화된 네스티드 재조합효소 중합효소 증폭
KR1020227042058A KR20220167397A (ko) 2016-03-04 2017-03-03 자동화된 네스티드 재조합효소 중합효소 증폭

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227042058A KR20220167397A (ko) 2016-03-04 2017-03-03 자동화된 네스티드 재조합효소 중합효소 증폭

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20200232050A1 (ko)
EP (2) EP4275794A3 (ko)
JP (3) JP2019508043A (ko)
KR (2) KR102473905B1 (ko)
CN (1) CN109072289A (ko)
AU (1) AU2017228401B2 (ko)
BR (1) BR112018067739A2 (ko)
CA (1) CA3016582A1 (ko)
ES (1) ES2950618T3 (ko)
MX (1) MX2018010575A (ko)
WO (1) WO2017152122A2 (ko)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11299777B2 (en) 2016-04-04 2022-04-12 Nat Diagnostics, Inc. Isothermal amplification components and processes
US9617587B1 (en) 2016-04-04 2017-04-11 Nat Diagnostics, Inc. Isothermal amplification components and processes
USD834724S1 (en) * 2016-10-14 2018-11-27 Life Technologies Corporation Illumination and imaging instrument
AU2018227436A1 (en) * 2017-02-28 2019-09-12 Abbott Diagnostics Scarborough, Inc. Microfluidic devices and related methods
CN108103247A (zh) * 2018-02-01 2018-06-01 上海海洋大学 基于rpa技术检测ⅲ型草鱼呼肠孤病毒的试剂盒及其专用引物和探针
USD909605S1 (en) * 2019-01-21 2021-02-02 Life Technologies Corporation Polymerase chain reaction instrument
CN111235316B (zh) * 2020-03-23 2022-11-25 中国检验检疫科学研究院 鉴定新型冠状病毒的引物探针及在三重荧光rpa的应用
CN112739833A (zh) * 2020-04-25 2021-04-30 黄婉秋 利用巢式RPA技术检测SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用
CN111621597A (zh) * 2020-05-09 2020-09-04 清华大学 一种病毒重组酶-聚合酶扩增检测方法
WO2021226754A1 (zh) * 2020-05-09 2021-11-18 杭州梓晶生物有限公司 一种病毒重组酶-聚合酶扩增检测方法
US20210381067A1 (en) * 2020-06-08 2021-12-09 Ampliwise Inc. Nucleic acid amplification and detection with attenuaiting probe
CN112481358A (zh) * 2020-11-11 2021-03-12 清华大学 一种巢式重组酶-聚合酶扩增方法及其应用
CN112501262A (zh) * 2020-12-15 2021-03-16 苏州点晶生物科技有限公司 一种基于双重多酶介导的核酸扩增检测方法及试剂
CN112760417B (zh) * 2021-01-20 2022-05-17 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 一种rap基因检测试剂盒、检测方法和应用及rap病毒检测试剂盒
WO2022174377A1 (zh) * 2021-02-19 2022-08-25 清华大学 一种巢式重组酶-聚合酶扩增的方法及其应用
CN112899404B (zh) * 2021-03-16 2022-12-27 广东省农业科学院动物卫生研究所 鳜蛙虹彩病毒的Nested-RAA检测引物对及其应用和检测方法
WO2023088952A1 (en) * 2021-11-17 2023-05-25 Lex diagnostics Ltd. Devices, systems, and methods for nucleic acid amplification
WO2024064317A2 (en) * 2022-09-23 2024-03-28 Customarray Inc. Reagent delivery system with fluidic device and sensor

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080286835A1 (en) * 2005-02-19 2008-11-20 Geneform Technologies Limited Isothermal Amplification of Nucleic Acids
JP2014516512A (ja) * 2011-04-07 2014-07-17 アリーア サン ディエゴ， インコーポレイテッド リコンビナーゼポリメラーゼ増幅混合物のモニタリング
WO2014182847A1 (en) * 2013-05-07 2014-11-13 Micronics, Inc. Device for preparation and analysis of nucleic acids

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7399590B2 (en) 2002-02-21 2008-07-15 Asm Scientific, Inc. Recombinase polymerase amplification
EP2290096B1 (en) 2002-02-21 2014-11-19 Alere San Diego, Inc. Recombinase polymerase amplification using a temperature-sensitive recombinase agent
EP2336361B1 (en) * 2004-06-01 2019-01-23 Alere San Diego, Inc. Kit for recombinase polymerase amplification
CA2587085C (en) * 2004-10-27 2017-08-08 Cepheid Closed-system multi-stage nucleic acid amplification reactions
CA2599657A1 (en) * 2005-03-09 2006-09-21 The Regents Of The University Of California Microfluidic valve for liquids
WO2007096702A2 (en) 2005-07-25 2007-08-30 Asm Scientific, Inc. Methods for multiplexing recombinase polymerase amplification
CA2646132C (en) * 2006-02-13 2019-03-19 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Primers and probe for detection and discrimination of influenza virus type a
EP2007905B1 (en) * 2006-03-15 2012-08-22 Micronics, Inc. Integrated nucleic acid assays
WO2008035205A2 (en) 2006-05-04 2008-03-27 Asm Scientific, Inc. Recombinase polymerase amplification
US9689031B2 (en) 2007-07-14 2017-06-27 Ionian Technologies, Inc. Nicking and extension amplification reaction for the exponential amplification of nucleic acids
EP2326732A4 (en) * 2008-08-26 2012-11-14 Fluidigm Corp TEST METHODS FOR INCREASED SURPLUS OF SAMPLES AND / OR TARGETS
US9469867B2 (en) * 2009-05-20 2016-10-18 Alere San Diego, Inc. DNA glycosylase/lyase and AP endonuclease substrates
US9057097B2 (en) 2009-06-05 2015-06-16 Alere San Diego Inc. Recombinase polymerase amplification reagents and kits
US9334529B2 (en) * 2009-11-03 2016-05-10 Leijon Diagnostics Ab Genotyping of N loci in a target nucleic acid molecule
US8597886B2 (en) * 2010-02-15 2013-12-03 Cascade Biosystems, Inc. Methods and materials for detecting viral or microbial infections
GB2516675A (en) * 2013-07-29 2015-02-04 Atlas Genetics Ltd A valve which depressurises, and a valve system
WO2015031691A1 (en) * 2013-08-28 2015-03-05 Cellular Research, Inc. Massively parallel single cell analysis
CN104195236B (zh) * 2014-08-13 2015-08-19 北京恩济和生物科技有限公司 一种巢式pcr数字定量方法
AU2018227436A1 (en) * 2017-02-28 2019-09-12 Abbott Diagnostics Scarborough, Inc. Microfluidic devices and related methods

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080286835A1 (en) * 2005-02-19 2008-11-20 Geneform Technologies Limited Isothermal Amplification of Nucleic Acids
JP2014516512A (ja) * 2011-04-07 2014-07-17 アリーア サン ディエゴ， インコーポレイテッド リコンビナーゼポリメラーゼ増幅混合物のモニタリング
WO2014182847A1 (en) * 2013-05-07 2014-11-13 Micronics, Inc. Device for preparation and analysis of nucleic acids

Also Published As

Publication number Publication date
KR102473905B1 (ko) 2022-12-06
JP2021118695A (ja) 2021-08-12
CN109072289A (zh) 2018-12-21
EP3423599B1 (en) 2023-04-19
EP4275794A3 (en) 2024-01-17
US20200232050A1 (en) 2020-07-23
EP3423599A2 (en) 2019-01-09
KR20220167397A (ko) 2022-12-20
AU2017228401A1 (en) 2018-09-27
ES2950618T3 (es) 2023-10-11
JP2019508043A (ja) 2019-03-28
WO2017152122A3 (en) 2017-10-19
CA3016582A1 (en) 2017-09-08
MX2018010575A (es) 2019-01-10
WO2017152122A2 (en) 2017-09-08
BR112018067739A2 (pt) 2019-01-08
EP3423599A4 (en) 2020-01-08
JP2023123447A (ja) 2023-09-05
AU2017228401B2 (en) 2023-07-27
EP4275794A2 (en) 2023-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102473905B1 (ko) 자동화된 네스티드 재조합효소 중합효소 증폭
JP6285478B2 (ja) 一体化された試料調製、反応、及び検出のための装置及び方法
US20190234978A1 (en) System for nucleic acid preparation
US20090011417A1 (en) Testing Device
US6391624B1 (en) Highly sensitive biological agent probe
US10449541B2 (en) Microfluidic device
US20200123594A1 (en) Methods and devices for sequencing
WO2022266513A2 (en) Devices, systems, and methods for analysis of nucleic acids
CN113557090A (zh) 成分进入流体的精确递送
CN108026591B (zh) 诊断方法和组合物
CA3159363A1 (en) Systems and methods for sample preparation
CA3159563A1 (en) Methods and devices using cartridges for sequencing
US20230203570A1 (en) Multiomic analysis device and methods of use thereof
JPWO2006106868A1 (ja) 反応容器における不揮発性液体分注方法及び反応容器処理装置
JP2023554620A (ja) チップを再生するためのシステムおよび方法
JP4751633B2 (ja) 反応容器の反応液回収方法
WO2024064704A1 (en) Pathogen testing device and method
JP4714497B2 (ja) 反応容器処理装置

Legal Events

Date Code Title Description
AMND Amendment
N231 Notification of change of applicant
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
E90F Notification of reason for final refusal
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant