ITTO20130940A1 - Kit per analisi biochimiche e metodo per eseguire un processo biochimico di tipo migliorato - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

“KIT PER ANALISI BIOCHIMICHE E METODO PER ESEGUIRE UN PROCESSO BIOCHIMICO DI TIPO MIGLIORATO”

La presente invenzione è relativa a un sistema o kit per analisi biochimiche e ad un metodo per eseguire un processo biochimico.

Come è noto, l’analisi degli acidi nucleici richiede, secondo varie modalità di riconoscimento, fasi preliminari di preparazione di un campione di materiale biologico, di amplificazione del materiale nucleico in esso contenuto e di ibridazione di singoli filamenti obiettivo o di riferimento, corrispondenti alle sequenze ricercate.

Al termine delle fasi preparatorie, il campione deve essere esaminato per controllare se l’amplificazione è avvenuta regolarmente.

Secondo la metodologia denominata PCR in tempo reale (“real time PCR”), il DNA viene amplificato attraverso cicli termici opportunamente selezionati e l’evolversi dell’amplificazione viene rilevata e monitorata mediante fluorescenza durante l’intero processo.

Sono noti a questo scopo vari metodi e apparati di ispezione di tipo ottico. In particolare, i metodi e gli apparati di tipo ottico sono frequentemente basati sul fenomeno della fluorescenza. Le reazioni di amplificazione sono condotte in modo che i filamenti, contenuti in una camera di riconoscimento ricavata in un supporto, includano molecole fluorescenti o fluorofori. Il supporto viene esposto a una sorgente luminosa avente un opportuno spettro di emissione, tale da eccitare i fluorofori. A loro volta, i fluorofori eccitati emettono una radiazione secondaria a una lunghezza d’onda di emissione maggiore rispetto al picco dello spettro di eccitazione. La luce emessa dai fluorofori viene raccolta e rivelata mediante un sensore ottico. Allo scopo di eliminare la radiazione luminosa di fondo, che rappresenta una fonte di disturbo, il sensore ottico è provvisto di filtri passa banda centrati alla lunghezza d’onda di emissione dei fluorofori.

Il rilevamento di sostanze diverse nello stesso campione richiede di regola l’impiego di fluorofori distinti, che hanno rispettive lunghezze d’onda di eccitazione e di emissione. Sorgenti luminose con diversi spettri di emissione vengono quindi utilizzate in successione, per analizzare le risposte nelle bande di eccitazione e di emissione di ciascun fluoroforo.

Analizzatori per PCR atti ad essere utilizzati per la lettura ottica dei campioni sono descritti in US 2012/0170608 e in US 2013/0004954. Questi analizzatori sono atti a leggere supporti provviste di un numero relativamente ridotto di pozzetti (in particolare 6 pozzetti) contenenti i campioni da analizzare, e ciascun pozzetto ha dimensioni relativamente elevate, cioè dimensione quadrata con lato compreso tra 3 e 4 mm.

I sistemi noti hanno alcune limitazioni. In particolare, la composizione della superficie del chip tipicamente utilizzato per l’analisi, genera riflessioni indesiderate della sorgente ottica utilizzata per illuminare il supporto durante l’analisi a fluorescenza, generando rumori di fondo che elevano la soglia di sensibilità di rivelazione.

Inoltre, la Richiedente ha verificato che i sistemi descritti in US 2012/0170608 e in US 2013/0004954 non consentono la lettura di supporti in silicio aventi pozzetti di dimensioni più piccole di quelle previste dall’arte nota ivi descritta (ad esempio dimensioni quadrate con lato pari o inferiore a 1 mm). L’acquisizione di immagini, tipicamente a bassa risoluzione (es., 300x200 pixel), effettuata da tali sistemi rende difficoltosa la discriminazione dei singoli pozzetti e l’acquisizione selettiva della luminosità della fluorescenza emessa dai pozzetti. In conclusione, una lettura basata su analisi della fluorescenza di tali supporti è, di fatto, impraticabile per valori di fluorescenza sotto una certa soglia, tipici di una real-time PCR.

L’analisi su volumi così ridotti prevede l’utilizzo di sistemi di acquisizione di immagini ad alta risoluzione, o una modifica delle sorgenti di emissione di luce, un aumento del costo e della dimensione dell’apparato di lettura, la qual cosa è indesiderabile.

Scopo della presente invenzione è fornire un kit per analisi biochimiche e un metodo per eseguire un processo biochimico che permettano di superare le limitazioni descritte e, in particolare, che permettano di ridurre il rischio di errori di lettura durante detta analisi.

Secondo la presente invenzione vengono forniti (“provided”) un kit per analisi biochimiche e un metodo per eseguire un processo biochimico, come definiti nelle rivendicazioni allegate.

Per una migliore comprensione dell’invenzione, ne verranno ora descritte alcune forme di realizzazione, a puro titolo di esempio non limitativo e con riferimento ai disegni allegati, nei quali:

- la figura 1 è una vista in pianta dall’alto di una cartuccia per analisi biochimiche in accordo a una forma di realizzazione della presente invenzione;

- la figura 2 è una vista in pianta dal basso della cartuccia di figura 1;

- la figura 3 è una vista laterale della cartuccia di figura 1, sezionata lungo il piano di traccia III-III di figura 1;

- le figure 4A-4D mostrano, in vista in sezione laterale, fasi di fabbricazione della cartuccia delle figure 1-3;

- la figura 5 è una vista prospettica di un analizzatore per analisi biochimiche;

- la figura 6 è una vista laterale, sezionata lungo un piano longitudinale, dell’analizzatore di figura 5;

- la figura 7 è un diagramma di flusso relativo a un metodo per acquisire immagini della cartuccia delle figure 1-3 mediante l’analizzatore delle figure 5-6, al fine di eseguire fasi di processo biochimico, secondo una forma di realizzazione della presente invenzione;

- la figura 8 mostra un’immagine della cartuccia di figura 1 acquisita mediante l’analizzatore di figura 5;

- la figura 9 è un diagramma di flusso relativo a un metodo per elaborare l’immagine di figura 8 al fine di identificare pozzetti appartenenti alla cartuccia di figura 1 rappresentati nell’immagine di figura 8;

- la figura 10 mostra l’immagine di figura 8 dopo le fasi di elaborazione di figura 9;

- la figura 11 mostra l’immagine di figura 9 al termine delle fasi di elaborazione di figura 7;

- la figura 12 mostra una vista prospettica esplosa di un microreattore per analisi biochimiche di tipo noto; e

- la figura 13 mostra un metodo diagnostico implementabile mediante un kit includente il microreattore di figura 12 e l’analizzatore delle figure 5 e 6.

Secondo un aspetto della presente invenzione viene fornito un analizzatore ottico, configurato per ricevere una cartuccia per analisi biochimiche includente una pluralità di pozzetti, ed eseguire una analisi a fluorescenza di detta cartuccia, in particolare dei pozzetti. L’analizzatore comprende un’unità di controllo (microprocessore e memoria) configurata per: (a) acquisire un'immagine associata alla fluorescenza emessa dalla cartuccia (in particolare, dai pozzetti); (b) identificare, sull’immagine, pixel appartenenti a linee di contorno dei pozzetti, generando una immagine binaria, cioè un’immagine rappresentata con due soli livelli di colore, bianco e nero; (c) riconoscere, tra le forme geometriche identificate alla fase (b), quelle che meglio approssimano (o quelle assimilabili a) una forma geometrica di riferimento identificativa di un pozzetto ideale (questa fase è eseguita, in particolare mediante filtro di Hough); (d) acquisire, dall’immagine di partenza, valori di intensità luminosa (identificativi della fluorescenza emessa dai pozzetti) solo in corrispondenza di porzioni della stessa immagine che a loro volta corrispondono alle regioni riconosciute alla fase (c); (e) valutare uno stato di avanzamento e/o un risultato dell’analisi biochimica sulla base dei valori di intensità luminosa acquisiti alla fase (d).

Si fa notare che, mentre la fase (b) serve a localizzare elementi (i pozzetti) sull’immagine, la fase (c) serve a interpretare cosa gli elementi localizzati rappresentino. Infatti, la fase (b) potrebbe restituire un risultato non completamente corretto, cioè potrebbe identificare come pozzetti difetti dell’immagine o riflessioni indesiderate della superficie della cartuccia non corrispondenti a pozzetti. Dunque, la fase (c) ha la funzione di rilevare quali forme identificate alla fase (b) corrispondono effettivamente a pozzetti della cartuccia.

Secondo un ulteriore aspetto della presente invenzione viene fornita una cartuccia per analisi biochimiche includente: un corpo di supporto, avente una prima e una seconda faccia opposte tra loro lungo una direzione Z ortogonale alla prima e alla seconda faccia; una pluralità di pozzetti (in particolare 96 pozzetti), in particolare alloggianti sonde di acidi nucleici per l’ibridizzazione a rispettivi acidi nucleici obiettivo, formati nel corpo di supporto in corrispondenza della prima faccia; una pluralità di strati biocompatibili estendentesi in rispettivi pozzetti; e uno strato antiriflesso estendentesi sulla prima faccia esternamente ai detti pozzetti.

Inoltre, la cartuccia può comprendere un modulo di contenimento di bordo accoppiato alla prima faccia del corpo di supporto (es., mediante incollaggio) in corrispondenza di regioni di bordo esterno della prima faccia, così da circondare completamente la pluralità di pozzetti.

Secondo un ulteriore aspetto della presente invenzione, è altresì fornito un kit, o sistema, per analisi biochimiche comprendente l’analizzatore ottico e la cartuccia precedentemente descritti, atti ad interoperare per fornire un risultato dell’analisi biochimica.

Vengono ora descritte forme di realizzazione della cartuccia e dell’analizzatore ottico in maggior dettaglio, e con riferimento a rispettive figure.

Le figure 1-3 mostrano una cartuccia monouso (“disposable”) per analisi biochimiche, indicata nel suo complesso con il numero di riferimento 1. La figura 1 è una vista superiore della cartuccia 1, la figura 2 è una vista inferiore della cartuccia 1 e la figura 3 è una vista in sezione laterale, presa lungo la linea di sezione III-III delle figure 1 e 2.

La cartuccia 1 comprende un corpo di supporto 2 includente una pluralità di pozzetti (“wells”) 8, un modulo di contenimento di bordo 3, un riscaldatore 5 e un sensore di temperatura 6, formanti un microreattore per analisi biochimiche. Nel seguito, i termini cartuccia e microreattore sono utilizzati in modo intercambiabile, in quanto tutti gli elementi che realizzano la cartuccia ed il microreattore sono formati in forma integrata mediante processi di microfabbricazione su materiale semiconduttore.

Per semplicità, nel seguito si farà riferimento a cartucce e strumentazione per l’amplificazione di acidi nucleici mediante PCR (“Polymerase Chain Reaction”) e l’analisi dei risultati dell’amplificazione, senza che ciò possa essere considerato limitativo. Quanto di qui in avanti descritto, infatti, trova vantaggiosa applicazione anche in sistemi destinati all’esecuzione e al riconoscimento dei risultati di differenti processi biochimici, oltre che dell’amplificazione mediante PCR.

In una forma di realizzazione, il corpo di supporto 2 è una piastrina di materiale semiconduttore, ad esempio silicio monocristallino, e presenta forma sostanzialmente rettangolare. Inoltre, una faccia 2a del corpo di supporto 2 presenti la pluralità di pozzetti 8, ed è ricoperta con uno strato di passivazione 7 biocompatibile, ad esempio ossido di silicio.

Il modulo di contenimento di bordo 3 ha, in vista superiore, forma poligonale chiusa ed è realizzato in materiale polimerico preferibilmente trasparente. Il modulo di contenimento di bordo 3 è altresì fissato sullo strato di passivazione 7 del corpo di supporto 2 in corrispondenza di regioni periferiche del corpo di supporto 2, ad esempio mediante incollaggio con colla biocompatibile, in modo tale da circondare completamente i pozzetti 8 senza sovrapporsi ad essi. In dettaglio, la cartuccia 1 è utilizzata in un sistema di analisi a fluorescenza di campioni biologici ed è atta ad alloggiare tali campioni biologici. In questo contesto, la trasparenza del modulo di contenimento di bordo 3 è riferita alle lunghezze d’onda di eccitazione e alle lunghezze d’onda generate dai fluorofori presenti nel campione contenuto nella cartuccia 1.

I pozzetti 8 sono atti a ricevere rispettivi campioni di materiale biologico da analizzare. In una forma di realizzazione, i pozzetti 8 sono in numero di 96 (solo alcuni di essi sono mostrati in figura 1, per semplicità di rappresentazione) e sono disposti a formare una matrice avente righe e colonne. Ciascun pozzetto 8 ha forma quadrangolare, ad esempio quadrata con lati di lunghezza pari a 800 µm e profondità, misurata lungo la direzione Z, pari a 400 µm. Inoltre, ciascun pozzetto 8 è separato da un altro pozzetto 8 immediatamente successivo (lungo una stessa riga e/o stessa colonna della matrice di pozzetti) di una distanza compresa tra 200 e 500 µm.

In una forma di realizzazione, inoltre, la cartuccia 1 è stata funzionalizzata fissando sonde alle pareti e/o al fondo dei pozzetti 8. Le sonde comprendono, ad esempio, singoli filamenti di DNA contenenti sequenze obiettivo di nucleotidi da ricercare nel campione biologico analizzato.

Il riscaldatore 5 e il sensore di temperatura 6 sono realizzati in corrispondenza di una faccia 2b del corpo di supporto 2, opposta alla faccia 2a. In particolare, il riscaldatore 5 include una pluralità di serpentine resistive atte a sviluppare calore per effetto Joule quando percorse da corrente. Le serpentine del riscaldatore 5 si estendono in corrispondenza della faccia 2b in regioni della faccia 2b sostanzialmente corrispondenti a rispettive regioni della faccia 2a che alloggiano i pozzetti 8. Il riscaldatore 5 e il sensore di temperatura 6 sono termicamente accoppiati ai pozzetti 8, in modo che l’energia termica rilasciata dal riscaldatore 5 provochi il riscaldamento del materiale biologico nei pozzetti 8. Il riscaldatore 5 è definito da una o più piste conduttive, ad esempio metalliche o in polisilicio. Il sensore di temperatura 6 è di tipo termoresistivo. Come noto, in un sensore termoresistivo, la resistenza varia in funzione della temperatura e quindi una lettura della resistenza è indicativa della temperatura a un dato istante.

Il corpo di supporto 2 comprende inoltre piazzole di contatto 9a disposte a un’estremità longitudinale del corpo di supporto 2, per formare un connettore 9. Quando il modulo di contenimento di bordo 3 è disposto sulla faccia 2a del corpo di supporto 2, il connettore 9 sporge su un lato rispetto al modulo di contenimento di bordo 3, esternamente all’area racchiusa dal modulo di contenimento di bordo 3. Il connettore 9 è elettricamente accoppiato al riscaldatore 5 e al sensore di temperatura 6 mediante piste conduttive realizzate nel corpo di supporto 2. Il connettore 9 permette il controllo del corpo di supporto 2 (es., per eseguire i cicli termici PCR) una volta che il corpo di supporto 2 è stato inserita in un analizzatore (descritto in seguito con riferimento alle figure 5 e 6).

Per effettuare analisi di un campione con la cartuccia 1, nei pozzetti 8 viene introdotta una miscela di reagenti in soluzione che comprende fluorofori di due tipi. Ad esempio, un primo tipo di fluorofori (es., FAM) ha una lunghezza d’onda di eccitazione λE1e una lunghezza d’onda di rilevamento (o di emissione) λD1e si combina con una prima sostanza da ricercare. Un secondo tipo di fluorofori (es., ROX) ha una lunghezza d’onda di eccitazione λE2e una lunghezza d’onda di rilevamento (o di emissione) λD2e si combina con una seconda sostanza da ricercare. Il secondo tipo di fluorofori ha la sola funzione di marker di controllo, mentre la funzione di probe molecolari per rilevare l’amplificazione del DNA è garantita dai fluorofori del primo tipo.

Secondo un aspetto della presente invenzione, come mostrato in figura 3 in vista in sezione, lo strato di passivazione 7 ha spessore variabile a seconda che lo si misuri in corrispondenza dei pozzetti 8 oppure esternamente ai pozzetti 8. In maggior dettaglio, lo strato di passivazione 7 ha spessore, esternamente ai pozzetti 8, tale da funzionare come strato antiriflesso per la radiazione di eccitazione utilizzata durante le fasi di rilevamento mediante fluorescenza. In questo modo, la superficie della cartuccia 1 non genera riflessioni indesiderate. Tale problema non si pone, invece, internamente ai pozzetti 8. Dunque, le porzioni dello strato di passivazione 7 esterne ai pozzetti 8 sono scelte di spessore diverso dalle porzioni di strato di passivazione 7 interne ai pozzetti 8.

In pratica, per ottenere uno strato di passivazione 7 atto a funzionare come strato antiriflesso esternamente ai pozzetti 8, è opportuno considerare la lunghezza d’onda λE1della radiazione di eccitazione, l’indice di rifrazione n del materiale con cui lo strato di passivazione 7 stesso è realizzato (nel caso di ossido di silicio SiO2, tale valore è pari a circa n=1.45) e il coseno dell’angolo θ che si forma con la normale al piano di incidenza della radiazione. Lo spessore h effettivo dello strato di passivazione 7, esternamente ai pozzetti 8, è dunque scelto compreso fra λE1cosθ/(4·n)-10% e λE1cosθ/(4·n)+10%, preferibilmente uguale a λE1cosθ/(4·n).

Lo spessore h dello strato di passivazione 7, internamente ai pozzetti 8, è scelto diverso da λE1/(4·n), ad esempio inferiore a λE1/(4·n).

Inoltre, si nota che lo strato di passivazione 7 di ossido di silicio è biocompatibile ed è dunque adatto all’utilizzo descritto.

Secondo una forma di realizzazione esemplificativa, lo strato di passivazione 7 è di SiO2ed ha uno spessore, in corrispondenza dei pozzetti 8, pari a circa 20 nm, e, lateralmente ai pozzetti 8 (ovvero sopra la faccia 2a), pari a circa 90 nm.

Le figure 4A-4D mostrano schematicamente fasi di fabbricazione di una cartuccia 1 del tipo precedentemente descritto.

Con riferimento alla figura 4A, si dispone il corpo di supporto 2 (ad esempio un substrato di silicio, in forma di fetta o “wafer”), avente la faccia 2a opposta alla faccia 2b lungo la direzione Z. In corrispondenza della faccia 2b, il corpo di supporto 2 presenta il riscaldatore 5, il sensore di temperatura 6 e il connettore 9. Questi elementi sono formati in modo di per sé noto, non oggetto della presente invenzione, e dunque le loro rispettive fasi di fabbricazione non sono descritte in dettaglio.

In corrispondenza della faccia 2a viene formato uno strato di maschera rigida (“hard mask”) 27, di ossido di silicio SiO2, ad esempio mediante crescita termica.

Quindi, figura 4B si procede, in modo noto e quindi non descritto in dettaglio, ad una fase di attacco mascherato dello strato di maschera rigida 27, per realizzare aperture 28 nello strato di maschera rigida 27 in corrispondenza delle regioni del corpo di supporto 2 in cui si desidera formare i pozzetti 8. Le aperture 28 espongono rispettive porzioni superficiali della faccia 2a.

Quindi, figura 4C, un ulteriore attacco, utilizzando lo strato di maschera rigida 27 come maschera di attacco, consente di rimuovere porzioni selettive del corpo di supporto 2 in corrispondenza delle aperture 28. Si forma così la pluralità di pozzetti 8 (anche se, in questa fase, privi dello strato di ossido biocompatibile di silicio). L’attacco del silicio procede fintantoché non si raggiunge la profondità desiderata per i pozzetti 8, ad esempio 400 µm.

Infine, figura 4D, una fase di crescita termica di ossido di silicio SiO2consente di crescere uno strato biocompatibile 29 internamente ai pozzetti 8. Alternativamente alla crescita termica, è altresì possibile depositare ossido di silicio.

Lo spessore dello strato di maschera rigida 27 (in particolare dopo la fase di ulteriore crescita, o deposito, di figura 4D) è tale da essere pari a (λE1·cosθ)/(4·n), come precedentemente illustrato, o, più precisamente un multiplo dispari di (λE1·cosθ)/(4·n), per evitare riflessioni indesiderate secondo quanto prima descritto. Viceversa, lo spessore dello strato biocompatibile 29 è diverso da (λE1·cosθ)/(4·n) e, più precisamente inferiore a (λE1·cosθ)/(4·n).

Lo strato di maschera rigida 27 (come ottenuto dopo la fase di attacco di figura 4B) insieme con lo strato biocompatibile 29 formano lo strato di passivazione 7 precedentemente illustrato.

Dopo la fase 4D, si esegue una fase di incollaggio, mediante un adesivo biocompatibile, esempio silicone, del modulo di contenimento di bordo 3, ottenendo la cartuccia 1 di figura 3.

Al fine dell’utilizzo della cartuccia 1 in un analizzatore per PCR in tempo reale, i pozzetti 8 vengono trattati al fine di migliorarne la biocompatibilità.

Il trattamento comprende una fase di pulizia ed attivazione, e comprende un trattamento mediante una soluzione di CH3OH:HCl (4:1) per 10 minuti a temperatura ambiente, e, in seguito, una fase di risciacquo con acqua ultrapura a pH 7.0 per rimuovere i reagenti in eccesso. Quindi, segue una fase di anidrificazione comprendente un trattamento termico in forno per 15 minuti a 70 °C.

Queste fasi hanno la funzione di rendere la cartuccia 1 (in particolare i pozzetti 8) idrofila.

Quindi, la superficie attiva dei pozzetti 8 viene ulteriormente trattata, durante una fase di “blocking”, comprendente un trattamento mediante una soluzione includente 1% BSA (Bovine Serum Albumin), 5% SSC (“Sodium chloride” più “Sodium Cytrate”). Questa fase è eseguita, in particolare, a 55°C per un tempo compreso tra 4 e 15 ore, in cui la soluzione è lasciata “riposare” nei pozzetti 8.

Infine, viene eseguito un lavaggio con acqua deionizzata.

Poiché il trattamento prima descritto per aumentare l’idrofilicità può inibire la PCR a causa della presenza di polielettroliti, queste ultime fasi hanno la funzione di ripristinare caratteristiche idonee alla PCR, affinché essa possa avvenire in modo corretto e come desiderato.

La figura 5 mostra un analizzatore per PCR in tempo reale, indicato nel suo complesso con il numero di riferimento 10, atto a essere utilizzato per la lettura della cartuccia 1 precedentemente descritta, al fine di acquisire informazioni sullo stato della PCR.

Come mostrato in figura 5, l’analizzatore per PCR 10 comprende un primo guscio 12, chiuso inferiormente da una piastra metallica 13, e un secondo guscio 14, incernierato al primo guscio 12. Il primo guscio 12, la piastra metallica 13 e il secondo guscio 14 definiscono un involucro dell’analizzatore 10.

Con riferimento anche alla figura 6, il primo guscio 12 ha uno alloggiamento (“slot”) 15 per ricevere la cartuccia 1. L’alloggiamento 15 è accessibile dall’esterno per l’inserimento della cartuccia 1 quando il secondo guscio 12 è aperto, in posizione sollevata. In posizione corrispondente alla regione racchiusa dal modulo di contenimento di bordo 3 inserito nell’alloggiamento 15 (ovvero, in corrispondenza dei pozzetti 8), il primo guscio 12 presenta una prima finestra 16 e una seconda finestra 17. La prima finestra 16 mette in comunicazione l’alloggiamento 15 con l’interno del primo guscio 12, mentre la seconda finestra 17 permette l’osservazione dei pozzetti 8 quando la cartuccia 1 è inserita nell’alloggiamento 15 e il secondo guscio 14 è sollevato.

All’interno del primo guscio 12 sono alloggiati una scheda di controllo 20, una ventola 21, un collettore 22 e una scheda sensore 23, su cui è montato un sensore di temperatura calibrato 24.

La scheda di controllo 20 e la ventola 21 sono fissate alla piastra metallica 13.

La scheda di controllo 20 ospita un’unità di controllo 25, che presiede al funzionamento dell’analizzatore 10, come spiegato più avanti, e almeno un modulo di memoria 26.

Nella forma di realizzazione qui descritta, la ventola 21 è allineata alle finestre 16, 17 ed è azionabile in modo da aspirare aria attraverso il collettore 22. Più precisamente, un flusso d’aria viene aspirato lungo un percorso che si sviluppa dall’alloggiamento 15 alla ventola 21 attraverso il collettore 22, in modo da causare uno scambio termico fra il flusso d’aria e la cartuccia 1 posto nell’alloggiamento 15.

Il secondo guscio 14 è incernierato al primo guscio 12 e definisce un coperchio, conformato in modo da accoppiarsi a tenuta di luce con il primo guscio 12 e oscurare la seconda finestra 17. In pratica, quando il secondo guscio 14 è chiuso sul primo guscio 12, l’interno del secondo guscio 14 è sostanzialmente inaccessibile alla luce ambientale e la cartuccia 1 inserita nell’alloggiamento 15 è oscurata. Quando il secondo guscio 14 è sollevato, l’alloggiamento 15 è accessibile per inserire e rimuovere la cartuccia 1. Quando la cartuccia 1 si trova nell’alloggiamento 15, inoltre, i pozzetti 8 sono visibili ed accessibili dall’esterno per consentire operazioni di caricamento di campioni biologici da analizzare.

Nel secondo guscio 14 sono alloggiati una prima sorgente luminosa 30, una seconda sorgente luminosa 31, un primo sensore di immagini 32 e un secondo sensore di immagini 33, tutti operativamente accoppiati alla, e controllati dalla, unità di controllo 25.

Le prima sorgente luminosa 30 e la seconda sorgente luminosa 31, che comprendono rispettivi dispositivi emettitori 30a, 31a, ad esempio del tipo a LED, sono orientate in modo da illuminare la cartuccia 1 attraverso la seconda finestra 17 e sono provviste rispettivamente di un primo filtro di eccitazione 35 e di un secondo filtro di eccitazione 36 che intercettano la radiazione proveniente rispettivamente dal dispositivo emettitore 30a e dal dispositivo emettitore 31a. Il primo filtro di eccitazione 35 e il secondo filtro di eccitazione 36 hanno rispettive bande passanti di eccitazione BE1, BE2centrate attorno a lunghezze d’onda di eccitazione λE1, λE2di fluorofori di due differenti tipi.

Ad esempio, il primo filtro di eccitazione 35 ha banda passante BE1centrata attorno ad una lunghezza d’onda di eccitazione λE1pari a 494 nm, ovvero compatibile con fluorofori FAM, ed il secondo filtro di eccitazione 36 ha banda passante BE2centrata attorno ad una lunghezza d’onda di eccitazione λE2pari a 575 nm, ovvero compatibile con fluorofori ROX.

La radiazione luminosa fornita dalla prima sorgente luminosa 30 e dalla seconda sorgente luminosa 31 è quindi sostanzialmente confinata rispettivamente nella banda passante di eccitazione BE1e nella banda passante di eccitazione BE2del primo filtro di eccitazione 35 e del secondo filtro di eccitazione 36. Le bande passanti di eccitazione BE1, BE2sono inoltre disgiunte e non sovrapposte.

Il primo sensore di immagini 32 e il secondo sensore di immagini 33, ad esempio sensori CMOS, sono disposti in modo da ricevere la luce emessa dai fluorofori presenti nel campione contenuto nella cartuccia 1 e eccitati dalla luce proveniente dalla prima sorgente luminosa 30 e dalla seconda sorgente luminosa 31. Nella forma di realizzazione descritta, nel caso di fluorofori FAM, la lunghezza d’onda della radiazione emessa è pari a 522 nm, mentre nel caso di fluorofori ROX la lunghezza d’onda della radiazione emessa è pari a 602 nm.

Secondo una forma di realizzazione, la prima sorgente luminosa 30 e il primo sensore di immagini 32 sono allineati lungo un primo asse X, parallelo al piano del corpo di supporto 2 quando quest’ultimo si trova nell’alloggiamento 15 e ruotato di 45° rispetto a un asse longitudinale del corpo di supporto 2 nell’alloggiamento 15. La seconda sorgente luminosa 31 e il secondo sensore di immagini 33 sono allineati lungo un secondo asse Y, perpendicolare al primo asse X.

Il primo sensore di immagini 32 e il secondo sensore di immagini 33 sono provvisti rispettivamente di un primo filtro di rilevamento 37 e di un secondo filtro di rilevamento 38. Il primo filtro di rilevamento 37 e il secondo filtro di rilevamento 38 hanno rispettive bande passanti di rilevamento BD1, BD2centrate attorno a lunghezze d’onda di rilevamento (o di emissione) λD1, λD2dei rispettivi fluorofori. Le bande passanti BD1, BD2del primo filtro di rilevamento 37 e del secondo filtro di rilevamento 38 sono inoltre disgiunte e non sovrapposte ed escludono rispettivamente le bande passanti BE1, BE2del primo filtro di eccitazione 35 e del secondo filtro di eccitazione 36.

Nella forma di realizzazione descritta, inoltre, il primo sensore di immagini 32 e il secondo sensore di immagini 33 sono sensori CMOS RGB e forniscono ciascuno tre rispettivi segnali per i canali rosso, verde e blu. Infatti, i sensori CMOS RGB comprendono una pluralità di fotorivelatori disposti a matrice e provvisti ciascuno di un rispettivo filtro di colore rosso, verde o blu, con gli elementi verdi in proporzione doppia rispetto agli elementi rossi e blu (RGGB), secondo il cosiddetto schema di Bayer, o “Bayer filter”. Un sensore RGB fornisce quindi tre segnali di canale, o segnali immagine, uno per ciascuno dei colori fondamentali rosso, verde e blu, che poi vengono combinati con operatori di media locale per ricostruire i colori originali dell’immagine acquisita. Ciascun segnale immagine rappresenta quindi la stessa immagine filtrata con un filtro corrispondente a uno dei colori fondamentali. Nel seguito, con l’espressione segnali immagine SIsi intenderà indicare tutti i segnali di canale relativi a una stessa immagine o porzione di immagine (eventualmente anche un singolo pixel).

I segnali forniti dal primo sensore di immagini 32 e dal secondo sensore di immagine 33 contengono quindi informazioni relative alla risposta di ciascun tipo di fluoroforo nelle bande dei colori fondamentali, quando viene attivata l’una o l’altra della prima sorgente luminosa 30 e della seconda sorgente luminosa 31.

L’unità di controllo 25 sfrutta i segnali immagine SIe informazioni preliminarmente immagazzinate nel modulo di memoria 26 per determinare la presenza e le concentrazioni (eventualmente nulle) nel campione di sostanze oggetto di indagine, a cui i fluorofori si sono legati.

L’unità di controllo 25 presiede al funzionamento dell’analizzatore 10 e controlla l’esecuzione principalmente di una ciclatura termica, per ottenere l’amplificazione degli acidi nucleici presenti nel materiale biologico ad esempio mediante la tecnica della PCR (“Polymerase Chain Reaction”), e di una procedura di rivelazione ottica di specifiche sequenze di nucleotidi (“target DNA”).

La cartuccia 1 viene inserita nell’alloggiamento 15 e una soluzione contenente un campione di materiale biologico e gli ingredienti per il processo di amplificazione viene introdotta nei pozzetti 8. Tra gli altri ingredienti, la soluzione comprende nucleotidi (G, A, T, C), primers, un enzima DNA-polimerasi (ad esempio TAQ-polimerasi), fluorofori e sonde per DNA contenenti singoli filamenti obiettivo.

In questa fase, non è richiesta una particolare precisione per l’introduzione del campione biologico e degli ingredienti per il processo di amplificazione, in quanto il modulo di contenimento di bordo 3 è sufficiente ad evitare che tale soluzione fluisca fuori dalla cartuccia 1. Secondo un aspetto della presente invenzione, la soluzione e gli ingredienti per il processo di amplificazione sono in forma liquida e vengono introdotti nei pozzetti 8 con l’ausilio di una spatolina morbida (es., in policarbonato idrofobico). Questa fase è sufficiente a riempire i pozzetti 8, così che ciascuno di essi contenga circa 200 nL di soluzione. Per evitare che la soluzione evapori, può essere utilizzato olio minerale, introdotto nei pozzetti 8 in modo da coprirli completamente. Anche in questo caso, il modulo di contenimento di bordo 3 è atto a trattenere l’olio minerale evitando che fuoriesca al di fuori della cartuccia 1.

L’unità di controllo 25 pilota il riscaldatore 5 e la ventola 21 rispettivamente per fornire e sottrarre energia termica in modo che la temperatura nei pozzetti 8 vari ciclicamente secondo un profilo prefissato, che permette le reazioni di amplificazione (sinteticamente denaturazione, annealing, estensione e ibridazione per la PCR). Se il campione da analizzare contiene sequenze complementari alle sonde per DNA, durante la fase di ibridazione fluorofori vengono incorporati nei filamenti ibridizzati, che vengono resi rilevabili otticamente. La rispondenza della temperatura al profilo desiderato viene verificata utilizzando il sensore di temperatura 6.

Per la rivelazione di filamenti ibridizzati, che contengono fluorofori, l’unità di controllo 25 utilizza la procedura di seguito descritta con riferimento alla figura 7.

Dopo una fase di accensione, con eventuale calibrazione (non descritta in dettaglio in quanto non parte della presente invenzione), l’unità di controllo 25 acquisisce (fase S1) sia il segnale immagine SIassociato ai fluorofori del primo tipo (es., FAM) con lunghezza d’onda di rilevamento λD1(che rispondono alla lunghezza d’onda di eccitazione λE1della prima sorgente luminosa 30), sia il segnale immagine SIassociato ai fluorofori del secondo tipo (es., ROX) con lunghezza d’onda di rilevamento λD2(che rispondono principalmente alla lunghezza d’onda di eccitazione λE2della seconda sorgente luminosa 31).

I segnali immagine SIcosì ottenuti sono rappresentativi di immagini definite da matrici di punti (pixel). La figura 8 mostra a titolo esemplificativo una immagine 40 di una porzione della cartuccia 1 in cui è visibile la radiazione a fluorescenza emessa da ciascun pozzetto 8. Nel seguito della descrizione, si farà riferimento all’elaborazione di una sola immagine (es., l’immagine associata ai fluorofori del primo tipo), a titolo esemplificativo. Le stesse fasi sono eseguite sulla seconda immagine (es., l’immagine associata ai fluorofori del secondo tipo).

La luminosità per singolo pixel è proporzionale alla potenza di fluorescenza rilevata dai sensori di immagini attraverso i rispettivi di filtri di rilevamento.

Successivamente (fase S2), l’unità di controllo 25 seleziona, nell’immagine 40 di figura 8, regioni di interesse (“regions of interest”, ROI), eliminando le porzioni di immagine prive di informazioni significative. Nella forma di realizzazione descritta, in particolare, le regioni di interesse selezionate corrispondono ai pozzetti 8 della cartuccia 1. La fase S2, dunque, è volta a riconoscere automaticamente le porzioni dell’immagine 40 che includono un pozzetto 8, escludendo dall’elaborazione le restanti porzioni che non includono un pozzetto 8. I pozzetti 8 sono isolati, sull’immagine 40, identificandone il contorno. Di conseguenza, questa fase comprende l’elaborazione dell’immagine 40 per eseguire un riconoscimento dei contorni (“edge detection”) degli elementi presenti sull’immagine 40.

Sono note nello stato dell’arte numerose tecniche per il riconoscimento dei contorni a partire da una generica immagine. Tali tecniche sono utilizzate allo scopo di rilevare i punti di un'immagine digitale in cui l'intensità luminosa subisce una variazione superiore ad una certa soglia. Bruschi cambiamenti dell’intensità luminosa di un'immagine sono tipicamente identificativi di cambiamenti significativi della realtà fisico di cui l’immagine è la rappresentazione. Con riferimento all’immagine 40 di figura 8, una elevata intensità luminosa dell’immagine corrisponde all’area delimitata dai pozzetti 8 che emettono radiazione fluorescente. L'operazione di riconoscimento dei contorni genera una immagine contenente molte meno informazioni rispetto all’immagine 40 originale, poiché dettagli non rilevanti al fine dell'individuazione dei contorni vengono eliminati, conservando invece le informazioni essenziali per descrivere le caratteristiche geometriche dei pozzetti 8. Metodi noti per il riconoscimento dei contorni comprendono metodi basati sulla ricerca (“search-based”) e metodi basati sull'attraversamento dello zero (“zerocrossing”). I metodi basati sulla ricerca riconoscono i contorni cercando i massimi ed i minimi della derivata del primo ordine dell'immagine, tipicamente identificando la direzione in cui si ha il massimo gradiente locale. I metodi zero-crossing cercano i punti in cui la derivata del secondo ordine attraversa il valore lo zero.

Uno dei metodi noti che può essere utilizzato al fine della presente invenzione, per implementare la fase S2 di figura 7, è noto come algoritmo di Canny, o metodo di Canny (J.F. Canny, “A computational approach to edge detection, IEEE Trans, Pattern Analysis and Machine Intelligence, 8(6), 1986, 679-698).

Per completezza di descrizione, vengono ora descritti, con riferimento alla figura 9, sotto-fasi che implementano, secondo un aspetto della presente invenzione, un metodo di riconoscimento dei contorni secondo la fase S2 di figura 7. Il metodo di figura 9 è implementabile su elaboratore, mediante programma software.

Con riferimento alla figura 9, fase P1, l’immagine 40 acquisita (in formato digitale) viene elaborata per rilevare valori di luminanza. La luminanza è definita come la misura fotometrica dell’intensità luminosa per unità di area. La scelta del valore di unità di area A da considerare è frutto di valutazioni derivanti dal caso particolare in esame, come ad esempio la dimensione dell’immagine e la precisione desiderata.

Secondo un aspetto della presente invenzione, l’immagine 40 ha dimensioni 300x200 pixel, e l’unità di area scelta per il calcolo della luminanza è pari ad un pixel, ovvero il valore di luminanza dell’immagine 40 viene calcolato per ciascun pixel. A questo fine, si acquisisce, per ciascun i-esimo pixel, il valore di rosso Ri(nell’intervallo 0-255), di verde Gi(nell’intervallo 0-255) e di blu Bi(nell’intervallo 0-255), e si ottiene il rispettivo valore di luminanza Lvapplicando l’equazione:

Lv_i=0.2126·Ri+0.7152·Gi+0.0722·Bi

Si fa notare che i valori 0 e 255 sono, rispettivamente, il minimo ed il massimo valore consentito per ciascun pixel rappresentato su 8 bit. Altri intervalli possono essere utilizzati.

Si genera così una matrice avente la stessa dimensione in pixel dell’immagine 40 (es., una matrice 300x200 o vettore avente 60000 locazioni), in cui ogni campo è identificativo di un valore di luminanza del rispettivo pixel.

Quindi, fase P2, si procede con una prima elaborazione dell’immagine di figura 8, normalizzando il valore di contrasto pixel per pixel. A questo fine, si estrapolano dall’immagine 40 i valori di rosso, verde e blu per ciascun pixel, analogamente a quanto descritto con riferimento alla fase P1 precedente. Dunque, per ciascun i-esimo pixel, si ottiene il valore di rosso Ri(nell’intervallo 0-255), di verde Gi(nell’intervallo 0-255) e di blu Bi(nell’intervallo 0-255). Si esegue, per ciascun i-esimo pixel, una operazione di normalizzazione per ciascuna componente di colore, secondo la formula:

Ci-((Ri+Gi+Bi)/3)

dove Ciè la rispettiva componente di colore (C<∈>{R,G,B}) rispetto alla quale si esegue la normalizzazione.

Si ottiene così una matrice avente la stessa dimensione in pixel dell’immagine 40 (es., una matrice 300x200, o vettore di 60000 locazioni), in cui ogni campo è identificativo di un valore normalizzato di contrasto per quel rispettivo pixel. Questa fase è opzionale ed ha la funzione di riduzione dell’eventuale presenza di rumore nell’immagine.

Quindi, fase P3, si calcolano valori di gradiente di luminosità dell’immagine ottenuta alla fase P2 utilizzando un filtro gaussiano. È quindi opportuno specificare le dimensioni del filtro gaussiano, le quali influenzano direttamente il risultato dell’operazione. Come noto, filtri gaussiani di piccole dimensioni (raggio ridotto) consentono di riconoscere contorni più netti a scapito della velocità di elaborazione, mentre filtri di grandi dimensioni (elevato raggio) garantiscono maggiore rapidità di esecuzione ma sono indicati per riconoscere contorni più ampi e più sfumati.

La Richiedente ha verificato che un buon compromesso, per il caso particolare oggetto della presente invenzione, si ottiene scegliendo un valore di raggio di kernel Gaussiano pari a 3 ed un valore di larghezza di kernel Gaussiano pari a 5.

All’interno dell’area definita dai valori scelti per il raggio e per la larghezza della funzione gaussiana, si acquisisce, pixel per pixel, la variazione di intensità della luce. In seguito alla fase P3 si ottiene una mappa di gradienti che fornisce il valore di ampiezza del gradiente per ciascun pixel dell'immagine 40 e la direzione del gradiente. Il valore del gradiente, insieme ad un array di valori del modulo (o “magnitude”) del gradiente vengono usati come parametri di ingresso per definire le soglie da usare nel processo di sogliatura della successiva fase P4.

Un valore di massimo locale è indicativo di una elevata probabilità di presenza di una porzione di un contorno ricercato. Tuttavia, questa indicazione non è sufficiente per decidere se una determinata regione corrisponde ad una regione di contorno di un pozzetto 8 oppure ad una sua porzione centrale. I punti corrispondenti ai massimi locali sono considerati come appartenenti ad un contorno e saranno presi in considerazione nelle successive fasi di elaborazione. Un massimo locale si ha nei punti in cui la derivata del gradiente si annulla.

Al termine della fase di ricerca dei massimi locali, l’immagine risultante è definita da una matrice contenente valori di livelli di grigio che rappresentano possibili pixel di bordo di ciascun pozzetto 8. È quindi opportuno eseguire una fase decisionale per decidere quali pixel rappresentino effettivamente un bordo.

Quindi, fase P4, si esegue l’individuazione dei contorni mediante sogliatura con isteresi. A questo fine, vengono definite due soglie, una soglia bassa T1 ed una soglia alta T2, che vengono confrontate con il gradiente calcolato per ciascun pixel. Se il valore del gradiente è inferiore alla soglia bassa T1, il pixel è scartato; se il valore del gradiente è superiore alla soglia alta T2, il pixel è accettato come parte di un contorno; se il valore del gradiente è compreso fra le due soglie T1 e T2, il pixel è accettato solamente se contiguo ad un punto già precedentemente accettato.

La presenza di due soglie T1 e T2 risolve la difficoltà che si avrebbe nel definire un unico valore di gradiente di luminosità per discriminare l’appartenenza di un pixel ad un contorno. Risulta evidente che il valore di T1 e T2 deve essere scelto caso per caso, sulla base dell’immagine che si sta analizzando. A titolo di esempio, la Richiedente ha verificato che valori accettabili sono pari a T1=100 e T2=190. Questi valori sono confrontati con il valore di gradiente di luminosità rilevato alla fase P3 precedente (ovvero il confronto viene eseguito per ogni misura di gradiente, sulla matrice di pixel). L’intervallo di valori possibili per il gradiente, calcolati sull’immagine campione figura 8 è compreso tra 0 e 255.

Al termine di questa fase P4 si ottiene un'immagine binaria dove ciascun pixel è marcato come appartenente ad un contorno oppure non appartenente ad un contorno.

Quindi, fase P5, si esegue una fase di generazione dell’immagine binaria (ovvero, rappresentata con due soli colori, o due soli livelli di luminosità), in cui i pixel di contorno vengono rappresentati con il colore bianco (o nero) e i restanti pixel vengono rappresentati con il colore nero (o bianco). Si ottiene così una immagine del tipo mostrato in figura 10 ed identificata con il numero di riferimento 50. L’immagine 50 è un’immagine binaria, ossia rappresentata su due soli livelli di colore (bianco e nero), in cui l'informazione associata ad un punto (pixel) è rappresentata unicamente dalla sua posizione.

Tornando alle fasi di metodo di figura 7, fase S3, si applica un algoritmo di riconoscimento di forme (“pattern recognition”) all’immagine 50 di figura 10. Un esempio di algoritmo utilizzabile è noto come algoritmo di Hough.

In questo contesto, il riconoscimento di forme è basato su stime a massima verosimiglianza, e non su una corrispondenza esatta. In altre parole, si tengono in considerazione variazioni statistiche in quanto i pozzetti rappresentati sull’immagine 50 non hanno una forma quadrangolare ideale. A titolo di esempio, è possibile utilizzare l’algoritmo di Hough, o qualsiasi altro algoritmo di riconoscimento di forme noto, ad esempio l’algoritmo (o trasformata, o filtro) di Radon.

Nel seguito si farà esplicito riferimento alla trasformata di Hough (anche detta filtro di Hough o algoritmo di Hough), senza per questo perdere di generalità.

L’algoritmo di Hough è un metodo, di per sé noto, utilizzato per individuare forme definite analiticamente (linee, cerchi, poligoni, ecc.) all'interno di un'immagine digitale.

L'algoritmo di Hough si fonda sull'assunzione che ciascun punto (pixel) fornisce un contributo (anche chiamato “voto”) alla definizione di uno spazio diverso da quello dell'immagine denominato "spazio dei parametri" o "accumulatore" (nel caso dell’immagine 50, lo spazio è bidimensionale, rappresentabile mediante un vettore o una matrice o “array” di accumulo).

L'algoritmo di Hough riceve in ingresso le coordinate dei punti appartenenti alle curve presenti nell'immagine (ovvero dei pixel identificati come appartenenti ad un contorno), e fornisce in output una descrizione parametrica dell'insieme delle curve riconosciute, appartenenti ad una fissata figura analitica (come detto, una linea, un poligono, etc.).

In dettaglio, definita e parametrizzata la figura analitica che si intende cercare (es., una retta), per ogni pixel rilevato all’interno dell'immagine 50 si identificano tutte le curve che potrebbero passare per quel pixel (nel caso di ricerca di una retta, l’insieme delle possibili curve è il fascio di rette per il pixel) e si incrementano di conseguenza le relative locazioni del vettore o matrice di accumulo.

Si ottiene così una funzione di accumulazione definita nello spazio dei parametri e cui massimi determinano i parametri che identificano le curve individuate nello spazio immagine.

Nel caso del riconoscimento di linee, la descrizione analitica adottata non è la forma parametrica y=mx+b, ma, per ragioni computazionali, si utilizza una rappresentazione in coordinate polari del tipo ρ=x·cosθ+y·senθ, dove i parametri da identificare sono la coppia (ρ,θ), dove ρ è la distanza tra la retta e l’origine del sistema di riferimento, e θ è l’angolo che la normale alla retta forma con il semi asse positivo delle x.

La matrice di accumulazione A(ρ,θ)rappresenta lo spazio in coordinate polari (ρ,θ); per ciascun pixel nello spazio dell’immagine 50 di partenza, si calcolano tutte le curve che passano per quel pixel e si incrementano le relative celle della matrice di accumulazione A(ρ,θ). I punti di massimo della funzione di accumulazione così ottenuta determinano le rette ricercate.

A partire dall’equalizzazione di una o più rette, è possibile risalire a forme geometriche differenti oppure identificare i punti di intersezione tra le rette, identificando così un caratteristico punto di ogni pozzetto 8.

È inoltre nota in letteratura la trasformata di Hough generalizzata secondo la quale, data una forma geometrica da individuare, se l’immagine analizzata contiene istanze della forma da individuare i voti si accumulano nelle posizioni del punto di riferimento che corrisponde a tali istanze. Come nella trasformata di Hough classica, si ricerca il picco dell’accumulatore e tale picco rappresenta l’istanza della forma ricercata. Il metodo descritto presuppone che le forme abbiano la stessa dimensione e orientazione, ma sono note ulteriori generalizzazioni anche nei casi di variazione di scala e di orientazione.

Ad esempio, con riferimento all’immagine 50 di figura 10, è possibile utilizzare, come ingresso alla funzione che implementa la trasformata di Hough, l’immagine 50 come immagine su cui eseguire la ricerca delle forme geometriche da individuare e un’immagine di riferimento ideale che rappresenta ciascun pozzetto 8. Ad esempio, l’immagine di riferimento è un quadrato, ad esempio di dimensione 14x14 pixel. In questo modo, applicando la trasformata di Hough generalizzata, si ottiene in modo automatico una immagine 60 del tipo mostrato in figura 11, in cui ciascuna istanza (i pozzetti 8) dell’immagine 50 ritenuta confrontabile ed affine (sulla base dell’elaborazione della trasformata di Hugh) con l’immagine di riferimento di figura 11 è stata identificata.

La trasformata di Hough restituisce anche una coppia di valori (pi, qi) per ciascun pozzetto 8 individuato sull’immagine 60, identificativi di una coppia coordinate appartenenti al rispettivo pozzetto 8 (ad esempio, tale coppia di coordinate è identificativa di un rispettivo vertice di ciascun pozzetto 8). In questo modo, è possibile conoscere esattamente la posizione di ciascun pozzetto 8 sull’immagine 60 e, di conseguenza, sull’immagine 40 originaria.

La figura 11 mostra un’immagine 60 che è ottenuta a partire dall’immagine 50 di figura 10 in cui le forme che, sulla base delle fasi precedenti, sono state identificate come somiglianti all’immagine di riferimento ideale, sono state circondate da un quadrato 62 che è proprio tale immagine di riferimento ideale. Altre forme (es., le forme arrotondate identificate con il riferimento 65), dissimili dal quadrato 62 di riferimento ideale, non sono state identificate come pozzetti 8 e quindi non saranno prese in considerazione durante la successiva fase S4.

Quindi, fase S4 di figura 7, si procede all’analisi della fluorescenza dei pozzetti 8 come rilevabile dall’immagine 40. Questa fase è eseguita calcolando i valori di intensità luminosa dei pixel dell’immagine 40 esclusivamente in corrispondenza dei pozzetti 8 identificati durante la fase S3 precedente, cioè in corrispondenza di (“at”) regioni dell’immagine 40 corrispondenti a (“corresponding to”) rispettive regioni dell’immagine 60 internamente delimitate dai quadrati di riferimento ideali. Più in particolare, questa fase comprende calcolare l’intensità luminosa media in corrispondenza dei pozzetti rappresentati sull’immagine 40. A questo fine, dunque, si calcola pixel per pixel (come detto, solo per i pozzetti selezionati) il valore di intensità luminosa, si sommano tra loro i valori così calcolati e si esegue una operazione di divisione per il numero totale di pixel considerati (in altre parole, si esegue una operazione di media aritmetica). L’intensità luminosa della fluorescenza emessa da ogni pozzetto dell’immagine 40 è dunque data dalla somma dei valori di intensità luminosa dei pixel di ogni pozzetto identificato, diviso per il numero di pixel, ed è identificativa del valore di fluorescenza emesso da ogni pozzetto 8 della cartuccia 1 all’istante di analisi considerato.

Di conseguenza, è possibile determinare le concentrazioni dei fluorofori emettitori nel campione in esame, ad esempio mediante soglie.

Le concentrazioni così determinate vengono memorizzate nel modulo di memoria 26, eventualmente elaborate dall’unità di controllo 25 e rese disponibili attraverso un’interfaccia (non mostrata), ad esempio un’interfaccia USB.

Eseguendo le fasi S1-S4 di figura 7 più volte durante i cicli termici della PCR è possibile ricavare informazioni circa l’andamento del segnale di fluorescenza e, di conseguenza, informazioni relative alla PCR stessa.

È noto che, in una reazione PCR tipica, il prodotto di PCR aumenta ad ogni ciclo di amplificazione ed il diagramma della fluorescenza sul numero dei cicli esibisce un andamento sigmoide. Nei cicli finali, i prodotti di PCR non aumentano più e la curva mostra un plateau. Dunque, tracciando una curva di interpolazione dei valori di fluorescenza media ottenuti ripetendo più volte le fasi di figura 7, è possibile acquisire informazioni circa la buona riuscita dell’amplificazione (la curva è sostanzialmente una sigmoide) oppure, al contrario, ottenere una indicazione che la procedura di amplificazione non è andata a buon fine.

Le stesse fasi di figura 7 sono eseguite analogamente per acquisire la fluorescenza emessa dai fluorofori di riferimenti (ROX) al fine di eseguire un controllo con fluorofori di riferimento.

Lo strato di passivazione 7 con spessore variabile permette di ridurre efficacemente la riflessione della radiazione di eccitazione a livello del corpo di supporto 2, evitando o riducendo considerevolmente imprecisioni nella lettura dovute a riflessioni indesiderate. Il vantaggio è particolarmente importante per gli analizzatori portatili, che per poter essere facilmente trasportati e utilizzati anche fuori laboratorio devono privilegiare la riduzione delle dimensioni e dei pesi, oltre che essere a basso costo. In particolare, per i vincoli imposti dalla destinazione d’uso è difficile ed economicamente non conveniente adottare accorgimenti che permettano di ottimizzare l’uniformità della radiazione rilevata a livello dell’analizzatore.

Secondo un ulteriore aspetto della presente invenzione, è ora descritta una procedura di diagnosi in vitro di malattie genetiche (figura 13) a partire da campioni biologici direttamente prelevati dal soggetto in esame (in particolare, campioni di saliva prelevati con tampone o “swab” boccale), in modo diretto automatizzato, in una singola fase.

La procedura di figura 13 si applica, in modo particolare, ad una cartuccia o microreattore per analisi biochimiche del tipo descritto nel documento US 2013/0004954, a nome STMicroelectronics s.r.l., e mostrata in figura 12.

Alternativamente, è anche possibile utilizzare una cartuccia o microreattore per analisi biochimiche del tipo descritto nel documento US 2013/0004952, a nome STMicroelectronics s.r.l..

Tuttavia, altre cartucce o microreattori possono essere utilizzati, preferibilmente includenti pozzetti di forma quadrata o rettangolare aventi, in vista superiore, lati di dimensioni pari a, o maggiori di, 1 mm. Alternativamente, i pozzetti possono avere forma circolare, con diametro pari a, o maggiore di, 1 mm.

L’analisi a fluorescenza di reazioni PCR che avvengono in tale microreattore può essere eseguita mediante un analizzatore per PCR in tempo reale del tipo descritto nello stesso documento US 2013/0004954, oppure mediante l’analizzatore 10 secondo la presente invenzione, indifferentemente.

La vista esplosa di figura 12 mostra una cartuccia, o microreattore, 100 per analisi biochimiche del tipo descritto nel documento US 2013/0004954. Il microreattore 100 è alloggiato su una scheda elettronica o PCB 102. Più precisamente, la scheda PCB 102 presenta un’apertura 102a passante, dove è alloggiato il microreattore 100. Il microreattore 100 comprende una prima piastrina 103, ad esempio in materiale polimerico, e una seconda piastrina 104, in materiale semiconduttore (ad esempio silicio) unite fra di loro, ad esempio mediante un adesivo a base siliconica.

Una pluralità di pozzetti 105 sono ricavati nella prima piastrina 103 e sono configurati per ricevere soluzioni contenenti campioni biologici da analizzare. In una forma di realizzazione, il microreattore 100 è stato funzionalizzato fissando sonde per DNA alle pareti dei pozzetti 105. Le sonde per DNA possono comprendere singoli filamenti di DNA contenenti sequenze obiettivo di nucleotidi da ricercare nel campione biologico analizzato.

Nella seconda piastrina 104 sono integrati riscaldatori 106 e sensori di temperatura di bordo 107. I sensori di temperatura di bordo 107 sono di tipo termoresistivo. In pratica, loro resistenza varia in funzione della temperatura e quindi una lettura della resistenza è indicativa della temperatura a un dato istante. La seconda piastrina 104 sporge leggermente su un lato rispetto alla prima piastrina 103 e sulla parte sporgente ospita piazzole di contatto 108, per la connessione dei riscaldatori 106 e dei sensori di temperatura di bordo 107 con piste conduttive 109 sulla scheda PCB 102. Terminali 109a delle piste 109 permettono la connessione della scheda PCB 102 una volta che è stata inserita in un analizzatore per PCR. Il microreattore 100 comprende, secondo una forma di realizzazione, sei pozzetti 105 aventi forma, in vista superiore, sostanzialmente quadrata o rettangolare. Ciascun pozzetto 105 ha ad esempio, lati di lunghezza compresa tra 3 mm e 4 mm, ed una profondità pari a circa 3 mm. Inoltre, ciascun pozzetto 105 è separato lateralmente da un altro pozzetto 105 di una distanza pari a circa 1 mm.

Con riferimento alla figura 13, secondo la procedura di diagnosi di malattie genetiche della presente invenzione, si esegue una prima fase D1 in cui viene fornito (“provided”) un campione di tampone diagnostico (“swab”) boccale. Il campione di “swab” boccale può essere acquisito mediante semplice prelievo di cellule dell’epitelio boccale, con metodica non invasiva, disperdendo successivamente (fase D2) tali cellule epiteliali in un mezzo di trasporto di tipo noto (fase di stemperamento).

La fase di stemperamento include la dissoluzione delle cellule di campione prelevate in un mezzo di trasporto (o soluzione di trasporto). La soluzione di trasporto è atta a favorire la lisi (rottura) delle cellule epiteliali prelevate così da liberare il DNA. La lisi è completata durante le fasi iniziali della ciclatura termica delle fasi successive (favorita dal calore).

Per questa analisi, ciascun pozzetto 105 del microreattore 100 viene precaricato con (fase D3):

- 27 µl di cera (che viene fusa e colata in ciascun pozzetto 8) e che serve a sigillare ciascun pozzetto 8 per evitare fenomeni di evaporazione durante la ciclatura termica della PCR;

- 4 µl di reagenti per la PCR (includenti “primers”, “probes” ed enzima polimerasi), in forma di soluzione liquida; e

- 2 µl di soluzione contenente le cellule epiteliali stemperate nel mezzo di trasporto.

La cera utilizzata deve essere compatibile con la PCR e con i reagenti utilizzati, in particolare non deve inibire la PCR. Inoltre, quando fusa, deve essere trasparente ed esibire una bassa fluorescenza alle lunghezze d’onda di interesse (utilizzate per l’analisi a fluorescenza), al fine di non interferire con le misure della fluorescenza emessa dai pozzetti 8. Inoltre, deve preferibilmente mostrare una bassa tensione vapore, per non evaporare durante i cicli termici richiesti per la PCR. Preferibilmente, deve mostrare una densità minore rispetto alla densità dei reagenti PCR e delle soluzioni utilizzate, in modo tale che essa copra i reagenti PCR e la soluzione al fine di evitare l’evaporazione di essi durante i cicli termici della PCR. Questo consente inoltre di introdurre nei pozzetti 8 reagenti PCR / soluzione da analizzare indipendentemente prima o dopo l’inserimento della cera nei pozzetti 8 (i pozzetti 8 possono così essere precaricati con la cera durante le fasi stesse di fabbricazione della cartuccia 1). Inoltre, la cera consente di ottenere una effettiva e valida protezione dei pozzetti 8, evitando fenomeni di contaminazione incrociata (“crosscontamination”) tra pozzetti 8 adiacenti e da agenti contaminanti esterni. Inoltre, la cera utilizzata deve possedere una temperatura di fusione adeguata, tale per cui essa risulta solida a temperatura ambiente (o temperature inferiori alla temperatura ambiente), ma liquida alle temperature a cui la PCR è condotta (tipicamente pari o maggiore di circa 55 °C).

La Richiedente ha verificato che una cera che possiede queste caratteristiche è una cera paraffinica, in particolare del tipo commercializzato da Sigma-Aldrich con il codice 76228.

Alternativamente alla cera, è altresì possibile utilizzare olio minerale.

Quindi, fase D4, si procede ad inserire il microreattore 100 così caricato nell’analizzatore (es., analizzatore 10 di figura 5 o nell’analizzatore descritto in US 2013/0004954), e viene avviata la ciclatura termica per la PCR.

A questo fine, a titolo esemplificativo, la ciclatura termica comprende un riscaldamento ad una temperatura scelta nell’intervallo compreso tra 94 a 99 °C per un tempo compreso tra 2 e 10 minuti, e, in seguito una pluralità di cicli (es., 50 cicli), in cui ciascun ciclo include:

- una fase di riscaldamento a temperatura compresa tra 94 e 99 °C per un tempo compreso tra 5 e 20 secondi; e

- una fase di riscaldamento a temperatura compresa tra 57 e 62 °C per un tempo compreso tra 35 e 70 secondi.

Durante questi cicli termici, il processo di PCR viene monitorato (fase D5) mediante analisi a fluorescenza, ad esempio secondo quanto precedentemente descritto, eseguendo le fasi S1-S4 di figura 7. Tuttavia, qualsiasi altro metodo di monitoraggio in tempo reale, di tipo noto nello stato dell’arte, può essere utilizzato (ad esempio come descritto in US 2013/0004954).

Al dispositivo e al procedimento descritti possono essere apportate modifiche e varianti, senza uscire dall’ambito della presente invenzione, come definita nelle rivendicazioni allegate.

Claims (14)

1. RIVENDICAZIONI 1. Kit per analisi biochimiche comprendente un analizzatore (10) e una cartuccia (1; 100) avente una pluralità di pozzetti (8; 105) atti a ricevere una soluzione biologica da analizzare, l’analizzatore (10) essendo configurato per ricevere detta cartuccia (1; 100) e includendo almeno una sorgente luminosa (30; 31), per illuminare i pozzetti (8; 105) con una prima radiazione luminosa avente una prima lunghezza d’onda (λE1; λE2), e almeno un sensore di immagini (32; 33), per rilevare una seconda radiazione luminosa, avente una seconda lunghezza d’onda, emessa da detti pozzetti (8; 105) in risposta alla prima radiazione luminosa; caratterizzato dal fatto che l’analizzatore comprende un’unità di controllo (25) configurata per: (a) acquisire, da detto sensore di immagini, una prima immagine (40) rappresentativa di detta seconda radiazione luminosa; (b) identificare, in detta prima immagine, pixel appartenenti a linee di contorno di detti pozzetti (8; 105), generando una immagine binaria (50) in cui un primo valore di intensità luminosa è attribuito a pixel appartenenti a dette linee di contorno, e un secondo valore di intensità luminosa, diverso da detto primo valore di intensità luminosa, è attribuito ai restanti pixel di detta immagine binaria, detti pixel aventi il primo valore di intensità luminosa definendo forme geometriche mono o bidimensionali in detta immagine binaria; (c) riconoscere, tra dette forme geometriche, quelle che meglio approssimano una forma geometrica di riferimento identificativa di un pozzetto ideale; (d) generare una seconda immagine in cui a ciascuna forma geometrica definita dai pixel aventi il primo valore di luminosità è associata la forma geometrica di riferimento solo nel caso in cui il riconoscimento sia stato positivo; (e) acquisire, dalla prima immagine, valori di intensità luminosa solo in corrispondenza di (“at”) porzioni della stessa corrispondenti a (“corresponding to”) rispettive porzioni della seconda immagine delimitate da rispettive forme geometriche di riferimento associate a rispettive forme geometriche definite dai pixel aventi il primo valore di luminosità; e (f) valutare uno stato di avanzamento e/o un risultato di detta analisi biochimica sulla base di detti valori di intensità luminosa rilevati.
2. 2. Kit secondo la rivendicazione 1, in cui la cartuccia (1) include: un corpo di supporto (2), avente una prima (2a) e una seconda (2b) faccia opposte tra loro, detti pozzetti (8) estendendosi in detto corpo di supporto (2) in corrispondenza di detta prima faccia (2a); una pluralità di strati biocompatibili (29) estendentesi in rispettivi pozzetti (8); e uno strato antiriflesso (27) estendentesi sulla prima faccia (2a) esternamente a detti pozzetti (8).
3. 3. Kit secondo la rivendicazione 2, in cui detta cartuccia (1) comprende inoltre un modulo di contenimento di bordo accoppiato alla prima faccia (2a) del corpo di supporto (2) in corrispondenza di regioni di bordo della prima faccia (2a), in modo da circondare completamente detta pluralità di pozzetti (8).
4. 4. Kit secondo la rivendicazione 2 o 3, in cui detto strato antiriflesso (27) ha uno spessore pari a circa un quarto della prima lunghezza d’onda (λE1) diviso per l’indice di rifrazione dello strato antiriflesso, o pari ad un multiplo dispari di un quarto della prima lunghezza d’onda diviso per l’indice di rifrazione del rispettivo strato antiriflesso, e moltiplicato per il coseno dell’angolo che si forma con la normale al piano di incidenza della radiazione avente la prima lunghezza d’onda (λE1), e in cui ciascuno di detti strati biocompatibili (27) ha uno spessore inferiore ad un quarto della prima lunghezza d’onda (λE1) diviso per l’indice di rifrazione del rispettivo strato biocompatibile e moltiplicato per il coseno dell’angolo che si forma con la normale al piano di incidenza della radiazione avente la prima lunghezza d’onda (λE1).
5. 5. Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 2-4, in cui detti strati biocompatibili (29) e detto strato antiriflesso (27) sono di ossido di silicio.
6. 6. Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 2-5, in cui detta cartuccia (1) comprende inoltre almeno un riscaldatore (5) termicamente accoppiato alla pluralità di pozzetti (8) tramite il corpo di supporto (2).
7. 7. Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 2-6, in cui detta cartuccia (1) comprende inoltre un sensore di temperatura (6) termicamente accoppiato al corpo di supporto (2).
8. 8. Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 2-7, in cui ciascun pozzetto (8) di detta cartuccia (1) alloggia sonde di acidi nucleici per l’ibridizzazione a rispettivi acidi nucleici obiettivo, e una soluzione contenente uno o più tra: primer in grado di legarsi agli acidi nucleici obiettivo, nucleotidi, enzimi estensori di acidi nucleici ed acidi nucleici, detti pozzetti (8) contenenti dette sonde di acidi nucleici e detta soluzione essendo inoltre uniformemente coperti da olio minerale per contrastare l’evaporazione di detta soluzione.
9. 9. Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la funzionalità (b) di identificare, su detta prima immagine, pixel appartenenti a linee di contorno di detti pozzetti (8) è eseguita utilizzando un filtro di Canny per il riconoscimento di contorni (“edge detection”).
10. 10. Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la funzionalità (c) di riconoscere è eseguita utilizzando un filtro di Hough o di Radon.
11. 11. Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la funzionalità (f) di valutare uno stato di avanzamento e/o un risultato di detta analisi biochimica sulla base di detti valori di intensità luminosa rilevati comprende calcolare media aritmetica dei valori di intensità luminosa rilevati, e fornire un risultato della valutazione sulla base del valore medio di intensità calcolato.
12. 12. Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui l’unità di controllo (25) è inoltre configurata per: acquisire, da detto sensore di immagini, una pluralità di prime immagini rappresentative di rispettive radiazioni luminose aventi la seconda lunghezza d’onda emesse da detti pozzetti (8) in risposta a rispettive radiazioni luminose aventi la prima lunghezza d’onda, in istanti temporali successivi tra loro; eseguire, per ciascuna di dette prime immagini della pluralità di prime immagini, le operazioni (b)-(e); e rilevare se i valori di intensità luminosa acquisiti per ciascuna prima immagine della pluralità di prime immagini formano una sigmoide.
13. 13. Metodo per eseguire un processo biochimico, comprendente: attivare una sorgente luminosa (30; 31) configurata per illuminare una soluzione contenuta in una pluralità di pozzetti (8) con una prima radiazione luminosa avente una prima lunghezza d’onda (λE1; λE2); e rilevare una seconda radiazione luminosa, avente una seconda lunghezza d’onda, emessa da detti pozzetti (8; 105) in risposta alla prima radiazione luminosa, caratterizzato dal fatto di comprendere inoltre le fasi di: (a) acquisire una prima immagine (40) rappresentativa di detta seconda radiazione luminosa; (b) identificare, in detta prima immagine, pixel appartenenti a linee di contorno di detti pozzetti (8; 105), generando una immagine binaria (50) in cui un primo valore di intensità luminosa è attribuito a pixel appartenenti a dette linee di contorno, e un secondo valore di intensità luminosa, diverso da detto primo valore di intensità luminosa, è attribuito ai restanti pixel di detta immagine binaria, detti pixel aventi il primo valore di intensità luminosa definendo forme geometriche mono o bidimensionali in detta immagine binaria; (c) riconoscere, tra dette forme geometriche, quelle che meglio approssimano una forma geometrica di riferimento identificativa di un pozzetto ideale; (d) generare una seconda immagine in cui a ciascuna forma geometrica definita dai pixel aventi il primo valore di luminosità è associata la forma geometrica di riferimento solo nel caso in cui il riconoscimento sia stato positivo; (e) acquisire, dalla prima immagine, valori di intensità luminosa solo in corrispondenza di (“at”) porzioni della stessa corrispondenti a (“corresponding to”) rispettive porzioni della seconda immagine delimitate da rispettive forme geometriche di riferimento associate a rispettive forme geometriche definite dai pixel aventi il primo valore di luminosità; e (f) valutare uno stato di avanzamento e/o un risultato di detta analisi biochimica sulla base di detti valori di intensità luminosa rilevati.
14. 14. Metodo secondo la rivendicazione 13, comprendente inoltre le fasi di: - fornire un campione biologico da analizzare; - estrarre, da detto campione biologico da analizzare, filamenti di DNA; - riempire detti pozzetti (8, 105) mediante: 27 µl di cera o olio minerale, 4 µl di reagenti per PCR, e 2 µl di soluzione contenente detti filamenti di DNA; - riscaldare detti pozzetti ad una temperatura compresa tra 94 a 99 °C per un tempo compreso tra 2 e 10 minuti - eseguire una pluralità di cilci termici comprendenti ciascuno: una fase di riscaldamento a temperatura compresa tra 94 e 99 °C per un tempo compreso tra 5 e 20 secondi; e una fase di riscaldamento a temperatura compresa tra 57 e 62 °C per un tempo compreso tra 35 e 70 secondi.