CN113557090A - 成分进入流体的精确递送 - Google Patents

成分进入流体的精确递送 Download PDF

Info

Publication number
CN113557090A
CN113557090A CN202080020085.3A CN202080020085A CN113557090A CN 113557090 A CN113557090 A CN 113557090A CN 202080020085 A CN202080020085 A CN 202080020085A CN 113557090 A CN113557090 A CN 113557090A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fluid
microwells
microwell
channel
contents
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202080020085.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113557090B (zh
Inventor
丹尼斯·普罗森
菲利普·斯普勒
李思行
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cellular Research Inc
Original Assignee
Cellular Research Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cellular Research Inc filed Critical Cellular Research Inc
Publication of CN113557090A publication Critical patent/CN113557090A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113557090B publication Critical patent/CN113557090B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00279—Features relating to reactor vessels
    • B01J2219/00281—Individual reactor vessels
    • B01J2219/00286—Reactor vessels with top and bottom openings
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00279—Features relating to reactor vessels
    • B01J2219/00306—Reactor vessels in a multiple arrangement
    • B01J2219/00313—Reactor vessels in a multiple arrangement the reactor vessels being formed by arrays of wells in blocks
    • B01J2219/00315—Microtiter plates
    • B01J2219/00317—Microwell devices, i.e. having large numbers of wells
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0642—Filling fluids into wells by specific techniques
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B01L2200/0668—Trapping microscopic beads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0673—Handling of plugs of fluid surrounded by immiscible fluid
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0689—Sealing
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0819—Microarrays; Biochips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0829—Multi-well plates; Microtitration plates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0864—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices comprising only one inlet and multiple receiving wells, e.g. for separation, splitting
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0877—Flow chambers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0893—Geometry, shape and general structure having a very large number of wells, microfabricated wells
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Fluid Mechanics (AREA)
  • Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本文所公开的包括用于将一种或更多种成分引入流体中的系统、装置、设备和方法。第一流体和第二流体可以共同注入流动池的流体通道中。在一些实施方案中，第一流体和第二流体不混溶(例如含水缓冲液和非水液体)。在一些实施方案中，第二流体的密度低于第一流体。

Description

成分进入流体的精确递送
技术领域
本公开一般涉及分子生物学领域，例如利用分子条形码确定基因表达。
背景技术
当前的技术允许通过在将每个细胞与条形码编码试剂珠粒共定位在隔室中时将细胞特异性寡核苷酸条形码附接到来自单个细胞的poly(A)mRNA分子，而以大规模平行的方式(例如，>10000个细胞)测量单细胞的基因表达。需要将一种或更多种成分引入流体(例如，包含单个珠粒和单个细胞的微孔的流体)的系统和方法。
发明内容
本文之公开包括用于将一种或更多种成分引入微孔的内容物的系统、装置、设备和方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)将第一流体引入包括顶部、第一侧壁和底部的流体通道，其中流体通道的底部包括多个微孔，并且其中流体通道的顶部、第一侧壁和底部围绕除所述多个微孔中的每个微孔的容积之外(例如，在所述微孔上方)的所述流体通道的流体通道容积，由此所述流体通道容积和所述多个微孔中的每个微孔包含第一流体；(b)以第一流速将第一置换流体引入所述流体通道，以从所述流体通道容积中置换第一流体；(c)以第二流速将第二流体随后紧接着第二置换流体和/或与第二置换流体同时引入所述流体通道，其中当第二流体与所述微孔中的内容物接触第一持续时间时，第二流体的一种或更多种成分进入所述微孔中的内容物，并且其中第二置换流体从所述流体通道容积中置换第二流体和/或密封所述微孔中的内容物。在一些实施方案中，所述方法包括：(c)以第三流速将第三流体随后紧接着第三置换流体和/或与第三置换流体同时引入所述流体通道，其中当第三流体与所述微孔中的内容物接触第二持续时间时，第三流体的一种或更多种成分进入所述微孔中的内容物，并且其中第三置换流体从所述流体通道容积中置换第三流体和/或密封所述微孔中的内容物。
本文所公开的包括用于引入一种或更多种成分的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)将第一流体引入包括顶部、第一侧壁和底部的流体通道，其中流体通道的底部包括多个微孔，并且其中流体通道的顶部、第一侧壁和底部围绕除所述多个微孔中的每个微孔的容积之外(例如，在所述微孔上方)的所述流体通道的流体通道容积，由此所述流体通道容积和所述多个微孔中的每个微孔包含第一流体；(b)将第一置换流体引入所述流体通道，以从所述流体通道容积中置换第一流体；(d)以第二流速将多种第二流体中每种随后紧接着第二置换流体和/或与第二置换流体同时引入所述流体通道，其中当第二流体与所述微孔中的内容物接触第一持续时间时，多种第二流体中的每一种的一种或更多种成分进入所述微孔中的内容物，并且其中第二置换流体从所述流体通道容积中置换第二流体和/或密封所述微孔的内容物。
本文之公开包括用于引入一种或更多种成分的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)提供包括顶部、第一侧壁和底部的流体通道，其中流体通道的底部包括多个微孔，所述微孔包含第一流体，其中流体通道的顶部、第一侧壁和底部围绕除所述多个微孔中的每个微孔的容积之外(在所述微孔上方)的所述流体通道的流体通道容积，并且其中所述流体通道容积缺少第一流体；(b)以第二流速将多种第二流体中每种随后紧接着第二置换流体和/或与第二置换流体同时引入所述流体通道，其中当第二流体与所述微孔中的内容物接触第一持续时间时，多种第二流体中的每一种的一种或更多种成分进入所述微孔的内容物，并且其中第二置换流体从所述流体通道容积中置换第二流体和/或密封所述微孔中的内容物。
在一些实施方案中，提供流体通道包括：将第一流体引入所述流体通道，由此所述流体通道容积和所述多个微孔中的每个微孔包含第一流体；和(b)将第一置换流体引入所述流体通道以从所述流体通道容积中置换第一流体。在一些实施方案中，所述方法包括恰好在引入多种第二流体中的第二流体前一步引入第三置换流体。在一些实施方案中，所述方法包括在引入第二置换流体之后立即引入第三置换流体。在一些实施方案中，所述方法包括恰好在引入第二置换流体前一步引入第三置换流体。在一些实施方案中，所述方法包括恰好在引入多种第二流体中的第二流体前一步引入第三流体。在一些实施方案中，所述方法包括在引入第二置换流体之后立即引入第三流体。在一些实施方案中，所述方法包括恰好在引入第二置换流体前一步引入第三流体。在一些实施方案中，第二流体和/或第三流体通过扩散进入所述微孔的内容物。
在一些实施方案中，所述微孔的内容物中第二流体的一种或更多种成分的浓度与接触的第一持续时间有关，和/或所述微孔的内容物中第三流体的一种或更多种成分的浓度与接触的第二持续时间有关。在一些实施方案中，接触的第一持续时间与所述流动通道中第二流体的第一速度和第二流体的体积有关，和/或接触的第二持续时间与所述流动通道中第三流体的第二速度和第三流体的体积有关。在一些实施方案中，接触的第一持续时间取决于所述流动通道中第二流体的第一速度和所述流动通道中第二流体的纵向长度，和/或接触的第二持续时间取决于所述流动通道中第三流体的第二速度和所述流动通道中第三流体的纵向长度。
在一些实施方案中，所述流动通道中第二流体的纵向长度取决于引入的第二流体的体积、流体通道容积的体积、流动池容积或它们的组合，和/或所述流动通道中第三流体的纵向长度取决于引入的第三流体的体积、流体通道容积的体积、流动池容积或它们的组合。在一些实施方案中，第一流速为固定流速，第二流速为固定流速，和/或第三流速为固定流速。在一些实施方案中，第一流速是可变流速，第二流速是可变流速，和/或第三流速是可变流速。在一些实施方案中，第一流速是递增的流速，第二流速是递增的流速，和/或第三流速是递增的流速。在一些实施方案中，第一流速为递减的流速，第二流速为递减的流速，和/或第三流速为递减的流速。在一些实施方案中，引入第一流体和/或第一置换流体包括以第一流速将第一流体随后紧接着第一置换流体和/或与第一置换流体同时共同注入。
在一些实施方案中，引入第一流体和/或第一置换流体包括使用泵引入第一流体和/或第一置换流体。在一些实施方案中，将第二流体随后紧接着第二置换流体和/或与第二置换流体同时引入流体通道包括将第二流体及随后将第二置换流体共同注入。在一些实施方案中，将第二流体随后紧接着第三置换流体和/或与第三置换流体同时引入包括使用泵将第三流体随后紧接着第三流体和/或与第三流体同时引入。在一些实施方案中，将第三流体随后紧接着第三置换流体和/或与第三置换流体同时引入流体通道包括将第三流体及随后将第三置换流体共同注入。在一些实施方案中，将第三流体随后紧接着第三置换流体和/或与第三置换流体同时引入包括使用泵将第三流体随后紧接着第三流体和/或与第三流体同时引入。
在一些实施方案中，第一流体和/或第一置换流体通过非层流被引入流体通道，第二流体和/或第二置换流体通过非层流被引入流体通道，和/或第三流体和/或第三置换流体通过非层流被引入流体通道。在一些实施方案中，流体通道被配置用于通过非层流引入第一流体、第一置换流体、第二流体、第二置换流体、第三流体和/或第三置换流体。在一些实施方案中，非层流是活塞流或近似活塞流。
在一些实施方案中，经由包括流体通道的流动池的第一开口将第一流体引入所述流体通道，并且经由所述流动池的第二开口从所述流体通道容积中置换第一流体。在一些实施方案中，经由包括流体通道的流动池的第一开口将第二流体引入所述流体通道，并且经由所述流动池的第二开口从所述流体通道容积中置换第二流体。在一些实施方案中，经由包括流体通道的流动池的第一开口将第三流体引入所述流体通道，并且经由所述流动池的第二开口从所述流体通道容积中置换第三流体。在一些实施方案中，经由包括流体通道的流动池的第二开口将第三流体引入所述流体通道，并且经由所述流动池的第一开口从所述流体通道容积中置换第三流体。在一些实施方案中，经由包括流体通道的流动池的第三开口将第三流体引入所述流体通道，并且经由所述流动池的第四开口从所述流体通道容积中置换第三流体。
在一些实施方案中，所述方法包括在引入第三流体之前相对于流体通道的底部重新定向流体通道的方向。在一些实施方案中，所述方法包括将流体通道的方向相对于流体通道的底部重新定向为80、180或270度。在一些实施方案中，在引入第一置换流体之后，微孔包含单细胞、颗粒或它们的组合。在一些实施方案中，第一流体包括含水液体、多个单细胞、多个颗粒或它们的组合。在一些实施方案中，含水液体包括预充液体(primingliquid)。在一些实施方案中，第一置换流体、第二置换流体包括，和/或第三置换流体包括气体、非水液体或它们的组合。在一些实施方案中，第二流体和/或第三流体包括含水液体。在一些实施方案中，第一内容液、第二内容液和/或第三内容液包括非水液体。在一些实施方案中，第一置换液、第二置换液和/或第三置换液包括气体、含水液体或它们的组合。
在一些实施方案中，第一内容液的密度高于第二内容液的密度，其中第二内容液的密度高于第三内容液的密度，和/或其中第一内容液的密度高于第三内容液的密度。在一些实施方案中，第一内容液的密度高于第一置换液的密度、第二置换液的密度和/或第三置换液的密度。在一些实施方案中，第二内容液的密度高于第一置换液的密度、第二置换液的密度和/或第三置换液的密度。在一些实施方案中，第三内含液的密度高于第一置换液的密度、第二置换液的密度和/或第三置换液的密度。在一些实施方案中，第一内容液的密度低于第一置换液的密度、第二置换液的密度和/或第三置换液的密度。在一些实施方案中，第二内容液的密度低于第一置换液的密度、第二置换液的密度和/或第三置换液的密度。在一些实施方案中，第三内容液的密度低于第一置换液的密度、第二置换液的密度和/或第三置换液的密度。
在一些实施方案中，第一置换液、第二置换液和/或第三置换液是不同的。在一些实施方案中，第一置换液、第二置换液和/或第三置换液是不同类型的。在一些实施方案中，第一置换液、第二置换液和/或第三置换液是相同的。在一些实施方案中，第一置换液、第二置换液和/或第三置换液是相同类型的。在一些实施方案中，第一流体、第二流体和/或第三流体是不同的。在一些实施方案中，第一流体、第二流体和/或第三流体是不同类型的。在一些实施方案中，第一流体、第二流体和/或第三流体是相同的。在一些实施方案中，第一流体、第二流体和/或第三流体是相同类型的。
在一些实施方案中，第一流体、第二流体和/或第三流体包括分析物、缓冲成分、小分子、生物分子、试剂、作用剂或它们的组合。在一些实施方案中，第一流体、第二流体和/或第三流体包括裂解缓冲液。在一些实施方案中，当暴露于裂解缓冲液时，细胞的内容物被释放到微孔中。在一些实施方案中，和细胞相关联的靶分子与和颗粒相关联的条形码的靶结合区域杂交。在一些实施方案中，所述方法包括进行反应。在一些实施方案中，反应包括逆转录反应、核酸延伸反应、聚合酶链反应和/或它们的组合。在一些实施方案中，第一流体是第一塞并且第二流体是第二塞。
本文之公开包括将一种或更多种成分引入流体中的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)提供包括流体通道的流动池，其中流体通道包括顶部、第一侧壁和底部，并且其中底部包括包含多个微孔的基板；(b)用预充液预充流动池；(c)从多个微孔上方的流体通道容积中置换预充流体，由此多个微孔的每个微孔的内容物包括预充流体；以及(d)将第一流体和第二流体共同注入所述流体通道，其中恰好在第二流体前一步将第一流体引入所述流体通道，其中第一流体的一种或更多种成分进入所述微孔的内容物，并且其中第二流体密封所述微孔的内容物。
在一些实施方案中，第一流体与微孔的内容物的表面接合一段持续时间。在一些实施方案中，第一流体的一种或更多种成分通过扩散进入微孔。在一些实施方案中，在第一流体与微孔表面接合的持续时间内，所述一种或更多种成分在微孔内容物中引发反应。在一些实施方案中，在第一流体与微孔的表面接合之后，所述一种或更多种成分在微孔的内容物中引发反应。
本文之公开包括进行反应的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)提供包括流体通道的流动池，其中流体通道包括顶部、第一侧壁和底部，并且其中底部包括包含多个微孔的基板；以及(b)将第一流体和第二流体共同注入所述流体通道，其中恰好在第二流体前一步将第一流体引入所述流体通道，其中第一流体与微孔的表面接合一段持续时间，其中第一流体的一种或更多种成分进入微孔的内容物，其中所述一种或更多种成分在微孔的内容物中引发反应，并且其中第二流体密封所述微孔的内容物。
本文所公开的包括将不同浓度的分析物递送至多个微孔的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)提供包括流体通道的流动池，其中流体通道包括顶部、第一侧壁和底部，其中底部包括包含多个微孔的基板；以及(b)将第一流体和第二流体共同注入所述流体通道，其中恰好在第二流体前一步将第一流体引入流体通道，其中第一流体与微孔的内容物的表面接合一段持续时间，其中第一流体包括一种或更多种成分，其中第一流体的一种或更多种成分包括分析物，其中第一流体的流速沿流体通道的纵向路径是不均匀的，其中分析物进入所述微孔的内容物，其中对于多个微孔中的至少两个微孔，微孔中分析物的最终浓度是不相等的，并且其中第二流体密封所述微孔的内容物。
在一些实施方案中，第一流体是第一塞并且第二流体是第二塞。在一些实施方案中，在第一流体与微孔表面接合的持续时间内，所述一种或更多种成分在微孔内容物中引发反应。在一些实施方案中，所述方法包括在共同注入之前用预充流体预充流动池。在一些实施方案中，所述方法包括，在所述共同注入之前，从多个微孔上方的流体通道容积中置换预充流体。在一些实施方案中，第一流体的体积至多是第二流体的体积的10％。在一些实施方案中，在共同注入之后，多个微孔上方的流体通道容积包含第二流体。在一些实施方案中，在共同注入之后，多个微孔上方的流体通道容积不包含第一流体。在一些实施方案中，从多个微孔上方的流体通道容积中置换预充流体包括将置换流体注入所述流体通道中。在一些实施方案中，置换流体是气体。在一些实施方案中，置换流体是非水液体。在一些实施方案中，预充流体是第一含水液体。在一些实施方案中，预充流体是第一非水液体。在一些实施方案中，在所述共同注入之前，微孔包含初始微孔流体。在一些实施方案中，初始微孔流体包括预充流体。在一些实施方案中，初始微孔流体是含水液体。在一些实施方案中，初始微孔流体是含水缓冲液。在一些实施方案中，初始微孔流体是非水液体。
在一些实施方案中，第一流体的一种或更多种成分包括分析物。在一些实施方案中，第一流体包含已知浓度的分析物。在一些实施方案中，第一流体包含未知浓度的分析物。在一些实施方案中，第一流体的一种或更多种成分包括分析物、缓冲成分、小分子、生物分子、试剂、作用剂或它们的任意组合。在一些实施方案中，第一流体的流速等于第二流体的流速。在一些实施方案中，第一流体和第二流体不混溶。
在一些实施方案中，第一流体的密度大于第二流体的密度。在一些实施方案中，第一流体的密度大于第二流体的密度，并且其中第一流体和第二流体不混溶。在一些实施方案中，第一流体包括第二含水液体并且第二流体包括第一非水流体。在一些实施方案中，第一流体包括第二含水液体并且第二流体包括气体。在一些实施方案中，第一流体包括第二非水液体并且第二流体包括第二含水液体。
在一些实施方案中，第二流体具有与置换流体相同的组成。在一些实施方案中，第二流体具有与置换流体不同的组成。在一些实施方案中，第一流体具有与置换流体不同的组成。在一些实施方案中，第一流体的一种或更多种成分扩散到微孔中产生第一流体和初始微孔液的第一混合物。在一些实施方案中，第一流体的一种或更多种成分以较低浓度存在于初始微孔液中。在一些实施方案中，第一流体的一种或更多种成分不存在于初始微孔液中。在一些实施方案中，第一混合物中第一流体的一种或更多种成分的浓度为初始微孔液中第一流体的一种或更多种成分的浓度的至少2倍。
在一些实施方案中，所述持续时间小于反应持续时间。在一些实施方案中，在持续时间发生后开始反应。在一些实施方案中，在第二流体密封微孔的内容物之后开始反应。在一些实施方案中，持续时间足够短以致微孔的一种或更多种成分不会扩散出微孔。在一些实施方案中，微孔的一种或更多种成分包括细胞、珠粒、生物分子、缓冲液成分、小分子、生物分子、试剂、作用剂或它们的任意组合。在一些实施方案中，反应持续时间介于约1秒和约3小时之间。在一些实施方案中，持续时间是动态控制的。在一些实施方案中，持续时间是第一流体的体积、第一流体的流速、流动池尺寸或它们的任意组合的函数。在一些实施方案中，持续时间是通过调节第一流体的体积、第一流体的流速或它们的任意组合来动态控制的。
在一些实施方案中，在所述持续时间之后，微孔中第一流体的一种或更多种成分的最终浓度是所述持续时间和/或流动池尺寸的函数。在一些实施方案中，第一流体的流速沿着流体通道的纵向路径是均匀的。在一些实施方案中，第一流体的流速沿着流体通道的纵向路径是不均匀的。在一些实施方案中，第一流体的流速沿着流体通道的纵向路径而变化。在一些实施方案中，第一流体的流速沿着流体通道的纵向路径而增大。在一些实施方案中，第一流体的流速沿着流体通道的纵向路径而减小。在一些实施方案中，第一流体的流速变化是线性的。在一些实施方案中，第一流体的流速变化是非线性的。在一些实施方案中，第一流体的流速变化是指数型的。在一些实施方案中，第一流体的流速变化是对数型的。
在一些实施方案中，第一流体的流速在沿着流体通道的纵向路径的前部位置处相对于在沿着流体通道的纵向路径的后部位置处较高。在一些实施方案中，第一流体的流速在沿着流体通道的纵向路径的前部位置处相对于在沿着流体通道的纵向路径的后部位置处较低。在一些实施方案中，在前部位置处相对于在后部位置处的第一流体的流速之间的差异为、约为、至多约为或至少约为1.1倍。在一些实施方案中，在所述共同注入后多个微孔的内容物中第一流体的一种或更多种成分的最终浓度是均匀的。在一些实施方案中，在所述共同注入后多个微孔的内容物中第一流体的一种或更多种成分的最终浓度的变异系数小于5％。在一些实施方案中，在所述连续的共同注入后多个微孔的内容物中第一流体的一种或更多种成分的最终浓度是不均匀的。在一些实施方案中，每个微孔的内容物中第一流体的一种或更多种成分的最终浓度沿着流体通道的纵向路径变化。在一些实施方案中，每个微孔的内容物中第一流体的一种或更多种成分的最终浓度的变化是线性的。在一些实施方案中，每个微孔的内容物中第一流体的一种或更多种成分的最终浓度的变化是非线性的。在一些实施方案中，每个微孔的内容物中第一流体的一种或更多种成分的最终浓度的变化是指数型的。在一些实施方案中，每个微孔的内容物中第一流体的一种或更多种成分的最终浓度的变化是对数型的。
在一些实施方案中，在沿着流体通道的纵向路径的前部位置处相对于在沿着流体通道的纵向路径的后部位置处的微孔的内容物中的第一流体的一种或更多种成分的最终浓度之间的差异为、约为、至多约为、或至少约为1.1倍。在一些实施方案中，每个微孔的内容物中第一流体的一种或更多种成分的最终浓度沿着流体通道的纵向路径而增大。在一些实施方案中，每个微孔的内容物中第一流体的一种或更多种成分的最终浓度沿着流体通道的纵向路径而减小。
在一些实施方案中，在多个微孔中，流动池尺寸是一致的。在一些实施方案中，在多个微孔中，流动池尺寸不一致。在一些实施方案中，流动池尺寸包括微孔的容积和/或与多个微孔上方的流体通道容积接合的微孔的表面积。在一些实施方案中，在沿着流体通道的纵向路径的前部位置处相对于在沿着流体通道的纵向路径的后部位置处的微孔的容积之间的差异是、约是、至多约是或至少约是1.1倍。在一些实施方案中，在沿着流体通道的纵向路径的前部位置处相对于在沿着流体通道的纵向路径的后部位置处与多个微孔上方的流体通道容积接合的微孔的表面积之间的差是、约是、至多约是或至少约是1.1倍。
在一些实施方案中，在所述流和底部之间的边界处的流速是非零的。在一些实施方案中，横跨所述流体通道的横截面上的流的相对流速近似恒定。在一些实施方案中，所述流是活塞流。在一些实施方案中，所述顶部包括亲水涂层，其中亲水涂层包括聚乙二醇(PEG)、聚-Hema、pluronic酸F68、pluronic酸F108、pluronic酸F127、聚山梨醇酯20、二氧化硅(SiO2)、氮化硅或它们的任意组合。在一些实施方案中，顶部的角度远小于第一侧壁的接触角。
在一些实施方案中，密封微孔的内容物的第二流体减小了相互干扰(cross-talk)。在一些实施方案中，与利用单一流体注入执行的可比较的流动池方法相比，密封微孔的内容物的第二流体将相互干扰减小了、约、至多约或至少约5％。在一些实施方案中，相互干扰包括核酸、蛋白质、抗体、生物分子或它们的任意组合从一个微孔扩散到另一个微孔。在一些实施方案中，相互干扰包括核酸、蛋白质、抗体、生物分子或它们的任意组合从微孔扩散到多个微孔上方的流体通道容积。
在一些实施方案中，所述基板包括微孔阵列，其中微孔阵列包括至少100个微孔，其中每个微孔的容积在约1,000μm3至约786,000μm3的范围内。在一些实施方案中，减小的相互干扰使得能够使用较高密度的微孔阵列而不会有随之增大的相互干扰。在一些实施方案中，与标准微孔阵列相比，较高密度的微孔阵列每英寸2包含至少100多个微孔。在一些实施方案中，与标准微孔阵列相比，使用较高密度的微孔阵列提高了细胞装载效率。在一些实施方案中，与标准微孔阵列相比，使用较高密度的微孔阵列提高了珠粒装载效率。与标准微孔阵列相比，使用较高密度的微孔阵列可以减少双重态事件(doublet event)的数量。
在一些实施方案中，所述方法包括在共同注入之前在多个微孔中捕获单细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在共同注入之前在多个微孔中捕获单细胞和单个珠粒，其中单个珠粒包含多个拴系条形码(tethered barcode)，并且其中多个拴系条形码还包括：i)珠粒特异性细胞标记；ii)多样化的分子标记的组；以及iii)能够与核酸分子杂交的多个靶结合区域。在一些实施方案中，反应包括细胞裂解。在一些实施方案中，第一流体包括裂解缓冲液。在一些实施方案中，持续时间是足以向微孔递送足够裂解细胞的量的裂解缓冲液的时间长度。在一些实施方案中，与利用单一流体注入进行的可比较的流动池方法相比，密封微孔的内容物的第二流体带来由条形码捕获的mRNA和/或细胞成分结合试剂寡核苷酸的数量的增加。在一些实施方案中，与利用单一流体注入进行的可比较的流动池方法相比，密封微孔的内容物的第二流体带来与所测定的每个mRNA和/或细胞成分结合试剂寡核苷酸相关联的特有分子标记的存在数量的增加。在一些实施方案中，与利用单一流体注入执行的可比较的流动池方法相比，密封微孔的内容物的第二流体带来信噪比的增大。
在一些实施方案中，第一流体的流速随着其穿过流体通道而逐渐减小，其中在多个微孔中，第一流体的一种或更多种成分在每个微孔中的最终浓度是均匀的。在一些实施方案中，进入微孔的内容物的第一流体的一种或更多种成分使反应终止。在一些实施方案中，所述方法包括向流体通道中第二次共同注入流体。在一些实施方案中，第二次共同注入流体包括将第二次共同注入的第一流体和第二次共同注入的第二流体共同注入到流体通道中，其中恰好在第二次共同注入的第二流体前一步将第二次共同注入的第一流体引入流体通道，并且其中第二次共同注入的第二流体密封所述微孔的内容物。在一些实施方案中，第二次共同注入的第一流体和第二次共同注入的第二流体不混溶。在一些实施方案中，第二次共同注入的第一流体的密度大于第二次共同注入的第二流体的密度。在一些实施方案中，第二次共同注入的第一流体的密度大于第二次共同注入的第二流体的密度，并且其中第二次共同注入的第一流体和第二次共同注入的第二流体不混溶。
在一些实施方案中，第二次共同注入在相对于第一次共同注入的相反方向上进行。在一些实施方案中，第二次共同注入的第一流体包括含水液体并且第二次共同注入的第二流体包括非水液体。在一些实施方案中，第二次共同注入的第一流体包括含水液体并且第二次共同注入的第二流体包括气体。在一些实施方案中，第二次共同注入的第一流体包括非水液体并且第二次共同注入的第二流体包括含水液体。在一些实施方案中，第一次共同注入的第一流体和第二次共同注入的第一流体是相同的。在一些实施方案中，第一次共同注入的第一流体和第二次共同注入的第一流体是不同的。在一些实施方案中，第一次共同注入的第二流体和第二次共同注入的第二流体是相同的。在一些实施方案中，第一次共同注入的第二流体和第二次共同注入的第二流体是不同的。在一些实施方案中，所述方法不包括使用缓冲添加剂来减小相互干扰。在一些实施方案中，缓冲添加剂调节流体和/或试剂的粘度。在一些实施方案中，缓冲添加剂包括蔗糖、聚乙二醇(PEG)、Ficoll、丙三醇、甘油、硫酸葡聚糖、histopaque、牛血清白蛋白或它们的任意组合。
在一些实施方案中，提供了一种包括流动池的装置，所述流动池包括至少一个入口和至少一个出口，其中至少一个入口和至少一个出口能够导引流体流通过流动池，从而使微孔与流体接触。在一些实施方案中，包括流动池的装置是被配置为对多个单细胞执行自动化的条形码编码分析的仪器系统的可移除损耗件。
本文之公开包括用于确定单细胞中靶核酸分子存在数量的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)提供包括流体通道的流动池，其中流体通道包括顶部、第一侧壁和底部，并且其中底部包括包含多个微孔的基板；(b)在多个微孔中捕获单细胞和单个珠粒，其中单个珠粒包含多个拴系条形码，并且其中多个拴系条形码还包括：i)珠粒特异性细胞标记；ii)多样化的分子标记的组；以及iii)能够与靶核酸分子杂交的多个靶结合区域；(c)将第一流体和第二流体共同注入所述流体通道，其中恰好在第二流体前一步将第一流体引入所述流体通道，其中第一流体与微孔的内容物的表面接合一段持续时间，其中第一流体包括裂解缓冲液，其中第一流体的一种或更多种成分通过扩散进入微孔并引发细胞裂解，并且其中第二流体密封所述微孔的内容物；(d)使细胞裂解后从单细胞释放的靶核酸分子以随机方式与拴系在单个珠粒上的多个靶结合区域杂交；(e)进行延伸反应以产生多个分子缀合物，每个分子缀合物包含条形码与靶标核酸分子中之一的互补序列的一部分；(f)对分子缀合物进行扩增和测序；以及(g)测定单细胞中靶核酸分子存在的数量。在一些实施方案中，第一流体的密度大于第二流体的密度，并且其中第一流体和第二流体不混溶。在一些实施方案中，步骤(b)包括预充流动池、装载细胞、然后装载珠粒。在一些实施方案中，步骤(b)包括预充流动池、用空气注入置换预充缓冲液、装载细胞悬液、用空气注入置换细胞悬液，以及装载珠粒。在一些实施方案中，多个拴系条形码还包含通用引物序列。在一些实施方案中，栓系在珠粒上的多个条形码的多个靶结合区域包含选自基因特异性序列、oligo-dT序列、无规多聚体序列或它们的任意组合之中的序列的混合物。
在一些实施方案中，靶核酸分子包括RNA分子。在一些实施方案中，靶核酸分子包括mRNA分子。在一些实施方案中，靶核酸分子包括细胞成分结合试剂寡核苷酸。在一些实施方案中，细胞成分结合试剂寡核苷酸包括样品索引寡核苷酸。在一些实施方案中，靶核酸分子包括细胞成分结合试剂寡核苷酸，并且其中，测定单细胞中靶核酸分子的存在数量指示了单细胞中细胞成分靶标的拷贝数。在一些实施方案中，靶核酸分子包括样品索引寡核苷酸，并且其中，测定单细胞中靶核酸分子的存在数量指示了鉴定细胞的样品来源。在一些实施方案中，与利用单一流体注入进行的可比较的流动池方法相比，密封微孔的内容物的第二流体带来由条形码捕获的mRNA和/或细胞成分结合试剂寡核苷酸的数量的增加。在一些实施方案中，与利用单一流体注入进行的可比较的流动池方法相比，密封微孔的内容物的第二流体带来与所测定的mRNA和/或细胞成分结合试剂寡核苷酸中的每一个相关联的特有分子标记的存在数量的增加。在一些实施方案中，与利用单一流体注入进行的可比较的流动池方法相比，密封微孔的内容物的第二流体带来信噪比的增大。在一些实施方案中，第一流体是第一塞并且第二流体是第二塞。
本文之公开包括测量作用剂对单细胞的剂量依赖性表型效应的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)提供包括流体通道的流动池，其中流体通道包括顶部、第一侧壁和底部，并且其中底部包括包含多个微孔的基板；(b)在多个微孔中捕获单细胞；(c)将第一流体和第二流体共同注入所述流体通道，其中恰好在第二流体前一步将第一流体引入流体通道，其中第一流体与所述微孔的内容物的表面接合一段持续时间，其中第一流体包含一种或更多种成分，其中第一流体的一种或更多种成分包括作用剂，其中第一流体的流速沿着流体通道的纵向路径是不均匀的，其中在所述持续时间内所述作用剂通过扩散进入所述微孔，其中对于所述多个微孔中的至少两个微孔，微孔的内容物中的作用剂的最终浓度是不相等的，并且其中第二流体密封所述微孔的内容物；以及(d)测量依赖于微孔中作用剂最终浓度的一种或更多种表型效应。
在一些实施方案中，第一流体的密度大于第二流体的密度，并且其中第一流体和第二流体不混溶。在一些实施方案中，所述方法包括第二次共同注入流体，其中第二次共同注入包括将第二次共同注入的第二第一液体和第二次共同注入的第二液体共同注入到流体通道中，其中，恰好在第二次共同注入的第二液体前一步将第二次共同注入的第一液体引入流体通道，其中第二次共同注入的第二液体密封所述微孔的内容物。在一些实施方案中，第二次共同注入的第一液体的密度大于第二次共同注入的第二液体的密度，并且其中第二次共同注入的第一液体和第二次共同注入的第二液体不混溶。在一些实施方案中，第二次共同注入在相对于第一次共同注入的相反方向上进行。在一些实施方案中，第二次共同注入的第一流体包含第二作用剂。在一些实施方案中，第一流体是第一塞并且第二流体是第二塞。
在一些实施方案中，第一流体的流速在沿着流体通道的纵向路径的前部位置处相对于在沿着流体通道的纵向路径的后部位置处较高。在一些实施方案中，第一流体的流速在沿着流体通道的纵向路径的前部位置处相对于在沿着流体通道的纵向路径的后部位置处较低。在一些实施方案中，在沿着流体通道的纵向路径的前部位置处相对于在沿着流体通道的纵向路径的后部位置处的第一流体的流速之间的差异为、约为、至多约为或为至少约为1.1倍。在一些实施方案中，在连续的共同注入之后多个微孔的内容物中的作用剂的最终浓度是不一致的。在一些实施方案中，每个微孔的内容物中作用剂的最终浓度沿着流体通道的纵向路径而变化。在一些实施方案中，每个微孔的内容物中作用剂的最终浓度的变化是线性的。在一些实施方案中，每个微孔的内容物中药剂的最终浓度的变化是非线性的。在一些实施方案中，每个微孔的内容物中作用剂的最终浓度的变化是指数型的。在一些实施方案中，每个微孔的内容物中作用剂的最终浓度的变化是对数型的。在一些实施方案中，在沿着流体通道的纵向路径的前部位置处相对于在沿着流体通道的纵向路径的后部位置处的微孔的内容物中的作用剂的最终浓度之间的差异为、约为、至多约为或至少约为1.1倍。
在一些实施方案中，作用剂包含一种或更多种成分。在一些实施方案中，第二作用剂包含一种或更多种成分。在一些实施方案中，作用剂包括一种或更多种化学剂、药物、小分子、生物剂(biologic)、CRISPR单向导RNA(sgRNA)、小干扰RNA(siRNA)、CRISPR RNA(crRNA)、小分子发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)、反义寡核苷酸、肽或肽模拟物抑制剂、适配体、抗体、胞内抗体(intrabody)、或它们的任意组合。在一些实施方案中，作用剂包括一种或更多种表观遗传修饰剂、表观遗传酶、双环肽、转录因子、DNA或蛋白质修饰酶、DNA嵌入剂、外排泵抑制剂、核受体活化剂或抑制剂、蛋白酶体抑制剂、酶的竞争性抑制剂、蛋白质合成抑制剂、核酸酶、蛋白质片段或结构域、标签或标志物、抗原、抗体或抗体片段、配体或受体、来自天然生物活性肽的合成肽或模拟肽、抗微生物肽、成孔肽、靶向或细胞毒性的肽、降解或自毁肽、CRISPR组分系统或其组分、DNA、RNA、人工核酸、纳米颗粒、寡核苷酸适配体、肽适配体或它们的任意组合。在一些实施方案中，作用剂具有选自以下的至少一种效应活性：调节生物活性、结合调节蛋白、调节酶活性、调节底物结合、调节受体活化、调节蛋白质稳定性/降解、调节转录物稳定性/降解、以及它们的任意组合。
在一些实施方案中，作用剂包括感染剂。在一些实施方案中，作用剂包括抗感染剂。在一些实施方案中，作用剂包括感染剂和抗感染剂的混合物。在一些实施方案中，感染剂包括病毒、细菌、真菌、原生动物寄生虫或它们的任意组合。在一些实施方案中，抗感染剂包括抗细菌剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂或它们的任意组合。在一些实施方案中，作用剂包括细胞毒性剂。在一些实施方案中，细胞毒性剂选自化学治疗剂、生物剂(biologicagent)、毒素、放射性同位素或它们的任意组合。在一些实施方案中，作用剂包含治疗剂的非活性成分。在一些实施方案中，治疗剂的非活性成分包括赋形剂、载体、稀释剂、媒介、佐剂、空运载体或它们的任意组合。在一些实施方案中，作用剂包括表达运载体，其中所述表达运载体编码以下一种或更多种：mRNA、反义核酸分子、RNAi分子、shRNA、成熟miRNA、前体miRNA、初级miRNA、抗miRNA、核酶、它们的任意组合。在一些实施方案中，单细胞包含重组表达运载体。在一些实施方案中，重组表达运载体包括诱导型启动子，并且其中以下一种或更多种的表达受所述诱导型启动子的控制：mRNA、反义核酸分子、RNAi分子、shRNA、成熟miRNA、前体miRNA、初级miRNA、抗miRNA、核酶、它们的任意组合。在一些实施方案中，作用剂是诱导型启动子的剂量依赖性诱导剂。在一些实施方案中，剂量依赖性诱导剂包括四环素、原始霉素、大环内酯、蜕皮激素、米非司酮或它们的任意组合。在一些实施方案中，作用剂调节一种或更多种靶标生物标志物的表达。在一些实施方案中，作用剂调节一种或更多种靶标生物标志物的活性。
在一些实施方案中，所述方法包括在多个微孔中捕获单个珠粒，其中单个珠粒包含多个拴系条形码，并且其中多个拴系条形码还包括：i)珠粒特异性细胞标记；ii)多样化的分子标记的组；以及iii)能够与靶核酸分子杂交的多个靶结合区域。在一些实施方案中，测量依赖于微孔中作用剂的最终浓度的一种或更多种表型效应包括mRNA表达谱分析，其中mRNA表达谱分析包括细胞中多个mRNA靶标的定量分析。在一些实施方案中，测量依赖于微孔中作用剂的最终浓度的一种或更多种表型效应包括蛋白质表达谱分析，其中蛋白质表达谱分析包括细胞中多个蛋白质靶标的定量分析。在一些实施方案中，测量依赖于微孔中作用剂的最终浓度的一种或更多种表型效应包括同时定量分析细胞中的多个蛋白质靶标和多个核酸靶标分子。
在一些实施方案中，所述方法包括确定微孔阵列内每个细胞的流动池纵向位置(longitudinal flowcell position)。在一些实施方案中，微孔阵列内每个细胞的流动池纵向位置的确定包括确定每个细胞的来源的微孔。在一些实施方案中，微孔阵列的每个微孔包括阵列地址码。在一些实施方案中，阵列地址码包含对于微孔阵列中的每个微孔特有的核酸条形码。在一些实施方案中，阵列地址码被共价附接至微孔的一个或更多个内表面。在一些实施方案中，共价附接包括使用一种或更多种可切割的接头以能够释放阵列地址码。在一些实施方案中，一个或更多个可切割的接头包括酸不稳定接头、碱不稳定接头、光可切割接头、酶可切割接头或它们的任意组合。在一些实施方案中，阵列地址码包括限制酶位点。在一些实施方案中，附接到珠粒的条形码的子集包括用于阵列地址码的退火位点。在一些实施方案中，在释放时，阵列地址码与条形码子集杂交。
在一些实施方案中，测序期间细胞标记与阵列地址码的关联鉴定了微孔阵列内每个细胞的来源的微孔。在一些实施方案中，多个珠粒中的每一个包括多个随机条形码、第一组光学标记和第二组光学标记。在一些实施方案中，第一组光学标记中的每个光学标记包括第一光学部分并且第二组光学标记中的每个光学标记包括第二光学部分。在一些实施方案中，多个珠粒中的每一个都与包含第一光学部分和第二光学部分的光学条形码相关联，并且其中第一光学部分和第二光学部分选自包含两个或更多个光谱不同的光学部分的组。在一些实施方案中，多个珠粒中的至少两个珠粒包含特有的光学条形码，并且其中可以在流动池中检测多个珠粒中的每个珠粒的光学条形码以确定多个珠粒中的每个珠粒的定位。在一些实施方案中，所述方法包括检测多个珠粒中的每个珠粒的光学条形码以确定多个珠粒中的每个珠粒的定位。在一些实施方案中，所述方法包括基于多个珠粒的定位确定多个单细胞的微孔定位。
在一些实施方案中，所述方法包括对每个流动池纵向位置处的作用剂浓度的评估。在一些实施方案中，第一流体包括荧光染料，其中荧光染料与作用剂的比例是已知的。在一些实施方案中，所述方法包括在共同注入第一流体和第二流体之后对流动池进行光学成像，其中光学成像包括对每个微孔中的荧光染料的测量，其中流动池包括用于光学成像的透明窗口。在一些实施方案中，对每个微孔中的荧光染料的测量使得能够评估每个微孔中的作用剂的浓度。在一些实施方案中，所述方法包括基于确定每个细胞的来源的微孔和估算每个流动池纵向位置处的作用剂的浓度来得出对每个细胞暴露于其中的作用剂的浓度的估算。在一些实施方案中，所述方法包括对每个细胞暴露于其中的作用剂的评估浓度和所述细胞的RNA和/或DNA表达谱的相关性分析。在一些实施方案中，相关性分析鉴定了以下一种或更多种：候选治疗剂、候选治疗剂的候选剂量和候选治疗剂的细胞靶标。
附图说明
图1图示了非限制示例性的条形码。
图2示出了条形码编码和数字化计数的非限制示例性工作流程。
图3是显示用于从多个靶标生成在3’-端处条形码编码的靶标的索引库的非限制示例性过程的示意图。
图4示出了用于条形码编码的示例性的微孔盒(cartidge)的分解图。
图5A示出了在共同注入之前包含定位在示例性的微孔盒的入口的移液管尖端界面处的含水液体(“A2”)和非水液体(“NA”)的示例性移液管。
图5B提供了根据本文提供的方法的一些实施方案经历第一流体和第二流体的共同注入的示例性流动池的示意图。
图6A-图6D描绘了用于将第一流体和第二流体共同注入到流动池中的非限制示例性工作流程。
图7描绘了用于将第一流体和第二流体第一次共同注入到流动池中然后将第一流体和第二流体第二次共同注入到流动池中的非限制示例性工作流程。
图8A-图8C描绘了用于将流体注入流动池的非限制示例性工作流程。
图9提供了经历第一流体(包括裂解缓冲液)和第二流体(包括油)的共同注入的示例性流动池的示意图。
图10A提供了经历第一流体和第二流体的共同注入的示例性流动池的示意图，其中第一流体的流速沿着流动池的纵向路径是不均匀的。
图10B提供了非限制示例性图表，其示出了包含分析物的共同注入的第一流体沿着流动池的纵向路径(细线)的不均匀流速和分析物在沿流动池纵向路径的微孔的内容物内的不均匀浓度。
图11提供了经历第一流体和第二流体的共同注入的流动池的前部、中部和后部的示例性示意图，其中第一流体的流速沿着流动池的纵向路径是不均匀的。
图12A1-图12C2显示了在共同注入包含CHAPS裂解缓冲液的第一流体和包含GC2油的第二流体之后的1分钟(图12A1-图12A2)、7分钟(图12B1-12B2)和13分钟(图12C1-图12C12)的微孔的示例性明场图像(图12A1、12B1和12C1)和荧光图像(图12A2、12B2和12C2)。在共同注入之前，阵列的三个微孔包含单个钙黄绿素染色细胞。
具体实施方式
在下面的详细描述中，参考了构成其一部分的附图。在附图中，除非上下文另有说明，否则相似的标记通常标识相似的组件。在详细说明、附图和权利要求中描述的说明性实施方案并不意味着是限制性的。在不脱离本文提出的主题的精神或范围的情况下，可以利用其他实施方案，并且可以做出其他改变。将容易理解，本公开的各方面，如在本文中总体描述的和在附图中示出的，可以被布置、替换、组合、分离和设计为各种各样不同的配置，所有这些均明确地涵盖于本文中并作为本文公开的一部分。
本文提及的所有专利、公开的专利申请、其他出版物和来自GenBank以及其他数据库的序列按照相关技术通过引用被整体并入。
对于确定例如在不同发育阶段或在不同环境条件下在细胞中表达的基因，在临床上是重要的是对于少量核酸(例如信使核糖核苷酸(mRNA)分子)予以定量。然而，确定核酸分子(例如mRNA分子)的绝对数量也非常具有挑战性，尤其是当分子数量非常小时。确定样品中分子绝对数量的一种方法是数字化的聚合酶链反应(PCR)。理想情况下，PCR在每个循环中产生相同的分子拷贝。然而，PCR可能有缺点，比如每个分子以随机概率复制，并且该概率因PCR循环和基因序列而异，从而导致扩增偏差和基因表达测量不准确。可以使用具有特有分子标记(也称为分子索引(MI))的随机条形码对分子数量进行计数并校正扩增偏差。随机条形码编码，诸如PreciseTM分析(Cellular Research,Inc.(加利福尼亚州，帕洛阿尔托))和RhapsodyTM分析(Becton,Dickinson and Company(新泽西，富兰克林湖))，可以通过在逆转录(RT)过程中使用分子标记(ML)以标记mRNA来校正由PCR和文库制备步骤引起的偏差。
PreciseTM分析法可以利用具有大量(例如6561至65536个)在poly(T)寡核苷酸上的特有分子标记序列的非消耗性随机条形码池，以在RT步骤期间与样品中的所有聚(A)-mRNA杂交。随机条形码可以包含通用PCR引发位点。在RT期间，靶标基因分子与随机条形码随机反应。每个靶标分子可以与随机条形码杂交，从而产生随机条形码编码的互补核糖核苷酸(cDNA)分子)。标记后，来自微孔板的微孔中的随机条形码编码的cDNA分子可以被汇集到单个管中，用于PCR扩增和测序。可以分析原始测序数据以提供读段的数量、具有特有分子标记序列的随机条形码的数量以及mRNA分子的数量。
本文所公开的包括用于引入一种或更多种成分的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)将第一流体引入包括顶部、第一侧壁和底部的流体通道，其中流体通道的底部包括多个微孔，并且其中流体通道的顶部、第一侧壁和底部围绕流体通道的流体通道容积，由此流体通道容积和多个微孔中的每个微孔包含第一流体；(b)以第一流速将第一置换流体引入所述流体通道以从流体通道容积中置换第一流体；(c)以第二流速将第二流体(本文也称为第一流体)随后紧接着第二置换流体和/或与第二置换流体(本文也称为第二流体)同时引入所述流体通道，其中当第二流体与微孔中的内容物接触第一持续时间时，第二流体的一种或更多种成分进入微孔中的内容物，并且其中第二置换流体从流体通道容积中置换第二流体和/或密封所述微孔的内容物。
本文之公开包括用于引入一种或更多种成分的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)将第一流体引入包括顶部、第一侧壁和底部的流体通道，其中流体通道的底部包括多个微孔，并且其中流体通道的顶部、第一侧壁和底部围绕流体通道的流体通道容积，由此流体通道容积和多个微孔中的每个微孔包含第一流体；(b)将第一置换流体引入所述流体通道以从流体通道容积中置换第一流体；(c)以第二流速将多种第二流体(本文也称为第一流体)中的每种第二流体随后紧接着第二置换流体和/或与第二置换流体(在本文中也称为第二流体)同时引入所述流体通道，其中当第二流体与微孔中的内容物接触第一持续时间时，多种第二流体中的每一种的一种或更多种成分进入微孔中的内容物，并且其中第二置换流体从流体通道容积中置换第二流体和/或密封所述微孔的内容物。
本文之公开包括用于引入一种或更多种成分的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)提供包括顶部、第一侧壁和底部的流体通道，其中流体通道的底部包括包含第一流体的多个微孔，其中流体通道的顶部、第一侧壁和底部围绕流体通道的流体通道容积，并且其中流体通道容积缺少第一流体；(b)以第二流速将多种第二流体(本文也称为第一流体)中每种第二流体随后紧接着第二置换流体和/或与第二置换流体(本文也称为第二流体)同时引入所述流体通道中，其中当第二流体与微孔中的内容物接触第一持续时间时，多种第二流体中的每一种的一种或更多种成分进入微孔中的内容物，并且其中第二置换流体从流体通道容积中置换第二流体和/或密封所述微孔的内容物。
本文之公开包括将一种或更多种成分引入流体中的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)提供包括流体通道的流动池，其中流体通道包括顶部、第一侧壁和底部，并且其中底部包括包含多个微孔的基板；(b)用预充液预充所述流动池；(c)从所述多个微孔上方的流体通道容积中置换预充流体，由此多个微孔的每个微孔的内容物包括预充流体；以及(d)将第一流体和第二流体共同注入所述流体通道，其中恰好在第二流体前一步将第一流体引入流体通道，其中第一流体的一种或更多种成分进入所述微孔的内容物，并且其中第二流体密封所述微孔的内容物。
本文之公开包括进行反应的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)提供包括流体通道的流动池，其中流体通道包括顶部、第一侧壁和底部，并且其中底部包括包含多个微孔的基板；以及(b)将第一流体和第二流体共同注入所述流体通道，其中恰好在第二流体前一步将第一流体引入流体通道，其中第一流体与微孔的表面接合一段持续时间，其中第一流体的一种或更多种成分进入所述微孔的内容物，其中一种或更多种成分在微孔的内容物中引发反应，并且其中第二流体密封所述微孔的内容物。
本文之公开包括将不同浓度的分析物递送至多个微孔的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)提供包括流体通道的流动池，其中流体通道包括顶部、第一侧壁和底部，其中底部包括包含多个微孔的基板；以及(b)将第一流体和第二流体共同注入所述流体通道，其中恰好在第二流体前一步将第一流体引入流体通道，其中第一流体与微孔的内容物的表面接合一段持续时间，其中第一流体包括一种或更多种成分，其中第一流体的一种或更多种成分包括分析物，其中第一流体的流速沿着流体通道的纵向路径是不均匀的，其中分析物进入微孔的内容物，其中对于多个微孔中的至少两个微孔，微孔中分析物的最终浓度是不相等的，并且其中第二流体密封所述微孔的内容物。
本文之公开包括用于确定单细胞中靶核酸分子存在数量的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)提供包括流体通道的流动池，其中流体通道包括顶部、第一侧壁和底部，并且其中底部包括包含多个微孔的基板；(b)在多个微孔中捕获单细胞和单个珠粒，其中单个珠粒包含多个拴系条形码，并且其中多个拴系条形码还包含：i)珠粒特异性细胞标记；ii)多样化的分子标记的组；以及iii)能够与靶核酸分子杂交的多个靶结合区域；(c)将第一流体和第二流体共同注入所述流体通道，其中恰好在第二流体前一步将第一流体引入流体通道，其中第一流体与微孔的内容物的表面接合一段持续时间，其中第一流体包括裂解缓冲液，其中第一流体的一种或更多种成分通过扩散进入微孔并引发细胞裂解，并且其中第二流体密封所述微孔的内容物；(d)使细胞裂解后从单细胞释放的靶核酸分子以随机方式与拴系于单个珠粒的多个靶结合区域杂交；(e)进行延伸反应以产生多个分子缀合物，每个分子缀合物包含条形码和靶核酸分子中之一的互补序列的一部分；(f)对分子缀合物进行扩增和测序；以及(g)确定单细胞中靶核酸分子的存在数量。
本文之公开包括测量作用剂对单细胞的剂量依赖性表型效应的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)提供包括流体通道的流动池，其中流体通道包括顶部、第一侧壁和底部，并且其中底部包括包含多个微孔的基板；(b)在多个微孔中捕获单细胞；(c)将第一流体和第二流体共同注入所述流体通道，其中恰好在第二流体前一步将第一流体引入流体通道，其中第一流体与微孔的内容物的表面接合一段持续时间，其中第一流体包括一种或更多种成分，其中第一流体的一种或更多种成分包括作用剂，其中第一流体的流速沿着流体通道的纵向路径是不均匀的，其中在所述持续时间内作用剂通过扩散进入所述微孔，其中对于所述多个微孔中的至少两个微孔，微孔的内容物中作用剂的最终浓度是不相等的，并且其中第二流体密封所述微孔的内容物；以及(d)测量依赖于微孔中作用剂最终浓度的一种或更多种表型效应。
定义
除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。参见，例如，Singleton等，Dictionary of Microbiologyand Molecular Biology(微生物学和分子生物学词典)第二版，J.Wiley&Sons(纽约,NY1994)；Sambrook等，Molecular Cloning，A laboratory Manual(分子克隆，实验室手册)，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor，纽约1989)。出于本公开的目的，下文定义以下术语。
如本文所用，术语“衔接子”可以表示有助于所关联的核酸的扩增或测序的序列。关联核酸可以包括靶向核酸。关联核酸可以包括空间标记、靶向标记、样品标记、索引标记或条形码序列(例如，分子标记)中的一种或更多种。衔接子可以是线性的。衔接子可以是预腺苷化的衔接子。衔接子可以是双链或单链的。一个或更多个衔接子可以位于核酸的5’或3’端。当在5’和3’端衔接子包含已知序列时，已知序列可以是相同或不同的序列。位于多核苷酸5’和/或3’末端的衔接子能够与固定在表面上的一个或更多个寡核苷酸杂交。在一些实施方案中，衔接子可以包括通用序列。通用序列可以是两个或多个核酸分子共有的核苷酸序列区域。两个或多个核酸分子也可以具有不同序列的区域。因此，例如，5’衔接子可以包括相同和/或通用的核酸序列并且3’衔接子可以包括相同和/或通用的序列。可以存在于多个核酸分子的不同成员中的通用序列可以允许使用与该通用序列互补的单一通用引物复制或扩增多个不同序列。类似地，可以存在于核酸分子集合的不同成员中的至少一个、两个(例如，一对)或更多个通用序列可以允许使用至少一个、两个(例如，一对)或更多个与该通用序列互补的单一通用引物进行多个不同序列的复制和扩增。因此，通用引物包括可以与这种通用序列杂交的序列。可以修饰带有靶核酸序列的分子以将通用衔接子(例如，非靶核酸序列)附接到不同的靶核酸序列的一端或两端。附接到靶核酸的一个或更多个通用引物可以提供用于通用引物杂交的位点。与靶核酸附接的一个或更多个通用引物可以彼此相同或不同。
如本文所用，术语“关联”或“与……相关联”可以表示两个或多个物种(species)可识别为在某个时间点共处一地。关联可以意味着两个或多个物种在或曾经在类似的容器内。关联可以是信息学关联。例如，关于两个或多个物种的数字信息可以被储存并且可以被用于确定一个或更多个物种在某个时间点曾共处一地。关联也可以是物理关联。在一些实施方案中，两个或多个关联物种“拴系”、“附接”或“固定”到彼此或共同的固体或半固体表面。关联可以指用于将标记附接到固体或半固体支持物例如珠粒的共价或非共价方式。关联可以是靶标与标记之间的共价键。关联可以包括两个分子(例如靶标分子与标记)之间的杂交。
如本文所用，术语“互补”可以指两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果在核酸给定位置处的核苷酸能够与另一核酸的核苷酸形成氢键，则认为这两个核酸在该位置处彼此互补。两个单链核酸分子之间的互补可以是“部分的”，其中只有一些核苷酸结合，或者当单链分子之间存在完全互补时，互补可以是完整的。如果第一核苷酸序列与第二核苷酸序列互补，则可以说第一核苷酸序列是第二序列的“互补物”。如果第一核苷酸序列和与第二序列相反(即，核苷酸的顺序相反)的序列互补，则可以说第一核苷酸序列是第二序列的“反向互补物”。如本文所用，“互补”序列可以指序列的“互补物”或“反向互补物”。从本公开内容可以理解，如果一个分子可以与另一个分子杂交，那么它可以与杂交的分子互补或部分地互补。
如本文所用，术语“数字化计数”可以指用于评估样品中靶标分子数量的方法。数字化计数可以包括确定已与样品中的靶标相关联的特有标记的数量的步骤。这种本质上可以是随机的方法将对分子进行计数的问题从定位和识别相同分子这一个问题转变为与预定义的标记组的检测有关的一系列是/否的数字化问题。
如本文所用，术语“标记”可以指与样品中的靶标相关联的核酸代码。标记可以是例如核酸标记。标记可以是完全或部分可扩增的标记。标记可以是完全或部分可测序的标记。标记可以是的天然核酸的一部分，其可识别出区别。标记可以是已知序列。标记可以包含核酸序列的接合区(junction)，例如天然与非天然序列的接合区。如本文所用，术语“标记”可以与术语“索引”、“标签”或“标记-标签”互换使用。标记可以传达信息。例如，在各种实施方案中，标记可以用于确定样品的身份、样品的来源、细胞的身份和/或靶标。
如本文所用，术语“非消耗性储库”可以指由许多不同标记组成的条形码(例如，随机条形码)池。非消耗性储库可以包括大量不同的条形码，使得当非消耗性储库与靶标池相关联时，每个靶标可能与特有的条形码相关联。每个被标记的靶标分子的专一性(uniqueness)可以通过随机选择的统计数据来确定，并且取决于与标记的多样性相比的集合中相同靶标分子的拷贝数。所得标记靶标分子组的大小可以由条形码编码过程的随机性质确定，然后对检测到的条形码数量的分析允许计算原始集合或样品中存在的靶标分子的数量。当存在的靶标分子的拷贝数量与特有条形码的数量之比低时，标记的靶标分子具有高度的专一性(即，多于一个的靶标分子被一个给定标记所标记的可能性非常低)。
如本文所用，术语“核酸”是指多核苷酸序列或其片段。核酸可以包括核苷酸。核酸对于细胞可以是外源的或内源的。核酸可以存在于无细胞环境中。核酸可以是基因或其片段。核酸可以是DNA。核酸可以是RNA。核酸可以包括一种或更多种类似物(例如，改变的骨架、糖或核碱基)。类似物的一些非限制性实例包括：5-溴尿嘧啶、肽核酸、异种核酸、吗啉代、锁核酸、乙二醇核酸、苏糖核酸、双脱氧核苷酸、虫草素、7-脱氮-GTP、荧光团(例如与糖连接的罗丹明或荧光素)、含硫醇的核苷酸、生物素连接的核苷酸、荧光碱基类似物、CpG岛状物(CpG island)、甲基-7-鸟苷、甲基化核苷酸、肌苷、硫尿苷、假尿苷、二氢尿苷、Q核苷(queuosine)和Y核苷(wyosine)。“核酸”、“多核苷酸”、“靶多核苷酸”和“靶核酸”可以互换使用。
核酸可以包含一个或更多个修饰(例如，碱基修饰、骨架修饰)，从而为核酸提供新的或增强的特征(例如，提高的稳定性)。核酸可以包括核酸亲和标签。核苷可以是碱基-糖组合。核苷的碱基部分可以是杂环碱基。此类杂环碱基的两个最常见的种类是嘌呤和嘧啶。核苷酸可以是这样的核苷，其进一步包括与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团。对于那些包含呋喃戊糖的核苷，磷酸基团可以连接到糖的2’、3’或5’羟基部分。在形成核酸时，磷酸基团可以将相邻的核苷彼此共价连接以形成线性聚合化合物。反过来，该线性聚合化合物的各端可以进一步连接以形成环形化合物；然而，线性化合物通常是合适的。此外，线性化合物可以具有内部核苷酸碱基互补性并且因此可以以产生完全或部分双链化合物的方式折叠。在核酸内，磷酸基团通常可以被称为形成核酸的核苷间骨架。所述键或骨架可以是3’到5’磷酸二酯键。
核酸可以包括经修饰的骨架和/或经修饰的核苷间键。经修饰的骨架可以包括在骨架中保留磷原子的那些和在骨架中没有磷原子的那些。其中含有磷原子的合适的修饰核酸骨架可以包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯诸如3’-亚烷基膦酸酯、5’-亚烷基膦酸酯、手性膦酸酯、次膦酸酯、氨基磷酸酯包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯和硼酸磷酸酯，其具有正常3’-5’键、2’-5’键的类似物，以及具有反向极性的那些，其中一个或更多个核苷酸间键是3’→3’、5’→5’或2’→2’键。
核酸可以包含由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或一个或更多个短链的杂原子或杂环的核苷间键形成的多核苷酸的骨架。这些可以包括那些具有吗啉键(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基(thioformacetyl)骨架；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基骨架；核糖乙酰基(riboacetyl)骨架；含烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及其他具有混合N、O、S和CH2的组成部分的。
核酸可以包括核酸模拟物。术语“模拟物”可以旨在包括这样的多核苷酸，其中仅呋喃糖环或者呋喃糖环和核苷酸间键两者被非呋喃糖基团取代，仅呋喃糖环的取代也可以称为糖替代物。可以保留杂环碱基部分或经修饰的杂环碱基部分以与合适的靶核酸杂交。一种这样的核酸可以是肽核酸(PNA)。在PNA中，多核苷酸的糖骨架可以被含有酰胺的骨架特别是氨基乙基甘氨酸骨架替代。核苷酸可以被保留并被直接或间接地结合到骨架的酰胺部分的氮杂(aza)氮原子上。PNA化合物中的骨架可以包括两个或多个链接的氨基乙基甘氨酸单元，这给与了PNA含酰胺的骨架。杂环碱基部分可以直接或间接与骨架的酰胺部分的氮杂氮原子结合。
核酸可以包含吗啉代骨架结构。例如，核酸可以包含代替核糖环的6元吗啉环。在这些实施方案的一部分实施方案中，二氨基磷酸酯(phosphorodiamidate)或其他非磷酸二酯的核苷间键可以替代磷酸二酯键。
核酸可以包括链接的吗啉代单元(例如，吗啉代核酸)，其具有附接到吗啉环的杂环碱基。连接基团可以链接吗啉代核酸中的吗啉代单体单元。非离子型的基于吗啉代的寡聚化合物可以具有较少的与细胞蛋白质的不良相互作用。基于吗啉代的多核苷酸可以是核酸的非离子型模拟物。可以使用不同的连接基团将吗啉类中的各种化合物连接起来。另外一类多核苷酸模拟物可以被称为环己烯基核酸(CeNA)。通常存在于核酸分子中的呋喃糖环可以被环己烯基环取代。CeNA DMT保护的亚磷酰胺单体可以被制备并用于利用亚磷酰胺化学的低聚化合物合成。将CeNA单体掺入核酸链可以增大DNA/RNA杂交体的稳定性。CeNA寡聚腺苷酸可以与核酸互补物形成复合物，其稳定性与天然复合物相似。进一步的修饰可以包括锁核酸(LNA)，其中2’-羟基基团与糖环的4’碳原子相连，从而形成2’-C、4’-C-氧亚甲基键，从而形成双环的糖部分。该键可以是亚甲基(-CH2)，基团桥接2’氧原子和4’碳原子，其中n为1或2。LNA和LNA类似物可以显示出非常高的与互补核酸的双链热稳定性(Tm＝+3至+10℃)，对于3’-核酸外切降解的稳定性和良好的溶解性。
核酸还可以包括核碱基(通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用，“未修饰的”或“天然”核碱基可以包括嘌呤碱基(例如，腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))和嘧啶碱基(例如，胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U))。经修饰的核碱基可以包括其他合成和天然的核碱基，诸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基(-C＝C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代特别是5-溴代、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤(deazaguanine)和7-脱氮腺嘌呤(deazaadenine)以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。经修饰的核碱基可以包括：三环嘧啶诸如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶(5,4-b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3H)-酮)，G-clamps诸如取代的吩噁嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶(5,4-(b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3H)-酮)，G-clamps诸如取代的吩噁嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶(5,4-(b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)，咔唑胞苷(2H-嘧啶(4,5-b)吲哚-2-酮),吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶(3',2':4,5)吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。
如本文所用，术语“样品”可以指包含靶标的组合物。用于通过所公开的方法、装置和系统进行分析的合适样品包括细胞、组织、器官或生物体。样品可以指多个细胞。样品可以指单层细胞。样品可以指薄切片(例如，组织薄切片)。样品可以指可以以一个维度放置在阵列上的固体或半固体的细胞集合。
如本文所用，术语“取样装置”或“装置”可以指可以取得样品的切片和/或将该切片放置在基板上的装置。取样装置可以指例如荧光激活细胞分选(FACS)机、细胞分选机、活检针、活检装置、组织切片装置、微流体装置、刀片网格和/或切片机。
如本文所用，术语“固体支持物”可以指离散的固体或半固体表面，多个条形码(例如，随机条形码)可以附接到该表面上。固体支持物可以包括由塑料、陶瓷、金属或聚合材料(例如，水凝胶)组成的任何类型的实心的、多孔的或空心的球体、球、支撑件(bearing)、圆柱体或其他类似构造，核酸可以(例如，共价或非共价地)固定在其上。固体支持物可以包括离散颗粒，其可以为球形(例如，微球)或具有非球形或不规则形状，诸如立方体、长方体、金字塔形、圆柱形、圆锥形、长方形或圆盘形等。珠粒的形状可以是非球形的。间隔为阵列的多个固体支持物可以不包括基板。固体支持物可以与术语“珠粒”互换使用。
如本文所用，术语“随机条形码”可以指包括本公开的标记的多核苷酸序列。随机条形码可以是可以用于随机条形码编码的多核苷酸序列。随机条形码可以用于定量样品中的靶标。随机条形码可以用于控制在标记与靶标相关联后可能发生的错误。例如，随机条形码可以用于评估扩增或测序错误。与靶标相关联的随机条形码可以称为随机条形码-靶标或随机条形码-标签-靶标。
如本文所用，术语“基因特异性随机条形码”可以指包含标记和基因特异性靶结合区域的多核苷酸序列。随机条形码可以是可用于随机条形码编码的多核苷酸序列。随机条形码可以用于定量样品中的靶标。随机条形码可以用于控制在标记与靶标相关联后可能发生的错误。例如，随机条形码可以用于评估扩增或测序错误。与靶标相关联的随机条形码可以被称为随机条形码-靶标或随机条形码-标签-靶标。
如本文所用，术语“随机条形码编码”可以指核酸的随机标记(例如，条形码编码)。随机条形码编码可以利用递归泊松策略来关联和定量与靶标相关联的标记。如本文所用，术语“随机条形码编码”可以与“随机标记”互换使用。
如这里所使用的，术语“靶标”可以指可以与条形码(例如，随机条形码)相关联的组合物。通过所公开的方法、装置和系统进行分析的示例性的合适靶标包括寡核苷酸、DNA、RNA、mRNA、微RNA和tRNA等。靶标可以是单链或双链的。在一些实施方案中，靶标可以是蛋白质、肽或多肽。在一些实施方案中，靶标是脂质。如本文所用，“靶标”可以与“物种”互换使用。
如本文所用，术语“逆转录酶”可以指具有逆转录酶活性(即，催化从RNA模板合成DNA)的一组酶。一般而言，此类酶包括但不限于：逆转录病毒逆转录酶，逆转录转座子逆转录酶，逆转录质粒逆转录酶，逆转录子(retron)逆转录酶，细菌逆转录酶，来源于II组内含子的逆转录酶，以及它们的突变体、变体或衍生物。非逆转录病毒逆转录酶包括：非LTR逆转录转座子逆转录酶，逆转录质粒逆转录酶，逆转录子逆转录酶，以及II组内含子逆转录酶。II组内含子逆转录酶的实例包括乳酸乳球菌LI.LtrB内含子逆转录酶、细长嗜热链球菌TeI4c内含子逆转录酶或嗜热脂肪地芽孢杆菌GsI-IIC内含子逆转录酶。其他类别的逆转录酶可以包括许多类别的非逆转录病毒逆转录酶(即逆转录子、II组内含子和产生多样性的逆转录因子等)。
术语“通用衔接子引物”、“通用引物衔接子”或“通用衔接子序列”可互换使用，指可以用于与条形码(例如，随机条形码)杂交以生成基因特异性条形码的核苷酸序列。通用衔接子序列可以是例如在本公开的方法中使用的所有条形码中通用的已知序列。例如，当使用本文公开的方法标记多个靶标时，每个靶标特异性序列可以连接到相同的通用衔接子序列。在一些实施方案中，在本文公开的方法中可以使用多于一种的通用衔接子序列。例如，当使用本文公开的方法标记多个靶标时，至少两个靶标特异性序列与不同的通用衔接子序列连接。通用衔接子引物及其互补物可以被包含在两个寡核苷酸中，其中一个包含靶标特异性序列而另一个包含条形码。例如，通用衔接子序列可以是寡核苷酸的包含靶标特异性序列的一部分，以产生与靶核酸互补的核苷酸序列。包含条形码和通用衔接子序列的互补序列的第二寡核苷酸可以与所述核苷酸序列杂交并产生靶标特异性条形码(例如，靶标特异性随机条形码)。在一些实施方案中，通用衔接子引物具有与本公开的方法中使用的通用PCR引物不同的序列。
条形码
条形码编码，例如随机条形码编码，已经在例如Fu等人，Proc Natl Acad SciU.S.A.，2011年5月31日，108(22)：9026-31；公开号US2011/0160078的美国专利申请；Fan等人，Science，2015年2月6日，347(6222)：1258367；公开号US2015/0299784的美国专利申请；公开号WO2015/031691的PCT申请中进行了描述，这些中每一个的内容，包括任何支持或补充的信息或材料，通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，本文公开的条形码可以是随机条形码，其可以是可以用于随机地将标记(例如，条形码、标签)加于靶标的多核苷酸序列。条形码可以被称为随机条形码，如果所述随机条形码的不同条形码序列的数量与要标记的任何靶标的存在数量之比可以为或约为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1，或是这些值中任意两个值之间的数字或范围。靶标可以是mRNA物种，其包括具有相同或几乎相同的序列的mRNA分子。条形码可以被称为随机条形码，如果所述随机条形码的不同条形码序列的数量与要标记的任何靶标的存在数量之比至少或最多为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或100:1。随机条形码的条形码序列可以称为分子标记。
条形码，例如随机条形码，可以包括一个或更多个标记。示例性标记可以包括通用标记、细胞标记、条形码序列(例如，分子标记)、样品标记、板标记、空间标记(spatiallabel)和/或前空间标记(pre-spatial label)。图1图示了具有空间标记的示例性条形码104。条形码104可以包括可以将条形码连接至固体支持物105的5’胺。条形码可以包含通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和/或分子标记。条形码中不同的标记(包括但不限于通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和分子标记)的顺序可以变化。例如，如图1所示，通用标记可以是最5’端的标记，并且分子标记可以是最3’端的标记。空间标记、维度标记和细胞标记可以为任意顺序。在一些实施方案中，通用标记、空间标件、维度标记、细胞标记和分子标记为任意顺序。条形码可以包括靶结合区域。靶结合区域可以与样品中的靶标(例如，靶核酸、RNA、mRNA、DNA)相互作用。例如，靶结合区域可以包括可以与mRNA的poly(A)尾相互作用的oligo(dT)序列。在一些情况下，条形码的标记(例如，通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和条形码序列)可以用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个核苷酸分隔开。
标记，例如细胞标记，可以包含特有的核酸子序列的组，所述核酸子序列具有定义长度，例如每个有七个核苷酸(相当于一些汉明纠错码(Hamming error correction code)中使用的比特数)，其可以被设计为提供纠错能力。包含七个核苷酸序列的纠错子序列的组可以被设计使得该组中序列的任何成对组合表现出定义的“遗传距离”(或失配碱基的数量)，例如，纠错子序列的组可以被设计成表现出三个核苷酸的遗传距离。在这种情况下，针对标记的靶核酸分子对所述序列数据的组中的纠错序列的审查(下面更全面地描述)可以允许人们检测或纠正扩增或测序错误。在一些实施方案中，用于创建纠错码的核酸子序列的长度可以改变，例如，它们的长度可以是或约为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、31、40、50或这些值中的任意两个值之间的数量或范围的核苷酸。在一些实施方案中，可以使用其他长度的核酸子序列创建纠错码。
条形码可以包括靶结合区域。靶结合区域可以与样品中的靶标相互作用。靶标可以是或包括：核糖核酸(RNA)、信使RNA(mRNA)、微RNA、小干扰RNA(siRNA)、RNA降解产物、各自包含poly(A)尾的RNA，或它们的任意组合。在一些实施方案中，多个靶标可以包括脱氧核糖核酸(DNA)。
在一些实施方案中，靶结合区域可以包括能够与mRNA的poly(A)尾相互作用的oligo(dT)序列。条形码的一个或更多个标记(例如通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和条形码序列(例如分子标记))可以通过间隔子与条形码的另外一个或两个其余标记分隔开。间隔子可以是例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多个核苷酸。在一些实施方案中，条形码的标记都没有被间隔子分隔开。
通用标记
条形码可以包括一个或更多个通用标记。在一些实施方案中，对于附接于给定固体支持物的一组条形码中的所有条形码，所述一个或更多个通用标记可以是相同的。在一些实施方案中，对于附接于多个珠粒的所有条形码，一个或更多个通用标记可以是相同的。在一些实施方案中，通用标记可以包含能够与测序引物杂交的核酸序列。测序引物可以用于对包含通用标记的条形码进行测序。测序引物(例如通用测序引物)可以包括与高通量测序平台相关联的测序引物。在一些实施方案中，通用标记可以包含能够与PCR引物杂交的核酸序列。在一些实施方案中，通用标记可以包含能够与测序引物和PCR引物杂交的核酸序列。能够与测序引物或PCR引物杂交的通用标记的核酸序列可以称为引物结合位点。通用标记可以包含可以用于启动条形码转录的序列。通用标记可以包含可以用于条形码或条形码内的区域的延伸的序列。通用标记的长度可以是或约为1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或者这些值中的任意两个值之间的数字或范围的核苷酸。例如，通用标记可以包含至少约10个核苷酸。通用标记的长度可以至少为或最多为1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200或300个核苷酸。在一些实施方案中，可切割的接头或经修饰的核苷酸可以是通用标记序列的一部分，以使条形码能够被从支持物上切割下来。
维度标记
条形码可以包括一个或更多个维度标记。在一些实施方案中，维度标记可以包括这样的核酸序列，其提供关于其中发生了标记(例如，随机标记)的维度的信息。例如，维度标记可以提供关于靶标被条形码编码的时间的信息。维度标记可以与样品中的条形码编码(例如，随机条形码编码)的时间相关联。维度标记可以在标记时间被活化。不同的维度标记可以在不同的时间活化。维度标记提供关于其中靶标、靶标群组和/或样品被条形码编码的顺序的信息。例如，可以在细胞周期的G0阶段对细胞群进行条形码编码。可以在细胞周期的G1阶段再次用条形码(例如，随机条形码)脉冲触发细胞。可以在细胞周期的S阶段再次用条形码脉冲触发细胞，依此类推。在每一脉冲触发(例如，细胞周期的每一阶段)中的条形码可以包含不同的维度标记。通过这种方式，维度标记提供了有关在细胞周期的哪个阶段标记了哪些靶标的信息。维度标记可以查询许多不同的生物时间。示例性生物时间可以包括但不限于细胞周期、转录(例如，转录起始)和转录物降解。在另一个实例中，可以在用药物和/或疗法处理之前和/或之后标记样品(例如，细胞、细胞群)。不同靶标拷贝数的变化可以表明样品对药物和/或疗法的响应。
维度标记可以是可活化的。可活化的维度标记可以在特定的时间点被活化。所述可活化标记可以被例如持续活化(例如，不关闭)。可活化的维度标记可以例如被可逆地活化(例如，可活化的维度标记可以打开和关闭)。例如，维度标记可以被可逆地活化至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。维度标记可以被可逆地活化，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。在一些实施方案中，可以利用荧光，光，化学事件(例如，另一分子的切割、连接，添加修饰(例如，聚乙二醇化、类泛素化(sumoylated)、乙酰化、甲基化、去乙酰化、去甲基化)，光化学事件(例如，光笼(photocaging))和非天然核苷酸的引入使维度标记活化。
在一些实施方案中，维度标记可以对于附接于给定固体支持物(例如珠粒)的所有条形码(例如，随机条形码)是相同的，但对于不同的固体支持物(例如，珠粒)是不同的。在一些实施方案中，同一固体支持物上至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的条形码可以包含相同的维度标记。在一些实施方案中，同一固体支持物上至少60％的条形码可以包含相同的维度标记。在一些实施方案中，同一固体支持物上至少95％的条形码可以包含相同的维度标记。
在多个固体支持物(例如珠粒)中可以有多达106个或更多的特有维度标记序列。维度标记的长度可以是或约是1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或者这些值中的任意两个之间的数字或范围的核苷酸。维度标记的长度可以至少是或最多是1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200或300个核苷酸。维度标记可以包含约5至约200个核苷酸。维度标记可以包含约10至约150个核苷酸。维度标记的长度可以包含约20至约125个核苷酸。
空间标记
条形码可以包括一个或更多个空间标记。在一些实施方案中，空间标记可以包括这样的核酸序列，其提供了关于与条形码相关联的靶标分子的空间取向的信息。空间标记可以与样品中的坐标相关联。坐标可以是固定坐标。例如，坐标可以是参照基板而固定的。空间标记可以参照二维或三维网格。可以参照标志(landmark)而固定坐标。标志可以是在空间中可识别的。标志可以是可以成像的结构。标志可以是生物结构，例如解剖学标志。标志可以是细胞标志，例如细胞器。标志可以是非自然标志，诸如这样的结构，其具有可识别的标识，诸如颜色代码、条形码、磁性、荧光、放射性或特有的尺寸或形状。空间标记可以与物理分区(例如，孔、容器或液滴)相关联。在一些实施方案中，一起使用多个空间标记来编码空间中的一个或更多个位置。
空间标记可以对于附接于给定固体支持物(例如珠粒)的所有条形码是相同的，但对于不同的固体支持物(例如珠粒)是不同的。在一些实施方案中，相同固体支持物上包含相同空间标记的条形码的百分比可以是或约为60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％，或者这些值中的任意两个值之间的数字或范围。在一些实施方案中，在相同固体支持物上包含相同空间标记的条形码的百分比可以至少是或至多是60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％。在一些实施方案中，相同固体支持物上至少60％的条形码可以包含相同的空间标记。在一些实施方案中，相同固体支持物上至少95％的条形码可以包含相同的空间标记。
在多个固体支持物(例如珠粒)中可以呈现多达106个或更多的特有空间标记序列。空间标记的长度可以是或约是1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或者这些值中任意两个值之间的数量或范围的核苷酸。空间标记的长度可以是至少或最多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200或300个核苷酸。空间标记可以包含约5至约200个核苷酸。空间标记可以包含约10至约150个核苷酸。空间标记的长度可以包含约20至约125个核苷酸。
细胞标记
条形码(例如，随机条形码)可以包括一个或更多个细胞标记。在一些实施方案中，细胞标记可以包括这样的核酸序列，其提供了用于确定哪个靶核酸源自哪个细胞的信息。在一些实施方案中，细胞标记对于附接于给定固体支持物(例如珠粒)的所有条形码是相同的，但对于不同固体支持物(例如珠粒)是不同的。在一些实施方案中，在相同固体支持物上包含相同细胞标记的条形码的百分比可以是或约是60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％，或者这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，在相同固体支持物上包含相同细胞标记的条形码的百分比可以是或约是60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％。例如，相同固体支持物上至少60％的条形码可以包含相同的细胞标记。作为另一个示例，相同固体支持物上至少95％的条形码可以包含相同的细胞标记。
在多个固体支持物(例如珠粒)中可以呈现多达106个或更多的特有细胞标记序列。细胞标记的长度可以是或约是1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或者这些值中任意两个值之间的数量或范围的核苷酸。细胞标记的长度可以至少是或最多是1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200或300个核苷酸。例如，细胞标记可以包含约5至约200个核苷酸。作为另一个示例，细胞标记可以包含约10至约150个核苷酸。作为又一个示例，细胞标记的长度可以包括约20至约125个核苷酸。
条形码序列
条形码可以包括一个或更多个条形码序列。在一些实施方案中，条形码序列可以包括这样的核酸序列，其提供了与条形码杂交的特定类型的靶核酸物种的识别信息。条形码序列可以包括这样的的核酸序列，其为与条形码(例如，靶结合区域)杂交的靶核酸物种的特定事件提供计数器(例如，提供粗略近似值)。
在一些实施方案中，多样化的条形码序列的组被附接到给定的固体支持物(例如，珠粒)。在一些实施方案中，可以有或约有102、103、104、105、106、107、108、109、或这些值中任意两个值之间的数量或范围的特有分子标记序列。例如，多个条形码可以包括具有不同序列的约6561个条形码序列。作为另一个示例，多个条形码可以包括具有不同序列的约65536个条形码序列。在一些实施方案中，可以至少有或至多有102、103、104、105、106、107、108或109个特有的条形码序列。所述特有的分子标记序列可以被附接到给定的固体支持物(例如珠粒)。在一些实施方案中，颗粒(例如水凝胶珠粒)部分或完全地包括所述特有的分子标记序列。
条形码的长度在不同的实施方式中可能不同。例如，条形码的长度可以是或约是1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或者这些值中任意两个值之间的数量或范围的核苷酸。作为另一个示例，条形码的长度可以至少是或最多是1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200或300个核苷酸。
分子标记
条形码(例如，随机条形码)可以包括一个或更多个分子标记。分子标记可以包括条形码序列。在一些实施方案中，分子标记可以包括这样的核酸序列，其提供与条形码杂交的特定类型的靶核酸物种的识别信息。分子标记可以包括这样的核酸序列，其为与条形码(例如，靶结合区域)杂交的靶核酸物种的特定事件提供计数器。
在一些实施方案中，多样化的分子标记的组被附接到给定的固体支持物(例如，珠粒)。在一些实施方案中，可以有或约有102、103、104、105、106、107、108、109或这些值中任意两个值之间的数量或范围的特有分子标记序列。例如，多个条形码可以包括具有不同序列的约6561个分子标记。作为另一个示例，多个条形码可以包括具有不同序列的约65536个分子标记。在一些实施方案中，可以至少有或至多有102、103、104、105、106、107、108或109个特有的分子标记序列。具有特有分子标记序列的条形码可以被附接到给定的固体支持物(例如珠粒)。
对于使用多个随机条形码的条形码编码(例如随机条形码编码)，不同分子标记序列的数量与任意靶标存在数量之比可以是或约是1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1或这些值中任意两个值之间的数量或范围。靶标可以是mRNA物种，其包括具有相同或几乎相同序列的mRNA分子。在一些实施方案中，不同分子标记序列的数量与任意靶标的存在数量之比至少是或最多是1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或100:1。
分子标记的长度可以是或约是1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或这些值中任意两个值之间的数量或范围的核苷酸。分子标记的长度可以至少是或最多是1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200或300个核苷酸。
靶结合区域
条形码可以包括一个或更多个靶结合区域，如捕获探针。在一些实施方案中，靶结合区域可以与感兴趣的靶标杂交。在一些实施方案中，靶结合区域可以包括这样的核酸序列，其与靶标(例如，靶核酸、靶分子、例如要分析的细胞核酸)特异性地杂交，例如与特定的基因序列杂交。在一些实施方案中，靶结合区域可以包括能够与特定靶核酸的特定位置附接(例如，杂交)的核酸序列。在一些实施方案中，靶结合区域可以包括能够与限制酶位点突出端(例如，EcoRI突出粘端)特异性杂交的核酸序列。然后条形码可以连接到包含与限制性位点突出端互补的序列的任意核酸分子。
在一些实施方案中，靶结合区域可以包含非特异性靶向核酸序列。非特异性靶向核酸序列可以指可以与多个靶核酸结合的序列，而与靶核酸的特异性序列无关。例如，靶结合区域可以包括无规多聚体序列、poly(dA)序列、poly(dT)序列、poly(dG)序列、poly(dC)序列或它们的组合。例如，靶结合区域可以是与mRNA分子上的poly(A)尾杂交的oligo(dT)序列。无规多聚体序列可以是例如任意长度的随机二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体或更高的多聚体序列。在一些实施方案中，靶结合区域对于附接到给定珠粒的所有条形码是相同的。在一些实施方案中，附接于给定珠粒的多个条形码的靶结合区域可以包括两个或更多个不同的靶结合序列。靶结合区域的长度可以是或约是5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或者这些数值中任意两个值之间的数量或范围的核苷酸。靶结合区域的长度可以至多是约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个核苷酸。例如，可以使用逆转录酶(如莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶)对mRNA分子进行逆转录，以生成具有poly(dC)尾的cDNA分子。条形码可以包括带有poly(dG)尾的靶结合区域。在条形码的poly(dG)尾与cDNA分子的poly(dC)尾之间的碱基配对之后，逆转录酶将模板链从细胞RNA分子切换到条形码，并继续复制到条形码5’端。通过这样做，得到的cDNA分子在cDNA分子3’端上包含条形码序列(如分子标记)。
在一些实施方案中，靶结合区域可以包括能够与包含多腺苷酸化端的mRNA杂交的oligo(dT)。靶标结合区可以是基因特异性的。例如，靶结合区域可以被配置为与靶标的特定区域杂交。靶结合区域的长度可以是或约是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或这些值中任意两个值之间的数量或范围的核苷酸。靶结合区域的长度可以至少是或最多是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。靶结合区域的长度可以为约5-30个核苷酸。当条形码包括基因特异性靶结合区域时，该条形码在本文中可以被称为基因特异性条形码。
取向特性
随机条形码(例如，随机条形码)可以包括一种或更多种可以用于定向(例如，对齐)条形码的取向特性。条形码可以包含用于等电聚焦的部分(moiety)。不同的条形码可以包括不同的等电聚焦点。当这些条形码被引入样品时，样品可以经历等电聚焦，以便将条形码定向为已知方式。通过这种方式，可以使用取向特性开发样品中已知的条形码图谱。示例性取向特性可以包括电泳迁移率(例如，基于条形码的尺寸)、等电点、自旋、导电性和/或自组装。例如，具有自组装取向特性的条形码在活化后可以自组装成特定取向(例如，核酸纳米结构)。
亲和特性
条形码(例如，随机条形码)可以包括一种或更多种亲和特性。例如，空间标记可以包括亲和特性。亲和特性可以包括化学和/或生物的部分(moiety)，其可以促进条形码与另一个实体(例如，细胞受体)的结合。例如，亲和特性可以包括抗体，例如对样品上的特定的部分(例如受体)具有特异性的抗体。在一些实施方案中，抗体可以将条形码引导至特定的细胞类型或分子。可以对特定细胞类型或分子处和/或附近的靶标进行标记(例如，随机标记)。在一些实施方案中，亲和特性还可以提供除了空间标记的核苷酸序列之外的空间信息，因为抗体可以将条形码引导至特定位置。抗体可以是治疗性抗体，例如单克隆抗体或多克隆抗体。抗体可以是人源化的或嵌合的。抗体可以是裸抗体或融合抗体。
抗体可以是全长(即，天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组方法形成的)免疫球蛋白分子(例如IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即特异性结合)部分，如抗体片段。
抗体片段可以是例如抗体的一部分，诸如F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和sFv等。在一些实施方案中，抗体片段可以与被全长抗体识别的相同抗原结合。抗体片段可以包括由抗体可变区组成的分离片段，诸如由重链和轻链可变区组成的“Fv”片段，以及其中轻链和重链可变区通过肽接头连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)。示例性抗体可以包括但不限于癌细胞抗体、病毒抗体、结合到细胞表面受体(CD8、CD34、CD45)的抗体和治疗性抗体。
通用衔接子引物
条形码可以包括一种或更多种通用衔接子引物。例如，基因特异性条形码(如基因特异性随机条形码)可以包含通用衔接子引物。通用衔接子引物可以指在所有条形码中通用的核苷酸序列。可以使用通用衔接子引物构建基因特异性条形码。通用衔接子引物的长度可以是或约是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或在这些中的任意两个之间的数量或范围的核苷酸。通用衔接子引物的长度可以至少是或最多是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。通用衔接子引物的长度可以为5-30个核苷酸。
接头
当条形码包含多于一种类型的标记(例如，多于一种细胞标记或多于一种条形码序列，例如一个分子标记)时，所述标记可以插入有接头标记序列。接头标记序列的长度可以至少是约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个核苷酸。接头标记序列的长度最多可以是约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个核苷酸。在一些情况下，接头标记序列的长度为12个核苷酸。接头标记序列可以用于促进条形码的合成。接头标记可以包括纠错(例如，汉明(Hamming))码。
固体支持物
在一些实施方案中，本文公开的条形码(例如随机条形码)可以与固体支持物相关联。固体支持物可以是例如合成颗粒。在一些实施方案中，部分或全部的条形码序列，例如固体支持物上的多个条形码(例如，第一多个条形码)的用于随机条形码(例如，第一条形码序列)的分子标记至少有一个核苷酸不同。相同固体支持物上条形码的细胞标记可以相同。不同固体支持物上条形码的细胞标记可以至少有一个核苷酸不同。例如，第一固体支持物上的第一多个条形码的第一细胞标记可以具有相同的序列，并且第二固体支持物上的第二多个条形码的第二细胞标记可以具有相同的序列。第一固体支持物上的第一多个条形码的第一细胞标记和第二固体支持物上的第二多个条形码的第二细胞标记可以至少有一个核苷酸不同。细胞标记可以长为例如约5-20个核苷酸。条形码序列可以长为例如约5-20个核苷酸。所述合成颗粒可以是例如珠粒。
珠粒可以是例如硅胶珠粒、可控孔径玻璃珠粒、磁性珠粒、Dynabead、Sephadex/Sepharose珠粒、纤维素珠粒、聚苯乙烯珠粒或它们的任意组合。珠粒可以包括以下材料：诸如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁性、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅树脂、或它们的任意组合。
在一些实施方案中，珠粒可以是聚合物珠粒，例如可变形的珠粒或凝胶珠粒，其用条形码或随机条形码功能化(例如来自10X Genomic(加利福利亚，旧金山)的凝胶珠粒)。在一些实施方式中，凝胶珠粒可以包括基于聚合物的凝胶。凝胶珠粒可以例如通过将一种或更多种聚合物前体封装成液滴来产生。当聚合物前体暴露于加速剂(例如，四甲基乙二胺(TEMED))时，可以生成凝胶珠粒。
在一些实施方案中，颗粒可以是可破坏的(例如，可溶解的、可降解的)。例如，聚合物珠粒可以在所需条件下溶解、熔化或降解。所需条件可以包括环境条件。所需条件可以导致聚合物珠粒以受控方式溶解、熔化或降解。由于化学刺激、物理刺激、生物刺激、热刺激、磁刺激、电刺激、光刺激或它们的任意组合，凝胶珠粒可以溶解、熔化或降解。
分析物和/或试剂，例如寡核苷酸条形码，例如，可以偶联/固定到凝胶珠粒的内表面(例如，通过寡核苷酸条形码和/或用于产生寡核苷酸条形码的材料的扩散可接近的内部)和/或凝胶珠粒或本文所述的任何其他微囊的外表面。偶联/固定可以经由任何形式的化学键合(例如，共价键、离子键)或物理现象(例如，范德华力、偶极-偶极相互作用等)。在一些实施方案中，试剂偶联/固定到凝胶珠粒或本文所述的任何其他微囊可以是可逆的，诸如，例如经由不稳定部分(labile moiety)(例如，经由化学交联剂，其包括本文描述的化学交联剂)。在施加刺激时，不稳定部分可以被切割并且固定的试剂得以释放。在一些实施方案中，不稳定部分是二硫键。例如，在寡核苷酸条形码经由二硫键固定到凝胶珠粒的情况下，将二硫键暴露于还原剂可以切割二硫键并使寡核苷酸条形码从珠粒上释放。可以包括不稳定部分作为凝胶珠粒或微囊的一部分、作为将试剂或分析物连接到凝胶珠粒或微囊的化学接头的一部分、和/或作为试剂或分析物的一部分。在一些实施方案中，多个条形码中的至少一个条形码可以被固定在颗粒上、部分固定在颗粒上、封闭在颗粒中、部分封闭在颗粒中，或者是它们的任意组合。
在一些实施方案中，凝胶珠粒可以包括多种不同的聚合物，包括但不限于：聚合物、热敏聚合物、光敏聚合物、磁性聚合物、pH敏感聚合物、盐敏感聚合物、化学敏感聚合物、聚电解质、多糖、肽、蛋白质和/或塑料。聚合物可以包括但不限于以下材料：诸如聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚(苯乙烯磺酸盐)(PSS)、聚(烯丙胺)(PAAm)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚(乙烯亚胺)(PEI)、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(PDADMAC)、聚(吡咯)(PPy)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVPON)、聚(乙烯基吡啶)(PVP)、聚(甲基丙烯酸)(PMAA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚苯乙烯(PS)、聚(四氢呋喃)(PTHF)、聚(邻苯二甲酸)(PTHF)、聚(己基紫精)(PHV)、聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚(L-精氨酸)(PARG)，聚(乳酸-乙醇酸共聚物)(PLGA)。
许多化学刺激可以用于触发珠粒的破坏、溶解或降解。这些化学变化的实例可以包括但不限于pH介导的珠壁的变化、珠壁通过交联键的化学切割而崩解、珠壁的触发解聚以及珠壁转换反应。体型改变(bulk change)也可用于触发珠粒的破坏。
在将囊体设计成释放试剂方面，通过各种刺激进行的微囊的体型或物理变化也提供了许多优势。体型或物理变化发生在宏观尺度上，其中珠粒破裂是由刺激引起的机械物理力的结果。这些过程可以包括但不限于压力引起的破裂、珠壁熔化或珠壁孔隙率的变化。
生物刺激也可以用于触发珠粒的破坏、溶解或降解。通常，生物触发类似于化学触发，但许多示例使用生物分子，或在生命系统中常见的分子，诸如酶、肽、糖类、脂肪酸和核酸等。例如，珠粒可以包含具有肽交联的聚合物，所述肽交联对特定蛋白酶的切割敏感。更具体地，一个实例可以包括包含GFLGK肽交联的微囊。在添加了生物触发剂如蛋白酶组织蛋白酶B时，壳孔的肽交联被切割，珠粒的内容物得以释放。在其他情况下，蛋白酶可以被热活化。在另一个示例中，珠粒包括含有纤维素的壳壁。添加壳聚糖水解酶用作生物触发剂实现纤维素键切割、壳壁解聚和其内部内容物的释放。
还可以在施加热刺激时诱导珠粒释放其内容物。温度的变化可能导致珠粒发生各种变化。热量的变化可以导致珠粒熔化，从而使珠壁崩解。在其他情况下，热量可以使珠粒内部成分的内部压力增大，从而使珠粒破裂或爆裂。在其他情况下，热量可以使珠粒转变成收缩的脱水状态。热量也可以作用于珠壁内的热敏聚合物从而导致珠粒破裂。
将磁性纳米颗粒包含在微囊的珠壁中可以触发珠粒的破裂并引导珠粒排列成阵列。本公开的装置可以包括用于任意目的的磁性珠粒。在一个示例中，将Fe3O4纳米颗粒掺入含有聚电解质的珠粒中会在存在振荡磁场刺激的情况下触发破裂。
珠粒也可以由于电刺激而破坏、溶解或降解。与上一节中描述的磁性颗粒类似，电灵敏珠粒既可以触发珠粒破裂，也可以实现其他功能，例如在电场中对齐、导电性或氧化还原反应。在一个示例中，包含电敏材料的珠粒在电场中对齐，从而可以控制内部试剂的释放。在其他示例中，电场可以引起珠壁本身内的氧化还原反应，这可以增大孔隙率。
也可用使用光刺激来破坏珠粒。许多光触发剂能做到，并且可以包括使用各种分子的系统，例如能够吸收特定波长范围的光子的纳米颗粒和发色团。例如，金属氧化物涂层可以用作囊体触发剂。对涂覆有SiO2的聚电解质囊体进行紫外线照射可以导致珠壁崩解。在又一示例中，可以在珠壁中掺入光开关材料例如偶氮苯基团。在应用紫外线或可见光时，这些化学物质在吸收光子后会经历可逆的顺反异构化。在这方面，在应用光触发剂时，纳入光子开关可得到可以分解或变得更加多孔的珠壁。
例如，在图2所示的条形码(例如，随机条形码)的非限制性示例中，在方框208处将诸如单个细胞的细胞引入到微孔阵列的多个微孔之后，在方框212处可以将珠粒引入到微孔阵列的多个微孔中。每个微孔可以包括一个珠粒。珠粒可以包括多个条形码。条形码可以包含附接到珠粒的5'胺区域。条形码可包括通用标记、条形码序列(例如分子标记)、靶结合区或其任何组合。
本文公开的条形码可以关联(例如，附着到)固体支持物(例如，珠粒)。与固体支持物相关联的条形码可各自包含选自包含带有特有序列的至少100或1000个条形码序列的组的条形码序列。在一些实施方案中，与固体支持物相关联的不同条形码可包括具有不同序列的条形码。在一些实施方案中，一定百分比的与固体支持物相关联的条形码包含相同的细胞标记。例如，该百分比可以是或大约是60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％，或者这些值中的任意两个之间的数字或范围。作为另一示例，该百分比可以是至少或至多60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％。在一些实施方案中，与固体支持物相关联的条形码可具有相同的细胞标记。与不同固体支持物相关的条形码可以具有选自带有特有序列的至少100或1000个细胞标记的不同细胞标记。
本文公开的条形码可以关联(例如，附着到)固体支持物(例如，珠粒)。在一些实施方案中，可以用固体支持物对样品中的多个靶标进行条形码编码，该固体支持物包括与多个条形码相关联的多个合成颗粒。在一些实施方案中，固体支持物可包括与多个条形码相关联的多个合成颗粒。不同固体支持物上的多个条形码的空间标记可以相差至少一个核苷酸。例如，固体支持物可以包括二维或三维的多个条形码。合成颗粒可以是珠粒。珠粒可以是硅胶珠粒、可控孔玻璃珠粒、磁珠粒、Dynabeads、Sephadex/Sepharose珠粒、纤维素珠粒、聚苯乙烯珠粒或它们的任何组合。固体支持物可包括聚合物、基质、水凝胶、针阵列装置、抗体或其任何组合。在一些实施方案中，固体支持物可以是自由漂浮的。在一些实施方案中，固体支持物可以嵌入半固体或固体阵列中。条形码可能未与固体支持物关联。条形码可以是单个核苷酸。条形码可以与底物相关联。
如本文所用，术语“拴系的”、“附着的”和“固定的”可互换使用，并且可以指用于将条形码附着到固体支持物的共价或非共价方式。各种不同的固体支持物中的任何一种都可以用于附接预先合成的条形码的固体支持物或用于条形码的原位固相合成的固体支持物。
在一些实施方案中，固体支持物是珠粒。珠粒可以包括一种或更多种类型的固体、多孔或空心球体、球、轴承、圆柱体或其他类似的结构，核酸可以(例如，共价或非共价)固定于其上。珠粒可以例如由塑料、陶瓷、金属、聚合材料或其任何组合构成。珠粒可以是或包含球形的离散颗粒(例如微球)或具有非球形或不规则形状，如立方体、长方体、棱锥体、圆柱形、圆锥形、长方形或圆盘形等的离散颗粒。在一些实施方案中，珠粒的形状可以是非球形的。
珠粒可包含多种材料，包括但不限于顺磁性材料(例如镁、钼、锂和钽)、超顺磁性材料(例如铁氧体(Fe3O4；磁铁矿)纳米颗粒)、铁磁性材料(例如、铁、镍、钴、它们的一些合金和一些稀土金属化合物)、陶瓷、塑料、玻璃、聚苯乙烯、二氧化硅、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶(Sepharose)、琼脂糖、水凝胶、聚合物、纤维素、尼龙、或其任何组合。
在一些实施方案中，珠粒(例如，标记所附着的珠粒)是水凝胶珠粒。在一些实施方案中，珠粒包括水凝胶。
本文公开的一些实施方案包括一种或更多种颗粒(例如珠粒)。每个颗粒可以包含多个寡核苷酸(例如，条形码)。多个寡核苷酸中的每一个可以包含条形码序列(例如，分子标记序列)、细胞标记和靶结合区(例如，oligo(dT)序列、基因特异性序列、无规多聚体或其组合)。多个寡核苷酸中的每一个的细胞标记序列可以相同。不同颗粒上寡核苷酸的细胞标记序列可以不同，从而可以识别不同颗粒上的寡核苷酸。在不同的实现方式中，不同细胞标记序列的数量可以不同。在一些实施方案中，细胞标记序列的数量可以是或大约为10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、106、107、108、109、这些值中的任意两个值之间的数值或者范围，或者更多。在一些实施方案中，细胞标记序列的数量可以是至少或最多10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、106、107、108或109。在一些实施方案中，多个颗粒中的不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000个或更多个包括具有相同细胞序列的寡核苷酸。在一些实施方案中，包含具有相同细胞序列的寡核苷酸的多个颗粒可以是至多0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多。在一些实施方案中，多个颗粒中没有一个具有相同的细胞标记序列。
每个颗粒上的多个寡核苷酸可以包含不同的条形码序列(例如，分子标记)。在一些实施方案中，条形码序列的数量可以是或大约为10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、106、107、108、109或这些值中的任意两个值之间的数值或者范围。在一些实施方案中，条形码序列的数量可以是至少或最多10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、106、107、108或109。例如，多个寡核苷酸序列中的至少100个包括不同的条形码序列。作为另一个例子，在单个颗粒中，至少100、500、1000、5000、10000、15000、20000、50000、这些值中的任意两个之间的数量或范围、或更多个寡核苷酸中的更多个包含不同的条形码序列。一些实施方案提供了多个包含条形码的颗粒。在一些实施方案中，待标记的靶标与不同条形码序列的存在(或拷贝或数量)之比可为至少1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90或更多。在一些实施方案中，多个寡核苷酸中的每一个还包含样品标记、通用标记或两者。颗粒可以是例如纳米颗粒或微粒。
珠粒的尺寸可以变化。例如，珠粒的直径可以在0.1微米到50微米的范围内。在一些实施方案中，珠粒的直径可以是或大约为0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50微米，或这些值中的任意两个之间的数值或范围。
珠粒的直径可以与衬底的孔的直径有关。在一些实施方案中，珠粒的直径可以比孔的直径长或短达或大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或这些值中任意两个之间的数值或范围。珠粒的直径可以与细胞的直径(例如，被基板的孔捕获的单个细胞)的直径相关。在一些实施方案中，珠的直径可以比孔的直径长或短至少或最多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。珠粒的直径可以与细胞(例如，被基板的孔捕获的单个细胞)的直径相关。在一些实施方案中，珠的直径可以比细胞的直径长或短达或大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％或这些值中任意两个之间的数值或范围。在一些实施方案中，珠粒的直径可以比细胞直径长或短至少或最多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％或300％。
珠粒可以附接到和/或嵌入到衬底中。珠粒可以附接和/或嵌入凝胶、水凝胶、聚合物和/或基质中。珠粒在基质(例如凝胶、基质、支架或聚合物)内的空间位置可以使用珠粒上条形码上存在的空间标记来识别，该标记可以用作定位地址。
珠粒的实例可以包括但不限于链霉亲和素珠粒、琼脂糖珠粒、磁性珠粒、
Figure BDA0003255081130000391
微珠、抗体缀合珠粒(例如抗免疫球蛋白微珠粒)、蛋白A缀合珠粒、蛋白G缀合珠粒、蛋白A/G缀合珠粒、蛋白L缀合珠粒、oligo(dT)缀合珠粒、二氧化硅珠粒、二氧化硅样珠粒、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠和BcMagTM端羧基磁性珠粒。
珠粒可以与量子点或荧光染料相关联(例如，一起浸渍)以使其在一个荧光光学通道或多个光学通道中发荧光。珠粒可以与氧化铁或氧化铬结合，使其具有顺磁性或铁磁性。珠粒可以被识别。例如，可以使用相机对珠粒进行成像。珠粒可以具有与珠粒相关联的可检测代码。例如，珠粒可以包括条形码。例如，由于在有机或无机溶液中溶胀，珠粒可以改变尺寸。珠粒可以是疏水的。珠粒可以是亲水的。珠粒可以是生物相容的。
固体支持物(例如，珠粒)可以被可视化。固体支持物可以包含可视化标签(例如，荧光染料)。可以将固体支持物(例如珠粒)蚀刻带有标识符(例如，号码)。可以通过对珠粒进行成像来可视化标识符。
固体支持物可包含不溶性、半溶性或不溶性材料。当固体支持物包括与其连接的接头、支架、结构单元或其他反应性部分时，可称之为“功能化的”，而当固体支持物缺乏与其连接的此类反应性部分时，可称之为“非功能化的”。固体支持物可以在溶液中自由使用，例如以微量滴定孔形式；以流通形式，如在柱中；或在量油尺中。
固体支持物可以包括膜、纸、塑料、涂敷表面、平坦表面、玻璃、载玻片、芯片或它们的任何组合。固体支持物可以采用树脂、凝胶、微球或其他几何构型的形式。固体支持物可以包括二氧化硅芯片、微粒、纳米颗粒、板、阵列、毛细管、扁平支持物例如玻璃纤维过滤器、玻璃表面、金属表面(钢、金、银、铝、硅和铜)、玻璃支持物、塑料支持物、硅支持物、芯片、过滤器、膜、微孔板、载玻片、塑料材料，包括多孔板或膜(例如，由聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚偏二氟乙烯形成)，和/或晶片、梳子、针或针(例如，适用于组合合成或分析的针)或在平坦表面的凹坑或纳升孔阵列中的珠粒，所述平坦表面如晶片(例如，硅晶片)、带有或不带有过滤器底部的凹坑的晶片。
固体支持物可以包含聚合物基质(例如，凝胶、水凝胶)。聚合物基质可能能够渗透细胞内空间(例如，细胞器周围)。聚合物基质可以能够被泵送至整个循环系统。
基板和微孔阵列
如本文所用，基板可以指一种类型的固体支持物。基板可指可包含本公开的条形码或随机条形码的固体支持物。例如，基板可以包括多个微孔。例如，基板可以是包括两个或更多个微孔的孔阵列。在一些实施方案中，微孔可包括限定体积的小反应室。在一些实施方案中，微孔可以截留一个或更多个细胞。在一些实施方案中，微孔可以仅截留一个细胞。在一些实施方案中，微孔可以截留一个或更多个固体支持物。在一些实施方案中，微孔可以仅截留一个固体支持物。在一些实施方案中，微孔截留单个细胞和单个固体支持物(例如，珠粒)。微孔可包含本公开的条形码试剂。
条形码编码方法
本公开提供了用于估算物理样品(例如，组织、器官、肿瘤、细胞)中不同位置处的不同靶标的数量的方法。该方法可以包括将条形码(例如，随机条形码)放置在紧靠着样品的位置、裂解该样品、将不同的靶标与条形码相关联、扩增所述靶标和/或对所述靶标进行数字化计数。该方法还可以包括对条形码上的空间标签获得的信息进行分析和/或可视化。在一些实施方案中，一种方法包括使样品中的多个靶标可视化。将多个靶标映射到样本图上可以包括生成样本的二维图或三维图。二维图和三维图可以在对样本中的多个靶标进行条形码编码(例如，随机条形码)之前或之后生成。使样品中的多个靶标可视化可包括将多个靶标映射到样品的图上。将多个靶标映射到样本图上可以包括生成样本的二维图或三维图。二维图和三维图可以在对样本中的多个靶标进行条形码编码之前或之后生成。在一些实施方案中，二维图和三维图可以在裂解样品之前或之后生成。在生成二维图或三维图之前或之后裂解样品可包括加热样品、将样品与去污剂接触、改变样品的pH值或其任何组合。
在一些实施方案中，对多个靶标进行条形码编码包括将多个条形码与多个靶标杂交以产生条形码编码的靶标(例如，随机条形码编码的靶标)。对多个靶标进行条形码编码可以包括生成条形码编码的靶标的索引库。可以用包含多个条形码(例如，随机条形码)的固体支持物来生成条形码编码的靶标的索引库。
样品和条形码接触
本公开提供了用于接触样品(例如，细胞)到本公开的基板。包含例如细胞、器官或组织薄切片的样品可以与条形码(例如，随机条形码)接触。例如，可以通过重力流接触细胞，其中所述细胞可以沉降并形成单层。样品可以是组织薄切片。薄切片可以放置在基板上。样品可以是一维的(例如，形成平面)。样品(例如，细胞)可以例如，通过在基板上生长/培养细胞而散布在整个基板上。
当条形码紧密接近靶标时，靶标可以与条形码杂交。可以以非耗竭性的比例接触条形码，使得每个不同的靶标可以与本公开的不同的条形码相关联。为了确保靶标和条形码之间的有效关联，靶标可以与条形码交联。
细胞裂解
在布设好细胞和条形码之后，可以裂解细胞以释放靶分子。细胞裂解可以通过多种方式例如，通过化学或生化方式、通过渗透性休克、或通过热裂解、机械裂解或光学裂解中的任一种来完成。可以通过添加细胞裂解缓冲液来裂解细胞，所述细胞裂解缓冲液包含去污剂(例如，SDS、十二烷基硫酸锂、Triton X-100、Tween-20或NP-40)、有机溶剂(例如，甲醇或丙酮)，或消化酶(例如蛋白酶K、胃蛋白酶或胰蛋白酶)或其任何组合。为了增加靶标和条形码的关联，可以通过例如降低温度和/或增加裂解物的粘度来改变靶分子的扩散速率。
在一些实施方案中，可以使用滤纸裂解样品。可以在滤纸上面用裂解缓冲液浸泡滤纸。滤纸可以在压力下施加到样品上，这可以促进样品的裂解和样品的靶标与底物的杂交。
在一些实施方案中，裂解可以通过机械裂解、热裂解、光学裂解和/或化学裂解进行。化学裂解可包括使用消化酶，如蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶。裂解可以通过向底物中加入裂解缓冲液来进行。裂解缓冲液可包含Tris HCl。裂解缓冲液可包含至少约0.01、0.05、0.1、0.5或1M或更多的Tris HCl。裂解缓冲液可包含至多约0.01、0.05、0.1、0.5或1M或更多的Tris HCL。裂解缓冲液可包含约0.1M Tris HCl。裂解缓冲液的pH值可以是至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高。裂解缓冲液的pH值可以是至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液的pH值为约7.5。裂解缓冲液可包含盐(例如，LiCl)。裂解缓冲液中盐的浓度可为至少约0.1、0.5或1M或更高。裂解缓冲液中盐的浓度可以是至多约0.1、0.5或1M或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液中盐的浓度为约0.5M。裂解缓冲液可包含去污剂(例如，SDS、十二烷基硫酸锂、triton X、吐温、NP-40)。裂解缓冲液中去污剂的浓度可为至少约0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％或7％或更大。裂解缓冲液中去污剂的浓度最多可为约0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％或7％或更大。在一些实施方案中，裂解缓冲液中去污剂的浓度为约1％十二烷基硫酸锂。裂解方法中使用的时间可能取决于所用去污剂的量。在一些实施方案中，使用的去污剂越多，裂解所需的时间越少。裂解缓冲液可包含螯合剂(例如，EDTA、EGTA)。裂解缓冲液中螯合剂的浓度可为至少约1、5、10、15、20、25或30mM或更高。裂解缓冲液中螯合剂的浓度可为至多约1、5、10、15、20、25或30mM或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液中螯合剂的浓度为约10mM。裂解缓冲液可以包含还原剂(例如，β-巯基乙醇，DTT)。裂解缓冲液中还原剂的浓度可为至少约1、5、10、15或20mM或更高。裂解缓冲液中还原剂的浓度可为至多约1、5、10、15或20mM或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液中还原剂的浓度为约5mM。在一些实施方案中，裂解缓冲液可包含约0.1M TrisHCl、约pH 7.5、约0.5M LiCl、约1％十二烷基硫酸锂、约10mM EDTA和约5mM DTT。
裂解可以在约4、10、15、20、25或30℃的温度下进行。裂解可以进行约1、5、10、15或20分钟或更多分钟。裂解的细胞可包含至少约100000、200000、300000、400000、500000、600000或700000个或更多个靶核酸分子。裂解的细胞可包含至多约100000、200000、300000、400000、500000、600000或700000或更多个靶核酸分子。
将条形码附接至靶核酸分子
在细胞裂解并从其释放核酸分子之后，核酸分子可以随机地与共定位的固体支持物的条形码相关联。关联可以包括条形码的靶识别区域与靶核酸分子的互补部分的杂交(例如，条形码的oligo(dT)可以与靶标的poly(A)尾相互作用)。可以选择用于杂交的测定条件(例如，缓冲液pH值、离子强度、温度等)促进形成特定的、稳定的杂交体。在一些实施方案中，从裂解的细胞释放的核酸分子可以与底物上的多个探针结合(例如，与底物上的探针杂交)。当探针包含oligo(dT)时，mRNA分子可以与探针杂交并被逆转录。寡核苷酸的oligo(dT)部分可以作为cDNA分子第一链合成的引物。例如，在图2所示的条形码的非限制性示例中，在方框216处，mRNA分子可以与珠粒上的条形码杂交。例如，单链核苷酸片段可以与条形码的靶结合区杂交。
附接还可以包括条形码的靶识别区域和靶核酸分子的一部分的连接。例如，靶结合区可以包含能够与限制性位点突出端(例如，EcoRI突出粘端)特异性杂交的核酸序列。测定程序还可包括用限制酶(例如，EcoRI)处理靶核酸以产生限制性位点突出端。然后可以将条形码与包含与限制性位点突出端互补的序列的任何核酸分子连接。连接酶(例如，T4 DNA连接酶)可用于连接两个片段。
例如，在图2所示的条形码的非限制性示例中，在方框220，来自多个细胞(或多个样品)的标记靶标(例如靶标-条形码分子)可以随后汇集到例如管中。标记的靶标可以通过例如检索条形码和/或靶标-条形码分子所附接的珠粒来汇集。
可以通过使用磁性珠粒和外部施加的磁场来实现对附接的靶标条形码分子的基于固体支持物的集合的检索。一旦汇集了靶标-条形码分子，所有进一步的处理都可以在单个反应容器中进行。进一步处理可包括例如逆转录反应、扩增反应、切割反应、解离反应和/或核酸延伸反应。可以在微孔内进行进一步的处理反应，即，无需首先汇集来自多个细胞的已标记的靶核酸分子。
逆转录或核酸延伸
本公开提供了一种使用逆转录(例如，在图2的框224处)或核酸延伸来产生靶标-条形码缀合物的方法。靶标-条形码缀合物可包含条形码和全部或部分靶核酸(即，条形码编码的cDNA分子，例如随机条形码编码的cDNA分子)的互补序列。通过逆转录引物和逆转录酶一起添加，可以进行相关RNA分子的逆转录。逆转录引物可以是oligo(dT)引物、随机六核苷酸引物或靶特异性寡核苷酸引物。Oligo(dT)引物的长度可以是或可以是大约12-18个核苷酸，并与哺乳动物mRNA 3'端的内源性poly(A)尾结合。随机六核苷酸引物可以在各种互补位点与mRNA结合。靶特异性寡核苷酸引物通常选择性地引发感兴趣的mRNA。
在一些实施方案中，mRNA分子逆转录为标记的RNA分子可以通过添加逆转录引物而进行。在一些实施方案中，逆转录引物是寡(dT)引物、随机六核苷酸引物或靶特异性寡核苷酸引物。通常，oligo(dT)引物的长度为12-18个核苷酸，并与哺乳动物mRNA 3'端的内源性poly(A)尾结合。随机六核苷酸引物可以在各种互补位点与mRNA结合。靶特异性寡核苷酸引物通常选择性地引发感兴趣的mRNA。
在一些实施方案中，靶标是cDNA分子。例如，可以使用逆转录酶(如莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶)对mRNA分子进行逆转录，以生成具有聚(dC)尾的cDNA分子。条形码可以包括带有聚(dG)尾的靶结合区域。在条形码的poly(dG)尾和cDNA分子的poly(dC)尾之间碱基配对后，逆转录酶将模板链从细胞RNA分子切换到条形码，并继续复制到条形码的5'端。通过这样做，得到的cDNA分子包含cDNA分子3'端的条形码序列(如分子标记)。
逆转录可以重复进行以产生多个标记的cDNA分子。本文公开的方法可以包括进行至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个逆转录反应。该方法可包括进行至少约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个逆转录反应。
扩增
可以进行一个或多个核酸扩增反应(例如，在图2的框228)以产生标记的靶核酸分子的多个拷贝。可以以多重方式进行扩增，其中同时扩增多个靶核酸序列。扩增反应可用于向核酸分子添加测序接头(adaptor)。如果存在，扩增反应可以包括扩增样品标记的至少一部分。扩增反应可以包括扩增细胞标记和/或条形码序列(例如，分子标记)的至少一部分。扩增反应可以包括扩增样品标签、细胞标记、空间标记、条形码序列(例如，分子标记)、靶核酸或其组合的至少一部分。扩增反应可以包括扩增多个核酸的0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、100％或这些值中的任意两个之间的数值或范围。该方法还可以包括进行一个或多个cDNA合成反应以产生一个或多个靶标条形码分子的cDNA拷贝，包括样品标记、细胞标记、空间标记和/或条形码序列(例如，分子标记).
在一些实施方案中，可以使用聚合酶链反应(PCR)进行扩增。如本文所用，PCR可以指通过DNA互补链的同时引物延伸来体外扩增特定DNA序列的反应。如本文所用，PCR可包括反应的衍生形式，包括但不限于RT-PCR、实时PCR、嵌套PCR、定量PCR、多重PCR、数字PCR和组装PCR。
标记核酸的扩增可包括基于非PCR的方法。基于非PCR的方法的例子包括但不限于多重置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、实时SDA、滚环扩增或环到环扩增。其他基于非PCR的扩增方法包括多个循环的DNA依赖性RNA聚合酶驱动的RNA转录扩增或RNA引导的DNA合成和转录以扩增DNA或RNA靶标、连接酶链反应(LCR)和Qβ复制酶(Qβ)方法，使用回文探针，链置换扩增，使用限制性内切核酸酶的寡核苷酸驱动扩增，一种扩增方法，其中引物与核酸序列杂交并且在延伸反应和扩增之前切割所得双链体，使用缺乏5'核酸外切酶活性的核酸聚合酶进行链置换扩增、滚环扩增和分枝延伸扩增(RAM)。在一些实施方案中，扩增不产生环化转录物。
在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包括对标记的核酸(例如，标记的RNA、标记的DNA、标记的cDNA)进行聚合酶链反应以产生标记的扩增子(例如，随机标记的扩增子)。标记的扩增子可以是双链分子。双链分子可包括双链RNA分子、双链DNA分子或与DNA分子杂交的RNA分子。双链分子的一条或两条链可以包含样品标记、空间标记、细胞标记和/或条形码序列(例如，分子标签)。标记的扩增子可以是单链分子。单链分子可包含DNA、RNA或其组合。本公开的核酸可以包括合成的或改变的核酸。
扩增可包括使用一种或更多种非天然核苷酸。非天然核苷酸可包括光不稳定或可触发的核苷酸。非天然核苷酸的实例可包括但不限于肽核酸(PNA)、吗啉代和锁核酸(LNA)，以及乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。可以将非天然核苷酸添加到扩增反应的一个或多个循环中。可添加非天然核苷酸来鉴定扩增反应中的特定循环或时间点的产物。
进行一个或多个扩增反应可以包括使用一个或多个引物。一种或更多种引物可包含例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个或更多个核苷酸。一种或更多种引物可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15或更多个核苷酸。一种或更多种引物可包含少于12-15个核苷酸。一种或更多种引物可以与多个标记的靶标(例如，随机标记的靶标)的至少一部分退火。一个或多个引物可以与多个标记靶标的3'端或5'端退火。一种或更多种引物可以与多个标记靶标的内部区域退火。内部区域可以是来自多个标记靶标的3'端的至少约50、100、150、200、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、650、700、750、800、850、900或1000个核苷酸。一个或多个引物可以包括一组固定的引物。一种或更多种引物可包括至少一种或更多种定制引物。一种或更多种引物可包含至少一种或更多种对照引物。一种或更多种引物可包含至少一种或更多种基因特异性引物。
一种或更多种引物可以包括通用引物。通用引物可以与通用引物结合位点退火。一个或多个定制引物可以与第一样品标记、第二样品标记、空间标记、细胞标记、条形码序列(例如，分子标记)、靶标或其任何组合退火。一种或更多种引物可包括通用引物和定制引物。可以设计定制引物以扩增一个或多个靶标。靶标可包含一个或多个样品中的总核酸的子集。靶标可以包括一个或多个样品中全部标记靶标的子集。一种或更多种引物可包含至少96种或更多种定制引物。一种或更多种引物可包含至少960种或更多种定制引物。一种或更多种引物可包含至少9600种或更多种定制引物。一种或更多种定制引物可以与两种或更多种不同的标记核酸退火。两种或更多种不同的标记核酸可以对应于一种或更多种基因。
在本公开的方法中可以使用任何扩增方案。例如，在一个方案中，第一轮PCR可以使用基因特异性引物和针对通用Illumina测序引物1序列的引物扩增附接在珠粒上的分子。第二轮PCR可以使用侧翼为Illumina测序引物2序列的嵌套基因特异性引物和针对通用Illumina测序引物1序列的引物扩增第一PCR产物。第三轮PCR加入P5和P7以及样本索引，将PCR产物转化为Illumina测序文库。使用150bp x 2测序的测序可以揭示read1上上的细胞标记和条形码序列(例如，分子标签)、read2上的基因以及index1 read上的样本索引。
在一些实施方案中，可以使用化学切割从底物去除核酸。例如，核酸中存在的化学基团或修饰的碱基可用于促进其从固体支持物上的去除。例如，可以使用酶从底物去除核酸。例如，可以通过限制性内切核酸酶消化从底物中去除核酸。例如，用尿嘧啶-d-糖基化酶(UDG)处理含有dUTP或ddUTP的核酸可用于从底物中去除核酸。例如，可以利用执行核苷酸切除的酶，如碱基切除修复酶，如无嘌呤/无嘧啶(AP)核酸内切酶，从底物中去除核酸。在一些实施方案中，可以使用光可裂解基团和光从底物上去除核酸。在一些实施方案中，可切割接头可用于从底物去除核酸。例如，可切割接头可包含生物素/亲和素、生物素/链霉亲和素、生物素/中性亲和素、Ig-蛋白A、光不稳定接头、酸或碱不稳定接头基团或适体中的至少一种。
当探针是基因特异性的时，分子可以与探针杂交并被逆转录和/或扩增。在一些实施方案中，在核酸被合成(例如，逆转录)之后，它可以被扩增。可以以多重方式进行扩增，其中同时扩增多个靶核酸序列。扩增可以向核酸添加测序接头。
在一些实施方案中，可以在衬底上进行扩增，例如，使用桥式扩增。cDNA可以是均聚物加尾，以便利用在底物上的oligo(dT)探针产生用于桥式扩增的相容性末端。在桥式扩增中，与模板核酸3'端互补的引物可以是每对中与固体颗粒共价附接的第一引物。当含有模板核酸的样品与颗粒接触并进行单次热循环时，模板分子可以与第一引物退火，第一引物通过添加核苷酸在正向延伸形成由模板分子和与模板互补的新形成的DNA链组成的双链分子。在下一个循环的加热步骤中，双链分子可以变性，从颗粒中释放模板分子，并留下通过第一引物附接在颗粒上的互补DNA链。在随后的退火和延伸步骤的退火阶段，互补链可以与第二引物杂交，该第二引物与互补链在从第一引物去除的位置处的区段互补。这种杂交可以导致互补链在通过共价键固定到第一引物和通过杂交固定到第二引物在第一和第二引物之间形成桥。在延伸阶段，第二引物可以通过在同一反应混合物中加入核苷酸而反向延伸，从而将桥转变为双链桥。然后开始下一个循环，双链桥可以变性产生两条单链核酸分子，每条核酸分子的一端分别通过第一和第二引物连接到颗粒表面，另一端未连接。在第二个循环的退火和延伸步骤中，每条链都可以与同一颗粒上先前未使用的另一条互补引物杂交，以形成新的单链桥。现在杂交的两个以前未使用的引物伸长以将两个新桥转换为双链桥。
扩增反应可以包括扩增多个核酸的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或100％。
标记核酸的扩增可包括基于PCR的方法或基于非PCR的方法。标记核酸的扩增可包括标记核酸的指数型扩增。标记核酸的扩增可包括标记核酸的线性扩增。可以通过聚合酶链反应(PCR)进行扩增。PCR可以指通过同时引物延伸DNA互补链来体外扩增特定DNA序列的反应。PCR可以包括反应的衍生形式，包括但不限于RT-PCR、实时PCR、嵌套PCR、定量PCR、多重PCR、数字PCR、抑制PCR、半抑制PCR和组装PCR。
在一些实施方案中，标记核酸的扩增包括基于非PCR的方法。基于非PCR的方法的例子包括但不限于多重置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、实时SDA、滚环扩增或环到环扩增。其他基于非PCR的扩增方法包括DNA依赖性RNA聚合酶驱动的RNA转录扩增或RNA引导的DNA合成和转录的多个循环以扩增DNA或RNA靶标、连接酶链反应(LCR)、Qβ复制酶(Qβ)，使用回文探针，链置换扩增，使用限制性内切核酸酶的寡核苷酸驱动扩增，一种扩增方法，其中引物与核酸序列杂交，并且在延伸反应和扩增之前切割所得双链体，使用缺乏5'核酸外切酶活性的核酸聚合酶进行链置换扩增、滚环扩增和/或分枝延伸扩增(RAM)。
在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包括对扩增的扩增子(例如，靶标)进行嵌套聚合酶链反应。扩增子可以是双链分子。双链分子可包括双链RNA分子、双链DNA分子或与DNA分子杂交的RNA分子。双链分子的一条或两条链可以包含样品标签或分子标识符标记。或者，扩增子可以是单链分子。单链分子可包含DNA、RNA或其组合。本发明的核酸可以包含合成的或改变的核酸。
在一些实施方案中，该方法包括重复扩增标记的核酸以产生多个扩增子。本文公开的方法可包括进行至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个扩增反应。或者，该方法包括进行至少约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个扩增反应。
扩增还可以包括将一种或更多种对照核酸添加到一种或更多种包含多种核酸的样品中。扩增还可以包括将一种或更多种对照核酸添加到多种核酸中。对照核酸可包含对照标记。
扩增可包括使用一种或更多种非天然核苷酸。非天然核苷酸可包括光不稳定和/或可触发核苷酸。非天然核苷酸的实例包括但不限于肽核酸(PNA)、吗啉代和锁核酸(LNA)，以及乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。可以将非天然核苷酸添加到扩增反应的一个或更多个循环中。可添加非天然核苷酸来鉴定扩增反应中的特定循环或时间点的产物。
进行一种或更多种扩增反应可以包括使用一种或更多种引物。一种或更多种引物可包含一种或更多种寡核苷酸。一种或更多种寡核苷酸可包含至少约7-9个核苷酸。一种或更多种寡核苷酸可包含少于12-15个核苷酸。一种或更多种引物可以与多种标记核酸的至少一部分退火。一个或更多个引物可以与多个标记核酸的3'端和/或5'端退火。一个或更多个引物可以与多种标记核酸的内部区域退火。内部区域可以是来自多个标记核酸的3'端的至少约50、100、150、200、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、650、700、750、800、850、900或1000个核苷酸。一个或更多个引物可以包括一组固定的引物。一种或更多种引物可包括至少一种或更多种定制引物。一种或更多种引物可包含至少一种或更多种对照引物。一种或更多种引物可包含至少一种或更多种管家基因引物。一种或更多种引物可包括通用引物。通用引物可以与通用引物结合位点退火。一个或多个定制引物可以与第一样品标签、第二样品标签、分子标识符标记、核酸或其产物退火。一种或更多种引物可包括通用引物和定制引物。可以设计定制引物以扩增一种或更多种靶核酸。靶核酸可包含一个或多个样品中的总核酸的子集。在一些实施方案中，引物是附接到本公开的阵列的探针。
在一些实施方案中，对样品中的多个靶标进行条形码编码(例如，随机条形码编码)还包括生成条形码编码靶标(例如，随机条形码编码靶标)或条形码编码的靶标片段的索引库。不同条形码的条形码序列(例如，不同随机条形码的分子标记)可以彼此不同。生成条形码编码靶标的索引库包括：从样品中的多个靶标生成多个索引多核苷酸。例如，对于包含第一索引靶标和第二索引靶标的条形码编码靶标的索引库，第一索引多核苷酸的标记区域可以与第二索引多核苷酸的标记区域相差、约、至少、或最多相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50个或这些值中的任意两个值之间的数量或范围的核苷酸。在一些实施方案中，生成条形码编码靶标的索引库包括：使多个靶标例如mRNA分子与包括poly(T)区和标记区的多个寡核苷酸接触；并使用逆转录酶进行第一链合成以产生单链的标记cDNA分子，每个标记cDNA分子包含cDNA区和标记区，其中多个靶标包括不同序列的至少两个mRNA分子，并且多个寡核苷酸包括不同序列的至少两个寡核苷酸。生成条形码编码靶标的索引库还可以包括扩增单链标记cDNA分子以产生双链标记cDNA分子；并对双链标记cDNA分子进行嵌套PCR，以产生标记的扩增子。在一些实施方案中，该方法可以包括产生经衔接子标记的扩增子。
条形码编码(例如，随机条形码编码)可以包括使用核酸条形码或标签来标记个体核酸(例如，DNA或RNA)分子。在一些实施方案中，它涉及在cDNA分子从mRNA产生时向它们添加DNA条形码或标签。可以执行嵌套PCR以使PCR扩增偏差最小化。可以添加衔接子以利用例如新一代测序(NGS)进行测序。例如在图2的框232处，测序结果可以用于确定细胞标记、分子标记和靶标的一个或多个拷贝的核苷酸片段的序列。
图3是示意图，其显示了生成条形码编码靶标(例如，随机条形码编码靶标)的索引库的非限制示例性方法，所述靶标诸如条形码编码的mRNA或其片段。如在步骤1中所示，逆转录过程可以利用特有的分子标记序列、细胞标记序列和通用PCR位点对每个mRNA分子进行编码。特别地，通过一组条形码(例如，随机条形码)310与RNA分子302的poly(A)尾区域308的杂交(例如，随机杂交)，RNA分子302可以被逆转录以产生标记的cDNA分子304，其包括cDNA区域306。每个条形码310可以包括靶结合区域，例如poly(dT)区域312、标记区域314(例如，条形码序列或分子)和通用PCR区域316。
在一些实施方案中，细胞标记序列可以包括3至20个核苷酸。在一些实施方案中，分子标记序列可以包括3至20个核苷酸。在一些实施方案中，多个随机条形码中的每一个进一步包括通用标记和细胞标记中的一个或更多个，其中，对于固体支持物上的多个随机条形码，通用标记是相同的，并且对于固体支持物上的多个随机条形码，细胞标记是相同的。在一些实施方案中，通用标记可以包括3至20个核苷酸。在一些实施方案中，细胞标记包括3至20个核苷酸。
在一些实施方案中，标记区域314可以包括条形码序列或分子标记318和细胞标记320。在一些实施方案中，标记区域314可以包括通用标记、维度标记和细胞标记中的一个或更多个。条形码序列或分子标记318的长度可以是、可以约是、可以至少是或可以最多是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或这些值中任意值之间的数量或范围的核苷酸。细胞标记320的长度可以是、可以约是、可以至少是或可以最多是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或这些值中任意值之间的数量或范围的核苷酸。通用标记的长度可以是、可以约是、可以至少是或可以最多是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或这些值中任意值之间的数量或范围的核苷酸。对于固体支持物上的多个随机条形码，通用标记可以是相同的，并且对于固体支持物上的多个随机条形码，细胞标记是相同的。维度标记的长度可以是、可以约是、可以至少是或可以最多是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或这些值中任意值之间的数量或范围的核苷酸。
在一些实施方案中，标记区域314可以包括、约包括、至少包括、或至多包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000个或这些值中任意值之间的数量或范围的不同的标记，诸如条形码序列或分子标记318和细胞标记320。每个标记的长度可以是、可以约是、可以至少是或可以最多是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或这些值中任意值之间的数量或范围的核苷酸。条形码或随机条形码310的组可以包含、约包含、至少包含或最多可以为10、20、40、50、70、80、90、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1020个或这些值中的任意值之间的数量或范围的条形码或随机条形码310。例如，条形码或随机条形码310的组可以各自包含特有的标记区域314。标记的cDNA分子304可以被纯化以去除多余的条形码或随机条形码310。纯化可以包括Ampure珠粒纯化。
如步骤2所示，可以将来自步骤1中逆转录过程的产物汇集到1个管中，并使用第一PCR引物池和第一通用PCR引物进行PCR扩增。由于特有的标记区域314，汇集(pooling)是可行的。特别地，标记的cDNA分子304可以被扩增以产生嵌套PCR标记的扩增子322。扩增可以包括多重PCR扩增。扩增可以包括以单个反应体积用96个多重引物进行的多重PCR扩增。在一些实施方案中，在单个反应体积中，多重PCR扩增可以利用、利用约、利用至少或利用最多10、20、40、50、70、80、90、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1020或这些值中的任意值之间的数量或范围的多重引物。扩增可以包括使用包含靶向特定基因的定制引物326A-C的第一PCR引物池324和通用引物328。定制引物326可以与标记的cDNA分子304的cDNA部分306’内的区域杂交。通用引物328可以与标记的cDNA分子304的通用PCR区域316杂交。
如图3的步骤3所示，步骤2中PCR扩增的产物可以用嵌套PCR引物池和第二通用PCR引物进行扩增。嵌套PCR可以使PCR扩增偏差最小化。特别地，嵌套PCR标记的扩增子322可以进一步通过嵌套PCR进行扩增。所述嵌套PCR可以包括在单个反应体积中利用嵌套PCR引物332a-c的嵌套PCR引物池330和第二通用PCR引物328’的多重PCR。嵌套PCR引物池328可以包含、包含约、包含至少或包含最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或这些值中任意值之间的数量或范围的不同的嵌套PCR引物330。嵌套PCR引物332可以包含衔接子334并与标记扩增子322的cDNA部分306”内的区域杂交。通用引物328’可以包含衔接子336并与标记扩增子322的通用PCR区316杂交。因此，步骤3产生了衔接子标记的扩增子338。在一些实施方案中，嵌套PCR引物332和第二通用PCR引物328’可以不包含衔接子334和336。相反，衔接子334和336可以被连接到嵌套PCR的产物以产生衔接子标记的扩增子338。
如步骤4所示，可以使用文库扩增引物对步骤3的PCR产物进行PCR扩增以进行测序。特别地，可以利用衔接子334和336对衔接子标记的扩增子338进行一种或更多种其他测定。衔接子334和336可以与引物340和342杂交。一种或更多种引物340和342可以是PCR扩增引物。一种或更多种引物340和342可以是测序引物。可以使用一种或更多种衔接子334和336进一步对衔接子标记的扩增子338进行扩增。可以使用一种或更多种衔接子334和336对衔接子标记的扩增子338进行测序。引物342可以包含板索引(plate index)344使得利用相同组的条形码或随机条形码310生成的扩增子可以在使用新一代测序(NGS)的一个测序反应中来测序。
与寡核苷酸相关联的细胞成分结合试剂
本文公开的一些实施方案提供了多种组合物，每种组合物包含与寡核苷酸缀合的细胞成分结合试剂(例如蛋白质结合试剂)，其中，寡核苷酸包含与其缀合的细胞成分结合试剂的特有识别物。细胞成分结合试剂(如条形码编码的抗体)及其用途(如细胞的样本索引)已在美国专利申请公开US2018/0088112和美国专利申请公开US2018/0346970中进行了描述；这些中的每一个的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，细胞成分结合试剂能够特异性地结合到细胞成分靶标。例如，细胞成分结合试剂的结合靶标可以是或包括碳水化合物、脂质、蛋白质、细胞外蛋白质、细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T-细胞受体、主要组织相容性复合物、肿瘤抗原、受体、整联蛋白(integrin)、细胞内蛋白或它们的任意组合。在一些实施方案中，细胞成分结合试剂(例如，蛋白质结合试剂)能够特异性地结合到抗原靶标或蛋白质靶标。在一些实施方案中，每个寡核苷酸可以包含条形码，例如随机条形码。条形码可以包括条形码序列(例如，分子标记)、细胞标记、样品标记或它们的任意组合。在一些实施方案中，每个寡核苷酸可以包括接头。在一些实施方案中，每个寡核苷酸可以包含寡核苷酸探针的结合位点，如poly(A)尾。例如，poly(A)尾可以例如未锚定到固体支持物或锚定到固体支持物。poly(A)尾的长度可以为约10至50个核苷酸。在一些实施方案中，poly(A)尾的长度可以为18个核苷酸。寡核苷酸可以包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或两者。
特有识别物可以是，例如，具有任意合适长度的核苷酸序列，例如，从约4个核苷酸至约200个核苷酸。在一些实施方案中，特有识别物是长度为25个核苷酸至约45个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方案中，特有识别物的长度可以是、约是、小于、大于4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸、10个核苷酸、15个核苷酸、20个核苷酸、25个核苷酸、30个核苷酸、35个核苷酸、40个核苷酸、45个核苷酸、50个核苷酸、55个核苷酸、60个核苷酸、70个核苷酸、80个核苷酸、90个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸或者上述值中任意两个之间的范围。
在一些实施方案中，特有识别物选自多样化的特有识别物的组。多样化的特有识别物的组可以包括或包括约20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、5000个或这些值中任意两个值之间的数量或范围的不同的特有识别物。各种各样的特有识别物的组可以包括至少或包括最多20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000或5000个不同的特有识别物。在一些实施方案中，所述特有识别物的组被设计为与待分析样品的DNA或RNA序列具有最小的序列同源性。在一些实施方案中，所述特有识别物组的序列彼此或其互补序列有或约有1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸、10个核苷酸或这些值中的任意两个值之间的数量或范围的核苷酸的差异。在一些实施方案中，特有识别物组的序列彼此或其互补序列至少或最多有1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸、10个核苷酸差异。在一些实施方案中，特有识别物组的序列彼此或其互补序列有至少3％、至少5％、至少8％、至少10％、至少15％、至少20％或更多的差异。
在一些实施方案中，特有识别物可以包含引物(如，通用引物)的结合位点。在一些实施方案中，特有识别物可以包含针对引物如通用引物的至少两个结合位点。在一些实施方案中，特有识别物可以包含针对引物(如，通用引物)的至少三个结合位点。引物可以用于特有识别物的扩增，例如通过PCR扩增。在一些实施方案中，引物可以用于嵌套PCR反应。
本公开内容涵盖任意合适的细胞成分结合试剂，诸如蛋白质结合试剂、抗体或其片段、适配体、小分子、配体、肽、寡核苷酸等，或它们的任意组合。在一些实施方案中，细胞成分结合试剂可以是多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体、单链抗体(sc-Ab)或它们的片段，诸如Fab、Fv等。在一些实施方案中，多种细胞成分结合试剂可以包括或包括约20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、5000种或这些值中任意两个值之间的数量或范围的不同的细胞成分试剂。在一些实施方案中，多种细胞成分结合试剂可以包括至少或包括最多20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000或5000种不同的细胞成分试剂。
寡核苷酸可以通过各种机制与细胞成分结合试剂缀合。在一些实施方案中，寡核苷酸可以与细胞成分结合试剂共价缀合。在一些实施方案中，寡核苷酸可以与细胞成分结合试剂非共价缀合。在一些实施方案中，寡核苷酸通过接头与细胞成分结合试剂缀合。接头可以是例如可从细胞成分结合试剂和/或寡核苷酸上切割或分离的。在一些实施方案中，接头可以包括将寡核苷酸可逆地附接至细胞成分结合试剂的化学基团。所述化学基团可以例如通过胺基团与接头缀合。在一些实施方案中，接头可以包括与细胞成分结合试剂所缀合的另一化学基团形成稳定键的化学基团。例如，所述化学基团可以是紫外光可裂解基团、二硫键、链霉亲和素、生物素、胺等。在一些实施方案中，化学基团可以通过氨基酸(如赖氨酸)上的伯胺或N末端与细胞成分结合试剂缀合。市售的偶联试剂盒，如Protein-OligoConjugation Kit(蛋白-寡核苷酸偶联试剂盒，Solulink,Inc.,加利福利亚州圣迭戈)、
Figure BDA0003255081130000531
oligo conjugation system(寡核苷酸耦联系统，Innova Biosciences,英国剑桥)等可以用于将寡核苷酸与细胞成分结合试剂缀合。
寡核苷酸可以与细胞成分结合试剂(例如，蛋白质结合试剂)的任意合适位点缀合，只要它不干扰细胞成分结合试剂与其细胞成分靶标之间的特异性结合。在一些实施方案中，细胞成分结合试剂是蛋白质，例如抗体。在一些实施方案中，细胞成分结合试剂不是抗体。在一些实施方案中，寡核苷酸可以在除抗原结合位点之外的任何地方与抗体缀合，例如，Fc区、CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、CL结构域等。将寡核苷酸缀合至细胞成分结合试剂(例如抗体)的方法先前已公开，例如在美国专利6,531,283中，其内容在此通过引用明确地全文并入。寡核苷酸与细胞成分结合试剂的化学计量可以变化。为了增大测序中对细胞成分结合试剂特异性寡核苷酸进行检测的灵敏度，在缀合期间提高寡核苷酸与细胞成分结合试剂之比可能是有利的。在一些实施方案中，每一细胞成分结合试剂可以与单个寡核苷酸分子缀合。在一些实施方案中，每一细胞成分结合试剂可以与多于一个的寡核苷酸分子缀合，例如，至少，或最多，2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、1000个或这些值中任意两个值之间的数量或范围的寡核苷酸分子，其中，每个寡核苷酸分子包含相同或不同的特有识别物。在一些实施方案中，每一细胞成分结合试剂可以与多于一个寡核苷酸分子缀合，例如，至少，或最多，2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、1000个寡核苷酸分子，其中每个寡核苷酸分子包含相同或不同的特有识别物。
在一些实施方案中，多种细胞成分结合试剂能够特异性地结合至样品中的多个细胞成分靶标，诸如单个细胞、多个细胞、组织样品、肿瘤样品或血液样品等。在一些实施方案中，多个细胞成分靶标包括细胞表面蛋白、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合物、肿瘤抗原、受体或它们的任意组合。在一些实施方案中，多个细胞成分靶标可以包括细胞内细胞成分。在一些实施方案中，多个细胞成分靶标可以包括细胞内细胞成分。在一些实施方案中，多种细胞成分可以是或约为细胞或有机体中全部细胞成分(例如，蛋白质)的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或这些值中的任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，多种细胞成分可以至少是或最多为细胞或有机体中全部细胞成分(例如蛋白质)的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。在一些实施方案中，多个细胞成分靶标可以包括或包括约2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、1000、10000个或这些值中任意两个值之间的数量或范围的不同的细胞成分靶标。在一些实施方案中，多个细胞成分靶标可以包括至少或包括最多2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、1000、10000个不同的细胞成分靶标。
使用与寡核苷酸缀合的细胞成分结合试剂进行样品索引
本文所公开的包括用于样品鉴定的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：使来自多个样品中的每个样品的一个或更多个细胞与多种样品索引组合物中的样品索引组合物接触，其中一个或更多个细胞中的每一个包含一个或更多个细胞成分靶标，其中多种样品索引组合物中的每一种包含与样品索引寡核苷酸相关联的细胞成分结合试剂，其中细胞成分结合试剂能够特异性地结合到所述一个或更多个细胞成分靶标中的至少一个，其中样品索引寡核苷酸包括样品索引序列，并且其中多种样品索引组合物中的至少两种样品索引组合物的样品索引序列包括不同的序列；去除多个样品索引组合物中的未结合的样品索引组合物；使用多个条形码(例如，随机条形码)对样品索引寡核苷酸进行条形码编码(例如，随机条形码编码)以创建多个条形码编码的样品索引寡核苷酸；获得多个条形码编码的样品索引寡核苷酸的测序数据；以及基于所述多个条形码编码的样品索引寡核苷酸中的至少一个条形码编码的样品索引寡核苷酸的样品索引序列识别所述一个或更多个细胞中的至少一个细胞的样品来源。
在一些实施方案中，使用多个条形码对样品索引寡核苷酸进行条形码编码包括：使多个条形码与样品索引寡核苷酸接触以生成与样品索引寡核苷酸杂交的条形码；以及延伸与样品索引寡核苷酸杂交的条形码以生成多个条形码编码的样品索引寡核苷酸。延伸所述条形码可以包括使用DNA聚合酶延伸所述条形码以生成多个条形码编码的样品索引寡核苷酸。延伸所述条形码可以包括使用逆转录酶延伸所述条形码以生成多个条形码编码的样品索引寡核苷酸。
与抗体缀合的寡核苷酸、用于与抗体缀合的寡核苷酸或先前与抗体缀合的寡核苷酸在本文中被称为抗体寡核苷酸(“AbOligo”)。样品索引上下文中的抗体寡核苷酸在本文中被称为样品索引寡核苷酸。与抗体寡核苷酸缀合的抗体在本文中称为热抗体或寡核苷酸抗体。未与抗体寡核苷酸缀合的抗体在本文中称为冷抗体或无寡核苷酸抗体。与结合试剂(例如，蛋白质结合试剂)缀合的寡核苷酸、用于与结合试剂缀合的寡核苷酸或先前与结合试剂缀合的寡核苷酸在本文中称为试剂寡核苷酸。本文中在样品索引语境中的试剂寡核苷酸称为样品索引寡核苷酸。与抗体寡核苷酸缀合的结合试剂在本文中称为热结合试剂或寡核苷酸结合试剂。未与抗体寡核苷酸缀合的结合试剂在本文中称为冷结合试剂或无寡核苷酸结合试剂。
细胞成分和核酸靶标的同时定量分析
在一些实施方案中，本文公开的方法可以用于使用本文公开的组合物和可以将条形码序列(例如，分子标记序列)关联到细胞成分结合试剂的寡核苷酸和核酸靶标分子两者的寡核苷酸探针来同时定量分析样品中的多个细胞成分靶标(例如蛋白质靶标)和多个核酸靶标分子。同时定量分析多个细胞成分靶标和多个核酸靶标分子的其他方法在公开号US2018/0088112的美国专利申请和公开号US2018/0346970的美国专利申请中进行了描述；每件申请的内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，样品可以是单个细胞、多个细胞、组织样品、肿瘤样品或血液样品等。在一些实施方案中，样品可以包括细胞类型，诸如正常细胞、肿瘤细胞、血细胞、B细胞、T细胞、母体细胞、胎儿细胞的混合物或来自不同对象的细胞的混合物。
在一些实施方案中，样品可以包括被分离到单独隔室(如微孔阵列中的微孔或液滴)中的多个单细胞。
在一些实施方案中，多个细胞成分靶标包括细胞表面蛋白质、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、抗体、主要组织相容性复合物、肿瘤抗原、受体或它们的任意组合。在一些实施方案中，多个细胞成分靶标可以包括细胞内细胞成分。在一些实施方案中，多种细胞成分可以是或约为生物体或生物体的一个或更多个细胞中的所有细胞成分(如表达的蛋白质)的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，多种细胞成分可以至少是或最多为生物体或生物体的一个或更多个细胞中所有细胞成分(如能够被表达的蛋白质)的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。在一些实施方案中，多个细胞成分靶标可以包括或约包括2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、1000、10000个或这些值中任意两个值之间的数量或范围的不同的细胞成分靶标。在一些实施方案中，多个细胞成分靶标可以至少包括或最多包括2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、1000或10000个不同的细胞成分靶标。
在一些实施方案中，使多种细胞成分结合试剂与样品接触以与多个细胞成分靶标特异性结合。未结合的细胞成分结合试剂可以例如通过清洗去除。在样品包含细胞的实施方案中，可以去除未与细胞特异性结合的任何细胞成分结合试剂。
在一些情况下，可以将来自细胞群的细胞分离(例如，分隔)到本公开的基板的孔中。细胞群可以在分离前稀释。可以稀释细胞群使得基板的至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的孔容纳单个细胞。可以稀释细胞群使得基板的最多1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的孔容纳单个细胞。可以稀释细胞群，使得稀释群中的细胞数量是或至少是基板上的孔的数量的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。可以稀释细胞群，使得稀释群中的细胞数量是或至少是基板上的孔的数量的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在某些情况下，稀释细胞群，使得细胞数量约为基板中孔数量的10％。
单个细胞分配到基板的孔中可以遵循泊松分布。例如，可以至少有0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％或更大的概率，基板的孔具有超过一个细胞。可以至少有0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％或更大的概率，基板的孔具有超过一个细胞。单个细胞分配到基板的孔中可以是随机的。单个细胞分配到基板的孔中可以是非随机的。可以将细胞分离，使得基板的孔只容纳一个细胞。
在一些实施方案中，细胞成分结合试剂可以另外与荧光分子缀合以实现细胞的流式分选到单独的隔室中。
在一些实施方案中，本文公开的方法提供将多种组合物与样品接触以与多个细胞成分靶标特异性结合。应当理解，所使用的条件可以允许细胞成分结合试剂例如抗体与细胞成分靶标特异性结合。在接触步骤之后，可以去除未结合的组合物。例如，在样品包含细胞并且组合物特异性结合细胞成分靶标在细胞表面上(如，细胞表面蛋白质)的实施方案中，未结合的组合物可以通过用缓冲液洗涤细胞来去除，使得只有与细胞成分靶标特异性结合的组合物与细胞一起保留。
在一些实施方案中，本文公开的方法可以提供从样品例如细胞中释放多个核酸靶标分子。例如，可以裂解细胞以释放多个核酸靶标分子。细胞裂解可以通过多种方式中的任意一种来完成，例如，通过化学处理、渗透压休克、热处理、机械处理、光学处理或它们的任意组合。可以通过添加包含去污剂(例如，SDS、十二烷基硫酸锂、Triton X-100、Tween-20或NP-40)的细胞裂解缓冲液、有机溶剂(例如，甲醇或丙酮)、或消化酶(例如蛋白酶K、胃蛋白酶或胰蛋白酶)或它们的任意组合来裂解细胞。
本领域普通技术人员将理解，多个核酸分子可以包括多种核酸分子。在一些实施方案中，多个核酸分子可以包括DNA分子、RNA分子、基因组DNA分子、mRNA分子、rRNA分子、siRNA分子或它们的组合，并且可以是双链或单链的。在一些实施方案中，多个核酸分子包括或约包括100、1000、10000、20000、30000、40000、50000、100000、1000000个或这些值中的任意两个值之间的数量或范围的物种。在一些实施方案中，多个核酸分子至少包括或最多包括100、1000、10000、20000、30000、40000、50000、100000或1000000个物种。在一些实施方案中，多个核酸分子可以来自例如单个细胞或多个细胞的样品。在一些实施方案中，可以从多个样品中(如多个单细胞)中汇集所述多个核酸分子。
在一些实施方案中，本文公开的方法可以包括将条形码(例如，随机条形码)关联到多个核酸靶标分子和细胞成分结合试剂的多个寡核苷酸，所述条形码可以包括条形码序列(如分子标记)，细胞标记，样品标记等，或它们的任意组合。例如，可以使用包含随机条形码的多个寡核苷酸探针与多个核酸靶标分子和组合物的多个寡核苷酸杂交。
在一些实施方案中，多个寡核苷酸探针可以固定在固体支持物上。固体支持物可以是自由漂浮的，例如溶液中的珠粒。固体支持物可以嵌入半固体或固体阵列中。在一些实施方案中，多个寡核苷酸探针可以不固定在固体支持物上。当多个寡核苷酸探针靠近多个核酸靶标分子和细胞成分结合试剂的多个寡核苷酸时，多个核酸靶标分子和细胞成分结合试剂的多个寡核苷酸可以与寡核苷酸探针杂交。可以使寡核苷酸探针以非耗竭性的比例接触，使得每个不同的核酸靶标分子和细胞成分结合试剂的寡核苷酸可以与本公开的具有不同条形码序列(例如，分子标记)的寡核苷酸探针相关联。
在一些实施方案中，本文公开的方法提供将寡核苷酸从与细胞成分靶标特异性结合的细胞成分结合试剂分离。分离可以以多种方式进行以将所述化学基团与细胞成分结合试剂分离，如UV光裂解、化学处理(例如，二硫苏糖醇处理)、加热、酶处理或它们的任意组合。将寡核苷酸从细胞成分结合试剂分离可以在使多个寡核苷酸探针与多个杂交的步骤之前、之后或期间进行
微孔
微孔的形状和大小
微孔可以制成多种形状。非限制示例性的孔几何形状可以包括圆筒形、圆锥形、半球形、矩形或多面体(例如，由几个平面组成的三维几何形状，例如六棱柱、八棱柱、倒三角锥、倒四方锥、倒五角锥、倒六角锥或倒截锥体)。微孔可以包括结合了这些几何形状中的两个或更多个的形状。例如，微孔可以部分为圆筒形，其余部分为倒锥形。微孔可以包括两个并排的圆筒体，其中一个直径(例如，大致对应于珠粒的直径)比另一个(例如，大致对应于细胞的直径)大，它们通过沿圆筒的全长(深度)延伸的垂直通道(即平行于圆筒轴)连接。微孔开口的位置可以变化。例如，微孔的开口可以在基板的上表面。例如，微孔的开口可以在基板的下表面。微孔的封闭端(例如底部)的形状可以变化。例如，微孔的封闭端可以是平的。例如，微孔的封闭端可以具有弯曲的表面(例如，凸面或凹面)。微孔的形状和/或大小可以根据要截留在微孔内的细胞或固体支持物的类型来确定。在一些实施例中，微孔在基板平面中可以具有非圆形的横截面(例如，四方形或六边形)。
微孔可以制造成多种大小。例如，微孔大小可以用微孔的直径和/或深度来表征。微孔的直径可以参考在微孔几何形状的平面横截面内能内切的最大的圆。在一些实施方案中，微孔的直径范围可以是微孔内要截留的细胞或固体支持物的直径的约1倍至约10倍。在一些实施方案中，微孔直径可以是或约是微孔内要截留的细胞或固体支持物的直径的1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，微孔直径可以是微孔内要截留的细胞或固体支持物的至少或至多1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍。在一些实施方案中，微孔直径可以是微孔内要截留的细胞或固体支持物的直径的约2.5倍。
微孔的直径可以用绝对尺寸来指定。微孔的直径范围可以从约1纳米至约1000微米。在一些实施方案中，微孔直径可以是或约是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000微米，或这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，微孔直径可以至少是或最多是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000微米。在一些实施方案中，微孔直径可以是或约是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000微米，或这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，微孔直径可以是至少或最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000微米。在一些实施方案中，微孔直径可以为约30微米。
微孔的深度可以变化，例如以提供对液滴(例如细胞和固体支持物)的有效捕获，或提供孔内包含的测定缓冲液和其他试剂的有效交换。直径与深度之比(即纵横比)可以变化，这样一旦细胞和/或固体支持物沉降在微孔内，它们就不会因微孔上方的流体运动移位。在一些实施方案中，微孔的深度可以小于珠粒的直径。例如，微孔的深度可以是或约是珠粒直径的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％、99.9％、100％或这些值中任意两个值之间的数量或范围。例如，微孔的深度可以至少或最多是珠粒直径的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％、99.9％、100％。在一些实施方案中，诸如珠粒的合成颗粒可以突出到微孔外部。
在一些实施例中，微孔的尺寸允许微孔包含至多一个珠粒。微孔的宽度与珠粒的直径之比可以在1-1.9的范围内变化。在一些实施方案中，微孔的宽度与珠粒的直径之比可以是或约是1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9，或这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，微孔的宽度与珠粒的直径之比可以至少或最多是1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8或1.9。
微孔的尺寸可以变化，使得微孔具有足够的空间来容纳固体支持物和各种大小的细胞，而不会被微孔上方的流体运动移走。微孔的深度范围可以是微孔内要截留的细胞或固体支持物的直径的约1倍至约10倍。在一些实施方案中，微孔深度可以是或约是微孔内要截留的细胞或固体支持物的直径的1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，微孔深度可以至少或至多是微孔内要截留的细胞或固体支持物的直径的1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一些实施方案中，微孔深度可以是将微孔内要截留的细胞或固体支持物的直径的约2.5倍。
微孔的宽度与微孔的深度的纵横比可以变化，例如在0.1-2的范围内。在一些实施方案中，微孔的宽度与微孔的深度的纵横比可以是或约是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2或这些值中的任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，微孔的宽度与微孔的深度的纵横比可以至少或最多是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2。
微孔的深度可以用其绝对尺寸来指定。例如，微孔的深度可以在约1纳米至约1000微米的范围内。在一些实施方案中，微孔深度可以是或约是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000微米，或者这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，微孔深度可以至少或最多是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000微米。在一些实施方案中，微孔深度可以是或约是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000微米，或这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，微孔深度可以至少或最多是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000微米。在一些实施方案中，微孔深度可为约30微米。
微孔的容积可以变化，例如在约1皮升至约1000微升的范围内。在一些实施方案中，微孔容积可以是或约是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000皮升，或者这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，微孔容积可以至少或最多是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000皮升。在一些实施方案中，微孔容积可以是或约是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000纳升，或这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，微孔容积可以至少或最多是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000纳升。在一些实施方案中，微孔容积可以是或约是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000微升，或这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，微孔容积可以至少或最多是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000。在一些实施方案中，微孔容积可以是约1微升。
微孔的容积可以用一个微孔相对于另一微孔的容积变化来表征。微孔容积的变异系数(以百分比表示)可以在约1％至约100％的范围内。微孔容积的变异系数可以是或约是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，或者这些值中任意两个值之间的数量或范围。微孔容积的变异系数可以至少或最多是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施方案中，微孔容积的变异系数可以为约2.5％。
微孔的容积与珠粒(或可以连接条形码寡核苷酸的固体支持物的表面积)的表面积之比可以变化，例如在约2.5至约1520微米的范围内。在一些实施方案中，该比值可以是或约是2.5、5、10、100、500、750、1000、1520微米，或者这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，该比值可以至少或最多是2.5、5、10、100、500、750、1000或1520微米。在一些实施方案中，该比值可以为约67.5微米。
微孔的布置
微孔可以布置在一维、二维或三维阵列中。例如，通过层叠一系列二维或更多二维阵列，例如通过层叠两个或更多个包含微孔阵列的基板，可以获得三维阵列。
图案和微孔之间的间距可以变化以优化在每个孔中截留单个细胞和单个固体支持物(例如珠粒)的效率，以及使阵列每单位面积的孔数最大化。微孔可以按照各种随机或非随机图案分布。例如，它们可以完全随机地分布在阵列基板的表面上，或者它们可以排列成方形网格、矩形网格或六边形网格等。
在孔之间中心到中心的距离或中心到中心的间距可以在约1微米至约1000微米之间变化。在一些实施方案中，在孔之间中心到中心的距离可以是或约是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000微米，或这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，在孔之间中心到中心的距离可以是至少或最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000微米。在一些实施方案中，在孔之间中心到中心的距离可以为约4890微米。
微孔边缘之间的距离或间距可以在约1微米至约1000微米之间变化。在一些实施方案中，孔边缘之间的距离可以是或约是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000微米，或者这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，孔边缘之间的距离可以是至少或最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000微米。在一些实施方案中，孔边缘之间的距离可以为约80微米。
微孔密度
微孔阵列可以包括不同密度的微孔，例如范围从每平方英寸100个微孔到每平方英寸1000000个微孔。在一些实施方案中，微孔阵列的密度可以是或约是每平方英寸100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000个，或这些值中任意两个值之间的数量或范围的微孔。在一些实施方案中，微孔阵列的密度可以是每平方英寸至少或最多100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000或10000000个微孔。在一些实施方案中，微孔阵列的密度可以是或约是每平方厘米10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000个，或这些值中任意两个值之间的数量或范围的微孔。在一些实施方案中，微孔阵列的密度可以是每平方厘米至少或最多10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000个微孔。
基板上微孔的总数可以根据孔的图案和间距以及阵列的总体尺寸而变化。阵列中微孔的数量可以变化，例如，范围从约96到约1000000。在一些实施方案中，微阵列中的微孔数量可以是或约是96、384、1536、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、108、109，或者这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，微阵列中微孔的数量可以是至少或最多96、384、1536、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、108、109。在一些实施方案中，微孔阵列中微孔的数量可以是约96。在一些实施方案中，微孔的数量可以是约150000。
微孔基板的表面特征
微孔阵列可以包括微孔之间的表面特征，其被设计用于帮助将细胞和固体支持物引导到孔中和/或防止它们沉降在孔之间的表面上。合适的表面特征的非限制性示例包括但不限于环绕孔或横跨孔之间的表面的拱顶状、脊状或峰状的表面特征。
基板的制造技术
微孔可以使用多种制造技术中的任意一种来制造。可以使用的制造方法的非限制性示例包括块体微加工技术，诸如光刻和湿化学刻蚀、等离子体刻蚀或深反应离子刻蚀；微成型和微压花；激光微加工；使用可固化材料的3D打印或其他直接写入制造工艺；以及类似的技术。
微孔阵列可以由多种基板材料制成。材料的选择可以取决于制造技术的选择，反之亦然。合适材料的非限制性示例包括熔融石英、玻璃、聚合物(例如琼脂糖、明胶、水凝胶、聚二甲基硅氧烷(PDMS)弹性体、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、聚酰亚胺、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、环氧树脂、基于硫醇-烯的树脂，以及金属或金属膜(例如铝、不锈钢、铜、镍、铬和钛)等。亲水性材料可能是制造微孔阵列所需要的(例如，为了增强润湿性并最小化细胞与其他生物材料的非特异性结合)。能够被处理和涂覆(例如通过氧等离子体处理，或聚环氧乙烷表面层的接枝)的疏水性材料可以用于制造微孔阵列。为了促进装置中夹带的气体或气泡的毛细芯吸/排出，使用多孔、亲水性材料制造微孔阵列可能是理想的。微孔阵列可以由单一材料制成。微孔阵列可以包含已结合在一起或经机械接合的两种或更多种不同材料。
基板的形状和大小
基板可以具有各种形状和大小。例如，基板(在其中制造微孔)的形状(或平面轮廓(footprint))可以是方形、矩形、圆形或不规则形状。其大小可以用它的宽度、长度和深度来表征。
基板的宽度可以在0.1英寸至10英寸的范围内变化。在一些实施方案中，基板的宽度可以是或约是0.1、0.2、0.3、0.4、05、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10英寸，或者这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，基板的宽度可以是至少或至多0.1、0.2、0.3、0.4、05、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10英寸。基板的宽度可以在0.2厘米至20厘米的范围内变化。在一些实施方案中，基板的宽度可以是或约是0.2、0.2、0.3、0.4、05、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20厘米，或这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，基板的宽度可以是至少或至多0.2、0.3、0.4、05、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或20厘米。
基板的长度可以在0.1英寸至10英寸的范围内变化。在一些实施方案中，基板的长度可以是或约是0.1、0.2、0.3、0.4、05、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10英寸，或者这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，基板的长度可以是至少或至多0.1、0.2、0.3、0.4、05、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10英寸。基板的长度可以在0.2厘米至20厘米的范围内变化。在一些实施方案中，基板的长度可以是或约是0.2、0.2、0.3、0.4、05、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20厘米，或这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，基板的长度可以是至少或至多0.2、0.3、0.4、05、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或20厘米。
在一些实施方案中，例如由其宽度和长度限定的基板的平面轮廓可以类似于微量滴定板的平面轮廓。在一些实施方案中，微孔阵列基板的平面轮廓可以类似于标准显微镜载玻片的平面轮廓。标准显微镜载玻片的平面轮廓的非限制性示例包括约75mm长x 25mm宽(约3”长x约1”宽)和约75mm长x 50mm宽(约3”长x2”宽)。
在其内制造微孔的基板的厚度可以在约0.1mm厚至约10mm厚或更大的范围内。微孔阵列基板的厚度可以是或约是0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mm，或者这些值中任意两个值之间的数量或范围。微孔阵列基板的厚度可以是至少或至多10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、0.1mm。微孔阵列基板的厚度可为约1mm厚。微孔阵列基板的厚度可以是这些范围内的任意值，例如，微孔阵列基板的厚度可以在约0.2mm至约9.5mm之间。
微孔阵列的表面处理
可以使用各种表面处理和表面改性技术来改变微孔阵列表面的特性。实例包括但不限于：氧等离子体处理以使疏水性材料的表面更亲水，使用湿法或干法刻蚀技术以使玻璃和硅的表面光滑或粗糙，将聚环氧乙烷或其他聚合物层(例如pluronic或牛血清白蛋白)吸附或接枝到底物表面以使它们更亲水并不易于非特异性地吸附生物分子和细胞，应用硅烷反应以另外将化学反应性官能团接枝到惰性硅和玻璃的表面等。光脱保护(photodeprotection)技术可以用于选择性地激活阵列结构中特定位置处的化学反应性官能团，例如，在微孔内壁上选择性地添加或激活化学反应性官能团(例如伯胺或羧基基团)可以用于将寡核苷酸探针、肽、蛋白质或其他生物分子共价偶接到微孔的壁上。对所利用的表面处理或表面改性的选择可以取决于所需的表面特性的类型和/或制成微孔阵列的材料的类型。
微孔的密封
可以例如在细胞裂解步骤期间密封微孔的开口，以防止相邻微孔之间靶核酸的交叉杂交。可以使用例如相对微孔阵列基板表面夹紧的固体材料的柔性膜或片(即板或平板)或合适的珠粒将微孔(或微孔阵列)密封或盖住，其中珠粒的直径大于微孔的直径。
使用固体材料的柔性膜或片形成的密封件可以包括例如无机纳米孔膜(例如氧化铝)、透析膜、载玻片、盖玻片、弹性膜(例如PDMS)或亲水性聚合物膜(例如，涂有已用裂解缓冲液水合的琼脂糖薄膜的聚合物膜)。
用于盖住微孔的固体支持物(例如珠粒)可以包括本公开的任意固体支持物(例如珠粒)。在一些实施方案中，固体支持物是交联葡聚糖珠粒(例如Sephadex)。交联葡聚糖的范围可以为从约10微米至约80微米。在一些实施方案中，用于覆盖的交联葡聚糖珠粒可以是或者约是10、20、30、40、50、60、70、80微米，或者这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，用于覆盖的交联葡聚糖珠粒可以是至少或至多10、20、30、40、50、60、70或80微米。珠粒可以大于微孔的直径。在一些实施方案中，珠粒可以比或约比微孔的直径大10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，珠粒可以至少或最多比微孔的直径大10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或99％。
密封件或盖可以允许缓冲液进出微孔，同时防止大分子(例如，核酸)迁移出孔外。在一些实施方案中，通过所述密封件或盖可以阻止有或约有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或这些值中任意两个值之间的数量或范围的核苷酸的大分子迁移到微孔内或迁移出微孔外。在一些实施方案中，通过所述密封件或盖可以阻止有至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个核苷酸的大分子迁移到微孔内或迁移出微孔外。
固体支撑物的操作
可以使固体支持物(例如，合成的颗粒或珠粒)分布在基板中。可以将固体支持物分布在基板的孔中，从基板的孔中取出，或在其他方面，通过离心或其他非磁性方式运输穿过包括一个或多个微孔阵列的装置。基板的微孔可以预先装载固体支持物。基板的微孔可以容纳或可以容纳约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个固体支持物。基板的微孔可以容纳至少或最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个固体支持物。在一些实施方案中，基板的微孔可以容纳一个固体支持物。
耗材
微孔阵列可以是分析系统的消耗性组件。微孔阵列可以重复使用。微孔阵列可以被配置为用作手动执行分析的独立装置，或者它们可以被配置为包括提供分析程序的完全或部分自动化的仪器系统的固定或可拆卸组件。在所公开方法的一些实施方案中，作为分析程序的一部分，可以将基于珠粒的条形码文库放置在微孔阵列的孔中。在一些实施方案中，珠粒可以被预装载到微孔阵列的孔中并作为例如用于执行核酸靶标的条形码编码和数字化计数的试剂盒的一部分提供给用户。
两个配对的微孔阵列
在一些实施方案中，可以提供两个配对的微孔阵列，一个预装载有通过第一磁体而保持就位的珠粒，另一个供用户在装载单个细胞时使用。在将细胞分配到第二微孔阵列中后，可以将两个阵列面对面放置并移除第一磁体，同时使用第二磁体将第一阵列中的珠粒向下吸入第二阵列的相应的微孔中，从而确保珠粒位于第二微孔阵列中的细胞上方，由此将细胞裂解后靶分子的扩散损失最小化，同时最大限度地使靶分子有效地附接到珠粒上的条形码。
不带微孔的基板
在一些实施方案中，基板不包括微孔。例如，珠粒可以是组装的。例如，珠粒可以是自组装的。珠粒可以自组装成单层。所述单层可以在基板的平坦表面上。单层可以在基板的弯曲表面上。珠粒单层可以通过任何方法形成，例如醇蒸发。
可以使用微孔的替代物来分隔单个细胞和珠粒，例如，单个固体支持物和单个细胞可以被限制在乳液中的单个液滴内(例如在液滴数字微流体系统中)。
细胞可以被限制在其本身包含多个拴系条形码的多孔珠粒内。单个细胞和固体支持物可以被分隔在任何类型的容器、微容器、反应腔室或反应容器等中。
可以在不使用微孔的情况下进行单细胞条形码编码。无需使用任何物理容器即可进行单细胞条形码编码分析。例如，无需物理容器的条形码编码可以通过将彼此靠近的细胞和珠粒嵌入聚合物层或凝胶层中来执行，以在不同的细胞/珠粒对之间建立扩散屏障。例如，无需物理容器的条形码编码可以在原位、在体内、在完整的实体组织上、在完整细胞上和/或以亚细胞方式执行。
微孔中颗粒的装载
在一些实施方案中，流体通道在其底部包括基板。基板可以包括具有多个微孔的微孔阵列。在一些实施方案中，微孔可以包含一个颗粒(例如，细胞或珠粒)。微孔阵列中具有单个颗粒的微孔的百分比可以变化，例如，范围从25％至90％。在一些实施方案中，微孔阵列中具有单个颗粒(例如单个细胞或单个珠粒)的微孔的百分比可以是或约是微孔阵列中能够包含单个细胞和合成颗粒的微孔的25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、99％或更多。在一些实施方案中，微孔阵列中具有单个颗粒(例如单个细胞或单个珠粒)的微孔的百分比可以是至少或至多25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或99％。
微孔可以包含两种不同类型的颗粒(例如，细胞和珠粒)。微孔阵列中具有两种不同类型颗粒中的每一种颗粒中的一个颗粒的微孔百分比可以变化，例如，范围从25％至90％。在一些实施方案中，微孔阵列中具有两种不同类型的颗粒(例如，单个细胞和单个珠粒)中每一种颗粒中的一个颗粒的微孔的百分比可以是或约是微孔阵列中能够包含单个细胞和合成颗粒的微孔的25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、99％或更多。在一些实施方案中，微孔阵列中具有两种不同类型的颗粒(例如，单个细胞或单个珠粒)中每一种颗粒中的一个颗粒的微孔的百分比可以是至少或至多25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或99。
装置
本文公开了用于条形码编码的装置。在一些实施方案中，装置包括：流动池，其包括流体通道、入口端和出口端，其中流体通道包括顶部、流体通道侧壁和底部。另一流体通道侧壁与顶部形成一个边缘并且与底部形成另一个边缘。顶部的接触角可以比流体通道侧壁的接触角小至少10度。流体通道的底部包括基板，该基板包括多个微孔。入口端和出口端经由所述流体通道与流动池流体连通。流体通道可以包括另一流体通道侧壁。该另一流体通道侧壁与顶部形成一个边缘并且与底部形成另一个边缘。
流动池
微孔阵列基板可以被封装在流动池内，该流通池提供与流体处理系统的其余部分的方便接口并且促进流体(例如，被递送到微孔阵列和/或乳液液滴的细胞和固体支持物的悬浮液、裂解缓冲液、冲洗缓冲液等)的交换。设计特征可以包括：(i)一个或更多个入口端，用于引入细胞样品、固体支持物悬浮液或其他分析试剂，(ii)一个或更多个微孔阵列腔室，其被设计用于提供有效的(例如，均匀的)填充和流体交换，同时最大限度地减少回涡(backeddies)或死区，以及(iii)一个或更多个出口端，用于将流体递送到样品收集点或废物储集器。
流动池的设计可以包括与多个微孔阵列接合的多个微阵列腔室，使得可以并行处理一个或更多个不同的细胞样品。流动池的设计还可以包括这样的特征，例如，通过使用位于腔室入口附近和微孔阵列上游的多孔阻挡物作为“流扩散器”，或将每个阵列腔室划分成几个子部分，它们共同覆盖相同的总阵列面积，但分开的入口流体流平行地流动通过它们，用于在阵列腔室的宽度上产生一致(例如，均匀)的流速分布(即“活塞流”)以实现将细胞和珠粒更有效(例如，均匀)地递送至微孔。在一些实施方案中，流动池可以附入或纳入超过一个微孔阵列基板。在一些实施方案中，一体化微孔阵列/流动池组装件可以构成系统的固定组件。在一些实施方案中，可以将微孔阵列/流通池组装件从仪器移除。
一般而言，流动池设计中的流体通道和阵列腔室的尺寸将被优化以(i)实现将细胞和珠粒有效(例如，均匀)地递送到微孔阵列，以及(ii)使样品和试剂的消耗最小化。在不同的实施方式中，流体通道的宽度可以不同，例如，范围从0.1mm至100mm。在一些实施方案中，宽度可以是或约是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100mm，或这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，所述宽度可以是至少或至多0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100mm。
在不同的实施方式中，流体通道的高度可以不同，例如，范围从0.1mm至100mm。在一些实施方案中，高度可以是或约是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10mm，或这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，高度可以是至少或至多0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9或10mm。
流动池可以使用本领域技术人员已知的各种技术和材料来制造。通常，流通池可以作为单独的部件制造，然后将其以机械方式夹紧或永久地结合到微孔阵列基板。合适的制造技术的实例包括传统机械加工，CNC机械加工，注塑成型，3D打印，一层或更多层激光或模切割的聚合物膜的对齐及层压，或诸如光刻和湿化学刻蚀、干法刻蚀、深反应离子蚀刻或激光微加工等的许多微制造技术中的任意一种。
一旦流动池部件被制造出来，可以以机械方式将其附接到微孔阵列基板，例如，通过将其针对微孔阵列基板(使用或不使用垫圈)夹紧，或者可以通过使用本领域技术人员已知的各种技术中的任意一种(取决于所用材料的选择)，例如通过使用阳极接合、热接合或各种粘合剂或粘合膜(包括基于环氧树脂、基于丙烯酸、基于有机硅、可UV固化、基于聚氨酯或基于氰基丙烯酸酯的粘合剂)中的任意一种，而将它直接接合到微孔阵列。在一些实施方案中，基板可以形成流体通道的流体通道底部，或者基板可以在流体通道的流体通道底部上。在一些实施方案中，基板包括硅、熔融石英、玻璃、聚合物、金属、弹性体、聚二甲基硅氧烷、琼脂糖、水凝胶或它们的组合。
流动池可以使用本领域技术人员已知的多种材料制造。通常，所用材料的选择取决于所用制造技术的选择，反之亦然。合适材料的实例包括但不限于硅，熔融石英，玻璃，各种聚合物中的任意一种，例如聚二甲基硅氧烷(PDMS；弹性体)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、聚酰亚胺、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、环氧树脂，金属(例如铝、不锈钢、铜、镍、铬和钛)，不粘材料例如聚四氟乙烯(PTFE)，或这些材料的组合。环烯烃聚合物(COP)可以包括Zeonor 1020R或Zeonor 1060R。
流体通道
流体通道可以包括流体通道顶部、两个流体通道侧壁和流体通道底部。流体通道顶部和每个流体通道侧壁形成边缘。流体通道侧壁可以具有正拔模角(draft angle)，例如，范围为1-15度。
在不同的实施方式中，流体通道的宽度可以不同，例如，范围从1mm到20mm。在一些实施方案中，流体通道的宽度可以是或约是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20mm，或这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，流体通道的宽度可以是至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mm。较大的宽度，例如7毫米，可以使给定流动池长度的流动池面积增大。
在不同的实施方式中，流体通道的高度可以不同，例如，范围从0.1mm至2mm。在一些实施方案中，流体通道的高度可以是或约是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.18、0.19、0.20mm，或这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，流体通道的高度可以是至少或至多0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19或0.20mm。
在一些实施方案中，流体通道顶部的接触角比流体通道侧壁的接触角要足够的小(例如，10、20、30、40、50、60、70、80或更多度)以实现流体通道内的非层流。在一些实施方案中，流体通道内的非层流能够实现通过流体通道内的流来搅动基板表面上的颗粒。在所述流与流体通道底部之间的边界处的流动速度可以是非零的。跨流体通道横截面的流的相对流速可以是恒定的或近似恒定的。所述非层流可以是活塞流。
在一些实施方案中，所述非层流可以近似为活塞流。所述活塞流可以近似为水平的活塞流。所述水平活塞流可以是毛细辅助的(capillary aided)水平活塞流。在一些实施方案中，活塞流可以不依赖于气体的浮力。活塞流可以不依赖于设备的倾斜。活塞流可以在缓冲液-气体的界面处。
在一些实施方案中，流体通道顶部包括亲水涂层。例如，亲水涂层可以是超亲水涂层。亲水涂层可以包括聚乙二醇(PEG)、聚-Hema、pluronic酸F68、pluronic酸F108、pluronic酸F127、聚山梨醇酯20、二氧化硅(SiO2)、氮化硅或它们的任意组合。在不同的实施方式中，亲水涂层的接触角可以不同。在一些实施方案中，亲水涂层的接触角可以是或约是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、23、30、40、50、60、70、80、90度，或这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，亲水涂层的接触角可以是至少或至多0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、23、30、40、50、60、70、80或90度。可以通过溅射、热生长、吸附、共价结合(例如，通过在其中溶解有涂层材料的液体中温育流体通道顶部或流体通道顶部的表面)或它们的任意组合对顶部涂覆亲水涂层。
在一些实施方案中，亲水和疏水涂层可以用于流体通道顶部或流体通道顶部。在一些实施方案中，选择性涂覆(此处也称为功能化)流体通道边界(此处也称为流动池边界)可以影响流通池特定部分中的毛细流动方向，以控制气体-缓冲液流体前沿轮廓的分布。
活塞流
在一些实施方案中，流动池的设计还可以包括这样的特征，例如，通过使用位于腔室入口附近和微孔上游的多孔阻挡物作为“流扩散器”，或将每个微孔腔室分成几个子部分，它们共同覆盖相同的总阵列面积，但分开的入口流体流平行地流过它们，用于在微孔腔室的宽度上产生一致(例如，均匀)的流速分布(即“活塞流”)，以实现将细胞和珠粒更有效(例如均匀)地递送到微孔。活塞流可以用于(1)实现将细胞和珠粒有效(例如均匀)地装载到流动池中；(2)消除已装载到流动池中的珠粒和细胞缓冲液的流通，这提高了流动池的细胞和珠粒捕获效率；和/或(3)能够在微孔表面搅动小颗粒，这可以消除珠粒双重体(beaddoublets)。
对于层流，相对速度分布可以是抛物线状的。最大流速出现在或接近于流体通道的中心。在流体通道边界(也称为流动池边界)、流体与流体通道的表面(例如流体通道底部和侧壁)之间的边界处，流速较低或接近于零。流体通道边界处的低流速可以导致的结果是微孔阵列表面或包含微孔的基板处的珠粒或细胞被搅动的程度低或最小。
在一些实施方案中，对于活塞流，相对流速在流体通道的横截面上可以是恒定的。活塞流可以使微孔阵列表面或包含微孔的基板处的珠粒或细胞能够被搅动。随着对珠粒或细胞的搅动，每个微孔可以包括一个珠粒和/或一个细胞。然而，流体通道边界处的气体(诸如空气、CO2或N2)的不均匀置换可能导致不均匀的活塞流，同时在流体通道边界处相对流速接近零。
可以使用对流动池的流体通道内的顶壁(也称为顶部、流体通道顶部或流体通道顶部)的亲水涂层或超亲水涂层或处理将气体塞和缓冲液塞引入到具有水平非倾斜工作流的流动池(即，不使流动池倾斜)。超亲水涂层提供了在无需利用浮力的情况下气体和缓冲液塞的均匀流体前沿的毛细辅助流动，从而实现由缓冲液置换气体或实现由气体置换缓冲液。
亲水或超亲水表面可以有助于缓冲液-气体界面处流体前沿的均匀的弯液面和移动，从而在不利用浮力的情况下避免流动池内的塞的破裂。亲水或超亲水涂层的使用可以在利用水平工作流的流动池内实现活塞流。在具有亲水或超亲水涂层的情况下，在流与流体通道底部之间的边界处的流动速度可以是非零的。跨流体通道横截面的相对流速可以是恒定的或近似恒定的。在一些实施方案中，活塞流可以是近似水平的活塞流。水平活塞流可以是毛细辅助的水平活塞流。在一些实施方案中，活塞流可以不依赖于气体的浮力。活塞流可以不依赖于装置的倾斜。活塞流可以在缓冲液-气体界面处或是其他形式的活塞流，例如油-水活塞流。
涂层偏移(coating offset)
在一些实施方案中，可以在流体通道顶部或流体通道顶部使用亲水和疏水涂层以定制(tailor)流动池中的气体-缓冲液流体前沿的轮廓。流体通道边界(在此也称为流动池边界)的选择性涂覆(在此也称为功能化)影响了流动池的特定部分中的毛细流动方向从而控制气体-缓冲液流体前沿轮廓的分布。图6B是示出了当流体通道顶部(除了流体通道顶部的边缘之外)涂覆有亲水涂层时毛细流动和压力驱动流动的方向示意图。在一些实施方案中，亲水涂层偏离流体通道边界(由流体通道顶部和侧壁形成的一个或更多个边缘)。该偏移导致流体通道边界处的流体通道顶部没有涂覆亲水涂层(也称为用疏水材料功能化的)。流体通道顶部的其余部分可以用亲水或超亲水材料进行功能化。由于流体通道顶部边缘处的流体通道顶部的疏水特性，毛细流动在该区域中可能减少或逆转。结果，气体-缓冲液界面的轮廓被修改，并且流体通道边界附近的气体塞的膨胀可能不再与该边缘正交。
在不同的实施方式中，所使用的缓冲液可以不同。在一些实施方案中，缓冲液可以是亲水性的。对于缓冲液-气体活塞流，顶部的边缘可以用疏水涂层进行功能化，并且其余部分可以用亲水涂层进行功能化。在一些实施方案中，缓冲液可以是疏水的而不是亲水的。对于缓冲液-气体活塞流，顶部的边缘可以用亲水涂层进行功能化，并且其余部分可以用疏水涂层进行功能化。其他的流动池边界，例如侧壁或底部，可以类似地功能化。
处理盒(cartridges)
在一些实施方案中，微孔阵列和流动池可以封装在提供与流体处理系统的其余部分的方便接口的可消耗处理盒中。流动池可以有助于被递送到微孔中的流体(例如细胞和珠粒悬浮液、裂解缓冲液、冲洗缓冲液等)的交换。在一些实施方案中，流动池可以被设计成有助于细胞和珠粒在多个微孔上的有效(例如，均匀)分布。设计特征可以包括：(i)一个或更多个用于引入细胞样品、珠粒悬浮液或其他分析试剂的入口端，(ii)一个或更多个微孔腔室，被设计用于提供有效(例如，均匀)的填充和有效的流体交换，同时最大限度地减少回涡或死区，以及(iii)一个或更多个出口端，用于将流体递送到样品收集点或废物储集器。在一些实施方案中，流动池的设计可以包括多个微孔腔室，这些微孔腔室与单个基板上的多个微孔阵列或者与多个微孔阵列基板接合，从而可以平行处理一个或更多个不同的细胞样品。在一些实施方案中，流动池的设计(例如流体通道和腔室的布局)可以进行调整，使得在给定的设计中流体可以进入不同图案的微孔(即可配置的微阵列图案)。
在一些实施方案中，流动池可以是处理盒的一部分。图4示出了用于条形码编码的示例性处理盒400的分解图。处理盒400可以包括流动池402，流动池402具有流体通道704，流体通道704由微孔阵列基板408、流体通道层412和盖板416形成。在不同的实施方式中，形成流动池400的层的数目可以不同，范围从1至20。在一些实施方案中，形成流动池400的层的数目可以是或约是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20，或这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，形成流动池400的层的数目可以是至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20。图4示出了处理盒400包括一个入口端，其由分别在盖板416和流体通道层412上的入口端组件420a和420b形成。入口端组件420a和420b可以是沿着轴线422同轴的。处理盒400包括在流体通道层412上的一个出口端424。出口端的位置在不同的实施方式中可以是不同的。在一些实施方案中，出口端可以在盖板416上。在一些实施方案中，出口端可以由盖板416和流体通道层412上的出口端组件形成。
处理盒400或流动池402可以包括(i)一个或更多个入口端，用于与仪器建立流体连接或手动将细胞样品、珠粒悬浮液或其他分析试剂引入处理盒中。流动池可以包括以下一个或更多个：(ii)一个或更多个旁路通道，即用于细胞样品和珠粒悬浮液的自计量，以避免过度填充或回流，(iii)一个或更多个集成的微孔阵列/流动池组装件，或微阵列基板位于其中的一个或更多个腔室，(iv)集成微型泵或其他流体驱动机构，用于控制流体流动通过该装置，(v)集成微型阀门(或其他容器机构)，用于分隔预装载的试剂(例如，珠粒悬浮液)或控制流体流动通过该装置，(vi)一个或更多个通风口，用于为捕获的气体提供逃逸路径，(vii)一个或更多个样品和试剂的废物储集器，(viii)一个或更多个出口端，用于与仪器建立流体连接或提供经处理的样品的收集点。(ix)机械接口特征，用于相对于仪器系统可重复地定位该可拆卸、可消耗的处理盒，并提供入口以便可以使外部磁铁进入而与微孔阵列紧密接近，(x)集成温度控制组件或热界面，用于提供与仪器系统良好的热接触，(xi)光学接口特征，例如透明窗口，用于微孔阵列的光学探查，或它们的任意组合。
处理盒可以被设计成并行处理多于一个的样品。处理盒还可以包括一个或更多个可移除的样品收集腔室，其适合于与独立的PCR热循环仪或测序仪器相连接。处理盒本身可以适合于与独立的PCR热循环仪或测序仪器相连接。在本公开中使用的术语“处理盒”可以意在包括在执行分析期间包含样品和珠粒的部件的任意组装件。
处理盒可以进一步包括被设计用于产生物理或化学屏障的组件，这些屏障防止大分子的扩散(或增加其路径长度和扩散时间)，以最小化微孔之间的交叉污染。此类屏障的实例可以包括但不限于：用于将细胞和固体支持物(例如珠粒)递送至微孔阵列的蛇形通道模式，在裂解或温育步骤期间被压入而与微孔阵列基板的表面接触的可伸缩压板或可变形膜片，使用较大的珠粒(例如如前所述的Sephadex珠粒)来阻塞微孔的开口，或在裂解或温育步骤期间从处理盒内的储集器中释放不混溶的疏水性流体，从而将阵列中的每个微孔有效地分离并隔开。
处理盒可以使用本领域技术人员已知的各种技术和材料来制造。通常，处理盒将被制造为一系列单独的组成部件，然后使用多个机械组装件或结合技术中的任意一种进行组装。合适的制造技术的示例包括但不限于常规机械加工、CNC机械加工、注塑成型、热成型和3D打印。一旦处理盒组件被制造出来，它们就可以使用螺钉和夹子等来机械组装，或者使用各种技术中的任意一种(取决于所用材料的选择)被永久接合，例如，通过使用热接合/焊接或各种粘合剂或粘合膜中的任意一种，其包括基于环氧基的、基于丙烯酸的、基于硅树脂的、可UV固化的、基于聚氨酯的或基于氰基丙烯酸酯的粘合剂。
处理盒组件可以使用多种合适材料中的任意一种来制造，所述材料包括但不限于硅，熔融石英，玻璃，多种聚合物中的任意一种，所述聚合物例如聚二甲基硅氧烷(PDMS；弹性体)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、聚酰亚胺、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、环氧树脂，不粘材料诸如聚四氟乙烯(PTFE)、金属(如铝、不锈钢、铜、镍、铬和钛)，或它们的任意组合。
处理盒的入口和出口的特征可以被设计成提供方便且防漏的与仪器的流体连接，或者可以用作开放式储集器，其用于将样品和试剂吸取移入或移出处理盒。用于入口和出口端连接器的便利机械设计的示例可以包括但不限于螺纹接头，鲁尔锁扣接头，鲁尔滑动或“滑动尖端”接头，以及压配合(press fit)接头等。处理盒的入口和出口端还可以包括当处理盒位于仪器中时能够被打开或刺破的盖子、弹簧加载的盖或封闭件、或聚合物膜，其用于防止在储存期间处理盒内表面的污染，或在将处理盒从仪器中取出时防止流体溢出。处理盒的一个或更多个出口端还可以包括可移除的样品收集腔室，其适用于与独立的PCR热循环仪或测序仪器相连接。
在一些实施方案中，入口端和出口端能够引导流体流通过流体通道，从而使微孔与流体接触。在一些实施方案中，该装置包括用于装载或移除细胞样品、分析试剂、珠粒悬浮液、来自装置的废物或它们的组合的移液管尖端接口。该装置可以包含细胞样品、分析试剂、珠粒悬浮液或它们的组合。
处理盒可以包括集成的微型泵或其他流体致动机构，其用于控制流体流动通过该装置。合适的微型泵或流体致动机构的示例可以包括但不限于：机电或气动致动的微型注射器或柱塞机构、气动或由外部活塞致动的隔膜泵、气动致动的试剂套袋或囊袋，或电渗泵。
处理盒可以包括微型阀，其用于分隔预装载的试剂或控制流体流动通过该装置。合适的微型阀门的示例可以包括但不限于：使用可以熔化或溶解的蜡制造的一次性“阀门”或聚合物塞，或者可以刺破的聚合物膜；利用可变形膜片和气动、磁性、电磁或机电(螺线管)致动构造的夹管阀，使用可变形膜瓣构造的单向阀，以及微型闸阀。
处理盒可以包括用于为截留的空气或气体例如CO2或N2提供逃逸路径的排气口。排气口可以根据各种技术构建，例如，使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)或其他疏水材料的多孔塞，其允许毛细芯吸空气或气体，但阻止水的渗透。
处理盒的机械接口特征可以提供处理盒相对于仪器系统的易移除但高度精确和可重复的定位。合适的机械接口特征可以包括但不限于：对准销钉，对准导向件，以及机械止动件等。所述机械设计特征可以包括用于使外部设备(例如磁体或光学组件)进入而紧靠微孔阵列腔室的可松脱特征(relief feature)。
处理盒可以包括用于与外部温度控制模块匹配的温度控制组件或热界面特征。合适的温度控制元件的示例可以包括但不限于电阻加热元件、微型红外发射光源、珀尔帖加热或冷却装置、散热器、热敏电阻和热电偶等。热界面特征可以由良好的热导体材料(例如铜、金、银等)制成，并且可以包括能够与外部加热块或冷却块进行良好热接触的一个或更多个平坦表面。
处理盒可以包括用于微孔阵列的光学成像或光谱探查的光学接合特征。处理盒可以包括光学透明窗口，例如微孔基板本身或流动池或微阵列腔室与微孔阵列相对的一侧，其由满足用于探测微孔阵列的成像或光谱技术的光谱要求的材料制成。合适的光学窗口材料的示例可以包括但不限于玻璃、熔融石英、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、环烯烃聚合物(COP)或环烯烃共聚物(COC)。
仪器模块和系统
在一些实施方案中，提供了用于多重的单细胞随机标记或分子条形码编码分析的自动化的仪器模块和系统。在一些实施方案中，这些仪器可以提供控制和分析功能，诸如(i)流体控制，(ii)细胞或珠粒分配和收集机制，(iii)细胞裂解机制，(iv)磁场控制，(v)温度控制，(vi)成像能力，(vii)图像处理，或它们的任意组合。在一些实施方案中，仪器系统可以包括一个或更多个模块，其中每个模块向系统提供一个或更多个特定的功能特征组。在其他实施方案中，仪器系统可以被封装成使得所有系统功能都位于一个或更多个封装包内或在同一封装包内。在一些实施方案中，系统可以包括附加的功能单元，作为系统的集成组件或模块组件，其将系统的功能能力扩展为包括PCR扩增(或其他类型的寡核苷酸扩增技术)和寡核苷酸测序。
在一些实施方案中，用户将细胞样品吸取转移到预加载有所有其他分析试剂的可移除的处理盒的入口端或样品孔中，将处理盒插入仪器系统中以进行处理，并收集来自该处理盒的出口端或孔输出(例如包含标记寡核苷酸文库的珠粒悬浮液)。仪器系统可以自动执行分析步骤，包括将细胞分配到微孔中，分配来自机载试剂孔的珠粒(如果尚未预加载到微孔中)，冲洗步骤，细胞裂解步骤，RNA或DNA靶标杂交步骤和磁辅助珠粒检索(magnet-assisted bead retrieval)。在一些实施方案中，仪器系统还包括成像和分析能力，以及对一些分析步骤(例如细胞和珠粒分配步骤)的实时反馈和控制，以确保微孔图案的最佳覆盖，同时最小化含有多于一个细胞或多于一个珠粒的孔的数量。在一些实施方案中，仪器系统包括嵌入式计算机或处理器(尽管在一些实施方案中可以使用外围计算机或处理器)，其运行用于控制和协调成像活动、运动控制、磁控制、流体控制(例如向流体管线施加压力或真空)的软件，以及其他功能子系统。
流体学
仪器系统可以提供用于将样品或试剂递送到与系统连接的一个或更多个分析处理盒内的一个或更多个微孔腔室或流动池的流体学能力。分析试剂和缓冲液可以储存在瓶子、试剂和缓冲液盒、或与处理盒入口连接的其他合适的容器中。在一些实施方案中，分析试剂和缓冲液可以预先装载并储存在位于处理盒本身之中的储集器中。所述系统可以包括经处理的样品和废物储集器，所述储集器为瓶子、盒或其他合适的容器的形式用于收集分析处理盒下游的流体。在一些实施方案中，经处理的样品和废液可收集在位于处理盒本身中的储集器中。在一些实施方案中，流体学模块可以支持在不同来源(例如，位于处理盒上的样品或试剂储集器，或位于仪器中的试剂瓶)与微孔腔室入口之间的流的切换。在一些实施方案中，流体学模块支持在执行细胞裂解和下游分析步骤之前在指定的、可调整的时间处使阵列中的细胞与活化剂、化学刺激物或测试化合物接触。在一些实施方案中，流体学模块可以支持在微孔室出口与不同的收集点(例如，位于处理盒内的已处理样品的储集、位于处理盒内的废物储集器、或位于仪器内的废物瓶)之间的流的切换。
使用泵和阀的流动控制：在一些实施方案中，流过系统的流体的控制通常将通过使用泵(或其他流体致动机构)和阀来执行。合适的泵的实例包括但不限于注射泵、可编程注射泵、蠕动泵、隔膜泵等。在一些实施方案中，可以通过在试剂和缓冲液容器的一个或更多个入口处或在分析处理盒的入口处施加正的气动压力来控制流过系统的流体。在一些实施方案中，可以通过在废物储集器的一个或更多个出口处或在分析处理盒的出口处抽真空来控制流过系统的流体。合适的阀的实例包括但不限于止回阀、机电二通或三通阀、气动二通和三通阀等。
流体流动模式：可以在分析程序中的不同的点利用不同的流体流动控制模式，例如正向流动(相对于给定微孔腔室的入口和出口)、反向流动、振荡或脉动流动或它们的组合都可以使用。在一些实施方案中，例如在微孔装载步骤期间可以使用振荡或脉动流动以促进细胞和珠粒的均匀分布。在一些实施方案中，在分析洗涤/冲洗步骤期间可以应用振荡或脉动流动以促进一个或更多个微孔流动池或腔室内的流体的完全和有效交换。
在分析处理工作流程中的不同的点可以使用不同的流体流速，例如，在所公开的仪器模块和系统的一些实施方案中，体积流速可以在-100毫升/秒至+100毫升/秒之间变化。在一些实施方案中，体积流速的绝对值可以是至少0.001毫升/秒、至少0.01毫升/秒、至少0.1毫升/秒、至少1毫升/秒、至少10毫升/秒、或至少100毫升/秒。在一些实施方案中，体积流速的绝对值可以是至多100毫升/秒、至多10毫升/秒、至多1毫升/秒、至多0.1毫升/秒、至多0.01毫升/秒，或至多0.001毫升/秒。给定时间点的体积流速可以具有该范围内的任意值，例如正向流速为2.5毫升/秒，反向流速为-0.05毫升/秒，或值为0毫升/秒(即，停止流动)。
空气注入：在流体学系统的一些实施方案中，当从一种溶液变为另一种溶液时，在溶液注入之间，例如，在流动池的灌注与细胞悬浮液的注入之间，或在冲洗缓冲液步骤与珠粒悬浮液的注入之间，插入空气注入可能是有利的。这种方法的潜在优势包括减少分散(通过消除液体/液体界面)和减少样品和试剂消耗(填充或清空流动池所需的流体量更少)。
在一些实施方案中，空气可以被注入流动池本身(例如，包括流体层)。在一些实施方案中，空气可以被注入到微孔阵列上方的流动池中的空间(例如，微孔腔室)中。在一些实施方案中，空气的注入可能不会实质上去除微孔阵列中的微孔的内容物。在一些实施方案中，空气的注入可以去除微孔阵列的微孔的至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％或更多的内容物。
空气的注入可以用于为液体(例如，包含细胞或珠粒悬浮液)的后续注入(例如，装载)创建均匀的环境。在一些实施方案中，相比于在没有预先空气注入的情况下的装载，空气注入后的液体装载可以至少被10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％地更均匀地分散。在一些实施方案中，相比于在没有预先空气注入的情况下的装载，空气注入后的液体装载可以至多被10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％地更均匀地分散。
空气的注入可以减少流动池和/或微孔阵列中的死区体积(或死区空间)。在一些实施方案中，可以利用空气的注入使死区体积减少至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％。在一些实施方案中，可以利用空气的注入使死区体积减少至多10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％。
在一些实施方案中，空气的注入可以使用自动移液管、注射泵等来进行。在一些实施方案中，空气的注入可以以在0.08毫升每秒至1.8毫升每秒之间的范围内的速率进行。在一些实施方案中，空气注入的速率为至少0.08毫升每秒、至少0.1毫升每秒、至少0.2毫升每秒、至少0.3毫升每秒、至少0.4毫升每秒、至少0.5毫升每秒、至少0.6毫升每秒、至少0.7毫升每秒、至少0.8毫升每秒、至少0.9毫升每秒、至少1.0毫升每秒、至少1.2毫升每秒、至少1.4毫升每秒、至少1.6毫升每秒、或至少1.8毫升每秒。在一些实施方案中，空气注入的速率为至多1.8毫升每秒、至多1.6毫升每秒、至多1.4毫升每秒、至多1.2毫升每秒、至多1.0毫升每秒、至多0.8毫升每秒、至多0.6毫升每秒、至多0.4毫升每秒、至多0.2毫升每秒、至多0.1毫升每秒、或至多0.08毫升每秒。本领域技术人员将认识到，空气注入的速率可以具有该范围内的任意值，例如约1.25毫升每秒。在某些情况下，注入速率为约0.36毫升每秒。
在一些实施方案中，空气注入的压力可以在0.01和0.25atm之间。在一些实施方案中，空气注入速率为至少0.01atm、至少0.05atm、至少0.10atm、至少0.15atm、至少0.2atm或至少0.25atm。在一些实施方案中，空气注入的速率为至多0.25atm、至多0.2atm、至多0.15atm、至多0.1atm、至多0.05atm或至多0.01atm。本领域技术人员将认识到，空气注入的压力可以具有该范围内的任意值，例如约0.11atm。
细胞和珠粒的分配机制
在一些实施方案中，仪器系统可以包括用于分配并进一步促进细胞和珠粒在多个微孔上的均匀分布的机制。此类机制的示例包括但不限于磁传输、摇摆、振摇、旋转、再循环流动、振荡或脉动流动、低频搅动(例如，通过形成腔室壁的或流体通道附近的柔性(例如硅树脂)膜的脉动)或高频搅动(例如，通过使用压电换能器)。在一些实施方案中，将这些机制中的一种或更多种与流动池或微孔腔室的内壁上的物理结构或特征(例如，夹层/顶帽结构、V形或脊线阵列)结合使用，以促进混合或有助于防止阵列腔室内的细胞或珠粒汇集。在流动池或微孔腔室的上表面或下表面上的流动增强肋片可以用于控制流速分布并减少穿过微孔开口的剪切(即，防止细胞或珠粒在试剂更换和冲洗步骤中被从微孔中脱除)。
磁场辅助的珠粒输送和操作
在一些实施方案中，通过使用磁性珠粒(例如与针对细胞表面标志物的抗体缀合，或作为随机标签库的固体支持物)和外部施加的磁场梯度，使得细胞或珠粒可分布在微孔中、从微孔中移除、或另外输送通过仪器系统的流动池或处理盒。在一些实施方案中，例如当使用磁场在微孔中捕获磁珠或从微孔洗脱磁珠时，外部施加的磁场梯度可以同时应用于整个微孔图案。在一些实施方案中，可以将外部施加的磁场梯度施加到微孔图案的选定区域。在一些实施方案中，可以将外部施加的磁场梯度施加到单个微孔。在一些实施方案中，永磁体可通过相对于微孔阵列移动一个或多个永磁体的位置来施加时变磁场梯度，反之亦然。在这些实施方案中，相对运动的速度可以被调节以使得磁场梯度的时间依赖性与磁性珠粒经历磁泳进或出微孔的时间表匹配。在一些实施方案中，可以通过改变施加到一个或多个电磁体的电流来提供时变磁场。在一些实施方案中，一个或多个永磁体和一个或多个电磁体的组合可用于提供磁场梯度，用于将磁性珠粒输送到微孔中、微孔外或通过装置。在一些实施方案中，细胞或珠粒可通过离心或其他非磁性手段分布在微孔中、从微孔中移除、或另外输送通过仪器系统的流动池或处理盒。
在一些实施方案中，可以使用一个或多个磁场从微孔中去除珠粒(固体支持物)。在一些实施方案中，可以在微孔中的细胞裂解和/或核酸附着到固定在单个珠粒上的多个寡核苷酸之后移除珠粒。可以将磁体放置在柱体的顶部，并且可以使用产生的磁场从孔中移除珠粒。在一些实施方案中，至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％的珠粒可以被去除。在一些实施方案中，最多70％、最多75％、最多80％、最多85％、最多90％、最多95％或最多100％的珠粒可以被去除。
实时成像和反馈
在一些实施方案中，使用成像系统和实时图像处理和分析来监测细胞和珠粒的分配过程(即细胞和/或珠粒在多个微孔中的分布)并且相应地使用反馈来调节处理步骤，例如通过延长或重复一些步骤，通过激活可替代的细胞或珠粒分配机制等，以改善细胞和/或珠粒的分布，或实现预先指定的目标分布。
一种以上细胞类型的分配
在一些实施方案中，系统可以包括用于在微孔阵列上分配一种以上细胞类型的功能。例如，系统可以用第一种细胞类型A来装载微孔阵列，然后冲洗并随后装载第二种细胞类型B，使得多个微孔包含单个类型A的细胞和单个类型B的细胞。这样的系统功能可以用于研究细胞-细胞间相互作用和其他应用。通常，系统可以被配置为在微孔阵列上分配至少一种细胞类型、至少两种细胞类型、至少三种细胞类型、至少四种细胞类型或至少五种细胞类型。在一些实施方案中，系统可以被配置为在微孔阵列上分配最多五种细胞类型、最多四种细胞类型、最多三种细胞类型、最多两种细胞类型或最多一种细胞类型。在一些实施方案中，所述系统可以被配置为在微孔阵列上分配细胞的复杂混合物。在所有这些配置中，系统可以被设置用于优化细胞在微孔中的分布，并使用如上所述的细胞分配、实时成像和反馈机制来识别具有比指定的细胞数更多或更少的细胞数的孔。一般而言，含有多于一种细胞类型(例如A型和B型各一个细胞，或A、B和C型各一个细胞)的微孔的百分比可以在约1％至约100％的范围内。在一些实施方案中，含有多于一种细胞类型的微孔的百分比可以是至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少40％、至少60％、至少80％，或至少90％。在其他实施方式中，含有多于一种细胞类型的微孔的百分比可以是至多100％、至多90％、至多80％、至多60％、至多40％、至多20％、至多10％、至多5％、或至多1％。在具体实施方案中，含有多于一种细胞类型的微孔的百分比可以具有落入该范围内的任意位置的值，例如约8.5％。
磁场控制
所公开的方法的一些实施方案在分析完成后利用磁场将珠粒从微孔中移除。在一些实施方案中，仪器系统还可以包括使用磁场将珠粒输送进或输送出微孔流动池或腔室，或输送通过仪器系统的其他部分，或在分析之前或分析期间在珠粒已被装载或分配之后将它们保留或截留在特定位置。用于提供磁场控制的合适方式的示例包括但不限于使用在相对于处理盒的固定位置中的电磁体，或使用根据需要而机械地重新定位的永磁体。在仪器系统的一些实施方案中，所施加的磁场的强度通过改变施加到一个或更多个电磁体的电流量而变化。在所述仪器系统的一些实施方案中，通过利用例如步进电机驱动的线性致动器、伺服电机驱动的线性致动器或凸轮轴机构而改变一个或更多个永磁体相对于微孔腔室的位置的位置，所施加的磁场的强度将发生变化。在其他实施方案中，与仅在两个固定位置之间执行转换相比，可以以线性(或非线性)方式控制磁体的位置，同时选择速度以将珠粒收集效率最大化。在所述仪器系统的一些实施方案中，使用脉冲磁场可以有利于例如防止磁性珠粒聚集。
除了考虑用于操纵珠粒和其他材料的磁场的强度和位置之外，重要的是设计系统使得磁场梯度适用于正在执行的任务。磁场中的空间梯度对磁性材料和颗粒施加平移力。通过使用多个磁体、使用具有特定的边缘和面的几何形状的磁体或磁化材料，以及通过设计具有适当空间尺度的磁体，可以实现适当的场梯度。这里，术语“磁体”是指永磁体或电磁体。固有地或通过设计形成的包括多个磁畴的磁体组装件，可以用于产生具有理想场强和空间变化的磁场。例如，可以将具有平行或反平行场轴或其他相对角度的小磁体图案邻近于孔和流体图案放置，以在装置的加载和操作期间实现珠粒的最佳截留或操纵。在所公开系统的一些实施方案中，例如，当使用磁场将磁性珠粒截留在微孔中或从微孔中洗脱磁性珠粒时，外部施加的磁场梯度可以被同时施加到整个微孔图案。在一些实施方案中，外部施加的磁场梯度可以被施加到微孔图案的选定区域。在一些实施方案中，外部施加的磁场梯度可以被施加到单个微孔。在一些实施方案中，外部施加的磁场的磁场线可以相对于微孔基板的平面成约30度至89度之间的角度。在一些实施方案中，磁场线相对于微孔基板平面的角度可以在大约45度至80度之间。在一些实施方案中，磁场线相对于微孔基板的平面的角度可以是至少45度、至少50度、至少55度、至少60度、至少65度、至少70度、至少75度或至少80度，或更高。在一些实施方案中，磁场线相对于微孔基板平面的角度可以为至多80度、至多75度、至多70度、至多65度、至多60度、至多55度、至多50度、或至多45度，或更小。本领域技术人员将认识到，磁场线相对于微孔基板平面的角度可以具有该范围内的任意值，例如约52度。
温度控制
在一些实施方案中，所述仪器系统将包括温度控制功能以促进分析结果的准确性和再现性，例如，微孔流动池或腔室的冷却可以有利于最小化微孔之间的分子扩散。可以并入仪器系统(或处理盒)设计中的温度控制组件的示例包括但不限于电阻式加热元件、红外光源、珀尔帖加热或冷却装置、散热器、热敏电阻、热电偶等。在所述系统的一些实施方案中，温度控制器可以在执行细胞裂解和下游分析步骤之前提供在指定的、可调整的时间处的可编程的温度变化。在所述系统的一些实施方案中，温度控制器可以提供在指定的时间间隔内的可编程的温度变化。在一些实施方案中，温度控制器可以进一步提供具有指定的频率和斜率的在两个或多个设定温度之间的温度循环，从而可以执行用于扩增反应的热循环。
成像能力
在一些实施方案中，提供了包括光学成像或其他光谱能力的仪器系统。例如，此类功能可以用于检查微孔基板以确定微孔图案是否已均匀且最佳地填充有细胞或珠粒。可以利用各种成像模式中的任意一种，包括但不限于明场、暗场、荧光、发光或磷光成像。成像模式的选择将影响微孔阵列、流动池和处理盒腔室的设计，因为微孔基板或者流动池或微孔腔室的相对的壁在所关注的光谱范围内必须是透明的。在一些实施方案中，可以使用部分相干的照明光来提高明场图像中未染色细胞的对比度。
在一些实施方案中，可以使用定量的相位成像来提高自动图像处理和分析软件在确定位于每个微孔中的细胞数量方面的性能。未染色的细胞通常吸收很少的光，但在透射光中会导致可测量的相位延迟。定量相位成像可以指用于从使用相干或部分相干的光收集的一系列的两个或多个图像(其获取了强度数据)计算相位信息的几种方法中的任意一种。例如，可以通过在不同散焦距离处摄制图像来拍摄一系列合适强度的图像。然后使用例如“强度传输(Transport of Intensity)”算法或基于Gerchberg-Saxton方法的迭代技术来处理图像以恢复相位信息，以创建视野中细胞的形状和密度图。
在一些实施方案中，可以将多个微孔中的每一个完整成像在单个图像中。在一些实施方案中，可以“平铺”一系列图像以创建整个微孔图案的高分辨率图像。在一些实施方案中，对于作为整体的图案，可以使用表示所述图案的子部分的单个图像来评价特性，例如，细胞或珠粒的分布。
在一些实施方案中，可以执行双波长激发和发射(或多波长激发或发射)成像。
光源
可以使用多种光源中的任意一种来提供成像或激发光，包括但不限于钨灯、卤钨灯、弧光灯、激光器、发光二极管(LED)或激光二极管。在许多实施方案中，一个或更多个光源和附加光学组件(例如透镜、滤光器、孔、光阑、反射镜等)的组合将构成照明系统(或子系统)。
检测器
各种图像传感器中的任意一种可以用于成像目的，包括但不限于光电二极管阵列、电荷耦合器件(CCD)相机或CMOS图像传感器。成像传感器可以是一维(线性)或二维阵列传感器。在许多实施方案中，一个或更多个图像传感器和附加光学组件(例如透镜、滤光器、孔、光阑、反射镜)等的组合将构成成像系统(或子系统)。
其他光学组件
光学系统通常将包括用于对通过系统的光束进行引导、成形、过滤或聚焦的各种光学组件。合适的光学组件的示例包括但不限于透镜、反射镜、棱镜、衍射光栅、有色玻璃滤光器、窄带干涉滤光器、宽带干涉滤光器、二向色反射器、光纤、光波导，等等。在一些实施方案中，成像系统将进一步包括一个或更多个平移台或其他运动控制机构，用于相对于照明和/或成像系统移动微孔基板，反之亦然。在一些实施方案中，仪器系统可以将光学透明的微阵列基板用作用于将激发光传送到微孔的波导。
补充分析技术
成像模式的选择还可以使得其他类型的分析的使用能够与随机标记和分子索引分析并行运行，例如，使用明场成像的台盼蓝活细胞/死细胞分析，使用荧光成像的基于荧光的活细胞/死细胞分析等。单个细胞的活力数据与相关微孔中每个珠粒相关联的细胞标签的相关性可以提供在分析来自多重化的单细胞分析的数据方面的附加水平的区分。
附加系统功能
在一些实施方案中，系统可以包括用于探测微孔阵列的非成像或非光学功能。用于检测截留气泡、确定细胞或珠粒在阵列上的分布等的非成像或非光学技术的示例包括但不限于光散射测量、紫外/可见光/红外吸收测量(例如使用染色的细胞或掺入染料的珠粒)、相干拉曼散射和电导测量(例如使用与微孔阵列一起登记的微制造电极阵列)。在一些实施方案中，所获得的关于特定孔的状况或内容物的信息可以用于确定那些孔必须被隔离、删除或以其他方式防止其影响分析结果。例如，可以使用电加热元件来形成气泡或使孔内容物变性，或者可以施加光能使孔壁变形从而卡住内容物，或者可以施加局部磁场使得待清除的珠粒被截留在基板中而非洗脱以用于分析。
与PCR热循环仪、测序仪和FACS仪器的接口
在一些实施方案中，本公开的仪器系统可以进一步包括与PCR热循环仪、测序仪、细胞分选仪、荧光激活细胞分选仪(FACS)仪器或其他类型的实验室自动化设备的接口。
在一些实施方案中，提供了用于PCR热循环仪的接口，使得仪器系统将已标记的寡核苷酸文库直接输出到与市售PCR仪器(例如，Roche
Figure BDA0003255081130000831
系列的实时PCR仪器等)兼容的管、条或板中。
在一些实施方案中，为细胞分选器或FACS仪器提供接口，使得分选的细胞直接沉积到微孔阵列或处理盒中。FACS仪器的接口可以例如包括硬件和软件组件，其中软件提供同时控制FACS仪器和单细胞、随机标记或分子条形码编码系统的能力。在一些实施方案中，所述软件可以提供用于识别FACS数据(例如特定细胞表面标志物的存在或不存在)与特定细胞亚群中一个或更多个基因的拷贝数之间的相关性的分析能力。FACS机器可以用于将单个细胞直接分选到本公开的微孔阵列中。
在一些实施方案中，通常提供与实验室自动化设备的接口，例如，与所公开的仪器系统一起使用的处理盒可以被配置为具有为适当尺寸和间距的入口，使得可以使用市售的移液站和液体处理机器人将样品和试剂直接分配到处理盒中。类似地，在一些实施方案中，与所公开的仪器系统一起使用的处理盒可以被配置为具有与用于自动储存、检索或在其他实验室工作站之间移动的市售板操作(plate-handling)机器人兼容的尺寸。
系统处理器和软件：
在一些实施方案中，设计用于支持多重化的、单细胞随机标记和分子条形码编码分析的自动化的仪器系统将包括处理器或计算机，以及软件以提供(i)仪器控制功能、(ii)图像处理和分析能力以及(iii)数据储存、分析和显示功能。
系统处理器和控制软件：在一些实施方案中，仪器系统将包括计算机(或处理器)和计算机可读介质，其包括代码以提供用户界面以及所有系统功能的手动、半自动或全自动控制，例如流体系统、温度控制系统、细胞或珠粒分配功能、磁性珠粒操作功能和成像系统的控制。在一些实施方案中，系统计算机或处理器可以是仪器系统的集成组件(例如，嵌入仪器内的微处理器或主板)。在一些实施方案中，系统计算机或处理器可以是独立模块，例如个人计算机或膝上型计算机。由仪器控制软件提供的流体控制功能的示例包括但不限于体积流体流速、流体流速、样品和珠粒添加的时点和持续时间、试剂添加以及冲洗步骤。由仪器控制软件提供的温度控制功能的示例包括但不限于指定的温度设定点和对温度变化的定时、持续时间和斜率的控制。由仪器控制软件提供的细胞或珠粒分配功能的示例包括但不限于对诸如振幅、频率和持续时间的搅拌参数的控制。由仪器控制软件提供的磁场功能的示例包括但不限于所施加的磁场的时点和持续时间、以及(在电磁体的情况下)磁场强度。由仪器控制软件提供的成像系统控制功能的示例包括但不限于自动对焦能力、照明或激发光曝光时间和强度的控制、图像采集速率的控制、曝光时间和数据储存选项。
图像处理软件：在仪器系统的一些实施方案中，系统将进一步包括计算机可读介质，其包括用于提供图像处理和分析能力的代码。所述软件提供的图像处理和分析能力的示例包括但不限于手动、半自动或全自动图像曝光调整(例如白平衡、对比度调整、信号平均和其他降噪能力等)、自动边缘检测和物体识别(即，用于识别图像中的细胞和珠粒)、自动统计分析(即，用于确定在每个微孔或微孔基板的每单位面积识别的细胞或珠粒的数量，或用于识别包含多于一个细胞或多于一个珠粒的孔)和手动测量能力(例如测量物体之间的距离等)。在一些实施方案中，仪器控制和图像处理/分析软件将被编写为单独的软件模块。在一些实施方案中，仪器控制和图像处理/分析软件将被并入集成包中。
在一些实施方案中，系统软件可以提供集成的实时图像分析和仪器控制，从而可以根据预定的特征组对细胞进行光学监测和分类。可以光学监测并用于分类目的的细胞特征的示例包括但不限于细胞大小，细胞形状，活细胞/死细胞测定(例如使用选择性吸收的发色团诸如台盼蓝，或荧光染料诸如钙黄绿素AM、乙啡啶均二聚物-1、DiOC2(3)、DiOC5(3)、DiOC6(3)、DiSC3(5)、DiIC1(5)、DiOC18(3)、碘化丙啶、
Figure BDA0003255081130000851
14、
Figure BDA0003255081130000852
Green等)，表现出特定范围的细胞内pH值(例如，使用细胞内pH敏感荧光探针，诸如2’,7’-双-(2-羧乙基)-5-(和-6-)羧基荧光素(BCECF)、2’,7’-双-(2-羧丙基)-5-(和-6-)-羧基荧光素(BCPCF)等)的细胞，表现出特定范围的膜电位(例如，使用膜电位敏感的荧光团，诸如FluoVoltTM、二-3-ANEPPDHQ、双-(1,3-二丁基巴比妥酸)三次甲基氧杂菁(DiBAC4(3))、DiBAC4(5)、DiSBAC2(3)、部花菁540、JC-1、JC-9、氧杂菁V、氧杂菁VI、四甲基罗丹明甲酯和乙酯、罗丹明123、Di-4-ANEPPS、Di-8-ANEPPS、Di-2-ANEPEQ、Di-3-ANEPPDHQ、Di-4-ANEPPDHQ等)的细胞，表现出特定水平的细胞内钙(例如使用Ca2+敏感的荧光染料，诸如fura-2、indo-1、fluo-3、fluo-4、Calcium Green-1、Quin2等)的细胞，表现出一种或更多种特定的细胞表面标志物(例如使用针对细胞表面标志物的荧光-标记抗体)的细胞，表达荧光蛋白(例如GFP、胆红素诱导型荧光蛋白、UnaG、dsRed、eqFP611、Dronpa、TagRFPs、KFP、EosFP、Dendra、IrisFP等)的细胞，等等。在许多实施方案中，可以选择具有不重叠的光谱特性(例如不重叠的激发峰、不重叠的吸收峰或发射峰等)的两种或多种染料、荧光团或其他光学探针，从而可以同时对细胞在两个或多个特性方面予以表征。在一些实施方案中，使用实时图像处理和分析来识别含有表现出一种或更多种特定特征的细胞的孔。
应用
本文公开的方法、装置和系统可以用于基础研究、生物医学研究、环境测试和临床诊断方面的多种应用。所公开的技术的潜在应用实例包括但不限于基因分型，基因表达谱分析，罕见细胞的检测和鉴定，疾病或病症的诊断，确定疾病或病症的预后，确定疾病或病症的治疗过程(例如，确定患者是否可以响应于治疗)，并监测所述对疾病或病症的治疗的响应，以及理解生物发育过程。
细胞类型
在一些实施方案中，细胞是正常细胞，例如处于不同发育阶段的人类细胞，或来自不同器官或组织类型的人类细胞。在一些实施方案中，细胞是非人类细胞，例如其他类型的哺乳动物细胞(例如小鼠、大鼠、猪、狗、牛或马)。在一些实施方案中，细胞是其他类型的动物或植物细胞。在其他实施方案中，细胞可以是任何原核或真核细胞。在一些实施方案中，在将细胞与珠粒关联之前对细胞进行分选。例如，细胞可以通过荧光激活细胞分选或磁激活细胞分选或更一般地通过流式细胞术来分选。可以按大小对细胞进行过滤。在一些实施方案中，截留物包含要与珠粒相关联的细胞。在一些实施方案中，流过物包含要与珠粒相关联的细胞。
在所公开的方法、装置和系统的一些实施方案中，第一细胞样品从未发生疾病或病症的人获得，而第二细胞样品从患有疾病或病症的人获得。在一些实施方案中，所述人是不同的人。在一些实施方案中，所述人为同一人，不过在不同的时间点采集细胞样品。在一些实施方案中，所述人是患者，并且细胞样品是患者的样品。在一些实施方案中，所述疾病或病症是癌症、细菌感染、病毒感染、炎性疾病、神经变性疾病、真菌病、寄生虫病、遗传病或它们的任意组合。
在一些实施方案中，细胞是从癌组织切除的癌细胞，例如乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、脑癌、黑色素瘤和非黑色素瘤皮肤癌，等等。在一些情况下，细胞源自癌症但收集自体液(例如循环肿瘤细胞)。癌症的非限制性实例可以包括腺瘤、腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、小细胞癌、大细胞未分化癌、软骨肉瘤和纤维肉瘤。
在一些实施方案中，细胞是已被病毒感染并含有病毒寡核苷酸的细胞。在一些实施方案中，病毒感染可以由选自双链DNA病毒(例如腺病毒、疱疹病毒、痘病毒)、单链(+链或“正义”)DNA病毒(例如细小病毒)、双链RNA病毒(例如呼肠孤病毒)、单链(+链或正义)RNA病毒(例如小核糖核酸病毒、披膜病毒)、单链(-链或反义)RNA病毒(例如正粘病毒、弹状病毒)、单链((+链或正义)RNA病毒，在其生命周期中有DNA中间体)RNA-RT病毒(例如逆转录病毒)，以及双链DNA-RT病毒(例如肝炎病毒)。
在一些实施方案中，细胞是细菌。这些可以包括革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。可以使用所公开的方法、装置和系统来分析的细菌的示例包括但不限于放线菌(Actinomedurae)、以色列放线菌、炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、肉毒杆菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、棒状杆菌、粪肠球菌、单核细胞增生李斯特菌、诺卡氏菌、痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、变形链球菌、肺炎链球菌等。革兰氏阴性菌包括但不限于猫阿菲波菌(Afipia felis)、拟杆菌属、杆菌状巴尔通体、百日咳鲍特氏菌、伯氏疏螺旋体、回归热疏螺旋体(Borrelia recurrentis)、布鲁氏菌、肉芽肿荚膜杆菌(Calymmatobacterium granulomatis)、弯曲杆菌、大肠埃希菌、土拉弗菌(Francisellatularensis)、阴道加德纳菌、埃及嗜血杆菌(Haemophilius aegyptius)、杜克氏嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、嗜肺军团菌、钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、脑膜炎奈瑟菌、牙龈卟啉单胞菌、斯氏普罗威登斯菌(Providencia sturti)、铜绿假单胞菌、肠炎沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、鲍氏志贺菌、念珠状链杆菌(Streptobacillusmoniliformis)、化脓性链球菌、梅毒螺旋体、霍乱弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、鼠疫耶尔森菌等。其他细菌可以包括鸟分枝杆菌、麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌、汉塞巴尔通体(Bartonella henseiae)、鹦鹉热衣原体、沙眼衣原体、伯氏考克斯体(Coxiellaburnetii)、肺炎支原体、小蛛立克次体(Rickettsia akari)、普氏立克次体(Rickettsiaprowazekii)、立克次氏立克次体、羌虫病立克次体、斑疹伤寒立克次体(Rickettsiatyphi)、解脲支原体、肺炎双球菌、查菲埃立克体(Ehrlichia chafensis)、屎肠球菌、脑膜炎球菌等。
在一些实施方案中，细胞是真菌。可以使用所公开的方法、装置和系统进行分析的真菌的非限制性实例包括但不限于曲霉菌、念珠菌、白色念珠菌、粗球孢子菌、隐球菌以及它们的组合。
在一些实施方案中，细胞是原生动物或其他寄生虫。使用本公开内容的方法、装置和系统进行分析的寄生虫的实例包括但不限于结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)，小隐孢子虫，环孢子虫(Cyclospora cayatanensis)，脑炎原虫(Encephalitozoa)，溶组织内阿米巴，比氏肠微胞虫(Enterocytozoon bieneusi)，兰氏贾第鞭毛虫，利什曼原虫，疟原虫，弓形虫，锥虫，变形虫(trapezoidal amoeba)，蠕虫(例如蠕虫)、特别是寄生虫，包括但不限于线虫(蛔虫、例如鞭虫、钩虫、蛲虫、蛔虫、丝虫等)、绦虫(例如绦虫)。
流体成分的精确递送
本文所公开的包括利用将两种流体(例如，两个塞)同时注入流体通道(包括位于流体通道底部的微孔)中，其允许在用第二流体(例如，非水液体(诸如油)和气体)密封所述孔之前，精确控制第一流体(例如含水液体，如裂解缓冲液)暴露于所述微孔的持续时间。在一些实施方案中，第一流体与在第一流体之后注入流动通道的第二流体具有高的相分离程度。附加地或替代地，微孔可以包括具有比第一液体更高的密度的另一种流体(例如，缓冲液)。
本文所公开的包括用于将分区(例如，微孔和液滴)暴露于液体(例如，含水液体，如缓冲液)以精确控制持续时间的系统、装置、设备和方法的实施方案。在一些实施方案中，所述系统、装置、设备和方法可以用于控制微孔中细胞的裂解反应。在一些实施方案中，微孔中细胞裂解反应的精确控制可以提高条形码编码分析(例如BD RhapsodyTM分析)的性能。在一些实施方案中，所述系统、装置、设备和方法可以用于控制微孔内分析物的浓度，使其具有沿流动池的流动或流体通道的路径(例如，纵向路径)的可变浓度。所述系统、装置、设备和方法可以用于研究分析物浓度对于改变细胞表型的作用。这种分析可以适用于开发细胞疗法治疗，例如，用于确定病毒运载体浓度对于细胞表型的作用。所述系统、装置、设备和方法能够实现在单细胞水平上和针对大的细胞群体对于大的分析物浓度范围与细胞表型之间的相关性进行测试。与RhapsodyTM单细胞分析平台的兼容可以检测RNA和蛋白质表达的表型变化。
用于测定单细胞的mRNA表达谱的方法可以以大规模平行的方式进行。例如，PreciseTM分析可以用于同时测定超过10000个细胞的mRNA表达谱。基板可以包含微孔阵列，其中每个微孔包含可截留单个细胞和单个包含条形码(例如，随机条形码)的固体支持物(例如，珠粒)的限定体积的反应室。单细胞的裂解和从所述细胞释放的靶核酸分子的标记可以在所述反应室阵列中以大规模平行的方式进行。然而，细胞裂解后在微孔之间蛋白质或RNA的相互干扰会降低信噪比并减少分析过程中捕获的特有靶标分子的数量。需要在精确的时间段内将缓冲液(例如，裂解缓冲液)递送至微孔从而可以精确递送所述缓冲液的一种或更多种成分(例如，洗涤剂、消化酶)的方法。需要密封并包含在微孔内引发的反应(例如，细胞裂解)以减少微孔之间的分子相互干扰的方法。此外，在多个微孔中产生一种或更多种分析物不同的浓度分布可以实现所述分析物的综合性相关研究(例如，分析物对于细胞表型的剂量依赖性效应)。本文公开的系统、装置和方法能够将可变量的分析物递送至多个微孔。
在一些实施方案中，提供了用于将一种或更多种成分引入流体的方法、系统和装置。所述方法可以包括第一流体和第二流体的共同注入。在一些实施方案中，所述方法包括将两种流体(例如，第一缓冲液和第二缓冲液、第一塞和第二塞)依次吸入然后一起分配。在一些实施方案中，第一流体和第二流体是不混溶的(例如含水和非水缓冲液)。在一些实施方案中，第二流体的密度低于第一流体。通过精确控制第一流体的流速和/或体积，可以高精度地控制第一流体通过(接合)微孔阵列中微孔的内容物表面的持续时间。在一些实施方案中，本文公开的方法能够将精确量的第一流体的一种或更多种组分递送至微孔。可以通过调节第一流体的流速和/或第一流体的体积(从而调节接合的持续时间)、第一流体中的一种或更多种成分的浓度、或它们的任意组合来控制所述第一流体的一种或更多种成分(例如，裂解缓冲液成分)的递送。第一流体的流速沿着流体通道可以是均匀的。在一些这样的实施方案中，均匀量的一种或更多种成分可以沿着流体通道被递送到多个微孔中的每一个。第一流体的流速沿着流体通道可以是不均匀的。在一些实施方案中，包含一种或更多种成分(例如，分析物)的第一流体的流速沿流动通道的纵向路径而动态地变化。在一些这样的实施方案中，沿着流动通道的纵向路径的微孔中得到的一种或更多种分析物的浓度是不均匀的。在一些实施方案中，提供了在微孔阵列内产生不同的分析物的浓度分布的方法。提供了测量作用剂对于单细胞的剂量依赖性表型效应的方法。
在一些实施方案中，提供了进行反应(例如，裂解反应)的方法。反应可以在微孔腔室内进行。第一流体可以包含一种或更多种引发反应的成分。第二流体可以密封并限制所述反应。微孔的内容物与第二流体之间的相分离可以限制微孔的内容物。反应可以包括在含有单个细胞和包含多个随机条形码的单个珠粒的微孔腔室中的细胞裂解。反应可以包括用所述随机条形码标记核酸靶分子。本文所公开的方法可以与单细胞分析平台(例如，BDRhapsodyTM)兼容。本文公开的方法可以提高单细胞分析平台的性能。在一些实施方案中，所公开的方法在所述单细胞分析平台中的应用，例如通过减少细胞裂解过程中微孔之间的分子的相互干扰，而带来RNA和蛋白质表达谱分析数据的改善(例如，降低的信噪比、增加的分子标记计数)。在一些实施方案中，裂解缓冲液与微孔接合的持续时间(例如，接合持续时间)为：i)足够长以使得足够量的裂解缓冲液能够从流体通道扩散到微孔中，使得微孔中最终的裂解缓冲液浓度足以裂解细胞；和/或ii)足够短以防止细胞内容物在细胞裂解之前、期间和/或之后扩散到微孔外。
本文所公开的包括用于将一种或更多种成分引入微孔的内容物的系统、设备、装置和方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)将第一流体引入包括顶部、第一侧壁和底部的流体通道，其中流体通道的底部包括多个微孔，并且其中流体通道的顶部、第一侧壁和底部围绕流体通道的除多个微孔中的每一个的容积之外(例如，在微孔上方)的流体通道容积，由此所述流体通道容积和多个微孔中的每个微孔包含第一流体；(b)以第一流速将第一置换流体引入所述流体通道以从所述流体通道容积中置换第一流体；(c)以第二流速将第二流体、随后紧接着第二置换流体和/或与第二置换流体同时引入所述流体通道，其中当第二流体进入微孔中与内容物接触第一持续时间时，第二流体的一种或更多种成分进入微孔中的内容物，并且其中第二置换流体从所述流体通道容积中置换第二流体和/或密封所述微孔中的内容物。
本文所公开的包括用于引入一种或更多种成分的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)提供包括顶部、第一侧壁和底部的流体通道，其中流体通道的底部包括包含第一流体的多个微孔，其中第一流体通道的顶部、侧壁和底部围绕所述流体通道的除多个微孔中的每个微孔的容积之外(在所述微孔上方)的流体通道容积，并且其中所述流体通道容积缺少第一流体；(b)以第二流速将多种第二流体中的每种第二流体随后紧接着第二置换流体和/或与第二置换流体同时引入所述流体通道，其中当第二流体进入微孔中与内容物接触第一持续时间时，多种第二流体中的每种流体的一种或更多种成分进入微孔中的内容物，并且其中第二置换流体从所述流体通道容积中置换第二流体和/或密封所述微孔中的内容物。
在一些实施方案中，提供了用于将一种或更多种成分引入流体中的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)提供包括流体通道的流动池，其中流体通道包括顶部、第一侧壁和底部，并且其中底部包括包含多个微孔的基板；(b)用预充液预充流动池；(c)从所述多个微孔上方的流体通道容积中置换预充流体，由此多个微孔中的每个微孔的内容物包括预充流体；以及(d)将第一流体和第二流体共同注入所述流体通道，其中恰好在第二流体前一步将第一流体引入所述流体通道，其中第一流体的一种或更多种成分进入所述微孔的内容物，并且其中第二流体密封所述微孔的内容物。在一些实施方案中，第一流体与微孔的内容物的表面接合一段持续时间。第一流体的一种或更多种成分可以通过扩散进入微孔。在第一流体与微孔的表面接合的持续时间期间，所述一种或更多种成分可以在微孔内容物中引发反应。在一些实施方案中，在第一流体与微孔的表面接合之后，所述一种或更多种成分在微孔的内容物中引发反应。
在一些实施方案中，提供了进行反应的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)提供包括流体通道的流动池，其中流体通道包括顶部、第一侧壁和底部，并且其中底部包括包含多个微孔的基板；(b)将第一流体和第二流体共同注入所述流体通道，其中恰好在第二流体前一步将第一流体引入所述流体通道，其中第一流体与微孔的表面接合一段持续时间，其中第一流体的一种或更多种成分进入所述微孔的内容物，其中一种或更多种成分在微孔的内容物中引发反应，并且其中第二流体密封所述微孔的内容物。
在一些实施方案中，提供了将不同浓度的分析物递送至多个微孔的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)提供包括流体通道的流动池，其中流体通道包括顶部、第一侧壁和底部，并且其中底部包括包含多个微孔的基板；(b)将第一流体和第二流体共同注入所述流体通道，其中恰好在第二流体前一步将第一流体引入所述流体通道，其中第一流体与微孔的内容物的表面接合一段持续时间，其中第一流体包括一种或更多种成分，其中第一流体的一种或更多种成分包括分析物，其中第一流体的流速沿着流体通道的纵向路径是不均匀的，其中分析物进入了微孔的内容物，其中对于多个微孔中的至少两个微孔，分析物的最终浓度是不相等的，并且其中第二流体密封所述微孔的内容物。
在一些实施方案中，在第一流体与微孔的表面接合的持续时间期间，一种或更多种成分在微孔内容物中引发反应。在一些实施方案中，所述方法包括在共同注入之前用预充流体预充流动池。在一些实施方案中，所述方法包括，在共同注入之前，从流体通道的容积(在所述多个微孔上方)中置换所述预充流体。第一流体的体积可以是第二流体的体积的至多10％(例如，1％、2％、3％、5％、7％、9％、10％和其中的重叠范围)。
在共同注入之后，在所述多个微孔上方的流体通道可以包含第二流体。在一些实施方案中，在共同注入之后，多个微孔上方的流体通道容积不包含第一流体。从所述多个微孔上方的流体通道容积中置换所述预充流体可以包括将置换流体注入所述流体通道中。置换流体可以是气体或非水液体。在一些实施方案中，预充流体可以是第一含水液体或第一非水液体。在共同注入之前，微孔可以包含初始微孔流体。初始微孔流体可包括预充流体。在一些实施方案中，初始微孔流体是含水液体。在一些实施方案中，初始微孔流体是含水缓冲液。在一些实施方案中，初始微孔流体是非水液体。第一流体的一种或更多种成分可以包括分析物。第一流体可以包含已知或未知浓度的分析物。第一流体的一种或更多种成分可以包括分析物、缓冲成分、小分子、生物分子、试剂、作用剂或它们的任意组合。流体(例如，第一流体、第二流体、置换流体)的注入可以至少置换多个微孔上方的流体通道容积的预先存在的流体的约90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％或其中重叠的范围)。
图5A示出了示例性的分配移液管，其包含在共同注入之前位于示例性处理盒的入口端的移液管尖端界面处的含水液体(“A2”)和非水液体(“NA”)。图5B提供了根据本文提供的方法的一些实施方案进行第一流体和第二流体的共同注入的示例性流动池的示意图。图5A和图5B显示了两种缓冲液被顺序吸入，缓冲液1(“A2”)接着是缓冲液2(“NA1”)。两种缓冲液不混合(例如含水和非水的缓冲液)，并且缓冲液1的密度可以低于缓冲液2。然后两种缓冲液(或液体，更常用的)被一起分配。由于缓冲液2的流速和体积被精确控制，并且流动池尺寸已知，因此可以高精度控制缓冲液2通过微孔阵列中每个微孔的持续时间。在一些实施方案中，将含水缓冲液随后非水缓冲液连续地共同注入到含有微孔阵列(其中所述微孔预先填充有含水缓冲液)的流动池可以使一种含水缓冲液的内容物进入另一种缓冲液(例如，从共同注入的含水缓冲液到微孔中的含水缓冲液)。在一些实施方案中，可以通过精确控制缓冲液2的体积和缓冲液2的流速来实现对含水缓冲液2与微孔表面接合的持续时间的精确控制。在一些实施方案中，接合持续时间的变化(通过改变缓冲液2的体积和/或流速)能够控制[含水缓冲液1]:[含水缓冲液2]的最终混合比。可以使用本文公开的系统和设备动态地控制接合持续时间，以实现在沿流动通道的不同点处的受控的混合比。非水液体(或气体)的共同注入可以物理密封微孔并限制内容物。
参考图5A和图5B，所描绘的流动池包括流体通道、入口和出口。流体通道的底部被示为包括基板，所述基板包括多个微孔。在共同注入之前，微孔包含第一含水液体(“A1”)并且流体通道的除微孔的容积和空间之外的容积或空间包含气体(“G”)。流体通道(不包括微孔)的流体被包含第二含水液体(“A2”)的共同注入过程中的第一流体置换。共同注入的第一流体已经通过与入口紧邻的微孔并且所述微孔现在包含第一含水液体和第二含水液体的混合物(“A1+A2”)。共同注入的第一流体之后随后紧接着包括第一非水液体(“NA1”)的共同注入的第二流体。共同注入的第二流体被描绘为密封所述紧邻入口的微孔中的内容物。共同注入的第一流体被显示为与位于流体通道中部的微孔的内容物的表面接合，其中共同注入的第一流体的一种或更多种成分处于进入(例如，通过扩散)微孔的内容物的过程中(“A1+(A2)”)。共同注入的第一流体尚未到达与出口相邻的微孔。
图6A至图6D描绘了用于将两种流体(例如，第一流体和第二流体)共同注射到流动池中的非限制示例性工作流程。例如，第一流体和第二流体可以是缓冲液或气体。图6A描绘了通过将包括第一含水液体(“A1”)的预充流体注入流体通道来预充流动池。包括气体(“G”)的置换流体被注入流体通道并且从流体通道(不包括微孔)中置换预充流体。在共同注入之前，微孔包含第一含水液体(“A1”)并且流体通道(不包括微孔)包含气体(“G”)。接下来，将包含第二含水液体(“A2”)的第一流体和包含第一非水液体(“NA1”)的第二流体共同注入到所述流体通道中，其中共同注入的第一流体恰好在共同注入的第二流体前一步被引入到流体通道中。流体通道(不包括微孔)中的流体(如果有的话)被共同注入的第一流体所置换。共同注入的第一流体已经通过紧邻入口的微孔，并且所述微孔现在包含第一含水液体和第二含水液体的混合物(“A1+A2”)。共同注入的第二流体被描绘为密封紧邻入口的微孔中的内容物。共同注入的第一流体被显示为与位于流体通道中部的微孔的内容物的表面接合，其中共同注入的第一流体的一种或更多种成分处于(例如，通过扩散)进入微孔的内容物过程中(“A1+(A2)”)。共同注入的第一流体尚未到达与出口相邻的微孔。共同注入的第二流体被描绘为在所述共同注入之后密封多个微孔中的内容物。
图6B描绘了通过将包括第一含水液体(“A1”)的预充流体注入流体通道来预充流动池。包括气体(“G”)的置换流体被注入所述流体通道并且从流体通道(不包括微孔)中置换所述预充流体。在共同注入之前，微孔包含第一含水液体(“A1”)并且流体通道(不包括微孔)包含气体(“G”)。接下来，将包含第二含水液体(“A2”)的第一流体和包含气体(“G”)的第二流体共同注入所述流体通道，其中所述共同注入的第一流体恰好在所述共同注入的第二流体前一步被引入所述流体通道。流体通道(不包括微孔)中的流体被所述共同注入的第一流体置换。共同注入的第一流体已经通过与入口紧邻的微孔并且所述微孔现在包含第一含水液体和第二含水液体的混合物(“A1+A2”)。共同注入的第二流体被描绘为密封与入口紧邻的微孔中的内容物。共同注入的第一流体被显示为与位于流体通道中部的微孔的内容物的表面接合，其中共同注入的第一流体的一种或更多种成分处于(例如，通过扩散)进入微孔的内容物的过程中(“A1+(A2)”)。共同注入的第一流体尚未到达与出口相邻的微孔。共同注入的第二流体被描绘为在所述共同注入之后密封多个微孔中的内容物。
图6C描绘了通过将包括第一含水液体(“A1”)的预充流体注入流体通道来预充流动池。将包括第一非水液体(“NA1”)的置换流体注入所述流体通道并从流体通道(不包括微孔)中置换所述预充流体。在共同注入之前，微孔包含第一含水液体(“A1”)并且流体通道的容积或空间(在微孔上方且不包括微孔)包含第一非水液体(“NA1”)。接下来，包含第二含水液体(“A2”)的第一流体和包含第二非水液体(“NA2”)(其可以是与第一非水液体相同的非水液体)的第二流体被共同注入到流体通道中，其中共同注入的第一流体恰好在共同注入的第二流体前一步被引入所述流体通道。流体通道(不包括微孔)中的流体被共同注入的第一流体置换。共同注入的第一流体已经通过与入口紧邻的微孔并且所述微孔现在包含第一含水液体和第二含水液体的混合物(“A1+A2”)。共同注入的第二流体被描绘为密封与入口紧邻的微孔的内容物。共同注入的第一流体被显示为与位于流体通道中部的微孔的内容物的表面接合，其中共同注入的第一流体的一种或更多种成分处于(例如，通过扩散)进入微孔的内容物的过程中(“A1+(A2)”)。共同注入的第一流体尚未到达与出口相邻的微孔。共同注入的第二流体被描绘为在共同注入之后密封多个微孔中的内容物。
图6D描绘了通过将包括第一非水液体(“NA1”)的预充流体注入流体通道来预充流动池。包括气体(“G”)的置换流体被注入所述流体通道并且从流体通道(不包括微孔)中置换所述预充流体。在共同注入之前，微孔包含第一非水液体(“NA1”)，并且流体通道(不包括微孔)包含气体(“G”)。接下来，包含第二非水液体(“NA2”)的第一流体和包含第一含水液体(“A1”)的第二流体被共同注入所述流体通道，其中共同注入的第一流体恰好在共同注入的第二流体前一步被引入流体通道。流体通道(不包括微孔)中的流体被共同注入的第一流体置换。共同注入的第一流体已经通过与入口紧邻的微孔，并且所述微孔现在包含第一非水液体和第二非水液体的混合物(“NA1+NA2”)。共同注入的第二流体被描绘为密封与入口紧邻的微孔中的内容物。共同注入的第一流体被显示为与位于流体通道中部的微孔的内容物的表面接合，其中共同注入的第一流体的一种或更多种成分处于(例如，通过扩散)进入微孔的内容物的过程中(“NA1+(NA2)”)。共同注入的第一流体尚未到达与出口相邻的微孔。共同注入的第二流体被描绘为在所述共同注入之后密封多个微孔中的内容物。
在一些实施方案中，第一流体的流速等于第二流体的流速。在一些实施方案中，第一流体和第二流体不混溶。在一些实施方案中，第一流体的密度大于第二流体的密度。在一些实施方案中，第一流体的密度大于第二流体的密度，并且其中第一流体和第二流体不混溶。第一流体可以包括第二含水液体并且第二流体可以包括第一非水流体。第一流体可以包括第二含水液体并且第二流体可以包括气体。第一流体可以包括第二非水液体并且第二流体可以包括第二含水液体。第二流体可以具有与置换流体相同的组成或与置换流体不同的组成。第一流体可以具有与置换流体不同的组成。如本文所用，术语“不混溶”应具备普通含义，并且还应指在给定的条件或一组条件(例如，温度和/或压力)下至少两个相或流体不相混合，使得所述至少两个相或流体即使在这些相已经历了某种类型的机械或物理搅拌(例如，气体与液体接触，非水液体与含水液体接触)之后仍维持或保持至少部分地分离。在一些实施方案中，所述至少两个相或流体即使在这些相已经历了某种类型的机械或物理搅拌之后仍然维持或保持完全地分离。气体可以是任意气体，诸如例如空气、氮气或氩气。在一些实施方案中，非水液体是油(例如，癸烷、十四烷或十六烷、硅油、矿物油)、烃、碳氟化合物或它们的任意组合
第一流体的一种或更多种成分扩散到微孔中可以产生第一流体和初始微孔液的第一混合物。在一些实施方案中，第一流体的一种或更多种成分以较低浓度存在于初始微孔液中或不存在于初始微孔液中。第一混合物中可以包括的第一流体的一种或更多种成分的浓度为、约为、至多为或至少为初始微孔液中第一流体的一种或更多种成分的浓度的2倍(例如，2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍或更高以及其中的重叠范围)。
在一些实施方案中，所述持续时间小于反应持续时间。在一些实施方案中，反应在所述持续时间发生后开始。在一些实施方案中，反应在第二流体密封微孔的内容物之后开始。在一些实施方案中，持续时间足够短以致微孔的一种或更多种成分不会扩散到微孔外。微孔的一种或更多种成分可以包括细胞、珠粒、生物分子、缓冲成分、小分子、生物分子、试剂、作用剂或它们的任意组合。反应持续时间可以介于约1秒和约6小时之间(例如，1秒、30秒、1分钟、5分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时和其中的重叠范围)。持续时间可以动态控制。在一些实施方案中，持续时间是第一流体的体积、第一流体的流速、流动池尺寸或它们的任意组合的函数。持续时间可以通过调节第一流体的体积、第一流体的流速或它们的任意组合来动态控制。在一些实施方案中，在所述持续时间之后微孔中第一流体的一种或更多种成分的最终浓度是持续时间和/或流动池尺寸的函数。在一些实施方案中，第一流体的流速随着其穿过流体通道而逐渐降低，其中在多个微孔中，第一流体的一种或更多种成分在每个微孔中的最终浓度是均匀的。在一些实施方案中，进入微孔内容物的第一流体的一种或更多种成分使反应终止。
在流和底部之间的边界处的流动速度可以是非零的。跨流体通道横截面的流的相对流速可以近似恒定。在一些实施方案中，流是活塞流。在一些实施方案中，顶部包括亲水涂层(例如，聚乙二醇(PEG)、聚Hema、pluronic酸F68、pluronic酸F108、pluronic酸F127、聚山梨醇酯20、二氧化硅(SiO2)和/或氮化硅)。在一些实施方案中，顶部的角度远小于第一侧壁的接触角。在一些实施方案中，第一流体是第一塞并且第二流体是第二塞。在一些实施方案中，预充流体、置换流体、第一次共同注入的第一流体、第一次共同注入的第二流体、第二次共同注入的第一流体、第二次共同注入的第二流体、第三次共同注入的第一流体、第三次共同注入的第二流体、第四次共同注入的第一流体、第四次共同注入的第二流体、第五次共同注入的第一流体和/或第五次共同注入的第二流体是塞。
在一些实施方案中，密封微孔的内容物的第二流体减少了相互干扰。在一些实施方案中，与利用单一流体注入进行的可比较的流动池方法相比，密封微孔的内容物的第二流体将相互干扰减少了、约减少了、约至多或约至少减少了2％(例如，2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、40％、50％、75％、100％或更高以及其中的重叠范围)。相互干扰可以包括核酸、蛋白质、抗体、生物分子或它们的任意组合从一个微孔扩散到另一个微孔。相互干扰可以包括核酸、蛋白质、抗体、生物分子或它们的任意组合从微孔扩散到流体通道的容积或空间(微孔上方)。在一些实施方案中，基板可以包括微孔阵列，其中微孔阵列包括至少100个微孔，其中每个微孔具有的容积在约1,000μm3至约786,000μm3的范围内。在一些实施方案中，减少的相互干扰使得能够使用较高密度的微孔阵列而不会伴随增大的相互干扰。与标准微孔阵列相比，较高密度的微孔阵列每平方英寸可以包括至少100个以上的微孔。在一些实施方案中，与标准微孔阵列相比，使用较高密度的微孔阵列提高了细胞装载效率和/或珠粒装载效率。与标准微孔阵列相比，使用较高密度的微孔阵列可以减少双重态事件的数量。
所述方法可以包括在共同注入之前在多个微孔中捕获单细胞。所述方法可以包括，在共同注入之前，在多个微孔中捕获单细胞和单个珠粒，其中单个珠粒包含多个拴系条形码，并且其中多个拴系条形码还包括：i)珠粒-特异性的细胞标记；ii)多样化的分子标记的组；和/或iii)能够与核酸分子杂交的多个靶结合区域。反应可以包括细胞裂解。第一流体可以包括裂解缓冲液。在一些实施方案中，持续时间是足以向微孔递送足够将细胞裂解的量的裂解缓冲液的时间长度。在一些实施方案中，与利用单一流体注入进行的可比较的流动池方法相比，密封微孔的内容物的第二流体带来被条形码捕获的mRNA和/或细胞成分结合试剂寡核苷酸的数量的增加。与利用单一流体注入进行的可比较的流动池方法相比，密封微孔内容物的第二流体可以使被条形码捕获的mRNA和/或细胞成分结合试剂寡核苷酸的数量增加、约增加、约至多或约至少增加2％(例如，2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、40％、50％、75％、100％或更高以及其中的重叠范围)。
在一些实施方案中，与利用单一流体注入进行的可比较的流动池方法相比，密封微孔内容物的第二流体带来与所测定的每个mRNA和/或细胞成分结合试剂寡核苷酸相关联的特有分子标记的存在数量的增加。与利用单一流体注入进行的可比较的流动池方法相比，密封微孔内容物的第二流体可以使与所测定的每个mRNA和/或细胞成分结合试剂寡核苷酸相关联的特有分子标记的存在数量增加、约增加、约至多或约至少增加2％(例如，2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、40％、50％、75％、100％或更高以及其中的重叠范围)。
在一些实施方案中，与利用单一流体注入进行的可比较的流动池方法相比，密封微孔的内容物的第二流体带来信噪比的增大。与利用单一流体注入进行的可比较的流动池方法相比，密封微孔内容物的第二流体可以使信噪比增大、约增大、约最多或约最少增大2％(例如，2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、40％、50％、75％、100％、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、20x、30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、100x或更高以及其中的重叠的范围。
在一些实施方案中，所述方法不包括使用缓冲添加剂来减少相互干扰，诸如例如调节流体和/或试剂粘度的缓冲添加剂。缓冲添加剂可以包括蔗糖、聚乙二醇(PEG)、聚蔗糖、丙三醇、甘油、硫酸葡聚糖、histopaque、牛血清白蛋白或它们的任意组合。
在一些实施方案中，提供了一种包括流动池的装置，所述流动池包括至少一个入口端和至少一个出口端，其中所述至少一个入口端和至少一个出口端能够引导流体流通过流动池，从而使微孔与流体接触。在一些实施方案中，所述包括流动池的装置是被配置为对多个单细胞进行自动化的条形码编码分析的仪器系统的可移除的消耗组件。
不均匀的流速
第一流体的流速可以沿着流体通道的纵向路径是均匀的或不均匀的。在一些实施方案中，第一流体的流速沿流体通道的纵向路径而改变(例如，增大和/或减小)。在一些实施方案中，第一流体的流速变化可以是线性的、非线性的、指数型的、对数型的或它们的任意组合。在一些实施方案中，第一流体的流速在沿着流体通道的纵向路径的前部位置处相对于沿着流体通道的纵向路径的后部位置处要高，而在其他实施方案中，第一流体的流速在沿着流体通道的纵向路径的前部位置处相对于在沿流体通道的纵向路径的后部位置处要低。在一些实施方案中，在前部位置处相对于在后部位置处的第一流体的流速之间的差异为、约为、约至多或约至少为1.1倍。在一些实施方案中，在前部位置处相对于在后部位置处的第一流体的流速之比在1:100至100:1的范围内。在一些实施方案中，在前部位置处相对于在后部位置处的第一流体的流速之比为至多10:1。在一些实施方案中，在前部位置处相对于在后部位置处的第一流体的流速之比为至多100:1。在一些实施方案中，在前部位置处相对于在后部位置处的第一流体的流速之比为至多1:1000。在一些实施方案中，在前部位置处相对于在后部位置处的第一流体的流速之比为至少1:10。在一些实施方案中，在前部位置处相对于在后部位置处的第一流体的流速之比为至少1:100。在一些实施方案中，在前部位置处相对于在后部位置处的第一流体的流速之比为至少1:1000。
在一些实施方案中，在前部位置处相对于在后部位置处的第一流体的流速之比可以是或约是1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39、1:40、1:41、1:42、1:43、1:44、1:45、1:46、1:47、1:48、1:49、1:50、1:51、1:52、1:53、1:54、1:55、1:56、1:57、1:58、1:59、1:60、1:61、1:62、1:63、1:64、1:65、1:66、1:67、1:68、1:69、1:70、1:71、1:72、1:73、1:74、1:75、1:76、1:77、1:78、1:79、1:80、1:81、1:82、1:83、1:84、1:85、1:86、1:87、1:88、1:89、1:90、1:91、1:92、1:93、1:94、1:95、1:96、1:97、1:98、1:99、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:9000、1:10000、或这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，在前部位置处相对于在后部位置处的第一流体的流速之比可以是至少或至多1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39、1:40、1:41、1:42、1:43、1:44、1:45、1:46、1:47、1:48、1:49、1:50、1:51、1:52、1:53、1:54、1:55、1:56、1:57、1:58、1:59、1:60、1:61、1:62、1:63、1:64、1:65、1:66、1:67、1:68、1:69、1:70、1:71、1:72、1:73、1:74、1:75、1:76、1:77、1:78、1:79、1:80、1:81、1:82、1:83、1:84、1:85、1:86、1:87、1:88、1:89、1:90、1:91、1:92、1:93、1:94、1:95、1:96、1:97、1:98、1:99、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:9000或1:10000。
在一些实施方案中，所述比值可以是或约是1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.5:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48:1、49:1、50:1、51:1、52:1、53:1、54:1、55:1、56:1、57:1、58:1、59:1、60:1、61:1、62:1、63:1、64:1、65:1、66:1、67:1、68:1、69:1、70:1、71:1、72:1、73:1、74:1、75:1、76:1、77:1、78:1、79:1、80:1、81:1、82:1、83:1、84:1、85:1、86:1、87:1、88:1、89:1、90:1、91:1、92:1、93:1、94:1、95:1、96:1、97:1、98:1、99:1、100:1、200:1、300:1、400:1、500:1、600:1、700:1、800:1、900:1、1000:1、2000:1、3000:1、4000:1、5000:1、6000:1、7000:1、8000:1、9000:1、10000:1，或这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，所述比值可以至少是或至多是1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.5:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48:1、49:1、50:1、51:1、52:1、53:1、54:1、55:1、56:1、57:1、58:1、59:1、60:1、61:1、62:1、63:1、64:1、65:1、66:1、67:1、68:1、69:1、70:1、71:1、72:1、73:1、74:1、75:1、76:1、77:1、78:1、79:1、80:1、81:1、82:1、83:1、84:1、85:1、86:1、87:1、88:1、89:1、90:1、91:1、92:1、93:1、94:1、95:1、96:1、97:1、98:1、99:1、100:1、200:1、300:1、400:1、500:1、600:1、700:1、800:1、900:1、1000:1、2000:1、3000:1、4000:1、5000:1、6000:1、7000:1、8000:1、9000:1或10000:1。
图10A提供了经历第一流体和第二流体的共同注入的示例性流动池的示意图，其中第一流体的流速沿着流动池的纵向路径是不均匀的。在第一次共同注入之前，微孔包含第一含水液体(“A1”)并且流体通道(不包括微孔)包含气体(“G”)。接下来，将包含第二含水液体(“A2”)的第一流体和包含第一非水液体(“NA1”)的第二流体共同注入到流体通道中，其中共同注入的第一流体恰好在共同注入的第二流体前一步被引入到流体通道中。流体通道(不包括微孔)中的流体被共同注入的第一流体置换。第一流体的流速沿着流动池的纵向路径是不均匀的，使得第一流体在流动通道前部的流速(“流速1”)、在流动通道中部分的流速(“流速2”)和在流动通道后部的流速(“流速3”)不相等。
图10B提供了非限制性示例图表，其示出了包含分析物的共同注入的第一流体沿着流动池的纵向路径(细线)的不均匀流速以及沿着流动池纵向路径的微孔内容物中的不均匀的分析物浓度。
图10A和图10B显示在第二含水流体通过流动池时，第二含水流体(例如含水缓冲液)的流速可以增大。第一流速可以小于第二流速，而第二流速又可以依次小于第三流速。第二含水流体从主体流体扩散到微孔的持续时间随着流速的增大而减少，导致位于流动或流体通道的与该流速相对应的横截面处的微孔的第二含水流体的成分浓度较低。通过以高精度动态地改变第二含水流体的速率，可以沿着微孔阵列精确地控制第二含水流体或其中的成分或内容物的所得的浓度分布。例如，如果含有给定分析物的缓冲液(例如，具有活塞流)以连续增大的流速通过流动池，则微孔中的所得分析物浓度可以沿着流动通道的路径长度持续降低。当分配流速在流动通道的各个部分处变化时，可以利用所述方法来控制沿流动通道的纵向路径的微孔中的一种或更多种分析物的浓度。
在一些实施方案中，在共同注入之后，多个微孔的内容物中第一流体的一种或更多种成分的最终浓度是均匀的。在一些实施方案中，在共同注入后，多个微孔的内容物中第一流体的一种或更多种成分的最终浓度的变化系数小于5％(例如，5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.01％以及其中的重叠范围)。在一些实施方案中，在顺序地共同注入后多个微孔的内容物中第一流体的一种或更多种成分的最终浓度是不均匀的。每个微孔的内容物中第一流体的一种或更多种成分的最终浓度可以沿着流体通道的纵向路径变化。每个微孔的内容物中第一流体的一种或更多种成分的最终浓度的变化可以是线性的、非线性的、指数型的和/或对数型的。在一些实施方案中，在沿着流体通道的纵向路径的前部位置处相对于在沿着流体通道的纵向路径的后部位置处的微孔内容物中的第一流体的一种或更多种成分的最终浓度之间的差异是、约是、约至多是或者约至少是1.1倍。在一些实施方案中，在沿着流体通道的纵向路径的前部位置处相对于在沿着流体通道的纵向路径的后部位置处的微孔的内容物中第一流体的一种或更多种成分的最终浓度之比的范围在1:100到100:1之间。在一些实施方案中，在沿着流体通道的纵向路径的前部位置处相对于在沿着流体通道的纵向路径的后部位置处的微孔的内容物中第一流体的一种或更多种成分的最终浓度之比最多为10:1。在一些实施方案中，在沿着流体通道的纵向路径的前部位置处相对于在沿着流体通道的纵向路径的后部位置处的微孔的内容物中第一流体的一种或更多种成分的最终浓度之比最多为100:1。在一些实施方案中，在沿着流体通道的纵向路径的前部位置处相对于在沿着流体通道的纵向路径的后部位置处的微孔的内容物中第一流体的一种或更多种成分的最终浓度之比最多为1:1000。在一些实施方案中，在沿着流体通道的纵向路径的前部位置处相对于在沿着流体通道的纵向路径的后部位置处的微孔的内容物中第一流体的一种或更多种成分的最终浓度之比至少是1:10。在一些实施方案中，在沿着流体通道的纵向路径的前部位置处相对于在沿着流体通道的纵向路径的后部位置处的微孔的内容物中第一流体的一种或更多种成分的最终浓度之比至少是1:100。在一些实施方案中，在沿着流体通道的纵向路径的前部位置处相对于在沿着流体通道的纵向路径的后部位置处的微孔的内容物中第一流体的一种或更多种成分的最终浓度之比至少是1:1000。
在一些实施方案中，在沿着流体通道的纵向路径的前部位置处相对于在沿着流体通道的纵向路径的后部位置处的微孔的内容物中的第一流体的一种或更多种成分的最终浓度之比可以是或约是1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39、1:40、1:41、1:42、1:43、1:44、1:45、1:46、1:47、1:48、1:49、1:50、1:51、1:52、1:53、1:54、1:55、1:56、1:57、1:58、1:59、1:60、1:61、1:62、1:63、1:64、1:65、1:66、1:67、1:68、1:69、1:70、1:71、1:72、1:73、1:74、1:75、1:76、1:77、1:78、1:79、1:80、1:81、1:82、1:83、1:84、1:85、1:86、1:87、1:88、1:89、1:90、1:91、1:92、1:93、1:94、1:95、1:96、1:97、1:98、1:99、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:9000、1:10000，或这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，在沿着流体通道的纵向路径的前部位置处相对于在沿着流体通道的纵向路径的后部位置处的微孔的内容物中第一流体的一种或更多种成分的最终浓度之比可以至少是或至多是1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39、1:40、1:41、1:42、1:43、1:44、1:45、1:46、1:47、1:48、1:49、1:50、1:51、1:52、1:53、1:54、1:55、1:56、1:57、1:58、1:59、1:60、1:61、1:62、1:63、1:64、1:65、1:66、1:67、1:68、1:69、1:70、1:71、1:72、1:73、1:74、1:75、1:76、1:77、1:78、1:79、1:80、1:81、1:82、1:83、1:84、1:85、1:86、1:87、1:88、1:89、1:90、1:91、1:92、1:93、1:94、1:95、1:96、1:97、1:98、1:99、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:9000或1:10000。
在一些实施方案中，所述比值可以是或约是1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.5:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48:1、49:1、50:1、51:1、52:1、53:1、54:1、55:1、56:1、57:1、58:1、59:1、60:1、61:1、62:1、63:1、64:1、65:1、66:1、67:1、68:1、69:1、70:1、71:1、72:1、73:1、74:1、75:1、76:1、77:1、78:1、79:1、80:1、81:1、82:1、83:1、84:1、85:1、86:1、87:1、88:1、89:1、90:1、91:1、92:1、93:1、94:1、95:1、96:1、97:1、98:1、99:1、100:1、200:1、300:1、400:1、500:1、600:1、700:1、800:1、900:1、1000:1、2000:1、3000:1、4000:1、5000:1、6000:1、7000:1、8000:1、9000:1、10000:1，或这些值中任意两个值之间的数量或范围。在一些实施方案中，所述比值可以至少是或至多是1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.5:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48:1、49:1、50:1、51:1、52:1、53:1、54:1、55:1、56:1、57:1、58:1、59:1、60:1、61:1、62:1、63:1、64:1、65:1、66:1、67:1、68:1、69:1、70:1、71:1、72:1、73:1、74:1、75:1、76:1、77:1、78:1、79:1、80:1、81:1、82:1、83:1、84:1、85:1、86:1、87:1、88:1、89:1、90:1、91:1、92:1、93:1、94:1、95:1、96:1、97:1、98:1、99:1、100:1、200:1、300:1、400:1、500:1、600:1、700:1、800:1、900:1、1000:1、2000:1、3000:1、4000:1、5000:1、6000:1、7000:1、8000:1、9000:1或10000:1。在一些实施方案中，每个微孔的内容物中第一流体的一种或更多种成分的最终浓度沿着流体通道的纵向路径而增大。在一些实施方案中，每个微孔的内容物中第一流体的一种或更多种成分的最终浓度沿着流体通道的纵向路径而减小。
图11提供了经历第一流体和第二流体的共同注入的流动池的前部、中部和后部的示例性示意图，其中第一流体的流速沿着流动池的纵向路径是不均匀的。
如图所示，可以将细胞和珠粒装载到分区(如，微孔)中(图中顶部的行)。接下来，可以创建沿流动池纵向路径长度的所需分析物浓度分布(图中部的行)。可以创建具有多种不同浓度分布的多种分析物。微孔可以用油密封，以将细胞、珠粒和分析物限制在物理分隔的微反应腔室中并进行孵育(图底部的行)。随后，可以进行分析测定。例如，可以使用针对细胞的RhapsodyTM RNA表达分析或RhapsodyTM蛋白质表达分析来确定在单细胞水平上分析物浓度的影响。
在共同注入之前，流体通道包含空气并且微孔包含单个珠粒(“B”)、单个细胞(“C”)和第一含水液体。接下来，将包含第二含水液体(“A2”)的第一流体和包含第一非水液体(“NA1”)的第二流体共同注入流体通道，其中第一次共同注入的第一流体恰好在第一次共同注入的第二流体前一步被引入流体通道。第二含水液体(“A2”)包含分析物。流体通道(不包括微孔)中的流体被第一次共同注入的第一流体置换。第一流体的流速沿着流动池的纵向路径是不均匀的，使得第一流体在流动通道前部的流速(“流速1”)、在流动通道中部的流速(“流速2”)和在流动通道后部的流速(“流速3”)不相等。共同注入的第一流体已经通过的微孔现在包含第一含水液体和第二含水液体的分析物的混合物(“A1+A2”)。对于其中显示第一流体与微孔内容物的表面接合的微孔，第一流体的分析物处于进入微孔内容物的过程中(“A1+(A2)”)。共同注入的第二流体被描绘为在共同注入之后密封多个微孔中的内容物。由于第一流体沿着流动池的纵向路径的不均匀的流速，第一流体与微孔内容物的表面接合的持续时间是可变的，因此沿着流动池的纵向路径在微孔的内容物中的分析物的最终浓度是不均匀的。
流动池尺寸(例如，微孔的容积和/或微孔与流体通道(不包括微孔)接合的表面面积)在多个微孔中可以是均匀的或不均匀的。在一些实施方案中，沿着流体通道的纵向路径的前部位置处相对于在沿着流体通道的纵向路径的后部位置处的微孔的容积之间的差异是、约是、约至多或约至少是1.1倍(例如，1.1、1.3、1.5、1.7、1.9、2.0、2.5、3、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍或更高以及其中的重叠范围)。在一些实施方案中，在沿着流体通道的纵向路径的前部位置处相对于在沿着流体通道的纵向路径的后部位置处的微孔与流体通道(不包括微孔)接合的表面面积之间的差异是、约是、约至多或约至少是1.1倍(例如，1.1、1.3、1.5、1.7、1.9、2.0、2.5、3、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍或更高以及其中的重叠范围)。
流体的共同注入
在一些实施方案中，所述方法可以包括向流体通道第二次共同注入流体。在一些实施方案中，第二次共同注入流体包括将第二次共同注入的第一流体和第二次共同注入的第二流体共同注入到流体通道中，其中第二次共同注入的第一流体恰好在第二次共同注入的第二流体前一步被引入流体通道，并且其中第二次共同注入的第二流体密封微孔的内容物。在一些实施方案中，第二次共同注入的第一流体和第二次共同注入的第二流体不混溶。在一些实施方案中，第二次共同注入的第一流体的密度大于第二次共同注入的第二流体的密度。在一些实施方案中，第二次共同注入的第一流体的密度大于第二次共同注入的第二流体的密度，并且其中第二次共同注入的第一流体和第二次共同注入的第二流体不混溶。在一些实施方案中，共同注入的第一流体的密度大于共同注入的第二流体的密度，并且其中共同注入的第一流体和共同注入的第二流体不混溶。
第二次共同注入可以在相对于第一次共同注入的相反方向上进行。第二次共同注入的第一流体可以包括含水液体并且第二次共同注入的第二流体可以包括非水液体。第二次共同注入的第一流体可以包括含水液体并且第二次共同注入的第二流体可以包括气体。
第二次共同注入的第一流体可以包括非水液体，而第二次共同注入的第二流体可以包括含水液体。在一些实施方案中，第一次共同注入的第一流体和第二次共同注入的第一流体可以相同或不同。在一些实施方案中，第一次共同注入的第二流体和第二次共同注入的第二流体可以相同或不同。
两次共同注入流体
图7描绘了用于向流动池第一次共同注入第一流体和第二流体，随后向流动池第二次共同注入第一流体和第二流体的非限制性示例工作流程。图7描绘了通过将包括第一含水液体(“A1”)的预充流体注入流体通道来预充流动池。包括气体(“G”)的置换流体被注入流体通道并且从流体通道(不包括微孔)中置换所述预充流体。在第一次共同注入之前，微孔包含第一含水液体(“A1”)并且流体通道(不包括微孔)包含气体(“G”)。接下来，将包含第二含水液体(“A2”)的第一流体和包含气体(“G”)的第二流体共同注入流体通道，其中第一次共同注入的第一流体恰好在第一次共同注入的第二流体前一步被引入流体通道。流体通道(不包括微孔)中的流体被第一次共同注入的第一流体置换。第一次共同注入的第一流体已经通过与入口紧邻的微孔，并且所述微孔现在包含第一含水液体和第二含水液体的混合物(“A1+A2”)。描绘了第一次共同注入的第二流体密封与入口紧邻的微孔中的内容物。第一次共同注入的第一流体被显示为与位于流体通道中部的微孔的内容物的表面接合，其中第一次共同注入的第一流体的一个或更多个成分处于进入微孔的内容物的过程中(“A1+(A2)”)。第一次共同注入的第一流体尚未到达与出口相邻的微孔。第一次共同注入的第二流体被描绘为在第一次共同注入之后密封多个微孔中的内容物。在第二次共同注入之前，微孔包含第一含水液体和第二含水液体的混合物(“A1+A2”)并且流体通道(不包括微孔)的容积或空间包含气体(“G”)。接下来，将包含第三含水液体(“A3”)的第一流体和包含第一非水液体(“NA1”)的第二流体共同注入流体通道，其中第二次共同注入的第一流体恰好在第二次共同注入的第二流体前一步被引入流体通道。流体被第二次共同注入的第一流体置换。第二次共同注入的第一流体已通过紧邻入口的微孔，并且所述微孔现在包含第一含水液体、第二含水液体和第三含水液体的混合物(“A1+A2+A3”)。第二次共同注入的第二流体被描绘为密封紧邻入口的微孔中的内容物。第二次共同注入的第一流体被显示为与位于流体通道中部的微孔的内容物的表面接合，其中第二次共同注入的第一流体的一种或更多种成分处于进入微孔的内容物的过程中(“A1+A2+(A3)”)。第二次共同注入的第一流体尚未到达与出口相邻的微孔。第二次共同注入的第二流体被描绘为在第二次共同注入之后密封多个微孔中的内容物。
多次共同注入流体
本文所公开的包括用于引入一种或更多种成分的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)将第一流体引入包括顶部、第一侧壁和底部的流体通道，其中流体通道的底部包括多个微孔，并且其中流体通道的顶部、第一侧壁和底部围绕流体通道的除多个微孔中的每个微孔的容积之外(例如，在微孔上方)的流体通道容积，由此流体通道容积和多个微孔中的每个微孔包含第一流体；(b)将第一置换流体引入所述流体通道以从流体通道容积中置换第一流体；(d)以第二流速将多种第二流体中的每种第二流体随后紧接着第二置换流体和/或与第二置换流体同时引入流体通道，其中当第二流体与微孔中的内容物接触第一持续时间时，多种第二流体中的每一种的一种或更多种成分进入微孔中的内容物，并且其中第二置换流体从流体通道容积中置换第二流体和/或密封微孔中的内容物。
图8A至图8C描绘了用于将流体注入流动池的非限制性示例工作流程。字母n表示每种类型的流体(气体(“G”)、含水液体(“A”)和非水液体(“NA”)已注入流动池的次数。返回箭头表示共同注入第一流体和第二流体的步骤，其中共同注入的第二流体包括为(n+1)的流体。在一些实施方案中，将非水液体或气体(“NA/G”)注入流体通道。在一些实施方案中，将含水液体或气体(“A/G”)被注入流体通道。
图8A所示的工作流程开始于将含水流体(例如，预充流体)注入流体通道(n＝1)。置换气体被注入流体通道(n＝1)并从流体通道中置换所述含水流体。在一次或更多次共同注入第一流体(例如，含水流体An+1，其中n＝1)和第二流体(例如，气体Gn，其中在将n增加1之后n＝2)之后，微孔内容物被密封(例如，通过NAn+1，其中n＝2)。
图8C所示的工作流程开始于将含水流体(例如，An，其中n＝1)注入流体通道。置换的非水流体或气体(例如，NA或Gn，其中n＝1)被注入流体通道并从流体通道中置换所述含水流体。这两种流体或气体可以不共同注入。随后第一次共同注入含水流体(例如，An+1，其中n＝1)和非水流体或气体(例如，NA或Gn+1，其中n＝1)和第二次共同注入含水流体(例如An+1，其中n＝2)和非水流体或气体(例如NA或Gn+1，其中n＝2)(或附加的共同注入，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多)。最后的非水流体或气体可以密封微孔的内容物。
图8C所示的工作流程开始于将非水流体(例如，NAn，其中n＝1)注入流体通道。置换的含水流体或气体(例如，A或Gn，其中n＝1)被注入流体通道并从流体通道中置换所述非水流体。这两种流体或气体可以不共同注入。随后第一次共同注入非水流体(例如，NAn+1，其中n＝1)和含水流体或气体(例如，A或Gn+1，其中n＝1)和第二次共注入非水流体(例如，An+1，其中n＝2)和含水流体或气体(例如，A或Gn+1，其中n＝2)(或附加的共同注入，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多)。最后的含水流体或气体可以密封微孔的内容物。
在一些实施方案中，所述方法可以包括2、3、4、5、6、7、9、9或更多次共同注入第一流体和第二流体。下面的表1-4比较了用于执行单次共同注入第一流体和第二流体(表1)、两次共同注入第一流体和第二流体(表2)、三次共同注入第一流体和第二流体(表3)以及四次共同注入第一流体和第二流体(表4)的非限制性示例工作流程。
表1：示例性共同注入工作流程中使用的流体
Figure BDA0003255081130001061
表2：示例性共同注入工作流程中使用的流体
Figure BDA0003255081130001062
Figure BDA0003255081130001071
表3：示例性共同注入工作流程中使用的流体
Figure BDA0003255081130001072
表4：示例性共同注入工作流程中使用的流体
Figure BDA0003255081130001081
Figure BDA0003255081130001091
引入一种更多种成分
在一些实施方案中，提供了用于引入一种或更多种成分的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)将第一流体引入包括顶部、第一侧壁和底部的流体通道，其中流体通道的底部包括多个微孔，并且其中流体通道的顶部、第一侧壁和底部围绕流体通道的流体通道容积，由此所述流体通道容积和多个微孔中的每个微孔包含第一流体；(b)以第一流速将第一置换流体引入所述流体通道以从流体通道容积中置换第一流体；(c)以第二流速将第二流体随后紧接着第二置换流体和/或与第二置换流体同时引入所述流体通道，其中当第二流体与微孔的内容物接触第一持续时间时，第二流体的一种或更多种成分进入微孔中的内容物，并且其中第二置换流体从流体通道容积中置换第二流体和/或密封所述微孔中的内容物。
所述方法可以包括(c)以第三流速将第三流体随后紧接着第三置换流体和/或与第三置换流体同时引入所述流体通道，其中当第三流体与微孔的内容物接触第二持续时间时，第三流体的一种或更多种成分进入微孔中的内容物，并且其中第三置换流体从流体通道容积中置换第三流体和/或密封所述微孔中的内容物。
在一些实施方案中，提供了用于引入一种或更多种成分的方法。本文所公开的包括用于引入一种或更多种成分的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)将第一流体引入包括顶部、第一侧壁和底部的流体通道，其中流体通道的底部包括多个微孔，并且其中流体通道的顶部、第一侧壁和底部围绕流体通道的流体通道容积，由此所述流体通道容积和多个微孔中的每个微孔包含第一流体；(b)将第一置换流体引入所述流体通道以从流体通道容积中置换第一流体；(c)以第二流速将多种第二流体中的每种第二流体随后紧接着第二置换流体和/或与第二置换流体同时引入所述流体通道，其中当第二流体与微孔的内容物接触第一持续时间时，多种第二流体中的每一种的一种或更多种成分进入微孔中的内容物，并且其中第二置换流体从流体通道容积中置换第二流体和/或密封所述微孔中的内容物。
在一些实施方案中，提供了用于引入一种或更多种成分的方法。本文所公开的包括用于引入一种或更多种成分的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)提供包括顶部、第一侧壁和底部的流体通道，其中流体通道的底部包括多个包含第一流体的微孔，其中流体通道的顶部、第一侧壁和底部围绕流体通道的流体通道容积，并且其中流体通道容积不含第一流体；(b)以第二流速将多种第二流体中的每种第二流体随后紧接着第二置换流体和/或与第二置换流体同时引入所述流体通道，其中当第二流体与微孔的内容物接触第一持续时间时，多种第二流体中的每一种的一种或更多种成分进入微孔中的内容物，并且其中第二置换流体从流体通道容积中置换第二流体和/或密封所述微孔中的内容物。
提供流体通道可以包括：将第一流体引入流体通道，由此流体通道容积和多个微孔中的每个微孔包含第一流体；以及(b)将第一置换流体引入所述流体通道以从流体通道容积中置换第一流体。在一些实施方案中，所述方法包括恰好在引入多种第二流体中的第二流体前一步引入第三置换流体。所述方法可以包括在引入第二置换流体之后立即引入第三置换流体。在一些实施方案中，所述方法包括恰好在引入第二置换流体前一步引入第三置换流体。所述方法可以包括恰好在引入多种第二流体中的第二流体前一步引入第三流体。在一些实施方案中，所述方法包括在引入第二置换流体之后立即引入第三流体，而在其他实施方案中，恰好在引入第二置换流体前一步引入第三流体。
在一些实施方案中，第一流体是第一塞并且第二流体是第二塞。第一流体、第二流体、第三流体、第四流体、第五流体、第六流体、第七流体、预充流体、第一置换流体、第二置换流体、第三置换流体和/或第四置换流体可以是塞。
第二流体和/或第三流体可以通过扩散进入微孔的内容物。在一些实施方案中，微孔的内容物中第二流体的一种或更多种成分的浓度与接触的第一持续时间有关，并且/或者微孔的内容物中第三流体的一种或更多种成分的浓度与接触的第二持续时间有关。在一些实施方案中，接触的第一持续时间与流动通道中第二流体的第一速度和第二流体的体积有关，并且/或者接触的第二持续时间与流动通道中第三流体的第二速度和第三流体的体积有关。接触的第一持续时间可以取决于流动通道中第二流体的第一速度和流动通道中第二流体的纵向长度，和/或接触的第二持续时间取决于流动通道中第三流体的第二速度和流动通道中第三流体的纵向长度。
流动通道中第二流体的纵向长度可以取决于所引入的第二流体的体积、流体通道容积的体积、流动池的容积或它们的组合，并且/或者流动通道中第三流体的纵向长度取决于引入的第三流体的体积、流体通道容积的体积、流动池的体积或它们的组合。在一些实施方案中，第一流速为固定流速，第二流速为固定流速，和/或第三流速为固定流速。在一些实施方案中，第一流速是可变流速，第二流速是可变流速，和/或第三流速是可变流速。在一些实施方案中，第一流速是递增的流速，第二流速是递增的流速，和/或第三流速是递增的流速。在一些实施方案中，第一流速为递减的流速，第二流速为递减的流速，和/或第三流速为递减的流速。
引入第一流体和/或第一置换流体可以包括以第一流速将第一流体随后紧接着第一置换流体和/或与第一置换流体同时共同注入。引入第一流体和/或第一置换流体可以包括使用泵引入第一流体和/或第一置换流体。在一些实施方案中，将第二流体随后紧接着第二置换流体和/或与第二置换流体同时引入流体通道包括将第二流体随后接着第二置换流体共同注入。将第二流体随后紧接着第三置换流体和/或与第三置换流体同时引入可以包括使用泵将第三流体随后紧接着第三流体和/或与第三流体同时引入。在一些实施方案中，将第三流体随后紧接着第三置换流体和/或与第三置换流体同时引入流体通道包括将第三流体随后接着第三置换流体共同注入。在一些实施方案中，将第三流体随后紧接着第三置换流体和/或与第三置换流体同时引入包括使用泵将第三流体随后紧接着第三流体和/或与第三流体同时引入。
第一流体和/或第一置换流体可以通过非层流被引入流体通道，第二流体和/或第二置换流体可以通过非层流被引入流体通道，并且/或者第三流体和/或第三置换流体可以通过非层流被引入流体通道。在一些实施方案中，流体通道被配置用于通过非层流引入第一流体、第一置换流体、第二流体、第二置换流体、第三流体和/或第三置换流体。在一些实施方案中，非层流可以是活塞流或近似活塞流。
可以经由包括流体通道的流动池的第一开口将第一流体引入流体通道，并且经由流动池的第二开口从流体通道容积中置换第一流体。可以经由包括流体通道的流动池的第一开口将第二流体引入流体通道，并且经由流动池的第二开口从流体通道容积中置换第二流体。在一些实施方案中，经由包括流体通道的流动池的第一开口将第三流体引入流体通道，并且经由流动池的第二开口从流体通道容积中置换第三流体。可以经由包括流体通道的流动池的第二开口将第三流体引入流体通道，并且经由流动池的第一开口从流体通道容积中置换第三流体。在一些实施方案中，经由包括流体通道的流动池的第三开口将第三流体引入流体通道，并且经由流动池的第四开口从流体通道容积中置换第三流体。
所述方法可以包括在引入第三流体之前相对于流体通道的底部重新定向流体通道的方向。所述方法可以包括将流体通道的方向相对于流体通道的底部重新定向为80、180或270度。在引入第一置换流体之后，微孔可以包含单个细胞、颗粒或它们的组合。第一流体可以包括含水液体、多个单细胞、多个颗粒或它们的组合。含水液体可以包括预充液体。在一些实施方案中，第一置换流体、第二置换流体包括和/或第三置换流体包括气体、非水液体或它们的组合。第二流体和/或第三流体可以包括含水液体。第一内容液、第二内容液和/或第三内容液可以包括非水液体。第一置换液、第二置换液和/或第三置换液可以包括气体、含水液体或它们的组合。
在一些实施方案中，第一内容液的密度高于第二内容液的密度，其中第二内容液的密度高于第三内容液的密度，和/或其中第一内容液的密度高于第三内容液的密度。在一些实施方案中，第一内容液的密度高于第一置换液的密度、第二置换液的密度和/或第三置换液的密度。在一些实施方案中，第二内容液的密度高于第一置换液的密度、第二置换液的密度和/或第三置换液的密度。在一些实施方案中，第三内容液的密度高于第一置换液的密度、第二置换液的密度和/或第三置换液的密度。在一些实施方案中，第一内容液的密度低于第一置换液的密度、第二置换液的密度和/或第三置换液的密度。在一些实施方案中，第二内容液的密度低于第一置换液的密度、第二置换液的密度和/或第三置换液的密度。在一些实施方案中，第三内容液的密度低于第一置换液的密度、第二置换液的密度和/或第三置换液的密度。本文提供的两种共同注入的流体(例如，第二流体和第二置换流体)之间的密度差可以是、约是、大于或至多是2％(例如，2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、40％、50％、75％、100％、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x或更高以及其中的重叠范围)。
在一些实施方案中，第一置换液、第二置换液和/或第三置换液是不同的。在一些实施方案中，第一置换液、第二置换液和/或第三置换液是不同类型的。在一些实施方案中，第一置换液、第二置换液和/或第三置换液是相同的。在一些实施方案中，第一置换液、第二置换液和/或第三置换液是相同类型的。在一些实施方案中，第一流体、第二流体和/或第三流体是不同的。在一些实施方案中，第一流体、第二流体和/或第三流体是不同类型的。在一些实施方案中，第一流体、第二流体和/或第三流体是相同的。在一些实施方案中，第一流体、第二流体和/或第三流体是相同类型的。在一些实施方案中，第一流体、第二流体和/或第三流体包括分析物、缓冲成分、小分子、生物分子、试剂、作用剂或它们的组合。
第一流体、第二流体和/或第三流体可以包括裂解缓冲液。在暴露于所述裂解缓冲液时，细胞的内容物可以释放到微孔中。与细胞相关联的靶分子可以与与颗粒相关联的条形码的靶结合区域杂交。在一些实施方案中，所述方法包括进行反应。(例如，逆转录反应、核酸延伸反应、聚合酶链反应和/或它们的组合)。
测定单细胞中靶核酸分子的存在数量
本文所公开的包括用于测定单细胞中靶核酸分子的存在数量的方法。本文提供的组合物和方法可以用于任何单细胞工作流程。单细胞工作流程可以利用微孔阵列或微孔处理盒(例如BD ResolveTM)或微流体装置(例如10X Genomics(加利福尼亚州旧金山)，Drop-seq(McCarroll实验室，哈佛医学院(马萨诸塞州剑桥)；Macosko等人，Cell(细胞)，2015年5月21 16；5:1202)、或Abseq(Mission Bio(加利福尼亚州旧金山)；Shahi等人，SciRep.2017年3月14；7:44447,)并结合与随机条形码相关联的固体或半固体颗粒(例如BDResolve或Drop-seq)或包含可释放随机条形码的可破裂水凝胶颗粒(例如10X Genomics或Abseq)。
在一些实施方案中，所述方法包括：(a)提供包括流体通道的流动池，其中流体通道包括顶部、第一侧壁和底部，并且其中底部包括包含多个微孔的基板；(b)在多个微孔中捕获单细胞和单个珠粒，其中单个珠粒包含多个拴系条形码，并且其中多个拴系条形码还包含：i)珠粒特异性细胞标记；ii)多样化的分子标记的组；和/或iii)能够与靶核酸分子杂交的多个靶结合区域；(c)将第一流体和第二流体共同注入流体通道，其中第一流体恰好在第二流体前一步被引入流体通道，其中第一流体与微孔的内容物的表面接合一段持续时间，其中第一流体包括裂解缓冲液，其中第一流体的一种或更多种成分通过扩散进入微孔并引发细胞裂解，并且其中第二流体密封所述微孔的内容物。所述方法可以包括(d)使细胞裂解后从单细胞释放的靶核酸分子以随机方式与拴系在单个珠粒上的多个靶结合区域杂交。所述方法可以包括(e)进行延伸反应以产生多个分子缀合物，每个分子缀合物包含条形码和靶核酸分子中之一的互补序列的一部分。所述方法可以包括(f)对所述分子缀合物进行扩增和测序。所述方法可以包括(g)测定单细胞中靶核酸分子的存在数量。
图9提供了示例性的经历了包含裂解缓冲液(例如，CHAPS裂解缓冲液)的第一流体和包含油(例如，GC油)的第二流体的共同注入的流动池的示意图。本文公开的方法可以用于通过减少微孔之间的分子相互干扰来改善BD RhapsodyTM(或其他单细胞分析)的性能。可以如本文所述将细胞和珠粒装载到微孔阵列中。所述共同注入的方法可以实现精确控制裂解条件，以减少孔间的分子相互干扰。例如，可以如本文所述将细胞和珠粒装载到微孔中，使得每个细胞与单个珠粒配对。细胞和珠粒装载后，细胞可以被裂解，细胞内容物自由扩散到微孔中的缓冲液中。可以使用BD RhapsodyTM分析(或其他单细胞分析)捕获来自珠粒上的每个细胞中的RNA或蛋白质。共同注入裂解缓冲液和油有助于避免微孔之间的蛋白质或RNA污染。控制裂解缓冲液与微孔接合的持续时间可以容许对控制裂解缓冲液从主体裂解缓冲液进入微孔的扩散时间的优化，从而使裂解缓冲液的浓度足以裂解细胞。附加地或可选地，接合持续时间可以足够短，使得细胞裂解后细胞内容物不会扩散到微孔外。可以精确控制和/或预先确定裂解缓冲液与每个微孔相互作用的确切持续时间。在油流过微孔之后，含水缓冲液与油之间的相分离密封并包含了微孔内的细胞内容物。在一些实施方案中，接合持续时间由裂解缓冲液的体积和裂解缓冲液的流速确定。裂解缓冲液暴露于微孔内容物的时点可以匹配裂解缓冲液从主体裂解溶液扩散到微孔的时间。
流体通道的底部被显示为包括基板，该基板包括多个微孔。在共同注入之前，流体通道(不包括微孔)的容积或空间包含空气并且微孔包含单个珠粒(“B”)、单个细胞(“C”)。将包含裂解缓冲液的第一流体和包含油的第二流体共同注入流体通道，其中共同注入的第一流体恰好在共同注入的第二流体前一步被引入流体通道。共同注入的第一流体已经通过与入口紧邻的微孔，并且所述微孔现在包含足够量的裂解缓冲成分以裂解所述单个细胞。共同注入的第二流体被描绘为密封与入口紧邻的微孔中的内容物。共同注入的第一流体被显示为与位于流体通道中部的微孔的内容物的表面接合，其中所述裂解物的一个或更多个成分处于进入所述微孔内容物的过程中。共同注入的第一流体尚未到达与出口相邻的微孔。
在一些实施方案中，第一流体的密度大于第二流体的密度，并且第一流体和第二流体不混溶。在一些实施方案中，第一流体是第一塞并且第二流体是第二塞。步骤(b)可以包括预充流动池、装载细胞、然后装载珠粒。在一些实施方案中，步骤(b)可以包括预充流动池、利用空气注入置换预充缓冲液、装载细胞悬液、利用空气注入置换细胞悬液以及装载珠粒。多个拴系条形码还可以包括通用引物序列。多个条形码的多个靶结合区域可以拴系在珠粒上，该珠粒包括从基因特异性序列、oligo-dT序列、无规多聚体序列或它们的任意组合中选择的序列的混合物。靶核酸分子可以包括RNA分子(例如，mRNA分子)。靶核酸分子可以包括细胞成分结合试剂寡核苷酸(例如，样品索引寡核苷酸、细胞成分结合试剂寡核苷酸)。在一些实施方案中，靶核酸分子包括细胞组分结合试剂寡核苷酸，并且测定单细胞中靶核酸分子的存在数量指示了单细胞中细胞成分靶标的拷贝数。在一些实施方案中，靶核酸分子包括样品索引寡核苷酸，并且测定单细胞中靶核酸分子的存在数量指示了细胞的样品来源鉴定。
在一些实施方案中，与利用单一流体注入进行的可比较的流动池方法相比，密封微孔的内容物的第二流体带来被条形码捕获的mRNA和/或细胞成分结合试剂寡核苷酸的数量的增加。与利用单一流体注入进行的可比较的流动池方法相比，密封微孔内容物的第二流体可以使被条形码捕获的mRNA和/或细胞成分结合试剂寡核苷酸的数量增加、约增加、约至多或约至少增加2％(例如，2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、40％、50％、75％、100％或更高以及其中的重叠范围)。
在一些实施方案中，与利用单一流体注入进行的可比较的流动池方法相比，密封微孔内容物的第二流体带来与所测定的每个mRNA和/或细胞成分结合试剂寡核苷酸相关联的特有分子标记的存在数量的增加。与利用单一流体注入进行的可比较的流动池方法相比，密封微孔内容物的第二流体可以使与所测定的每个mRNA和/或细胞成分结合试剂寡核苷酸相关联的特有分子标记的存在数量增加、约增加、约至多或约至少增加2％(例如，2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、40％、50％、75％、100％或更高以及其中的重叠范围)。
在一些实施方案中，与利用单一流体注入进行的可比较的流动池方法相比，密封微孔的内容物的第二流体带来信噪比的增大。与利用单一流体注入进行的可比较的流动池方法相比，密封微孔内容物的第二流体可以使信噪比增大、约增大、约至多或约至少增大2％(例如，2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、40％、50％、75％、100％或更高以及其中的重叠范围)。
测量作用剂对于单细胞的剂量依赖性表型效应的方法
在一些实施方案中，提供了测量作用剂对于单细胞的剂量依赖性表型效应的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)提供包括流体通道的流动池，其中流体通道包括顶部、第一侧壁和底部，并且其中所述底部包括包含多个微孔的基板；(b)在多个微孔中捕获单细胞；(c)将第一流体和第二流体共同注入所述流体通道，其中第一流体恰好在第二流体前一步被引入流体通道，其中第一流体与微孔的内容物的表面接合一段持续时间，其中第一流体包括一种或更多种成分，其中第一流体的一种或更多种成分包括作用剂，其中第一流体的流速沿着流体通道的纵向路径是不均匀的，其中作用剂在所述持续时间期间通过扩散进入所述微孔，其中对于所述多个微孔中的至少两个微孔，所述微孔的内容物中的作用剂的最终浓度不相等，并且其中第二流体密封所述微孔的内容物；以及(d)测量依赖于微孔中的作用剂最终浓度的一种或更多种表型效应。
在一些实施方案中，第一流体的密度大于第二流体的密度并且/或者第一流体和第二流体不混溶。所述方法可以包括第二次共同注入流体。第二次共同注入可以包括将第二次共同注入的第二第一液体和第二次共同注入的第二液体共同注入流体通道，其中第二次共同注入的第一液体恰好在第二次共同注入的第二液体前一步被引入流体通道。第二次共同注入的第二液体可以密封所述微孔的内容物。在一些实施方案中，第二次共同注入的第一液体的密度大于第二次共同注入的第二液体的密度，并且其中第二次共同注入的第一液体和第二次共同注入的第二液体不混溶。第二次共同注入可以在与第一次共同注入相反的方向或相同的方向上进行。在一些实施方案中，第二次共同注入的第一流体可以包括第二作用剂。所述方法可以包括如本文所公开的3、4、5、6、7、8、9或更多次流体的共同注入，并且所述共同注入的第一流体中的一个或更多个可以包括3、4、5、6、7、8、9种或更多的附加作用剂。在一些实施方案中，第一流体是第一塞并且第二流体是第二塞。相对于在沿着流体通道的纵向路径的后部位置处，第一流体的流速可以在沿着流体通道的纵向路径的前部位置处较高，并且/或者相对于在沿着流体通道的纵向路径的后部位置处，第一流体的流速可以在沿着流体通道的纵向路径的前部位置处较低。在一些实施方案中，在沿着流体通道的纵向路径的前部位置处相对于在沿着流体通道的纵向路径的后部位置处的第一流体的流速之间的差异为、约为、约至多为或约至少为1.1倍。在一些实施方案中，在沿着流体通道的纵向路径的前部位置处相对于在沿着流体通道的纵向路径的后部位置处的第一流体的流速之比范围为从1:100至100:1。在一些实施方案中，所述两种流速之比至多为10:1。在一些实施方案中，两种流速之比至多为100:1。在一些实施方案中，两种流量之比最多为1:1000。在一些实施方案中，两种流速之比至少为1:10。在一些实施方案中，两中流速之比至少为1:100。在一些实施方案中，两种流速之比至少为1:1000。
在一些实施方案中，在顺序地共同注入之后多个微孔的内容物中的作用剂的最终浓度是不均匀的。每个微孔的内容物中的作用剂的最终浓度可以沿流体通道的纵向路径而变化。在一些实施方案中，每个微孔的内容物中作用剂的最终浓度的变化可以是线性的、非线性的、指数型的和/或对数型的。在一些实施方案中，在沿着流体通道的纵向路径的前部位置处相对于在沿着流体通道的纵向路径的后部位置处的微孔的内容物中的作用剂的最终浓度之间的差异是、约是、约至多或约至少1.1倍。在一些实施方案中，在沿着流体通道的纵向路径的前部位置处相对于在沿着流体通道的纵向路径的后部位置处的微孔的内容物中作用剂的最终浓度之比在1:100至100:1的范围内。在一些实施方案中，两种最终浓度之比至多为10:1。在一些实施方案中，两种最终浓度之比至多为100:1。在一些实施方案中，两种最终浓度之比至多为1:1000。在一些实施方案中，两种最终浓度之比至少为1:10。在一些实施方案中，两种最终浓度之比至少为1:100。在一些实施方案中，两种最终浓度之比为至少1:1000。
作用剂和/或第二作用剂可以包括一种或更多种成分。在一些实施方案中，作用剂包括一种或更多种化学作用剂、药物、小分子、生物剂、CRISPR单导向RNA(sgRNA)、小干扰RNA(siRNA)、CRISPR RNA(crRNA)、小分子发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)、反义寡核苷酸、肽或肽模拟物抑制剂、适配体、抗体、胞内抗体或它们的任意组合。在一些实施方案中，作用剂可以包括一种或更多种表观遗传修饰剂、表观遗传酶、双环肽、转录因子、DNA或蛋白质修饰酶、DNA嵌入剂、外排泵抑制剂、核受体激活剂或抑制剂、蛋白酶体抑制剂、酶的竞争性抑制剂、蛋白质合成抑制剂、核酸酶、蛋白质片段或结构域、标签或标志物、抗原、抗体或抗体片段、配体或受体、来自天然生物活性肽的合成肽或类似肽、抗微生物肽、成孔肽、靶向或细胞毒性的肽、降解或自毁肽、CRISPR组分系统或其组分、DNA、RNA、人工核酸、纳米颗粒、寡核苷酸适配体、肽适配体或它们的任意组合。作用剂可以具有选自以下的至少一种效应活性：调节生物活性、结合调节蛋白、调节酶活性、调节底物结合、调节受体活化、调节蛋白质稳定性/降解、调节转录物稳定性/降解、以及它们的任以组合。
在一些实施方案中，作用剂可以包括感染剂、抗感染剂、或者感染剂和抗感染剂的混合物。感染剂可以包括病毒、细菌、真菌、原生动物寄生虫，或它们的任意组合。抗感染剂可以包括抗细菌剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂或它们的任意组合。在一些实施方案中，作用剂可以包括细胞毒性剂，诸如例如化疗剂、生物剂、毒素、放射性同位素或它们的任意组合。作用剂可以包括治疗剂的非活性成分，诸如例如赋形剂、载体、稀释剂、媒剂(vehicle)、佐剂、空运载体或它们的任意组合。
在一些实施方案中，作用剂可以包括表达运载体，其中所述表达运载体编码以下中的一种或更多种：mRNA、反义核酸分子、RNAi分子、shRNA、成熟miRNA、前体miRNA、初级miRNA、抗miRNA、核酶、它们的任意组合。单个细胞可以包含重组表达运载体。重组表达运载体可以包含诱导型启动子，其中以下一种或更多种的表达受所述诱导型启动子的控制：mRNA、反义核酸分子、RNAi分子、shRNA、成熟miRNA、前体miRNA、初级miRNA、抗miRNA、核酶、它们的任意组合。作用剂可以包括诱导型启动子的剂量依赖性诱导剂(例如，四环素、原始霉素、大环内酯、蜕皮激素、米非司酮或它们的任意组合)。在一些实施方案中，作用剂调节一种或更多种靶生物标志物的表达和/或活性。
在一些实施方案中，所述方法可以包括在多个微孔中捕获单个珠粒，其中单个珠粒包含多个拴系条形码，并且其中多个拴系条形码还包括：i)珠粒特异性细胞标记；ii)多样化的分子标记的组；和/或iii)能够与靶核酸分子杂交的多个靶结合区域。测量依赖于微孔中作用剂最终浓度的一种或更多种表型效应可以包括mRNA表达谱分析，其中mRNA表达谱分析包括细胞中多个mRNA靶标的定量分析。测量依赖于微孔中作用剂最终浓度的一种或更多种表型效应可以包括蛋白质表达谱分析，其中蛋白质表达谱分析包括细胞中多个蛋白质靶标的定量分析。测量依赖于微孔中作用剂最终浓度的一种或更多种表型效应可以包括同时定量分析细胞中的多个蛋白质靶标和多个核酸靶标分子。
确定细胞的流动池纵向位置和细胞的作用剂暴露
在一些实施方案中，提供了确定微孔阵列内一些或所有细胞的流动池纵向位置的方法。微孔阵列内一些或所有细胞的流动池纵向位置的确定可以包括确定一些或所有细胞的来源的微孔。微孔阵列的一些或所有微孔可以包括阵列地址码。阵列地址码可以包括针对微孔阵列中的每个微孔的特有的核酸条形码。在一些实施方案中，阵列地址码被共价附接到微孔的一个或更多个内表面。共价附接可以包括使用一种或更多种可切割接头以释放阵列地址码。在一些实施方案中，一个或更多个可切割接头包括酸不稳定接头、碱不稳定接头、光可切割接头、酶可切割接头或它们的任意组合。阵列地址码可以包括限制酶位点。在一些实施方案中，附接到珠粒的条形码的子集包括针对阵列地址码的退火位点。释放后，阵列地址码可以与条形码的子集杂交。在一些实施方案中，测序期间的细胞标记与阵列地址代码的关联将鉴定微孔阵列内每个细胞的来源的微孔。
在一些实施方案中，双重编码方案可以通过使用预置的阵列地址码(例如，对阵列中特定孔的位置进行编码的核酸条形码)而不是光学编码的珠粒来实施，以实施双重编码方案。在一些实施方案中，可以使用喷墨印刷技术、微阵列点样技术(microarray spottingtechniques)、蘸笔纳米光刻技术等将阵列地址码留置在孔中。在一些实施方案中，阵列地址码可以非特异性地吸附到微孔的一个或更多个内表面。在一些实施方案中，阵列地址码可以被共价附接到微孔的一个或更多个内表面。在一些实施方案中，阵列地址码可以通过固相合成技术来原位合成，其中微孔的一个或更多个内表面用作固体支持物。在阵列地址码被共价附接到微孔的一个或更多个内表面的实施方案中，所述附接可以包括使用可切割的接头，例如酸不稳定、碱不稳定或光可切割的接头，使得阵列地址码可以在需要时被释放并可以与附接到珠粒的拴系随机标记的子集杂交。在一些实施方案中，阵列地址码可以与附接到珠粒的包括细胞标记的多个随机标记结合使用。在一些实施方案中，可以使用阵列地址码代替附接到珠粒的多个随机标记，并且其本身可以包括细胞标记、分子标记以及一个或更多个引物或衔接子序列。
在一些实施方案中，提供了确定微孔阵列内一些或所有细胞的流动池纵向位置的方法。多个珠粒中的每一个可以包括多个随机条形码、第一组光学标记和第二组光学标记。第一组光学标记中的每个光学标记可以包含第一光学部分(optical moiety)并且第二组光学标记中的每个光学标记可以包含第二光学部分。多个珠粒中的每一个都与包含第一光学部分和第二光学部分的光学条形码相关联，并且其中第一光学部分和第二光学部分选自包含两个或多个光谱不同的光学部分的组。多个珠粒中的至少两个珠粒可以包括特有的光学条形码。可以在流动池中检测多个珠粒中的每一个的光学条形码以确定多个珠粒中的每一个的位置。所述方法可以包括检测多个珠粒中的每一个的光学条形码以确定多个珠粒中的每一个的位置。所述方法可以包括基于多个珠粒的位置来确定多个单细胞的微孔位置。
在一些实施方案中，提供了用于在双重编码方案中使用光学编码珠粒的方法和组合物，例如其中单个珠粒通过光学码(例如通过用一组光谱不同的荧光团、量子点、拉曼标签、上转换磷光体等浸渍所述珠粒；或通过使用固相分离汇集(split-pool)合成方法和一组光谱不同的荧光构建块来合成附接的光学码)以及被并入与给定珠粒附接的多个拴系随机标记中的核酸序列(例如细胞标记)来特异地识别。与表现出一组预定义特性的细胞或与超过一个细胞共定位的珠粒将各自基于它们的光学码而予以识别，并且来自所述珠粒的序列数据随后将通过相应的细胞标记序列来识别。
在一些实施方案中，还提供了评估每个流动池纵向位置处的作用剂浓度的方法(并由此确定每个细胞的作用剂暴露)。在一些实施方案中，第一流体包含荧光染料，其中荧光染料与作用剂的比例是已知的。流动池可以包括用于光学成像的透明窗口，并且所述方法可以包括在共同注入第一流体和第二流体之后对流动池进行光学成像，其中光学成像包括对每个微孔中的荧光染料的测量。每个微孔中荧光染料的测量可以实现对每个微孔中的作用剂浓度的估算。所述方法还可以包括基于确定每个细胞的来源的微孔和评估每个流动池纵向位置处的作用剂浓度，得到对于每个细胞所暴露于的作用剂浓度的估算。所述方法可以包括对每个细胞所暴露于的作用剂的评估浓度和所述细胞的RNA和/或DNA表达谱进行相关分析。相关性分析可以确认以下一项或更多项：候选治疗剂、候选治疗剂的候选剂量和候选治疗剂的细胞靶标。
示例
以上讨论的实施方案的一些方面在以下示例中更详细地公开，这些示例并非旨在限制本公开的范围。
示例1
限制的细胞裂解反应
该示例证明了所述共同注入方法可以实现微孔内容物的受控裂解和物理密封。
使钙黄绿素染色的细胞分布到微孔中。根据本文公开的方法，使用包含CHAPS裂解缓冲液的第一流体和包含GC2油的第二流体(BD CLiC文库制备系统)，进行第一流体和第二流体的顺序共同注入。图12A1-12C2显示了在共同注入包含CHAPS裂解缓冲液的第一流体和包含GC2油的第二流体之后的微孔的1分钟(图12A1-12A2)、7分钟(图12B1-12B2)和13分钟(图12C1-12C12)的示例性明场图像(图12A1、12B1和12C1)和荧光图像(图12A2、12B2和12C2)。
图12A1-12C2显示微孔中的裂解缓冲液浓度足以裂解细胞。钙黄绿素染色的细胞在用GC2油密封后保持完整长达1分钟，并且细胞内容物被限制在微孔中，没有明显的荧光损失(对应于没有钙黄绿素损失)。这表明GC2油封阻碍钙黄绿素从微孔中扩散到微孔外。鉴于钙黄绿素的分子量低于大多数细胞分子(例如mRNA、RNA、蛋白质或DNA)，这些数字表明这些更大的分子也被限制在微孔中。
在所述共同注入之前，阵列的三个微孔包含单个钙黄绿素染色的细胞。如图12A1-12A2中所示，钙黄绿素染色的细胞在用GC2油密封后的1分钟内最初保持完整(其中，明亮的离散点表明钙黄绿素染色的细胞是完整的)。如图12B1-12B2和图12C1-12C12所示，分别在7分钟和13分钟后，荧光在钙黄绿素染色的细胞的微孔内弥散，表明细胞裂解成功。此外，细胞内容物被限制在微孔中，没有明显的荧光损失(对应于没有钙黄绿素的损失)。这表明GC2油封阻碍钙黄绿素从微孔中扩散到流体通道的容积或空间(在微孔上方)。鉴于钙黄绿素的分子量低于大多数细胞分子(例如mRNA、RNA、蛋白质或DNA)，所述结果表明这些更大的分子也被限制在微孔中。因此，第二流体有效地将反应密封并限制在每个微孔内。总之，这些数据证明了本文提供的顺序共同注入方法将试剂(例如，裂解缓冲液试剂)递送至微孔以引发反应(例如，细胞裂解)的能力。此外，这些数据体现了根据若干实施方案得到的对于微孔之间的分子相互干扰的出乎意料的预防作用。
术语
在至少一些先前描述的实施方案中，一个实施方案中使用的一个或更多个要素可以可互换地用于另一实施方案中，除非这种替换在技术上不可行。本领域技术人员将理解，在不脱离要求保护的主题的范围的情况下，可以对上述方法和结构进行各种其他的省略、添加和修改。所有这些修改和变化都旨在落入由所附权利要求所定义的主题的范畴。
本领域技术人员将理解，对于本文公开的这些以及其他的过程和方法，在这些过程和方法中执行的功能可以以不同的顺序来实施。此外，所概括的步骤和操作仅作为示例提供，并且在不偏离所公开的实施方案的本质的情况下，其中一些步骤和操作可以是可选的、被合并成更少的步骤和操作、或者被扩展为附加的步骤和操作。
关于本文中基本上任意的复数和/或单数术语的使用，本领域技术人员可以按照适应于上下文和/或应用从复数翻译成单数和/或从单数翻译成复数。为了清楚起见，这里可以明确地阐述各种单数/复数排列。在本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数形式，除非上下文另有不同清晰阐述。除非另有说明，本文中对“或”的任何引用均旨在涵盖“和/或”。
本领域技术人员将理解，一般而言，本文中使用的术语、尤其是所附权利要求中使用的术语(例如，所附权利要求的主体)通常旨在作为“开放式”术语(例如，术语“包括”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“至少具有”，术语“包括”应解释为“包括但不限于”等)。本领域技术人员将进一步理解，如果打算引入权利要求关于特定数量的限定，则在该权利要求中会明确给出这样的意图，并且在无此类表述的情况下则不存在这样的意图。例如，为了帮助理解，以下所附权利要求可以包含使用介绍性短语“至少一个”和“一个或更多个”来引入权利要求限定。然而，这种短语的使用不应被解释为意指通过不定冠词“一”或“一个”来引入权利要求陈述会将包含此类引入的权利要求限定的任意特定权利要求限制于仅包含一个这种限定的实施方案，即使当该同一权利要求包括介绍性短语“一个或更多个”或“至少一个”和不定冠词诸如“一”或“一个”(例如，“一”和/或“一个”应解释为“至少一个”或“一个或更多个”)；这同样适用于使用定冠词来引入权利要求陈述。此外，即使明确陈述了引入的权利要求限定的特定数量，本领域技术人员也将认识到，这种陈述应该被解释为是指至少有所陈述的数量(例如，简单表述“限定两个”，而没有其他修饰语，意味着限定至少两个，或限定两个或多个)。此外，在那些使用了类似于“A、B和C等中的至少一个”的约定的情况下，一般而言，这样的结构的意图是本领域技术人员将理解该约定的意义(例如，“具有A、B和C中的至少一个的系统”将包括但不限于单独具有A、单独具有B、单独具有C、具有A加B、具有A加C、具有B加C、和/或具有A、B加C、等等的系统)。在那些使用了类似于“A、B或C等中的至少一个”的约定的情况下，一般而言，这样的结构的意图是本领域技术人员将理解该约定的意义(例如，“具有A、B或C中的至少一个的系统”将包括但不限于单独具有A、单独具有B、单独具有C、具有A加B、具有A加C、具有B加C、和/或具有A、B加C、等等的系统)。本领域技术人员将进一步理解，呈现了两个或多个可替代术语的几乎任意的不连续的词和/或短语，无论是在说明书、权利要求还是附图中，都应被理解为考虑了包括这些术语中之一、其中两者之一、或两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。
此外，在根据马库什组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到本公开由此也根据马库什组的任意的个体成员或成员子组进行描述。
如本领域技术人员将理解的，出于任意和所有的目的，例如在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还包括任意和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以很容易地被认为充分描述并能够将相同的范围分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性示例，本文讨论的每个范围都可以很容易地被分解分为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，所有语言诸如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”等等包括所列举的数字，并指代能够随后被分解为如上所述的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个物品的组是指具有1、2或3个物品的组。类似地，具有1-5个物品的组是指具有1、2、3、4或5个物品的组，等等。
从上文可以理解，为了说明的目的已经在本文中描述了本公开的各种实施方案，并且在不脱离本公开的范围和精神的情况下可以进行各种修改。因此，本文公开的各种实施方案不旨在限制，同时其真实的范围和精神由以下权利要求给出。

Claims (263)

1.一种将一种或更多种成分引入微孔的内容物的方法，包括：
(a)将第一流体引入流体通道，所述流体通道包括顶部、第一侧壁和底部，
其中，所述流体通道的底部包括多个微孔，
由此，所述流体通道和多个微孔中的每个微孔包含所述第一流体；
(b)以第一流速将第一置换流体引入所述流体通道，从而从所述流体通道中置换所述第一流体；
(c)以第二流速将第二流体随后紧接着第二置换流体和/或与第二置换流体同时引入所述流体通道，
其中，当所述第二流体与所述微孔中的内容物接触第一持续时间时，所述第二流体的一种或更多种成分进入所述微孔中的内容物，以及
其中，所述第二置换流体从所述流体通道中置换所述第二流体和/或密封所述微孔的内容物。
2.如权利要求1所述的方法，包括：
(d)以第三流速将第三流体随后紧接着第三置换流体和/或与第三置换流体同时引入所述流体通道，
其中，当所述第三流体与所述微孔中的内容物接触第二持续时间时，所述第三流体的一种或更多种成分进入所述微孔中的内容物，以及
其中，所述第三置换流体从所述流体通道中置换所述第三流体和/或密封所述微孔的内容物。
3.一种引入一种或更多种成分的方法，包括：
(a)将第一流体引入流体通道，所述流体通道包括顶部、第一侧壁和底部，
其中，所述流体通道的底部包括多个微孔，
由此，所述流体通道和多个微孔中的每个微孔包含第一流体；
(b)将第一置换流体引入所述流体通道以从所述流体通道中置换所述第一流体；
(c)以第二流速将多种第二流体中每种第二流体随后紧接着第二置换流体和/或与第二置换流体同时引入所述流体通道，
其中，当所述第二流体与所述微孔中的内容物接触第一持续时间时，所述多种第二流体中每一种的一种或更多种成分进入所述微孔中的内容物，以及
其中，所述第二置换流体从所述流体通道中置换所述第二流体和/或密封所述微孔的内容物。
4.一种引入一种或更多种成分的方法，包括：
(a)提供流体通道，所述流体通道包括顶部、第一侧壁和底部，
其中，所述流体通道的底部包括多个包含第一流体的微孔，以及
其中，流体通道容积不包含第一流体；
(b)以第二流速将多种第二流体中每种第二流体随后紧接着第二置换流体和/或与第二置换流体同时引入所述流体通道，
其中，当第二流体与所述微孔中的内容物接触第一持续时间时，所述多种第二流体中每一种的一种或更多种成分进入所述微孔中的内容物，以及
其中，所述第二置换流体从所述流体通道中置换所述第二流体和/或密封所述微孔的内容物。
5.如权利要求4所述的方法，其中，提供所述流体通道包括：
(a)将所述第一流体引入所述流体通道，
由此，所述流体通道和多个微孔中的每个微孔包含所述第一流体；和
(b)将第一置换流体引入所述流体通道以从所述流体通道中置换所述第一流体。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，包括：恰好在引入所述多种第二流体中的第二流体前一步引入第三置换流体。
7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，包括：在引入所述第二置换流体之后立即引入第三置换流体。
8.如权利要求1-5中任一项所述的方法，包括：恰好在引入所述第二置换流体前一步引入第三置换流体。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，包括：恰好在引入所述多种第二流体中的第二流体前一步引入第三流体。
10.如权利要求1-8中任一项所述的方法，包括：在引入所述第二置换流体之后立即引入第三流体。
11.如权利要求1-8中任一项所述的方法，包括：恰好在引入所述第二置换流体前一步引入第三流体。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，所述第二流体和/或所述第三流体通过扩散进入所述微孔的内容物。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，
其中，所述微孔的内容物中所述第二流体的一种或更多种成分的浓度与所述接触的第一持续时间有关，和/或
其中，所述微孔的内容物中所述第三流体的一种或更多种成分的浓度与所述接触的第二持续时间有关。
14.如权利要求13所述的方法，
其中，所述接触的第一持续时间与所述第二流体在所述流动通道中的第一速度和所述第二流体的体积有关，和/或
其中，所述接触的第二持续时间与所述第三流体在所述流动通道中的第二速度和所述第三流体的体积有关。
15.如权利要求13-14中任一项所述的方法，
其中，所述接触的第一持续时间取决于所述第二流体在所述流动通道中的第一速度和所述第二流体在所述流动通道中的纵向长度，和/或
其中，所述接触的第二持续时间取决于所述第三流体在所述流动通道中的第二速度和所述第三流体在所述流动通道中的纵向长度。
16.如权利要求15所述的方法，
其中，所述第二流体在所述流动通道中的纵向长度取决于所引入的所述第二流体的体积、所述流体通道的容积、所述流动池的容积，或它们的组合，和/或
其中，所述第三流体在所述流动通道中的纵向长度取决于所引入的所述第三流体的体积、所述流体通道的容积、所述流动池的容积，或它们的组合。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述第一流速是固定流速，其中所述第二流速是固定流速，和/或其中所述第三流速是固定流速。
18.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述第一流速是可变流速，其中所述第二流速是可变流速，和/或其中所述第三流速是可变流速。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述第一流速是递增的流速，其中所述第二流速是递增的流速，和/或所述第三流速是递增的流速。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述第一流速为递减的流速，其中所述第二流速为递减的流速，和/或其中所述第三流速为递减的流速。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中，引入所述第一流体和/或所述第一置换流体包括：以所述第一流速将所述第一流体随后紧接着所述第一置换流体和/或与所述第一置换流体同时共同注入。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中，引入所述第一流体和/或所述第一置换流体包括：使用泵引入所述第一流体和/或所述第一置换流体。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中，将所述第二流体随后紧接着所述第二置换流体和/或与第二置换流体同时引入所述流体通道包括：将所述第二流体在所述第二置换流体之前二者共同注入。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中，将所述第二流体随后紧接着第三置换流体和/或与第三置换流体同时引入包括：使用泵将所述第三流体、紧接着和/或同时将所述第三流体引入。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中，将所述第三流体随后紧接着第三置换流体和/或与所述第三置换流体同时将引入所述流体通道包括：将所述第三流体在所述第三置换流体之前二者共同注入。
26.如权利要求2-25中任一项所述的方法，其中，将所述第三流体随后紧接着所述第三置换流体和/或与所述第三置换流体同时引入包括：使用泵将所述第三流体随后紧接着所述第三流体和/或与所述第三流体同时引入。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，
其中，所述第一流体和/或所述第一置换流体通过非层流被引入所述流体通道，
其中，所述第二流体和/或所述第二置换流体通过非层流被引入所述流体通道，和/或
其中，所述第三流体和/或所述第三置换流体通过非层流被引入所述流体通道。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中，所述流体通道被配置为通过非层流引入所述第一流体、所述第一置换流体、所述第二流体、所述第二置换流体、所述第三流体和/或所述第三置换流体。
29.如权利要求27-28中任一项所述的方法，其中，所述非层流是活塞流或近似活塞流。
30.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中，经由包括所述流体通道的流动池的第一开口将所述第一流体引入所述流体通道，并且其中，经由所述流动池的第二开口从所述流体通道中置换所述第一流体。
31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其中，经由包括所述流体通道的流动池的第一开口将所述第二流体引入所述流体通道，并且其中，经由所述流动池的第二开口从所述流体通道中置换所述第二流体。
32.如权利要求2-26中任一项所述的方法，其中，经由包括所述流体通道的流动池的第一开口将所述第三流体引入所述流体通道，并且其中，经由所述流动池的第二开口从所述流体通道中置换所述第三流体。
33.如权利要求2-26中任一项所述的方法，其中，经由包括所述流体通道的流动池的第二开口将所述第三流体引入所述流体通道，并且其中，经由所述流动池的第一开口从所述流体通道中置换所述第三流体。
34.如权利要求2-26中任一项所述的方法，其中，经由包括所述流体通道的流动池的第三开口将所述第三流体引入所述流体通道，并且其中，经由所述流动池的第四开口从所述流体通道中置换所述第三流体。
35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，包括：在引入所述第三流体之前相对于所述流体通道的底部重新定向所述流体通道的方向。
36.如权利要求1-35中任一项所述的方法，包括：相对于所述流体通道的底部，将所述流体通道的方向重新定向为80、180或270度。
37.如权利要求1-36中任一项所述的方法，其中，在引入所述第一置换流体之后，所述微孔包含单个细胞、颗粒或它们的组合。
38.如权利要求1-37中任一项所述的方法，其中，所述第一流体包括：含水液体、多个单细胞、多个颗粒或它们的组合。
39.如权利要求0所述的方法，其中，所述含水液体包括预充液。
40.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中，所述第一置换流体、所述第二置换流体和/或所述第三置换流体包括气体、非水液体或它们的组合。
41.如权利要求37-40中任一项所述的方法，其中，所述第二流体和/或所述第三流体包括含水液体。
42.如权利要求1-37中任一项所述的方法，其中，所述第一内容液、所述第二内容液和/或所述第三内容液包括非水液体。
43.如权利要求42所述的方法，其中，所述第一置换液、所述第二置换液和/或所述第三置换液包括气体、含水液体或它们的组合。
44.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述第一内容液的密度高于所述第二内容液的密度，其中所述第二内容液的密度高于所述第三内容液的密度，和/或其中所述第一内容液的密度高于所述第三内容液的密度。
45.如权利要求1-44中任一项所述的方法，
其中，所述第一内容液的密度高于所述第一置换液的密度、所述第二置换液的密度和/或所述第三置换液的密度，
其中，所述第二内容液的密度高于所述第一置换液的密度、所述第二置换液的密度和/或所述第三置换液的密度，和/或
其中，所述第三内容液的密度高于所述第一置换液的密度、所述第二置换液的密度和/或所述第三置换液的密度。
46.如权利要求1-44中任一项所述的方法，
其中，所述第一内容液的密度低于所述第一置换液的密度、所述第二置换液的密度和/或所述第三置换液的密度，
其中，所述第二内容液的密度低于所述第一置换液的密度、所述第二置换液的密度和/或所述第三置换液的密度，和/或
其中，所述第三内容液的密度低于所述第一置换液的密度、所述第二置换液的密度和/或所述第三置换液的密度。
47.如权利要求1-46中任一项所述的方法，其中，所述第一置换液、所述第二置换液和/或所述第三置换液是不同的。
48.如权利要求1-47中任一项所述的方法，其中，所述第一置换液、所述第二置换液和/或所述第三置换液是不同类型的。
49.如权利要求1-48中任一项所述的方法，其中，所述第一置换液、所述第二置换液和/或所述第三置换液是相同的。
50.如权利要求1-49中任一项所述的方法，其中，所述第一置换液、所述第二置换液和/或所述第三置换液是相同类型的。
51.如权利要求1-50中任一项所述的方法，其中，所述第一流体、所述第二流体和/或所述第三流体是不同的。
52.如权利要求1-51中任一项所述的方法，其中，所述第一流体、所述第二流体、和/或第三流体是不同类型的。
53.如权利要求1-52中任一项所述的方法，其中，所述第一流体、所述第二流体和/或所述第三流体是相同的。
54.如权利要求1-53中任一项所述的方法，其中，所述第一流体、所述第二流体和/或所述第三流体是相同类型的。
55.如权利要求1-54中任一项所述的方法，其中，所述第一流体、所述第二流体和/或所述第三流体包括分析物、缓冲成分、小分子、生物分子、试剂、作用剂或它们的组合。
56.如权利要求1-55中任一项所述的方法，其中，所述第一流体、所述第二流体和/或所述第三流体包括裂解缓冲液。
57.如权利要求56所述的方法，其中，在暴露于所述裂解缓冲液时，所述细胞的内容物被释放到所述微孔中。
58.如权利要求37-56中任一项所述的方法，其中，和所述细胞相关联的靶分子与和所述颗粒相关联的条形码的靶结合区域杂交。
59.如权利要求1-56中任一项所述的方法，包括：进行反应。
60.如权利要求1-59中任一项所述的方法，其中，所述反应包括逆转录反应、核酸延伸反应、聚合酶链反应和/或它们的组合。
61.一种将一种或更多种成分引入流体的方法，所述方法包括：
(a)提供包含流体通道的流动池，
其中，流体通道包括顶部、第一侧壁和底部，并且
其中，所述底部包括基板，所述基板包括多个微孔流动池；
(b)用预充流体预充所述流动池；
(c)从所述多个微孔上方的流体通道的流动池容积中置换所述预充流体，由此多个微孔的每个微孔的内容物包含所述预充流体；以及
(d)将第一流体和第二流体共同注入所述流体通道，
其中，恰好在所述第二流体前一步将所述第一流体引入所述流体通道，
其中，所述第一流体的一种或更多种成分进入所述微孔的内容物，以及
其中，所述第二流体密封所述微孔的内容物。
62.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一流体与所述微孔的内容物的表面接合一段持续时间。
63.如权利要求62所述的方法，其中，所述第一流体的一种或更多种成分通过扩散进入所述微孔。
64.如权利要求62-63中任一项所述的方法，其中，在所述第一流体与所述微孔的表面接合的一段持续时间期间，所述一种或更多种成分在所述微孔的内容物中引发反应。
65.如权利要求62-63中任一项所述的方法，其中，在所述第一流体与所述微孔的表面接合之后，所述一种或更多种成分在所述微孔的内容物中引发反应。
66.一种进行反应的方法，该方法包括：
(a)提供包含流体通道的流动池，
其中，所述流体通道包括顶部、第一侧壁和底部，并且
其中，所述底部包括基板，所述基板包括多个微孔流动池；以及
(b)将第一流体和第二流体共同注入所述流体通道，
其中，恰好在所述第二流体前一步将所述第一流体引入所述流体通道，
其中，所述第一流体与微孔的表面接合一段持续时间，
其中，所述第一流体的一种或更多种成分进入所述微孔的内容物，
其中，所述一种或更多种成分在所述微孔的内容物中引发反应，并且
其中，所述第二流体密封所述微孔的内容物。
67.一种将不同浓度的分析物递送至多个微孔的方法，该方法包括：
(a)提供包含流体通道的流动池，
其中，所述流体通道包括顶部、第一侧壁和底部，
其中，所述底部包括基板，所述基板包括多个微孔流动池；以及
(b)将第一流体和第二流体共同注入所述流体通道，
其中，恰好在所述第二流体前一步将所述第一流体引入所述流体通道，
其中，所述第一流体与所述微孔的内容物的表面接合一段持续时间，
其中，所述第一流体包含一种或更多种成分，
其中，所述第一流体的所述一种或更多种成分包括分析物，
其中，所述第一流体的流速沿着所述流体通道的纵向路径是不均匀的，
其中，所述分析物进入所述微孔的内容物，
其中，对于所述多个微孔中的至少两个微孔，所述微孔中分析物的最终浓度不相等，以及
其中，所述第二流体密封所述微孔的内容物。
68.如权利要求67所述的方法，其中，在所述第一流体与所述微孔表面接合的一段持续时间内，所述一种或更多种成分在所述微孔的内容物中引发反应。
69.如权利要求66-68中任一项所述的方法，进一步包括，在所述共同注入之前，用预充流体预充所述流动池。
70.如权利要求69所述的方法，进一步包括：在所述共同注入之前，从所述多个微孔上方的流体通道的流动池容积中置换所述预充流体。
71.如权利要求1-70中任一项所述的方法，其中，所述第一流体的体积至多为所述第二流体的体积的10％。
72.如权利要求1-71中任一项所述的方法，其中，在所述共同注入之后，所述多个微孔上方的所述流体通道容积包含所述第二流体。
73.如权利要求1-72中任一项所述的方法，其中，在所述共同注入之后，所述多个微孔上方的所述流体通道容积不包含所述第一流体。
74.如权利要求1-64或70-73中任一项所述的方法，其中，从所述多个微孔上方的所述流体通道的流动池容积中置换所述预充流体包括：将置换流体注入所述流体通道。
75.如权利要求1-64或70-74中任一项所述的方法，其中，所述置换流体是气体。
76.如权利要求1-64或70-74中任一项所述的方法，其中，所述置换流体是非水液体。
77.如权利要求1-64或69-76中任一项所述的方法，其中，所述预充流体是第一含水液体。
78.如权利要求1-64或69-76中任一项所述的方法，其中，所述预充流体是第一非水液体。
79.根据权利要求1-78中任一项所述的方法，其中在所述共同注入之前，所述微孔包含初始微孔流体。
80.如权利要求79所述的方法，其中，所述初始微孔流体包括所述预充流体。
81.如权利要求79所述的方法，其中，所述初始微孔流体是含水液体。
82.如权利要求79所述的方法，其中，所述初始微孔流体是含水缓冲液。
83.如权利要求79所述的方法，其中，所述初始微孔流体是非水液体。
84.如权利要求1-83中任一项所述的方法，其中，所述第一流体的一种或更多种成分包括分析物。
85.如权利要求1-83中任一项所述的方法，其中，所述第一流体包含已知浓度的分析物。
86.如权利要求1-83中任一项所述的方法，其中，所述第一流体包含未知浓度的分析物。
87.如权利要求1-86中任一项所述的方法，其中，所述第一流体的一种或更多种成分包括分析物、缓冲成分、小分子、生物分子、试剂、作用剂或它们的任意组合。
88.如权利要求1-87中任一项所述的方法，其中，所述第一流体的流速等于所述第二流体的流速。
89.如权利要求1-88中任一项所述的方法，其中，所述第一流体与所述第二流体不混溶。
90.如权利要求1-88中任一项所述的方法，其中，所述第一流体的密度大于所述第二流体的密度。
91.如权利要求1-88中任一项所述的方法，其中，所述第一流体的密度大于所述第二流体的密度，并且其中所述第一流体与所述第二流体不混溶。
92.如权利要求1-91中任一项所述的方法，其中，所述第一流体包括第二含水液体并且所述第二流体包括第一非水液体。
93.如权利要求1-91中任一项所述的方法，其中，所述第一流体包括第二含水液体并且所述第二流体包括气体。
94.如权利要求1-91中任一项所述的方法，其中，所述第一流体包括第二非水液体并且所述第二流体包括第二含水液体。
95.如权利要求1-94中任一项所述的方法，其中，所述第二流体具有与所述置换流体相同的组成。
96.如权利要求1-94中任一项所述的方法，其中，所述第二流体具有与所述置换流体不同的组成。
97.如权利要求1-96中任一项所述的方法，其中，所述第一流体具有与所述置换流体不同的组成。
98.如权利要求79-97中任一项所述的方法，其中，所述第一流体的一种或更多种成分扩散到所述微孔中产生所述第一流体与所述初始微孔液的第一混合物。
99.如权利要求79-98中任一项所述的方法，其中，所述第一流体的一种或更多种成分以较低浓度存在于所述初始微孔液中。
100.如权利要求79-98中任一项所述的方法，其中，所述第一流体的一种或更多种成分不存在于所述初始微孔液中。
101.如权利要求98-100中任一项所述的方法，其中，所述第一混合物中包含的第一流体的一种或更多种成分的浓度为所述初始微孔液中的第一流体的一种或更多种成分的浓度的至少2倍。
102.如权利要求64-101中任一项所述的方法，其中，所述持续时间小于所述反应持续时间。
103.如权利要求64-102中任一项所述的方法，其中，所述反应在所述持续时间已经发生之后开始。
104.如权利要求64-103中任一项所述的方法，其中，所述反应在所述第二流体密封所述微孔的内容物之后开始。
105.如权利要求62-104中任一项所述的方法，其中，所述持续时间足够短，使得所述微孔的一种或更多种成分不会扩散出所述微孔。
106.如权利要求105所述的方法，其中，所述微孔的一种或更多种成分包括细胞、珠粒、生物分子、缓冲成分、小分子、生物分子、试剂、作用剂或它们的任意组合。
107.如权利要求64-106中任一项所述的方法，其中，所述反应持续时间在约1秒与约3小时之间。
108.如权利要求62-107中任一项所述的方法，其中，所述持续时间是动态控制的。
109.如权利要求62-108中任一项所述的方法，其中，所述持续时间是所述第一流体的体积、所述第一流体的流速、所述流动池尺寸或它们的任意组合的函数。
110.如权利要求62-109中任一项所述的方法，其中，所述持续时间是通过调节所述第一流体的体积、所述第一流体的流速或它们的任意组合来动态控制的。
111.如权利要求62-110中任一项所述的方法，其中，在所述持续时间之后所述微孔中第一流体的一种或更多种成分的最终浓度是所述持续时间和/或流动池尺寸的函数。
112.如权利要求1-66或68-111中任一项所述的方法，其中，所述第一流体的流速沿所述流体通道的纵向路径是均匀的。
113.如权利要求1-112中任一项所述的方法，其中，所述第一流体的流速沿所述流体通道的纵向路径是不均匀的。
114.如权利要求1-113中任一项所述的方法，其中，所述第一流体的流速沿所述流体通道的纵向路径而变化。
115.如权利要求1-114中任一项所述的方法，其中，所述第一流体的流速沿所述流体通道的纵向路径而增大。
116.如权利要求1-114中任一项所述的方法，其中，所述第一流体的流速沿所述流体通道的纵向路径而减小。
117.如权利要求114-116中任一项所述的方法，其中，所述第一流体的流速变化是线性的。
118.如权利要求114-116中任一项所述的方法，其中，所述第一流体的流速变化是非线性的。
119.如权利要求114-116中任一项所述的方法，其中，所述第一流体的流速变化是指数型的。
120.如权利要求114-116中任一项所述的方法，其中，所述第一流体的流速变化是对数型的。
121.如权利要求1-120中任一项所述的方法，其中，相对于在沿着所述流体通道的纵向路径的后部位置处，所述第一流体的流速在沿着所述流体通道的纵向路径的前部位置处较高。
122.如权利要求1-120中任一项所述的方法，其中，相对于在沿着所述流体通道的纵向路径的后部位置处，所述第一流体的流速在沿着所述流体通道的纵向路径的前部位置处较低。
123.如权利要求1-122中任一项所述的方法，其中，在所述前部位置处相对于在所述后部位置处的所述第一流体的流速之间的差异至少为约1.1倍。
124.如权利要求1-66或68-123中任一项所述的方法，其中，在所述共同注入之后，所述多个微孔的内容物中的所述第一流体的一种或更多种成分的最终浓度是均匀的。
125.如权利要求1-66或68-124中任一项所述的方法，其中，在所述共同注入后，所述多个微孔的内容物中的所述第一流体的一种或更多种成分的最终浓度的变异系数小于5％。
126.如权利要求1-123中任一项所述的方法，其中，在所述顺序地共同注入之后，所述多个微孔的内容物中的所述第一流体的一种或更多种成分的最终浓度是不均匀的。
127.如权利要求1-123或126中任一项所述的方法，其中，每个微孔的内容物中的所述第一流体的一种或更多种成分的最终浓度沿所述流体通道的纵向路径而变化。
128.如权利要求127所述的方法，其中，每个微孔的内容物中的所述第一流体的一种或更多种成分的最终浓度的变化是线性的。
129.如权利要求127所述的方法，其中，每个微孔的内容物中的所述第一流体的一种或更多种成分的最终浓度的变化是非线性的。
130.如权利要求127所述的方法，其中，每个微孔的内容物中的所述第一流体的一种或更多种成分的终浓度的变化是指数型的。
131.如权利要求127所述的方法，其中，每个微孔的内容物中的所述第一流体的一种或更多种成分的最终浓度的变化是对数型的。
132.如权利要求1-123或126-131中任一项所述的方法，其中，在沿着所述流体通道的纵向路径的前部位置处相对于在沿着所述流体通道的纵向路径的后部位置处的微孔的内容物中的所述第一流体的一种或更多种成分的最终浓度之间的差异至少为约1.1倍。
133.如权利要求1-123或126-132中任一项所述的方法，其中，每个微孔的内容物中的所述第一流体的一种或更多种成分的最终浓度沿着所述流体通道的纵向路径而增大。
134.如权利要求1-123或126-132中任一项所述的方法，其中，每个微孔的内容物中的所述第一流体的一种或更多种成分的最终浓度沿着所述流体通道的纵向路径而减小。
135.如权利要求1-134中任一项所述的方法，其中，在所述多个微孔中，所述流动池尺寸是一致的。
136.如权利要求1-134中任一项所述的方法，其中，在所述多个微孔中，所述流动池尺寸是不一致的。
137.如权利要求135-136中任一项所述的方法，其中，所述流动池尺寸包括所述微孔的容积和/或与所述多个微孔上方的流体通道容积接合的微孔的表面积。
138.如权利要求1-137中任一项所述的方法，其中，在沿着所述流体通道的纵向路径的前部位置相对于在沿着所述流体通道的纵向路径的后部位置处的微孔的容积之间的差异至少为约1.1倍。
139.如权利要求1-138中任一项所述的方法，其中，在沿着所述流体通道的纵向路径的前部位置相对于在沿着所述流体通道的纵向路径的后部位置处的与所述多个微孔上方的流体通道容积接合的微孔的表面积之间的差异至少为约1.1倍。
140.如权利要求1-139中任一项所述的方法，其中，在所述流与所述底部之间的边界处的所述流的速度是非零的。
141.如权利要求1-140中任一项所述的方法，其中，跨所述流体通道的横截面的流的相对流速近似恒定。
142.如权利要求1-141中任一项所述的方法，其中，所述流是活塞流。
143.如权利要求1-142中任一项所述的方法，其中，所述顶部包含亲水涂层，其中所述亲水涂层包含聚乙二醇(PEG)、聚血红素、pluronic酸F68、pluronic酸F108、pluronic酸F127、聚山梨酯20、二氧化硅(SiO2)、氮化硅或它们的任意组合。
144.如权利要求1-143中任一项所述的方法，其中，所述顶部的角度充分小于所述第一侧壁的接触角。
145.如权利要求1-144中任一项所述的方法，其中，密封所述微孔的内容物的所述第二流体减小了相互干扰。
146.如权利要求1-145中任一项所述的方法，其中，与利用单一流体注入进行的可比较的流动池方法相比，密封所述微孔的内容物的所述第二流体将相互干扰减小了至少约5％。
147.如权利要求145-146中任一项所述的方法，其中，所述相互干扰包括核酸、蛋白质、抗体、生物分子或它们的任意组合从一个微孔到另一个微孔的扩散。
148.如权利要求145-147中任一项所述的方法，其中，所述相互干扰包括核酸、蛋白质、抗体、生物分子或它们的任意组合从所述微孔扩散到所述多个微孔上方的流体通道容积。
149.如权利要求1-148中任一项所述的方法，其中，所述基板包括微孔阵列，其中所述微孔阵列包括至少100个微孔，其中每个微孔具有范围从约1,000μm3至约786,000μm3的容积。
150.如权利要求145-149中任一项所述的方法，其中，所述减小的相互干扰使得能够使用较高密度的微孔阵列而不会有随之增大的相互干扰。
151.如权利要求150所述的方法，其中，与标准微孔阵列相比，所述较高密度的微孔阵列每平方英寸包括至少100多个微孔。
152.如权利要求150-151中任一项所述的方法，其中，与标准微孔阵列相比，使用较高密度的微孔阵列提高了细胞装载效率。
153.如权利要求150-152中任一项所述的方法，其中，与标准微孔阵列相比，使用较高密度的微孔阵列提高了珠粒装载效率。
154.如权利要求150-153中任一项所述的方法，其中，与标准微孔阵列相比，使用较高密度的微孔阵列减少了双重态事件的数量。
155.如权利要求1-154中任一项所述的方法，进一步包括：在所述共同注入之前，在所述多个微孔中捕获单细胞。
156.如权利要求1-154中任一项所述的方法，进一步包括：在所述共同注入之前，在所述多个微孔中捕获单细胞和单个珠粒，其中，单个珠粒包含多个拴系条形码，并且其中所述多个拴系条形码进一步包括：
i)珠粒特异性细胞标记；
ii)多样化的分子标记的组；和
ii)能够与核酸分子杂交的多个靶结合区域。
157.如权利要求155-156中任一项所述的方法，其中，所述反应包括细胞裂解。
158.如权利要求155-157中任一项所述的方法，其中，所述第一流体包括裂解缓冲液。
159.如权利要求155-158中任一项所述的方法，其中，持续时间是足够将足以裂解所述细胞的量的裂解缓冲液递送至所述微孔的时间长度。
160.如权利要求155-159中任一项所述的方法，其中，与利用单一流体注入进行的可比较的流动池方法相比，密封所述微孔的内容物的所述第二流体带来由条形码捕获的mRNA和/或细胞成分结合试剂寡核苷酸的数量的增加。
161.如权利要求155-160中任一项所述的方法，其中，与利用单一流体注入进行的可比较的流动池方法相比，密封所述微孔的内容物的所述第二流体带来与所测定的每个所述mRNA和/或细胞成分结合试剂寡核苷酸相关联的特有分子标记的存在数量的增加。
162.如权利要求155-161中任一项所述的方法，其中，与利用单一流体注入进行的可比较的流动池方法相比，密封所述微孔的内容物的所述第二流体带来信噪比的增大。
163.如权利要求155-162中任一项所述的方法，其中当第一流体穿过所述流体通道时其流速逐渐降低，其中在所述多个微孔中，每个微孔中第一流体的一种或更多种成分的最终浓度是均匀的。
164.如权利要求1-163中任一项所述的方法，其中，进入所述微孔的内容物的所述第一流体的一种或更多种成分使反应终止。
165.如权利要求1-164中任一项所述的方法，进一步包括：向所述流体通道第二次共同注入流体。
166.如权利要求165所述的方法，其中，所述第二次共同注入流体包括将第二次共同注入的第一流体和第二次共同注入的第二流体共同注入所述流体通道，
其中，恰好在所述第二次共同注入的第二流体前一步将所述第二次共同注入的第一流体引入所述流体通道，并且
其中，所述第二次共同注入的第二流体密封所述微孔的内容物。
167.如权利要求165-166中任一项所述的方法，其中，所述第二次共同注入的第一流体与所述第二次共同注入的第二流体不混溶。
168.如权利要求165-167中任一项所述的方法，其中，所述第二次共同注入的第一流体的密度大于所述第二次共同注入的第二流体的密度。
169.如权利要求165-168中任一项所述的方法，其中，所述第二次共同注入的第一流体的密度大于所述第二次共同注入的第二流体的密度，并且其中，所述第二次共同注入的第一流体与所述第二次共同注入的第二流体不混溶。
170.如权利要求165-169中任一项所述的方法，其中，所述第二次共同注入在相对于所述第一次共同注入的相反方向上进行。
171.如权利要求165-170中任一项所述的方法，其中，所述第二次共同注入的第一流体包括含水液体并且所述第二次共同注入的第二流体包括非水液体。
172.如权利要求165-170中任一项所述的方法，其中，所述第二次共同注入的第一流体包括含水液体并且所述第二次共同注入的第二流体包括气体。
173.如权利要求165-170中任一项所述的方法，其中，所述第二次共同注入的第一流体包括非水液体并且所述第二次共同注入的第二流体包括含水液体。
174.如权利要求165-173中任一项所述的方法，其中，所述第一次共同注入的第一流体与所述第二次共同注入的第一流体是相同的。
175.如权利要求165-173中任一项所述的方法，其中，所述第一次共同注入的第一流体与所述第二次共同注入的第一流体是不同的。
176.如权利要求165-175中任一项所述的方法，其中，所述第一次共同注入的第二流体与第二次共同注入的第二流体是相同的。
177.如权利要求165-175中任一项所述的方法，其中，所述第一次共同注入的第二流体与所述第二次共同注入的第二流体是不同的。
178.如权利要求1-177中任一项所述的方法，其中，所述方法不包括使用缓冲添加剂来减少相互干扰。
179.如权利要求178所述的方法，其中，所述缓冲添加剂调节流体和/或试剂的粘度。
180.如权利要求178-179中任一项所述的方法，其中，所述缓冲添加剂包括蔗糖、聚乙二醇(PEG)、聚蔗糖、丙三醇、甘油、硫酸葡聚糖、histopaque、牛血清白蛋白或它们的任意组合。
181.如权利要求1-180中任一项所述的方法，其中，包括所述流动池的装置包括至少一个入口和至少一个出口，其中所述至少一个入口和至少一个出口能够导引流体流过所述流动池，从而使所述微孔与所述流体接触。
182.如权利要求1-181中任一项所述的方法，其中，包括所述流动池的装置是被配置为对多个单细胞执行自动化条形码编码分析的仪器系统的可移除的损耗件。
183.一种用于测定单细胞中靶核酸分子存在数量的方法，所述方法包括：
(a)提供包含流体通道的流动池，
其中，所述流体通道包括顶部、第一侧壁和底部，并且
其中，所述底部包括基板，所述基板包括多个微孔；
(b)在所述多个微孔中捕获单细胞和单个珠粒，其中，单个珠粒包括多个拴系条形码，并且其中所述多个拴系条形码进一步包括：
i)珠粒特异性细胞标记；
ii)多样化的分子标记的组；和
iii)能够与靶核酸分子杂交的多个靶结合区域，
(c)将第一流体和第二流体共同注入所述流体通道，
其中，恰好在所述第二流体前一步将所述第一流体引入所述流体通道，
其中，所述第一流体与所述微孔的内容物的表面接合一段持续时间，
其中，所述第一流体包括裂解缓冲液，
其中，所述第一流体的一种或更多种成分通过扩散进入所述微孔并引发细胞裂解，以及
其中，所述第二流体密封所述微孔的内容物；
(d)使细胞裂解后从单细胞释放的靶核酸分子以随机方式与拴系在单个珠粒上的多个靶结合区域杂交；
(e)进行延伸反应以产生多个分子缀合物，每个分子缀合物包含条形码与所述靶核酸分子中之一的互补序列的一部分；
(f)对所述分子缀合物进行扩增和测序；以及
(g)测定所述单细胞中所述靶核酸分子存在的数量。
184.如权利要求183所述的方法，其中，所述第一流体的密度大于所述第二流体的密度，并且其中，所述第一流体与所述第二流体不混溶。
185.如权利要求183所述的方法，其中，步骤(b)包括：预充所述流动池，装载所述细胞，然后装载所述珠粒。
186.如权利要求183所述的方法，其中，步骤(b)包括：预充所述流动池，利用空气注入来置换所述预充缓冲液，装载细胞悬浮液，利用空气注入来置换所述细胞悬浮液，以及装载所述珠粒。
187.如权利要求183-186中任一项所述的方法，其中，所述多个拴系条形码进一步包括通用引物序列。
188.如权利要求183-187中任一项所述的方法，其中，栓系在珠粒上的多个条形码的多个靶结合区域包括选自以下的混合物：基因特异性序列，oligo-dT序列，无规多聚体序列，或它们的任意组合。
189.如权利要求183-188中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸分子包括RNA分子。
190.如权利要求183-189中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸分子包括mRNA分子。
191.如权利要求183-190中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸分子包括细胞成分结合试剂寡核苷酸。
192.如权利要求191所述的方法，其中，所述细胞成分结合试剂寡核苷酸包括样品索引寡核苷酸。
193.如权利要求183-192中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸分子包括细胞成分结合试剂寡核苷酸，并且其中，测定所述单细胞中所述靶核酸分子的存在数量指示了所述单细胞中的细胞成分靶标的拷贝数。
194.如权利要求183-193中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸分子包括样品索引寡核苷酸，并且其中，测定所述单细胞中靶核酸分子的存在数量指示了鉴定所述细胞的样品来源。
195.如权利要求183-194中任一项所述的方法，其中，与利用单一流体注入进行的可比较的流动池方法相比，密封所述微孔的内容物的所述第二流体带来由所述条形码捕获的mRNA和/或细胞成分结合试剂寡核苷酸的数量的增加。
196.如权利要求183-195中任一项所述的方法，其中，与利用单一流体注入流动池进行的可比较的流动池方法相比，密封所述微孔的内容物的所述第二流体带来与所测定的mRNA和/或细胞成分结合试剂寡核苷酸中的每一个相关联的特有分子标记的存在数量的增加。
197.如权利要求183-196中任一项所述的方法，其中，与利用单一流体注入进行的可比较的流动池方法相比，密封所述微孔的内容物的所述第二流体带来信噪比的增大。
198.一种测量作用剂对单细胞的剂量依赖性表型效应的方法，所述方法包括：
(a)提供包含流体通道的流动池，
其中，所述流体通道包括顶部、第一侧壁和底部，并且
其中，所述底部包括基板，所述基板包括多个微孔；
(b)在所述多个微孔中捕获单细胞；
(c)将第一流体和第二流体共同注入所述流体通道，
其中，恰好在所述第二流体前一步将所述第一流体引入所述流体通道，
其中，所述第一流体与所述微孔的内容物的表面接合一段持续时间，
其中，所述第一流体包含一种或更多种成分，
其中，所述第一流体的一种或更多种成分包括作用剂，
其中，所述第一流体的流速沿着所述流体通道的纵向路径是不均匀的，
其中，所述作用剂在所述持续时间内通过扩散进入所述微孔，
其中，对于所述多个微孔中的至少两个微孔，所述微孔的内容物中的作用剂的最终浓度不相等，以及
其中，所述第二流体密封所述微孔的内容物；以及
(d)测量依赖于所述微孔中的作用剂的最终浓度的一种或更多种表型效应。
199.如权利要求198所述的方法，其中所述第一流体的密度大于所述第二流体的密度，并且其中所述第一流体与所述第二流体不混溶。
200.如权利要求198-199中任一项所述的方法，进一步包括第二次共同注入流体，其中所述第二次共同注入包括将第二次共同注入的第二第一液体和第二次共同注入的第二液体共同注入到所述流体通道中，其中恰好在所述第二次共同注入的第二液体前一步将所述第二次共同注入的第一液体引入所述流体通道，其中所述第二次共同注入的第二液体密封所述微孔的内容物。
201.如权利要求198-200中任一项所述的方法，其中所述第二次共同注入的第一液体的密度大于所述第二次共同注入的第二液体的密度，并且其中所述第二次共同注入的第一液体与所述第二次共同注入的第二液体不混溶。
202.如权利要求200-201中任一项所述的方法，其中，所述第二次共同注入在相对于所述第一次共同注入的相反方向上进行。
203.如权利要求200-202中任一项所述的方法，其中，所述第二次共同注入的第一流体包括第二作用剂。
204.如权利要求198-203中任一项所述的方法，其中，相对于在沿着所述流体通道的纵向路径的后部位置处，所述第一流体的流速在沿着所述流体通道的纵向路径的前部位置处较高。
205.如权利要求198-203中任一项所述的方法，其中，相对于在沿着所述流体通道的纵向路径的后部位置处，所述第一流体的流速在沿着所述流体通道的纵向路径的前部位置处较低。
206.如权利要求198-205中任一项所述的方法，其中，在沿着所述流体通道的纵向路径的前部位置处相对于在沿着所述流体通道的纵向路径的后部位置处的所述第一流体的流速之间的差异至少为约1.1倍。
207.如权利要求198-206中任一项所述的方法，其中，在所述顺序共同注入之后，所述多个微孔的内容物中的作用剂的最终浓度是不均匀的。
208.如权利要求198-207中任一项所述的方法，其中，每个微孔的内容物中的作用剂的最终浓度沿着所述流体通道的纵向路径而变化。
209.如权利要求208所述的方法，其中，每个微孔的内容物中的作用剂的最终浓度的变化是线性的。
210.如权利要求208所述的方法，其中，每个微孔的内容物中的作用剂的最终浓度的变化是非线性的。
211.如权利要求208所述的方法，其中，每个微孔的内容物中的作用剂的最终浓度的变化是指数型的。
212.如权利要求208所述的方法，其中，每个微孔的内容物中的作用剂的最终浓度的变化是对数型的。
213.如权利要求198-212中任一项所述的方法，其中，在沿着所述流体通道的纵向路径的前部位置处相对于在沿着所述纵向路径的后部位置处的微孔的内容物中的作用剂的最终浓度之间的差异至少为约1.1倍。
214.如权利要求198-203中任一项所述的方法，其中，所述作用剂包括一种或更多种成分。
215.如权利要求203-214中任一项所述的方法，其中，所述第二作用剂包括一种或更多种成分。
216.如权利要求198-215中任一项所述的方法，其中，所述作用剂包括一种或更多种化学剂、药物、小分子、生物剂、CRISPR单向导RNA(sgRNA)、小干扰RNA(siRNA)、CRISPR RNA(crRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)、反义寡核苷酸、肽或拟肽抑制剂、适配体、抗体、胞内抗体，或它们的任意组合。
217.如权利要求198-216中任一项所述的方法，其中，所述作用剂包括一种或更多种表观遗传修饰剂、表观遗传酶、双环肽、转录因子、DNA或蛋白修饰酶、DNA嵌入剂、外排泵抑制剂、核受体活化剂或抑制剂、蛋白酶体抑制剂、酶的竞争性抑制剂、蛋白质合成抑制剂、核酸酶、蛋白质片段或结构域、标签或标志物、抗原、抗体或抗体片段、配体或受体、来自天然生物活性肽的合成肽或类似肽、抗微生物肽、成孔肽、靶向或细胞毒性的肽、降解或自毁肽、CRISPR组分系统或其组分、DNA、RNA、人工核酸、纳米颗粒、寡核苷酸适配体、肽适配体或它们的任意组合。
218.如权利要求198-217中任一项所述的方法，其中，所述作用剂具有选自以下的至少一种效应活性：调节生物活性，结合调节蛋白，调节酶活性，调节底物结合，调节受体活化，调节蛋白质稳定性/降解，调节转录物稳定性/降解，以及它们的任意组合。
219.如权利要求198-218中任一项所述的方法，其中，所述作用剂包括感染剂。
220.如权利要求198-219中任一项所述的方法，其中，所述作用剂包括抗感染剂。
221.如权利要求198-220中任一项所述的方法，其中，所述作用剂包括感染剂和抗感染剂的混合物。
222.如权利要求219-221中任一项所述的方法，其中，所述感染剂包括病毒、细菌、真菌、原生动物寄生虫或它们的任意组合。
223.如权利要求219-222中任一项所述的方法，其中，抗感染剂包括抗细菌剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂或它们的任意组合。
224.如权利要求198-223中任一项所述的方法，其中，所述作用剂包括细胞毒性剂。
225.如权利要求224所述的方法，其中，所述细胞毒性剂选自：化学治疗剂、生物剂、毒素、放射性同位素或它们的任意组合。
226.如权利要求198-225中任一项所述的方法，其中，所述作用剂包括治疗剂的非活性成分。
227.如权利要求226所述的方法，其中，所述治疗剂的非活性成分包括赋形剂、载体、稀释剂、媒介、佐剂、空运载体或它们的任意组合。
228.如权利要求198-227中任一项所述的方法，其中，所述作用剂包括表达运载体，其中所述表达运载体编码以下中的一种或更多种：mRNA、反义核酸分子、RNAi分子、shRNA、成熟miRNA、前体miRNA、初级miRNA、抗miRNA、核酶、它们的任意组合。
229.如权利要求198-228中任一项所述的方法，其中，所述单细胞包含重组表达运载体。
230.如权利要求229所述的方法，其中，所述重组表达运载体包含诱导型启动子，并且其中，以下一种或更多种的表达受所述诱导型启动子的控制：mRNA、反义核酸分子、RNAi分子、shRNA、成熟miRNA、前体miRNA、初级miRNA、抗miRNA、核酶、它们的任意组合。
231.如权利要求229-230中任一项所述的方法，其中，所述作用剂是所述诱导型启动子的剂量依赖性诱导剂。
232.如权利要求229-231中任一项所述的方法，其中，所述剂量依赖性诱导剂包括四环素、原始霉素、大环内酯、蜕皮激素、米非司酮或它们的任意组合。
233.如权利要求198-232中任一项所述的方法，其中，所述作用剂调节一种或更多种靶标生物标志物的表达。
234.如权利要求198-233中任一项所述的方法，其中，所述作用剂调节一种或更多种靶标生物标志物的活性。
235.如权利要求198-234中任一项所述的方法，进一步包括在所述多个微孔中捕获单个珠粒，其中单个珠粒包含多个拴系条形码，并且其中所述多个拴系条形码进一步包括：
i)珠粒特异性细胞标记；
ii)多样化的分子标记的组；和
iii)能够与靶核酸分子杂交的多个靶结合区域。
236.如权利要求198-235中任一项所述的方法，其中，测量依赖于所述微孔中的作用剂的最终浓度的一种或更多种表型效应包括：mRNA表达谱分析，其中所述mRNA表达谱分析包括对细胞中多个mRNA靶标的定量分析。
237.如权利要求198-236中任一项所述的方法，其中，测量依赖于所述微孔中的作用剂的最终浓度的一种或更多种表型效应包括：蛋白质表达谱分析，其中蛋白质表达谱分析包括对细胞中多个蛋白质靶标的定量分析。
238.如权利要求198-237中任一项所述的方法，其中，测量依赖于所述微孔中的作用剂的最终浓度的一种或更多种表型效应包括：对细胞中的多个蛋白质靶标和多个核酸靶标分子的同时定量分析。
239.如权利要求155-238中任一项所述的方法，进一步包括：确定所述微孔阵列内每个细胞的流动池纵向位置。
240.如权利要求239所述的方法，其中，确定所述微孔阵列内每个细胞的流动池纵向位置包括：确定每个细胞的来源的微孔。
241.如权利要求239-240中任一项所述的方法，其中，所述微孔阵列的每个微孔包括阵列地址码。
242.如权利要求241所述的方法，其中，所述阵列地址码包括对于所述微孔阵列中的每个微孔特有的核酸条形码。
243.如权利要求241-242中任一项所述的方法，其中，所述阵列地址码被共价附接到所述微孔的一个或更多个内表面。
244.如权利要求243所述的方法，其中，所述共价附接包括使用一个或更多个可切割接头以能够释放所述阵列地址码。
245.如权利要求244所述的方法，其中，所述一个或更多个可切割接头包括酸不稳定接头、碱不稳定接头、光可切割接头、酶可切割接头或它们的任意组合。
246.如权利要求241-245中任一项所述的方法，其中，所述阵列地址码包括限制酶位点。
247.如权利要求241-146中任一项所述的方法，其中，附接到所述珠粒的所述条形码的子集包括：用于所述阵列地址码的退火位点。
248.如权利要求241-247中任一项所述的方法，其中，在释放时，所述阵列地址码与所述条形码的子集杂交。
249.如权利要求241-248中任一项所述的方法，其中，在测序期间所述细胞标记和所述阵列地址码的关联鉴定了所述微孔阵列内每个细胞的来源的微孔。
250.如权利要求155-249中任一项所述的方法，其中，所述多个珠粒中的每一个包括多个随机条形码、第一组光学标记和第二组光学标记。
251.如权利要求250所述的方法，其中，所述第一组光学标记中的每个光学标记包含第一光学部分并且所述第二组光学标记中的每个光学标记包含第二光学部分。
252.如权利要求251所述的方法，其中，所述多个珠粒中的每一个与包含所述第一光学部分和所述第二光学部分的光学条形码相关联，并且其中，所述第一光学部分和所述第二光学部分选自两个或更多个光谱不同的光学部分。
253.如权利要求252所述的方法，其中，所述多个珠粒中的至少两个珠粒包括特有的光学条形码，并且其中，可以在所述流动池中检测所述多个珠粒中每个珠粒的光学条形码以确定所述多个珠粒中每个珠粒的定位。
254.如权利要求252-253中任一项所述的方法，进一步包括：检测所述多个珠粒中每一个的光学条形码以确定所述多个珠粒中每一个的定位。
255.如权利要求252-254中任一项所述的方法，进一步包括：基于所述多个珠粒的定位确定所述多个单细胞的微孔定位。
256.如权利要求239-255中任一项所述的方法，进一步包括：评估在每个流动池纵向位置处的作用剂的浓度。
257.如权利要求239-256中任一项所述的方法，其中，所述第一流体包括荧光染料，其中所述荧光染料与所述作用剂的比例是已知的。
258.如权利要求239-257中任一项所述的方法，进一步包括：在共同注入所述第一流体和第二流体之后对所述流动池进行光学成像，其中，光学成像包括测量每个微孔中的荧光染料，其中所述流动池包括用于光学成像的透明窗口。
259.如权利要求258所述的方法，其中，测量每个微孔中的荧光染料使得能够估算每个微孔中的作用剂的浓度。
260.如权利要求239-259中任一项所述的方法，进一步包括：基于对每个细胞的来源的微孔的确定和对每个流动池纵向位置处的作用剂的浓度的估算，得到对每个细胞暴露于其中的作用剂的浓度的估算。
261.如权利要求260所述的方法，进一步包括：对每个细胞暴露于其中的作用剂的估算浓度与所述细胞的RNA和/或DNA表达谱的相关性分析。
262.如权利要求261所述的方法，其中，所述相关性分析鉴定以下一项或更多项：候选治疗剂、候选治疗剂的候选剂量以及候选治疗剂的细胞靶标。
263.如权利要求1-0中任一项所述的方法，其中，所述第一流体是第一塞并且所述第二流体是第二塞。
CN202080020085.3A 2019-03-18 2020-02-24 成分进入流体的精确递送 Active CN113557090B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962820259P 2019-03-18 2019-03-18
US62/820,259 2019-03-18
PCT/US2020/019506 WO2020190454A1 (en) 2019-03-18 2020-02-24 Precise delivery of components into fluids

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113557090A true CN113557090A (zh) 2021-10-26
CN113557090B CN113557090B (zh) 2024-03-22

Family

ID=72514287

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080020085.3A Active CN113557090B (zh) 2019-03-18 2020-02-24 成分进入流体的精确递送

Country Status (4)

Country Link
US (2) US11976269B2 (zh)
EP (1) EP3941630A4 (zh)
CN (1) CN113557090B (zh)
WO (1) WO2020190454A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115466671A (zh) * 2022-09-28 2022-12-13 广纳达康(广州)生物科技有限公司 一种防冲液核酸扩增物检测装置及检测方法
WO2023197588A1 (zh) * 2022-04-11 2023-10-19 东南大学 一种以小尺寸微管为容器的快速光加热pcr装置及方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20230102204A1 (en) * 2021-09-30 2023-03-30 Water Bear Health Technology (Nantong) Co., LTD. Microfluidic chip and manufacture method thereof, and cell separation and single-cell western blotting method
WO2023177601A1 (en) * 2022-03-18 2023-09-21 Owl biomedical, Inc. Microfabricated droplet dispensor with hydrogel
WO2024091930A1 (en) * 2022-10-24 2024-05-02 1859, Inc. Miniaturized methods and systems for sample screening

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103026232A (zh) * 2010-03-01 2013-04-03 匡特里克斯公司 扩大用于检测分子或颗粒的测定法中的动态范围的方法和系统
US20150267247A1 (en) * 2014-03-21 2015-09-24 Santa Clara University Microdroplet Formation by Wells in a Microfluidic Device
WO2016118915A1 (en) * 2015-01-22 2016-07-28 Becton, Dickinson And Company Devices and systems for molecular barcoding of nucleic acid targets in single cells
US20160253584A1 (en) * 2015-02-27 2016-09-01 Cellular Research, Inc. Spatially addressable molecular barcoding
WO2016149639A1 (en) * 2015-03-19 2016-09-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Devices and methods for high-throughput single cell and biomolecule analysis and retrieval in a microfluidic chip
US20180200710A1 (en) * 2017-01-13 2018-07-19 Cellular Research, Inc. Hydrophilic coating of fluidic channels
US20190060902A1 (en) * 2017-08-29 2019-02-28 Celsee Diagnostics, Inc. System and method for isolating and analyzing cells

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6324157A (ja) * 1987-03-18 1988-02-01 Olympus Optical Co Ltd 酵素免疫自動測定機
IL89447A0 (en) * 1989-03-02 1989-09-10 Galai Lab Ltd Analytical clinical method and device for carrying out such method
JPH0643163A (ja) * 1991-02-12 1994-02-18 Olympus Optical Co Ltd 酵素免疫自動測定方法
US6143496A (en) * 1997-04-17 2000-11-07 Cytonix Corporation Method of sampling, amplifying and quantifying segment of nucleic acid, polymerase chain reaction assembly having nanoliter-sized sample chambers, and method of filling assembly
US6899137B2 (en) * 1999-06-28 2005-05-31 California Institute Of Technology Microfabricated elastomeric valve and pump systems
US20060121624A1 (en) * 2004-03-03 2006-06-08 Huang Lotien R Methods and systems for fluid delivery
US8831887B2 (en) * 2005-10-12 2014-09-09 The Research Foundation For The State University Of New York Absolute PCR quantification
EP2636755A1 (en) * 2006-05-26 2013-09-11 AltheaDx Incorporated Biochemical analysis of partitioned cells
CA2894945C (en) * 2007-04-04 2018-01-09 Netbio, Inc. Methods for rapid multiplexed amplification of target nucleic acids
US8941826B2 (en) * 2007-09-10 2015-01-27 The Penn State Research Foundation Three-dimensional (3D) hydrodynamic focusing using a microfluidic device
CA2705213C (en) * 2007-11-07 2016-10-04 The University Of British Columbia Microfluidic device and method of using same
KR101362905B1 (ko) * 2007-11-30 2014-02-19 (주)바이오니아 마이크로 챔버 플레이트, 그 제조방법
US20120028822A1 (en) * 2008-11-04 2012-02-02 Helicos Biosciences Corporation Methods, flow cells and systems for single cell analysis
CN104722342B (zh) * 2009-03-24 2017-01-11 芝加哥大学 滑动式芯片装置和方法
US8709356B2 (en) * 2009-04-10 2014-04-29 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Systems and methods for minimization or elimination of diffusion effects in a microfluidic system
CN102483386B (zh) * 2009-07-01 2016-08-17 贝克曼考尔特公司 用于临床诊断学的改进的离子选择电极模块
ES2687144T3 (es) * 2011-02-03 2018-10-23 Northeastern University Métodos y composiciones para la captura y liberación altamente específicas de materiales biológicos
EP2502674A1 (en) * 2011-03-22 2012-09-26 Koninklijke Philips Electronics N.V. Method for performing molecular reactions by using immiscible intermediate fluids
US9556470B2 (en) * 2011-06-02 2017-01-31 Raindance Technologies, Inc. Enzyme quantification
WO2013159116A1 (en) * 2012-04-20 2013-10-24 University Of Chicago Fluidic devices for biospecimen preservation
ITTO20120703A1 (it) * 2012-08-03 2014-02-04 Biomerieux Sa Dispositivo microfluidico monouso, cartuccia includente il dispositivo microfluidico, apparecchio per eseguire una amplificazione di acido nucleico, metodo di fabbricazione del dispositivo microfluidico, e metodo di uso del dispositivo microfluidico
CN113528634A (zh) * 2012-08-14 2021-10-22 10X基因组学有限公司 微胶囊组合物及方法
US9914968B2 (en) * 2012-09-26 2018-03-13 Cepheid Honeycomb tube
US20140342375A1 (en) * 2013-03-15 2014-11-20 University Of Maryland Microfluidic processing of leukocytes for molecular diagnostic testing
US20170209864A1 (en) * 2013-03-15 2017-07-27 Gpb Scientific, Llc Methods and systems for processing particles
CN114272964B (zh) * 2013-06-25 2024-04-23 华盛顿大学商业中心 样品体积的自数字化
US10415084B2 (en) * 2013-06-27 2019-09-17 Quark Biosciences Taiwan, Inc. Multiplex slide plate device and operation method thereof
WO2015009967A1 (en) * 2013-07-19 2015-01-22 California Institute Of Technology Digital assay for quantifying and concentrating analytes
ITTO20130940A1 (it) * 2013-11-20 2015-05-21 St Microelectronics Srl Kit per analisi biochimiche e metodo per eseguire un processo biochimico di tipo migliorato
US10125393B2 (en) * 2013-12-11 2018-11-13 Genapsys, Inc. Systems and methods for biological analysis and computation
JP6183471B2 (ja) * 2014-01-31 2017-08-23 凸版印刷株式会社 生体分子解析キット及び生体分子解析方法
WO2015188171A1 (en) * 2014-06-06 2015-12-10 Berkeley Lights, Inc. Isolating microfluidic structures and trapping bubbles
US20170128947A1 (en) * 2014-07-02 2017-05-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Devices and methods for monitoring and quantifying nucleic acid amplification
EP3253911B1 (en) * 2015-02-04 2021-01-20 The University Of British Columbia Methods and devices for analyzing particles
US10788452B2 (en) * 2015-04-21 2020-09-29 General Automation Lab Technologies Inc. High resolution systems, kits, apparatus, and methods for bacterial community relationship determination and other high throughput microbiology applications
AU2016337312A1 (en) * 2015-10-16 2018-05-10 Oxford University Innovation Limited Microfluidic arrangements
EP3357575B1 (en) * 2017-02-06 2021-03-17 H. Hoffnabb-La Roche Ag Sealable microfluidic chip and method for thermocycling
JPWO2019098301A1 (ja) * 2017-11-17 2020-12-17 凸版印刷株式会社 標的分子の検出方法
DK3498865T3 (da) * 2017-12-14 2020-12-21 Univ Muenchen Ludwig Maximilians Påvisning og kvantificering af enkeltmolekyler ved hjælp af DNA-nanoteknologi i microwells

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103026232A (zh) * 2010-03-01 2013-04-03 匡特里克斯公司 扩大用于检测分子或颗粒的测定法中的动态范围的方法和系统
US20150267247A1 (en) * 2014-03-21 2015-09-24 Santa Clara University Microdroplet Formation by Wells in a Microfluidic Device
WO2016118915A1 (en) * 2015-01-22 2016-07-28 Becton, Dickinson And Company Devices and systems for molecular barcoding of nucleic acid targets in single cells
CN107407691A (zh) * 2015-01-22 2017-11-28 贝克顿迪金森公司 用于单细胞中核酸靶标的分子条码化的装置和系统
US20160253584A1 (en) * 2015-02-27 2016-09-01 Cellular Research, Inc. Spatially addressable molecular barcoding
WO2016149639A1 (en) * 2015-03-19 2016-09-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Devices and methods for high-throughput single cell and biomolecule analysis and retrieval in a microfluidic chip
US20180200710A1 (en) * 2017-01-13 2018-07-19 Cellular Research, Inc. Hydrophilic coating of fluidic channels
US20190060902A1 (en) * 2017-08-29 2019-02-28 Celsee Diagnostics, Inc. System and method for isolating and analyzing cells

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023197588A1 (zh) * 2022-04-11 2023-10-19 东南大学 一种以小尺寸微管为容器的快速光加热pcr装置及方法
CN115466671A (zh) * 2022-09-28 2022-12-13 广纳达康(广州)生物科技有限公司 一种防冲液核酸扩增物检测装置及检测方法
CN115466671B (zh) * 2022-09-28 2023-12-15 广纳达康(广州)生物科技有限公司 一种防冲液核酸扩增物检测装置及检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
US11976269B2 (en) 2024-05-07
CN113557090B (zh) 2024-03-22
EP3941630A4 (en) 2023-04-05
WO2020190454A1 (en) 2020-09-24
US20240263165A1 (en) 2024-08-08
US20200299672A1 (en) 2020-09-24
EP3941630A1 (en) 2022-01-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230083422A1 (en) Methods and compositions for combinatorial barcoding
US20220333185A1 (en) Methods and compositions for whole transcriptome amplification
US20230193372A1 (en) Error correction in amplification of samples
CN107208157B (zh) 用于条形编码核酸以用于测序的方法和组合物
US11124823B2 (en) Methods for RNA quantification
CN107208158B (zh) 空间上可寻址的分子条形编码
CN113557090B (zh) 成分进入流体的精确递送
EP3248018B1 (en) Devices and systems for molecular barcoding of nucleic acid targets in single cells
US10722880B2 (en) Hydrophilic coating of fluidic channels
WO2021113065A1 (en) Magnetic capture bead mediated molecular barcoding of nucleic acid targets in single particles and compositions for use in the same
US20200157600A1 (en) Methods and compositions for whole transcriptome amplification
WO2024137527A1 (en) Sorting method using barcoded chambers for single cell workflow

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant